JPH0788395B2 - タンパク質の精製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 背景 イオン交換クロマトグラフィーは通常のクロマトグラフ
技法であり、本来穏やかな技法であって、低コストであ
り、容量が大きく、しかも簡単に評価できる技術であ
る。しかしながら、現在のところ、この技法はタンパク
質（特に、rDNAタンパク質）からこれと密接に関連した
不純物を分離するための有用な技法であるとは言えな
い。

前記rDNAタンパク質の例はヒト組換えGM−CSFである。
血液中の顆粒球とマクロファージの生長および発生を促
進する因子であるGM−CSFの相補DNA（cDNA）は、最近に
なって、多くの研究室によってクローン化され、その塩
基配列が決定された。さらに、非組換えGM−CSFは（米
国特許第4438032号に記載される）Mo細胞系列の培養上
清から精製され、Ｎ末端からの最初の16個のアミノ酸が
決定された（Gasson et al.,Science,vol.226,1339−13
42（1984）を参照されたい）。多くのヒトGM−CSFの中
に、ヌクレオチド配列とアミノ酸配列の不均質性が観察
された。例えば、アミノ酸レベルでは、Ｎ末端アラニン
に対して100位にトレオニンとイソロイシンの両方が観
察されており、このことはGM−CSFの数種類の対立遺伝
子形態（すなわち、多形）がヒト集団内に存在しうるこ
とを示唆している。

現在、GM−CSFのcDNAのような、cDNAの新たな作製およ
びクローニング、並びにcDNAライブラリーの構築には、
いろいろな方法が利用されている。一例として、所望の
活性を示すポリペプチドを生産する細胞（例えば、非形
質転換ヒトＴ細胞源）から全mRNAが抽出される。この全
mRNAから、プライマー開始逆転写を用いて、初めに各mR
NA配列の相補体をつくり、次に第二鎖の合成を開始させ
ることにより、二本鎖cDNAが作製される。続いて、この
cDNAは、相補的なホモポリマー尾部を介して、あるいは
適当な制限部位を含んだリンカーセグメントにより作ら
れた付着末端を介して、それらを適切なプラスミドまた
はバクテリオファージベクターに結合させ、その後適当
な宿主を形質転換することによって、クローニングされ
る。本発明方法により精製されるタンパク質を生産させ
るためには、広範囲の発現系（すなわち、宿主−発現ベ
クターの組み合わせ）を使用することができる。利用可
能な宿主細胞の種類には、限定するものではないが、細
菌、酵母、昆虫、哺乳動物などの細胞が含まれる。

宿主細胞からGM−CSFを抽出し次いでそれを精製するた
めの方法がいろいろ開示されているが、GM−CSFは必ず
しもよい収量でかつ生物学的活性を保持した状態で適切
に精製されるとは限らない。

発明の要約 本発明は、粗製タンパク質を比較的純粋なタンパク質画
分と不純なタンパク質画分とに分離する方法を提供し、
その方法は純粋なタンパク質と不純物とが反対の電荷を
もつようなpHで粗製タンパク質をイオン交換樹脂に接触
させ、これにより前記画分の一方をイオン交換樹脂に選
択的に結合させることを特徴としている。イオン交換樹
脂は好ましくは強イオン交換樹脂であり、純粋なタンパ
ク質画分をイオン交換樹脂に結合させることが好まし
い。そして、イオン交換樹脂に結合された画分が好まし
くは溶離される。

粗製タンパク質のpHは、好ましくは、前記画分間に増幅
された実効電荷数の差が存在するような、分離すべきタ
ンパク質画分の等電点の範囲内のpHに調節される。

また、本発明は、粗製タンパク質を比較的純粋なタンパ
ク質画分と不純なタンパク質画分とに分離するためのpH
を決定する方法を提供し、その方法は回収すべき純粋な
タンパク質と除去すべき不純物の等電点を測定し、純粋
なタンパク質と不純物とが反対の電荷をもちかつ前記電
荷数間に増幅された差が存在するような等電点の範囲内
のpHを決定することを特徴としている。タンパク質画分
の等電点は、好ましくはコンピュータシミュレーション
により、または等電点電気泳動ゲルを使用することによ
り決定される。

前記方法はrDNAタンパク質、特に顆粒球・マクロファー
ジコロニー形成刺激因子（GM−CSF）の精製に有用であ
り、より詳細には、GM−CSFをΔ4GM−CSFから分離する
ことによるGM−CSFの精製に有用である。

特に好適な方法では、タンパク質は順次以下の物質： A.好ましくは架橋デキストラン、セルロース、アガロー
ス、またはアクリル樹脂担体に結合された、第四アミン
樹脂のような陰イオン交換樹脂； B.架橋デキストラン、セルロース、アガロース、または
アクリル樹脂担体に結合されたスルホネート官能基をも
つ陽イオン交換樹脂；および C.好ましくは約5,000〜約100,000ダルトンのタンパク質
分画化範囲をもつ、ゲル濾過手段 と接触させることにより精製される。

詳細な説明 本発明は、粗製タンパク質、特に粗製rDNAタンパク質を
精製するための、高分離能のイオン交換クロマトグラフ
ィー分離技法に関する。この技法では、回収しようとす
る純粋なタンパク質と除去しようとする不純物の等電点
付近でクロマトグラフィーが実施され、好ましくは純粋
なタンパク質と不純物の電荷数間に増幅された（例え
ば、最大の）差が存在しかつこれらの分子が相反して荷
電される（分極される）ようなpHで実施される。この増
幅された実効電荷数の差（等電点付近でのみ起こる）
は、電荷がほとんど存在しない状態でイオン交換樹脂へ
の選択的結合をもたらす適当なイオン交換クロマトグラ
フィー条件を選択するために使用することができる。便
宜上、この技法は以後デルタ等電点（Delta Isoelectri
c Point:DIP）クロマトグラフィーと呼ぶことにする。

目的のrDNAタンパク質に密接に関連したrDNA不純物は、
ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、逆相高性
能液体クロマトグラフィー、金属キレート化アフィニテ
ィークロマトグラフィー、および他の常用されるクロマ
トグラフィーによって粗製タンパク質から分離すること
が困難である。通常、これらの密接に関連した不純物は
対象のタンパク質産物に近似した分子量および電荷分布
をもつタンパク質であり、一般に１個（またはそれ以
上）の電荷アミノ酸を欠いている。これらの不純物の例
は、タンパク質加水分解やクロマトグラフィー相互作用
を受けやすいペプチド末端にニックが、導入されること
により形成されたタンパク質加水分解産物である。この
種の不純物は通常のイオン交換クロマトグラフィーでは
分離できないと考えられる。

DIPクロマトグラフィー技法は通常のイオン交換クロマ
トグラフィーといろいろな点で異っている。DIPは分離
しようとするタンパク質が極めて小さい実効電荷をもつ
ようなpHで行われる。これは目的タンパク質およびそれ
に密接に関連した不純物の等電点（pI）からわずかな分
数のpH単位だけ離れたpHでイオン交換樹脂に負荷するこ
とにより達成される。このことは対象のタンパク質が強
い電荷をもつpHで実施される通常のイオン交換クロマト
グラフィーと対照的であり、通常のイオン交換クロマト
グラフィーでは、DIPクロマトグラフィーより大きく、p
Iから約１−２の整数のpH単位離れたpHで負荷が行われ
る。

DIPを行うためのpHは、荷電密度対タンパク質および関
連不純物のpHのコンピュータシミュレーションにより、
あるいは等電点電気泳動ゲルの使用のような分析技術に
より予測される。通常のイオン交換クロマトグラフィー
では、負荷pHが目的タンパク質の全体の実効電荷を求め
ることにより決定され、そして負荷条件は最適化される
にしても経験的に最適化される。溶離条件を決定するた
めには、退屈な試行錯誤の実験作業を必要とする。

目的タンパク質に対して不純物を分極する試みが全くな
されない通常のイオン交換クロマトグラフィーと違っ
て、DIPクロマトグラフィーでは、負荷pHが密接に関連
した不純物のpIと目的タンパク質のpIとの間にあるよう
に選ばれ、従って、目的タンパク質は分極された不純物
と反対の電荷を獲得する。

DIPクロマトグラフィーにおいては、負荷の間のタンパ
ク質−タンパク質相互作用を低減させるために、高イオ
ン強度の環境が課せられ、そして強イオン交換体が用い
られる。通常のイオン交換技法では、最大の分離能を得
るために、より低いイオン強度の負荷条件と共に弱イオ
ン交換樹脂を使用することが適している。DIPクロマト
グラフィーにおいて、負荷の間のタンパク質−タンパク
質相互作用を低く抑えると、高度に選択的な結合並びに
極めて分離が負荷の間に得られ、そして通常の勾配溶離
の間に更なる分離が得られる。通常のイオン交換クロマ
トグラフィーでは、負荷の間に非選択的な結合が起こ
り、それ故に負荷中には大まかな分離が達成されるにす
ぎない；分離はもっぱら、固体マトリックスに高度に局
所的に結合されたタンパク質の密集状態から生じる強い
タンパク質−タンパク質相互作用のもとで、溶離の間に
得られる。

荷電密度対pHのコンピュータシミュレーションは、市販
のソフトウェアおよび適当なコンピュータ（例．大型メ
インフレームコンピュータ、マイクロコンピュータ、パ
ーソナルコンピュータ）を使って行われる。例えば、VA
Xコンピュータ（Digital Corp.）は“ポリペプチド分析
システム”（Intellegentics,Inc.,1981,1982,1983,198
4および1986年に版権を得る）のようなソフトウェアパ
ッケージと共に使用することができる。このソフトウェ
アを使うことにより、一次アミノ酸配列がインプットさ
れ、異なるpHでの荷電密度分布を得ることができる。別
の方法として、当分野でよく知られた方法による等電点
電気泳動（IEF）ゲルを使って、pIを測定することがで
きる。

DIPクロマトグラフィーは、タンパク質が変性を受けな
いpH範囲に等電点を有するタンパク質、特に組換えタン
パク質に適用される。多くのタンパク質の等電点は知ら
れている。例えば、J.Chrom.,220（1981）,p.115−194
（Chromatography Reviews）中のRighettiらによる“タ
ンパク質の等電点および分子量−新しい表”に掲載され
る広範な記録を参照されたい。DIPクロマトグラフィー
に適する等電点アロトロピズムを示す治療上重要なタン
パク質の例は、GM−CSF、白血球およびリンパ芽球イン
ターフェロン、成長ホルモン、スーパーオキシドジスム
ターゼ、およびエリトロポエチンである。その他のタン
パク質にはアンチトロンビンIII、ラクトーゲン、プラ
スミノーゲン、プロラクチン、ウロキナーゼ、およびビ
タミンB₁₂−結合タンパク質が含まれる。

DIPクロマトグラフィーの適用例は以下のヒト組換えGM
−CSFの精製方法である。GM−CSF精製の特に困難な面
は、デルタ４（Δ４）として知られる、４個のＮ末端ア
ミノ酸を欠くGM−CSFの分解産物の除去である。GM−CSF
は一般に第四アミノエチルカラムによる陰イオン交換、
ゲル濾過および逆相クロマトグラフィーの組み合わせに
より精製されるが、この方法はΔ４不純物を除去するの
に効果的でない。

しかしながら、DIPクロマトグラフィーはΔ４不純物を
除くことに成功した。最初に、完全なGM−CSFタンパク
質のコンピュータシミュレーションが、Δ４不純物のコ
ンピュータシミュレーションと比較され、GM−CSFのpI
が5.24であり、Δ４不純物のpIが4.98であると判明し
た。次に、この範囲内の使用pHを決定しなければならな
かった。この使用pHにおいて、（ａ）GM−CSFはΔ４不
純物と反対の電荷を獲得し、かつ（ｂ）これらの電荷数
の差の相対的な大きさが分離を可能にする程度に増幅さ
れる。完全なGM−CSFとΔ不純物との間には、１電荷／
分子（1ch/mol）のわずかな電荷数差が広いpH範囲にわ
たって存在する（すなわち、pH0.5では、それぞれの電
荷は＋16および＋15であり、pH11.5では、それぞれの電
荷は−11.1および−12である）。しかしながら、コンピ
ュータ模擬実験により予測されたように、pH5付近にお
いて、完全なGM−CSFとΔ４不純物との電荷数の差は増
幅され（すなわち、相対的電荷数差が増加され）かつ分
子が分極される：すなわち、pH5において、GM−CSFは＋
0.9ch/molを有するが、Δ４不純物はたったの−0.1ch/m
olをもつにすぎない。こうして、DIPに必要な２つの条
件（荷電分極および増幅）が満たされる。

残存する大腸菌宿主細胞の低pI不純物およびタンパク質
加水分解不安定化因子からの完全なGM−CSFの分離をさ
らに高めるために、負荷の間に高イオン強度が用いられ
た。これは分子間の静電相互作用を少なくする。それ故
に、これらの高イオン強度条件下で、pH5にて強陽イオ
ン交換体、例えば架橋デキストラン、セルロース、アガ
ロース、またはアクリル樹脂担体にスルホネート官能基
が結合されているカラム（例.S−Sepharose,Pharmacia,
Inc.製,Piscataway,NJ）を使用することが好適である。

このような腸イオン交換樹脂カラムを使用すると、望ま
しくないΔ４不純物、種々の低pI不純物、20K大腸菌不
純物（他の方法で以前に除去されなかった）、およびタ
ンパク質加水分解因子の一段階除去が達成され、これに
より最終産物が安定化されることが分かった。腸イオン
交換クロマトグラフィーを行うことにより、GM−CSFの
純度は約50％から約90％に上昇し、そのときの収率は70
−80％である。これに続いてゲル濾過段階を行う場合に
は、GM−CSFの純度は約99％に高められる。

以下はGM−CSFの分離・精製方法の一般的な説明であ
る。陰イオン交換クロマトグラフィー（好ましくは、第
四アミノエチルカラムを使用）はGM−CSFの通常の精製
段階であり、宿主細胞死滅後の上清から高pI不純物を除
くために行われる。やはり慣用されるゲル濾過段階は高
および低分子量不純物を除くために行われる。以下の記
載は精製されたタンパク質画分を強イオン交換樹脂に結
合させる方法に関するものであるが、本発明のいくつか
の実施態様では、不純なタンパク質画分を強イオン交換
樹脂に結合させることもできるだろう。同様に、以下の
記載および実施例は粗製タンパク質をイオン交換樹脂カ
ラムを通して連続通過させることに関するが、バッチ接
触のような他の接触方法も使用できるだろう。

一般的解説：操作は特に指定しない限り２−15℃で行
う。タンパク質濃度はクーマシーブルー結合検定により
各段階で測定する。クロマトグラフィーで期待された精
製度が得られない場合は、溶出画分を同一カラムで再度
クロマトグラフィーにかけることができ、また別の方法
として、前段階または先の一連の段階を通して再循環さ
せることもできる。この再処理は１つのバッチまたは複
数のバッチのプールからの溶出された副画分に対して実
施してもよい。どの段階においても、濃縮は硫安沈澱、
等電点沈澱および／または限外濾過により行われる。緩
衝溶液は脱イオン水（DI）、逆浸透水（RO）、または注
射用の水（WFI）を用いて調製される。

段階I:第四アミンカラムによるクロマトグラフィー GM−CSFの粗製抽出物のpHは、1Mビス−トリス（ビス
［２−ヒドロキシエチル］イミノ−トリス−［ヒドロキ
シメチル］メタン）のような緩衝液および／または4N H
Clで５−7.5に調節する。次に、この溶液を遠心および
／または濾過により澄明化する。水で希釈するか、また
は4N NaClのような塩溶液を添加して、この溶液の導電
率を10ミリジーメンス／センチメートル（mS/cm）以下
に調整する。第四アミンカラム（すなわち、架橋デキス
トラン、セルロース、アガロース、またはアクリル樹脂
担体に第四アミン官能基が結合しているカラム、例えば
Pharmacia,Inc.製のＱ−Sepharose）に50gタンパク質／
ゲルを越えない負荷量でバッチを装填する。溶離は20
mMビス−トリスのような緩衝液中の０−0.4M NaClまた
は他の適当な塩の勾配を用いて行う。適当な画分は合わ
せて後続の処理に供する。

段階II:スルホネートカラムによるクロマトグラフィー 合わせた画分は酸（例.1M酢酸、4N HCl）または塩基
（例.6N NaOH）を用いて、DIPクロマトグラフィーで分
離されるタンパク質画分の等電点の範囲内であるpH5に
調節する。NaOHでpH5に調節した0.01M酢酸のような緩衝
液を加えて、導電率を13mS/cmに調整する。この溶液は
0.2ミクロンフィルターを通して濾過し、スルホネート
カラム（すなわち、架橋デキストラン、セルロース、ア
ガロース、またはアクリル樹脂担体にスルホネート官能
基が結合しているカラム、例えばＳ−Sepharose）に20g
タンパク質／カラム材料を越えない負荷量で装填す
る。溶離は緩衝液（例.20mM酢酸、0.13M Na^cl、pH5.0緩
衝液）中に0.5Mまでの濃度勾配の塩（例.NaCl）を含む
溶液を用いて行う。適当な画分を合わせて後続の処理に
供する。このクロマトグラフィー段階は通常繰り返して
行う。

段階III:硫安沈澱 合わせたＳ−Sepharose画分に硫安を加えて50％〜60％
飽和の最終濃度とする。沈澱物を遠心により集める。沈
澱物は冷蔵保存することができる。

段階IV:ゲル濾過クロマトグラフィー 硫安沈澱物を0.35Mまでの塩（例．塩化ナトリウム）を
含む緩衝液（例.10mMリン酸ナトリウム、50mMクエン
酸、pH6緩衝液）に溶解する。この溶液を遠心し、0.2ミ
クロン範囲のフィルターを通して濾過し、その後同一緩
衝液で予め平衡化しておいた、約5,000〜約100,000ダル
トンのタンパウ質分画化範囲をもつゲル濾過カラム
（例.Sephacryl S−200HR,Pharmacia,Inc.製）に装填す
る。負荷量は3.5gタンパク質／ゲルを越えない。この
カラムを同一緩衝液で溶離し、適当な画分を合わせる。
画分は10mMリン酸塩、2mMクエン酸、pH7.2緩衝液のよう
な緩衝液に対して透析する。これとは別に、段階IVの全
体をこの後者の緩衝液により実施することができる。

段階V:精製されたバルクGM−CSF 合わせた画分は細孔寸法が0.2ミクロンまたはそれ以下
のウィルターを通して濾過し、−20℃以下で保存する。

代表的なIEFゲル電気泳動法は以下の文献に記載されて
いる： 1.電気泳動技術,Academic Press,（1983） Ed.:G.F.Simpson ＆ M.Whittaker “等電点電気泳動の最近の動向"J.S.Fawcett,p.57 2.通電点電気泳動：理論、方法論および応用， P.G.Righetti,Elsevier Biomedical Pres,（1983）p.14
8 3.pH4−６の範囲内での等電点電気泳動分離の適用， P.Gill,Electrophoresis ６:282（1985） 4.ポリアクリルアミドゲルによる超薄層等電点電気泳動
におけるタンパク質の迅速染色， M.D.Frey,Electrophoresis ３:27−32（1982） 5.セキレイの肝臓試料における酵素の超薄層等電点電気
泳動， M.Germeiner,Electrophoresis ３:146（1982） 以下の実施例はDIP技法に基づいたGM−CSFの精製方法を
例示するものである。

実施例１ GM−CSFの精製 段階1:第四アミンカラムクロマトグラフィー 180の粗製GM−CSF抽出物のpHを1Mビス−トリス緩衝液
（pH6.0）3.6および4N HCl 2.0でpH6.0に調節し
た。この溶液はSharples遠心機を使って0.75／分の供
給量で遠心することにより澄明化した。上清を冷脱イオ
ン水で約1.55倍に希釈して最終導電率を5.5mS/cmとし
た。12のＱ−Sepharoseカラムを10倍カラム容量の20m
Mビス−トリス緩衝液（pH6.0）で平衡化し、43.6の抽
出物を20mgタンパク質/ml樹脂の負荷量でこのカラムに
装填した。カラム（直径25cm）は120の平衡緩衝液を
用いて250ml/分の流量で洗った。0.03M NaClを含む20mM
ビス−トリス緩衝液（pH6.0）78と0.32M NaClを含む2
0mMビス−トリス緩衝液（pH6.0）78との間に線状勾配
を確立した。ゲル電気泳動（SDS−PAGE）に基づいて画
分（各々1.2）を合わせ、プールしたタンパク質（4.9
）を段階２でクロマトグラフィーにかけた。

段階2:スルホネートカラムクロマトグラフィー 段階１からの合わせた画分（4.9）は1M酢酸（pH5.0）
49mlでpH5に調節し、NaOHでpH5に調節した0.01M酢酸２
を用いて導電率を15mS/cmに調整した。この溶液は0.2
ミクロンフィルターを通して濾過し、その後0.13M NaCl
を含む20mM酢酸（pH5）で予め平衡化しておいた0.8の
Ｓ−Sepharoseカラムに4.7mg/mlカラム材料の負荷量で
装填した。このカラムは2.4の平衡緩衝液で洗い、そ
の後0.13M NaClを含む20mM酢酸（pH5）5.6と0.5M NaC
lを含む20mM酢酸（pH5）5.6との間に確立した線状勾
配で溶離した。ゲル電気泳動に基づいて画分を合わせ
た。このクロマトグラフィー段階は繰り返して行った。

段階3:硫安沈澱 段階２からの合わせた画分（240）に硫安を加えて351
g/（55％飽和）の濃度とした。この溶液は混合せずに
４℃で２時間放置し、その後4500rpm,4℃で30分間遠心
して沈澱物を得た。

段階4:ゲル濾過クロマトグラフィー 硫安沈澱物を18mMリン酸ナトリウム、2mMクエン酸、pH
7.2緩衝液36mlに溶解した。この溶液を4500rpmで30分間
遠心し、上清を0.2ミクロンフィルターを通して濾過し
た。瀘液はリン酸塩−クエン酸pH7.2緩衝液で予め平衡
化しておいた1.8のSephacryl S−200HRカラムに0.21m
g/mlゲルの負荷量で装填した。このカラムを同じpH7.2
緩衝液1.9で溶離した。タンパク質検定に基づいて画
分を合わせた。

段階5:濾過 段階４からの合わせた画分は0.2ミクロンフィルターを
通して濾過し、−20℃で保存した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 タン，ジョン・チュウ‐タイ アメリカ合衆国ニュージャージー州07039, リビングストン，キャメロット・ドライブ 19 (56)参考文献 特開 昭61−78799（ＪＰ，Ａ) 特開 昭52−57200（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−120058（ＪＰ，Ａ) 日本生化学会編「生化学講座１ タンパ ク質の化学Ｉ−分離・精製−」東京化学同 人（1976年３月22日発行）111〜133頁

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】粗製タンパク質混合物を所望のタンパク質
   を含む第１タンパク質画分と、所望のタンパク質と構造
   的に密接に関連する１または２以上の望ましくないタン
   パク質を含む第２タンパク質画分とに分離する方法であ
   って、 （ａ） 粗製タンパク質混合物中のタンパク質の等電点
   を決定し； （ｂ） 粗製タンパク質混合物のpHを所望のタンパク質
   の等電点と望ましくないタンパク質の等電点との間の値
   に調整し；そして （ｃ） 前記pHにおいて粗製タンパク質混合物を強イオ
   ン交換樹脂と接触させる； の各工程を含み、これにより第１タンパク質画分中のタ
   ンパク質と第２タンパク質画分中のタンパク質が反対に
   荷電して、前記タンパク質画分のうちの一方のみがイオ
   ン交換樹脂に結合することを特徴とする方法。
2. 【請求項２】所望のタンパク質が組換えタンパク質であ
   る、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】所望のタンパク質がGM−CSFである、請求
   項２記載の方法。
4. 【請求項４】所望のタンパク質を、粗製タンパク質混合
   物中の、所望のタンパク質と構造的に密接に関連する不
   純物から分離する方法であって、 （ａ） 所望のタンパク質および不純物の等電点をコン
   ピュータシミュレーションまたは等電点電気泳動ゲルに
   より決定し； （ｂ） 粗製タンパク質混合物のpHを所望のタンパク質
   の等電点と不純物の等電点との間に調整し；そして （ｃ） 前記pHにおいて粗製タンパク質混合物を強イオ
   ン交換樹脂と接触させる； の各工程を含み、これにより所望のタンパク質と不純物
   が反対に荷電して、一方のみがイオン交換樹脂に結合す
   ることを特徴とする方法。
5. 【請求項５】所望のタンパク質がGM−CSFであり、不純
   物がΔ４不純物である、請求項４記載の方法。