JPH08214897A

JPH08214897A - アスタキサンチン含有酵母抽出物の製造方法

Info

Publication number: JPH08214897A
Application number: JP7028490A
Authority: JP
Inventors: Yong Ki Kim; 容 ▲き▼ 金; Sung So; 星蘇
Original assignee: Pacific Corp
Current assignee: Pacific Corp
Priority date: 1995-02-16
Filing date: 1995-02-16
Publication date: 1996-08-27

Abstract

(57)【要約】【目的】アスタキサンチンを含有する酵母細胞抽出
物の製造方法を提供する。【構成】アスタキサンチンの天然供給源の一つである
パフィア酵母を、トリコデルマリーセイ(Trichoderma r
eesei)ＡＴＣＣ１３６１に由来する細胞壁分解酵素で処
理してアスタキサンチンを溶出させる方法である。【効果】本発明により処理された酵母細胞は、反応
液のまま乾燥させるか、必要な場合はアスタキサンチン
だけを分離して天然色素として利用することも可能であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アスタキサンチンを生
産する酵母を特定の細胞壁分解酵素で処理することによ
ってアスタキサンチンが溶出含有された酵母抽出物を製
造する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】アスタキサンチン（Astaxanthin ：３，
３’−ジヒドロキシ−カロチン−４，４’−ジオン）
は、自然界に広く分布されているカロチノイド系色素で
あって鮭や鱒の明るい桃色の色素源である。しかし、養
殖魚の場合、この色素を体内で合成できず、また、自然
界からも摂取不可能であるために、養殖魚がそれらの固
有の色を帯びることができず、その結果として価値が下
がることになる。

【０００３】このような問題を解決するため、養殖の飼
料中に人為的にアスタキサンチン色素を加えることによ
って鮭や鱒に特色ある桃色を帯びさせ、消費者の購買欲
を高める方法が試みられており、この目的のために、現
在では主に合成色素が利用されている。しかしながら、
食品添加物に対し合成添加物の安全性に関する制限が日
増しに厳格になり、また、合成色素は天然色素に比べて
吸収率が劣るので、次第に天然色素を好む傾向が増して
きた。

【０００４】最近アスタキサンチンの天然供給源として
最も注目されているものは、クルスタセア(Crustacea)
、微細藻類、ヘマトコックス(Haematococcus) 及びパ
フィアロドジマ(Phaffia rhodozyma) 酵母である。この
中でも、生産性において最も有利なものはパフィアロ
ドジマ酵母であり、これは不飽和脂肪酸、蛋白質、ビタ
ミンなどの栄養素が豊富に含まれているので、天然アス
タキサンチンの供給源としての価値がより高い。しか
し、パフィア(Phaffia) 属酵母のアスタキサンチンを天
然色素源として利用するためには、まず、酵母の細胞壁
を変性させるかあるいは溶解させてアスタキサンチンが
容易に溶出できるようにすることが必須である。

【０００５】酵母の細胞壁を処理する方法には、化学的
及び機械的方法がある。しかし、アスタキサンチンはカ
ロチノイド系色素であるので酸やアルカリには不安定で
あり、パフィア属酵母を化学的に処理するのは不適当で
ある。また、ホモジナイザー(homogenizer) を利用する
か、又は、超音波処理を介した機械的処理による方法も
実験的には可能であるが、大量生産には不適当である。

【０００６】従って、酵素処理による方法が最も適当で
あると考えられるが、パフィア属酵母の独特な細胞壁の
構造のため、最適な酵素に関する研究が未だ微々たる実
情にある。

【０００７】今まで発表された酵素を利用したパフィア
属酵母の細胞壁分解方法としては、バチルスサーキュラ
ンス(Bacillus circulans)ＷＬ−１２とパフィア属酵母
を混合培養し、バチルスサーキュランスにより生産され
る酵素で酵母の細胞壁を分解することであった。

【０００８】しかしながら、この方法においては、細胞
壁分解酵素の活性を保持するために、バチルスサーキュ
ランスＷＬ−１２の生菌濃度を適当水準に保つべきであ
り、また、不要なバチルス属の細胞屑(cell debris) が
混入するという欠点がある(Journal of Applied Bacter
iology, 59, 243 〜255, 1985)。

【０００９】また、他の方法は、トリコデルマハルジ
アニウム(Trichoderma harzianium)由来のNovo Mutanas
e sp 299(Trade mark, NOVO Laboratoriesの製品) 細胞
壁分解酵素を利用した方法(EP454,024 A2)であるが、こ
の方法では、この酵素がパフィア属酵母の細胞壁を分解
し得るということを提示しているにもかかわらず、アス
タキサンチンを溶出するのに２４〜４８時間が所要さ
れ、規模が大きくなると汚染菌等の成長のために抽出物
の成分に変化が生じる虞れがあるという欠点がある。

【００１０】従って、パフィア属酵母に対する経済的か
つ効果的な細胞壁酵素処理方法の提供が要求されてき
た。本発明では、トリコデルマリーセイ(Trichoderma r
eesei)ＡＴＣＣ１３６３１の細胞壁分解酵素がパフィア
属に属する酵母の細胞壁を分解し得ることを発見して本
発明を完成するに到った。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】すなわち、本発明の目
的は、トリコデルマリーセイＡＴＣＣ１３６１の細胞壁
分解酵素を用いてアスタキサンチンを生成するパフィア
属酵母を処理し、アスタキサンチンを細胞外に溶出させ
ることにより、吸収利用が容易であるアスタキサンチン
を含有する酵母細胞抽出物を製造する方法を提供するこ
とである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、ト
リコデルマリーセイＡＴＣＣ１３６１に由来する細胞壁
分解酵素を用いてアスタキサンチン生産能を有するパフ
ィア属酵母を処理することにより、アスタキサンチンを
細胞外に溶出させることを特徴とするアスタキサンチン
含有酵母細胞抽出物の製造方法である。

【００１３】以下、本発明をより詳細に説明する。本発
明によれば、パフィア属酵母の培養液又は酵母の懸濁液
（乾物量１〜３０％）を硫酸又は苛性ソーダ溶液でｐＨ
を４．０〜５．０に調整した後、トリコデルマリーセイ
ＡＴＣＣ１３６３１（韓国種菌協会寄託番号ＫＦＣＣ−
３５５１６）の細胞壁溶解酵素をパフィア属酵母乾物１
ｇ当たり１〜３単位(unit)添加し、２５〜３５℃で２〜
４時間処理する。

【００１４】アスタキサンチン生産能を有する酵母とし
ては、パフィア属に属する全ての酵素を用いることがで
き、その種類に制限はない。この酵素は、当業者によく
知られた方法により培養が可能であり、酵母中のアスタ
キサンチンの濃度を増加させるため、例えば、EP454,02
4 A2に記載された条件下に培養されることが好ましい。

【００１５】一般的に、酵母抽出物は栄養成分が豊富で
あるので、長時間反応すると汚染菌等が多量に増殖して
パフィア属酵母抽出物が変性する虞れがある。従って、
短時間で処理してパフィア属酵母の細胞壁を酵素分解す
ることが重要である。トリコデルマリーセイＡＴＣＣ１
３６３１に由来する酵母細胞分解酵素を用いることによ
り、生酵母又は熱処理された酵母などの細胞の状態にか
かわらず細胞壁の分解が可能であるが、細胞の処理時間
は細胞の状態に従って酵母細胞壁が十分に分解されるよ
うに考慮すべきである。

【００１６】すなわち、対数期まで培養された酵母はｐ
Ｈ４．０〜５．５、反応温度２５〜３５℃で、乾燥酵母
１ｇ当たり酵素２単位の量で反応させると約１時間未満
の反応時間がかかり、酵母細胞が熱処理された場合はそ
の時間が更に短くなる。しかし、約７２時間以上培養し
て停止期に入った酵母を上記と同じ条件で処理する際
は、約２〜４時間が必要とされる。

【００１７】酵母の細胞壁処理に使用される酵素の量
は、酵母が生酵母か又は熱処理された酵母であるかによ
って多少異なるが、一般的に乾燥酵母１ｇ当たり１〜３
単位の量が用いられる。

【００１８】このように酵素処理された酵母細胞は、更
に処理されてアスタキサンチン色素だけを分離して利用
することができると共に、酵素処理されたままの酵母細
胞に適当な乳化剤及び酸化防止剤を混合した後、噴霧乾
燥機などによって粉末化して天然色素として利用するこ
ともできる。

【００１９】トリコデルマリーセイから細胞壁分解酵素
の分離：パフィアロドジマＡＴＣＣ６６２７２の酵母細
胞０．５％、硫酸アンモニウム１％、燐酸カリウム０．
３％、塩化カリウム０．０５％、硫酸マグネシウム（Ｍ
ｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ）０．０５％及び硫酸鉄（ＦｅＳＯ
₄・７Ｈ₂Ｏ）０．００１％の溶液にトリコデルマリー
セイＡＴＣＣ１３６３１を接種し、２８℃で４日間振盪
培養した後遠心分離した。その上澄液に硫酸アンモニウ
ムを５０％濃度で飽和するように添加して酵素沈殿物を
取り、この沈殿を４℃で２日間水で透析して凍結乾燥
し、細胞液分解酵素を得た。

【００２０】細胞壁分解酵素の活性の測定：細胞壁分解
酵素の溶菌活性は次のような方法により濁度減少率で測
定した。まず、１２１℃で１０分間熱処理されたパフィ
ア属酵母細胞をコハク酸塩(Succinate) 緩衝液（２０ｍ
Ｍ、ｐＨ５．０）に懸濁させ、６６０ｎｍにおける吸光
度が０．５になるよう調整した。濁度減少率が１５〜３
０％の範囲となるように、この懸濁液１ｍｌに酵素溶液
２００μｌを添加し、混合し、３０℃で３０分間反応さ
せた後、６６０ｎｍにおける吸光度を測定し、次の式に
従って濁度減少率を求めた。

【００２１】濁度減少率（％）＝｛（ＡｂＲ₀−ＡｂＲ
₃₀）／ＡｂＲ₀｝×１００上式において、ＡｂＲ₀は反応混合液の初期吸光度であ
り、ＡｂＲ₃₀は３０分後の吸光度を表す。酵素の活性単
位はｐＨ５．０、３０℃で３０分間反応させ、吸光度が
１０％減少する量を１単位とした。

【００２２】トリコデルマリーセイに由来する細胞壁分
解酵素の作用範囲：トリコデルマリーセイＡＴＣＣ１３
６３１由来の細胞壁分解酵素の作用範囲を知るために、
多種の酵母細胞に対してその活性を検査した。検定菌株
としては、カンジダ(Candida) 、クルイベロマイセス(K
luyveromyces) （以上は、ＰＤ培地：ポテト(potato)２
０％、葡萄糖２％で培養）、シゾサッカロマイセス(Sch
izosaccharomyces) （ＹＥＰＤ培地：酵母抽出物１％、
ペプトン０．５％、葡萄糖１％で培養）及びその他酵母
菌株（ＹＭ培地：酵母抽出物０．３％、麦芽抽出０．３
％、ペプトン０．５％、葡萄糖２％で培養）を利用して
停止期まで培養し、１２１℃で１０分間熱処理した後遠
心分離にかけて蒸留水で洗浄した。細胞をコハク酸塩緩
衝液（２０ｍＭ、ｐＨ５．０）に懸濁してＯＤ₆₆₀＝
０．５になるよう調整し、懸濁液１ｍｌを取って酵素液
２０μｌ（２５０単位／ｍｌ）と混ぜた後３０℃で２時
間反応させ、ＯＤ₆₆₀の減少率を測定した。

【００２３】表１に示す様に、トリコデルマリーセイに
由来する細胞壁分解酵素は大部分の酵母菌株の細胞壁を
よく分解するが、ロドトルラ(Rhodotorula) 、カンジダ
(Candida) 、スポロボロマイセス(Sporobolomyces)等一
部の酵母の細胞壁は比較的分解しにくい。

【００２４】

【表１】

【００２５】

【実施例】以下、実施例に基づいて、本発明をより詳し
く説明する。

【００２６】実施例１トリコデルマリーセイＡＴＣＣ１３６３１が生成する酵
母細胞壁溶解酵素のｐＨ及び温度による活性を測定した
結果を表２及び表３に示した。表２及び表３から明らか
なように、パフィア属酵母の細胞壁を分解するに適する
ｐＨ範囲は、ｐＨ４．０〜５．０、かつ多少酸性であ
り、温度は３０℃で最も高い活性を示したが、２０〜５
０℃の広い範囲で活性を保持した。

【００２７】

【表２】

【００２８】

【表３】

【００２９】実施例２パフィアロドジマＡＴＣＣ６６２７２酵母を、ＹＭ培地
（酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ペプトン
０．５％、デキストロス１．０％、ｐＨ５．０）２００
ｍｌが収容されている１ｌ容量の３−バッフルフラスコ
(three baffledflask) に入れて、２０〜２２℃で３日
間振盪培養した。この培養液をＹＭ培地３ｌが入ってい
る５ｌ用発酵器に接種し、培養温度２２℃で充分な通風
条件下約７２時間培養した対数期状態の菌種を遠心分離
にかけた後、得られた酵母細胞をイオン水で２回洗浄し
た。

【００３０】上記の酵母細胞を適当量のイオン水に懸
濁、希釈して６６０ｎｍで吸光度を測定し、乾燥酵母細
胞の濃度（ｇ／ｌ）を調べた。該方法による６６０ｎｍ
においての吸光度０．０から０．５までの酵母の濃度
は、吸光度０．５の値が０．３６ｇ／ｌであった。

【００３１】アスタキサンチン色素の抽出状態を測るた
め、上記酵母懸濁液を乾燥重量１０％（ｗ／ｖ）の濃度
に調整し、硫酸又は苛性ソーダ溶液でｐＨを４．５に合
わせ、トリコデルマリーセイＡＴＣＣ１３６３１から得
た細胞壁分解酵素を一定量ずつ添加して３０℃で３０分
間及び６０分間反応させた。反応終了後遠心分離にかけ
て、上澄液を除き、残った酵母の小球（pellet）にアセ
トンを一定量添加して１〜２分間渦動処理（vortexing
）した後また遠心分離にかけた。

【００３２】このようにして得た細胞小球の色素状態を
観察してその結果を表４に示した。この時赤色の細胞が
白色に変わったらアスタキサンチン色素が完全に抽出さ
れたものと判断するのである。その結果、６０分間反応
した際乾燥酵母１ｇ当たり２単位の酵素量で白色の酵母
細胞が得られた。

【００３３】

【表４】

【００３４】実施例３実施例２と同じ方法で培養して得たパフィア酵母細胞で
それぞれ１％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ
／ｖ）、２０％（ｗ／ｖ）、３０％（ｗ／ｖ）の懸濁液
を作った。該懸濁液をｐＨ４．５に造成し、温度３０℃
でトリコデルマリーセイＡＴＣＣ１３６３１から得られ
た細胞壁分解酵素を乾燥酵母１ｇ当たり２単位入れて攪
拌しながら反応させた。

【００３５】次いで時間別に一定量のサンプルをとり、
実施例２と同じくアスタキサンチン色素の抽出状態を測
定しその結果を表５に示した。酵母懸濁液の濃度が１〜
２０％（ｗ／ｖ）の範囲内では２時間ほどで皆抽出され
たが、３０％においては懸濁液の粘性が高く多少の色彩
が残存した。

【００３６】

【表５】

【００３７】

【発明の効果】本発明によれば、トリコデルマリーセイ
ＡＴＣＣ１３６１の細胞壁分解酵素を用いてアスタキサ
ンチンを生成するパフィア属酵母を処理し、アスタキサ
ンチンを細胞外に溶出させることにより、吸収利用が容
易であるアスタキサンチンを含有する酵母細胞抽出物を
製造することができる。また、本発明により処理された
酵母細胞は、反応液のまま乾燥させるか、必要な場合は
アスタキサンチンだけを分離して天然色素として利用す
ることも可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０９Ｂ 61/00 Ｃ０９Ｂ 61/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 23/00 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/16 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】トリコデルマリーセイＡＴＣＣ１３６１
に由来する細胞壁分解酵素を用いてアスタキサンチン生
産能を有するパフィア属酵母を処理することにより、ア
スタキサンチンを細胞外に溶出させることを特徴とする
アスタキサンチン含有酵母細胞抽出物の製造方法
【請求項２】乾燥酵母１ｇ当たり１〜３単位の細胞壁
分解酵素を添加し、反応ｐＨ４．０〜５．０、反応温度
２５〜３５℃及び処理時間２〜４時間の条件で処理する
ことを特徴とする請求項１記載のアスタキサンチン含有
酵母細胞抽出物の製造方法。
【請求項３】酵母細胞が生酵母細胞又は熱処理された
酵母細胞であることを特徴とする請求項１記載のアスタ
キサンチン含有酵母細胞抽出物の製造方法。