JPH08119983A

JPH08119983A - 新規化合物ｗｆ１４８６５、その製造方法およびその用途

Info

Publication number: JPH08119983A
Application number: JP7167754A
Authority: JP
Inventors: Takanao Otsuka; 隆尚大塚; Tomoko Sato; 智子佐藤; Hiroshi Hatanaka; 洋畑中; Shigehiro Takase; 茂弘高瀬; Sumio Kiyoto; 純夫清遠; Masahiro Neya; 正博閨; Keiji Henmi; 恵次逸見
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1994-07-08
Filing date: 1995-07-03
Publication date: 1996-05-14

Abstract

(57)【要約】【構成】カテプシンＢおよび／またはＬに対する阻害
作用を有する新規化合物ＷＦ１４８６５ＡおよびＷＦ１
４８６５Ｂ、栄養培地で子嚢菌類アニキシオプシスハ
ンセン１８９７属に属するＷＦ１４８６５生産菌を培
養することにより、ＷＦ１４８６５ＡおよびＷＦ１４８
６５Ｂを製造する方法、およびＷＦ１４８６５Ａまたは
ＷＦ１４８６５Ｂと医薬上許容される担体とを含有する
医薬組成物。【効果】ＷＦ１４８６５ＡおよびＷＦ１４８６５Ｂ
は、カテプシンＢおよび／またはＬ活性に対する強い阻
害活性を有し、哺乳動物に対して経口または非経口投与
により、カテプシンＢおよび／またはＬ活性に起因する
種々の疾病を治療および予防することに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規化合物ＷＦ１４８
６５ＡおよびＷＦ１４８６５Ｂに関する。更に詳しく
は、本発明はカテプシンＢおよび／またはＬ活性を阻害
する役割を果たす新規化合物ＷＦ１４８６５ＡおよびＷ
Ｆ１４８６５Ｂ、栄養培地で子嚢菌類アニキシオプシス
属（Anixiopsis Hansen 1897) に属するＷＦ１４８６５
生産菌を培養することによりＷＦ１４８６５ＡおよびＷ
Ｆ１４８６５Ｂを製造する方法、およびＷＦ１４８６５
ＡまたはＷＦ１４８６５Ｂと医薬上許容される担体とを
含有する医薬組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】最近、リ
ソソームシステインプロテアーゼである、カテプシンＢ
および／またはＬが慢性関節リウマチ、変形性関節炎等
の炎症性関節疾患により引き起こされる関節破壊に関与
していることが示唆された〔Biochemical Pharmacolog
y, 44,1201 (1992) 〕。また、カテプシンＢおよび／ま
たはＬは筋ジストロフィーや空胞状末梢性筋障害(vacuo
lar distal myopathy)等の難治性の筋肉虚脱疾患を引き
起こすと考えられている。カテプシンＢおよびＬはアル
ツハイマー病を患った患者の脳における老人斑の形成に
関与する酵素でもある。

【０００３】それ故に、カテプシンＢおよび／またはＬ
阻害剤は、これらの疾病に対し有用であることが期待さ
れる。従来より、例えば微生物の産物であるアンチパイ
ンおよびロイペプチンは効果的ではあるが、システイン
プロテアーゼの可逆的な阻害剤であり〔McConnell et a
l., 33 J. Med. Chem. 86-93 (1990); Sutherland eta
l. 110 Biochem. Biophys. Res. Commun. 332-38 (198
2)〕、これらはまたセリンプロテアーゼも阻害する〔Um
ezawa, 45 Meth. Enzymol. 678-95 (1976)〕。化合物Ｅ
６４やその合成類縁体は、より選択的な阻害剤であるが
〔Barret et al.,201 Biochem. J. 189-98 (1982); Gr
inde, 701 Biochem. Biophys. Acta. 328-33 (1982)
〕、生体内で用いられる際には、血液の循環からあま
りにも早く消失してしまう〔Hashida et al., 91 J. Bi
ochem. 1373-80 (1982) 〕。

【０００４】

【発明を解決するための手段】本発明者らは微生物の産
物からカテプシンＢおよび／またはＬ阻害作用を示す新
規化合物をスクリーニングした。スクリーニングの結
果、本発明者らは子嚢菌類アニキシオプシス属に属する
菌株の培養物から、新規化合物ＷＦ１４８６５Ａおよび
ＷＦ１４８６５Ｂを単離した。

【０００５】本発明は、カテプシンＢおよび／またはＬ
に対する阻害作用を有し、以下に述べるような物理化学
的特性を有する新規化合物ＷＦ１４８６５ＡおよびＷＦ
１４８６５Ｂを提供する。本発明はまた、栄養培地で子
嚢菌類アニキシオプシス属に属するＷＦ１４８６５生産
菌を培養し、得られた培養物から化合物ＷＦ１４８６５
ＡまたはＷＦ１４８６５Ｂを採取することを特徴とする
化合物ＷＦ１４８６５ＡまたはＷＦ１４８６５Ｂの製造
法を提供する。更に、本発明はカテプシンＢおよび／ま
たはＬ活性に起因する上述した種々の疾病を治療および
予防するための哺乳動物用の医薬組成物として有用な、
有効成分として化合物ＷＦ１４８６５ＡまたはＷＦ１４
８６５Ｂと医薬上許容される担体とを含有する医薬組成
物を提供するものである。また更に、本発明はカテプシ
ンＢおよび／またはＬ阻害作用を示す薬剤、およびアニ
キシオプシスステルコラリア(Anixiopsis stercorari
a)Ｎｏ．１４８６５の生物学的に純粋な培養物を提供す
るものである。

【０００６】新規化合物ＷＦ１４８６５Ａは次の物理化
学的性質を有する。ａ）外観：無色粉末ｂ）分子式：Ｃ₁₆Ｈ₂₅Ｎ₅Ｏ₅ ｃ）ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ３６８（Ｍ＋Ｈ）ＨＲＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ測定値：３６８．１９２
４理論値Ｃ₁₆Ｈ₂₅Ｎ₅Ｏ₅＋Ｈ：３６８．１９３４ｄ）赤外線吸収スペクトル：図１に示す 3290, 2970, 1680, 1640, 1560, 1460, 1430, 1390, 12
00, 1140 900, 800ｃｍ^-1 ｅ）溶解性：可溶：メタノール、水難溶：アセトン不溶：クロロホルムｆ）呈色反応陽性：ニンヒドリン反応塩化第二鉄反応硫酸セリウム反応ヨウ素蒸気との反応陰性：エールリッヒ反応モーリッシュ反応ジアセチル反応ｇ）¹H-NMR スペクトル（４００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）
(図２に示す） δ ppm : 6.52 (1H, s),4.17 (1H, d, J=8Hz),3.69 (1
H, d, J=2Hz),3.51 (1H, d, J=2Hz),3.27 (1H, m),3.22
(1H, m),2.50 (2H, m),1.90 - 1.73 (3H, m),1.54 (1
H, m),1.20 (1H, m),0.94 (3H, d, J=7Hz),0.92 (3H,
t, J=7Hz) ｈ）¹³C-NMR スペクトル（１００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）
(図３に示す） δ ppm : 173.4 (s),170.6 (s),168.7 (s),148.6 (s),1
28.3 (s),110.0 (d),59.7 (d),54.2 (d),53.3 (d),39.3
(t),37.8 (d),29.0 (t),26.1 (t),22.6 (t),15.9 (q),
11.3 (q) ｉ）比旋光度：〔α〕_D ²⁵＝＋３０．０゜（ｃ＝０．１，ＣＨ₃ＯＨ）ｊ）アミノ酸分析：イソロイシン

【０００７】新規化合物ＷＦ１４８６５Ｂは次の物理化
学的性質を有する。ａ）外観：白色粉末ｂ）分子式：Ｃ₁₆Ｈ₂₅Ｎ₅Ｏ₅ ｃ）ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ３６８（Ｍ＋Ｈ）ＨＲＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ測定値：３６８．１９２
４理論値Ｃ₁₆Ｈ₂₅Ｎ₅Ｏ₅＋Ｈ：３６８．１９３４ｄ）赤外線吸収スペクトル：図４に示す 3300, 2960, 1680, 1650, 1620, 1550, 1470, 1440, 13
80, 1250 1130, 900 ｃｍ^-1 ｅ）溶解性：可溶：メタノール、水難溶：アセトン不溶：クロロホルムｆ）呈色反応陽性：ニンヒドリン反応硫酸セリウム反応塩化第二鉄−フェリシアン化カリウム反応ヨウ素蒸気との反応エールリッヒ反応陰性：塩化第二鉄反応モーリッシュ反応ｇ）¹H-NMR スペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）
(図５に示す） δ ppm : 6.50 (1H, s),4.36 (1H, dd, J=9Hz, J=6Hz),
3.53 (1H, d, J=2Hz),3.36 (1H, d, J=2Hz),3.30-3.14
(2H, m),2.49 (2H, m),1.78 (2H, m),1.70-1.54 (3H,
m),0.97 (3H, d, J=6Hz),0.92 (3H, d, J=6Hz) ｈ）¹³C-NMR スペクトル（７５ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）
（図６に示す） δ ppm : 174.6 (s),174.0 (s),170.2 (s),148.7 (s),1
28.4 (s),109.9 (d),55.6 (d),54.1 (d),53.6 (d),41.7
(t),39.3 (t),29.0 (t),26.0 (d),23.4 (q),22.6 (t),
21.9 (q) ｉ）比旋光度：〔α〕_D ²³＝＋３５゜（ｃ＝０．７，ＣＨ₃ＯＨ）ｊ）アミノ酸分析：ロイシン

【０００８】ＷＦ１４８６５Ａ（５−〔３−〔Ｎ−
〔〔（２Ｒ，３Ｒ）−３−トランス−（オキシカルボニ
ル）オキシラン−２−イル〕カルボニル〕−Ｌ−イソロ
イシル〕アミノプロパニル〕−１Ｈ−イミダゾール−２
−イルアミン）の構造式は以下の通りである。

【０００９】

【化１】

【００１０】ＷＦ１４８６５Ｂ（５−〔３−〔Ｎ−
〔〔（２Ｒ，３Ｒ）−３−トランス−（オキシカルボニ
ル）オキシラン−２−イル〕カルボニル〕−Ｌ−ロイシ
ル〕アミノプロパニル〕−１Ｈ−イミダゾール−２−イ
ルアミン）の構造式は以下の通りである。

【００１１】

【化２】

【００１２】本明細書中では、上記化合物ＷＦ１４８６
５ＡとＷＦ１４８６５Ｂを総称してＷＦ１４８６５とも
いう。

【００１３】ＷＦ１４８６５は、アニキシオプシスス
テルコラリア(Anixiopsis stercoraria)Ｎｏ．１４８６
５等のような子嚢菌類アニキシオプシス属に属するＷＦ
１４８６５生産菌を栄養培地で培養し、得られた培養物
からＷＦ１４８６５を採取することにより製造される。
子嚢菌類アニキシオプシス属に属するＷＦ１４８６５生
産菌の中でも、アニキシオプシスステルコラリア(Ani
xiopsis stercoraria)Ｎｏ．１４８６５は本発明者らに
よって鹿児島県鹿屋市で採取された土壌サンプルから新
たに単離されたものである。アニキシオプシスステル
コラリア(Anixiopsis stercoraria)Ｎｏ．１４８６５の
凍結乾燥サンプルは、ブタペスト条約に基づく国際寄託
機関である、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研
究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０
５））に１９９４年６月６日、寄託番号ＦＥＲＭＢＰ
−４６８９として寄託されている。

【００１４】本明細書中で挙げた特定な微生物を利用す
る方法は、単に説明の目的で挙げたものであり、新規化
合物ＷＦ１４８６５の製造はこれに限定されるものでは
ない。本発明はまた、ＷＦ１４８６５を製造することの
できる全ての変異体、これには自然発生した変異体だけ
でなく、Ｘ線、紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン、または２−アミノプリンな
どによる処理のような慣用の方法によって上述の微生物
から製造される人為的な変異体も包含される。

【００１５】アニキシオプシスステルコラリア(Anixi
opsis stercoraria)Ｎｏ．１４８６５は、以下のような
形態学的、培養的、生理学的性質を有する。

【００１６】ＷＦ１４８６５生産菌株Ｎｏ．１４８６５
の性質菌株Ｎｏ．１４８６５は、鹿児島県鹿屋市で採集した
土壌サンプルから単離されたものである。この微生物は
各種の培地で速やかに広がり、黄色味白色のコロニーを
形成した。この菌株Ｎｏ．１４８６５は幾つかの寒天
培地でアナモルフ（クリソスポリウム−モルフ(Chrysos
porium-morph) ）とテレオモルフ（子嚢殻）の両方を形
成した。子嚢殻は閉子嚢殻であって、子嚢が不規則に並
んでいる。子嚢は一重性膜を有し、形態は亜球形から卵
形で消失性の壁を有する。子嚢胞子はレンズ状で、不規
則な細網で覆われている。形態学的性質に基づき、この
菌株は子嚢菌類アニキシオプシス属に属すると考えられ
る（Y. Otani: Seiya Ito's Mycological Flora of Jap
an. Vol.III, No.2, 310p., Yokendo LTD., Tokyo,198
8) 。

【００１７】各種の寒天培地における培養的性質を表１
に示す。ＹｐＳｓ寒天培地ではコロニーが広く拡大的に
生育し、２５℃，２週間でその直径が６．５−７．０ｃ
ｍに達した。コロニーの表面は平坦で、薄く、色は淡赤
色から白色であった。裏面の色は赤味灰色から黄色味白
色であった。子嚢殻および分生子構造が観察された。コ
ーンミール寒天培地でのコロニーは広く拡大的に生育
し、同条件で直径が５．０−６．５ｃｍに達した。コロ
ニーの表面は平坦で、薄く、粉状で色は黄色味白色であ
った。裏面の色も黄色味白色であった。分生子構造が観
察された。

【００１８】形態的性質はＹｐＳｓ寒天培地での培養に
基づき決定された。閉子嚢殻は、薄く、平滑で、形態は
球形から亜球形をしており、その大きさは１３０−２９
０μｍで、成熟すると灰色味を帯びる。子嚢の内部には
８個の胞子が入っており、形態は亜球形から卵形で消失
性の壁を有し、その大きさは直径が７．５−１２．０μ
ｍであった。子嚢胞子はレンズ状で、その直径は３．５
−５．５μｍで不規則な細網に覆われている。アナモル
フは、アレウロ型分生子および分節型分生子からなる。
末端および側方のアレウロ型分生子は無色であり、隔壁
がなく、平滑で、洋梨状から棍棒状の形態をしていて、
裁断状の基部を有し、大きさは４．５−１０．０×４．
０−６．５μｍであった。中間に在る分節型分生子は無
色であり、隔壁がなく、平滑で、円筒形から樽型の形態
をしており、その両端が裁断状で、大きさは５．０−１
２．５×２．５−５．０μｍであった。栄養菌糸は、平
滑で、隔壁を有し、無色で、分岐していた。菌糸細胞
は、円筒形をしており、その幅は１．０−４．５μｍで
あった。

【００１９】Ｎｏ．１４８６５菌株は６℃から３６℃の
範囲で生育可能であり、最適生育温度は２６℃から３１
℃であった。これらの温度データはバレイショ・ブドウ
糖寒天培地（日水社製）で測定した。

【００２０】アニキシオプシス属の分類基準によると
（E. Gueho and C. De Vroey: Canadian Journal of Bo
tany, 64, pp.2207-2210, 1986) 、Ｎｏ．１４８６５菌
株はアニキシオプシスステルコラリア(Anixiopsis st
ercoraria)の菌株であると同定され、通商産業省工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ
−４６８９として寄託された（寄託日：１９９４年６月
６日）。

【００２１】

【表１】

【００２２】^*：麦芽エキス寒天培地、ツァペック寒天
培地、およびＭＹ２０寒天培地の組成は、JCM Catalogu
e of Strains（Nakase, T., 5th ed., 503p., Japan Co
llection of Microorganisms and Life Science Resear
ch Information Section ofthe Institute of Physical
and Chemical Research, Saitama, 1992）に基づいた
ものである。

【００２３】これらの特性は２５℃で１４日間培養した
後に観察した。メチューン・ハンドブック・オブ・カラ
ー(Kornerup, A. and J.H. Wanscher, Methuen Handboo
k ofColor, 3rd ed., 525p., Methuen, London, 1978)
に基づいて、色調の表記を行った。

【００２４】一般的に、ＷＦ１４８６５はＷＦ１４８６
５生産菌を同化し得る炭素源および窒素源を含有する栄
養培地で、好ましくは好気性条件下（例えば振盪培養、
液内培養等）にて培養することにより製造することがで
きる。

【００２５】栄養培地中の好適な炭素源はグルコース、
フルクトース、グリセリンおよびデンプン等の炭水化物
である。他の含有可能な炭素源としてはラクトース、ア
ラビノース、キシロース、デキストリン、糖蜜等が挙げ
られる。

【００２６】好適な窒素源は酵母エキス、ペプトン、グ
ルテンミール、綿実粉、大豆粉、コーンスティープリカ
ー、乾燥酵母等、並びにアンモニウム塩（例えば、硝酸
アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等）、尿素、アミノ酸等のような無機および有機窒素化
合物である。

【００２７】炭素源および窒素源は組み合わせて使用す
ることが有利であるけれども、純度の低い原料でも微量
の生育因子および相当量の無機栄養素を含有するものな
ら、使用に好適であるので、純品を用いる必要はない。
必要に応じて、炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リ
ン酸カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、マ
グネシウム塩、塩化コバルト等の無機塩を培地に添加し
てもよい。必要に応じて、特に培養液が著しく発泡する
場合は、流動パラフィン、高級アルコール、植物油、鉱
油またはシリコーンのような消泡剤を添加してもよい。

【００２８】大量製造の条件として、ＷＦ１４８６５の
製造には好気性液内培養が好ましい。少量の製造には、
フラスコまたはボトル内で振盪培養または表面培養を行
う。更に、大型タンクで培養を行う場合は、ＷＦ１４８
６５の製造工程における増殖遅延を防止するために、製
造タンク内へ増殖型の微生物を接種することが好まし
い。従って、まず最初に比較的少量の培地を微生物の胞
子または菌糸と共に接種し、接種した培地を培養するこ
とにより微生物の増殖型接種物を製造し、培養した増殖
型接種物を無菌的に大型タンクに移す。増殖型接種物を
製造する培地としては、ＷＦ１４８６５の主培養で利用
する培地と実質的に同じかあるいは若干異なる培地を使
用することができる。

【００２９】培養混合物の攪拌および通気は、種々の方
法で行うことができる。攪拌はプロペラまたは同様の機
械的攪拌装置により、醗酵槽を回転または振盪すること
によって、種々の揚水装置によって、あるいは培養液中
に無菌空気を通すことによって行うことができる。通気
は無菌空気を醗酵混合物中に通すことによって行うこと
ができる。

【００３０】培養は通常約４℃〜約４０℃、好ましくは
約２０℃〜約３０℃で、５０時間から１００時間かけて
行う。これは醗酵条件および規模により変更することが
できる。

【００３１】このように生産されたＷＦ１４８６５は、
抗生物質のような他の醗酵生成物を回収するために通常
用いられる公知の方法により培養液から採取される。

【００３２】一般的に、生産されたＷＦ１４８６５の大
部分は培養菌糸ケーク中に見出される。従って、ＷＦ１
４８６５は培養液を濾過または遠心分離することによっ
て得られる菌子ケークの抽出物から、慣用の溶媒を用い
た抽出、減圧下での濃縮、凍結乾燥、ｐＨ調整、慣用の
樹脂（例えば、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂、非イ
オン性吸着樹脂）による処理、慣用の吸着剤（活性炭、
ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ）による処
理、結晶化、再結晶等のような慣用の方法により単離さ
れる。

【００３３】ＷＦ１４８６５は、後記実施例に示すよう
な合成法により合成することもできる。ＷＦ１４８６５
はカルボキシル基を有するので、常法に従ってエステル
体に変換することができる。エステル体の例としては、
アルキルエステル（メチル、エチル、プロピル、イソプ
ロピル、n-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert−ブ
チル等のアルキルとのエステル）、アラルキルエステル
（ベンジルエステル等）等が挙げられる。

【００３４】以下の試験により、ＷＦ１４８６５の幾つ
かの生物学的性質を詳細に説明する。試験例１（ＷＦ１４８６５ＡまたはＷＦ１４８６５Ｂに
よる生体外でのカテプシンＢ活性の阻害。）カテプシンＢ活性は、蛍光産生性のペプチドであるＮ−
カルボベンゾキシ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ａｒｇ−ＡＭＣ
（Ｚ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）からの７−アミノ−４
−メチルクマリン（ＡＭＣ）の放出を３６０ｎｍにおけ
る励起および４６０ｎｍでの発光で検出することにより
測定した。全ての反応は、マイクロタイタープレート上
で行った。阻害剤５０μｌを、１０μＭのＺ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−ＡＭＣ、５ｍＭのジチオトレイトールおよび１
ｍＭのＥＤＴＡを含有する１００ｍＭのリン酸ナトリウ
ム緩衝溶液（ｐＨ６．０）で連続希釈した。反応は７５
ｎｇ／ｍｌのヒト肝臓カテプシンＢ（Athens Research
& Technology, 米国) の添加により開始した。その混合
物を３７℃、６０分間インキュベートし、３０ｍＭの酢
酸ナトリウムおよび７０ｍＭの酢酸を含有する緩衝溶液
（ｐＨ４．３）に溶解した１００ｍＭモノクロロアセテ
ートナトリウムを１００μｌ添加することにより反応を
終了させた。蛍光の測定には、タイターテックフルオロ
キャンII分光光度計(flow Laboratories, オーストラリ
ア) を使用した。試薬ブランク（酵素を含まない）の蛍
光を試験測定値から差し引いた。キャリブレーション
は、濃度の異なるフリーのＡＭＣで行った。

【００３５】ＷＦ１４８６５ＡおよびＷＦ１４８６５Ｂ
を阻害剤として使用した際に得られた結果を表２および
３にそれぞれ示す。上記測定において、ＷＦ１４８６５
ＡにはカテプシンＢ（Ｌｏｔ．ＣＢ９３０２）を使用
し、ＷＦ１４８６５ＢにはカテプシンＢ（Ｌｏｔ．ＣＢ
９４０２）を使用した。

【００３６】

【表２】

【００３７】

【表３】

【００３８】試験例２（ＷＦ１４８６５ＡまたはＷＦ１
４８６５Ｂによる生体外でのカテプシンＬ活性の阻
害。）カテプシンＬの活性は、ヒト肝臓カテプシンＬ（最終濃
度５０ｎｇ／ｍｌ、Calbiochem, 米国）および基質とし
てＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＡＭＣを用いてカテプシンＢ活
性と同様に測定した。ＷＦ１４８６５ＡおよびＷＦ１４
８６５Ｂを阻害剤として使用した際に得られた結果をそ
れぞれ表４および５に示す。上記測定において、ＷＦ１
４８６５ＡにはカテプシンＬ（Ｌｏｔ．７９３９９３）
を使用し、ＷＦ１４８６５ＢにはカテプシンＬ（Ｌｏ
ｔ．Ｂ１０５７３）を使用した。

【００３９】

【表４】

【００４０】

【表５】

【００４１】試験例３（急性毒性）ＷＦ１４８６５ＡまたはＷＦ１４８６５Ｂ（投与量：３
００ｍｇ／ｋｇ）を５匹のＩＣＲ系マウス（雌、５週
齢）に腹腔内に投与した。１週間観察したが、異常な症
状は認められなかった。

【００４２】本発明におけるＷＦ１４８６５ＡおよびＷ
Ｆ１４８６５Ｂは、強いカテプシンＢおよび／またはＬ
阻害作用を示すので、慢性関節リウマチ、変形性関節
炎、マラリア、歯肉炎、代謝性骨疾患（骨粗鬆症）、筋
ジストロフィー、空胞状末梢性筋障害(vacuolar distal
myopathy)およびアルツハイマー病のようなカテプシン
Ｂおよび／またはＬ活性亢進に起因する疾病を治療およ
び予防するための哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラ
ット、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ブタ）用の医薬品と
して使用される。

【００４３】本発明におけるＷＦ１４８６５ＡまたはＷ
Ｆ１４８６５Ｂは、医薬上許容できる担体との混合物と
して哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ネコ、
イヌ、ウサギ、ウシ、ブタ）に対し、カプセル剤、錠
剤、顆粒剤、散剤、バッカル剤、舌下剤および液剤のよ
うな医薬組成物の形態で経口または非経口的に投与する
ことができる。

【００４４】医薬上許容される担体としては、医薬用途
に慣用に使用される種々の有機または無機担体材料、例
えば賦形剤（例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、
ソルビット、ラクトース、グルコース、セルロース、タ
ルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等）、結合剤
（例えば、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシ
プロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチ
ン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、
デンプン等）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシ
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースのカル
シウム塩、ヒドロキシプロピル−デンプン、グリコール
−スターチのナトリウム塩、炭酸水素ナトリウム、リン
酸カルシウム、クエン酸カルシウム等）、滑沢剤（例え
ば、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、
ラウリル硫酸ナトリウム等）、矯味剤（例えば、クエン
酸、メントール、グリシン、オレンジ末等）、保存剤
（例えば、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウ
ム、メチルパラベン、プロピルパラベン等）、安定化剤
（例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等）、
懸濁化剤（例えば、メチルセルロース、ポリビニルピロ
リドン、ステアリン酸アルミニウム等）、分散剤（例え
ば、界面活性剤等）、水性希釈剤（例えば、水）、油類
（例えば、ゴマ油等）、および基剤ワックス（例えば、
カカオ脂、ポリエチレングリコール、白色ワセリン等）
が例示される。

【００４５】ＷＦ１４８６５ＡおよびＷＦ１４８６５Ｂ
の投与量は、疾患の種類、患者の体重および／または年
齢、投与経路等の種々の要因により変更することができ
る。ＷＦ１４８６５ＡまたはＷＦ１４８６５Ｂは、１日
に約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１〜５０ｍ
ｇ／ｋｇを非経口的に投与され、特に皮下、静脈、筋肉
または直腸に投与される。経口剤として使用する場合
は、ＷＦ１４８６５ＡまたはＷＦ１４８６５Ｂは好まし
くは１日に約０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ、より好ましく
は１０〜３００ｍｇ／ｋｇを投与することが望ましい。

【００４６】

【実施例】以下に、本発明を説明するために実施例を挙
げる。実施例１：ＷＦ１４８６５Ａの単離（１）Ｎｏ．１４８６５菌株の培養ショ糖（４％）、綿実粕（２％）、乾燥酵母（１％）、
ポリペプトン（１％）、リン酸二水素カリウム（０．２
％）、炭酸カルシウム（０．２％）、およびポリソルベ
ート８０（０．１％）を含有する水性シード培地（１２
０ｍｌ）を３つの５００ｍｌ容三角フラスコにそれぞれ
注ぎ、１２０℃で３０分間滅菌した。２５℃で２週間、
ＹｐＳｓ寒天培地上で増殖した成熟斜面培養物から一白
金耳のＮｏ．１４８６５菌株をそれぞれのシードフラス
コに接種した。接種されたフラスコを、回転振盪器（２
２０ｒｐｍ、振幅５．１ｃｍ）で２５℃で４日間振盪し
た。得られたシード培養物を、２０リットルの無菌の培
養培地に接種した。コーンスターチ（２％）、グリセリ
ン（１％）、ピーナッツパウダー（１％）、コーンステ
ィープリカー（０．５％）および炭酸カルシウム（０．
２％）を含有する水性培地を３０リットル容のステンレ
ススティールジャーファメンターに注いだ。培地のｐＨ
は１２０℃で３０分間滅菌する前に、ＮａＯＨ水溶液で
６．０に調節した。培養は、２０リットル／分で通気
し、１８０ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で５日間行わ
れた。

【００４７】培養中のＮｏ．１４８６５（ＷＦ１４８６
５Ａ）の生産を、逆相カラム（YMCAM303 ODS 250x4.6mm
（内径）ワイエムシィ社、日本）を用いたＨＰＬＣ（H
ighPerformance Liquid Chromatography ：高速液体ク
ロマトグラフィー）によりモニターした。溶媒系は０．
０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含有する２５％メ
タノール水であり、その検出波長は２１０ｎｍであっ
た。

【００４８】（２）ＷＦ１４８６５Ａの単離および精製培養終了後、培養液（４０リットル）を濾過し、４０リ
ットルのメタノールを攪拌しながら菌糸ケークに加え
た。その混合物を一晩放置し、濾過した。抽出物を減圧
下で水溶液になるまで濃縮し、高分子吸着剤ＨＰ−２０
（三菱化成（株），１．５リットル）に吸着させた。カ
ラムを水で洗浄後、所望する物質を５０％メタノール水
（６リットル）でカラムから溶出させた。その溶出液を
濃縮乾固（約４．５ｇ）させ、少量の水で溶解し、ＹＭ
Ｃ−ＯＤＳ−ＡＭ（ワイエムシィ社、日本、２リット
ル）カラムクロマトグラフィーに付した。カラムを０．
２％ＴＦＡを含有する１０％アセトニトリル水溶液で溶
出した。活性画分を集めて、濃縮乾固させ粗残留物８３
１ｍｇを得た。１００ｍｇの粗残留物を少量の０．１％
ＴＦＡを含有する１２．５％アセトニトリル水溶液に溶
解し、逆相カラムＹＭＣ−ＯＤＳ−ＡＭ（ＹＭＣ充填カ
ラム，SH-343-5AM, ワイエムシィ社、日本）に充填し
た。カラムは上記と同様の溶媒で溶出し、活性画分を集
めた。その集めた画分を乾燥し、０．１％ＴＦＡを含有
する２５％メタノール水で再び溶解し、逆相カラムＹＭ
Ｃ−ＯＤＳ−ＡＭ（ＹＭＣ充填カラム，SH-343-5AM, ワ
イエムシィ社、日本）に充填した。カラムを０．１％Ｔ
ＦＡを含有する２５％メタノール水で溶出した。活性画
分を、減圧下で濃縮し、凍結乾燥して純粋な粉末として
１１ｍｇのＷＦ１４８６５Ａを得た。

【００４９】実施例２：ＷＦ１４８６５Ｂの単離（１）Ｎｏ．１４８６５菌株の培養ショ糖（４％）、綿実粉（２％）、乾燥酵母（１％）、
ポリペプトン（１％）、リン酸二水素カリウム（０．２
％）、炭酸カルシウム（０．２％）、およびポリソルベ
ート８０（０．１％）を含有する水性シード培地（１２
０ｍｌ）を３つの５００ｍｌ容三角フラスコにそれぞれ
注ぎ、１２０℃で３０分間滅菌した。２５℃で２週間、
ＹｐＳｓ寒天培地上で増殖した成熟斜面培養物から一白
金耳のＮｏ．１４８６５菌株をそれぞれのシードフラス
コに接種した。接種されたフラスコは、回転振盪器（２
２０ｒｐｍ、振幅５．１ｃｍ）で２５℃、３日間振盪し
た。

【００５０】コーンスターチ（２％）、グリセリン（１
％）、コーンスティープリカー（０．５％）、ピーナッ
ツパウダー（１％）、硫酸アンモニウム（０．５％）、
炭酸カルシウム（１％）、およびβ−シクロデキストリ
ン（１％）を含有する水性培地を３０リットル容のステ
ンレススティールジャーファメンターに注いだ。培地の
ｐＨは１２０℃で３０分間滅菌する前に、６ＮのＮａＯ
Ｈ水溶液で６．０に調節した。

【００５１】得られたシード培養物を、２０リットルの
無菌の培養培地に接種した。培養は、２０リットル／分
で通気し、２００ｒｐｍで攪拌しながら、２５℃で４日
間行った。

【００５２】培養中のＮｏ．１４８６５（ＷＦ１４８６
５Ｂ）の生産を、逆相カラム（YMCAM303 ODS 250x4.6mm
（内径）、ワイエムシィ社、日本）を用いたＨＰＬＣ
によりモニターした。溶媒系は０．１％トリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）を含有するアセトニトリル−テトラヒドロ
フラン（ＴＨＦ）−水（１２．５：２．０：８５．５）
で、その検出波長は２１０ｎｍであった。

【００５３】（２）ＷＦ１４８６５Ｂの単離および精製このようにして得られた培養液（３２０リットル）を珪
藻土の層を用いて濾過した。３２０リットルの水道水を
攪拌しながら菌糸ケークに加え、濃硫酸でｐＨを２．０
に調節した。その混合物を５時間室温で放置し、濾過し
た。抽出物を６ＮのＮａＯＨ水溶液で６．５に調節し、
高分子吸着剤ＤｉａｉｏｎＨＰ−２０（三菱化成
（株）、２１リットル）に吸着させた。カラムを水で洗
浄後、５０％メタノール水で溶出した。その溶出液（８
４リットル）を４０リットルになるまで減圧下で濃縮し
た。その水溶液をＤｉａｉｏｎＨＰ−２０（１０リッ
トル）に通した。水、１０％メタノール水、および１５
％メタノール水で洗浄後、所望する物質を、４０％メタ
ノール水で溶出した。その溶出液を１０リットルになる
まで減圧下で濃縮し、１０ｍｌのＴＦＡを加えた。濃縮
液をＹＭＣ−ゲル(ODS-AM, 120-S50, ワイエムシィ社、
２リットル）カラムクロマトグラフィーに付した。カラ
ムを０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル−ＴＨＦ
−水（５：２：９３）で溶出した。活性画分を集めて、
減圧下で水溶液になるまで濃縮し、凍結乾燥した。少量
の水で溶解した後、粗製の黄色味粉末を同様な溶媒系で
溶出するＹＭＣ−ゲル（２リットル）カラムクロマトグ
ラフィーに再度付した。活性画分を凍結乾燥することに
より、淡黄色味粉末（３８９．９ｍｇ）を得た。４ｍｌ
の水に溶解したこの粗生成物をＹＭＣ−ゲル（２リット
ル）カラムに充填し、０．１％ＴＦＡを含有するアセト
ニトリル−ＴＨＦ−水（１０：２：８８）で溶出した。
その活性画分を減圧下で濃縮し、凍結乾燥した。２．５
ｍｌの水に溶解した白色粉末（２４３．８ｍｇ）を、Ｙ
ＭＣ充填カラム（D-ODS-15B, S-15, 250x30mm（内径）)
を用い、アセトニトリル−ＴＨＦ−水（１０：２：８
８）を移動相として、流速１８ｍｌ／分で溶出する分取
ＨＰＬＣに付した。目的の化合物を含有する活性画分を
集めて、減圧下で濃縮乾固させた。乾燥させた物質を少
量の水に溶解し、流速１０ｍｌ／分で上記と同様の溶媒
系でＹＭＣ充填カラム（ODS-AM,SH-343-5AM, S-5, 250x
20mm （内径）) を用いた分取ＨＰＬＣで単離した。有
機溶媒を除去するために濃縮した後、その水溶液をＤｉ
ａｉｏｎＨＰ−２０（３０ｍｌ）に通した。カラムを
水で洗浄後、メタノールで溶出した。その溶出液（１２
０ｍｌ）を、蒸発乾固させ、エタノールで懸濁し、その
後乾燥し、純粋な粉末として６４．３ｍｇのＷＦ１４８
６５Ｂを得た。

【００５４】製造例１（２Ｒ，３Ｒ）−トランス−２，３−エポキシコハク酸
ジエチルエステル（Chem. Pharm. Bull, 35, 1098 (198
7)に従い合成）（１．２０ｇ）のエタノール溶液（５ｍ
ｌ）に、氷冷下水酸化カリウム（４２２ｍｇ）のエタノ
ール溶液（１１ｍｌ）を滴下した。同温で１．５時間攪
拌した後、溶媒を減圧下濃縮した。得られた残渣を５％
硫酸水素カリウム水溶液（１００ｍｌ）に溶解した後、
塩化ナトリウムを飽和するまで加え、酢酸エチル（１０
０ｍｌ×３）で抽出した。酢酸エチル溶液を飽和食塩水
で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧
下濃縮し、（２Ｒ，３Ｒ）−トランス−２，３−エポキ
シコハク酸エチルエステル（１．０２ｇ）を油状物とし
て得た。¹ H-NMR(300MHz, CDCl₃):δ 1.32 (t, 3H, J=7.2Hz),
3.72 (d, 1H, J=2.0Hz),3.73 (d, 1H, J=2.0Hz), 4.29
(q, 2H, J=7.2Hz).

【００５５】製造例２フタルイミドアセトアルデヒドジエチルアセタール（１
８．０ｇ）をトリフルオロ酢酸（２００ｍｌ）に溶解
し、室温で３０分間攪拌し、減圧下トリフルオロ酢酸を
濃縮した。得られたフタルイミドアセトアルデヒドをベ
ンゼン（３００ｍｌ）に溶解し、（トリフェニルフォス
フォラニリデン）−２−プロパノン（２１．８ｇ）を加
え、５．５時間加熱還流した。溶媒を減圧下濃縮後、得
られた残渣をシリカゲルカラムクロマト（ヘキサン：酢
酸エチル、３：１）により精製し、２−（４−オキソペ
ント−２−エニル）イソインドール−１，３−ジオン
（１０．２ｇ）を得た。参考文献：J. Org. Chem., 59,
7299 (1994) m.p. 84 - 85℃¹ H-NMR(300MHz, DMSO-d₆):δ 2.19 (s, 3H), 4.39 (d,
2H, J=4.6Hz), 6.04 (dt, 1H, J=1.3, 16.2Hz), 6.87
(dt, 1H, J=4.6, 16.2Hz), 7.82 - 7.92 (m, 4H) ESI-M
S [M + H]⁺: 230.

【００５６】製造例３２−（４−オキソペント−２−エニル）イソインドール
−１，３−ジオン（８．２０ｇ）とトリエチルアミン
（５．７３ｇ）を無水ベンゼン（２００ｍｌ）に溶解
し、窒素気流下室温で、トリメチルシリルトリフレート
（１０．０ｇ）を攪拌しながら加えた。同温度で終夜攪
拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍ
ｌ）を加え、エーテル（６００ｍｌ）で抽出した。水洗
後、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、溶媒を減圧下濃縮
し、得られた残渣をテトラヒドロフラン（２００ｍｌ）
に溶解した。この溶液に炭酸水素ナトリウム（４．７６
ｇ）とＮ−ブロモコハク酸イミド（７．３８ｇ）を室温
で加え、１時間攪拌した後、飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液（１００ｍｌ）を加え、エーテル（３００ｍｌ）で
抽出した。飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥後、溶媒を減圧下濃縮し、得られた残渣をシリカ
ゲルカラムクロマト（ヘキサン：酢酸エチル、４：１）
により精製し、エーテル−ヘキサンより結晶化し、２−
（５−ブロモ−４−オキソペント−２−エニル）イソイ
ンドール−１，３−ジオン（５．６２ｇ）を得た。参考
文献：J. Org. Chem., 59, 7299 (1994) m.p. 119 - 120℃¹ H-NMR(300MHz, DMSO-d₆):δ 4.39 - 4.44 (m, 4H),
6.28 (dt, 1H, J=1.3, 16.1Hz), 7.00 (dt, 1H, J=4.5,
J=16.1Hz), 7.83 - 7.95 (m, 4H) MS [M + H]⁺: 308.

【００５７】製造例４２−（５−ブロモ−４−オキソペント−２−エニル）イ
ソインドール−１，３−ジオン（３．００ｇ）のジメチ
ルホルムアミド溶液（４０ｍｌ）に窒素気流下室温で攪
拌しながらアセチルグアニジン（３．０７ｇ）を加え、
同温で９６時間攪拌した。溶媒を減圧下濃縮後、得られ
た残渣に水（３００ｍｌ）を加え析出する結晶を濾取
し、水洗、乾燥することによりＮ−〔５−〔３−（１，
３−ジオキソ−１，３−ジヒドロイソインドール−２−
イル）プロペニル〕−１Ｈ−イミダゾール−２−イル〕
アセトアミド（１．８５ｇ）を得た。参考文献：J. Or
g. Chem., 59, 7299 (1994) m.p. 237 - 240℃¹ H-NMR(300MHz, DMSO-d₆):δ 2.01 (s, 3H), 4.28 (d,
2H, J=5.8Hz), 6.06 (dt, 1H, J=5.8, 15.6Hz), 6.35
(d, 1H, J=15.6Hz), 6.78 (s, 1H), 7.80 - 7.91 (m, 4
H) ESI-MS [M + H]⁺: 311.

【００５８】製造例５Ｎ−〔５−〔３−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒド
ロイソインドール−２−イル）プロペニル〕−１Ｈ−イ
ミダゾール−２−イル〕アセトアミド（６３０ｍｇ）を
酢酸（４０ｍｌ）とメタノール（４０ｍｌ）に溶解し、
１０％パラジューム炭素（２００ｍｇ）を加え、３気圧
の水素雰囲気下で５時間接触還元を行った。触媒を濾去
後、溶媒を減圧下濃縮し、残渣を酢酸エチル（５０ｍ
ｌ）に溶解した。この溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水
溶液及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで
乾燥した。溶媒を減圧下濃縮後、エーテル−ヘキサンよ
り結晶化しＮ−〔５−〔３−（１，３−ジオキソ−１，
３−ジヒドロイソインドール−２−イル）プロパニル〕
−１Ｈ−イミダゾール−２−イル〕アセトアミド（５５
０ｍｇ）を得た。 m.p. 226 - 228℃¹ H-NMR(300MHz, DMSO-d₆):δ 1.80 - 1.91 (m, 2H),
2.39 - 2.50 (m, 2H), 3. 60 (t, 2H, J=7.0Hz), 6.44
(s, 1H), 7.78 - 7.91 (m, 4H) ESI-MS [M + H]⁺: 313.

【００５９】製造例６Ｎ−〔５−〔３−（１，３−ジオキソ−１，３−ジヒド
ロイソインドール−２−イル）プロパニル〕−１Ｈ−イ
ミダゾール−２−イル〕アセトアミド（６２０ｍｇ）の
エタノール溶液（３０ｍｌ）にヒドラジン一水和物（５
００ｍｌ）を加え、１時間加熱還流した。溶媒を減圧下
濃縮後、１Ｍ塩酸（２０ｍｌ）を加え、７０℃で３０分
間攪拌した。析出する不溶物を濾去後、溶媒を減圧下濃
縮し、残渣に６Ｎ塩酸（２０ｍｌ）を加え２４時間加熱
還流した。溶媒を減圧下濃縮することにより５−（３−
アミノプロパニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イルア
ミン二塩酸塩（４２４ｍｇ）を粉末として得た。¹ H-NMR(300MHz, DMSO-d₆):δ 1.79 - 1.90 (m, 2H),
2.46 - 2.58 (m, 2H), 2. 68 - 2.80 (m, 2H), 6.63
(s, 1H) ESI-MS [M + H]⁺: 141.

【００６０】製造例７５−（３−アミノプロパニル）−１Ｈ−イミダゾール−
２−イルアミン二塩酸塩（４２４ｍｇ）とトリエチルア
ミン（６０５ｍｇ）のジメチルホルムアミド溶液（２０
ｍｌ）に、室温でｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−イソロ
イシンＮ−ヒドロサクシイミドエステル（６５３ｍ
ｇ）を加えた。同温で終夜攪拌した後、溶媒を減圧下濃
縮し、残渣を酢酸エチル（６０ｍｌ）に溶解した。この
溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和食塩水で
洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、溶媒を減
圧下濃縮しエーテルより結晶化し、５−〔３−（ｔ−ブ
トキシカルボニル−Ｌ−イソロイシル）アミノプロパニ
ル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イルアミン（３４８ｍ
ｇ）を得た。 m.p. 145 - 147℃¹ H-NMR(300MHz, CDCl₃):δ 0.89 (t, 3H, J=7Hz), 0.9
2 (d, 3H, J=7Hz), 1.05 - 1.24 (m, 2H), 1.42 (s, 9
H), 1.45 - 1.68 (m, 1H), 1.69 - 1.92 (m, 2H), 2.39
- 2.55 (m, 2H), 3.08 - 3.31 (m, 2H), 3.96 - 4.05
(m, 1H), 6.29 (s, 1H) ESI-MS [M + H]⁺: 354.

【００６１】製造例８５−〔３−（ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−イソロイシ
ル）アミノプロパニル〕−１Ｈ−イミダゾール−２−イ
ルアミン（３００ｍｇ）のジオキサン溶液（１０ｍｌ）
に、室温で４Ｎ塩化水素のジオキサン溶液（１０ｍｌ）
を加えた。同温で３０分間攪拌した後、溶媒を減圧下濃
縮しエーテルより粉末化し、５−〔３−（Ｌ−イソロイ
シル）アミノプロパニル〕−１Ｈ−イミダゾール−２−
イルアミン二塩酸塩（４４９ｍｇ）を得、次の反応に全
量用いた。

【００６２】製造例９（２Ｒ，３Ｒ）−トランス−２，３−エポキシコハク酸
ジエチルエステル（１５０ｍｇ）、ペンタフルオロフェ
ノール（１７２ｍｇ）のジメチルホルムアミド溶液（５
ｍｌ）に、室温で１−エチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１７９ｍｇ）を加
えた。同温で３時間攪拌した後、この溶液に、氷冷下５
−〔３−（Ｌ−イソロイシル）アミノプロパニル）−１
Ｈ−イミダゾール−２−イルアミン二塩酸塩（４４９ｍ
ｇ）とＮ−メチルモルホリン（１７２ｍｇ）のジメチル
ホルムアミド溶液（１０ｍｌ）を加え、室温で終夜攪拌
した。溶媒を減圧下濃縮し、残渣を酢酸エチル（２０ｍ
ｌ）に溶解し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び飽和
食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。溶
媒を減圧下濃縮し得られた粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（１
０−３０％アセトニトリルの０．１％トリフルオロ酢酸
水溶液のリニアグラジエント（１５０分間））により精
製後、凍結乾燥し、５−〔３−〔Ｎ−〔〔（２Ｒ，３
Ｒ）−３−トランス−（エトキシカルボニル）オキシラ
ン−２−イル〕カルボニル〕−Ｌ−イソロイシル〕アミ
ノプロパニル〕−１Ｈ−イミダゾール−２−イルアミン
（１２５ｍｇ）を得た。¹ H-NMR(300MHz, C D₃OD):δ 0.92 (t, 3H, J=7Hz),
0.94 (d, 3H, J=7Hz), 1. 12 - 1.27 (m, 1H), 1.30
(t, 3H, J=7Hz), 1.48 - 1.62 (m, 1H), 1.72 - 1.92
(m, 3H), 2.51 (m, 2H), 3.15 - 3.33 (m, 2H), 3.58
(d, 1H, J=2Hz), 3.73(d, 1H, J=2Hz), 4.18 (d, 1H, J
=8Hz), 4.25 (q, 2H, J=7Hz), 6.52 (s, 1H) ESI-MS [M + H]⁺: 396, FAB-MS [M + H] ⁺: 396.

【００６３】製造例１０５−〔３−〔Ｎ−〔〔（２Ｒ，３Ｒ）−３−トランス−
（エトキシカルボニル）オキシラン−２−イル〕カルボ
ニル〕−Ｌ−イソロイシル〕アミノプロパニル〕−１Ｈ
−イミダゾール−２−イルアミン（８０．３ｍｇ）のエ
タノール溶液（２ｍｌ）に、氷冷下水酸化カリウム（２
０．５ｍｇ）のエタノール溶液（１ｍｌ）を加え、同温
で２時間攪拌した。溶媒を１ｍｌまで減圧下濃縮し、エ
ーテル（２０ｍｌ）を加え析出物を濾取した。得られた
粗生成物を逆相ＨＰＬＣ（２−３０％アセトニトリルの
０．１％トリフルオロ酢酸水溶液のリニアグラジエント
（１５０分間））により精製後、凍結乾燥し、５−〔３
−〔Ｎ−〔〔（２Ｒ，３Ｒ）−３−トランス−（オキシ
カルボニル）オキシラン−２−イル〕カルボニル〕−Ｌ
−イソロイシル〕アミノプロパニル〕−１Ｈ−イミダゾ
ール−２−イルアミン（７．５ｍｇ）を得た。¹ H-NMR(300MHz, C D₃OD):δ 0.92 (t, 3H, J=7Hz),
0.94 (d, 3H, J=7Hz), 1. 20 (m, 1H), 1.54 (m, 1H),
1.73 - 1.90 (m, 3H), 2.50 (m, 2H), 3.14 - 3.30(m,
2H), 3.51 (d, 1H, J=2Hz), 3.69 (d, 1H, J=2Hz), 4.1
6 (d, 1H, J=8Hz), 6.52 (s, 1H) FAB-MS [M + H]⁺ : 368 [α] _D ²³=+27°(c=0.24, C H₃OH) IR (ν_max, KBr) 3280, 2970, 1680, 1640, 1560, 144
0, 1390, 1200, 1140 cm ^-1.

【００６４】

【発明の効果】ＷＦ１４８６５ＡおよびＷＦ１４８６５
Ｂは、カテプシンＢおよび／またはＬ活性に対する強い
阻害活性を有し、哺乳動物に対して経口または非経口投
与により、カテプシンＢおよび／またはＬ活性亢進に起
因する種々の疾病を治療および予防することに有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】臭化カリウム法で測定したＷＦ１４８６５Ａの
赤外線吸収スペクトルの図である。

【図２】ＷＦ１４８６５Ａの¹Ｈ−ＮＭＲ（核磁気共
鳴）スペクトルの図である。

【図３】ＷＦ１４８６５Ａの¹³Ｃ−ＮＭＲ（核磁気共
鳴）スペクトルの図である。

【図４】臭化カリウム法で測定したＷＦ１４８６５Ｂの
赤外線吸収スペクトルの図である。

【図５】ＷＦ１４８６５Ｂの¹Ｈ−ＮＭＲ（核磁気共
鳴）スペクトルの図である。

【図６】ＷＦ１４８６５Ｂの¹³Ｃ−ＮＭＲ（核磁気共
鳴）スペクトルの図である。

【図７】新規化合物ＷＦ１４８６５Ａを合成する際の反
応経路図である。

【図８】新規化合物ＷＦ１４８６５Ａを合成する際の反
応経路図である。

【図９】新規化合物ＷＦ１４８６５Ａを合成する際の反
応経路図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 17/16 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者清遠純夫茨城県土浦市永国東町1132−１ (72)発明者閨正博茨城県土浦市常名4016−25 (72)発明者逸見恵次茨城県つくば市下広岡668−37

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の性質（Ａ）または（Ｂ）を有する化
合物、ＷＦ１４８６５。・性質（Ａ）；ａ）外観：無色粉末ｂ）分子式：Ｃ₁₆Ｈ₂₅Ｎ₅Ｏ₅ ｃ）ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ３６８（Ｍ＋Ｈ）ＨＲＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ測定値：３６８．１９２
４理論値Ｃ₁₆Ｈ₂₅Ｎ₅Ｏ₅＋Ｈ：３６８．１９３４ｄ）赤外線吸収スペクトル：図１に示す 3290, 2970, 1680, 1640, 1560, 1460, 1430, 1390, 12
00, 1140 900, 800ｃｍ^-1 ｅ）溶解性：可溶：メタノール、水難溶：アセトン不溶：クロロホルムｆ）呈色反応陽性：ニンヒドリン反応塩化第二鉄反応硫酸セリウム反応ヨウ素蒸気との反応陰性：エールリッヒ反応モーリッシュ反応ジアセチル反応ｇ）¹H-NMR スペクトル（４００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）
(図２に示す） δ ppm : 6.52 (1H, s),4.17 (1H, d, J=8Hz),3.69 (1
H, d, J=2Hz),3.51 (1H, d, J=2Hz),3.27 (1H, m),3.22
(1H, m),2.50 (2H, m),1.90 - 1.73 (3H, m),1.54 (1
H, m),1.20 (1H, m),0.94 (3H, d, J=7Hz),0.92 (3H,
t, J=7Hz) ｈ）¹³C-NMR スペクトル（１００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）
（図３に示す） δ ppm : 173.4 (s),170.6 (s),168.7 (s),148.6 (s),1
28.3 (s),110.0 (d),59.7 (d),54.2 (d),53.3 (d),39.3
(t),37.8 (d),29.0 (t),26.1 (t),22.6 (t),15.9 (q),
11.3 (q) ｉ）比旋光度：〔α〕_D ²⁵＝＋３０．０゜（ｃ＝１．０，ＣＨ₃ＯＨ）ｊ）アミノ酸分析：イソロイシン・性質（Ｂ）；ａ）外観：白色粉末ｂ）分子式：Ｃ₁₆Ｈ₂₅Ｎ₅Ｏ₅ ｃ）ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ３６８（Ｍ＋Ｈ）ＨＲＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ測定値：３６８．１９２
４理論値Ｃ₁₆Ｈ₂₅Ｎ₅Ｏ₅＋Ｈ：３６８．１９３４ｄ）赤外線吸収スペクトル：図４に示す 3300, 2960, 1680, 1650, 1620, 1550, 1470, 1440, 13
80, 1250 1130, 900 ｃｍ^-1 ｅ）溶解性：可溶：メタノール、水難溶：アセトン不溶：クロロホルムｆ）呈色反応陽性：ニンヒドリン反応硫酸セリウム反応塩化第二鉄−フェリシアン化カリウム反応ヨウ素蒸気との反応エールリッヒ反応陰性：塩化第二鉄反応モーリッシュ反応ｇ）¹H-NMR スペクトル（３００ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）
(図５に示す） δ ppm : 6.50 (1H, s),4.36 (1H, dd, J=9Hz, J=6Hz),
3.53 (1H, d, J=2Hz),3.36 (1H, d, J=2Hz),3.30-3.14
(2H, m),2.49 (2H, m),1.78 (2H, m),1.70-1.54 (3H,
m),0.97 (3H, d, J=6Hz),0.92 (3H, d, J=6Hz) ｈ）¹³C-NMR スペクトル（７５ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）
（図６に示す） δ ppm : 174.6 (s),174.0 (s),170.2 (s),148.7 (s),1
28.4 (s),109.9 (d),55.6 (d),54.1 (d),53.6 (d),41.7
(t),39.3 (t),29.0 (t),26.0 (d),23.4 (q),22.6 (t),
21.9 (q) ｉ）比旋光度：〔α〕_D ²³＝＋３５゜（ｃ＝０．７，ＣＨ₃ＯＨ）ｊ）アミノ酸分析：ロイシン
【請求項２】栄養培地でアニキシオプシス属に属する
ＷＦ１４８６５生産菌を培養し、得られた培養物からＷ
Ｆ１４８６５を採取することを特徴とする請求項１記載
の化合物ＷＦ１４８６５の製造法。
【請求項３】有効成分として請求項１記載のＷＦ１４
８６５、および医薬上許容される担体を含有する医薬組
成物。
【請求項４】カテプシンＢおよび／またはＬ活性亢進
に起因する疾病の治療および／または予防するための薬
剤である請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】請求項１記載のＷＦ１４８６５またはそ
の塩を含有するカテプシンＢおよび／またはＬ阻害剤。
【請求項６】アニキシオプシスステルコラリアＮ
ｏ．１４８６５の生物学的に純粋な培養物。