JPH08502260A

JPH08502260A - ヒト免疫不全ウイルスに対するヒト中和モノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH08502260A
Application number: JP6509318A
Authority: JP
Inventors: デニスアールバートン; カーロスエフバーバス; リチャードエイラーナー
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1992-09-30
Filing date: 1993-09-30
Publication date: 1996-03-12
Also published as: NO951212D0; ATE233814T1; FI951488L; NO951212L; EP0675904A4; CA2145757A1; EP0675904B1; DE69332744T2; FI951488A0; ES2194015T3; AU5350194A; DE69332744D1; AU681360B2; WO1994007922A1; EP0675904A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）と免疫反応でき、かつそのウイルスを中和できるヒトモノクローナル抗体を記載する。また、そのモノクローナル抗体を使用する免疫療法及び診断方法、並びにそのモノクローナル抗体を産生するための細胞系が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト免疫不全ウイルスに対するヒト中和モノクローナル抗体技術分野本発明は一般に免疫学の分野に関するものであり、詳しくはヒト免疫不全ウイルス（HIV）を結合し、中和するヒトモノクローナル抗体に関する。背景 1.HIV免疫療法 HIVは後天性免疫不全症候群（AIDS）の原因物質であるので、それは熱心な研究の焦点である。免疫療法は、HIV感染及びHIV誘発疾患の予防、治癒または改善に対する幾つかのアプローチの一つである。詳しくは、受動免疫療法における中和抗体の使用が本発明に極めて重要である。 HIVと免疫反応性のポリクローナル抗体を含むヒト血清を使用するHIV-1感染したヒトの受動免疫化が報告されていた。例えば、Jacksonら，Lancet，９月，17: 647-652，(1988)；Karpasら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，87:7613-7616(1990) を参照のこと。多数のグループが、HIV隔離集団を試験管内で中和するヒトモノクローナル抗体の調製を報告していた。記載された抗体は、典型的には、HIV糖タンパク質gp1 20もしくは関連外表面エンベロープ糖タンパク質gp120またはトランスメンブラン糖タンパク質gp41のエピトープに対し免疫特異性を有する。例えば、Levy，Mi cro.Rev.，57:183-289(1993)；Karwowskaら，Aids Research and Human Ret-rov iruses，8:1099-1106(1992)；Takedaら，J.Clin.Invest.，89:1952-1957(1992) ；Tilleyら，Aids Research and Human Retrovirus，8:461-467(1992)；Lamanら，J.Virol.，66:1823-1831(1992)；Thaliら，J.Virol.，65:6188-6193(1991)；H oら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88:8949-8952(1991)；D'Souzaら，AIDS，5:10 61-1070(1991)；Tilleyら，Res.Viorol.，142:247-259(1991)；Br- olidenら，Immunol.，73:371-376(1991)；Matourら，J.Immunol.，146:4325-433 2(1992)；及びGornyら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88:3238-3242(1991)を参照のこと。現在まで、報告されたヒトモノクローナル抗体のいずれもが受動免疫化療法に有効ではないことが示された。更に、モノクローナル抗体として、それらは全て HIVエンベロープ糖タンパク質、gp120またはgp160の個々のエピトープと夫々反応する。有効な中和抗体が免疫反応するエピトープは、同定されていなかった。かなりのHIV中和活性を有するヒトモノクローナル抗体抗体製剤を開発することに対する要望が絶えずある。加えて、gp120及びgp41がHIVウイルスを細胞に結合することだけでなく、エンベロープ脱落（shedding）及び開裂を含む結合後の事象の両方に関与することを示唆する最近の研究に鑑みて、HIV gp120及びgp41 の付加的かつ多様な中和エピトープと免疫反応性のモノクローナル抗体に対する要望がある。総説につき、Levy，Micro.Rev.，57:183-289(1993)を参照のこと。付加的な（新規な）エピトープ特異性が必要とされる。何となれば、受動免疫化の後に、投与された患者が投与抗体に対し免疫応答を生じることができ、それにより特別な治療抗体を不活化し得るからである。 2.結合性ファージミドライブラリーから産生されたヒトモノクローナル抗体ファージミドと称される繊維状ファージディスプレイベクターの使用が、多様かつ新規な免疫特異性を有するモノクローナル抗体の大きなライブラリーの有効な調製を可能にすることが繰り返し示された。その技術は、繊維状ファージ複製のアッセンブリー段階中に遺伝子産物及び遺伝子を結合するための手段として繊維状ファージ外殻タンパク質膜アンカードメインを使用し、そして結合性ライブラリーからの抗体のクローニング及び発現に使用されていた。Kangら，Proc.Nat l.Acad.Sci.，USA，88:4363-4366(1991)。抗体の結合性ライブラリーが、cpVIII 膜アンカー（Kangら，上記文献）及びcpIII膜アンカーの両方を使用して生産されていた。Barbasら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88:7978-7982(1991)。繊維状ファージ系結合性抗体ライブラリーの多様性が、Ｈ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子のシャッフリング（shuffling）により（Kangら，Proc.Natl.Acad.Sci.，US A,:88:11120-11123(1991)）、そのライブラリーのクローン化されたＨ鎖遺伝子の CDR3領域を変更することにより（Barbasら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，89:44 57-4461(1992)）、またエラー−プローンポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりランダム突然変異をそのライブラリーに導入することにより［Gramら，Proc.Natl. Acad.Sci.，USA.，89:3576-3580(1992)］増大し得る。繊維状ファージディスプレイベクターがまたＢ型肝炎ウイルス（HBV）またはH IV抗原と免疫反応性のヒトモノクローナル抗体を産生するのに使用されていた。例えば、夫々、Zebedeeら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89:3175-3179(1992)；及びBurtonら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88:10134-10137(1991)を参照のこと。HIVと免疫反応性であるファージミドベクターにより産生された前記ヒトモノクローナル抗体のいずれもが、HIVを中和しないことが示された。発明の簡単な説明ファージミドベクターを使用してHIVを中和し、そして完全ヒト誘導の多数の中和抗体の迅速な調製を可能にするヒトモノクローナル抗体を結合性ライブラリーから同定し、単離する方法が、今発見された。同定された中和抗体はHIV gp12 0糖タンパク質及びgp41糖タンパク質につき新規なエピトープを形成し、それにより新規な免疫治療ヒトモノクローナル抗体の利用可能性を増大する。本発明は、HIVを中和するヒトモノクローナル抗体を提供し、またこれらのモノクローナル抗体を産生するのに使用される細胞系を提供する。また、中和機能をモノクローナル抗体の抗原結合ドメインに与え、かつ免疫原として使用してHIVを特異的に結合し、中和するその他の抗体を同定し得るアミノ酸配列が提供される。本発明のモノクローナル抗体は、HIV誘発疾患の診断及び免疫療法のための試薬として特別な実用性がある。本発明のモノクローナル抗体の主な利点は、それらがヒトポリヌクレオチド配列によりコードされるという事実に由来する。こうして、HIV誘発疾患の診断及び免疫療法のための本発明のモノクローナル抗体の生体内の使用は、異種誘導またはキメラ誘導のモノクローナル抗体が使用される場合に普通に見られる問題である受動投与抗体に対するかなりの宿主免疫応答の問題を大幅に減少する。一実施態様において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）糖タンパク質g p120と免疫反応でき、HIVを中和できるヒトモノクローナル抗体を意図している。好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号66、67、68、70、72、73、74、 75、78及び97からなる群から選ばれたＨ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。別の好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号95、96、97、98、101、102、103、104、105、107、11 0、115、118、121、122、124及び132からなる群から選ばれたＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。更に別の実施態様において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）糖タンパク質gp41と免疫反応でき、HIVを中和できるヒトモノクローナル抗体を意図している。好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号142、143、144、145及び 146からなる群から選ばれたＨ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。別の好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号147、148、149、150及び151からなる群から選ばれたＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。別の実施態様において、本発明は、本発明のヒトモノクローナル抗体のＨ鎖またはＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列をコードするポリヌクレオチド配列を記載する。また、ポリヌクレオチドを含むDNA発現ベクター、並びに本発明のベクター及びポリヌクレオチドを含む宿主細胞が意図されている。また、本発明は、HIVを含むと推測される試料を診断有効量の本発明のモノクローナル抗体と接触させ、モノクローナル抗体が試料と免疫反応するかどうかを測定することを特徴とするヒト免疫不全ウイルス（HIV）の検出方法を意図している。その方法は試験管内または生体内で実施でき、また免疫反応生産物の存在の種々の測定方法を含み得る。別の実施態様において、本発明は、免疫治療有効量の本発明のモノクローナル抗体をヒトに投与することを特徴とするヒトのヒト免疫不全ウイルス（HIV）疾患の受動免疫療法を施す方法を記載する。その投与は予防上与えられてもよく、また非経口投与により与えられてもよい。一種以上の異なるヒトモノクローナル抗体を含む医薬組成物が、本発明の治療方法における使用につき記載される。図面の簡単な説明この開示の一部を形成する図面において、図１はλHc2発現ベクターを生産するためにλZapに挿入された二本鎖合成DNA の配列を示す。二本鎖合成DNAインサートの調製が実施例1a2)に記載されている。Ｖ_HコードDNA同族体を発現するためにこのベクターに必要とされる種々の特徴は、シャイン−ダルガーノリボソーム結合部位、Mouvaら，J.Biol.Chem．255:27 ，1980により記載されているような発現タンパク質を周辺質に誘導するリーダー配列、及びＶ_H同族体を発現ベクターに操作により結合するのに使用された種々の制限酵素部位を含む。また、Ｖ_H発現ベクター配列は、可変領域Ｈ鎖（Ｖ_H主鎖）中に典型的に見られるアミノ酸をコードする短い核酸配列を含む。このＶ_H主鎖はXhoＩクローニング部位及びSpeＩクローニング部位に操作により結合されているＶ_H DNA同族体としての適当な読みの上流及びその中にある。二本鎖合成DNA インサートの上部ストランド及び下部ストランドの配列が夫々配列番号１及び配列番号２にリストされる。デカペプチドtagを含む10アミノ酸配列が配列番号５にリストされる。合成DNAインサートは制限酵素Not１及びXhoＩで消化されたλZ ap IIに方向性結合されてλHc2発現ベクターを形成する。図２はバクテリアの発現ベクターλHc2（Ｖ_H発現ベクター）の主要な特徴を示す。λZap II中のインサートの配向が示される。Ｖ_H DNA同族体がXhoＩクローニング部位及びSpeＩクローニング部位に挿入される。転写による読みが、クローニング部位の3'に丁度配置されるデカペプチドエピトープ（tag）を生じる。デカペプチドtag及びPel Bリーダー配列／スペーサーのアミノ酸残基配列が夫々配列番号５及び６にリストされる。図３は、λLc2発現ベクターを生産するためにλZapに挿入された二本鎖合成DN Aの配列を示す。Ｖ_LコードDNA同族体を発現するためにこのベクターに必要とされる種々の特徴が、図１に記載される。Ｖ_LコードDNA同族体がSacＩ制限部位及びXhoＩ制限部位でLc2配列に操作により結合される。二本鎖合成DNAインサートの上部ストランド及び下部ストランドの配列が夫々配列番号３及び配列番号４にリストされる。合成DNAインサートは制限酵素SacＩ及びNotＩで消化されたλZap IIに方向性結合されてλLc2発現ベクターを形成する。図４はバクテリアの発現ベクターLc2（Ｖ_L発現ベクター）の主要な特徴を示す。図３からの合成DNA配列が、λZapIIからのLac Zプロモーターと一緒に上部に示される。λZap II中のインサートの配向が示される。Ｖ_LDNA同族体がSacＩクローニング部位及びXhoＩクローニング部位に挿入される。Pel Bリーダー配列／スペーサーのアミノ酸残基配列が配列番号７にリストされる。図５はファージミド発現ベクターの形態のジシストロニック(dicistronic)発現ベクター、pCombを示す。図６は組換えFabによるHIV-1の中和を示す。同じ上澄み製剤をp24アッセイ及び融合細胞アッセイに使用した。これらの図は中和力価を示す。アッセイ操作及び結果の説明の詳細につき実施例３を参考のこと。ELISA力価及びFab濃度を実施例2bに記載されたようにして測定した。図７は実施例2b6)に記載されたようにして行った抑制ELISAにより示されるようなgp120（IIIB）に対するFabフラグメントの相対アフィニティーを示す。Fab2 7、6、29、２及び３は実施例４で説明された異なるグループの全てのプロトタイプ員である。ループ２は、その他のFabと同じライブラリーから選択されたが、V 3ループを認識するFabフラグメントである。そのデータは、Ｘ軸の次第に増加する濃度(10^-11M〜10^-7M)の可溶性gp120に対しＹ軸の最大結合率（％）としてプロットされる。図８はgp120(IIIB)に対するFabフラグメントとの可溶性CD4競合を示す。P4D10 及びループ２は対称である。P4D10は、gp120(IIIB)のV3ループと反応するマウスモノクローナル抗体である。実施例2b6)に説明されたデータが、図７に記載されたようにプロットされる。図９は実施例３に記載されたようにして調製された精製FabによるHIVの中和を示す。示された結果は、MN株を使用する融合細胞アッセイから誘導される。そのデータは、Ｘ軸の次第に増加するFab濃度［0.1から10マイクログラム／ミリリットル(μg/ml)より大きい濃度まで］に対しＹ軸の結合の抑制率(％)としてプロットされる。図10はgp120に結合するFabの可変Ｈ（Ｖ_H）ドメインのアミノ酸残基配列を示す。７つの異なるグループが配列相同性に基いて実施例４に記載されたようにして同定された。グループ中の第一配列による同一性がドットにより示される。Fa bクローンの名称が左側の欄に示される。相当する配列番号が右側の欄に示される。右から左への配列決定領域は、骨格領域１(FR1)、相補性決定領域１(CDR1) 、骨格領域２(FR2)、相補性決定領域２(CDR2)、骨格領域３(FR3)、相補性決定領域３(CDR3)、及び骨格領域４(FR4)である。LEQで開始する５アミノ末端残基配列はVH1aから生じ、一方、LEEで開始する５アミノ末端残基配列はVH3aプライマーから生じる。b11配列及びb29配列はb3グループと非常に類似し、そのグループ内のクローン内変異体であると論じ得る。それらはV-D及びD-J界面における相違のためにそれら自体のグループ中に入れられる。図11はgp120に結合するFabの可変Ｌ（Ｖ_L）ドメインのアミノ酸残基配列を示す。図の説明につき図10を参考のこと、また配列の分析につき実施例４を参考のこと。図12は、gp120に結合するFabから、実施例５に記載されたようにＬ鎖(H12-LCn Fab)のライブラリーに対しＨ鎖をクローンb12からシャッフルすることにより生じたＶ_Lドメインのアミノ酸残基配列を示す。新規なＶ_L配列は、最初のライブラリーからのクローン数に関係しないクローン数を指示したことに注目されたい。特異な配列が配列表中で配列番号114から122までにリストされる。新規なＶ_Lドメイン配列が最初のクローンb12 Ｖ_L配列のドメイン配列と比較される。図13は、gp120に結合するFabから、実施例５に記載されたようにＨ鎖(L12-HCn Fab)のライブラリーに対しＬ鎖をクローンb12からシャッフルすることにより生じたＶ_Hドメインのアミノ酸残基配列を示す。新規なＶ_H配列は、最初のライブラリーからのクローン数に関係しないクローン数を指示したことに注目されたい。特異な配列が配列表中で配列番号123から132までにリストされる。新規なＶ_Hドメイン配列が最初のクローンb12 Ｖ_H配列のドメイン配列と比較される。図14は、二つの図、図14A及び14B中で、夫々、Ｈ鎖レプリコン適合性鎖シャッフリングベクター(pTAC01H)及びＬ鎖レプリコン適合性鎖シャッフリングベクター(pTC01)のプラスミドマップを示す。両方のプラスミドは、プロモーター及びクローニング部位を含む部分において非常に似ている。略号：tacPO、tacプロモーター／オペロン；５ヒスチジンアミノ酸残基tag(ヒスチジン)5-尾部；f1IG 、f1ファージの遺伝子内領域；stu、夫々、Ｌ鎖及びＨ鎖によるインフレーム(in -frame)置換に供されるスタッファーフラグメント；cat、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ遺伝子；bla、b-ラクタマーゼ遺伝子；ori、複製の開始点。そのマップはほぼ縮尺どおりに描かれる。図15は二つの図、15A及び15B中の２成分のシャッフリングベクターのヌクレオチド配列を示す。ベクターの構築及び使用が実施例６に記載される。図15A中に、Ｌ鎖ベクター、pTC01中の多重クローニング部位の二本鎖ヌクレオチド配列が示される。上部ヌクレオチド塩基ストランド及び下部ヌクレオチド塩基ストランドの配列が夫々配列番号８及び配列番号９にリストされる。SacＩ制限部位で終止するpel Bリーダー配列を含むアミノ酸残基配列が配列番号10にリストされる。図15B中、Ｈ鎖ベクター、pTAC01H中の多重クローニング部位のヌクレオチド配列が示される。上部ヌクレオチド塩基ストランド及び下部ヌクレオチド塩基ストランドの配列が夫々配列番号11及び配列番号12にリストされる。Xho Ｉ制限部位で終止するpel Bリーダーを含むアミノ酸残基配列が配列番号13にリストされる。ヒスチジン尾部を含むアミノ酸残基配列が配列番号14にリストされる。適切な制限部位が下線を施されている。tacプロモーター及びリボソーム結合部位(rbs) がボックスにより示される。図16は、実施例６に記載されたようにIIIB gp120に対しELISAにより分析されたgp160(IIIB)(b1-b27)、gp120(IIIB)(B8-B35)、gp120(SF2)(s4-s8)、及びループペプチド(p35)によるパンニングにより最初のライブラリーから単離された全てのFabフラグメントのＨ鎖とＬ鎖の間の誘導交差の完全な組を示す。Ｈ鎖は水平にリストされ、またＬ鎖は垂直にリストされる。クローンは、実施例４で樹立されたグルーピングに従って選別される。異なるグループが水平線及び垂直線により分離される。特別なＨ鎖及びＬ鎖の交差点にある“−”はその特別な交差につき明らかな陰性（３倍以下のバックグラウンドのシグナル）を示し、“＋” は最初のＨ鎖及びＬ鎖の組み合わせに較べて明らかな陽性を示し、また“Ｗ”は ELISAにおける中間値を表す。“●”：HCp35/LCp35組み合わせは、gp120（IIIB) が使用される場合に陰性であるが、gp120（IIIB)で分析される場合には陽性である。同一の鎖は同じ識別記号（＊、¶、§、または￥）を有する。図17は、実施例６に記載されたように競合抗原として可溶性IIIB gp120を使用する競合ELISAにより分析された全てのパンニングからのＬ鎖とのb12 Ｈ鎖交差に関する抗体−抗原相互作用のアフィニティーを示す。そのデータは、Ｘ軸の次第に増加する濃度（10^-12M〜10^-7M)の可溶性gp120（IIIB)に対しＹ軸の最大結合率（％）としてプロットされる。図18はgp41に結合するFabの可変Ｈ（Ｖ_H）ドメインのアミノ酸残基配列を示す。Fabクローンの名称が左側の欄に示される。DL 41 19、DO 41 11、GL 41 1、MT 41 12及びSS 41 8と個々に称される５つのFabのＨ鎖配列が夫々の配列番号142 、143、144、145及び146を指定された。右から左への配列決定領域は、骨格領域１(FR1)、相補性決定領域１(CDR1)、骨格領域２(FR2)、相補性決定領域２(CDR2) 、骨格領域３(FR3)、相補性決定領域３(CDR3)、及び骨格領域４(FR4)である。図19はgp41に結合するFabの可変Ｌ（Ｖ_L）ドメインのアミノ酸残基配列を示す。図の説明につき図18を参照のこと。DL 41 19、DO 41 11、GL 41 1、MT 4112及びSS 41 8と個々に称される５つのFabのＬ鎖配列が夫々の配列番号147、148、149、 150及び151を指定された。発明の詳細な説明 A.定義アミノ酸残基：ポリペプチドのペプチド結合におけるポリペプチドの化学消化（加水分解）後に形成されたアミノ酸。本明細書に記載されたアミノ酸残基は “Ｌ”異性体であることが好ましい。しかしながら、“Ｄ”異性体の残基は、所望の機能的性質がポリペプチドにより保持されることを条件として、Ｌ−アミノ酸残基を置換し得る。NH₂はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を表す。COOHはポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を表す。標準のポリペプチド命名法（J.Biol.Chem.,243:3552-59(1969)により記載され、かつ37 CFR1.822(b)(2)で採用された）に従って、アミノ酸残基の略号が下記の対応表に示される。対応表記号アミノ酸１文字３文字 Y Tyr チロシン G Gly グリシン F Phe フェニルアラニン M Met メチオニン A Ala アラニン S Ser セリン I Ile イソロイシン L Leu ロイシン T Thr スレオニン V Val バリン P Pro プロリン K Lys リシン H His ヒスチジン Q Gln グルタミン E Glu グルタミン酸 Z Glx Glu及び／またはGln W Trp トリプトファン R Arg アルギニン D Asp アスパラギン酸 N Asn アスパラギン B Asx Asn及び／またはAsp C Cys システイン X Xaa 未知またはその他本明細書で式により表される全てのアミノ酸残基配列はアミノ末端からカルボキシ末端への通常の方向の左から右への配向を有することが注目されるべきである。加えて、“アミノ酸残基”という用語は、対応表にリストされたアミノ酸並びに本明細書中に参考として含まれる37 CFR 1.822(b)(4)にリストされたような修飾アミノ酸及び格別のアミノ酸を含むものと広く定義される。更に、アミノ酸残基配列の最初または末端にあるダッシュは一つ以上のアミノ酸残基の更に別の配列に結合されたペプチドまたはNH₂もしくはアセチルの如きアミノ末端基あるいはCOOHの如きカルボキシ末端基への共有結合を示すことが注目されるべきである。組換えDNA(rDNA)分子：二つのDNAセグメントを操作により結合することにより生産されたDNA分子。こうして、組換えDNA分子は、自然に通常一緒に見られない少なくとも二つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドDNA分子である。共通の生物起源を有しない、即ち、進化的に異なるrDNAは“異種”と言われる。ベクター：細胞中で自律複製できるrDNA分子であって、これに、DNAセグメント、例えば、遺伝子またはポリヌクレオチドが付着セグメントの複製をもたらすように操作により結合し得るrDNA分子。一種以上のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導し得るベクターは、本明細書中で“発現ベクター”と称される。特に重要なベクターは、逆転写酵素を使用して生産されたmRNAからのcDNA（相補DNA）のクローニングを可能にする。レセプター：レセプターは、他の分子に特異的（非ランダム）に結合し得る分子、例えば、タンパク質、糖タンパク質、等である。抗体：抗体という用語は、その種々の文法上の形態で、本明細書中で免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫活性部分、即ち、抗体結合部位またはパラトープを含む分子を表すのに使用される。例示の抗体分子は無傷免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子並びにFab、Fab'、F(ab')₂及び F(v)のような当業界で知られている部分を含む免疫グロブリン分子の部分である。抗体結合部位：抗体結合部位は、抗原を特異的に結合する（免疫反応する）Ｈ鎖及びＬ鎖の可変部及び超可変部を含む抗体分子の構造部分である。免疫反応という用語は、その種々の形態で、抗原決定基を含む分子と、抗体結合部位、例えば、全抗体分子またはその一部を含む分子の間の特異的結合を意味する。モノクローナル抗体：モノクローナル抗体は、その種々の文法上の形態で、特別なエピトープと免疫反応できる抗体結合部位の唯一の種を含む抗体分子の集団を表す。こうして、モノクローナル抗体は、典型的には、それが免疫反応するエピトープに対する単一結合アフィニティーを示す。それ故、モノクローナル抗体は、夫々、異なるエピトープに対し免疫特異性の複数の抗体結合部位を有する抗体分子、例えば、二重特異性抗体を含み得る。歴史的に、モノクローナル抗体はクローン上純粋な免疫グロブリン分泌細胞系の不死化により産生されたが、抗体分子のモノクローン上純粋な集団がまた本発明の方法により調製し得る。融合ポリペプチド：少なくとも二つのポリペプチドと、二つのポリペプチド。を一つの連続ポリペプチドに操作により結合する結合配列とを含むポリペプチド融合ポリペプチド中に結合された二つのポリペプチドは典型的には二つの独立の源に由来し、それ故、融合ポリペプチドは自然に通常結合されて存在しない二つの結合されたポリペプチドを含む。上流： DNA転写の方向と逆の方向にあり、それ故、非コードストランドでは5 'から3'へ進み、またmRNAでは3'から5'へ進む。下流：配列転写または読み取りの方向にDNA配列に更に沿って、即ち、DNAの非コードストランドに沿って3'から5'への方向またはRNA転写に沿って5'から3' の方向に移動する。シストロン：アミノ酸残基配列をコードし、かつ上流及び下流のDNA発現調節要素を含むDNA分子中のヌクレオチドの配列。リーダーポリペプチド：ポリペプチドのアミノ末端にあるアミノ酸配列の短い長さ部分（これはポリペプチドを内部の膜に運び、または誘導し、こうして細胞周辺腔への、そしておそらくそれを越えてのその最終の分泌を確実にする）。リーダー配列ペプチドは、普通、ポリペプチドが活性になる前に除去される。読み取り枠：翻訳に使用される連続のヌクレオチドトリプレット（コドン）の特別な配列。読み取り枠は翻訳開始コドンの位置に依存する。 B.ヒトモノクローナル抗体本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対し特異性であり、かつそのウイルスを中和するヒトモノクローナル抗体抗体に関する。本発明の好ましい実施態様において、HIVの糖タンパク質gp120中のエピトープポリペプチド配列を結合し得るヒトモノクローナル抗体が開示される。更に別の好ましい実施態様は、HIVの糖タンパク質gp41中のエピトープポリペプチド配列を結合し得るヒトモノクローナル抗体である。また、特定のアミノ酸配列を有する抗体が開示され、その配列は特定のエピトープを結合し、HIVウイルスがこれらの抗体により結合される場合にHIVを中和する能力を与える。クレームされた特異性を有するヒトモノクローナル抗体、及び同様の特異性を有する同様のヒトモノクローナル抗体が、HIV 誘発疾患の診断及び免疫療法に有益である。 “HIV誘発疾患”という用語は、HIVにより直接または間接に引き起こされるあらゆる疾患を意味する。HIV誘発疾患の例は後天性自己免疫不全症候群(AIDS)、及びHIV感染により引き起こされるAIDSと一般に関連する多数の症状のあらゆるものである。こうして、一局面において、本発明は、HIV中和部位と反応性であるヒトモノクローナル抗体及びこのような抗体を産生する細胞系に関する。本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞系の単離が本明細書に更に詳しく説明され、本明細書に記載されたファージミドベクターライブラリー方法を使用し、かつ関係するモノクローナル抗体の基本免疫反応及び中和パターンの測定を可能にするルーチンスクリーニング技術を使用して達成し得る。こうして、試験されるヒトモノクローナル抗体が本発明の細胞系により産生されたヒトモノクローナル抗体と同様の方法でHIVを結合し、中和する場合、その試験抗体は本発明の抗体と均等であると考えられる。ヒトモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ（即ち、均等の）特異性を有するかどうかを、前者が後者をHIVに結合することから阻止するか否かを確かめることにより、無用な実験をしないで、測定することがまた可能である。試験されるヒトモノクローナル抗体が、固相抗原、例えば、gp120への結合に関する通常の競合アッセイにおける本発明のヒトモノクローナル抗体による結合の低下により示されるように、本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する場合には、おそらく二つのモノクローナル抗体は同じエピトープ、または密接に関連したエピトープに結合する。ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性を有するか否かを測定する更に別の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を、それが通常反応性であるHIVでインキュベートし、次いで試験されるヒトモノクローナル抗体を添加して試験されるヒトモノクローナル抗体がHIVを結合するその能力において抑制されるかどうかを測定することである。試験されるヒトモノクローナル抗体が抑制される場合には、十中八九、それは本発明のモノクローナル抗体と同じか、または機能上均等なエピトープ特異性を有する。また、本発明のヒトモノクローナル抗体のスクリーニングは、HIV中和アッセイを使用し、そしてモノクローナル抗体がHIVを中和するか否かを測定して行い得る。ウイルス感染の一つ以上の段階でHIVを中和する能力は、本発明のヒトモノクローナル抗体の望ましい特性である。ウイルス中和は、種々の試験管内方法及び生体内方法により測定し得る。中和の能力を測定するための本明細書に記載された例示の方法は、HIV誘発融合細胞形成の抑制を測定する試験管内アッセイ、プラークアッセイ及びHIVで感染された細胞からのコアーp24抗原の排出の抑制を測定するアッセイである。本明細書に示されるように、本発明のヒトモノクローナル抗体の免疫特異性はセロタイプ及び／またはHIVの株にわたって共有されるエピトープに対し誘導でき、またはエピトープに応じて、HIVの単一株に対し特異性であり得る。こうして、好ましいヒトモノクローナル抗体はHIV-1、HIV-2、またはその両方と免疫反応でき、またHIV-1株、IIIB、MN、RF、SF-2、Z2、Z6、CDC4、ELI及び同様の株の一種以上と免疫反応し得る。抗体の免疫特異性、そのHIV中和能、及び抗体がエピトープにつき示す付随のアフィニティーは、抗体が免疫反応するエピトープにより特定される。エピトープ特異性は抗体の免疫グロブリンのＨ鎖の可変領域のアミノ酸残基配列により少なくとも一部特定され、またＬ鎖可変領域アミノ酸残基配列により一部特定される。好ましいヒトモノクローナル抗体は糖タンパク質gp120のCD4結合部位と免疫反応する。本発明の好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号66、67、68、70、72、 73、74、75、78及び97、並びにこれらの保存置換からなる配列の群から選ばれたＨ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。本発明の別の好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号95、96、97、98、 101、102、103、104、105、107、110、115、118、121、122、124及び132、並びにこれらの保存置換からなる配列の群から選ばれたＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。更に別の好ましいヒトモノクローナル抗体は糖タンパク質gp41のCD4結合部位と免疫反応する。本発明の好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号142、1 43、144、145、及び146並びにこれらの保存置換からなる配列の群から選ばれたＨ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。本発明の別の好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号147、148、149、1 50、及び151並びにこれらの保存置換からなる配列の群から選ばれたＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を有するモノクローナル抗体のgp41結合特異性を有する。本発明の教示により示されるように、また結合性ライブラリーシャッフリング方法及びスクリーニング方法を使用して、HIV中和モノクローナル抗体として機能する新規なＨ鎖とＬ鎖の対(H:L)を同定することができる。特に、HIV中和ヒトモノクローナル抗体から誘導された既知のＨ鎖を、Ｌ鎖のライブラリーでシャッフルして本発明の機能性抗体を形成する新規なH:L対を同定することができる。同様に、HIV中和ヒトモノクローナル抗体から誘導された既知のＬ鎖を、Ｈ鎖のライブラリーでシャッフルして本発明の機能性抗体を形成する新規なH:L対を同定することができる特に好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号66:95、67:96、72:102、 66:97、73:107、74:103、70:101、68:98、75:104、72:105、78:110、66:118、66 :122、66:121、66:115、97:124、97:132及び66:98、並びにこれらの保存置換からなる群から選ばれた対(H:L)中のＨ鎖及びＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を有するモノクローナル抗体のgp120免疫反応（結合）特異性を有する抗体である。コロンを有する二つの配列番号の表示、例えば、66:95は、夫々、配列番号66及び配列番号95に示された、夫々、Ｈ鎖及びＬ鎖、アミノ酸残基配列により形成されたH:L対を意味する。更に別の好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号142:147、143:148、14 4:149、145:150、及び146:151、並びにこれらの保存置換からなる群から選ばれた対(H:L)中のＨ鎖及びＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を有するモノクローナル抗体のgp41免疫反応（結合）特異性を有する抗体である。本明細書に更に記載されるように、ATCCに寄託されたE.coli微生物により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を有するヒトモノクローナル抗体が特に好ましい。 ATCC69078、69079及び69080と指定されたE.coli微生物により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を有するヒトモノクローナル抗体が特に好ましい。 “結合特異性を有する”は、同一または類似の免疫反応及び中和特性を示し、かつHIV抗原への結合につき競合する均等なモノクローナル抗体を意味する。ATCC6 9078、69079及び69080により産生されたヒトモノクローナル抗体が好ましい。本明細書に使用される“保存変異”という用語は、その他の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を表す。保存変異の例として、その他に代えて一つの疎水性残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンの置換、またはその他に代えて一つの極性残基の置換、例えば、リシンに代えてアルギニン、アスパラギン酸に代えてグルタミン酸、もしくはアスパラギンに代えてグルタミン、等の置換が挙げられる。また、“保存変異”という用語は、置換されたポリペプチドを有する抗体がまたHIVを中和することを条件として、未置換親アミノ酸に代えて置換アミノ酸の使用を含む。同様に、本発明の別の好ましい実施態様は、上記のＨ鎖ポリペプチド及び／またはＬ鎖ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またこれらのポリヌクレオチド配列に相補性であるポリヌクレオチド配列に関する。相補性ポリヌクレオチド配列として、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリッドを形成する配列が挙げられる。本発明のヒトモノクローナル抗体を使用することにより、ヒトモノクローナル抗体をスクリーニングして抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と同じ結合特異性を有するか否かを同定するのに使用でき、また活性免疫化(Herlynら，Sci-e nce,232:100(1986))に使用できる抗イディオタイプ抗体を産生することが今や可能である。このような抗イディオタイプ抗体は、公知のハイブリドーマ技術(Koh lerら，Nature,256:495(1975))を使用して産生し得る。抗イディオタイプ抗体は、関係する細胞系により産生されたヒトモノクローナル抗体に存在する特異な決定基を認識する抗体である。これらの決定基は抗体の超可変領域中に配置される。所定のエピトープに結合し、こうして抗体の特異性の原因であるのは、この領域である。抗イディオタイプ抗体は、動物を関係するモノクローナル抗体で免疫化することにより調製し得る。免疫された動物は免疫化抗体のイディオタイプ決定基を認識し、その決定基に応答して、これらのイディオタイプ決定基に対し抗体を産生するであろう。免疫された動物の抗イディオタイプ抗体（これらは第二の動物を免疫するのに使用された細胞系により産生された本発明のヒトモノクローナル抗体に対し特異性である）を使用することにより、免疫化に使用されたハイブリドーマの抗体と同じイディオタイプを有するその他のクローンを同定することが今や可能である。二つの細胞系のヒトモノクローナル抗体の間のイディオタイプ同一性は、二つのモノクローナル抗体が同じエピトープ決定基のそれらの認識に関して同じものであることを実証する。こうして、抗イディオタイプ抗体を使用することにより、同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を発現するその他のハイブリドーマを同定することが可能である。また、抗イディオタイプ技術を使用してエピトープを模擬するモノクローナル抗体を産生することが可能である。例えば、第一モノクローナル抗体に対しつくられた抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第一モノクローナル抗体により結合されたエピトープの“像”である超可変領域中に結合ドメインを有するであろう。こうして、抗イディオタイプモノクローナル抗体は免疫化に使用し得る。何となれば、抗イディオタイプモノクローナル抗体結合ドメインが抗原として有効に作用するからである。一つの好ましい実施態様において、本発明は本発明のヒトモノクローナル抗体から誘導されたFabフラグメントを含むトランケート免疫グロブリン分子を意図している。Fcレセプターを欠いているFabフラグメントは可溶性であり、また血清半減期に治療の利点を与え、また可溶性Fabフラグメントを使用するモードで診断上の利点を与える。可溶性Fabフラグメントの調製は一般に免疫技術で知られており、種々の方法により行い得る。可溶性Fabフラグメントの好ましい産生方法が本明細書に記載される。 C.免疫療法及び組成物ヒトモノクローナル抗体はまたHIV疾患に対し免疫療法に使用し得る。本発明のモノクローナル抗体と併せて本明細書に使用される“免疫療法に”または“免疫療法”という用語は、予防投与だけでなく、治療投与の両方を表す。こうして、モノクローナル抗体は、HIV誘発疾患の可能性及び／または重度を軽減するために高リスクの患者に投与でき、活性HIV感染を既に明らかに示している患者に投与でき、またはHIV感染のおそれのある患者に投与できる。 1.治療組成物それ故、本発明は、本明細書に記載された治療方法を実施するのに有益な治療組成物を意図している。本発明の治療組成物は、生理学上許される担体と一緒に、活性成分としてその中に溶解または分散された少なくとも一種の本明細書に記載されたヒトモノクローナル抗体を含む。好ましい実施態様において、治療組成物は、その目的が本明細書のいずれかに記載されているような免疫応答を誘発することではない限り、治療目的でヒト患者に投与される場合には免疫原性ではない。本明細書に使用される“医薬上許される”、“生理学上許される”及びそれらが組成物、担体、希釈剤及び試薬を表すようなこれらの文法上の変形は、互換可能に使用され、そしてこれらの物質が悪心、目眩、胃の不調、等の如き望ましくない生理作用を生じないでヒトに投与し得ることを表す。医薬組成物に溶解または分散された活性成分を含む医薬組成物の調製は、当業界で良く理解されている。典型的には、このような組成物は、水性または非水性の液体溶液または懸濁液のような無菌注射液として調製されるが、使用前の液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態がまた調製し得る。また、製剤は乳化し得る。活性成分は、医薬上許され、かつ活性成分と適合性であり、また本明細書に記載された治療方法における使用に適した量である賦形剤と混合し得る。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、等及びこれらの組み合わせである。加えて、所望により、組成物は少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、等を含んでいてもよく、これらは活性成分の有効性を増強する。本発明の治療組成物は、その中に成分の医薬上許される塩を含んでいてもよい。医薬上許される塩として、酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基により生成される）が挙げられ、これらは無機酸、例えば、塩酸もしくはリン酸、または有機酸、例えば、酢酸、酒石酸、マンデル酸、等により生成される。遊離カルボキシル基により生成される塩はまた無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化第二鉄、また有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン、等から誘導し得る。生理学上許される担体は当業界で公知である。液体担体の例は、活性成分及び水の他に物質を含まず、または緩衝剤、例えば、生理pH値のリン酸ナトリウム、生理食塩水もしくはこれらの両方、例えば、食塩加リン酸緩衝液を含む無菌水性溶液である。更に、水性担体は一種より多い緩衝塩だけでなく、塩化ナトリウム及び塩化カリウムの如き塩、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール及びその他の溶質を含んでもよい。また、液体組成物は、水に加えて、また水を除いて、液相を含んでもよい。このような付加的な液相の例は、グリセリン、植物油、例えば、綿実油、有機エステル、例えば、オレイン酸エチル、及び水−油エマルションである。治療組成物は、典型的には、全治療組成物の重量当たり少なくとも0.1重量％の抗体の量の本発明のHIV中和ヒトモノクローナル抗体を含む。重量％は抗体対全組成物の重量比である。こうして、例えば、0.1重量％は全組成物100g当たり 0.1gの抗体である。 2.治療方法本発明のヒトモノクローナル抗体の実証されたHIV中和能力に鑑みて、本開示はHIVを試験管内または生体内で中和する方法を提供する。その方法は、HIVを含むと考えられる試料を治療有効量の本発明のヒトモノクローナル抗体を含む組成物と接触させることを特徴とする。生体内の様式につき、その方法は本発明のヒトモノクローナル抗体を含む治療有効量の生理学上許される組成物を患者に投与することを特徴とする。こうして、本発明は一実施態様において本発明の免疫治療有効量のモノクローナル抗体をヒトに投与することを特徴とするヒトのHIV疾患の受動免疫療法を記載する。本発明の受動免疫療法を実施するのに代表的な患者は、HIV感染により引き起こされると考えられるAIDSまたは関連症状を含むHIV誘発疾患の兆候を示すヒト、及びHIV感染のおそれのあるヒトである。HIVによる感染のおそれのある患者は HIV感染した妊婦の赤ん坊、HIVを含むと知られている輸血のレシピエント、HIV 汚染針の使用者、知られているHIV感染個人との高リスクの性行動に関与した個人、及び同様のリスクの状況を含む。一実施態様において、受動免疫化方法は、好ましくは非競合エピトープに対し誘導され、またはHIVの異なるセロタイプもしくは株に対し誘導された一種より多い本発明のヒトモノクローナル抗体を含む組成物を投与して受動免疫療法の増大された有効性を与えることを特徴とする。ヒトモノクローナル抗体の治療（免疫治療）上有効な量は、所望の効果を得、即ち、試料または患者中に存在するHIVを中和し、それにより試料または患者中の検出可能なHIVの量を減少すると計算された前もって決められた量である。生体内治療の場合、有効量は患者に生じるHIV誘発疾患と関連する一つ以上の兆候の改善、またはHIV抗原の血清学的減少により測定し得る。こうして、本発明のモノクローナル抗体の投与の投薬量範囲は、HIV疾患の兆候が軽減され、または感染の可能性が低下される所望の効果を生じるのに充分に大きな範囲である。投薬量は副作用、例えは、過粘稠度症候群、肺水腫、鬱血性心不全、等を生じる程に大きくてはならない。一般に、投薬量は、患者の年齢、症状、性別及び疾患の程度により変化し、当業者により決定し得る。投薬量は合併症の場合に個々の医師により調節し得る。本発明の抗体の治療有効量は、典型的には、生理学上許される組成物中で投与される場合、約0.1マイクログラム(μg)／ミリリットル(ml)〜約100μg/ml、好ましくは約１μg/ml〜約５μg/ml、通常、約５μg/mlの血漿濃度を得るのに充分であるような抗体の量である。換言すれば、投薬量は、１日または数日にわたって、毎日１回以上の投与で、約0.1mg/kg〜約300mg/kg、好ましくは約0.2mg/kg〜約200mg/kg、最も好ましくは約0.5mg/kg〜約20mg/kgで変化し得る。本発明のヒトモノクローナル抗体は注射または経時の徐々の注入により非経口投与し得る。HIV感染は典型的には全身性であり、それ故、殆どの場合には治療組成物の静脈内投与により治療されるが、標的組織が感染性HIVを含む可能性がある場合にはその他の組織及び送出手段が意図されている。こうして、本発明のヒトモノクローナル抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮投与でき、またぜん動性装置により送出し得る。本発明のヒトモノクローナル抗体を含む治療組成物は、通常、例えば、単位投薬量の注射によるように静脈内投与される。本発明の治療組成物に関して使用される場合の“単位投薬量”という用語は、患者の単位投薬量として適した物理的に別個の単位を表し、夫々の単位が必要とされる希釈剤、即ち、担体、またはビヒクルと混在して所望の治療効果を生じるように計算された活性物質の前もって決められた量を含む。組成物は、投薬製剤と適合する方法で、治療有効量で投与される。投与される量は、治療される患者、活性成分を使用する患者の系の能力、及び所望される治療効果の程度に依存する。投与されるのに必要とされる活性成分の正確な量は、開業医の判断に依存し、また夫々の個人につき特別である。しかしながら、全身適用に適した投薬量範囲が本明細書に開示され、また投与の経路に依存する。投与に適したレジメはまた可変であるが、初期投与、続いてその後の注射またはその他の投与による１回以上の時間間隔における反復投薬により代表される。また、血液中の濃度を生体内療法に明記された範囲に保つのに充分な連続の静脈内注入が意図されている。有効量のモノクローナル抗体の投与の助けとして、患者の血液中のモノクローナル抗体を検出する診断方法が、投与された治療組成物の運命を特徴付けるのに有益である。また、本発明は本発明のヒトモノクローナル抗体を含む薬剤または医薬組成物の調製方法に関するものであり、その薬剤はHIV疾患の免疫療法に使用される。 D.診断アッセイ方法本発明は、免疫化学試薬として本発明のヒトモノクローナル抗体を使用して免疫反応生成物（その量は試料中のHIVの量に直接または間接に関係する）を生成して試料、例えば、生物液または組織試料中のHIVの存在、好ましくはその量を測定するための種々のアッセイ方法を意図している。当業者は、本発明の免疫化学試薬が免疫反応生成物（その量は生体試料中に存在するHIVの量に関係する）を生成するのに使用し得る多数の公知の臨床診断化学操作があることを理解するであろう。こうして、例示のアッセイ方法が本明細書に記載されるが、本発明はこのように限定されない。競合または非競合の種々の不均一プロトコル及び均一プロトコルが、本発明のアッセイ方法を行うのに使用し得る。本発明のモノクローナル抗体を使用し得るイムノアッセイの型の例は、直接フォーマットまたは間接フォーマットの競合イムノアッセイ及び非競合イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例はラジオイムノアッセイ(RIA)及びサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイである。本発明のモノクローナル抗体を使用する抗原の検出は、生理学的試料に関する免疫組織化学アッセイを含むイムノアッセイ（これらは前進モード、反転モード、または同時モードで実施される）を使用して行い得る。当業者は、無用の実験を行わないでその他のイムノアッセイフォーマットを知り、また容易に認めることができる。本発明のモノクローナル抗体は多くの異なる担体に結合でき、そしてHIVの存在を検出するのに使用し得る。公知の担体の例として、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロース及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース及びマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のために可溶性または不溶性であってもよい。当業者はモノクローナル抗体を結合するのに適したその他の担体を知るであろうし、またルーチン実験を使用してこのような担体を確かめることができるであろう。当業者に知られている多くの異なる標識及び標識方法がある。本発明に使用し得る標識の型の例として、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、ケミルミネッセンス化合物、及びバイオルミネッセンス化合物が挙げられる。当業者は本発明のモノクローナル抗体への結合に適したその他の標識を知るであろうし、またルーチン実験を使用してこのようなものを確かめることができるであろう。更に、本発明のモノクローナル抗体へのこれらの標識の結合は、当業者に普通の通常の技術を使用して行い得る。本発明の目的のために、HIVは生物液及び組織の試料中に存在する場合に本発明のモノクローナル抗体により検出し得る。検出可能な量のHIVを含むあらゆる試料が使用し得る。試料は液体、例えば、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清、等、または固体もしくは半固体、例えば、組織、糞便、等、または固体組織、例えば、組織診断に普通使用される固体組織であってもよい。更に大きな感度をもたらし得るその他の標識技術は、抗体を低分子量のハプテンにカップリングすることからなる。次いでこれらのハプテンが第二反応により特異的に検出し得る。例えば、ビオチンの如きハプテンを使用することが普通であり、これはアビジン、またはジニトロフェノール、ピリドキサール、もしくはフルオレセインと反応し、これらは特異性抗ハプテン抗体と反応できる。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、イムノアッセイにおいて試験管内の使用に適しており、この場合、それらは上記の試料中のHIVの検出のために液相中で使用でき、または固相担体に結合し得る。これらのイムノアッセイにおけるモノクローナル抗体は試験管内の使用のために種々の方法で検出可能に標識し得る。抗原の生体内検出のために本発明のヒトモノクローナル抗体を使用する際に、検出可能に標識されたヒトモノクローナル抗体が、診断上有効である投与量で投与される。“診断上有効”という用語は、検出可能に標識されたヒトモノクローナル抗体の量がモノクローナル抗体が特異性であるHIV抗原を有する部位の検出を可能にするのに充分な量で投与されることを意味する。投与される検出可能に標識されたヒトモノクローナル抗体の濃度は、HIVへの結合がバックグラウンドと比較して検出可能であるような充分な濃度であるべきである。更に、検出可能に標識されたモノクローナル抗体は、最良の標的対バックグラウンドシグナル比を与えるために循環系から迅速に除去されることが望ましい。一般に、生体内診断のための検出可能に標識されたヒトモノクローナル抗体の投与量は、個人の年齢、性別、及び疾患の程度の如き因子に応じて変化するであろう。ヒトモノクローナル抗体の投与量は、約0.01mg/m²から約500mg/m²まで、好ましくは0.1mg/m²から約200mg/m²まで、最も好ましくは約0.1mg/m²から約10mg /m²まで変化し得る。このような投与量は、例えば、多重注射が投与されるか否か、組織、及び当業者に知られているその他の因子に応じて変化し得る。生体内の診断画像形成につき、利用できる検出装置の型は所定の放射性同位元素を選択する際の重要な因子である。選択される放射性同位元素は、装置の所定の型につき検出可能である崩壊の型を有する必要がある。生体内の診断につき放射性同位元素を選択する際の更に別の重要な因子は、放射性同位元素が標的による最大の摂取の時点で以前として検出可能であるように放射性同位元素の半減期が充分に長いが、宿主に関して有害な放射線が最小にされるように充分に短いことである。理想的には、生体内の画像形成に使用される放射性同位元素は粒子放出を欠いているが、140〜250keVの範囲の多数の光子を生じ、これらが通常のガンマカメラにより容易に検出し得る。生体内の診断につき、放射性同位元素は、中間体官能基を使用することにより直接または間接に免疫グロブリンに結合し得る。金属イオンとして存在する放射性同位元素を免疫グロブリンに結合するのにしばしば使用される中間体官能基は二官能キレート剤、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTPA)及びエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)並びに同様の分子である。本発明のモノクローナル抗体に結合し得る金属イオンの典型的な例は、¹¹¹In、⁹⁷Ru、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As 、⁸⁹Zr、及び²⁰¹Tlである。また、本発明のモノクローナル抗体は、磁気共鳴画像形成(MRI)または電子スピン共鳴(ESR)の場合のような生体内診断の目的で常磁性同位体で標識し得る。一般に、診断画像を視覚化するためのあらゆる通常の方法が使用し得る。通常、 γ線放出同位元素及び陽電子放出同位元素がカメラ画像形成に使用され、常磁性同位体がMRIに使用される。このような技術に特に有益である元素として、¹⁵⁷Gd 、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Cr、及び⁵⁶Feが挙げられる。本発明のヒトモノクローナル抗体はHIV疾患治療の経過を監視するために試験管内及び生体内で使用し得る。こうして、例えば、HIVで感染された細胞の数の増加もしくは減少または生体中もしくは種々の体液中に存在するHIVの濃度の変化を測定することにより、HIV疾患を回復することを目的とした特別な治療レジメが有効であるか否かを測定することが可能であろう。 E.診断系本発明はまた本明細書に記載された診断方法に従って試料中のHIVの存在につき分析するための診断系、好ましくはキット形態の診断系を記載する。診断系は、少なくとも１回のアッセイを行うのに充分な量の、別々にパッケージされた試薬として主題のヒトモノクローナル抗体を含む。別の実施態様において、治療上投与された抗体の運命を監視するためのような体液試料中の抗HIVモノクローナル抗体の存在につき分析するための診断系が意図されている。その系は、少なくとも１回のアッセイを行うのに充分な量の、対照試薬としての主題抗体、そして好ましくは前もって選択された量のHIV抗原を含み、夫々が免疫化学試薬として別々にパッケージされる。パッケージされた試薬の使用に関する指示がまた典型的に含まれる。 “使用に関する指示”として、典型的には、試薬濃度または少なくとも一つのアッセイ方法パラメーター、例えば、混合される試薬と試料の相対量、試薬／試料混合物の維持期間、温度、緩衝条件、等を記載する明確な表示が挙げられる。体液中のHIVを検出する実施態様において、本発明の診断系は、本発明のヒトモノクローナル抗体を含む免疫複合体の生成を通信できる標識または指示手段を含むことができる。本明細書で使用される“複合体”という用語は、抗体−抗原反応の如き特異的結合反応の生成物を表す。例示の複合体は免疫反応生成物である。本明細書に使用される“標識”及び“指示手段”という用語は、それらの種々の文法上の形態で、複合体の存在を示す検出可能なシグナルの発生に直接または間接に関与する単一の原子及び分子を表す。あらるる標識または指示手段が、本発明の抗体またはモノクローナル抗体組成物の一部である発現タンパク質、ポリペプチド、または抗体分子に結合またはとり込みでき、または別々に使用でき、これらの原子または分子は単独で、または付加的な試薬と一緒に使用し得る。このような標識は臨床診断化学においてそれ自体公知であり、そしてそれらがその他の点で新規なタンパク質の方法及び／または系と共に使用される限り、本発明の一部を構成する。標識手段は、抗体または抗原に、それらを変性しないで、化学的に結合して有益な免疫蛍光トレーサーであるフルオロクロム（色素）を生成する蛍光標識剤であり得る。好適な蛍光標識剤はフルオロクロム、例えば、フルオレセインイソシアネート(FIC)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド(DANSC)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、リサミン、ローダミン8200スルホニルクロリド(RB200S C)等である。免疫蛍光分析技術の説明が、DeLuca，“免疫蛍光分析”,Antibody As a Tool，Marchalonisら編集，John Wiley＆Sons，Ltd.,189-231頁(1982)に見られ、この文献が参考として本明細書に含まれる。好ましい実施態様において、指示基は、酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、グルコースオキシダーゼ、等である。主たる指示基が酵素、例えば、HRPまたはグルコースオキシダーゼである場合、付加的な試薬が、レセプター−リガンド複合体（免疫反応体）が生成した事実を視覚化するのに必要とされる。HRPに関するこのような付加的な試薬として、過酸化水素及び酸化色素前駆体、例えば、ジアミノベンジジンが挙げられる。グルコースオキシダーゼに有益な付加的な試薬は、２，２’−アミノ−ジ−（３−エチル−べンゾチアゾリン−Ｇ−スルホン酸)(ABTS)である。また、放射性元素が有益な標識剤であり、本明細書に例示されるように使用される。例示の放射能標識剤はγ線放出を生じる放射性元素である。それ自体でγ 線を放出する元素、例えば、¹²⁴I、¹²⁵I、¹²⁸I、¹³²I及び⁵¹Crが、γ線放出を生じる放射性元素指示基の一つのクラスを代表する。¹²⁵Iが特に好ましい。有益な標識手段の別の群は、それ自体で陽電子を放出する元素、例えば、¹¹C、¹⁸F、¹⁵ O及び¹³Nである。こうして放出された陽電子は、動物の生体中に存在する電子との遭遇後にγ線を生じる。また、βエミッター、例えば、¹¹¹インジウムまたは³ Hが有益である。ポリペプチド及びタンパク質の標識の結合、即ち、標識化は当業界で公知である。例えば、ハイブリドーマにより産生された抗体分子は、培地の成分として用意された放射性同位元素を含むアミノ酸の代謝とり込みにより標識し得る。例えば、Galfreら，Meth.Enzymol.，73:3-46(1981)を参照のこと。活性化された官能基によるタンパク質接合またはカップリングの技術が特に適用可能である。例えば、Aurameasら，Scand.J.Immunol.，8巻、補遺7:7-23(1978)、Rodwellら，Biot ech.，3:889-894(1984)、及び米国特許第4,493,795号明細書を参照のこと。また、診断系は、好ましくは別個のパッケージとして、特異的結合剤を含み得る。“特異的結合剤”は、本発明の試薬種またはこのような種を含む複合体を選択的に結合できる分子そのものであるが、それ自体、本発明のポリペプチドまたは抗体分子組成物ではない。例示の特異的結合剤は二次抗体分子、補体タンパク質またはこれらのフラグメント、S.アウレウス(aureus)プロテインＡ、等である。特異的結合剤は、その種が複合体の一部として存在する場合には試薬種を結合することが好ましい。好ましい実施態様において、特異的結合剤は標識される。しかしながら、診断系が標識されていない特異的結合剤を含む場合、その薬剤は典型的には増幅手段または試薬として使用される。これらの実施態様において、標識された特異的結合剤は、増幅手段が試薬種を含む複合体に結合される場合に増幅手段を特異的に結合できる。本発明の診断キットは、“ELISA”フォーマットに使用されて血管の液体試料、例えば、血液、血清、または血漿中の本発明のAPCインヒビターの量を検出し得る。“ELISA”は、固相に結合された抗体または抗原及び酵素−抗原接合体または酵素−抗体接合体を使用して試料中に存在する抗原の量を検出し、定量する酵素結合免疫吸着検定法を表す。ELISA技術の説明が、1982年にロスアルトス，C Aの Lange Medical Publicationsにより発行されたD.P.Sitesら著、Basic and Cli-n ical Immunologyの第４編の22章並びに米国特許第3，654，090号、同第3，850， 752号、及び同第4，016，043号明細書に見られ、これらは全て参考として本明細書に含まれる。こうして、幾つかの実施態様において、本発明のヒトモノクローナル抗体は固体マトリックスに固定されて主題診断系中にパッケージを含む固相担体を形成し得る。試薬は典型的には水性媒体からの吸着により固相マトリックスに固定されるが、当業者に公知のタンパク質及びポリペプチドに適用できる固定のその他のモードが使用し得る。また、有益な固体マトリックスが当業界で公知である。このような材料は水不溶性であり、ファーマシア・ファイン・ケミカルズ（ピスキャットアウェー、NJ ）から商品名セファデックス（SEPHADEX）として市販されている架橋デキストラン；アガロース；ノースシカゴ、ILのアボット・ラボラトリィズから市販されている直径約１ミクロン〜約５ミリメートルのポリスチレンのビーズ；ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルロースもしくはナイロンをベースとするウェブ、例えば、シート、ストリップまたはパドル；またはチューブ、プレートもしくはマイクロタイタプレートのウェル、例えば、ポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルからつくられたものを含む。本明細書に記載された診断系の試薬種、標識された特異的結合剤または増幅試薬は、分散液として溶液で用意でき、または実質的に乾燥粉末として、例えば、凍結乾燥形態で用意し得る。指示手段が酵素である場合、酵素の基質がまた系の別個のパッケージ中に用意し得る。また、固相担体、例えば、前記マイクロタイタプレート及び一種以上の緩衝液が、この診断アッセイ系中に別々にパッケージされた要素として含まれていてもよい。診断系に関して本明細書に説明されたパッケージング材料は、診断系に慣用されているものである。 “パッケージ”という用語は、固定した制限内で本発明のモノクローナル抗体の如き診断試薬を保持できる固体マトリックスまたはガラス、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリカーボネート）、紙、箔、等の如き材料を表す。こうして、例えば、パッケージは、意図される診断試薬を入れるのに使用されるビン、バイアル、プラスチック及びプラスチック−箔積層エンベロープ、等の容器であってもよく、またはそれはマイクログラム量の意図される診断試薬が操作により定着された、即ち、検出される抗体またはポリペプチドにより免疫学的に結合され得るように結合されたマイクロタイタプレートウェルであってもよい。本発明のアッセイに使用するための材料は、キットの調製に理想的に適している。このようなキットは、区画されて一種以上の容器装置、例えば、バイアル、チューブ、等を密に閉じ込めて収容するキャリヤー装置を含み、その容器装置の夫々がその方法に使用される別個の要素の一つを含む。例えば、容器装置の一つは、検出可能に標識され、または検出可能に標識し得る本発明のヒトモノクローナル抗体を含んでいてもよい。また、キットは診断方法を実施するのに使用される上記のその他の免疫化学試薬のいずれかを含む容器を有していてもよい。 F．HIV中和ヒトモノクローナル抗体の産生方法本発明は新規なHIV中和ヒトモノクローナル抗体の産生方法を記載する。その方法は一般に種々の源から産生でき、またナイーブライブラリー、修飾ライブラリー、及びHIV特異性免疫応答を示すヒトドナーから直接生産されたライブラリーを含む抗体分子の結合性ライブラリーの使用に基いている。結合性ライブラリーの生産及び操作方法は文献に広範に記載されており、本発明の特異な実施態様をつくり、使用するのに必要とされる特徴を除いて、本明細書中に詳しく概説されないであろう。しかしながら、その方法は一般にライブラリーの抗体種をクローン化し、発現するための繊維状ファージ（ファージミド）表面発現ベクター系の使用を伴う。結合性ライブラリーを生産するための種々のファージミドクローニング系が他人により記載されている。例えば、Kangら，Pr oc.Natl.Acad.Sci.，USA，884363-4366（1991）；Barbasら，Proc.Natl.Acad．S ci.，USA，88:7978-7982（1991）；Zebedeeら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89 ：3175-3179（1992）；Kangら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88:11120-11123（1 991）；Barbasら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89:4457-4461（1992）；及びGra mら，Proc． Natl.Acad.Sci.，USA，89:3576-3580（1992）（これらの文献は参考として本明細書に含まれる）により記載されたようなファージミドに関する結合性抗体ライブラリーの調製を参照のこと。一実施態様において、その方法はHIV感染ドナーからのドナー免疫細胞メッセンジャーRNAを使用することによりヒトモノクローナル抗体のファージミドライブラリーを調製することを伴う。ドナーはAIDSの症状のものであってもよいが、好ましい実施態様において、ドナーは無症候性である。何となれば、得られるライブラリーがかなり多数のHIV中和ヒトモノクローナル抗体を含むからである。別の実施態様において、ドナーはHIVに対する免疫応答に関してナイーブであり、即ち、ドナーはHIV感染されていない。また、ライブラリーは合成されたものであってもよく、またはその他の抗原に対して免疫応答を有するドナーから誘導し得る。ヒトモノクローナル抗体の産生方法は一般に（1）ライブラリーの源としてヒト免疫グロブリン遺伝子を使用して別個のＨ鎖コード遺伝子ライブラリー及びＬ鎖コード遺伝子ライブラリーをクローニングベクター中で調製し、（2）Ｈ鎖コード遺伝子ライブラリー及びＬ鎖コード遺伝子ライブラリーを、ヘテロダイマー抗体分子を発現し、構築し得る単一ジシストロニック発現ベクター中に組み合わせ、（3）構築されたヘテロダイマー抗体分子を繊維状ファージ粒子の表面で発現し、（4）前もって選択された抗原に対するファージ粒子のパンニングの如きイムノアフィニティー技術を使用して表面発現ファージ粒子を単離し、それにより特別なＨ鎖コード遺伝子及びＬ鎖コード遺伝子並びに前もって選択された抗原と免疫反応する抗体分子を含む一種以上のファージミドを単離することを伴う。本明細書の実施例に記載されるように、得られるファージミドライブラリーは、ライブラリーのモノクローナル抗体の免疫特異性を増大し、かつ／または変更するように操作されて本発明の付加的な望ましいヒトモノクローナル抗体を産生し、続いて同定し得る。例えば、Ｈ鎖及びＬ鎖免疫グロブリン分子をコードする遺伝子がランダムに混合（シャッフル）されて構築免疫グロブリン分子中に新規なHL対を生じることができる。また、Ｈ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子のいずれかまたは両方が免疫グロブリンポリペプチドの可変領域の相補性決定領域（CDR）中で突然変異誘発され、続いて望ましい免疫反応及び中和の能力につきスクリーニングし得る。一実施態様において、Ｈ遺伝子及びＬ遺伝子は、本明細書中に更に記載される “２成分”系と称される別個のモノシストロニック（monocistronic）発現ベクター中にクローン化し得る。この方法において、上記の工程（2）は、Ｈ鎖コード遺伝子及びＬ鎖コード遺伝子の組み合わせが表面接近可能な抗体ヘテロダイマー分子を有するファージミドの発現及び構築のための単一宿主細胞への二つの２成分プラスミドの同時導入により生じる点で異なる。一つのシャッフリング実施態様において、シャッフリングは実施例６に記載されるように２成分発現ベクターで行うことができ、夫々が単一のＨ鎖コード遺伝子またはＬ鎖コード遺伝子を発現できる。本発明の方法において、抗体分子はモノクローナルである。何となれば、クローニング方法が抗体産生細胞系のクローン上純粋な種の調製を可能にするからである。加えて、モノクローナル抗体はヒトである。何となれば、Ｈ鎖コード遺伝子及びＬ鎖コード遺伝子がヒト免疫グロブリン産生免疫細胞、例えば、脾臓、胸腺、骨髄、等から誘導されるからである。また、HIV中和ヒトモノクローナル抗体の産生方法は、前もって選択されたHIV 抗原と免疫反応性の得られる抗体ライブラリーが中和能を測定するための一つ以上の本明細書に記載されたアッセイにおいてHIVを中和する能力を有する抗体種の存在につきスクリーニングされることを必要とする。こうして、抗体分子の好ましいライブラリーが最初に産生され（これはHIV抗原、好ましくは、gp160、gp 120、gp41、gp160のV3ループ領域、またはgp120及びgp41のCD4結合部位に結合する）、次いで本明細書に記載されたようにしてHIV中和抗体につきスクリーニングされる。付加的なライブラリーが、シャッフリングされたライブラリーから付加的なHI V免疫反応性かつ中和ヒトモノクローナル抗体につきスクリーニングし得る。本発明の更に別の特徴として、抗体分子のＨ鎖コード遺伝子またはＬ鎖コード遺伝子のヌクレオチド及び相当するアミノ酸残基配列が、核酸配列決定により決定される。一次アミノ酸残基配列情報は、抗体分子のエピトープ反応性に関する必須の情報を与える。同定されたHIV免疫反応性モノクローナル抗体可変鎖領域配列の配列比較が図1 0〜13に示される。配列は配列相同性に基いて整列され、それにより関連抗体分子のグループが同定され、この場合、Ｈ鎖遺伝子またはＬ鎖遺伝子がかなりの配列相同性を共有する。ヒトモノクローナル抗体の例示の調製が実施例に記載される。関係する抗体を発現できる特別なベクターの単離は、繊維状ファージ遺伝子の発現及びファージ粒子のアッセンブリーを許す宿主細胞へのジシストロニック発現ベクターの導入を伴う。２成分ベクター系が使用される場合、両方のベクターが宿主細胞中に導入される。典型的には、宿主はE.coliである。その後、ヘルパーファージゲノムが一種以上の免疫グロブリン発現ベクターを含む宿主細胞に導入されてファージ粒子を構築させるのに必要な遺伝子相補性を与える。得られる宿主細胞は培養されて導入されたファージ遺伝子及び免疫グロブリン遺伝子が発現されることを可能にし、またファージ粒子が宿主細胞から構築され、放出されることを可能にする。次いで放出されたファージ粒子が宿主細胞培地から回収され、そして望ましい免疫反応及び中和特性につきスクリーニングされる。典型的には、回収粒子が前もって選択された抗原との免疫反応につき“パンニングされる”。次いで強い免疫反応性粒子が回収され、粒子の個々の種がクローン単離され、更にHIV中和につきスクリーニングされる。中和抗体を産生するファージが選択され、本発明のヒトHIV中和モノクローナル抗体の源として使用される。また、本発明のヒトモノクローナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体のＨ鎖またはＬ鎖をコードするポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を変更することにより産生し得る。例えば、部位誘導突然変異誘発により、発現ベクターのヌクレオチド配列を変更することができ、それにより得られる発現されたアミノ酸残基配列の変化を導入することができる。こうして、例えば、配列番号66のポリヌクレオチドを得、それを配列番号67のポリヌクレオチドに変換することができる。同様に、既知のポリヌクレオチドを得、それをランダム突然変異誘発によりランダムに変更し、変更されたポリヌクレオチドを発現系に再度導入し、続いて生産物H:L対をHIV中和活性につきスクリーニングすることができる。部位誘導され、かつランダムな突然変異誘発方法はポリヌクレオチド技術において公知であり、主題ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を変更する方法として限定するものと見なされるべきではない。イムノアフィニティー単離された抗体中のファージ粒子の存在のために、一実施態様は免疫グロブリンコード遺伝子をトランケートするための得られるクローン化遺伝子の操作を伴い、その結果、可溶性Fabフラグメントがファージミドベクターを含む宿主E.coli細胞により分泌される。こうして、得られる操作されたクローン化免疫グロブリン遺伝子は可溶性Fabを産生し、これはエピトープ結合研究に関するELISAアッセイ、既知の抗HIV抗体分子との競合アッセイ、またHIV 中和アッセイにおいて容易に特性決定し得る。可溶化Fabは比較研究及び特性決定研究のための再現可能かつ相当な抗体製剤を与える。可溶性Fabの調製は一般に免疫技術に記載されており、また実施例2b6)に記載されたようにして、またはBurtonら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88:10134-101 37（1991）により記載されたようにして行い得る。 G．抗HIVモノクローナル抗体を発現するための発現ベクター及びポリヌクレオチド本発明のヒトモノクローナル抗体の調製は、一実施態様において、本明細書に記載された結合性抗体ライブラリーを調製するのに使用されるクローニングベクター及び発現ベクターに依存する。クローン化免疫グロブリンＨ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子は、本明細書に記載された方法の種々の段階でλベクター、ファージミドベクター及びプラスミドベクターの間でシャトルし得る。ファージミドベクターは、構築された繊維状ファージ粒子の表面で発現される融合タンパク質を生産する。本発明の好ましいファージミドベクターは、アミノ末端からカルボキシ末端への方向に、（1）原核生物分泌シグナルドメイン、（2）免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖可変領域を形成する異種ポリペプチド、及び（3）繊維状ファージ膜アンカードメインを含む融合ポリペプチドをコードし、そしてそれを発現できるヌクレオチド配列を含む組換えDNA（rDNA）分子である。そのベクターは、融合ポリペプチドを発現するためのDNA発現調節配列、好ましくは原核生物調節配列を含む。繊維状ファージ膜アンカーは、繊維状ファージ粒子のマトリックスと会合でき、それにより融合ポリペプチドをファージ表面にとり込むことができるcpIII外殻タンパク質またはcpVIII外殻タンパク質のドメインであることが好ましい。分泌シグナルは、タンパク質にグラム陰性バクテリアの周辺質膜を標的とさせるタンパク質のリーダーペプチドドメインである。好ましい分泌シグナルはpelB 分泌シグナルである。エルビニア・カロトバ（Erwinia carotova）からの二つの pelB遺伝子産物変異体からの分泌シグナルドメインの予測アミノ酸残基配列が、 Leiら，Nature，331:543-546（1988）により記載されている。 pelBタンパク質のリーダー配列が、融合タンパク質の分泌シグナルとして既に使用されていた（Betterら，Science，240:1041-1043（1988）；Sastryら，Proc .Natl.Acad.Sci.，USA，86:5728-5732（1989）；及びMullinaxら，Proc.Natl.Ac ad.Sci.，USA，87:8095-8099（1990））。Oliver，エシェリキア・コリ（Escher ichia coli）及びサルモネラ・チフィムリウム（Salmonella Typhimurium），Ne idhard，F.C.編集，米国微生物学協会，ワシントンD.C.，1:56-69（1987）に記載されたような本発明に有益なE.coliからのその他の分泌シグナルポリペプチドドメインのアミノ酸残基配列。ベクターに好ましい膜アンカーは、繊維状ファージM13、f1、fd、及び均等の繊維状ファージから得られる。好ましい膜アンカードメインが遺伝子III及び遺伝子VIIIによりコードされた外殻タンパク質中に見られる。繊維状ファージ外殻タンパク質の膜アンカードメインは外殻タンパク質のカルボキシ末端領域の一部であり、脂質二層膜をスパンするための疎水性アミノ酸残基の領域と、通常その膜の周辺質面に見られ、その膜から離れて伸びる帯電されたアミノ酸残基の領域とを含む。ファージf1中で、遺伝子VIII外殻タンパク質の膜をスパンする領域は残基Trp- 26〜Lys-40を含み、また周辺質領域は41から52までのカルボキシ末端11残基を含む（Ohkawaら，J.Biol.Chem.，256:9951-9958（1981））。例示の膜アンカーはc pVIIIの残基26〜40からなるようである。こうして、好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列がM13繊維状ファージ遺伝子VIII外殻タンパク質（また、c pVIIIまたはCP8と称される）から誘導される。遺伝子VIII外殻タンパク質は、典型的には、外殻タンパク質の約2500〜3000のコピーを含むファージ粒子の大半にわたって成熟繊維状ファージに存在する。加えて、その他の好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列がM13繊維状ファージ遺伝子III外殻タンパク質（また、cpIIIと称される）から誘導される。遺伝子III外殻タンパク質は、典型的には、外殻タンパク質の約４〜６のコピーを含むファージ粒子の一端で成熟繊維状ファージに存在する。繊維状ファージ粒子の構造、それらの外殻タンパク質及び粒子アセンブリーの詳細な説明につき、Rachedら，Microbiol.Rev.，50:401-427（1986）；及びMode lら，“バクテリオファージ：２巻”，R.Calendar編集，Plenum Publishing Co. ，375-456頁，（1988）による総説を参照のこと。 DNA発現調節配列は構造遺伝子産物を発現するためのDNA発現シグナルの組を含み、また公知であるように、シストロンが構造遺伝子産物を発現できるようにシストロンに操作により結合された5'要素及び3'要素の両方を含む。5'調節配列は転写を開始するためのプロモーターと、上流の翻訳可能なDNA配列の5'末端に操作により結合されたリボソーム結合部位とを形成する。 E.coli中の高レベルの遺伝子発現を得るために、強力なプロモーターを使用して多量のmRNAを生じるだけでなく、リボソーム結合部位を使用してmRNAが有効に翻訳されることを確実にすることが必要である。E.coli中で、リボソーム結合部位は開始コドン（AUG）と、開始コドンの上流の配列３〜９のヌクレオチドの長い配置された３〜11のヌクレオチド（Shineら，Nature，254:34（1975））とを含む。配列AGGAGGU（これはシャイン−ダルガーノ（SD）配列と称される）はE.c oli16S rRNAの3'末端に相補性である。mRNA及びmRNAの3'末端にある配列へのリボソームの結合は下記の幾つかの因子により影響され得る。（i）SD配列と16S rRNAの3'末端との間の相補性の程度（ii）SD配列とAUG［Robertsら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，76:760（1979a ）Robertsら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，76:5596（1979b）；Guarenteら，Sci -ence，209:1428（1980）；及びGuarenteら，Cell，20:543（1980）］の間の間隔そしておそらくその間にあるDNA配列最適化は、この間隔が系統的に変化されるプラスミド中の遺伝子の発現のレベルを測定することにより達成される。異なるmRNAの比較は、位置-20から+13まで（この場合、AUGのＡが位置０である）［Goldら，Annu.Rev.Microbiol.，35:365（ 1981）］に統計上好ましい配列があることを示す。リーダー配列が翻訳に著しく影響することが示された（Robertsら，1979 a,b上記文献）。（iii）AUGに続くヌクレオチド配列（これはリボソーム結合に影響する）［Ta n-iguchiら，J.Mol.Biol.，118:533（1978）］ 3'調節配列は、異種融合ポリペプチドとの枠中にあり、かつそのポリペプチドに操作により結合された少なくとも一つの終止コドンを形成する。好ましい実施態様において、使用されるベクターは、複製の原核生物の開始点またはレプリコン、即ち、それで形質転換された原核宿主細胞、例えば、バクテリア宿主細胞の染色体外で組換えDNA分子の直接の自律複製及び維持につき能力を有するDNA配列を含む。このような複製の開始点は当業界で公知である。複製の好ましい開始点は、宿主生物中で有効であるものである。好ましい宿主細胞は E.coliである。E.coli中のベクターの使用につき、複製の好ましい開始点はpBR3 22及び種々のその他の普通のプラスミドに見られるColE1である。また、pACYC及びその誘導体に見られる複製のp15A開始点が好ましい。ColE1レプリコン及びp15 Aレプリコンが分子生物学において広く使用されており、種々のプラスミドにつき入手でき、またSambrookら，“分子クローニング：実験マニュアル”第２編， Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989により少なくとも記載されている。 ColE1レプリコン及びp15Aレプリコンは、二種の“２成分”プラスミドが使用される本発明の一実施態様に使用するのに特に好ましい。何となれば、それらは夫々E.coli中でプラスミドの複製を誘導する能力を有するが、一方、その他のレプリコンは同じE.coli細胞中で第二プラスミド中に存在するからである。換言すれば、ColE1及びp15Aは、同じ宿主中の二つのプラスミドの維持を可能にする非干渉レプリコンである（例えば、Sambrookら，上記文献l.3〜1.頁を参照のこと）。この特徴が本発明の２成分ベクター実施態様に特に重要である。何となれば、ファージ複製に許される単一宿主細胞は、二つの別個のベクター、即ち、Ｈ鎖ポリペプチドを発現するための第一ベクターと、Ｌ鎖ポリペプチドを発現するための第二ベクターの独立かつ同時の複製を支持する必要があるからである。加えて、原核生物レプリコンを含む実施態様はまた発現がそれで形質転換されたバクテリア宿主に薬剤耐性の如き選択的な利点を与える遺伝子を含む。典型的なバクテリアの薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン、テトラサイクリン、ネオマイシン／カナマイシンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を与える遺伝子である。また、ベクターは典型的には翻訳可能なDNA配列の挿入に都合のよい制限部位を含む。例示のベクターは、バイオラド・ラボラトリィズ（リッチモンド、 CA）から入手し得るプラスミドpUC8、pUC9、pBR322、及びpBR329並びにファーマシア（ピスキャットアウェー、NJ）から入手し得るpPL及びpKK223である。繊維状ファージ粒子の表面における本発明のモノクローナル抗体の発現のためのベクターは、第一ポリペプチド及び第二ポリペプチドの形態の翻訳可能な第一 DNA配列及び第二DNA配列を受取り、かつ発現するのに適した組換えDNA（rDNA）分子であり、この場合、ポリペプチドの一つが繊維状ファージ外殻タンパク質膜アンカーに融合される。即ち、ポリペプチドの少なくとも一つは、繊維状ファージ膜アンカードメイン、原核生物分泌シグナルドメイン、及び免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖可変ドメインを含む融合ポリペプチドである。ヘテロダイマー抗体分子を発現するためのDNA発現ベクターは、二つの翻訳可能なDNA配列をベクター中に存在する二つの別個のカセットに独立にクローン化（挿入）して抗体分子の第一ポリペプチド及び第二ポリペプチド、または抗体分子を含むポリペプチドのリガンド結合部分（即ち、免疫グロブリン分子のＨ可変領域及びＬ可変領域）を発現するための二つの別個のシストロンを形成するための系を与える。二つのシストロンを発現するためのDNA発現ベクターは、ジシストロニック発現ベクターと称される。そのベクターは、挿入DNAへの方向性結合に適したヌクレオチドの配列を介して操作により結合された上流及び下流の翻訳可能なDNA配列を含む第一カセットを含む。上流の翻訳可能な配列は本明細書に特定された分泌シグナルをコードする。下流の翻訳可能な配列は、本明細書に特定された繊維状ファージ膜アンカーをコードする。カセットは、インサート翻訳可能なDNA配列（インサートDNA）が方向性結合に適したヌクレオチドの配列を介してカセットに方向性挿入される場合に生産されるレセプターポリペプチドを発現するためのDNA発現調節配列を含むことが好ましい。繊維状ファージ膜アンカーは、繊維状ファージ粒子のマトリックスを結合でき、それにより融合ポリペプチドをファージ表面にとり込むことができるcpIII外殻タンパク質またはcpVIII外殻タンパク質のドメインであることが好ましい。また、レセプター発現ベクターは、第二レセプターポリペプチドを発現するための第二カセットを含む。第二カセットは、方向性結合に適したヌクレオチドの配列を介して典型的にはカセットの読み取り枠中に少なくとも一つの終止コドンを形成するベクターの下流DNA配列にその3'末端で操作により結合された本明細書に特定された分泌シグナルをコードする第二の翻訳可能なDNA配列を含む。第二の翻訳可能なDNA配列は、DNA発現調節配列にその5'末端で操作により結合されて5'要素を形成する。第二カセットは、翻訳可能なDNA配列（インサートDNA）の挿入後に、そのインサートDNAによりコードされたポリペプチドと共に分泌シグナルのレセプターを含む第二融合ポリペプチドを発現できる。上流の翻訳可能なDNA配列は前記の原核生物分泌シグナルをコードする。pelB 分泌シグナルをコードする上流の翻訳可能なDNA配列は、レセプター発現ベクター中の封入に好ましいDNA配列である。下流の翻訳可能なDNA配列は前記の繊維状ファージ膜アンカーをコードする。こうして、下流の翻訳可能なDNA配列は、繊維状ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIII外殻タンパク質の膜アンカードメインに相当し、好ましくはそのドメインと同じであるアミノ酸残基配列をコードする。本発明のDNA発現ベクター中のカセットは、翻訳可能なDNA配列（インサートDN A）の挿入後に、適当な宿主中で融合ポリペプチドを発現できるヌクレオチドの配列を形成するそのベクターの領域である。ヌクレオチドの発現コンピテント配列はシストロンと称される。こうして、そのカセットは、上流及び下流の翻訳可能なDNA配列に操作により結合されたDNA発現調節要素を含む。シストロンは、翻訳可能なDNA配列がその目的に適したヌクレオチドの配列を介して上流配列と下流配列の間に方向性挿入（方向性結合）される場合に形成される。得られる三つの翻訳可能なDNA配列、即ち、上流配列、挿入配列及び下流配列は全て同じ読み取り枠中で操作により結合される。こうして、抗体分子を発現するためのDNA発現ベクターは、翻訳可能なDNA配列をベクターのカセット部分にクローン化して、モノクローナル抗体の第一ポリペプチド及び第二ポリペプチド、即ち、Ｈ鎖及びＬ鎖を発現できるシストロンを生産するための系を与える。本明細書で使用される“ベクター”という用語は、それが操作により結合された別の核酸を異なる遺伝子環境間に輸送できる核酸分子を表す。好ましいベクターは、それらが操作により結合されるDNAセグメント中に存在する構造遺伝子産物の自律複製及び発現の可能なものである。それ故、ベクターは前記のレプリコンと選択可能なマーカーとを含むことが好ましい。 DNA配列またはセグメントに関して本明細書で使用される“操作により結合された”という用語は、その配列またはセグメントが、好ましくは通常のホスホジエステル結合により、一本鎖または二本鎖形態のDNAの一つのストランドに共有結合されたことを意味する。本発明の転写単位またはカセットが操作により結合されるベクターの選択は、当業界で公知であるように、所望される機能的性質、例えば、ベクター複製及びタンパク質発現、並びに形質転換される宿主細胞に直接依存し、これらは組換えDNA分子を構築する技術に固有の制限である。方向性結合に適したヌクレオチドの配列、即ち、ポリリンカーは、（1）複製及び輸送のために上流の翻訳可能なDNA配列及び下流の翻訳可能なDNA配列を操作により結合し、かつ（2）ベクターへのDNA配列の方向性結合のための部位または手段を与えるDNA発現ベクターの領域である。典型的には、方向性ポリリンカーは、二つ以上の制限エンドヌクレアーゼ認識配列、または制限部位を形成するヌクレオチドの配列である。制限開裂後に、二つの部位は、翻訳可能なDNA配列がD NA発現ベクターに結合し得る付着末端を生じる。二つの制限部位は、制限開裂後に、非相補性であり、それにより、カセット中への翻訳可能なDNA配列の方向性挿入を可能にする付着末端を与えることが好ましい。一実施態様において、方向性結合手段は、上流の翻訳可能なDNA配列、下流の翻訳可能なDNA配列、またはその両方中に存在するヌクレオチドにより与えられる。別の実施態様において、方向性結合に適したヌクレオチドの配列は、多方向性クローニング手段を形成するヌクレオチドの配列を含む。方向性結合に適したヌクレオチドの配列が多数の制限部位を形成する場合、それは多クローニング部位と称される。好ましい実施態様において、DNA発現ベクターは、本発明の教示に従ってゲノムを封入する繊維状ファージ粒子の形態で都合の良い操作のために設計される。この実施態様において、DNA発現ベクターは複製の繊維状ファージ開始点を形成するヌクレオチド配列を含み、その結果、そのベクターは、適当な遺伝子相補性の表示後に、一本鎖複製型で繊維状ファージとして複製でき、そして繊維状ファージ粒子にパッケージングし得る。この特徴は、ファージ粒子の集団を含むその他の粒子からの、粒子、及びその中に含まれたベクターのその後の分離のためにファージ粒子にパッケージングされるDNA発現ベクターの能力を与える。複製の繊維状ファージ開始点は、公知であるように、複製の開始、複製の終止及び複製により生産された複製型のパッケージングのための部位を形成するファージゲノムの領域である（例えば、Raschedら，Microbiol.Rev.，50:401-427（1 986）；及びHoriuchi，J.Mol.Biol.，188:215-223（1986）を参照のこと）。本発明で使用するのに好ましい複製の繊維状ファージ開始点は、複製のM13、f 1またはfdファージ開始点（Shortら，Nucl.Acids Res.，16:7583-7600（1988））である。本発明のヒトモノクローナル抗体のクローニング及び発現に好ましい DNA発現ベクターは本明細書に記載されたジシストロニック発現ベクターpComb8 、pComb2-8、pComb3、pComb2-3及びpComb2-3'である。本発明の特に好ましいベクターは、本発明のヒトモノクローナル抗体のＨ鎖可変領域またはＬ鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を含む。図10〜13 に示されたＨ鎖またはＬ鎖アミノ酸残基配列をコードするヌクレオチド配列、図 10〜13に示されたそれらの配列の結合特異性を有するＨ鎖またはＬ鎖をコードするヌクレオチド配列、または図10−13に示された配列に関する保存置換を有するＨ鎖またはＬ鎖をコードするヌクレオチド配列、及びこれらの相補性ポリヌクレオチド配列を含むベクターが特に好ましい。ポリヌクレオチドがヒトモノクローナル抗体Ｈ鎖またはＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を産生するためのDNA発現ベクターの成分部分である限り、本発明はまたこのようなＨ鎖配列またはＬ鎖配列をコードする単離ポリヌクレオチドを意図している。遺伝暗号及びその付随の重剰性のために、意図されるＨ鎖またはＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列をコードする多数のポリヌクレオチド配列が設計し得ることが理解されるべきである。こうして、本発明は遺伝暗号の重剰性の特徴を含むこのような交互ポリヌクレオチド配列を意図している。本発明のヒトモノクローナル抗体を産生するための発現ベクターが抗体の発現に適合性の宿主細胞中に宿される限り、本発明は本発明のベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞を意図している。好ましい宿主細胞は、本明細書に記載されるようにE.coliである。本発明のヒトモノクローナル抗体を産生する好ましい発現ベクターを含むE.co li培養物が、本明細書に記載されるように、ブタベスト条約の要件に従ってアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC、ロックビル、MD）に寄託された。実施例下記の実施例は本発明を説明することを目的とするが、本発明の範囲を限定しない。 1．ファージ粒子にヘテロダイマーレセプターを生産するためのジシストロニック発現ベクターの構築直接スクリーニングし得る多数のFab抗体フラグメントを産生するためのベクター系を得るために、バクテリオファージλ中の発現ライブラリーをHuseら，Sc ience，246:1275-1281（1989）に記載されたようにして予め構築した。これらの系は繊維状ファージ粒子の表面に標的される発現Fabを与える設計特徴を含んでいなかった。ベクター系を選択するのに使用される主な基準は、直接スクリーニングし得る最大数のFabフラグメントを産生することの必要性であった。バクテリオファージλを三つの理由で開始点として選択して発現ベクターを開発した。第一に、ファージDNAの試験管内のパッケージングがDNAを宿主細胞に再導入する最も有効な方法であった。第二に、単一ファージプラークのレベルでタンパク質発現を検出することが可能であった。最後に、ファージライブラリーのスクリーニングは、典型的には、非特異的結合による難点を殆ど伴っていなかった。別のプラスミドクローニングベクターは、それらが同定された後にクローンの分析のみに有利である。この利点はpCombVIIIの如きジシストロニック発現ベクターの使用のために本発明の系で失われず、それにより、Ｈ鎖、Ｌ鎖、またはFab発現インサートを含むプラスミドが切除されることを可能にした。 a．ジシストロニック発現ベクターpCOMBの構築（i）λZap（商標）IIの調製 λZap（商標）IIは、６の特異なクローニング部位、融合タンパク質発現、及びファージミド（ブルースクリプトSK-）の形態のインサートを迅速に切除する能力を含む最初のλZapの特徴の全てを維持するが、SAM 100突然変異を欠いており、XL1-ブルーを含む多くのNon-Sup F株に関する増殖を可能にする最初のλZap の誘導体（ATCC受理番号40,298）である。λZap（商標）IIは、Shortら，Nuc.Acid sRes.，16:7583-7600（1988）に記載されたようにして、λZapを制限酵素Nco I で消化することにより生産された4254の塩基対（bp）のDNAフラグメント中に含まれるラムダＳ遺伝子を置換することにより構築された。この4254 bpフラグメントを、そのベクターを制限酵素Nco Iで消化した後にλgt10（ATCC受理番号40, 179）から単離されたラムダＳ遺伝子を含む4254 bp DNAフラグメントで置換した。λgt10から単離された4254 bp DNAフラグメントを、T4 DNAリガーゼ及び通常のプロトコル、例えば、Current Protocols in Molecular Biology，Ausub-elら編集，John Wiley and Sons，NY，1987に記載されたプロトコルを使用して最初のλZapベクターにつないでλZap（商標）IIを生成した。（ii）λHc2の調製 E.coli宿主細胞中で複数のＶ_HコードDNA同族体を発現するために、λHc2と称されるベクターを構築した。そのベクターは下記のものを与えた。Ｖ_HコードDNA 同族体を適当な読み取り枠に入れる能力；Shineら，Nature，254:34，1975により記載されたようなリボソーム結合部位；pelB分泌シグナルと称される発現タンパク質を細胞周辺腔に誘導するリーダー配列；既知エピトープ（エピトープtag ）をコードするポリヌクレオチド配列；そしてまたＶ_HコードDNA同族体とエピトープtagをコードするポリヌクレオチドの間のスペーサータンパク質をコードしたポリヌクレオチド。λHc2はHuseら，Science，246:1275-1281（1989）により既に記載されていた。 λHc2を調製するために、上記の特徴の全てを含む合成DNA配列を、互いにハイブリッドを形成し、図１に示された二本鎖合成DNA配列を形成する20〜40の塩基の一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを設計することにより構築した。個々の一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを表１に示す。ポリヌクレオチドN2、N3、N9-4、N11、N10-5、N6、N7及びN8（表１）を、夫々のポリヌクレオチド0.1マイクログラム／マイクロリットル（μg/μl）１マイクロリットル（μl）及びT₄ポリヌクレオチドキナーゼ20単位を70mMのトリス-HCl （トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン塩酸塩）pH7.6、10mMのMgCl₂、５mM のジチオスレイトール（DTT）、10mMのβ−メルカプトエタノール及び500マイクログラム／ミリリットル（μg/ml）のウシ血清アルブミン（BSA）を含む溶液に添加することによりキナーゼ処理した。その溶液を37℃で30分間保ち、その溶液を65℃で10分間保つことによりその反応を停止した。二つの最終ポリヌクレオチド、20ngのポリヌクレオチドN1及びポリヌクレオチドN12を、20mMのトリス-HC L、pH7.4、2mMのMgCl₂及び50mMのNaClを含む溶液1/10容積と一緒に上記のキナーゼ処理反応溶液に添加した。この溶液を70℃に５分間加熱し、水500mlのビーカー中で1.5時間にわたって室温、約25℃に冷却した。この期間中に、全ての10のポリヌクレオチドはアニールして図１に示された二本鎖合成DNAインサートを形成した。個々のポリヌクレオチドを、上記の反応溶液40μlを50mMのトリス-HCl 、pH7.5、7mMのMgCl₂、1mMのDTT、1mMのアデノシントリホスフェート（ATP）及びT₄DNAリガーゼ10単位を含む溶液に添加することにより互いに共有結合させて合成DNAインサートを安定化した。この溶液を37℃で30分間保ち、次いでその溶液を65℃で10分間保つことによりT4DNAリガーゼを不活化した。上記の反応液52 μl、10mMのATP及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ５単位を含む溶液４μlを混合することにより最終ポリヌクレオチドをキナーゼ処理した。この溶液を37℃で30 分間保ち、次いでその溶液を65℃で10分間保つことによりT4ポリヌクレオチドキナーゼを不活化した。完全な合成DNAインサートを、制限酵素、Not I及びXho Iで先に消化された実施例1a1）に記載されたλZap（商標）IIベクターに直接つないだ。その結合混合物を製造業者の指示に従ってカリフォルニア、ラ・ジョラにあるストラタゲンから市販されているギガパック（Gigapack）IIゴールドパッキングエキスを使用してパッケージした。パッケージした結合混合物をXL1-ブルーセル（ストラタゲン）に塗布した。個々のλプラークをコアーにし、インサートを製造業者（ストラタゲン）により提供されたλZap（商標）IIの生体内切除プロトコルに従って切除した。この生体内切除プロトコルは、クローン化されたインサートをλHc2ベクターからファージミドベクターに移動させて操作及び配列決定を容易にした。上記のクローニング工程の正確さを、Sangerら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74 :5463-5467（1977）に記載されたサンガー・デオキシ方法を使用し、そしてAMV 逆転写酵素³⁵S-ATP配列決定キット（ストラタゲン）中で製造業者の指示を使用してインサートを配列決定することにより確かめた。Ｖ_H発現ベクター（λHc2）中で得られる二本鎖合成DNAインサートの配列を図１に示す。λHc2の夫々のストランドの配列（上部及び下部）を、夫々配列番号１及び配列番号２として配列表中にリストする。得られるλHc2発現ベクターを図２に示す。 3）λLc2の調製 E.coli宿主細胞中で複数のＶ_LコードDNA同族体を発現するために、適当な読み取り枠中にＶ_LコードDNA同族体を入れる能力を有するλLc2と称されるベクターを構築し、Shineら，Nature，254:34，1975により記載されたようなリボソーム結合部位を得、Leiら，J.Bac.，169:4379（1987）及びBetterら，Science，240: 1041（1988）によりE.coli中でFabフラグメントを成功して分泌するのに既に使用されたpelB遺伝子リーダー配列分泌シグナルを得、そしてまたクローニングのための制限エンドヌクレアーゼ部位を含むポリヌクレオチドを得た。λLc2はHus eら，Science，246:1275-1281（1989）により既に記載されていた。上記の特徴の全てを含む合成DNA配列を、互いにハイブリッドを形成し、図３に示された二本鎖合成DNA配列を形成する20〜60の塩基の一本鎖ポリヌクレオチドセグメントを設計することにより構築した。二本鎖合成DNA配列内の夫々個々の一本鎖ポリヌクレオチドセグメント（01-08）の配列を表２に示す。ポリヌクレオチド02、03、04、05、06及び07（表２）を、夫々のポリヌクレオチド１μl（0.1μg/μl）及びT₄ポリヌクレオチドキナーゼ20単位を70mMのトリスHCl、pH7.6、10mMのMgCl₂、5mMのDTT、10mMのβ−メルカプトエタノール及び5 00μg/mlのBSAを含む溶液に添加することによりキナーゼ処理した。その溶液を3 7℃で30分間保ち、その溶液を65℃で10分間保つことによりその反応を停止した。夫々20ngの二つの最終ポリヌクレオチド、01及び08を、20.0mMのトリス-HCl、 pH7.4、2mMのMgCl₂及び15.0mMの塩化ナトリウム（NaCl）を含む溶液1/10容積と一緒に上記のキナーゼ処理反応溶液に添加した。この溶液を70℃に５分間加熱し、水500mlのビーカー中で1.5時間にわたって室温、約25℃に冷却した。この期間中に、全ての８のポリヌクレオチドはアニールして図３に示された二本鎖合成DN Aインサートを形成した。個々のポリヌクレオチドを、上記の反応溶液40μlを50 mlのトリス-HCl、pH 7.5、7mlのMgCl₂、1mmのDTT、1mmのATP及びT4DNAリガーゼ1 0単位を含む溶液に添加することにより互いに共有結合させて合成DNAインサートを安定化した。この溶液を37℃で30分間保ち、次いでその溶液を65℃で10分間保つことによりT4DNAリガーゼを不活化した。上記の反応液52μl、10mMのATP及びT 4ポリヌクレオチドキナーゼ５単位を含む溶液４μlを混合することにより最終ポリヌクレオチドをキナーゼ処理した。この溶液を37℃で30分間保ち、次いでその溶液を65℃で10分間保つことによりT4ポリヌクレオチドキナーゼを不活化した。完全な合成DNAインサートを、制限酵素Sac I及びXho Iで先に消化された実施例1a1）に記載されたλZap（商標）IIベクターに直接つないだ。その結合混合物を製造業者の指示に従ってギガパックIIゴールドパッキングエキス（ストラタゲン）を使用してパッケージした。パッケージした結合混合物をXL1-ブルーセル（ストラタゲン）に塗布した。個々のλプラークをコアーにし、インサートを製造業者（ストラタゲン）により提供されたλZap（商標）IIの生体内切除プロトコルに従って切除した。この生体内切除プロトコルは、クローン化されたインサートをλLc2ベクターからファージミドベクターに移動させて操作及び配列決定を容易にした。上記のクローニング工程の正確さを、AMV逆転写酵素³⁵S-dATP配列決定キット（ストラタゲン）中で製造業者の指示を使用してインサートを配列決定することにより確かめた。得られるLc2発現ベクター（λLc2）の配列を図３に示す。夫々のストランドを、配列番号３及び配列番号４として配列表中に別々にリストする。得られるλLc2発現ベクターを図４に図示する。 λLc3と称される本発明に使用するのに好ましいベクターは、先に調製された λLc2の誘導体である。λLc2は、図３及び配列番号３の配列に示されるようにEc oR Ｉ制限部位に対し3'、またシャイン−ダルガーノリボソーム結合部位に対し5 'に配置されたSpe I制限部位を含む。また、Spe I制限部位は、図１及び２並びに配列番号１に示されるようにλHc2中に存在する。pCombと称される結合性ベクターを、下記の実施例1a4）に記載されるように、λHc2及びλLcの部分を一緒に合わせることにより構築した。得られる結合性pCombベクターは二つのSpe I制限部位（即ち、一つはλHc2により与えられ、一つは間にEcoR I部位を含んで、λL c2により与えられた）を含んでいた。二つのSpe I制限部位の存在にもかかわらず、Spe I及びEcoR I付着末端を有するDNA同族体を、下記の実施例1bに記載されたようにしてSpe I及びEcoR Iで先に消化されたpComb発現ベクターに成功して方向性結合した。Lc2ベクターにより与えられた3'Spe I部位へのEcoR I制限部位の近接は、3'Spe I部位の完全消化を抑制した。こうして、pCombをSpe I及びEcoR Iで消化することは、二つのSpe I部位間のEcoR I部位の除去をもたらさなかった。第二Spe I制限部位の存在は、Spe Iのみで消化されたpCombベクターへの結合に望ましくないかもしれない。何となれば、二つの部位間の領域が除去されるからである。それ故、λLc3と称される、第二Spe I部位または3'Spe I部位を欠いているλLc2の誘導体は、まずλLc2をSpe Iで消化して直線状にされたベクターを生成することにより生産された。これらの末端はフィル・インされて（filled in）ブラントエンドを形成し、これらが一緒につながれてSpe I部位を欠いているλLc3を生じる。λLc3は、下記の結合性ベクターを構築するのに使用するのに好ましいベクターである。 4）pCombの調製ファージミドを、上記の生体内切除プロトコルを使用して発現ベクターλHc2 またはλLc2から切除した。二本鎖DNAを、Holmesら，Anal.Biochem.，114:193（ 1981）により記載された方法に従ってファージミドを含む細胞から調製した。生体内切除から生じるファージミドは、親ベクターと同じ抗体フラグメントクローニング及び発現のためのヌクレオチド配列を含んでおり、夫々、λHc2及びLc2に対応して、ファージミドHc2及びLc2と称される。ファージミドHc2及びファージミドLc2の部分を合わせることにより生産される結合性ファージミドベクターpCombの構築のために、ファージミドHc2を最初にSa c Iで消化してLacZプロモーターに対し5'に配置された制限部位を除去した。直線状にされたファージミドをT4ポリメラーゼで平滑断端し、つないでSac I部位を欠いているHc2ファージミドを得た。次いで修飾Hc2ファージミド及びLc2ファージミドを別々にSca I及びEcoR Iで制限消化して5'から3'にSca I制限部位、No t I制限部位、Xho I制限部位、Spe I制限部位及びEcoR I制限部位を有するHc2フラグメントと、5'から3'にEcoR I制限部位、Sac I制限部位、Xba I制限部位及び Sac I制限部位を有するLc2フラグメントを得た。次いで、直線状にされたファージミドをそれらの夫々の付着末端で一緒につないでpComb、即ち、Not I、Xho I 、Spe I、EcoR I、Sac I、Xba I、Not I、Apa I及びSca Iの制限部位の直線配置を有する環状にされたファージミドを生成した。次いでつながれたファージミドベクターを適当なバクテリア宿主に挿入し、形質転換体を抗生物質アンピシリンにつき選択した。選択されたアンピシリン耐性形質転換体を二つのNot I部位の存在につきスクリーニングした。得られるアンピシリン耐性結合性ファージミドベクターをpCom bと称し、その構成図を図５に示す。得られる結合性ベクター、pCombは、二つの融合タンパク質を発現するための二つのカセットを有し、また5'から3'方向にリストされた下記の操作により結合された要素のためのヌクレオチド残基配列を有するDNA分子からなっていた。LacZ遺伝子から上流の誘導LacZプロモーターからなる第一カセット；Not I制限部位；リボソーム結合部位；pelBリーダー；スペーサー；5'Xho及び3'Spe I制限部位により境界形成されたクローニング領域：デカペプチドtag、続いて発現調節終止配列；発現調節リボソーム形成部位からなる第二カセットに5'に配置されたEcoR I制限部位；pelBリーダー；スペーサー領域；5'Sac I及び3'Xba I制限部位により境界形成されたクローニング領域、続いて発現調節終止配列及び第二Not I制限部位。 pComb2と称される本発明に使用するのに好ましい結合性ベクターを、pCombにつき上記されたようにして、ファージミドHc2及びファージミドLc3の部分を合わせることにより構築する。得られる結合性ベクター、pComb2は、第二カセット中の第二Spe I制限部位が排除されている以外は、ｐCombと同様に二つの融合タンパク質を発現するためのpCombと同一の二つのカセットを有するDNA分子からなる。 b．バクテリオファージ外殻タンパク質膜アンカーを有する融合タンパク質を発現するためのベクターpCombIIIベクターの構築多数のエンドヌクレアーゼ制限クローニング部位のために、先に調製したpCom bファージミド発現ベクターは、本発明に使用するための発現ベクターの調製のための修飾に有益なクローニングビヒクルである。その目的のために、pCombをE coR I及びSpe Iで消化し、続いてホスファターゼ処理して直線状にされたpComb を生産した。 1）pCombIIIの調製バクテリオファージcpIII膜アンカードメインをコードする配列を使用して、別個のファージミド発現ベクターを構築した。繊維状ファージ外殻タンパク質、 cpIIIをコードするDNA配列、Ｌ鎖の発現のための膜アンカーの3'にLacZプロモーター領域配列を含む膜アンカー並びにSpe I及びEcoR I付着末端を形成するPCR生産物を、市販のバクテリオファージベクター（ニュージャージー、ピスキャットアウェーにあるファーマシア）であるM13mp18から調製した。修飾cpIIIを調製するために、M13mp18からの複製型DNAを最初に単離した。簡単には、LB（ルリア−ベルタニ培地）2mlに、F'エピソーム（JM107、JM109またはTG1）を有するバクテリア株の培養液50μlを単一プラークから誘導されたバクテリオファージ粒子の1/10の懸濁液と共に混合した。その混合物を絶えず攪拌しながら37℃で４〜５時間インキュベートした。次いでその混合物を12,000xgで５分間遠心分離して感染バクテリアをペレット化した。上澄みを除去した後、ペレットを激しく攪拌しながら100μlの氷冷溶液Ｉ中に再度懸濁させた。溶液Ｉは、 50mMのグルコース、10mMのEDTA（エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム）及び25mMのトリス-HCl、pH8.0を混合し、15分間オートクレーブ処理することにより調製した。バクテリア懸濁液に、新たに調製した溶液II 200μlを混合し、その管を５回迅速に倒立させた。溶液IIは、0.2NのNaOH及び１％のSDSを混合することにより調製した。バクテリア懸濁液に、150μlの氷冷溶液IIIを混合し、管を倒立位置で10秒間軽く攪拌して溶液IIIを粘稠なバクテリア溶解産物に分散させた。溶液I IIは、5Mの酢酸カリウム60ml、氷酢酸11.5ml及び水28.5mlを混合することにより調製した。次いで、得られたバクテリア溶解産物を氷の上で５分間貯蔵し、続いて小型遠心分離機中で12,000xgで４℃で５分間遠心分離した。得られた上澄みを回収し、新しい管に移した。上澄みに、等容積のフェノール／クロロホルムを添加し、その混合物を攪拌した。次いでその混合物を小型遠心分離機中で12,000xg で２分間遠心分離した。得られた上澄みを新しい管に移し、二本鎖バクテリオファージDNAを室温で２倍の容積のエタノールで沈殿させた。その混合物を室温で２分間放置した後、その混合物を遠心分離してDNAをペレット化した。上澄みを除去し、ペレット化された複製型DNAを25μlのトリス-HCl、pH7.6、及び10mMのE DTA（TE）中に再度懸濁させた。次いで二本鎖M13mp18複製型DNAを、cpIIIで膜アンカーをコードする遺伝子を単離するための鋳型として使用し、その配列が配列表中に配列番号33としてリストされる。膜アンカードメインcpIIIのアミノ酸残基配列を配列番号34にリストする。M13mp18複製型DNAを上記のようにして調製し、Lac Zプロモーターをコードする配列に対し5'に配置されたcpIII膜アンカードメインの成熟遺伝子、オペレーター及びＬ鎖発現を調節するためのcap結合部位からなるDNAフラグメントの構築のために二つのPCR増幅の鋳型として使用した。制限部位、Spe I及びEcoR Iを増幅反応中につくり、夫々フラグメントの5'末端及び3'末端に配置されていた。二つの別個のPCR増幅の生産物を組み合わせることによりこのフラグメントをつくる操作を、以下に記載する。プライマー対、即ち、表３にリストされたG-3（F）（配列番号35）及びG-3（B ）（配列番号36）を、先に行ったような第一PCR反応に使用してcpIII膜アンカー遺伝子を増幅し、Spe I制限部位及びNhe I制限部位をフラグメントにとり込んだ。PCR反応につき、M13mp18複製型DNA 1ngを含む２μlを0.5 mlの小型遠心分離管中で市販の10X PCR緩衝液（プロメガ・バイオテク、マジソン、ウィスコンシン）10μlと混合した。そのDNA混合物に、dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）の2.5m Mの溶液８μlを混合して200マイクロモル（μM）の最終濃度を生じた。G-3（F）プライマー３μl（60ピコモル（pM）に相当する）及び3'後方G-3（B）プライマー３μl（60pM）をDNA溶液に混合した。その混合物に、滅菌水73μl及びポリメラーゼ（プロメガ・バイオテク）１μl/５単位を添加した。鉱油２滴を混合物の上部に入れ、サーモサイクラー中の40ラウンドのPCR増幅を行った。増幅サイクルは、52℃で２分間、72℃で1.5分間そして91℃で２分間からなっていた。次いで、M13mp18を含む試料から得られたPC修飾cpIII膜アンカードメインDNAフラグメントをジーン・クリーン（Gene Clean）（BI0101、ラ・ジョラ、カリフォルニア）で精製し、フェノール／クロロホルムで２回抽出し、クロロホルムで１回抽出し、続いてエタノールで沈殿させ、そして10mMのトリス-HCl、pH7.5、及び１m MのEDTA中で-70℃で貯蔵した。フラグメントの夫々5'末端及び3'末端にSpe I部位及びNhe I部位を有する得られたPCR修飾cpIII DNAフラグメントを１％のアガロースゲル中の電気泳動により確認した。修飾cpIII DNAフラグメントを含むアガロース中の領域をアガロースから分離した。PCR修飾cpIII膜アンカードメインDNAフラグメントの配列を配列表中に配列番号40としてリストする。また、得られた増幅PCRフラグメントは４つのグリシン残基と、Ｈ鎖とcpIIIコードドメインの間に並置された一つのセリンとを含む５アミノ酸テサー（tether）をコードするヌクレオチド配列を含んでいた。一旦発現されると、規則的な二次構造を欠いている５アミノ酸残基配列はFabとcpIIIドメインの相互作用を最小にするのに利用できた。表３にリストされたプライマー対、Lac-F（配列番号37）及びLac-B（配列番号 38）を使用する第二PCR増幅を、M13mp18複製型鋳型DNAの別個のアリコートにつき行って、LacZプロモーター、オペレーター及び5'Nhe I部位と3'EcoR I部位とを有するCap結合部位を増幅した。この増幅に使用したプライマーは、増幅フラグメントの5'末端にNhe I部位をとり込んでcpIII遺伝子フラグメントの3'末端及び増幅cpIIIフラグメントに対し3'のNhe I部位の一部とオーバーラップするように設計した。PCR生産物の反応及び精製を上記のようにして行った。5'Nhe I制限部位と3'EcoR I制限部位とを有する得られたPCR修飾cpIII DNAフラグメントの配列を配列表中に配列番号41としてリストする。 cpIII膜アンカー及びLacZプロモーター領域を構築するのに使用するための別のLac-Bプライマーは、表３に示されたLac-B'であった。第二PCR増幅において、 Lac-Bに代えてLac-B'をLac-Fと共に使用した以外は、増幅反応を上記のようにして行った。増幅反応からの生産物を配列表中にヌクレオチド位置１からヌクレオチド位置172までの配列番号41としてリストする。Lac-B'の使用は、3'末端で29 のヌクレオチドを欠いているLacZ領域を生じたが、Lac-Fプライマー及びLac-Bプライマーで生産された更に長いフラグメントと機能上均等であった。次いで、プライマー対G-3（F）とG-3（B）及びLac-FとLac-Bを使用する第一PC R増幅及び第二PCR増幅の生産物を、cpIII膜アンカーオーバーラップ及びNhe I制限部位に相当するヌクレオチドで組換えて、G3-F（配列番号35）とLac-B（配列番号38）のプライマー対を使用するPCRの第二ラウンドにかけて、下記のものからなる組換えPCR DNAフラグメント生産物を生成した。5'Spe I制限部位；全成熟 cpIIIタンパク質のアミノ酸残基198に相当するヌクレオチド残基配列で開始する cpIII DNA膜アンカードメイン；アミノ酸残基番号112にある膜アンカーにより与えられる内在性終止部位；Nhe I制限部位、LacZプロモーター、オペレーター及びCap結合部位配列；並びに3'EcoR I制限部位。カッパーＬ鎖との実施例２で調製したＨ鎖-cpIII融合タンパク質の協調発現のためのファージミドベクターを構築するために、組換えPCR修飾cpIII膜アンカードメインDNAフラグメントをSpe I及びEcoR Iで制限消化して、実施例1a4）で調製した唯一のSpe I部位を有する同様に消化されたpComb2ファージミド発現ベクターへの方向性結合のためのDNAフラグメントを生産してpComb2-III（また、pCo mb2-IIIと称される）ファージミドベクターを生成した。こうして、唯一のSpe I 制限部位を有する得られたアンピシリン耐性を与えるpComb2-3ベクターは、Ｈ鎖（Fd）-cpIII融合生産物及びＬ鎖タンパク質の別々の発現を誘導するための別個のLacZプロモーター配列／オペレーター配列を含む。発現タンパク質を、膜における機能性アセンブリーのためのpelBリーダー配列により細胞周辺腔に誘導した。ベクター中のファージF1遺伝子間領域の封入は、ヘルパーファージの助けにより一本鎖ファージミドのパッケージングを可能にした。ヘルパーファージ重感染の使用はcpIIIの二つの形態の発現をもたらす。こうして、正常なファージ形態形成は、Fab-cpVIII融合のためのウイルス粒子へのとり込みにつきFab-cpIII融合とヘルパーファージの天然cpIIIとの間の競合により乱された。加えて、クロラムフェニコール耐性、等を与えるベクターが本発明における使用に意図されている。 pComb-III'またはpComb2-3'と称される、付加的な制限酵素クローニング部位を有する本発明に使用するのに更に好ましいファージミド発現ベクターを、pCom b2-3につき上記されたようにして、Shortら，Nuc.Acids Res.，16:7583-7600（1 988）に記載され、またストラタゲンから市販されているｐブルースクリプトからの51の塩基対フラグメントの添加により調製した。pComb2-3'を調製するために、pComb2-3を最初にXho I制限酵素及びSpe I制限酵素で消化して直線状にされたpComb2-3を生成した。ベクターｐブルースクリプトを、制限酵素部位、Sal I 、Acc I、Hinc II、Cla I、Hind III、EcoR V、Pst I、Sma I及びBamH Iを含む5 1の塩基対フラグメントを放出する同酵素で消化した。その51の塩基対フラグメントを付着末端Xho I及びSpe Iを介して直線状にされたpComb2-3ベクターにつないでpComb2-3'を生成した。Ｆ前方プライマーＢ後方プライマー 1．5'から3'へ：Spe I制限部位配列が一本の下線を施されている。cpIIIの5'末端とのオーバーラップ配列が二重の下線を施されている。 2．5'から3'へ：Nhe I制限部位配列が一本の下線を施されている。cpIIIの3'末端とのオーバーラップ配列が二重の下線を施されている。 3．5'から3'へ：cpIIIの3'末端とのオーバーラップ配列が二重の下線を施されている。Nhe I制限配列が位置４でヌクレオチド残基“Ｇ”で開始し、更に５残基G CTAGCだけ延びる。 4．EcoR I制限部位配列が一本の下線を施されている。 5．LacZを増幅するためのオルタナティブ後方プライマー；EcoR I制限部位配列が一本の下線を施されている。 2．ジシストロニック発現ベクターpComb2-3から産生されたHIV-1特異性モノクローナル抗体の単離本発明を実施するに際して、抗体のＨ鎖（Ｖ_H及びＣ_H１からなるFd）及びＬ（カッパー）鎖（Ｖ_L、Ｃ_L）を最初にヘテロダイマーFab分子のアセンブリーのためにE.coliの周辺質に標的する。ファージ表面で抗体Fabライブラリーの発現を得るために、FdまたはＬ鎖をコードするヌクレオチド残基配列を、繊維状バクテリオファージ外殻タンパク質膜アンカーをコードするヌクレオチド残基配列に操作により結合する必要がある。膜アンカーを得るのに本発明で使用するための外殻タンパク質はIII（cpIII即ちcp3）である。本明細書に記載された実施例において、Fd鎖をコードするヌクレオチド残基配列を本発明の融合タンパク質中で cpIII膜アンカーに操作により結合する方法が記載される。ファージミドベクター中で、翻訳可能なDNA配列からなる第一シストロン及び第二シストロンを操作により結合してジシストロニックDNA分子を生成する。ジシストロニックDNA分子中の夫々のシストロンを、融合タンパク質、Fd-cpIII、及びカッパーＬ鎖の協調発現のためにDNA発現調節配列に結合する。第一シストロンは、融合タンパク質、Fd-cpIIIに操作により結合された周辺質分泌シグナル（pelBリーダー）をコードする。第二シストロンはカッパーＬ鎖に操作により結合された第二pelBリーダーをコードする。pelBリーダーの存在は、バクテリア細胞質から細胞周辺腔への融合タンパク質及びＬ鎖の両方の協調されているが、別々の分泌を促進する。この方法において、ファージミド発現ベクターは、Fd-cpIII融合及びカッパー鎖に加えてアンピシリン選択可能な耐性マーカー遺伝子（βラクタマーゼまたは bla）を有する。複製のf1ファージ開始点は、一本鎖ファージミドの生成を促進する。Fd-cpIII融合（Ｖ_H、Ｃ_H1、cpIII）及びＬ鎖（Ｖ_L，、Ｃ_L）をコードするジシストロニックメッセージのイソプロピルチオガラクトピラノシド（IPTG）誘導発現は、Ｈ鎖及びＬ鎖の形成をもたらす。夫々の鎖をpelBリーダー配列により細胞周辺腔に送出し、続いてこれを開裂する。Ｈ鎖はcpIII膜アンカードメインにより膜中につなぎ止められ、一方Ｌ鎖は周辺質に分泌される。Ｌ鎖の存在下のＨ鎖は集合してFab分子を生成する。この同じ結果は、別法で、Ｌ鎖が膜アンカーを有するＬ鎖融合タンパク質を介して膜中につなぎ止められ、そしてＨ鎖がpe lBリーダーにより周辺質に分泌される場合に得られる。ヘルパーファージによるE.coliのその後の感染により、繊維状バクテリオファージの集合が進行するにつれて、外殻タンパク質IIIはバクテリオファージの尾部でとり込まれる。 a.リンパ球RNAの調製骨髄5mlをHIV-1無症候性の血清反応陽性の個人から吸引により除去した。全細胞RNAを上記の骨髄リンパ球からChomczynskiら，Anal Biochem.，162:156-159（ 1987）により記載されたRNA調製方法を使用し、そしてRNA単離キット（ストラタゲン）を製造業者の指示に従って使用して調製した。簡単に言えば、単離骨髄中の細胞の即時均一化のために、β−メルカプトエタノール71μｌを含む3.0Mのグアニジニウムイソチオシアネートを含む変性溶液10mlを単離骨髄に混合した。次いでpH4.0の2Mの濃度の酢酸ナトリウム1mlを均一にされた細胞と混合した。また、前もってH₂Oで飽和したフェノール1mlを均一にされた脾臓を含む変性溶液に混合した。クロロホルム：イソアミルアルコール（24:1 v/v）混合物2mlをこのホモジネートに添加した。ホモジネートを10秒間激しく混合し、氷の上に15分間保った。次いでホモジネートを肉厚の50mlのポリプロピレン遠心分離管（フィッシャー・サイエンティフィック社、ピッツバーグ、PA）に移した。その溶液を４℃ で10,000xgで20分間遠心分離した。上のRNAを含む水層を新しい50mlのポリプロピレン遠心分離管に移し、等容積のイソプロピルアルコールと混合した。この溶液を少なくとも１時間にわたって-20℃に保ってRNAを沈殿させた。沈殿したRNAを含む溶液を20分間にわたって４℃で10,000xgで遠心分離した。ペレットにした全細胞RNAを回収し、上記の変性溶液3mlに溶解した。イソプロピルアルコール3mlを再度懸濁した全細胞RNAに添加し、激しく混合した。この溶液を少なくとも１時間にわたって-20℃に保ってRNAを沈殿させた。沈殿したRNAを含む溶液を10分間にわたって４℃で10,000xgで遠心分離した。ペレットにしたRNA を、75％のエタノールを含む溶液で１回洗浄した。ペレットにしたRNAを減圧で1 5分間乾燥し、次いでジメチルピロカーボネート処理したH₂O(DEPC-H₂O)中で再度懸濁させた。長いポリＡトラクトを含む配列に富んだメッセンジャ−RNA（mRNA）を、Molec -ular Cloning：A Laboratory Manual，Maniatisら編集，Cold Spring Harbor， NY，（1982）に記載された方法を使用して全細胞RNAから調製した。簡単に言えば、先に記載したようにして単一ドナーから単離された全RNAの半分をDEPC-H₂O1ml中に再度懸濁させ、５分間にわたって65℃に保った。100 mMのトリス-HCL、1MのNa Cl、2.0 mMのEDTA、pH7.5、及び0.2％のSDSからなる2X高塩負荷緩衝液1mlを再度懸濁されたRNAに混合し、その混合物を室温に冷却した。次いで精製された全RNAを、実施例2cに記載されたPCR増幅反応に使用した。また、mRNAを下記の操作によりポリＡ＋RNAに更に精製した。全MRNAを、オリゴ-dT （コラボラティブ・リサーチ型２または型３）を0.1Mの水酸化ナトリウム及び5m MのEDTAを含む溶液で洗浄し、次いでそのカラムをDEPC-H₂Oで平衡にすることにより前もって調製したオリゴ-dTカラムに適用した。溶離液を無菌ポリプロピレン管中に回収し、溶離液を65℃で５分間加熱した後、同カラムに再度適用した。次いでオリゴ-dTカラムを、50mMのトリス-HCl、 pH7.5、500 mMの塩化ナトリウム、１mMのEDTA、pH7.5、及び0.1％のSDSからなる高塩負荷緩衝液２mlで洗浄した。次いでオリゴ-dTカラムを、50mMのトリス-HCl、pH7.5、100 mM、１mMのEDTA 及び0.1％のSDSからなる1X中間塩緩衝液２mlで洗浄した。メッセンジャーRNAを、10mMのトリス-HCl、 pH7.5、１mMのEDTA、pH7.5、及び0.05％のSDSからなる緩衝液１mlでオリゴ-dTカラムから溶離した。この溶液をフェノール／クロロホルムで抽出し、続いて100％のクロロホルムで１回抽出することによりメッセンジャーRNAを精製した。メッセンジャーRNAをエタノール沈殿により濃縮し、DEPC H₂ O中に再度懸濁させた。得られた精製mRNAは、抗HIV-1 Fab DNAライブラリーの調製のための複数の抗H IV-1コードＶ_H配列及びＶ_L配列を含んでいた。 b.結合性HIV-1抗体ライブラリーの構築 1)オリゴヌクレオチドプライマーの選択免疫グロブリンタンパク質CDRをコードするヌクレオチド配列は高度に可変である。しかしながら、例えば、Ｌ鎖またはＨ鎖のＶ領域ドメインに隣接し、また実質的に保存されたヌクレオチド配列、即ち、同じプライマー配列にハイブリッドを形成する配列を含む保存配列の幾つかの領域がある。それ故、保存配列にハイブリッドを形成し、生産されたDNA同族体に制限部位をとり込み、合成DNAフラグメントをベクターに操作により結合するのに適するポリヌクレオチド合成（増幅）プライマーを構築した。更に詳しくは、プライマーは、生産された得られるDNA同族体が方向性結合手段を含むベクターの領域で上流の翻訳可能なDNA配列と共に読み取り枠中で本発明の発現ベクターに挿入し得るように設計された。Ｖ_Hドメインの増幅のために、pCom2-3発現ベクターの特有のXhoＩ部位及びSpe Ｉ部位への方向性結合に適合性の付着末端を導入するようにプライマーを設計した。全ての場合、５'プライマーVH1a（5'CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGG 3'配列番号 42）及びVH3a（５’GAGGTGCAGCTCGAGGAGTCTGGG 3'配列番号43）を夫々Ｖ_H１サブグループファミリー及びＶ_H３サブグループファミリーとの相同性を最大にするように設計したが、その他のサブグループのかなりのクロスプライミングが予想された。pComb2-3ベクターへのクローニングのためのXhoＩ制限部位が下線を施されている。５’プライマーと一緒に使用されたヌクレオチド配列５’GCATGT ACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG 3'（配列番号44）を有する３'プライマーCG1zは、ヒンジ領域の部分に相当するＨ鎖のプライマーである。pComb2-3ベクターへのクローニングのためのSpeＩ部位が下線を施されている。Ｖ_Lドメインをコードするヌクレオチド配列は高度に可変性である。しかしながら、Ｊ_L、Ｖ_L骨格領域及びＶ_Lリーダー／プロモーターを含むＶ_Lドメインに隣接する保存配列の幾つかの領域がある。それ故、保存配列にハイブリッドを形成し、そして増幅フラグメントをSacＩ及びXbaＩで切断されたpComb2-3発現ベクターにクローン化することを可能にする制限部位をとり込む増幅プライマーを構築した。先にリストされたＨ鎖プライマーに類似するカッパーＶ_Lドメインの増幅のために、５'プライマー、VK1a（５’GACATC GAGCTCACCCAGTCTCCA 3'配列番号45）及びVK3a（５’GAAATT GAGCTCACGCAGTCTCCA 3'配列番号46）を使用した。また、これらのプライマーは、下線を施されたヌクレオチドにより示されたSacＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を導入し、Ｖ_LDNA同族体をpComb2-3発現ベクターにクローン化させた。Ｌ鎖の３'末端に相当するヌクレオチド配列５’GCGCCG TCTAGAACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCAAG 3'（配列番号4 7）を有する３’Ｖ_L増幅プライマー、CK1aを使用してＬ鎖を増幅するとともに、Ｖ_LDNA同族体をpComb2-3発現ベクターに挿入するのに必要とされる下線を施された XbaＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をとり込んだ。本明細書に記載された全てのプライマー及び合成ポリヌクレオチドを、アラバマ、フンツビルにあるリサーチ・ゲネチックスから購入し、または製造業者の指示を使用してアプライド・バイオシステムズDNA合成装置、型式381Aで合成した。 2)V_H DNA同族体及びV_LDNA同族体のPCR増幅 RCR増幅のための調製において、先に調製されたmRNAをプライマー伸長反応によるcDNA合成の鋳型として使用した。最初に、水中の全mRNA 20〜10μｇを最初に70℃で10分間にわたって先にリストされたＨ鎖またはＬ鎖３'プライマー600ng （60.0pモル）とハイブリッドを形成（アニール）した。続いてそのハイブリッド形成した混合物を夫々200μMのdATP、dCTP、dGTP及びdTTP、40mMのトリス-HCl 、pH8.0、 8mMのMgCI₂、50mMのNaCl、2mMのスペルミジン及び600単位の逆転写酵素（スーパースクリプト、BRL）を含む典型的な50μｌの逆転写反応に使用した。次いでその反応混合物を37℃で１時間保ってRNA-cDNA混合物を生成した。次いで得られたRNA-cDNA混合物３μｌを、60μMの濃度の全ての４つのdNTP、5 0mMのKCl、10mMのトリス-HCl、pH8.3、15mMのMgCl₂、0.1％のゼラチン及び５単位のテルムス・アクアチクス（Thermus aquatics）（Taq）DNAポリメラーゼ（パーキン−エルマー−セタス、エメリービル、カリフォルニア）、及び先にリストされた適当な５'プライマー及び３'プライマー60pモルの混合を含む100μlの反応容積でPCR増幅に使用した。分離した反応混合物を鉱油で覆い、35サイクルの増幅にかけた。夫々の増幅サイクルは、91℃で１分間の変性、52℃で２分間のアニーリング、及び72℃で1.5分間のプライマー伸長によるポリヌクレオチド合成、続いて72℃で10分間の最終維持期間を含んでいた。次いで、その反応混合物のアリコートを２％のアガロースゲルで別々に電気泳動にかけた。ゲル電気泳動移動により測定して成功した増幅後に、RNA-cDNAの残部を増幅し、その後、共通の３'プライマーのPCR生産物を、別個のＶ_H及びＶ_LコードDNA同族体を含む試料にプールし、次いでフェノール／クロロホルムで２回、クロロホルムで１回抽出し、エタノールで沈殿させ、10mMのトリス-HCl、pH7.5及び１mMのEDTA中で-70℃で貯蔵した。 3)pComb2-3発現ベクターへのＶ_H及びＶ，コードDNA同族体の挿入次いで、先に調製したＶ_HコードDNA同族体（Ｈ鎖）を、10単位のリガーゼを含む150μlの全容積で16℃で一夜にわたって同様に消化され、直線状にされたpCom b2-3へのその後の結合のために過剰のXhoＩ及びSpeＩで消化した。そのライブラリーの構築をBurtonら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88:10134-10137（1991）により記載されたようにして行った。簡単に言えば、結合後に、Ｈ鎖DNAを含むpCo mb2-3ベクターをその後XL1-ブルー細胞へのエレクトロポレーションにより形質転換した。形質転換そして培養後に、ライブラリーサイズを培養物のアリコートを塗布することにより測定した。典型的には、ライブラリーは約10⁷の員を有していた。次いで一夜の培養物を調製し、それからＨ鎖ライブラリーを含むファージミドDNAを調製した。Ｖ_LコードDNA同族体（Ｌ鎖）のクローニングのために、Ｈ鎖ライブラリーを含むファージミドDNA10μgをその後SacＩ及びSbaＩで消化した。得られた直線状にされたベクターをホスファターゼで処理し、アガロースゲル電気泳動により精製した。長さ4.7kbの所望のフラグメントをゲルから切除した。このベクターと調製したＬ鎖PCR DNAの結合は、Ｈ鎖につき上記されたように進行した。cpIIIアンカー配列（Fd-cpIII）及びＬ鎖フラグメントに操作により結合されたＨ鎖フラグメントを有する約10⁷の員のライブラリーを、こうして生成した。 4)Fabヘテロダイマーを発現するファージの調製 XL1-ブルー細胞への先に生成された得られたライブラリーの形質転換後に、ファージを調製して標的抗原に関するパンニングによるHIV-1特異性Fabの単離を可能にした。ヘテロダイマー発現が誘導されたファージを単離するために、SOC培地３ml（SOCは水１リットル中のバクトトリプトファン20g、酵母エキス5g及びNa Cl 0.5gの混合物から、pHを7.5に調節し、そしてFd-cpIII及びＬ鎖ヘテロダイマーの発現を誘導する使用の直前にグルコース20mlを混合することにより調製した）を混合し、培養液を37℃で１時間にわたって220 rpmで振とうし、その時間後に、20μg/mlのカルベニシリン及び10μg/mlのテトラサイクリンを含むSB10ml（ SBは１リットル当たりトリプトファン30g、酵母エキス20g、及びモプス緩衝液10 gを混合し、pHを７に調節して調製した）を300rpmで更に１時間振とうした。この得られた混合物を、50μg/mlのカルベニシリン及び10μg/mlのテトラサイクリンを含むSB100mlに混合し、１時間振とうし、その時間後に、ヘルパーファージVCSM13（10¹²pfu）を混合し、その混合物を更に２時間振とうした。この時間後に、70μg/mlのカナマイシンを混合し、30℃で一夜保った。低温はファージの表面における更に良好なヘテロダイマーとり込みを生じた。上澄みを遠心分離により透明にした（４℃のJA10ローター中15分間にわたって4000rpm）。ファージを４％（w/v）のポリエチレングリコール8000及び３％（w/v）のNaClの混合物により沈殿させ、氷の上に30分間保ち、続いて遠心分離（４℃のJA10ローター中20分間にわたって9000rpm）を行った。ファージペレットをPBS 2ml中で再度懸濁させ、３分間にわたって微量遠心分離してデブリをペレットにし、新しい管に移し、以下に記載されるその後のスクリーニングのために-20℃で貯蔵した。コロニー形成単位（cfu）の力価を測定するために、ファージ（パッケージされたファージミド）をSB中で希釈し、１μｌを使用して、10μg/mlのテトラサイクリンを含むSB中で増殖された新しい（OD600=1）XL1-ブルー細胞50μｌを感染した。ファージ及び細胞を室温で15分間保ち、次いでLB/カルベニシリンプレートに直接塗布した。 5)ファージ表面における抗HIV-1ヘテロダイマーの選択 (a)ファージライブラリーの多重パンニング実施例2b4）で生成されたファージライブラリーを被覆マイクロタイタプレート上の本明細書に記載されたHIV-1株IIIbの組換えgp120に対しパンニングして抗 gp120ヘテロダイマーにつき選択した。第二ファージライブラリーを下記の組換えgp41（アメリカン・バイオテクノロジーズ、ボストン、MA）に対しパンニングして抗gp41ヘテロダイマーにつき選択した。使用したパンニング操作はパームレイ及びスミス（Parmleyら，Gene，73:305- 318（1988）により最初に記載された操作の改良であった。パンニングの４ラウンドを行って特定の抗原結合クローンにつき濃縮した。この操作につき、マイクロタイタプレート（コスター3690）の４つのウェルを0.1Mの重炭酸塩溶液、pH8. 6中の先に調製した25μｌの40μg/mlのgp120またはgp41（アメリカン・バイオテクノロジーズ）で一夜にわたって４℃で被覆した。ウェルを２回水洗し、ウェルをPBS中３％（w/v）BSAで完全に満たし、プレートを１時間にわたって37℃に保つことによりブロックした。ブロッキング溶液を振とうした後、先に調製したファージライブラリー（典型的には、10¹¹cfu）50μｌを夫々のウェルに混合し、プレートを２時間にわたって37℃に保った。ファージを除去し、プレートを１回水洗した。次いで夫々のウェルを１時間の期間にわたって室温でTBS/トゥイーン（50mMのトリス-HCl、pH7.5、150 mMのNaC l、0.5％のトゥイーン20）で10回洗浄し、この場合、洗浄はウェルをピペットで上下して洗浄し、毎回、洗浄の間にウェルをTBS/トゥイーンで完全に満たしたままにすることからなっていた。プレートを蒸留水でもう一度洗浄し、付着ファージを夫々のウェルへの50μｌの溶離緩衝液（固体グリシンでpH2.2に調節され、１mg/ml のBSAを含む0.1MのHCl）の添加により溶離し、続いて10分間室温に保った。溶離緩衝液を数回ピペットで上下して除去し、使用した溶離緩衝液50μｌ当たり2Mのトリス塩基３μｌで中和した。溶離したファージを使用して新しい（OD₆₀₀=1）E.coliXL-1ブルー細胞２mlを室温で15分間にわたって感染し、その時間後に、20μg/mlのカルベニシリン及び 10μg/mlのテトラサイクリンを含むSB10mlを混合した。20μｌ、10μｌ、そして１/10μｌのアリコートを塗布のために培養液から除去してプレートから溶離されたファージ（パッケージされたファージミド）の数を測定した。培養液を37℃ で１時間振とうし、その後、それを50μg/mlのカルベニシリン及び10μg/mlのテトラサイクリンを含むSB100mlに添加し、１時間振とうした。次いでヘルパーファージVCSM13（10¹²pfu）を添加し、その培養液を更に２時間振とうした。この時間後に、70μg/mlのカナマイシンを添加し、その培養液を37℃で一夜インキュベートした。ファージ調製そしてその後のパンニングを上記のようにして繰り返した。パンニングの夫々のラウンド後に、ファージの収率（％）を測定し、この場合、収率（％）は（溶離されたファージの数／適用されたファージの数）Ｘ100である。初期のファージインプット比を選択プレートにつき力価測定により測定したところ、パンニングの夫々のラウンドにつき約10¹¹cfuであった。最終のファージアウトプット比を、上記のようにして対数期のXL1−ブルー細胞２mlを感染し、アリコートを選択プレートに塗布することにより測定した。gp120反応性ファージに関する最初のパンニングにおいて、4.6Ｘ10¹¹のファージを４つのウェルに適用し、7.7Ｘ10⁵のファージを溶離した。４回目のパンニング後に、1.0Ｘ10⁸のファージを溶離した。この操作から、20のクローンをHIV-1のIIIB株からのグリコシル化組換えgp120に結合するそれらの能力につきFabライブラリーから選択した。５つのクローンをgp41への結合に特異的なFabライブラリーから選択した。次いでパンニングされたファージ表面ライブラリーを、以下に説明されるELISA によるその後のスクリーニングのために可溶性Fabフラグメントを発現するものに変換した。株IIIBのgp120及びgp41に関するパンニングに加えて、バキュロウイルス中で生産された組換えgp120（IIIB株）及びSteimerら，Science，254:105-108（1991 ）により記載されたようにして得られたチャイニーズハムスター卵巣細胞中で生産された組換えgp120（SF2株）がまた結合性ライブラリーのパンニングの抗原として意図されている。gp120 のV3ループの中央の最も保存された部分に相当する、Satterthwaitら，Bulletin of the World Health Organization，68：補遺，1 7-25（1990）により記載されたように調製された別の抗原、合成環状ペプチド、 N=CH-（CH₂）₃CO [SISGPGRAFYTG］NCH₂CO-Cys-NH₂（配列番号48）をマレイミド活性化BSAにカップリングした。ウェル当たりタンパク質抗原１μｇまたはBSA- ペプチド10μｇで被覆された１、２または４つのELISAウェルを使用してライブラリーをパンニングした。パンニングの４回のラウンドを上記の夫々の抗原につき行った。最終ラウンドからの溶離ファージを使用してXL1-ブルー細胞を感染した。４種の抗原に対するパンニングの４回のラウンドは100倍〜1000倍の溶離ファージの増幅を生じた。次いでパンニングされたファージ表面ライブラリーを、以下に説明されるその後のELISAによるスクリーニングのために可溶性Fabフラグメントを発現するものに変換した。 6)可溶性ヘテロダイマーの調製及びHIV-1抗原への結合特異性の特性決定上記のファージの表面で発現された突然変異誘発ヘテロダイマーの特異性を更に特性決定するために、酸溶離ファージからの可溶性Fabヘテロダイマーを調製し、HIV-1誘導抗原被覆プレートによるELISAアッセイにおいて、また競合アッセイにより分析した。可溶性ヘテロダイマーを調製するために、先に調製した20のgp120陽性クローン及び５のgp41陽性クローンからのファージミドDNAを単離し、SpeＩ及びNheＩで消化した。これらの酵素による消化は適合性付着末端を生じた。遺伝子III部分を欠いている4.7 kbのDNAフラグメントをゲル精製し（0.6％のアガロース）、自己結合した。E.coli XL1-ブルー細胞の形質転換はcpIIIフラグメントを欠いている組換え体の単離を与えた。クローンをXhoＩ-XbaＩ消化によるcpIIIフラグメントの除去につき試験し、これは1.6-kbのフラグメントを生じるべきである。0. 2のOD₆₀₀に達するまでクローンを50μg/mlのカルベニシリン及び20mMのMgCl₂を含むSB100 ml中で37℃で増殖させた。IPTG（１mM）を添加し、培養物を30℃で一夜増殖させた（37℃の増殖はヘテロダイマー収率のごくわずかな低下を与える）。細胞を４℃でJA10ローター中15分間にわたって4000rpmで遠心分離によりペレットにした。細胞を、34μg/mlのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を含むPBS 4ml中で再度懸濁させ、氷上で音波処理により溶解した（50％の能力で２〜４分間）。デブリをJA20ローター中で４℃で15分間にわたって14,000rpm で遠心分離によりペレットにした。上澄みを以下に説明されるELISA分析に直接使用し、-20℃で貯蔵した。多数のクローンの研究につき、培養液10mlは分析に充分なヘテロダイマーを与えた。この場合、音波処理を緩衝液２ml中で行った。また、上記のアッセイをgp41特異性クローンにつき行った。 a)ELISAによるスクリーニング先に調製した可溶性ヘテロダイマーをELISAにより分析した。このアッセイのために、gp120及びgp41をパンニング操作のための上記のマイクロタイタプレートの個々のウェルに別々に混合し、４℃で一夜保ってタンパク質溶液をウェルの壁に付着させた。維持期間後に、ウェルを５回水洗し、その後、PBS中で希釈された１％のBSAの溶液100μｌと共に１時間にわたって37℃に保ち、ウェルの非特異性部位をブロックした。その後、プレートを倒立させ、振とうしてBSA溶液を除去した。次いで特定の糖タンパク質基質と反応性の先に調製した可溶性ヘテロダイマー25μｌを夫々のウェルに混合し、１時間にわたって37℃に保って免疫反応生成物を生成した。維持期間後に、ウェルを10回水洗して未結合の可溶性抗体を除去し、次いで１％のBSAを含むPBS中で希釈されたアルカリ性ホスファターゼに接合された二次ヤギ抗ヒトIgG F（ab'）₂の1:1000希釈液25μｌと共に維持した。ウェルを１時間にわたって37℃に保ち、その後、ウェルを10回水洗し、続いてp-ニトロフェニルホスフェート（PNPP）50μｌで発色させた。発色を405nm で監視した。陽性クローンは10分後に＞１（殆どの場合、＞1.5）のA405値を生じ、一方、陰性クローンは0.1〜0.2の値を生じた。 gp120反応性Fabのおよその濃度を、Zebedeeら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，8 9:3175-3179（1992）により記載されたサンドイッチELISAを使用するELISAにより測定し、図６の最初の欄に示す。加えて、FabはＥ．coli中で発現され、正確に集合したタンパク質のフラクションが変化し得るので、gp120と反応するFabの量がまたELISA滴定により測定された。また、そのデータを図６中の第二欄に示す。 HIV-1誘導抗原に対してパンニングしたクローンにつき、可溶性Fabフラグメントを発現するライブラリーへのパンニングしたファージ表面ライブラリーの変換後に、30〜40のコロニーを使用してXL1-ブルー細胞を形質転換し、上澄みをパンニングに使用した抗原に対するELISAアッセイでスクリーニングした。一般に上澄みの80％より多くが試験して陽性であった。次いで代表的な数の陽性物を更なる分析のための夫々の抗原パンニングから選択した。 b)可溶性gp120及びCD4による競合ELISA 上記のELISAアッセイで測定された免疫反応性ヘテロダイマーを、その後、競合ELISAにより分析して選択したヘテロダイマーのアフィニティーを測定した。上記のようにして、0.1Mの重炭酸塩緩衝液、pH8.6中の５μg/mlのgp120または可溶性CD4（アメリカン・バイオテクノロジーズ）で別々に被覆したマイクロタイタウェルにつきELISAを行った。0.5％のBSA/0.025％のトゥイーン20/PBS中に希釈された10-¹¹Mから10-⁷Mまでの濃度の範囲で次第に増加する濃度の可溶性または遊離のgp120を可溶性ヘテロダイマーと混合し、その希釈を滴定実験で測定し、その実験は２倍希釈後にOD値のかなりの低下をもたらした。CD4競合アッセイにつき、0.5％のBSA/0.025％のトゥイーン20/PBS中に希釈された10-¹¹Mから10-⁶ Mまでの濃度の範囲で次第に増加する濃度の可溶性または遊離のCD4を可溶性ヘテロダイマーと混合した。プレートを90〜120分間にわたって37℃に保ち、0 .05％のトゥイーン20/PBSで注意して10回洗浄し、その後、1:500の希釈でアルカリ性ホスファターゼ標識したヤギ抗ヒトIgG F（ab'）₂と混合し、続いて１時間にわたって37℃に保った。発色をELISAにつき記載されたようにして行った。下記の実施例３に記載された中和能の関係がHIV-1特異性Fabの抗原結合アフィニティーに関係し得ることを証明するために、競合アッセイを行い、この場合、可溶性gp120をFab結合につきELISAプレートに被覆されたgp120と競合させた。図７は、全てのFabが約10-⁹Mの遊離gp120のIC₅₀でgp120への結合から競合されたことを示す。加えて、実施例３に示されるように、抗原アフィニティーと中和の間には相関関係がない。試験したFabは、実施例４に記載された配列分析及び比較により決定されたのと同じグループの員であるFab 4、12、21及び７を含んでいた。Fab13、27、６、29、２及び３は、実施例４に記載された配列分析及び比較により決定されたのと異なるグループの全ての員である。ループ２はV3ループを認識する以外はその他のFabと同じライブラリーから選択されたFabフラグメントである。V3ループペプチドのみを用いて、競合をSF2株からのgp120を用いて行った。中和がgp120-CD4相互作用のブロッキングと関連し得るか否かを調べるために、gp120被覆ELISAウェルへの結合につきFabと競合する可溶性CD4を用いて競合EL ISAを行った。結果を図８に示す。P4D10及びループ２は、CD4により競合されないと予想される対照である。P4D10はgp120（IIIB）のV3ループと反応するマウスモノクローナル抗体である。ループ2Fab競合を、gp120（SF2）を使用して行った。図８に示されるように、対照を除いて全てのFabの結合が約10^-8Mの可溶性CD4 のIC₅₀で抑制された。加えて、CD4により抑制されたgp120に対する中和Fabと非中和Fabの間に相違が検出されなかった。これは、CD4-gp120相互作用のブロッキングがHIV-1ウイルスのFab中和に重要な因子でありそうもないことを意味する。同様の競合アッセイを、４種のHIV-1誘導抗原に対しパンニングされたFabを用いて行った。gp120（IIIB）に対するパンニングから誘導された19のFabは10⁷〜1 0^-9Mの範囲のgp120（IIIB）に対する見掛アフィニティー（1/50％抑制の濃度）を示し、殆どが1-3Ｘ10^-8である。パンニング操作は、タイトバインダーにつき強く選択する傾向があり、こうしてアフィニティーの比較的狭いバンドへのグルーピングが予想された。gp160（IIIB）に対するパンニングから誘導された1 6のFabのうちの、６種がまたgp120（IIIB）と反応性であり、競合ELISAはそれらがｇp120に対しパンニングされたFabと同様の見掛アフィニティーを有することを示した。gp160パンニングからの非gp120反応性クローンはgp160との低いELISA 反応性を示し、gp160と充分には競合し得なかった。それらはgp41に対し誘導し得るが、ここでは探究されなかった。また、gp120（SF2）に対するパンニングから誘導された８種のFabはgp120（IIIB）との強いELISA反応性を示し、同様の見掛結合アフィニティーを示した。４種のFabをV3ループペプチドに対するパンニングから誘導した。これらのFabのうち、２種がELISAでgpl20（SF2）と反応したが、いずれもがgp120（IIIB）と反応しなかった。gp120（SF2）に対するこれらのループバインダーの見掛結合アフィニティーは10^-8Mであった。 Fabの株交差反応性に関する調査を完全にするため、gp120パンニング及びgp16 0（IIIB）パンニングから誘導されたFabをgp120（SF2）とのELISA反応性につき調べた。全てが反応性であった。それ故、V3ループペプチドに対するパンニングにより選択されたFabを除いて全ての試験したFabは、IIIB株及びSF2株からのgp1 20に結合した。 FabをELISAウェルに固定されたgp120（IIIB）へのそれらの結合のCD4抑制につきスクリーニングした。再度、V3ループバインダーを除いて全てが、CD4抑制に対する感受性を示した。抑制定数は10^-7〜10^-9Mの範囲であった。本発明のHIV-1組換えFabの結合が過剰の本発明のFabだけでなく、無症候性もしくは症候性の患者血清中に存在し、またはEBV形質転換、等の如きその他の手段により得られたポリクローナルもしくはモノクローナルのHIV-1抗体の存在下で行われるような競合ELISAアッセイがまた意図されている。本発明の特性決定されたFabの結合につき競合する外部混合された抗体の能力は、特異なエピトープ及び結合特異性に加えて均等な抗体の測定を可能にするであろう。 3.試験管内のHIV-1に対する組換えヒトFabフラグメントの中和活性ウイルスへの抗体の結合は、感染性または中和の損失をもたらすことができ、ウイルスに対する防御機構のみならず、抗体が重要な役割を果たすことが広く認められている。しかしながら、抗体中和に基く分子上の原理の理解は制限され、抗体のその他のエフェクター機能の後に遅れている。このような理解はワクチンの合理的な設計そして予防または治療のための受動抗体の有効な使用に必要とされる。これはヒト免疫不全ウイルスにつき特に緊急である。幾つかの研究が、ウイルスが一つより多い機構により中和されるという一般的な結論を導き、使用される機構はウイルスの性質、認識されるエピトープ、抗体のイソタイプ、ウイルス侵入に使用される細胞レセプター及びウイルス：抗体の比の如き因子に依存するであろう。中和の主たる機構は、ウイルス粒子の凝集、細胞レセプターへのウイルスの付着の抑制及び付着後のイベント、例えば、ウイルス膜及び細胞膜の融合及びウイルス粒子の二次の非被覆（uncoating）の抑制と考えることができる。第三の機構の重要な特徴の一つは、それが最初の二つの機構につき予想される抗体のほぼ化学量論量よりはるかに少ない量を必要とし得ることである。何となれば、ウイルス粒子の少数の重要な部位の占有が中和に充分であり得るからである。例えば、インフルエンザＡウイルス粒子の中和は、Ou tlawら，Epidemiol.Infect.，106:205-220（1992）により記載されているような単一ヒット速度論に従うことが示された。徹底的な研究がHIV-1の抗体中和につき行われた。総説に関して、Naraら，FAS EB J.，5:2437-2455（1991）を参照のこと。殆どがV3ループとして知られているウイルスエンベロープ糖タンパク質gp120の第三超可変部中の単一線状エピトープに集中した。このループに対する抗体は、ウイルス膜と細胞膜の融合を抑制することにより中和するものと示唆される。中和において生じるループへの結合は、ウイルス−細胞相互作用の前またはCD4へのgp120の結合後に起こり得る。Nara ら，ヒトエイズ及び関連動物疾患のレトロウイルス，Girardら編集，138-150頁（1988）； Linselyら，J．Virol.，62:3695-3702（1988）；及びSkinnerら，J ．V-irol.，67:4195-4200（1988）を参照のこと。V3ループの特徴は、ループ内の配列変異性［Goudsmitら，FASEB J.，5:2427-2436（1991）及びAlbertら，AID S，4:107-112（1990）］及びループ外の配列変化に対するループの中和抗体の感受性［Naraら，FASEB J.，5:2437-2455（1991）； Albertら，上記文献； McKea tingら， AIDS，3:777-784（1989）；及びWahlbergら，AIDS Res.Hum.Retroviruses，7:98 3-990（1991）］である。それ故、抗V3ループ抗体は、しばしば株特異性であり、生体内のループ中の突然変異は抗体中和からのウイルスの回避のための機構を与え得る。最近、かなりの関心がgp120へのCD4結合をブロックできる抗体に集中していた。幾つかのグループが、これらの抗体の特徴を、（ａ）高次、即ち、非直線状のエピトープと反応し、（ｂ）広範囲のウイルス単離株と反応し、かつ（ｃ）更に長い感染期間後にヒトの主たる中和抗体であると記載していた。Berkowerら，J. Vir-ol.，65:5983-5990（1991）；Steimerら，Science，254:105-108（1991）； Hoら，J.Virol.，65:489-493（1991）；Kangら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88 :6171-6175（1991）；Posnerら，J.Immunol.，146：4325-4332（1991）；及びTi lleyら，Res.Virol.，142:247-259（1991）を参照のこと。この型の中和抗体は潜在的な治療薬の有望な標的を与えることが明らかであろう。これらの抗体の中和の一つ以上の機構が知られていないが、これはウイルス付着のブロッキングではないかもしれないという或る種の指示がある。何となれば、gp120へのCD4結合を抑制する幾つかのマウスモノクローナル抗体が非中和性またはごく弱い中和性であるからである。結合性ライブラリーを使用するBurtonら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88:101 34-10137（1991）により記載されたようなHIV-1のエンベロープに対するヒトモノクローナル抗体の産生は、中和の問題に対する新しいアプローチを可能にする。gp120の３次元構造の欠如及びウイルスの複雑さを仮定すると、そのアプローチは関連抗体の挙動により分子レベルで中和を研究しようと試みる。これは下記の理由により可能である。（１）組み合わせのアプローチは多数のヒト抗体の迅速な産生を可能にし、（２）抗体（Fabフラグメント）がE.coli中で発現され、容易に配列決定でき、そして（３）抗体が同様の配列及び共通の構造モチーフを有し、機能の相違を一次構造と有意に関連させる。中和の研究を、実施例１及び２に記載されたようにして調製されたgp120に対する20のクローンからのヒト組換えFabフラグメントにつき本明細書に記載されたようにして行い、それらの全てが株交差反応性であり、gp120に結合することからCD4により抑制される。ここに示された結果は、中和がウイルス凝集またはウイルス粒子表面におけるgp120分子の架橋により影響されず、また可溶性CD4と組換えgp120の間の相互作用のブロッキングと関連されなかったことを示す。また、中和の研究を、実施例１及び２に記載されたようにして調製されたgp41 反応性クローンからのヒト組換えFabフラグメントにつき本明細書に記載されたようにして行った。結果を以下に示す。二つの異なるアッセイ、即ち、p24 ELISAアッセイ及び融合細胞アッセイを行って組換えヒトHIV-1免疫反応性Fabの中和能を測定した。付加的なアッセイ、即ち、プラークアッセイを行ってgp41反応性Fabの中和有効性を測定した。プラークアッセイにおいて、CD4+細胞をウイルスによる接種の前に可溶性gp41反応性Fa bの存在下または不在下で培養した。抗体による感染性の抑制（また、中和と称される）を、PBS単独に暴露された細胞と比較して培養液中のプラーク形成率（％）として表した。これらのアッセイの幾つかにつき、組換えFabを最初に精製した。50μg/mlのカルベニシリン及び20mMのMgCl₂を含むSBの１リットル培養液に適当なクローンを接種し、７時間後に２mMのIPTGで誘導し、30℃で一夜増殖した。細胞ペレットを音波処理し、得られた上澄みを50mlの容積まで濃縮した。濾過した上澄みを25 mlのプロテインＧ抗Fabカラムに装填し、３ml／分の速度で緩衝液120 mlで洗浄し、pH2.3でクエン酸で溶離した。次いで中和フラクションを濃縮し、50mMのMES 、pH6.0に交換し、１ml／分の速度で2mlのモノ-Sカラムに装填した。０〜500 mM のNaClの勾配を１ml／分で運転し、Fabが200〜250mMのNaClの範囲で溶離した。濃縮後、gp120に対するELISAで力価測定した場合、Fabは陽性であり、10〜15％のSDS-PAGEにより50kDの単一バンドを示した。1.4の吸光率（１mg/ml）を使用して濃度を280nmで吸光度測定により測定した。 a.p24 ELISAアッセイにより測定される中和このアッセイにつき、HIV-1 IIIBまたはMN感染した末梢血単核細胞（PBMC）（ 50TCID₅₀（50％組織培養感染投与量）、100μｌ）の希釈された組織培養上澄みを実施例2b6）で調製した組換えFab上澄みの、1:20の希釈で開始する連続希釈液（1:2)と共に２時間にわたって37℃に保った。また、ヒト中和血清、既知のヒト中和モノクローナル抗体2F5及びパパイン消化によりその抗体から誘導されたFab フラグメント、並びにBrolidenら，J.Virol.，64:936-940（1990）により記載されたような既知のマウス中和モノクローナル抗体及びそのF（ab'）₂フラグメントを含む対称Fab上澄みを用意した。PBMC（１ｘ10⁵の細胞）をウイルス／抗体混合物に混合し、１時間にわたって37℃に保った。その後、細胞を洗浄し、10％のウシ胎児血清、１％のグルタミン、抗生物質及びIL-2を補給したRPMI 1640培地（ギブコ）中で維持した。培地を１日目及び４日目に交換した。感染７日後に、上澄みを回収し、Sundqvistら，J．Med．Virol.，29:170-175（1989）（その開示が参考として本明細書に含まれる）により記載されたHIV-1 p24抗原捕獲ELISA により分析した。培養上澄み中の490nmにおける光学密度の80％以上の低下が陰性Fabまたは陰性ヒト血清と比較して起こった場合に、中和を陽性と定義した。全てのFab、mAb及び血清を用いる試験を少なくとも２回繰り返した。 b.融合細胞形成に基く定量的な感染性アッセイ HIV-1のMN株を用いる定量的な中和アッセイを、Naraら,AIDS Res.Human Re-tr oviruses，3:283-302（1987）（その開示が参考として本明細書に含まれる）により記載されたようにして行った。CEM-SS標的細胞の単層を抗体の存在下または不在下でウイルスと共に培養し、融合細胞形成単位の数を３〜５日後に測定した。等量のウイルスをそのアッセイに使用して、試験した種々の抗体濃度の直接の比較を可能にした。そのアッセイは抗体の濃度の２〜４倍の相違内で１〜0.001 のウイルス生存フラクション範囲にわたって反復可能であった（P<0.001）。 c.gp120に対する中和アッセイの結果アッセイを一般に再現性の結果でもって少なくとも２回繰り返した。図６に報告されたデータにつき、gp120特異性Fab上澄みを二つの部分に分け、一方をp24 アッセイに使用し、他方を融合細胞アッセイに使用した。ダッシュ（-）は、p24 アッセイにおいて1:20の希釈で、また融合細胞において1:16で中和がなかったことを示す（殆どのクローンは1:4の希釈で検出可能な中和を示さない）。中和力価を、その図に示す。p24アッセイにつき、力価はELISAにおける吸光度の80％より大きい低下を生じる最大希釈に相当する。融合細胞アッセイにつき、Fab 4及び12は上澄みの1:4希釈で95％より大きい中和を生じ、また1:128の希釈で夫々80％及び70％の低下を生じた。これらのFabはアッセイの両方の型において有効な中和剤であった。また、プロウイルス組み込みのPCRに基くアッセイを使用して、それらはIIIB株及びRF株による感染を中和することが示された。Fa b６及び７は融合細胞アッセイにおいて中和を示さなかったが、その他の上澄み製剤は活性を示した。Fab13はp24アッセイにおいて一貫して有効であったが、融合細胞アッセイでは有効ではなかった。幾つかのその他のクローンが更に低いレベルの中和能を示す。 Fabを先に記載されたようにしてクローンの幾つかの選択から精製し、両方の中和アッセイに使用した。図９に示されるように、Fab４及び12は、例えば、約2 0nM（１μg/ml）のFab濃度で融合細胞形成の50％の抑制で同様のレベルで両方のアッセイにおいて再度有効であった。示された結果は、MN株を使用する融合細胞アッセイから誘導される。Fab７及び21は融合細胞アッセイにおいて同等に有効であったが、p24アッセイにおいて若干有効ではなかった。p24アッセイは夫々３ μg/mlのFab４、15μg/mlのFab７、３μg/mlのFab12、４μg/mlのFab13及び７μ g/mlのFab21につきHIV-1 MN株の80％より大きい中和を示した。しかしながら、F ab13は25μg/mlで融合細胞アッセイにおいて有効ではなかった。IIIB株につき、 80％より大きい中和が、夫々13μg/mlのFab4、15μg/mlのFab７、７μg/mlのFab 12及び14μg/mlのFab21につき観察された。Fab11は図６に示されるように精製されない場合には中和アッセイにおいて有効ではなく、精製後にFab11はHIV-１を中和するのにFab12と同等に有効であった。この理由のために、そのFabがFab12 及びFab13と共に実施例７に記載されたようにATCCに寄託されている。図６及び９に示されたデータから生じる幾つかの結論がある。HIV-１はウイルス粒子表面でウイルス粒子凝集またはgp120分子の架橋を生じないで中和し得ることが明らかである。何となれば、１価のFabフラグメントが有効であるからである。この知見を更に確かめるために、Fabフラグメントを既知の中和ヒトモノクローナル抗体のパパイン消化により産生した。図６に示されるように、FabフラグメントはHIV-１のMN株の中和において全IgGとほぼ同等に有効であった。これはV3ループに対する２種のマウスモノクローナル抗体から調製されたFabに関する結果と一致する。マウスモノクローナル抗体のＦ（ab'）₂フラグメントは、 MN株の中和において親IgGよりも若干有効ではなかった。重要なことに、これらの対照抗体からのフラグメントはHIV-１のIIIB株を中和するのに比較的不十分であった。また、これらの結果は、使用した２つのアッセイの間に相違があることが明らかであることを示す。何となれば、Fab13は一方のアッセイにおいて一貫して有効であったが、他のアッセイにおいて有効ではなかったからである。主たる変数は、感染前のウイルス及び抗体のインキュベーション時間（p24アッセイにつき２時間、また融合細胞アッセイにつき0.5時間）、感染に使用したウイルスの量、ウイルスを増殖するのに使用した細胞（前者につきヒトPBMC、また後者につきH9細胞）及び感染された細胞（前者につきヒトPBMC、また後者につきCEM. SS細胞）であった。これらのうち、異なる細胞中に通過された、二つのアッセイに使用したMNウイルスは重要なことに異なるという強い可能性がある。 d.gp41に関する中和アッセイの結果 gp41反応性Fabは、位置565-585及び644-663にあるアミノ酸残基を含むgp41の高次エピトープに対し特異性を示した。５種の選択されたgp41特異性FabをDL41 19、DO 41 11、GL 41 １、MT 41 12及びSS 41 ８と称した。中和アッセイをgp12 0反応性Fabにつき上記されたようにして行った。プラークアッセイにおいて、示されたデータは50％の中和を得るのに必要とされるFabの濃度マイクログラム／ミリリットルである。また、その他の二つのアッセイに関するデータは、上記の p24アッセイ及び融合細胞アッセイの記載に定義されるように感染を中和するのに必要とされるFabのマイクログラム／ミリリットルで表される。三つの中和アッセイ、プラーク、融合細胞及びp24の結果を表４に示す。MN HIV-１株及びIIIB HIV-１株をアッセイにつき表４に示されるように使用した。略号“ND”は、表に示される場合に測定されなかったことを表す。表４に示されるように、全ての５種のFabは、プラークアッセイ、融合細胞アッセイまたはp24アッセイにおいてHIVのMN株及びIIIB株の両方を中和するのに有効であった。Fab DL 41 19及びDO 41 11はプラークアッセイにおいて株特異性を示し、この場合、前者はIIIB株よりもMN株とのプラーク形成を抑制するのに10倍有効であった。反対の特異性がDO 41 11 Fabで見られた。しかしながら、両方の Fabは融合細胞アッセイにより測定して匹敵する中和を示した。２種のFab、GL 4 1 １及びSS 41 ８はMN株またはIIIB株とのプラーク形成を抑制するのに同等に有効であった。Fab MT 41 12は同様に株特異性ではなかったが、中和が10倍多い抗体を必要とした。Fab MT 41 12がp24アッセイに使用された場合、株特異性が明らかではなく、この場合、同じ量の抗体が同等に有効であった。全ての５種の抗体が融合細胞アッセイで測定されたようにIIIBを中和した。こうして、５種のgp41特異性Fabが、中和活性を測定するのに使用した三つのアッセイの少なくとも二つにおいてHIV-１MN及びIIIBを中和した。更に、株特異性がプラークアッセイにより測定されるように５つのアッセイのうちの二つにおいて支配的であった。これらの判別中和特性に基いて、gp41特異性FabはHIV-１を中和するのに有益な治療試薬を与える。 4.HIV-１特異性モノクローナル抗体Fab間の核酸配列分析の比較及び相当する誘導アミノ酸残基配列中和抗体と弱い中和Fabまたは非中和Fabとの間の関係を研究するために、中和活性が分析された図６にリストされた20種を含む実施例２で調製されたヒト抗gp 120Fabを発現する32のクローンの可変ドメインを配列決定した。加えて、５種の gp41特異性Fabをまた配列決定した。シーケナーゼ1.0（USB、クレーブランド、OH）及びCglドメイン（SEQGb：５’ GTCGTTGACCAGGCAGCCCAG ３’配列番号49）またはCkドメイン（SEQKb：５’ATAGA AGTTGTTCAGCAGGCA ３’配列番号50）中の配列にハイブリッドを形成する適当なプライマーを使用して核酸配列決定を二本鎖DNAにつき行った。また、配列決定は一本鎖DNA及びT3プライマー（５’ATTAACCCTCACTAAAG ３’配列番号51）またはCkドメイン（KEF：５’GAATTCTAAACTAGCTAGTTCG ３’配列番号52）中の配列にハイブリッドを形成するプライマーを使用した。 32のgp120特異性クローンの核酸配列から誘導された可変Ｈ鎖及びＬ鎖のアミノ酸残基配列を夫々図10及び11に示す。グルーピングをＨ鎖配列中の類似性に基いて行った。ドットは夫々の部分中の第一配列との同一性を示す。配列番号が、図それ自体中の相当する誘導Ｈ鎖及びＬ鎖（配列番号53-81からＶ_H、また配列番号82-113からＶ_L）アミノ酸残基配列の右にリストされる。互いの誘導配列の整列及びゲンバンク・データベースによる誘導配列の整列はプログラムのマックベクタースートを使用した。Sanz，J.Immunol.，147:1720-1 729（1991）により記載されたＨ鎖CDR3配列の分析につき、殆どの5'ヌクレオチドがKabatら，免疫学上関係するタンパク質の配列，US Dept．of Health and Hu man Services，ワシントン，DC（1991）によればＨ鎖可変領域のコドン95の後の最初のヌクレオチドであると考えられた。殆どの3'ヌクレオチドが、公表された生殖細胞系JH遺伝子と整合された配列の前の最後の同定されていないヌクレオチドに帰属された。DNASTARソフトウェアーを使用してCDR3配列を分析した。あらゆる点で最良の相同性を与える生殖細胞系Ｄ遺伝子を決定するために、配列の比較をALIGNプログラム及びCOMPAREプログラムの両方で行った。第二工程において、SEQCOMPプログラムを使用してコードストランドまたは生殖細胞系Ｄ遺伝子の逆補体を有する少なくとも６のヌクレオチドの配列同一性を見出した。 gp41特異性FabのＨ鎖配列及びＬ鎖配列を夫々図18及び19に示す。CDR3Ｈ鎖のアミノ酸残基配列は、可変ドメインのその他の領域よりもFab間で殆どの変化を示す。 a.Ｈ鎖配列によるグループへの抗体の編成 32のgp120クローンのＶ_Hドメイン及びＶ_Lドメインを配列決定し、マックベクターソフトウェアーを使用を使用してＶ_Hドメインを比較した。この分析は、異なる抗原に対するパンニングにより選択されたクローンを含む幾つかのクローンが互いに密接に関連していることを直ちに証明した。この例外は、gp120/160抗原に対するパンニングにより選択されたFabに関係しないV3ループペプチドに対するパンニングにより選択されたFabである。図10は、gpl20/160パンニングから誘導されたＶ_H配列が７つのグループに編成し得ることを示す。アミノ酸配列の比較から明らかな広い特徴が、本明細書に説明される。グループ内の配列の関連性がかなり変化する。例えば、クローン番号b8で開始するグループ中で、アミノ酸配列が非常に類似する。６のクローンは同一であり、残りが主配列からの最大５つの相違（排除された5'プライマーによるEQ相違）を示した。唯一のクローンがCDR3領域中で単一の相違を示した。主配列からのこのグループ中の全ての配列にわたる平均の差異は1.1アミノ酸残基／可変ドメインである。この量は、PCRから生じ得る差異の大きさに相当する。一定のドメインの配列決定はドメイン当たり約１の塩基変化のPCRエラー頻度を示した。対照的に、クローンb3を筆頭とするグループ中で、二つのクローンは全く同一ではなかった。コンセンサスグループ配列からの平均の相違は配列当たり3.3の残基であり、CDR3単独に関する測定は1.3である。それ故、おそらくこのグループ中のＨ鎖は互いの体細胞変異体であると考えられる。クローン１を筆頭とするグループは第三のパターンを示す。クローンb1及びb1 4はクローンb2及びB2と同様に同一である。しかしながら、23のアミノ酸の相違が二つの組のクローン間に存在する。クローンb24及びB30は、これらの二つの組のクローンまたは互いにほぼ同等に良く区別される（13〜25の相違）。依然としてCDR3領域が非常に類似している。幾つかの説明がこのパターンにつき示唆し得る。１）このグループ中の全てのクローンが、広範囲にわたる体細胞突然変異を受けた同じ生殖細胞系遺伝子に由来し、２）クロスオーバーイベントが起こって異なる生殖細胞系遺伝子を同じDJ組み合わせで実質的に組み換え、３）“収束進化” プロセスが同じDJ組み合わせと会合した異なる生殖細胞系遺伝子の選択をもたらした。 b.gp120バインダーからのＶ_Lドメインの配列 FabのＶ_L配列を図10中に特定されたグループに編成し、図11に示す。直ちに、図10と比較して、抗原結合能そして実際に、殆どの部分につき、抗原アフィニティーを保持する同じか、または非常に類似するＨ鎖との異なるＬ鎖の対合により証明されるような広範囲の鎖乱婚が明らかであった。この乱婚は先に考えられたグループを更に参考として更に研究し得る。クローンb8グループ（その中で、Ｈ鎖の員は同一であり、または非常に類似する）はまた同一であり、または非常に類似する４つのＬ鎖（３より小さいアミノ酸の相違）を生じた。それ故、主たるＨ鎖−Ｌ鎖組み合わせがこのグループにつき記載し得る。一つの員（クローンb8）は同じか、または非常に密接に関連したＶ_L遺伝子を有していたが、異なるJK遺伝子を使用することが明らかであった。二つのその他の員（クローンB8及びb18）は主要配列に更にかけ離れて関連していた（７〜12の相違）。更に二つのクローン（b13及びB26）はVk1と比較して異なるファミリー、Vk3からのVk遺伝子を使用し、それ故、主要配列に関連していなかった。単一Ｈ鎖の体細胞変異体を含むと示唆されたクローンb3グループは、かなりのＬ鎖多様性を示し、二つの員は互いに密接に関連していなかった。Vk3-Jk2組み合わせが支配的であったが、Vk3-Jk3組み合わせ及びVk1-Jk3組み合わせがまた生じた。一方、クローンb1グループにおいて、Ｈ鎖がそれらのＬ鎖パートナーにつき更にえり好みすることの証拠が存在した。こうして、密接に関連したＨ鎖は関連Ｌ鎖と対合されることが明らかであった。同一のＨ鎖対（blとb14；b2とB2）は非常に類似したＬ鎖（夫々、２及び４のアミノ酸の相違）を有し、一方、異なるＨ鎖（b24及びB30）は互いに、またはその他のグループ員に関連しない異なるＬ鎖を有していた。クローン４グループは、４つの密接に関連したＨ鎖が異なったクローンb7Ｌ鎖以外は３つの密接に関連したＬ鎖（主たるＨ鎖−Ｌ鎖組み合わせ）と対合された点でこの現象の別の例を与える。要するに、Ｈ鎖（Ｖ_H）配列を７つのグループに編成し、この場合、グループの夫々の員はいずれかの制限された数の相違でもって同一または非常に類似した CD3領域を有する。Ｌ鎖（Ｖ_L）がそれらのＨ鎖パートナーにより特定されたグルーピングに束縛された場合、かなりのＬ鎖配列変化が観察された。鎖乱婚のこの現象が先に観察され、図11を参考にして理解し得る。顕著な中和能が配列の二つのグループに制限された。第一グループは、非常に類似するＨ鎖及びＬ鎖を有するFab４、７、12及び21からなっていた。第二グループはＦab13、８、18、22及び27からなっていた。Fab13のみが顕著な中和能を示したが、その他は若干弱い活性を示した。重要なことに、このグループにおいて、Fab13はそのグループのその他の員とは異なるＬ鎖を有していた。 5.ライブラリーに対する単一クローンのＨ鎖及びＬ鎖のシャッフリング可能な機能性Ｈ鎖−Ｌ鎖組み合わせを更に研究するために、図10に示されたクローンb12（また、相当する可溶性Fab製剤につきFab12と称される）のＨ鎖を実施例２で調製した最初のＬ鎖ライブラリーと組換えて新規なライブラリーH12-LC nを構築した。加えて、b12Ｌ鎖を最初のＨ鎖ライブラリーと組換えてライブラリーHn-L12を構築した。これらの二つのライブラリーを実施例2b5）に記載されたg p120（IIIB）に対するパンニングの３ラウンドにより得た。得られた免疫反応体クローンから発現されたFabを上記の実施例３に記載されたようにして分析した。クローンb12を選択した。何となれば、このFabは実施例３に示されたように試験管内でHIV-１を中和したからである。最初のＬ鎖ライブラリーを用いてクローンb12のFd遺伝子からシャッフリングされたライブラリーの調製を行うために、b12Ｈ鎖を最初にpComb2-3中で発現された破傷風トキソイド結合クローンにサブクローン化した。次いでＬ鎖ライブラリーをこの構築物にクローン化して１ｘ10⁷の員のライブラリーを得た。そのサブクローニング工程を使用して最初のＬ鎖による汚染及び過剰代表度（over-rep -resentation）を避けた。同様の操作をクローンb12からのＬ鎖に対するＨ鎖のシャッフリングに採用して３ｘ10⁶の員のライブラリーを得た。クローニング操作及びパンニング操作を、最初のライブラリーにつき上記されたようにして行った。 b12で組換え、パンニングによりgp120を結合した11のＬ鎖をその後の競合ELIS A及び配列分析にランダムに選択した。このシャッフリングされた組み合わせの見掛アフィニティーは約10^-8〜10^-9MのIC₅₀で同様であった。これらの配列を編成し、この場合、３種の組は最初のb12Ｌ鎖に非常に類似し、その他の８種は幾つかの可能なサブグルーピングにより最初のものから多くの相違を示した。 b12Ｈ鎖クローンに結合したＬ鎖の配列を図12に示す。これらの配列をクローンb12からの最初のＬ鎖の配列と比較する。Ｌ鎖を、最初のＬ鎖クローンに相当しない番号により同定する。新しいＬ鎖を有する新たに選択されたクローンの帰属番号はこうして任意である。また、これらのＬ鎖の配列を配列表中に配列番号 114〜122にリストする。幾つかのＬ鎖配列は同一である。gp120との免疫反応性に加えて、これらのシャッフリングされたクローンから単離された新規なFab を実施例３に記載されたようにしてHIV-１感染の中和に関する融合細胞アッセイで試験した。夫々クローンb12からのＨ鎖、既知のHIV-１中和クローン、及びL28 、L25、L26及びL22と称される新しいＬ鎖を有する４種のシャッフリングされたモノクローナルFab抗体は全て0.4μg/mlの精製Fabを用いる融合細胞アッセイにおいて約60％の中和を示した。この効果は、最初のクローンb12Ｈ鎖及びＬ鎖対で得られた効果に等しかった。約80％の最大の中和が、0.7μg/mlでH12/L28Fab 及びH12/L25Fabで得られ、これは最初のクローンb12Ｈ鎖及びＬ鎖対で見られた中和に等しかった。H12/L22Fab及びH12/L26Fabから得られる中和は、0.4μg/ml 〜1.0μg/mlのFab濃度で60％でプラトーになった。こうして、実施例２に記載されたようにして調製された最初のライブラリー中で得られたgp120免疫反応性かつHIV中和Fabに加えて、既知の中和Ｈ鎖をＬ鎖のライブラリーとシャッフリングすることにより、新規なHIV-１中和Fabモノクローナル抗体を得た。また、b12Ｌ鎖と組換えたＨ鎖をランダムに選択した。一つは最初のb12Ｈ鎖に非常に似ていたが、その他は多くの相違を有する。それにもかかわらず、V-D接合及びD-J接合は実質的に同一であり、これはクローンがおそらく体細胞修飾により同じ転移Ｂ細胞クローンにより生じたことを示す。競合ELISAは最初に分析されたものから選択された変異体の間にアフィニティーの明らかな相違を明らかにすることができなかった。 b12Ｌ鎖クローンに結合したＨ鎖の配列を図13に示す。これらの配列をクローンb12からの最初のＨ鎖の配列と比較する。Ｈ鎖を、最初のＬ鎖クローンに相当しない番号により同定する。新しいＬ鎖を有する新たに選択されたクローンの帰属番号はこうして任意である。また、これらのＬ鎖の配列を配列表中に配列番号 123〜132にリストする。幾つかのＬ鎖配列は同一である。gp120との免疫反応性に加えて、新規なクローンを実施例３に記載されたようにしてHIV-１感染の中和に関する融合細胞アッセイで試験した。夫々クローンb12からのＨ鎖、既知のHIV -１中和クローン、及びH2及びH14と称される新しいＨ鎖を有する２種のシャッフリングされたモノクローナルFab抗体は、夫々1.0μg/ml及び0.5μg/mlの精製Fab を用いる融合細胞アッセイにおいて約40％の中和を示した。この効果は、２μg/mlの濃度で最初のクローンb12Ｈ鎖及びＬ鎖対で得られた効果に等しかった。約50％の最高の中和が、最初のクローンb12Ｈ鎖及びＬ鎖対で0.7μg/mlで80 ％の中和と比較して1.0μg/mlで新しいH14鎖を有するFabで得られた。こうして、実施例２に記載されたようにして調製された最初のライブラリー中で得られた gp120免疫反応性かつHIV中和Fabに加えて、既知の中和Ｌ鎖をＨ鎖のライブラリーとシャッフリングすることにより、新規なHIV-１中和Fabモノクローナル抗体を得た。こうして、このシャッフリングプロセスは、gp120に結合した更に多くのＨ鎖及びＬ鎖パートナーがアフィニティーの点で実施例２で調製された最初のライブラリーから得られたものに等しいことを明らかにした。このアプローチを用いて、付加的なHIV-１中和抗体を最初のライブラリー中に存在するものにつき容易に得ることができる。Ｈ鎖シャッフリングにより生じるクローンの複雑さはまた、このアプローチが体細胞多様化の経過をマップにするのに使用し得ることを示唆する。結合性ライブラリーは、このようなライブラリーから誘導された抗体が生体内の応答において産生された抗体にどの程度相当するのかを測定し得るようにＨ鎖及びＬ鎖をランダムに組換える。原則として、抗原を結合するＨ鎖−Ｌ鎖組み合わせが偶発的に生じることができ、即ち、いずれの鎖も生体内で抗原結合に関与していないが、その組み合わせは試験管内で抗原を結合する。しかしながら、入手できるデータは、試験管内で抗原をしっかりと結合するのに関与した免疫ライブラリーからのＨ鎖が生体内で抗原特異性クローンから生じることを示唆する。第一に、研究は一般に免疫されていないIgGライブラリー中の高アフィニティーバインダーを同定することができなかった。Perssonら，Pro c.Natl.Acad.Sci.，USA，88:2432-2436（1991）及びMarksら，Eur.J.Immun-ol. ，21:985-991（1991）を参照のこと。更に、上記のように、gp120バインダーはgp120に対するHIV血清反応陰性ドナーからの骨髄IgGライブラリーをパンニングする際に観察されなかった。第二に、免疫されたライブラリーからのバインダーと会合したＨ鎖は典型的には比較的高い頻度でライブラリー中にあり、これはそれらが免疫動物から単離された mRNA中で強く代表されたことを示す。Catonら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，87: 6450-6454（1990）及びPerssonらの上記文献を参照のこと。第三に、免疫されたライブラリーからのＨ鎖は、実施例６に記載されたようにして種々の関連しないＬ鎖で組換えられた場合に特異性を指示することが明らかであった。第四に、ここのようなクローン内Ｈ鎖変異体の単離は、活性抗体応答がクローン化されることを示した。こうして、Ｌ鎖バインダーとの既知のＨ鎖のシャッフリング及びその逆が本発明に使用するのに好ましい。何となれば、新規な中和Fabが生体内で産生される抗体の他に得られるからである。Ｈ鎖乱婚、即ち、抗原アフィニティーを保持して異なるＬ鎖と対合するＨ鎖の能力は、生体内のＬ鎖パートナーを同定するのに重大な問題を呈する。これは同じＢ際から生じたようなパートナーの厳密な定義に当てはまるだけでなく、いずれかのパートナーの体細胞変異体を包含するようなものにも当てはまる。特にクローン内Ｌ鎖変異体を伴う、主たるＨ鎖−Ｌ鎖組み合わせの存在は、関係するＬ鎖がライブラリー中に良く代表され、おそらく生体内の抗原結合に関連することを示唆する。しかしながら、乱婚は、幾つかの組み合わせがおそらく生体内で生じるが、或る組み合わせが組換え中に免疫パートナー鎖をシャッフリングしていないことが確かではないことを意味する。例えば、33のクローンのうちの２つのクローン中の実際に同じＬ鎖（b6、B20）の発生は、それがおそらく抗原剌激クローン中の生体内関与と合致するライブラリー中に過剰代表されることを示唆する。しかしながら、Ｌ鎖の生体内パートナーがb6またはB20Ｈ鎖であるのか、あるいは実際に剌激クローンから生じるその他のＨ鎖であるのかを知る方法がない。結合性ライブラリーから生じるＬ鎖は生体内で使用されるものでなくでもよい。それにもかかわらず、幾つかのＨ鎖がＬ鎖パートナーを比較的えり好みすることが明らかであり、一方、その他のＨ鎖が殆ど無関心であるように見えることを注目することが重要である。この観察は、この分析からの明らかにえり好みするＨ鎖が２成分プラスミド系（この場合、対合が競合状況下に選択されるのではなく、下記の実施例６に示されるように強制される）中に抗原結合を維持して多様なＬ鎖を受け入れるであろうという知見により調和される必要がある。二つの報告は、結合性ライブラリーから生じるＨ鎖−Ｌ鎖組み合わせと免疫されたマウス中のハイブリドーマを比較する。ライブラリーアプローチはmRNAで開始し、それ故、おそらくプラズマ細胞集団を反映している。対照的に、ハイブリドーマは活性化されているが、末端で分化されていないＢ細胞集団を反映すると考えられ、またEBV形質転換は静止Ｂ細胞集団を反映すると考えられる。Ｌ鎖の確実性に関する議論がどのようなものであろうとも、図10のＨ鎖は関係する多くの特徴を示す。最も頻繁に使用されるＨ鎖はクローンb8型のものである。この使用はPCR増幅におけるバイアスを単に代表するものと論じ得る。しかしながら、VH1aプライマー及びVH3aプライマーにより増幅されたこのグループ中のほぼ等しい数のクローンの出現は、この見解に反論する。更に、幾つかのグループ中のクローン内変異体の存在は、一つが初期のライブラリーとは異なる遺伝子を少なくともサンプリングしていることを示す。ここでクローン化された抗体は、無症候性ドナーの血清中に存在するポリクローナル抗体との定性的な関係を有する。抗gp120（IIIB）抗体の力価は約1:3000 であり、反応性の50％より多くがクローン12、13及び14からのFabのカクテルまたはCD4により抑制された。抗gp120（SF2）抗体の力価は約1:800であった。更に、短い束縛V3ループペプチドに対する血清の力価は1:500であり、完全長MN V3ループペプチドに対する血清の力価はわずかに1:300であった。“抗CD4部位抗体” の重要性は、Fab12、13及び14のカクテルが試験した28のドナーのうちの26でgp1 20（IIIB）との血清抗体反応性の大きなフラクションの結合を抑制できた点で長期HIV感染のドナーにおいて一般的と思われる。ウイルスを中和するFabの能力は議論の余地がある領域であった。問題の一つは、FabがIgGのパパイン消化により古典的に産生されることであった。時折の場合のように、Fabが親IgGに対し低下された活性を示す場合、Fab調製中のIgG汚染を排除することは困難であり得る。しかしながら、組換えFabは、本明細書に示されるように、ウイルスを明らかに中和する。 HIV-１の中和の機構は、ウイルス粒子凝集を必要とせず、またgp120架橋を必要としないことが明らかである。加えて、中和に対するCD4-gp120相互作用のブロッキングとの相関関係がない。本発明のクローン化された中和Fabの存在は、中和潜在性を与える分子上の特徴を研究させるべきである。例えば、Fab13を含むクローンのグループの場合、その中和クローンのＬ鎖の特異な特徴は、13のＬ鎖がそのグループ中のその他のＨ鎖で組換えられた鎖シャッフリング実験が明らかになり得ることを示唆する。二つの異なるＬ鎖と対合されたＨ鎖は抗原アフィニティーを保持するが、実施例６に示されるように変更された良好な特異性を示すことが示された。限られた数のみが強く中和する多数のFabのここでの観察は、重要な意義を有し得る。そのパターンが全抗体につき反復される場合、gp120構造の多くがある意味では“デコイ”であり、即ち、免疫系が高アフィニティーであるが、制限された抗ウイルス機能の抗体を産生する際にかなりの努力を費やし得るものと思われる。その状況を悪化させるために、有効ではない抗体がgp120に結合し、強い中和抗体の結合を抑制し得る。これは、本発明の中和抗体を誘導するように主として設計されるべきであるワクチン投与に明らかな意義を有する。 6.２成分プラスミド系中の結合性ライブラリーの選択されたＨ鎖及びＬ鎖DNA 配列のシャッフリングレプリコン適合性プラスミドの２成分系を開発して結合性抗体ライブラリーから単離されたヒトFabフラグメントの組中のＨ鎖及びＬ鎖の乱婚組換えに関する可能性を試験した。その系の有効性が、無症候性HIVドナーの骨髄ライブラリーから誘導された本発明の結合性ライブラリーにつき実証される。 a.２成分プラスミド系の構築本発明に使用するための２成分プラスミドpTACO1H及びpTC01は、夫々、λHc2 及びλLc3からのpelBリーダー領域及び多重クローニング部位と、レプリコン適合性発現ベクターpFL281及びpFL261の組を含む。pFL281及びpFL261の両方がLari merら，Prot.Eng.，3:227-231（1990）（その開示が参考として本明細書に含まれる）により記載されていた。pFL261及びpFL281のヌクレオチド配列は受理番号 M29363及びM68946として EMBL、GenBank及びDDBJヌクレオチド配列データベースにある。プラスミドpFL281は、Larimerらの上記の文献にまた記載され、かつ受理番号M29362を有するプラスミドpFL260をベースとしている。プラスミドpFL2 60とpFl281の唯一の区別は、pFL281がEagＩ部位とXma III部位の間にpFL260の60 bp配列を欠いており、二つのBamHＩ部位の一つの損失をもたらすことである。この欠失は、本明細書に記載された発現ベクターへのBamHＩHc2フラグメントのクローニングを可能にするのに必要である。レプリコン適合性発現ベクターは三つの共通の要素：（ｉ）fl一本鎖DNA page 遺伝子内IG領域；（ii）タイトに調節されたtacプロモーター及びlacオペレーター；及び（iii）特定のクローニング部位を有するrbs-ATG領域を共有する。プラスミドベクターはそれらの抗生物質耐性マーカー及びプラスミドレプリコンを異にする。pFL261はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（cat）をコードし、クロラムフェニコール耐性を与える遺伝子、及びp15Aレプリコンを有する。pFL281はβ−ラクタマーゼ（bla）をコードし、アンピシリン耐性を与える遺伝子、及びpMBlからのColE1レプリコン（ori）を有する。p15Aレプリコン及びColE1レプリコンは、同じE.coli宿主中の両方のプラスミドの同時の維持を可能にする。夫々、実施例la2）及びla3）で調製されたHc2ベクター及びLc2ベクターを、当業者に良く知られている通常の方法を使用し、またSambrookら，Molecular Clo- ning：A Laboratory Manual，第二編，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ニューヨーク（1989）により記載されたようにしてプラスミド形態に変換し、続いてXhoＩ-SpeＩ（pHc2）及びSacＩ-XbaＩ（pLc2の場合）で消化した。消化されたpHc2プラスミド及びLc2プラスミドへの挿入のための合成リンカーをアメリカン・シンセシスにより調製した。これらのリンカーを挿入してクローニング部位間の距離を増大し、消化の有効性を増大した。pHc2への二本鎖リンカーインサートを調製するための5'リンカー及び3'リンカーは夫々５’TCGAGGGTCGGTCGGTCTCTAGACGGTCGGTCGGTCA ３’（配列番号133）及び５’CTAGTGACCGACCGACCGTCTAGAGACCGACCGACCC ３’（配列番号134）であった。p Lc2への二本鎖リンカーインサートを調製するための５’リンカー及び３'リンカーは夫々５’CGGTCGGTCGGTCCTCGAGGGTCGGTCGGTCT ３’（配列番号135）及び５’CTAGAGACCGACCGACCCTCGAGGACCGACCGACCGAGCT ３’（配列番号136）であった。リンカーオリゴヌクレオチドの対をそれらの夫々の消化されたウシ腸ホスファターゼ処理されたベクターに別々につないだ。続いて、pHc2及びpLc2の多重クローニング部位を夫々発現ベクター、pFL281及びpFL261に転移した。このプロセスを行うために、Lc2及びHc2の両方の多重クローニング領域をGramら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，89:3576-3580（1992）により記載され、またベントポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブズ）を使用してその製造業者の推奨に従って実施例2bに記載されたようにしてPCR により別々に増幅した。前方プライマー、５’CAAGGAGACA GGATCCATGAAATAC ３ ’（配列番号137）を、その下線を施されたヌクレオチドにより示されるその内部BamHＩ部位を介してクローニングベクターpFL261及びpFL281のリボソーム結合部位へのpelBリーダー配列のフラッシュ融合を与えるように設計した。逆プライマー５’AGGGCGAATT GGATCCCGGGCCCCC ３’（配列番号138）を、pHc2/pLc2の親ベクター中の関係する領域の下流をアニールし、第二BamHＩ部位を生じるように設計した。次いで得られたHc2及びLc2 PCR増幅産物をBamHＩで消化して、夫々Ba mHＩで直線状にされたpFL281ベクター及びpFL261ベクターへのその後の結合のためのBamH Ｉ懸垂を与えた。pTC01と称される、Lc2インサートを含む得られるＬ鎖ベクターをこの形態で使用し、一方、Ｈ鎖ベクターを更にヒスチジン尾部で修飾して、Skerraら，Bio/Technology，９:273-278（1991）により記載されたような固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによりFabフラグメントの精製を可能にした。この目的のために、合成リンカーオリゴヌクレオチド、夫々、５ ’リンカー及び３’リンカー、５’CTAGTCATCATCATCATCATTAAGCTAGC ３’（配列番号139）及び５’CTAGGCTAGCTTAATGATGATGATGATGA ３’（配列番号140）をSpe Ｉ部位に挿入してデカペプチドtag配列を実際に除去してpTACO1Hと称されるＨ鎖ベクターを生成した。全てのクローニング実験におけるFabフラグメントの発現を、１％（w/v）グルコースを全ての培地及びプレートに添加することにより抑制した。 b.発現プラスミドの構築Ｌ鎖可変ドメインの発現のために、先に調製したpTACO1を最初にSacＩ及びXba Ｉで消化した。次いで個々のＬ鎖インサートを、調製したpComb2-3プラスミドの 22を別々に消化することにより得、実施例２に記載され、また図７にリストされたようにしてスクリーニングし、これらは酵素の同じ組み合わせでgp120に結合し、その0.7kbフラグメントを、低融点アガロースゲル電気泳動、続いてb-アガロース消化を使用して単離した。鎖シャッフリング実験につき、図７に示された７つのグループの夫々の下記の代表的な員を選択した。b11；b6；b4-b12- b7-b2l；b3；s8；b1-b14-b24；b13-b22-B26-b8-b18-b27-B8-B35-s4；及び一つのループペプチド結合クローン、p35。異なるグループをセミコロン分離により示し、一方、同じグループの員にダッシュを付ける。得られた単離Ｌ鎖を、5:1のインサート対ベクターのモル比を使用して通常の条件下で16℃で一夜にわたって PTCO1に別々につないで21のＬ鎖pTCO1発現ベクターを生成した。Ｈ鎖可変ドメインの発現のために、先に調製したpTACO1Hを最初にXhoＩ及びSp eＩで消化した。次いでＨ鎖インサートを、Ｌ鎖インサートを得た20のpComb2-3 プラスミドの別々のPCR増幅反応により得た。ベクター中にcpIII遺伝子アンカー配列を含まないＨ鎖を得るために、制限消化に代えて、PCRを使用してＨ鎖インサートを単離した。PCR反応につき、夫々の５’プライマー及び３’プライマー、５’CAGGTGCAGCTCGAGCAGTCTGGG ３’（VH1a）（配列番号42）及び５’GCATGTA CTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG ３’（CG1z）（配列番号44）を使用して実施例2a1）及び例2a2）に記載されたようにしてＨ鎖に相当する領域を増幅した。得られたP CR産物を低融点電気泳動により精製し、XhoＩ及びSpeＩで消化し、再度精製し、 1:2のベクター対インサートのモル比を使用して同様に調製したＨ鎖pTACO1Hベクターに別々につないで21のＨ鎖pTACO1H発現ベクターを生成した。 c.２成分プラスミドの同時形質転換 CaCl₂コンピテントXL1-ブルー細胞（ストラタゲン；recA1、endA1、gyrA96、t hi、hsdR17、supE44、relA1、lac、｛F'proAB、lacI^q、ZDM15、Tn（tet^R）｝）を調製し、20のＨ鎖ベクターの夫々との20のＬ鎖ベクターの夫々の誘導交差において夫々のプラスミドの約0.5μgの精製DNAで形質転換した。両方のプラスミド及びエピソームの存在を、形質転換体を１％のグルコースを含む３成分抗生物質寒天プレート（100 μg/mlのカルベニシリン、30μg/mlのクロラムフェニコール、10μg/mlのテトラサイクリン、32g/lのLB寒天）に塗布することにより選択した。二つのレプリコン適合性プラスミドからなる２成分プラスミドを14に示されるように構築した。pTACO1H Ｈ鎖ベクターを図14Aに図示し、pTACO1L鎖ベクターを図14Bに図示する。両方の発現ベクターは、図15に示されるようにBamH Ｉ部位を介してリボソーム結合部位及びtac プロモーターに融合されたpelBリーダー配列を含む同様のクローニング部位を特徴とする。Ｌ鎖ベクター、pTACOl及びＨ鎖ベクター、pTACO1Hに関して、tac プロモーター、リボソーム結合部位（rbs）及び下線を施された適当な制限部位と共に多重クローニング部位のヌクレオチド配列が、夫々図15A及び図15Bに示される。また、これらの配列が図面の簡単な説明に記載されたように配列表にリストされる。また、Ｈ鎖ベクターpTACO1Hは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより組換えFabフラグメントの精製を可能にする（His）₅-尾部を含む。同じバクテリア細胞中の両方のプラスミドの存在が、培地中の両方の抗生物質の存在により選択される。発現がグルコースの添加により増殖中に部分抑制され、室温でIPTGの添加により誘導される。これらの条件下で、両方のプラスミドは細胞内で安定であり、またヤギ抗ヒトカッパー抗体及びヤギ抗ヒトIgG1抗体を使用するELISAにより分析されるようにFabフラグメントの発現を支持する。 d.組換えFabフラグメントの調製抗原結合活性の測定のためのバクテリア培養物を96ウェル組織培養プレート（コスター#3596）中で増殖させた。250 μlのスーパーブロース［SBは１リットル当たり下記の成分を有していた：30μg/mlのクロラムフェニコール、100 μg/ml のカルベニシリン、及び１％（w/v）のグルコースを含む、10gの３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、30gのトリプトン、20gの酵母エキス、pH7.0、25 ℃］をウェルに混合し、先の実施例6cで調製した単一の二重形質転換体を接種した。次いで、接種したプレートを、A₅₅₀が約１〜1.5になるまで、水平シェーカーで適度に振とうしながら（200rpm）７〜９時間にわたって37℃に保った。細胞をマイクトタイタプレートの遠心分離（４℃で30分間にわたり1,500Ｘｇ）により回収し、上澄みを捨て、細胞を再度懸濁させ、１mMのIPTGを含むが、グルコースを含まない新しい培地中で室温で一夜にわたって誘導した。細胞を遠心分離により回収し、34μg/mlのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）及び1.5 ％（w/v）のストレプトマイシンスルフェートを含むPBS（10 mMのリン酸ナトリウム、160mMのNaCl、pH7.4、25℃）175μl中で再度懸濁させ、-80℃と37℃の間で３回の凍結−融解サイクルにより溶解した。得られた粗抽出物を上記のように部分精製し、その後、抗原結合ELISAにより分析した。 e.相対アフィニティーのアッセイ及び測定ウェルを0.1 μgの抗原で被覆した後に、相対アフィニティーを実施例2b6）に記載されたようにして測定した。選択した抗原は破傷風トキソイド並びに組換え gp120（株IIIB）及びgp120（株SF2）を含んだ。夫々の抗原につき、pTCO1及びpT ACO1Hで同時形質転換したXL1-ブルー細胞の陰性対照抽出物を試験してE.coli中のその他の成分がアッセイ中の抗原に対しアフィニティーを有するか否かを測定した。夫々の抽出物をBSA結合活性につき分析し、BSA陽性クローンを陰性と考えた。一つの鎖のみを発現する全ての可能な単一形質転換体を二重形質転換体につき記載されたようにして調製し、使用した抗原のいずれに対してもアフィニティーを有しないことがわかった。そのアッセイの性質のために、これが個々の鎖それ自体による結合の欠如によるのか、または発現もしくはひだ形成（folding）によるのかは、測定し得なかった。 f.gp120/gp160 結合抗体の組内のＨ鎖及びＬ鎖の直接交差の結果同じ無症候性HIVドナーの骨髄から誘導されたが、gp120（IIIB）、gp160（III B）、及びgp120（SF2）に対しパンニングされたFabフラグメントを、実施例４に記載されたようにしてそれらのＨ鎖のCDR3のアミノ酸配列に基いて７つのグループの一つに帰属した。同じライブラリーから、束縛された超可変V3-ループ様ペプチドJSISIGPGRAFYTGZC（配列番号141）に対する抗体を単離した。鎖シャッフリング実験につき、図７に示された７つのグループの夫々の下記の代表的な員を選択した：b11；b6； b4-b12-b7-b21；b3；s8； b1-b14-b24； b13-b22-B26-b8- b18-b27-B8-B35-s4；及び一つのループペプチド結合クローン、p35。クローンb4 、b7、b12、及びb21は、融合細胞形成により感染の抑制を監視する場合にHIVに対する中和活性を示し、またクローンb13、b12、及びb4は実施例３に示されるようにp24生産を監視する場合にHIVに対する中和活性を示した。Ｌ鎖及びＨ鎖を最初の構築物からクローン化し、上記のようにして全ての可能な２成分組み合わせをXL1-ブルー細胞に同時形質転換した。完全交差の結果を図16に示す。予想されるように、異なるFab フラグメントから誘導された同一の鎖は同様の結合特性、例えば、b18HC、b27HC、B8HC、B35HC 、s4HCを有していた。夫々の場合の最初のＬ鎖との最初のＨ鎖の交差は結合活性を明らかに反復発生した。わずかな相違が同一の可変ドメイン配列、例えば、 b4とb12（一定ドメインが構築物のいずれかにつき配列決定されなかった）を含む幾つかのＨ鎖間に存在した。その例外はb8HCであり、これはその可変ドメインにおいてb18HC、b27HC、B8HC、B35HC、s4HCと同一であったが、更に大きい交差反応性を示す。おそらく、これは細胞中の発現レベルの相違または一定ドメイン配列中の相違のためである。明らかな相違が異なるＬ鎖を受入れ、依然として抗原を結合するそれらの傾向の点でＨ鎖間に存在したが、gp120（IIIB）に対しパンニングされた組中の最小の乱婚Ｈ鎖、b1HCでさえもがその交差の43％で依然としてそうであった。スペクトルの他の面で、５種のＨ鎖、b11HC、b6HC、b12 HC 、b7HC、及びb8HCがこの組中の全てのＬ鎖と生産的に交差した。詳細に試験したＨ鎖交差（s4HC、B35HC、B26HCの全て；b12HC、b12HCの殆ど）につき、見掛結合アフィニティーの有意な相違が、図17に示されるように、同じＨ鎖を使用するが、異なるＬ鎖を使用するFabフラグメント間に見られなかった。この場合、可溶性gp120（IIIB）との競合からのIC₅₀は約10^-8Mであった。Ｈ鎖のCDR3の配列に従って樹立され、かつ図16中で水平な直線、また垂直な直線により示される最初の７つのグループ内で、完全な乱婚が存在し、即ち、これらのCDR3決定グループ内のＨ鎖及びＬ鎖は互いに完全に乱婚であった。しかしながら、その他のグループ間、例えば、b1HC-b24HCとb13LC-s4LCの間には乱婚の欠如があった。これらの配列に基くグループの分析において、ファージディスプレイライブラリーがパンニングされたタンパク質抗原は重要な因子ではなかった。この場合の例外は全てのＬ鎖とのp35HCの交差であった。gp120（SF2）または最初の抗原、ループペプチドに結合した唯一の交差は、最初のＨ鎖及びＬ鎖を含む交差であった。Ｈ鎖と違って、Ｌ鎖は全てのＨ鎖と生産的に交差せず、また異常に低い乱婚によりその他のＬ鎖から区別できなかった。実施例３に記載されたようにして行われた中和アッセイにおいて、クローンb2 1からのＬ鎖とのクローンb12からのＨ鎖の対合により生じる誘導交差はHIV-1を中和するのに有効であった。 g.Ｈ鎖及びＬ鎖の抗原内交差同じライブラリーに由来する高アフィニティーFabフラグメント間の交差から誘導された結論が関連しないライブラリーに拡張し得るか否かを決定するために、異なるドナーからの破傷風トキソイドに特異性の関連しないγ1k-Fab フラグメント（P3-13）を交差の新しい組［Persson ら，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，8 8：2432-2436（1991）中のクローン３］に選択した。抽出物を破傷風トキソイドまたはgp120（IIIB）で探査した。そのデータは、抗原に対する結合活性がＨ鎖により決定された点でgp120交差実験からの結果を確認する。クローンP3-13のＨ鎖はＬ鎖b4、b12、b21、及びb14と対合して破傷風トキソイドに対するアフィニティーを有するFabフラグメントを生じた。P3-13のＬ鎖はb3、b6、b11、及びb14 のＨ鎖と対合してgp120（IIIB）に対するアフィニティーを有するFabフラグメントを生じた。gp120バインダーに由来するＬ鎖のいずれもがP3-13 Ｈ鎖と組み合わせてgp120特異性を与えることができなかった。同様に、P3-13 Ｌ鎖はgp120バインダーに由来するＨ鎖のいずれと組み合わせても破傷風トキソイド特異性を生じることができず、抗体−抗原相互作用におけるＨ鎖の優性を確認した。重要なことに、破傷風トキソイドに対し強いシグナルを示した３種のＬ鎖（b4、b12、b21）の全てが、それらの最初のＨ鎖のCDR3により選別された時に同じグループの員であった。関連しないライブラリー間の交差から予想し得るように、低い程度の乱婚があっただけでなく、即ち、鎖がはるかに少ない相補性鎖と生産的に対合しただけでなく、競合ELISAにより測定された見掛アフィニティー定数の範囲が非常に広かった（6.3 X 10⁶-6.3 X10^-8M）。他のＬ鎖によるP3-13 Fabフラグメント中の最初のP3-13 Ｌ鎖の置換は、破傷風トキソイドに対するアフィニティーを10〜100倍低下した（6.3 X10^-8Mから6.3X 10^-6 Mに）。HIVパンニングの全てのＨ鎖とのP3-13のＬ鎖の交差において、生産的交差は、b14HC/P3-l3LC（そのシグナルは見掛結合定数の確実な測定にはあまりに弱すぎた）を除いて、gp120（IIIB）に対する同様のアフィニティーを有していた（2.5 X 10⁷-6.3 X10^-7M）。これらのアフィニティーは、それらの最初のＬ鎖とのgp120-Ｈ鎖のアフィニティーよりも約５倍低かった。こうして、これらの結果は、鎖シャッフリングが試験管内で許されるが、生体内で許されない更に別の手段であることを示し、これは抗体多様性を天然のもの以外に拡大することを助けるものと予想し得る。本発明の２成分系の最も重要な特徴は、初期のベクターの構築後に夫々の交差につき個々の鎖をリクローニングすることを必要としないで、特性決定されたＬ鎖とＨ鎖の間で多数（数百）の誘導交差を生じるその能力である。ファージディスプレイ方法及び生物学的アッセイと組み合わせて使用される場合、それは生物学的または化学的に活性な抗体を見出す目的で鎖シャッフリングにより抗原結合クローンのプールの最も重要なサブセットの迅速な分析を可能にする。ここで研究された抗原の組につき、殆どのＨ鎖は幾つかのＬ鎖と組換えて抗原結合Fabフラグメントを生じた。これらの結果は結合性抗体ライブラリーの多様性につき重要な意味を有する。個々の鎖の驚くべき乱婚のためにＬ鎖とＨ鎖の最初の生体内の組み合わせを信頼できる程に予測することは可能ではないが、組換え抗体ライブラリーは、同じ抗原に対してかすかに関連するFabでさえもが試験管内で組換えて生体内で見られない鎖組み合わせを生じ得るという事実を利用する。実際に、或る種の生物学的または化学的な活性を有することが示された或る数の抗体の同定後に、バインダーの同じプールからランダムにサンプリングし続けるのではなく誘導様式でそれらの個々の鎖をシャッフリングすることが良好であり得る。拡張により、この系において観察された乱婚は、変性した、化学合成されたオリゴヌクレオチドを使用して構築されたライブラリーにおいて、別個の合成Ｈ鎖が別個の合成Ｌ鎖と対合して別個の抗原結合Fabフラグメントを産生し得るというかなりの融通性があることを示す。鎖シャッフリングと対にされた結合性ライブラリーの多様性は３次元空間の広い研究を可能にし、それにより抗体、基質及びコファクターの３成分複合体中の分子を如何にして模倣するかという問題を解決すべきである。 7.物質の寄託下記の細胞系を1992年9月30日に米国、MD、ロックビル・パークローン・ドライブ1301にあるザ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に寄託した。細胞系 ATCC 受理番号 E.coli MT11 ATCC 69078 E.coli MT12 ATCC 69079 E.coli MT13 ATCC 69080 上にリストした寄託株、MT11、MT12及びMT13は、実施例2bで調製したb11（クローンb11）、b12（クローンb12）、及びb13（クローンb13）と称されるFabの夫々の発現のための発現ベクターpcomb2-3を含むバクテリア細胞（E.coli）である。Ｈ鎖可変ドメイン及びＬ鎖可変ドメインの配列を夫々図10及び11に示す。この寄託を特許手続の目的のための微生物の寄託の国際認可に関するブタベスト条約の条項およびその規則（ブタベスト条約）のもとに行った。これは寄託の日から 30年にわたる生存可能な培養物の維持を確保する。生物はブタベスト条約の条項のもとにATCCにより利用可能にされ、この条約は関連米国特許の発行後または米国特許出願もしくは外国特許出願の公開後（いずれか最初に公開されたもの）に公衆への培養物の子孫の永久かつ無制限の利用可能性を確保し、また35 U.S.C． §122およびそれに従う米国特許庁の規則（特に886 OG 638を参考とする37CFR §1.14を含む）に従って米国特許庁によりその権利が与えられると定められた者への子孫の利用可能性を確保する。本件特許出願の譲受け人は、培養寄託株が適当な条件下で培養された場合に死滅し、または喪失もしくは分解される場合、それが同培養物の生存可能な標本で連絡後速やかに交換されることに同意した。寄託株の利用可能性は、あらゆる政府の権威のもとにその特許法に従って付与された権利に反して発明を実施するライセンスと見なされるべきではない。以上に記載された明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに充分であると考えられる。本発明は寄託された細胞系により範囲を限定されるべきではない。何となれば、寄託実施態様は本発明の一局面の単なる例示として意図されており、機能上均等であるあらゆる細胞系が本発明の範囲内にあるからである。物質の寄託は、本明細書に含まれる記載が本発明のあらゆる局面（その最良の様式を含む）の実施を可能にするのに不充分であるという承認を構成するものではなく、またそれは請求の範囲をそれが表す特定の例示に限定するものと見なされるべきではない。実際に、本明細書に示され、記載されたものに加えて本発明の種々の改良が以上の記載から当業者に明らかになるであろうし、またこれらの改良は請求の範囲内に入る。配列表 (1)一般情報 (i)出願人： (A)名称：ザ・スクリップス・リサーチ・インスティチュート (B)通り：10666ノース・トレイ・パインズ・ロード (C)都市：ラ・ジョラ (D)州：カリフォルニア (E)国：米国 (F)郵便番号：92037 (G)電話番号：619-554-2937 (H)ファックス番号：619-554-6312 (ii)発明の名称：ヒト免疫不全ウェルに対するヒト中和モノクローナル抗体 (iii)配列の数：151 (iv)コンピュータ読み取り可能形態： (A)媒体型：フロッピーディスク (B)コンピュータ：IBM PC互換機 (C)操作システム：PC-DOS/MS-DOS (D)ソフトウェア：パテントイン・リリース#1.0、バージョン#l.25（EP O) (v)本件出願データ： (A)出願番号：PCT/US93/ (B)出願日：1993年9月30日 (vi)先行出願データ： (A)出願番号：US 07/954,148 (B)出願日：1992年9月30日 (2)配列番号１の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：173塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号１： (2)配列番号２の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：173塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号２： (2)配列番号３の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：131塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号３： (2)配列番号４の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：139塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号４： (2)配列番号５の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：10アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：ペプチド (v)フラグメント型：中間部 (xi)配列の記載：配列番号５： (2)配列番号６の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：26アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：ペプチド (v)フラグメント型：Ｎ末端 (xi)配列の記載：配列番号６： (2)配列番号７の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：23アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：ペプチド (v)フラグメント型：Ｎ末端 (xi)配列の記載：配列番号７： (2)配列番号８の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：198塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：二本鎖 (D)トポロジー：環状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号８： (2)配列番号９の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：198塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：二本鎖 (D)トポロジー：環状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号９： (2)配列番号10の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：24アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：ペプチド (v)フラグメント型：Ｎ末端 (xi)配列の記載：配列番号10： (2)配列番号11の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：220塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：二本鎖 (D)トポロジー：環状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号11： (2)配列番号12の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：220塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：二本鎖 (D)トポロジー：環状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号12： (2)配列番号13の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：28アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：ペプチド (v)フラグメント型：Ｎ末端 (xi)配列の記載：配列番号13： (2)配列番号14の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：７アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：ペプチド (v)フラグメント型：Ｃ末端 (xi)配列の記載：配列番号14： (2)配列番号15の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：32塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号15： (2)配列番号16の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：36塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号16： (2)配列番号17の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：32塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号17： (2)配列番号18の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：29塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号18： (2)配列番号19の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：40塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号19： (2)配列番号20の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：38塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号20： (2)配列番号21の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：40塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号21： (2)配列番号22の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：38塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号22： (2)配列番号23の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：33塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号23： (2)配列番号24の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：28塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号24： (2)配列番号25の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：34塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号25： (2)配列番号26の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：36塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号26： (2)配列番号27の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：31塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号27： (2)配列番号28の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：30塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号28： (2)配列番号29の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：48塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号29： (2)配列番号30の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：40塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号30： (2)配列番号31の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：27塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号31： (2)配列番号32の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：24塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号32： (2)配列番号33の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：666塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：二本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号33： (2)配列番号34の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：211アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：不明 (ii)配列の種類：タンパク質 (iii)ハイポセティカル：NO (v)フラグメント型：中間部 (xi)配列の記載：配列番号34： (2)配列番号35の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：48塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号35： (2)配列番号36の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：40塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号36： (2)配列番号37の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：36塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 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(ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号51： (2)配列番号52の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：22塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA （ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号52： (2)配列番号53の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：128アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号53： (2)配列番号54の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：124アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号54： (2)配列番号55の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：128アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号55： (2)配列番号56の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：128アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号56： (2)配列番号57の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：128アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号57： (2)配列番号58の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：128アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号58： (2)配列番号59の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：128アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号59： (2)配列番号60の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：128アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 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(xi)配列の記載：配列番号100： (2)配列番号101の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：106アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号101： (2)配列番号102の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：108アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号102： (2)配列番号103の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号103： (2)配列番号104の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号104： (2)配列番号105の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号105： (2)配列番号106の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：104アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号106： (2)配列番号107の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号107： (2)配列番号108の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号108： (2)配列番号109の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：108アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号109： (2)配列番号110の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：108アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号110： (2)配列番号111の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：93アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号111： (2)配列番号112の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：104アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号112： (2)配列番号113の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：96アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号113： (2)配列番号114の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (Xi)配列の記載：配列番号114： (2)配列番号115の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号115： (2)配列番号116の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号116： (2)配列番号117の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号117： (2)配列番号118の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号118： (2)配列番号119の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号119： (2)配列番号120の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号120： (2)配列番号121の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号121： (2)配列番号122の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：107アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号122： (2)配列番号123の情報 (i)配列の特徴 (A)配列の長さ：126アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号123： (2)配列番号124の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：125アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号124： (2)配列番号125の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：124アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号125： (2)配列番号126の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：124アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号126： (2)配列番号127の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：124アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号127： (2)配列番号128の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：125アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号128： (2)配列番号129の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：125アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号129： (2)配列番号130の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：124アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号130： (2)配列番号131の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：124アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号131： (2)配列番号132の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：124アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号132： (2)配列番号133の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：37塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA（ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号133： (2)配列番号134の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：37塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA（ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号134： (2)配列番号135の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：32塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA（ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号135： (2)配列番号136の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：40塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA（ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号136： (2)配列番号137の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：25塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA（ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号137： (2)配列番号138の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：25塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA（ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号138： (2)配列番号139の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：29塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：DNA（ゲノム） (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号139： (2)配列番号140の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：29塩基対 (B)配列の型：核酸 (C)鎖の数：一本鎖 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (iii)ハイポセティカル：NO (iv)アンチセンス：NO (xi)配列の記載：配列番号140： (2)配列番号141の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：13アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：ペプチド (v)フラグメント型：中間部 (ix)配列の特徴： (A)名称／記号：修飾部位 (B)存在位置：１ (D)その他の情報：／標識−Ｊ (ix)配列の特徴： (A)名称／記号：修飾部位 (B)存在位置：１３ (D)その他の情報：／標識−ＺＣ (xi)配列の記載：配列番号141： (2)配列番号142の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：126アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号142： (2)配列番号143の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：122アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号143： (2)配列番号144の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：132アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号144： (2)配列番号145の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：126アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号145： (2)配列番号146の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：124アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号146： (2)配列番号147の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：109アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号147： (2)配列番号148の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：112アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記裁：配列番号148： (2)配列番号149の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：111アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号149： (2)配列番号150の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：111アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号150： (2)配列番号151の情報 (i)配列の特徴： (A)配列の長さ：112アミノ酸 (B)配列の型：アミノ酸 (D)トポロジー：直線状 (ii)配列の種類：タンパク質 (xi)配列の記載：配列番号151：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＧ０１Ｎ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ 33/68 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者バーバスカーロスエフアメリカ合衆国カリフォルニア州 92122 サンディエゴチャーマントドライヴ 7425 アパートメント 2816 (72)発明者ラーナーリチャードエイアメリカ合衆国カリフォルニア州 92037 ラジョライーストローズランドドライヴ 7750

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト免疫不全ウイルス（HIV）糖タンパク質gp120と免疫反応でき、かつHIV を中和できるヒトモノクローナル抗体であって、そのモノクローナル抗体が配列番号66、67、68、70、72、73、74、75、78及び 97、並びにこれらの保存置換からなる群から選ばれたＨ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有することを特徴とするヒトモノクローナル抗体。２．モノクローナル抗体が配列番号66:95、67:96、72:102、66:97、73:107、74: 103、70:101、68:98、75:104、72:105、78:110、66:118、66:122、66:121、66:1 15、97:124、97:132及び66:98、並びにこれらの保存置換からなる群から選ばれた対中にＨ鎖及びＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を有するモノクローナル抗体の結合特異性を有する請求の範囲第１項に記載のヒトモノクローナル抗体。３．モノクローナル抗体がATCC 69078、ATCC 69079またはATCC 69080により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を有する請求の範囲第１項に記載のヒトモノクローナル抗体。４．モノクローナル抗体がATCC 69078、ATCC 69079またはATCC 69080により産生されたモノクローナル抗体である請求の範囲第３項に記載のヒトモノクローナル抗体。５．ヒト免疫不全ウイルス（HIV）糖タンパク質gp120と免疫反応でき、かつHIV を中和できるヒトモノクローナル抗体であって、そのモノクローナル抗体が配列番号95、96、97、98、101、102、103、104、10 5、107、110、115、118、121、122、124及び132、並びにこれらの保存置換からなる群から選ばれたＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有することを特徴とするヒトモノクローナル抗体。６．ヒト免疫不全ウイルス（HIV）糖タンパク質gp120と免疫反応でき、かつHIV を中和できるヒトモノクローナル抗体のＨ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列部分をコードするポリヌクレオチド配列であって、そのモノクローナル抗体が配列番号66、67、68、70、72、73、74、75、78及び 97からなる群から選ばれた前記Ｈ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列、及びそのアミノ酸残基配列の保存置換、並びにこれらに相補性のポリヌクレオチド配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有することを特徴とするポリヌクレオチド配列。７．ポリヌクレオチドがDNAである請求の範囲第６項に記載のポリヌクレオチド配列。８．ヒト免疫不全ウイルス（HIV）糖タンパク質gp120と免疫反応でき、かつHIV を中和できるヒトモノクローナル抗体のＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列部分をコードするポリヌクレオチド配列であって、そのモノクローナル抗体が配列番号95、96、97、98、101、102、103、104、10 5、107、110、115、118、121、122、124及び132からなる群から選ばれた前記Ｌ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列、及びそのアミノ酸残基配列の保存置換、並びにこれらに相補性のポリヌクレオチド配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有することを特徴とするポリヌクレオチド配列。９．ヒト免疫不全ウイルス（HIV）糖タンパク質gp41と免疫反応でき、かつHIVを中和できるヒトモノクローナル抗体であって、そのモノクローナル抗体が配列番号142、143、144、145及び146、並びにこれらの保存置換からなる群から選ばれたＨ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有することを特徴とするヒトモノクローナル抗体。 10．モノクローナル抗体が配列番号142:147、143:148、144:149、145:150、及び 146:151、並びにこれらの保存置換からなる群から選ばれた対中にＨ鎖及びＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を有するモノクローナル抗体の結合特異性を有する請求の範囲第９項に記載のヒトモノクローナル抗体。 11．ヒト免疫不全ウイルス（HIV）糖タンパク質gp41と免疫反応でき、かつHIVを中和できるヒトモノクローナル抗体であって、そのモノクローナル抗体が配列番号147、148、149、150、及び151、並びにこれらの保存置換からなる群から選ばれたＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有することを特徴とするヒトモノクローナル抗体。 12．ヒト免疫不全ウイルス（HIV）糖タンパク質gp41と免疫反応でき、かつHIVを中和できるヒトモノクローナル抗体のＨ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列部分をコードするポリヌクレオチド配列であって、そのモノクローナル抗体が配列番号142、143、144、145、及び146からなる群から選ばれた前記Ｈ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列、及びそのアミノ酸残基配列の保存置換、並びにこれらに相補性のポリヌクレオチド配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有することを特徴とするポリヌクレオチド配列。 13．ポリヌクレオチドがDNAである請求の範囲第12項に記載のポリヌクレオチド配列。 14．ヒト免疫不全ウイルス（HIV）糖タンパク質gp41と免疫反応でき、かつHIVを中和できるヒトモノクローナル抗体のＬ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列部分をコードするポリヌクレオチド配列であって、そのモノクローナル抗体が配列番号147、148、149、150、及び151からなる群から選ばれた前記Ｌ鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列、及びそのアミノ酸残基配列の保存置換、並びにこれらに相補性のポリヌクレオチド配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有することを特徴とするポリヌクレオチド配列。 15．請求の範囲第６項、第８項、第12項または第14項に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とする宿主細胞。 16．請求の範囲第６項、第８項、第12項または第14項に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを特徴とするDNA発現ベクター。 17．ヒト免疫不全ウイルス（HIV）の検出方法であって、 HIVを含むと推測される試料を診断有効量の請求の範囲第１項、第５項、第９項または第11項に記載のモノクローナル抗体と接触させ、モノクローナル抗体が試料と免疫反応するか否かを測定することを特徴とするヒト免疫不全ウイルスの検出方法。 18．検出が生体内である請求の範囲第17項に記載の方法。 19．モノクローナル抗体を放射性同位元素及び常磁性標識からなる群から選ばれた標識で検出可能に標識する請求の範囲第18項に記載の方法。 20．検出が試験管内である請求の範囲第17項に記載の方法。 21．モノクローナル抗体を放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド金属、ケミルミネセンス化合物、バイオルミネセンス化合物、及び酵素からなる群から選ばれた標識で検出可能に標識する請求の範囲第20項に記載の方法。 22．モノクローナル抗体を固相に結合する請求の範囲第20項に記載の方法。 23．ヒトのヒト免疫不全ウイルス（HIV）疾患の受動免疫療法であって、免疫治療有効量の請求の範囲第１項、第５項、第９項または第11項に記載のモノクローナル抗体をヒトに投与することを特徴とするヒト免疫不全ウイルス疾患の受動免疫療法。 24．受動免疫療法を予防のために施す請求の範囲第23項に記載の方法。 25．投与が非経口投与である請求の範囲第23項に記載の方法。 26．非経口投与が皮下、筋肉内、腹腔内、洞内、経皮、または静脈内の注射によるものである請求の範囲第25項に記載の方法。 27．非経口投与が徐々の注入によるものである請求の範囲第25項に記載の方法。 28．徐々の注入が静脈内またはぜん動性の装置によるものである請求の範囲第27 項に記載の方法。 29．免疫治療有効量が約0.1mg/kgから約300mg/kgまでである請求の範囲第25項に記載の方法。 30．ヒトのヒト免疫不全ウイルス（HIV）疾患に活性な免疫治療を誘導する方法であって、免疫原有効量の請求の範囲第１項、第５項、第９項または第11項に記載のモノクローナル抗体に対する抗イディオタイプ抗体をヒトに投与することを特徴とするヒト免疫不全ウイルス疾患の免疫治療の誘導方法。 31．薬理学的担体中に免疫治療有効量の請求の範囲第１項、第５項、第９項または第11項に記載のモノクローナル抗体の少なくとも１回の投薬量を含むことを特徴とする医薬組成物。 32．前記組成物が２種以上の異なるモノクローナル抗体を含む請求の範囲第31項に記載の医薬組成物。 33．ヒト免疫不全ウイルス（HIV）を含むと推測される源中のHIVの検出に有益なキットであって、そのキットが請求の範囲第１項、第５項、第９項または第11項に記載のモノクローナル抗体を含む容器を含む一つ以上の容器を密閉してその中に収容するように区画されているキャリヤー装置を含むことを特徴とするHIVの検出に有益なキット。