JPH0787787B2 - 温度感受性細菌の産生法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は遺伝子工学の分野、さら
に詳しくは、遺伝子工学的に操作された微生物によって
産生される生産物の外在化法に有用な温度感受性細菌の
産生法に関する。

【０００２】

【従来の技術および課題】イー・コリ（Ｅ.coli）およ
び他の原核性微生物を、所望の蛋白質の表現用宿主とし
て使用する際に伴なう１つの問題として、しばしば、精
製のために該宿主細胞から蛋白質を外在化させることが
挙げられている。この問題を解消するための試みには、
均質化または超音波処理のような細胞もしくは菌体の物
理的破壊、洗浄剤またはリゾチームによる処理のような
細胞もしくは菌体の化学的破壊および排泄シグナルペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を、所望の生産物をコード
する構造遺伝子へ融合させることが包含される。例え
ば、ヨーロッパ特許出願第６１２５０号（Ｗeissman e
t al．）は宿主細胞の溶解剤または滲透剤による処理
を開示しており、米国特許第４３３６３３６号（Ｓilha
vy et al．）は、得られるハイブリッド蛋白が宿主細
胞表面近く、またはそれを越えて輸送されるように細胞
質蛋白用の遺伝子を非細胞質蛋白用の遺伝子に融合させ
る方法を開示し、また、米国特許第４３３８３９７号
（Ｇilbert et al．）はプレ蛋白質用の構造遺伝子を
表現ベクターに挿入することからなる成熟分泌蛋白質の
製法を開示している。

【０００３】イー・コリは二本鎖ＤＮＡウイルスである
偏性寄生体のラムダ・ファージによって感染される。イ
ー・コリ遺伝学同様、ラムダ遺伝学はよく研究されてい
る（例えば、“Ｔhe Ｂacteriophage Ｌambda",edi
t．Ａ．Ｄ．Ｈershey,ＣoldＳpring Ｈarbor Ｌabora
tory,Ｎew Ｙork,１９７１参照）。ラムダはテンペレ
ート・ファージで、イー・コリ中で、２相のうちの１つ
の相で増殖する。１つの相、溶菌相において、ファージ
ＤＮＡは自律的に複製し、キャンプシド蛋白質の形成、
包装および宿主細胞の溶解を指令する。溶菌相の間のラ
ムダＤＮＡの表現は非常に効率的である。転写は両方の
ＤＮＡ鎖上で、また、１本の鎖上で右側方向へ向って、
およびもう１本の鎖上で左側方向へ向って起る。誘発は
３７℃で５０分間に約１００個のファージ粒子の放出を
もたらすことができる（前記Ｈershey参照）。もう１つ
の相、溶原相において、ラムダＤＮＡは宿主細胞ゲノム
に組込まれ、宿主複製酵素により、宿主染色体ＤＮＡと
共に受動的に複製される。溶原相におけるファージはプ
ロファージとして知られ、宿主は溶原菌として知られ、
免疫性であるといわれる。

【０００４】免疫性は溶菌相を誘発する種々の事象の発
生により失なわれうる。ラムダintおよびxis遺伝子の生
産物はイー・コリゲノムからのラムダゲノム除去の触媒
作用をし、自律複製できる共有的に閉じた環を形成す
る。これらの遺伝子および、直接的または間接的に、全
ての他のラムダ遺伝子の合成はラムダｃＩ遺伝子の生産
物により抑制される。ある種の化学薬品またはＤＮＡ損
傷剤に応答して、細菌は細菌性recＡ遺伝子の生産物の
合成を指令する。該recＡ遺伝子生産物は蛋白加水分解
的にｃＩレプレッサー蛋白質を開裂し、溶菌相遺伝子の
表現を可能にさせる。ついで、ファージの増殖は、最終
的にラムダＤＮＡの自律複製を開始させるいくつかのラ
ムダ調節因子の相互作用を必要とする。ラムダＰおよび
Ｏ遺伝子の生産物がＤＮＡ複製に必要とされる。ＤＮＡ
複製についで、ファージはウイルス構造蛋白質、すなわ
ち、頭部および尾部蛋白質の合成および無垢な中空ウイ
ルス粒子中でのそれらの組立を指令しなければならな
い。これを完了するには少なくとも１８個の遺伝子の相
互作用を必要とする。最後に、該ＤＮＡが中空ウイルス
粒子中に包装されて感染性無垢ウイルス粒子が形成さ
れ、菌体は、Ｑ遺伝子の生産物によって活性化されるラ
ムダＳおよびＲ遺伝子によってコードされた細胞内溶解
素によって破壊され、それにより、ファージが放出す
る。Ｑ遺伝子はＮ機能によって活性化される。Ｎ遺伝子
はｃＩ機能によって抑制される。

【０００５】キャプシド組立に必要な該１８個の遺伝子
は遺伝地図の右側転写鎖の約３位および３６位の間（遺
伝地図上の位置は総ラムダＤＮＡのパーセンテイジで表
わしている）に存在する。左から右へ、第１の遺伝子は
Ａ、ＷおよびＢで、最後はＪである。正常な溶原菌で
は、Ｊ遺伝子の右側に８個の細菌遺伝子がある。そのう
ちの５個、bioＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦがビオチンの生
合成に包含される。第６番目のuvrＢは紫外線照射耐性
を与える。最後の２つ、chlＡおよびＥは塩素酸塩に対
する感受性を与える[Ｇuest．Ｍol．Ｇen．Ｇenet．,１
０５：２８５〜２８９（１９６９）;Ｓtevens et a
l．,“Ｔhe Ｂacteriophage Ｌambda",ed．Ｈershey,
前出,pp５１５〜５３４参照]。天然の宿主細胞溶解にお
いて機能する他のラムダ遺伝子はkil遺伝子である。kil
遺伝子の機能は余りよく判明していない。kil遺伝子を
表現する細胞は誘発後、細胞増殖速度が減少する。kil
機能の喪失は細胞の正常な速度での増殖、すなわち、誘
発後、溶菌が起るまで対数期増殖を可能とする。Ｓおよ
びＲ遺伝子と同様、kil遺伝子はｃＩレプレッサーによ
り、Ｎ遺伝子を介し、間接的に制御されている[Ｇreer,
Ｖirology,６６:５８９〜６０４（１９７５）参照]。

【０００６】温度感受性溶原菌はよく研究されている
[例えば、Ｃampbell,Ｖirology,１４:２２〜３２（１９
６１）参照]。ｃＩ８５７遺伝子は温度感受性ｃＩ変異
体で、３８℃以下で機能する[Ｓussman et al．,Ｃ．
Ｒ．Ｈ．Ａcad．Ｓci．Ｐaris,２５４:１５１７〜１５
１９（１９６２）参照]。同様なファージ系が他の属で
起ることが知られている。例えば、ロモフスカヤら[Ｌo
movskaya et al．,Ｊ．Ｖirol．,９:２５８〜２６２
（１９７２）]はストレプトマイセス（Ｓtreptomyces）
に感染するテンペレート・ファージの温度感受性変異株
を報告している。フロック[Ｆlock,Ｍol．Ｇen．Ｇene
t．,１５５:２４１〜２４７（１９７７）]はバチルス
（Ｂacillus）に感染するテンペレート・ファージphi−
１０５の温度感受性変異株を報告している。ボトスタイ
ンら[Ｂotstein et al．,Ｎature．２５１:５８４〜
５８８（１９７４）]はサルモネラ（Ｓalmonella）に感
染するテンペレート・ファージＰ２２の温度感染性変異
株を報告している。ジョストロームら[Ｊostrom et a
l．,Ｊ．Ｂacteriol．,１１９:１９〜３２（１９７
４）]およびトムプソン[Ｔhompson,Ｊ．Ｂacteriol．,
１２９:７７８〜７８８（１９７７）]はスタフイロコッ
カス（Ｓtaphylococcus）に感染するテンペレート・フ
ァージphi−１１の温度感受性変異株を報告している。
ミラーら[Ｍiller et al．,Ｖirol．,５９:５６６〜
５６９（１９７４）]はシウドモナス（Ｐseudomonas）
のテンペレート・ファージを報告している。

【０００７】ボトスタインら[Ｂotstein et al．,Ａn
n．Ｒev．Ｇenetics,１６:６１〜８３（１９８２）]に
よる報告のようにラムダ細胞内溶解素がファージを吸収
できるサルモネラ株を溶解することが判明している。ペ
リショーダら[Ｐerricaudet et al．,ＦＥＢＳ Ｌet
t．,５６:７〜１１（１９７５）]はラムダint、xis、re
d、gam、ｃＩＩＩおよびＫil遺伝子を含むセグメントで
ある遺伝地図の５８位および７１位の間（△５８〜７
１）のラムダ遺伝子の欠失を記載している。ヨーロッパ
特許出願２０８４５８４号（Ｈershberger et al．）
はプラスミドの安定化および選択のため、宿主細胞とし
て溶原菌の使用を開示している。この発明者らは、例え
ば、欠損ｃＩ遺伝子を有する溶原菌の、機能ｃＩ遺伝子
を有するプラスミドによる形質転換を開示している。１
つの開示された具体例において、該機能ｃＩ遺伝子はｃ
Ｉ８５７遺伝子である。

【０００８】転置因子、すなわち、宿主の染色体組換機
構とは独立して組換できる遺伝子がマーカーとして宿主
細胞に挿入できることが知られている。ロスら[Ｒoss
etal．,Ｃell．１６:７２１〜７３１（１９７９）]は、
転置テトラサイクリン耐性因子tn１０によってプロモー
トされる欠失および逆位の物理的構造を報告している。
デイビスら[Ｄavis et al．,“Ｂacterial Ｇenetic
s",Ｃold ＳpringＨarbor Ｌaboratory,Ｎew Ｙork
（１９８０）]は転置因子の使用を記載している。ラブ
カンら[Ｒuvkun et al．,Ｎature．２８９:８５〜８
８（１９８１）]は、転置カナマイシン耐性およびネオ
マイシン耐性因子tn５を有するプラスミドの接合、つい
で、相同組換によるtn５のリゾビウム・メリロチ（Ｒhi
zobium meliloti）の染色体ＤＮＡへの組込みを報告し
ている。相同フランキング配列の存在に由来する組換に
よる非対応遺伝子の組込もヨーロッパ特許出願第７４８
０８号に開示されている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明はテンペレート・
ファージからの細胞内溶解素コード付け遺伝子を用いる
細菌内で生産物を産生する方法を提供するものである。
本発明の方法は、温度感受性ファージ・レプレッサー遺
伝子および機能性ファージ・リゾチーム・コード付け遺
伝子を有し、許容条件下で該リゾチーム・コード付け遺
伝子が抑制され、制限条件下で表現される温度感受性細
菌株を、直接または間接的に生産物を表現するＤＮＡ分
子で形質転換し、許容条件下で該形質転換株を培養して
該生産物を産生させ、温度を上昇させて制限条件を生じ
させ、所望により、培養培地またはその濃縮物から該生
産物を回収することからなる。

【００１０】本発明の他の態様は、生産物を産生する細
菌を、温度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子および
ファージ・リゾチーム・コード付け遺伝子を有し、許容
条件下で該リゾチーム・コード付け遺伝子が抑制され、
制限条件下で表現されるファージＤＮＡ配列で形質転換
して細菌を溶菌性にし、許容条件下で該形質転換細菌を
培養して生産物を産生させ、温度を変化させて制限条件
を生じさせ、所望により、生産物を培養培地またはその
濃縮物から回収することからなる細菌生産物の産生法を
提供するものである。本発明のもう１つの態様は、温度
感受性レプレッサー遺伝子および機能性リゾチーム・コ
ード付け遺伝子を有し、該リゾチーム・コード付け遺伝
子が許容条件下で抑制され、制限条件下で表現される欠
損ファージ配列、選択マーカーおよび、好ましくは、宿
主細胞の染色体における隣接配列と相同のフランキング
ＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラグメントを提供するもの
である。

【００１１】本発明のもう１つ別の態様は、細菌を本発
明のＤＮＡフラグメントで形質転換してなる溶菌性細菌
の製法および該ＤＮＡフラグメントからなる細菌を提供
するものである。さらに、本発明のもう１つの態様は、
有効用量の細菌生産物を含有する量の温度感受性細菌の
哺乳類に投与し、これにより、細菌が哺乳類の体内で溶
解し、該生産物を放出することからなる哺乳類に細菌生
産物を投与する方法を提供するものである。

【００１２】温度感受性細菌は、温度感受性レプレッサ
ー遺伝子を含み、１つの温度範囲（許容条件）にて培養
した場合、レプレッサーが機能するが、もう１つの温度
範囲（制限条件）で培養した場合、レプレッサーが機能
せず、レプレッサーが表現されず、または安定でないフ
ァージＤＮＡ配列を有する細菌である。制限条件下、フ
ァージ・リゾチーム・コード付け遺伝子を含め、ファー
ジ遺伝子が表現され、菌体の溶解をもたらす。かかる温
度感受性細菌が溶菌性細菌である。本明細書に記載のよ
うないずれの溶菌性細菌も本発明の方法に使用できる。
温度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子は入手するこ
とができ、あるいは公知の方法でかかる遺伝子を変異さ
せることにより調製できる。例えば、キャンベル[Ｃamp
bell,Ｖirology,１４:２２〜３２（１９６１）]は温度
感受性ファージ変異株の単離を記載している。一般に、
この方法は、ファージ感染細菌に、紫外線照射によるな
どして変異誘発処理を行ない、生存菌を高温でインキュ
ベートして、いずれかの温度感受性レプレッサー変異株
の誘導を生じさせることからなる。ついで、溶解質を感
受性細菌の感染に用いる。この新たな溶原菌を加熱誘発
に付し、加熱誘発後に生じたファージを温度感受性細菌
からの溶原菌調製に用いる。このサイクル（溶原菌調
製、誘発、再調製）はファージ・レプレッサー変異体の
同定に通じる。典型的には、３〜４回のかかるサイクル
がかかる変異株を得るのに充分である。

【００１３】以下の記載は大部分、溶菌性イー・コリ、
ことに、ｃＩ８５７イー・コリ溶原菌に関する。けれど
も、これに限定するものではなく、ラムダまたは前記し
たテンペレート・ファージのような他のテンペレート・
ファージからのレプレッサーおよび細菌内溶解素コード
付け遺伝子を用いて他の溶菌性イー・コリならびに他の
溶菌性細菌についても同様に行なうことができる。ｃＩ
８５７溶原菌は公知であり、一般的に入手でき、３８℃
以下で活性であるが、３８℃を超えると不活性なｃＩレ
プレッサーを産生する。これらは、レプレッサーが３８
℃を超えると不活性になる変異に加えて、ｃＩ８５７遺
伝子が、ラムダrecＡ遺伝子の生産物による蛋白加水分
解的開裂に対して該ｃＩレプレッサー蛋白を不感性にす
る第２の変異を含有するので他の温度感受性イー・コリ
溶原菌より好ましい。すなわち、許容条件下で培養した
場合、ｃＩレプレッサー蛋白は安定で、したがって、免
疫性を維持するのに効率的である。

【００１４】イー・コリＵＣ５８２２株はｃＩ８５７変
異を有する溶原菌である。また、該株はint遺伝子（int
６am、アンバー変異）およびＰ遺伝子（Ｐ３am、アンバ
ー変異）に点変異を有する（アンバー変異は翻訳の終止
を合図する。）。一般に、ＵＣ５８２２株は、欠損性、
すなわち、一般に感染性ファージ粒子を生成しないの
で、例えば、ＭＭ２９４（ｃＩ８５７）株よりも好まし
い。欠損性溶原菌は、ことに、ポリペプチドを哺乳類に
投与するのに用いる場合に好ましい。しかしながら、Ｕ
Ｃ５８２２株は低レベルのリゾチームを産生し、これ
は、多分、該株が誘発後、ＳおよびＲ遺伝子のより低い
複写数、すなわち、ＭＭ２９４（ｃＩ８５７）より低い
複写数、すなわち、５０〜１００を有するためであるに
もかかわらず、ＵＣ５８２２株は誘発後、容易に溶解す
る。

【００１５】本発明の方法における１つの態様におい
て、温度感受性細菌は、直接または間接的に所望の生成
物をコードするＤＮＡ分子により形質転換される。この
形質転換は、ＤＮＡ分子が宿主細胞に入り、生産物を表
現することを可能にするいずれの技術によっても行なう
ことができる。これらの技術には、例えば、形質転換、
形質導入、接合および細胞融合が包含される。多くの適
当な表現ベクターがよく知られており、生産物用の遺伝
子クローニングおよび細胞のかかる分子による形質転換
のための技術と同様に広く利用されている。一般に、生
産物は非排泄性の非対応遺伝子生産物、すなわち、天然
には宿主によって生産されない、外在化されない物質で
ある。直接表現される生産物にはポリペプチドが包含さ
れ、間接的に表現される生産物にはポリペプチド、糖蛋
白質、抗生物質および、例えば、金属チオネイン産生細
菌内に隔離することのできるような金属イオンのごとき
他の分子が包含される。

【００１６】形質転換宿主ｃＩ８５７溶原菌は、所望の
生産物の表現に至適な許容条件下（＜３８℃、通常、３
２〜３６℃）、無際限に増殖できる。充分な増殖が達成
されたとき、すなわち、通常、対数増殖期中期（Ａ₆₅₀
＝０．５）に達したとき、溶原菌を制限条件下で培養し
てラムダ細胞内溶解素の合成を誘発させる。これは、培
養培地またはその濃縮物の温度を、ｃＩ８５７株の場
合、３８℃より高く、好ましくは、４２〜４４℃に約９
０〜１２０分間上昇させることにより行なえる。別法と
して、培養培地またはその濃縮物の温度を３８℃より高
く、好ましくは、４２〜４４℃に短時間、すなわち、フ
ァージＤＮＡを誘発するに充分な時間、好ましくは、少
なくとも約５分間上昇させ、ついで、温度を０〜３８
℃、好ましくは、２〜３６℃に低下させる。溶菌がより
効率的で、迅速であるので、制限条件を９０〜１２０分
間維持することが好ましい。しかしながら、場合によ
り、例えば、所望の蛋白質が熱不安定性な場合または制
限条件を維持する経費をさけるような場合には後者の方
法も好ましい。宿主ｃＩ８５７株が機能ラムダcro遺伝
子を有する場合、溶菌が起るまで、細胞は細胞が機能す
るいずれの温度においてもリゾチームを合成しつづけ
る。ラムダ細胞内溶解素は０℃のごとき低温でも活性で
あるが、一般的に、蛋白合成速度および触媒活性の低下
ゆえに、溶菌に要する時間は低温ではより長くなる。

【００１７】誘発の直前または誘発後、好ましくは、細
胞を、濾過、遠心分離または他の手段により濃縮し、こ
の濃縮物を溶菌するまでインキュベートする。かかる方
法は所望の生産物の収集および精製を容易にする。誘発
につづき、細胞壁は実質的に分解する。プロトプラスト
の形の細胞は所望の生産物を合成しつづけ、生産物は細
胞膜を通して多量に培地中に放出される。培地中への完
全な放出は溶菌によって達成される。溶菌は培養培地ま
たはその濃縮物の清澄化および／または培養培地または
濃縮物の粘度増加によって観察できる。溶菌は、例え
ば、機械的撹拌または急激な培養条件の変化、例えば、
温度を２〜２５℃の間で急激に変化させるか、培地また
は濃縮物の浸透圧強度を変化させることにより増強する
ことができる。好ましくは、細胞を濃縮し、生産物含有
上澄液をデカンテーションした後、誘発細胞を最少塩緩
衝液または０．１Ｍトリス緩衝液、５０mＭＮaＣlおよ
び１mＭ ＥＤＴＡに懸濁させ、撹拌して溶菌を行なう。
ついで、公知の方法により、培地またはその濃縮物から
所望の生産物を回収し、所望により、精製する。

【００１８】別法として、溶菌相の誘発前に全細胞を濃
縮し、哺乳類に経口投与する。ついで、体内で誘発が起
り、所望のポリペプチドの放出をもたらす。この方法は
ことに、全細胞ならびに所望の抗原が免疫保護応答を起
させるのに好適な場合に、動物に該抗原を投与するのに
有用である。例えば、ＬＴ−Ｂ抗原のような抗原をコー
ドする遺伝子を有する温度感受性溶菌は直接ブタおよび
／またはウシに摂取させることができる。各動物に投与
する菌体の量は有効用量を含有する菌体量である。単位
量の菌体によって産生される蛋白質量は公知の方法で計
算することができる。

【００１９】本発明の１つの態様は本発明の方法に用い
る溶菌性細菌を調製するのに使用できるＤＮＡフラグメ
ントを提供することである。かかるＤＮＡフラグメント
は温度感受性レプレッサー遺伝子および機能性リゾチー
ム・コード付け遺伝子を有する欠損ファージ配列からな
る。かかる欠損ラムダ配列からなるＤＮＡフラグメント
は細胞内溶解素が制限条件下で表現されるような温度感
受性ｃＩ遺伝子および機能性ラムダ細胞内溶解素コード
付け遺伝子（Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ）、選択マーカーおよ
び、好ましくは、宿主細胞染色体における隣接ＤＮＡと
相同のフランキングＤＮＡ配列を有する。１つの具体例
において、該ＤＮＡフラグメントは、遺伝地図の５８位
および７１位間の遺伝子が欠失しており、したがって、
int、xisおよびkil遺伝子を欠き、温度感染性ｃＩ遺伝
子を有し、ＯおよびＰ遺伝子に変異を有し、該ｃＩ遺伝
子がｃＩ８５７変異体で、制限条件下で細胞内溶解素を
産生するラムダＤＮＡからなる。ＯおよびＰ変異は欠失
または点変異とすることができる。Ｏ２９、Ｐ３および
Ｐ８０変異のような点変異は、それらが容易に利用でき
るので好ましい。Ｐ３変異はＰ８０変異より好ましい。

【００２０】他の具体例においては、フラグメントは、
遺伝地図の３位および７１位の間の遺伝子に実質的な欠
失があるラムダＤＮＡからなる。かかるフラグメントは
ラムダ・キャプシド組立に必須の実質的に全ての遺伝子
ならびにint、xisおよびkil遺伝子が欠失している。所
望の生産物を産生する、または、例えば、遺伝子工学的
技術により、予めもしくはその後に所望の生産物を産生
するようにした宿主細胞、イー・コリまたは他の細菌
は、公知の技術により、温度感受性ファージ・レプレッ
サー遺伝子およびファージ・リゾチーム・コード付け遺
伝子を有するファージＤＮＡ配列で形質転換される。こ
れには、かかる温度感受性レプレッサー遺伝子を有する
テンペレート・ファージ、好ましくは、欠損ファージで
の細菌の感染が包含される。また、公知の方法、例え
ば、形質転換、形質導入、接合および融合により、細菌
を本発明のＤＮＡフラグメントで形質転換させることが
包含される。一般に、形質転換にはファージまたはプラ
スミドのようなベクターへのフラグメントの組込が包含
される。例えば、フラグメントはpＢＲ３２２等のよう
なプラスミド中でクローンすることができ、該フラグメ
ントに側面を接する配列に相同する隣接配列を欠くか、
組換事象を欠損している（rec^-）適当な宿主中、in viv
oで生育できる。該プラスミドは回収し、所望の生産物
産生用の適当な宿主の形質転換に使用できる。かかる宿
主の形質転換についで、宿主染色体における隣接ＤＮＡ
配列と相同のフランキングＤＮＡ配列を有するフラグメ
ントを相同隣接配列のサイトで自然に組換えることによ
り組込む。別法として、所望の生産物を産生する適当な
宿主は線型または環型の分離ＤＮＡフラグメントで形質
転換できる。

【００２１】該ＤＮＡフラグメントは選択マーカーを有
し、形質転換体の選択を容易にする。選択マーカーは、
典型的には、分析可能な酵素をコードし、栄養要求宿主
に原栄養性を復元するか、致死もしくは抑制化合物、一
般に、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子である。好
ましくは、選択マーカーは抗生物質耐性を与える遺伝子
で、これらは、入手できないか、あるいは自然に原栄養
性に復帰する栄養要求性宿主の使用を要しない。テトラ
サイクリンは安価で、また、テトラサイクリン耐性は通
常、自然には獲得されないので、テトラサイクリン耐性
が好ましい。形質転換体におけるマーカーの存在は宿主
が該ＤＮＡフラグメントからなっていることを示す。該
ＤＮＡフラグメントと宿主細胞ＤＮＡの間の相同はラム
ダＤＮＡと側面を接する領域およびマーカー中にのみ存
在するので、該フラグメントが組込まれれば、全フラグ
メントが組込れる。ＤＮＡフラグメント中にマーカーが
ない場合、形質導入または形質転換操作後、ラムダＤＮ
Ａを有する宿主細胞の選択は欠損ファージによる推定的
形質導入体の重複感染（非組込み）および免疫性生存細
菌の選択が必要とされる。

【００２２】本発明のＤＮＡフラグメントの組込みによ
り溶菌性にしたイー・コリ株には、例えば、ＭＧ株が包
含される。これらの株は、そのラムダＤＮＡが遺伝地図
の５８位および７１位の間の遺伝子を欠失し、したがっ
て、int、xis、red、gam、kilおよびeＩＩＩ遺伝子を欠
き、ｃＩ８５７変異を有し、ＯおよびＰ遺伝子に遺伝子
を有し、制限条件下で細胞内溶解素が表現されるように
機能性Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子を有する溶原菌であ
る。１つの具体例において、アンバー・サプレッサー、
すなわち、ＵＡＧ翻訳終止コードンの翻訳サプレッサー
の宿主細胞ＤＮＡによる産生のため、点（アンバー）変
異株であるＭＧ１株[Ｃ６００（λ△５８〜７１,ｃＩ８
５７,Ｐ３,Ｏ２９）,ＳuＩＩ⁺,galＫ,lacＺ,thi,gal::t
n１０tet^R]が解読され、ＯおよびＰ遺伝子が表現され
る。本発明の方法で用いるさらに好ましい宿主細胞は表
現型的にＯ^-およびＰ^-のものである。１つの具体例にお
いて、ＭＧ３株[Ｎ９９（λ△５８〜７１,ｃＩ８５７,
Ｐ３,Ｏ２９）,galＫ,lacＺ,thi,gal::tn１０ tet^R]は
ＭＧ１株と同様なラムダＤＮＡを有する。しかし、この
株は表現型的にＯ^-およびＰ^-で、tet^R,△kil,△intおよ
び△xisである。

【００２３】もっとも好ましい溶菌性イー・コリはＭＧ
４株である。これは実質的に全てのラムダ構造蛋白質、
組立遺伝子および正常な右側プロファージー細菌接合
点、すなわち、右側結合サイト（att^R）を欠失する株で
ある。ことに、これらは遺伝地図の３位および７１位間
のラムダ遺伝子の実質的に全てを欠失し、ＯおよびＰ遺
伝子に点変異を有し、制限条件下で細胞内溶解素が表現
されるように温度感受性ｃＩ遺伝子、機能性Ｎ、Ｑ、Ｓ
およびＲ遺伝子を有し、選択マーカー、すなわち、tn１
０テトラサイクリン耐性転置因子を有する溶原菌であ
る。かかる欠損溶原菌はウイルス増殖に対する４つの独
立した遮断を有している。すなわち、（i）ＯおよびＰ
複製機能の喪失、（ii）プロファージの重複感染ファー
ジからのintおよびxis遺伝子による相補をできなくさせ
るatt^Rの喪失、（iii）ラムダ構造遺伝子のコード不能
および（iv）ラムダＤＮＡの大きさが包装に必要な最小
の大きさよりはるかに小さいことである。これらは、最
初に、ＭＧ株のようなｃＩ８５７、Ｏ^-、Ｐ^-溶原菌株に
塩素酸塩ストレスを加えて塩素酸塩耐性株を産生し、Ａ
およびＢ機能欠損の重複感染異種免疫もしくはビルレン
ト・ラムダまたはラムドイド・ファージの増殖を相補で
きない変異株を選択することにより調製できる。該マー
カー、ラムダＤＮＡおよび該イー・コリ染色体からのフ
ランキング配列からなるＤＮＡフラグメントは、例え
ば、制限エンドヌモレアーゼによる処理またはＰ１形質
導入によってＭＧ４株から単離できる。

【００２４】ＭＧ４は、ウイルス構造成分をコードする
パクテリオファージ遺伝子の全部または大部分を欠失さ
せることによりＭＧ３から誘導できる。これらの遺伝子
の喪失を保証するためには、ＭＧ４中のウイルス・ゲノ
ムが、それ自体これらの遺伝子を欠損している重複感染
ファージを相補および増殖させることができないことを
証明すれば充分である。λシャロン３Ａ（λＡ^-,Ｂ^- i
mm８０）がこの重複感染に使用できるファージの例であ
る。別法として、異種免疫またはビルレント・ファージ
（λvir）の存在下、ＡまたはＢにアンバー変異を有す
るか、他のウイルス構造シストロンを有するいずれかの
ファージを感受性イー・コリ上で平板培養することがで
きる。該２つのファージ間で組換が起り、組換体、例え
ば、virＡ^-の形成をもたらす。組換体の頻度は実験条件
に依存して、１〜５０％の間である。組換体は、それら
がサプレッサー含有溶原菌[Ｙmel（λ）]上で平板培養
できることおよび、それらがＮ９９のような非抑圧、λ
感受性株上でプラークを形成しないことにより認識でき
る。この交差で得られるプラークをＹmel（λ）または
Ｎ９９を入れたペトリ皿上で平板培養し、組換体を精製
する。Ａおよび／またはＢ遺伝子機能を欠損するラムダ
・ファージは、それらのラムダ・ゲノム上の位置ゆえ
に、これらの機能を相補できないＭＧ４株が他のラムダ
構造遺伝子の全てを欠失することになるので好ましい。
欠損ファージおよび宿主をこのように使用することは
「マーカー救済」と称され、広く実施されている（例え
ば、“ＴheＢacteriophage Ｌambda",ed．Ａ．Ｄ．Ｈe
rshey,Ｃold Ｓpring ＨarborＬaboratory,１９７１,
Ｓtevens et al．,pp５１５〜５３３参照）。

【００２５】本発明はいずれの細菌生産物の製造にも使
用できる。その例は非常に多く、とりわけ、インシュリ
ン、狂犬病糖蛋白質、Ｋ９９および９８７Ｐ抗原、抗生
物質、生長ホルモン、金属チオネイン、α−１−抗トリ
プシン、インフルエンザ抗原、リンフオカインおよびイ
ンターフェロンが包含される。加えて、本発明は、従来
必要とされている溶菌工程を回避して、操作を非常に簡
単に、かつ、操作時間を短縮できるので、コロニー・ス
クリーニング、ＲＮＡ単離およびプラスミド調製にも用
いることができる。つぎに実施例を挙げて、本発明をさ
らに詳しく説明するが、これらに限定されるものではな
い。実施例中、全ての出発材料は容易に入手できるか、
公知の技術によって容易に調製できる。形質導入は実質
的にエクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネテ
ィックス[“Ｅxperiments in Ｍolecular Ｇenetic
s",ed．Ｊ．Ｈ．Ｍiller,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌ
aboratory,Ｎew Ｙork（１９７２）,pp．２０１〜２０
５]の記載に従って行なった。

【００２６】

【実施例】実施例１ ＭＧＯの調製 Ｃ６００株（イー・コリＳuＩＩ⁺,Ｋ１２,galＫ,lacＺ,
suＩＩ,thi）をλｃＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２９（ウイスコ
ンシン大学、Ｗ．Ｓyzbalski氏提供）の存在下でインキ
ュベーションした。３２℃で一夜増殖させ、生存細菌を
分離、精製した。これらの細菌の８０％が重複感染に対
して免疫性であり、４４℃で増殖できず、４４℃にさら
した後、λｃＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２９と区別できないラ
ムダ・ファージ[該ファージがＣ６００株上ではプラー
クを生じるが、Ｎ９９株（イー・コリＫ１２,galＫ,lac
Ｚ,suＯ,thi）上では生じないことで判定]を産生するこ
とが判明した。これらの生存細菌群の１つを精製し、Ｍ
ＧＯ（Ｃ６００（λｃＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２９））と命
名した。

【００２７】実施例２ ＭＧＯ−ＡＲ６の調製 Ｎ５１５１株（イー・コリＫ１２,ＳＡ５００,galＫ,la
cＺ,pro,thr,his,gal８（λｃＩ８５７ △５８〜７１
△Ｈ１））を、予めＡＲ４株（イー・コリＫ１２,ga
l::tn１０（Ｐlcm１００））上で増殖させたＰlm１００
ファージの存在下でインキュベーションした。Ｎ５１５
１およびＡＲ４上で増殖させたＰlm１００の交差はテト
ラサイクリン耐性、ＵＶ感受性、温度感受性溶原菌を生
じさせた。これらの単離物の１つを精製し、ＭＧＯ−Ａ
Ｒ６（イー・コリＫ１２,gal８,gal::tn１０λ△５８〜
７１ ｃＩ８５７ △Ｈ１（bio uvrＢ））と命名し
た。

【００２８】実施例３ ＭＧ１の調製 ＭＧＯ−ＡＲ６は、Ｐlcm１００の存在下にインキュベ
ーションしたＡＲ６の生存菌を単離することによりＰlc
m１００溶原菌になった。ＭＧＯ−ＡＲ６のＰlcm１００
溶原菌をＭＧＯ−ＡＲ１８と命名した。ＭＧＯ株を、Ｍ
ＧＯ−ＡＲ１８上で増殖させたＰlcm１００によりＰ１
形質導入して交差させた。ファージを吸収させた後、菌
体を４Ｊ／m²のＵＶ照射（ＵＶ線量計で測定した場合、
２Ｊ／m²／sの割合の２５４nmの光の照射）に付し、テ
トラサイクリンの存在下でインキュベーションした。テ
トラサイクリン耐性コロニーの１１％がＵＶ光に耐性を
示し、それらがＨ１欠失を有せず、したがって、それら
がｃＩからファージの右側端までのラムダ遺伝子を有し
ていることを示した。ことに、このことはこれらのコロ
ニーがＰ３およびＯ２９変異と、無垢のＳおよびＲ遺伝
子を有していることを意味している。ＵＶ耐性、テトラ
サイクリン耐性菌の１／３はファージを産生しなかっ
た。したがって、これらはラムダの５８〜７１欠失を獲
得し、それ故、int、xisおよびkil遺伝子を欠失したと
判断された。この群を精製し、ＭＧ１（（Ｃ６００）
（λ△５８〜７１,ｃＩ８５７Ｐ３ Ｏ２９）,ＳuＩ
Ｉ⁺,galＫ,lacＺ,thi,gal::tn１０ tet^R）と命名し
た。

【００２９】実施例４ ＭＧ１をＰlcm１００の存在下でインキュベーション
し、生存菌を精製した。これらの生存菌のうち、非常に
高い割合でＰlcm１００溶原菌となったＭＧ１菌体が同
定された。ＭＧ１のＰlcm１００溶原菌を精製し、ＭＧ
２と命名した。Ｎ９９株を、ＭＧ２上で増殖させたＰlc
m１００でＰlcm１００形質導入により交差させた。テト
ラサイクリン耐性の形質導入体を選択した。これらの全
てはラムダに対して免疫性で、したがって、ラムダ溶原
菌と判断された。これらの溶原菌の１つを精製し、ＭＧ
３（Ｎ９９（λ△５８〜７１ ｃＩ８５７ Ｐ３ Ｏ２
９））と命名した。ＭＧ３を４４℃に９０〜１２０分間
さらして溶菌を測定した。該温度にさらす前および後、
菌体培養中には全くファージは見出されなかった（３．
３×１０⁸細胞／mlの培養０．１ml当り＜１）。ファー
ジの存在はＣ６００菌体上で検定した。非欠損ラムダ・
プロファージを有するイー・コリ株の対照培養は３．３
×１０⁸細胞／mlの培養１ml当り、１０⁵〜１０⁹個のフ
ァージを含有していた。

【００３０】実施例５ ＭＧ３の調製 実質的に前記実施例と同様に、ただし、Ｎ９９株をλｃ
Ｉ８５７ Ｐ３ Ｏ２９で直接溶原菌化してＭＧ３株を
調製した。得られた溶原菌をＭＧＯ−ＡＲ１８株でＰ１
形質導入することにより交差させ、温度誘発により溶菌
するが、ファージを産生しないテトラサイクリン耐性溶
原菌を選択した。

【００３１】実施例６ ＵＣ５８２２の調製 Ｎ９９株をλint６ red３ ｃＩ８５７ Ｐ８０および
λhy５ ｃＩ imm２１△b２で感染させてＵＣ５８２２
株を調製した。λhy５ ｃＩ imm２１△b２はファージ
λおよびファージ２１のハイブリッドである。この調製
におけるλhy５ｃＩ imm２１ △b２の目的は、λint
６ red３ ｃＩ８５７ Ｐ８０がこの株を溶原菌化す
るために必要なトランス状態でint機能を付与すること
にある。△b２変異は△hy５ ｃＩ imm２１ △b２フ
ァージのそれ自体の該株への組込の指令をできなくす
る。ラムダの重複感染に免疫性であるが、ファージ２１
に対して感受性を示すこの交差の生存菌を精製し、ＵＣ
５８２２と命名した。この株は４４℃にさらすと生存し
なかった。４４℃におけるインキュベーションの前後
で、ＵＣ５８２２の培養中にファージは全く検出できな
かった。

【００３２】実施例７ ＭＧ４の調製 ＭＧ３の培養菌をルリア（Ｌuria）ブロスまたは他の完
全培地中、Ａ₆₅₀＝０．５となるまで３２℃で増殖させ
た。培養物は約５×１０⁸細胞／mlを含有していた。つ
いで、培養物を、０．２％グルコースおよび０．２％Ｋ
ＣlＯ₃を補足した栄養寒天平板上で平板培養した。平板
を嫌気性条件下、３２℃でコロニーが形成されるまで
（３〜５日間）インキュベーションした。かかる条件
下、この培地上での増殖により、chlＡ、Ｂ、Ｃまたは
Ｄ遺伝子に変異を有するイー・コリを選択した（“Ｅxp
ts．in Ｍolecular Ｇenetics",Ｊ．Ｍiller,pp．２
２６〜２２７参照）。

【００３３】chlＢ、ＣまたはＤにおける変異はＭＧ４
の単離にはつながらない。変異のうち、chlＡの表現に
影響するのはchlＡにおける点変異およびchlＡの左側ま
たは右側に伸びる欠失である。chlＡの左側に伸びる欠
失は隣接するuvrＢ遺伝子の破壊をきたし得、それ故、
生物にＵＶ感受性表現型を与える。同じ理由で、chlＤ
から右側へ伸びる欠失も生物にＵＶ感受性表現型を与え
得る。嫌気性インキュベーションで得られた塩素酸塩耐
性コロニーがＵＶ感受性であるか否かを決定するために
テストする。これは、塩素酸塩耐性コロニーをペトリ皿
上で画線し、ペトリ皿の１／２をカバーし、他の半分を
２５４nmＵＶ光の１０Ｊ／m²照射に付すことにより、都
合よく行なえる。この線量はＵＶ感受性菌体を殺すが、
ＵＶ耐性変異株は殺さないために充分な量である。ＵＶ
感受性変異株（chlＡまたはchlＤにおける変異からな
る）の欠損ラムダ・ファージの存在をテストする。これ
は、同種免疫ファージの画線を介して菌体を交差画線す
ることにより行なえる。ラムダ感受性細菌は交差画線の
ところでファージによって殺され、ラムダ溶原菌は重複
感染に対して免疫性であり、殺されない。chlＡおよびc
hlＤ遺伝子、ラムダ・ゲノムおよびuvrＢ遺伝子の所在
の結果、全てのＵＶ感受性chlＡ変異株はラムダ溶原菌
となりうる。したがって、ＵＶ感受性、ラムダ溶原菌は
左側にuvrＢ中へ伸びるchlＡの欠失を含む。該欠失がuv
rＢを通過して伸びる場合、ビオチン・オペロン中、ま
た、多分、構造ラムダ遺伝子中へ伸びることができる。
この方法により、構造ラムダ遺伝子の欠失が得られてい
る（Ｇrier,Ｖirology,６６:５８９〜６０４（１９７
５））。全てのuv感受性、chlＡ^-、ラムダ溶原菌をλvi
rＡ^-で感染させる。２．５時間後、λvirＡ^-ファージお
よびλvirＡ⁺組換体について、溶解物の平板培養を行な
う。λvirＡ^-の増殖および／またはλvirＡ⁺ファージの
産生のあったＭＧ４候補株をすてる。λvirＡ^-の相補ま
たはvirＡ⁺の産生をしない株はchlＡからラムダのＡ遺
伝子まで伸びる欠失を有している。chlＡからラムダの
Ａ遺伝子までの欠失を有するＭＧ４候補株の溶菌細菌特
性（＞３８℃の増殖の際の溶菌）についてテストする。
欠失を有し、溶菌細菌特性を保持している株をＭＧ４と
して精製する。

【００３４】実施例８ ＭＭ２９４（ｃＩ８５７）およびＵＣ５８２２における
クローニング イー・コリＭＭ２９４株をλｃＩ８５７の存在下でイン
キュベートした。３２℃で一夜増殖後、生存細菌を単離
し、精製した。重複感染に免疫で、４４℃で増殖でき
ず、ファージを産生できないクローンを分離した。得ら
れたｃＩ８５７溶原株、ＭＭ２９４（λｃＩ８５７）お
よびイー・コリＵＣ５８２２株をＣaＣl₂処理によって
コンピテント菌とし、イー・コリＬＴ−Ｂ抗原ならびに
アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性についての遺
伝子を有するプラスミド、pＤＮ５で形質転換した。両
方の溶菌細菌株のアンピシリンおよびテトラサイクリン
耐性形質転換体は標準栄養ブロス中、３０〜３２℃でよ
く増殖し、ＬＴ−Ｂ抗原を表現した。細菌を遠心分離に
よりペレット化し、４２℃の標準栄養ブロスに移す。約
９０〜１２０分以内に、細胞溶解が明白になり、実質的
に完了した。ＬＴ−Ｂ抗原がブロス中に放出された。４
×１０⁷細胞／mlからなるＭＭ２９４（ｃＩ８５７）形
質転換体の試料において、１ml当り、約２×１０⁸個の
ラムダ・ファージを収集した。ＵＣ５８２２形質転換体
の同様な試料中では、全くファージは収集されなかった
（＜２０個／ml）。

【００３５】実施例９ ＵＣ５８２２におけるクローニング イー・コリＬＴ−Ｂ抗原の遺伝子を有するプラスミドp
ＥＳＳ２を含有するイー・コリＵＣ５８２２の種培養を
アンピシリン含有Ｌブロスの５ml試験管中でインキュベ
ートした。６時間後、試験管内容物をアンピシリンを含
有する培地５００mlに移し、３２℃で一夜振とうしなが
らインキュベートした。該一夜培養物４００mlを、バー
テイス(Ｖirtis)・ベンチ・トップ醗酵器中、アンピシ
リン含有培地１０lに移した。培養物を３２℃に保持
し、各時間ごとに試料１００mlについてＡ₄₂₀における
増殖をモニターした。４時間目に、培養物に５０％デキ
ストロース２００mlおよび消泡剤０．１mlを加えた。８
時間目、培養物は４．８Ａ₄₂₀単位となり、４３℃に変
化させた。１０時間目、培養物に再び５０％デキストロ
ース２００mlを加え、１４時間目に培養を停止した。４
時間目、６時間目、８時間目、９時間目、１０時間目、
１０．６時間目および１４時間目の細胞濃縮物(ペレッ
ト)および細胞上澄液の試料のＬＴ_Bについて、既知濃度
のＬＴ_Bを標準とするエライサ(ＥＬＩＳＡ)テストを用
いてテストした。

【００３６】結果を表１に示す。最初の４〜８時間、Ｌ
Ｔ−Ｂの９０％以上が細胞内に存在していたが、温度変
化後２時間(接種後１０時間)、ＬＴ−Ｂの９０％が上澄
液中に存在した。温度変化後６時間目、ＬＴ−Ｂの９５
％が上澄液中にあり、ＬＴ−Ｂは総蛋白質の８．５％に
相当した。ＬＴ−Ｂの収率はpＥＳＳ２で形質転換した
イー・コリＭＭ２９４からの収率よりもはるかに大きか
った。温度変化後、２〜４時間以内に培地の粘度上昇お
よび可視細胞片によって溶菌が明らかとなった。温度変
化後４〜６時間まで、粘度は大いに減少し、培養物は容
易にポンプで限外濾過装置に通して全細胞片および残っ
た未溶解細胞を除去できた。粘度の増加は高分子量ＤＮ
ＡおよびＲＮＡの培地への放出を反映し、内因性ヌクレ
アーゼの作用が究極的に著しい粘度の減少をもたらす。

【００３７】

【表１】

【００３８】実施例１０ 溶菌性サルモネラの調製 接合またはＤＮＡ形質転換により、サルモネラおよびＭ
Ｇ３の間で種間交差を行なう。サルモネラ株は正常には
テトラサイクリン感受性であり、ＭＧ３はテトラサイク
リン耐性である。テトラサイクリン耐性となったサルモ
ネラ組換体の４２℃における増殖能力をテストする。こ
の温度で溶解するサルモネラは組換を通じてＭＧ３の溶
菌性細菌機能を獲得する。この実験は、(１)ラムダ溶菌
性機能がサルモネラで表現されること、および(２)サル
モネラとイー・コリ(ＭＧ３)の間に該遺伝子と側面を接
するイー・コリ配列のサルモネラ中への組換を可能にす
る充分な相同性が存在することにより可能である。

【００３９】実施例１１ 溶菌性バチルスの調製 第１法 宿主の溶解を指令するに充分な遺伝因子にはλcＩ８５
７、Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子およびＰ_Lプロモータが
包含される。これらの遺伝子の制限地図は公知である
(Ｍolecular Ｃloning,Ｍaniatis et al．,Ｃold
Ｓpring ＨarborＬaboratory,Ｎ．Ｙ．)。これらの遺
伝子はラムダからプラスミド(例えば、pＢＲ３２２)上
にサブクローンされる。バチルスからのＤＮＡのフラグ
メントをプラスミド中、非必須部分のサイトに挿入す
る。宿主株ＤＮＡの性質または機能あるいはそのプラス
ミド中における方向づけに特性を与える必要はない。つ
いで、バチルスを精製プラスミドＤＮＡと共にインキュ
ベーションし、抗生物質耐性形質転換体を選択する。こ
れらの形質転換体をテストし、高温にさらした後、溶菌
するか否かを測定する。これらの形質転換体において、
ラムダ遺伝子を含有するプラスミドは自律的複製単位と
して存在するか、プラスミドおよび染色体上の相同バチ
ルスＤＮＡ間の組換事象を介して宿主染色体中に組込ま
れる。バチルス染色体中に複製できないプラスミドによ
って担持されるＤＮＡの組込みは公知である(Ｈaldenwa
y et al,Ｊ．Ｂact．１４２:９０〜９８,１９８０)。
この方法は受容宿主株中でのラムダ溶菌遺伝子の表現を
必要とするが、ＭＧ３のイー・コリ配列と受容細胞株と
の間の相同性は要求しない。

【００４０】第２法 ファージphi−１０５はバチルスに感染し、テンペレー
ト・ファージで、変異できるcＩ様レプレッサーを有し
ている。このレプレッサーに影響を及ぼす温度感受性変
異を有するphi−１０５の誘導体を調製することができ
る。除去もしくは複製機能を欠くファージ誘導体は変異
誘発処理または欠損株の単離によって分離できる(Ｆloc
k,Ｍol．Ｇen．Ｇenet．,１５５:２４１〜２４７,１９
７７)。熱不安定性レプレッサーを有するファージ誘導
体を得る。この変異体の溶原菌は、感受性細胞を３０℃
にて該ファージ感染し、生存細胞を分離し、これらの細
胞の重複感染ファージに対する免疫および４０℃におい
て増殖不能なことをテストすることにより調製される。
かかる生物はファージ産生溶菌性細菌である。欠損溶菌
性細菌を分離するため、細菌を変異誘発処理し、生存コ
ロニーを、phi−１０５感受性バチルスの未発達ローン
上でレプリカ平板培養を行なう。高温にさらした後、ロ
ーン上でほとんど、または全くファージを産生しない温
度感受性コロニーはファージ増殖に影響を及ぼす変異を
有している。変異誘発処理のくり返しにより、より多く
のストリンジエント変異株を得ることができる。この構
造を可動化し、この構造の移動を容易に選択するため
に、phi−１０５ゲノムに結合した抗生物質耐性マーカ
ーを有する誘導体を分離することが好ましい。これは、
バチルス染色体のランダム・フラグメントを、pＢＲ３
２２のような、抗生物質耐性決定子を有する、バチルス
中で複製できないプラスミドにクローニングすることに
より行なえる。形質転換した、薬剤耐性細胞が単離さ
れ、これは組込みプラスミドを有している。これらの細
胞のいくつかにおいて、プラスミドはphi−１０５のサ
イトの近くに組込まれている。薬剤耐性コロニーの非分
割プールを普遍バチルス導入ファージ、pＢＳ１で感染
させる。pＢＳ１のストックは、イー・コリにおけるＰl
cm１００が機能すると正確に同じ方法でバチルス中で機
能し、バチルス細胞を薬剤耐性に形質導入するために用
いられる。これらの薬剤耐性形質導入体をテストし、そ
れらが温度感受性で、溶菌性細菌であるか否かを測定す
る。形質導入体の約１％が溶菌性細菌特性を獲得してい
る。以上説明した本発明の方法および組成物は細菌生産
物の産生および外在化に有用である。以上は本発明の好
ましい具体例についての記載であるが、本発明の精神を
逸脱することなく、種々の変形を加えることができ、そ
れらも本発明範囲のものである。

【００４１】

【発明の効果】本発明によれば、直接または間接的に所
望の生成物をコードするある種のＤＮＡ分子を用いて細
菌を形質転換させることにより、所望の生産物の外在化
法に有用な温度感受性細菌を産生することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジェフリィ・イラ・オーエルバッチ アメリカ合衆国メリーランド州20901、シ ルバー・スプリング、セント・アンドリュ ース・レイン600番

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （i）選択可能な形質をコードしている
   遺伝子である選択マーカー；（ii）温度感受性ｃＩレプ
   レッサー遺伝子およびリゾチーム・コード付け遺伝子が
   許容条件下で抑制されかつ制限条件下で表現されるよう
   な機能性リゾチーム・コード付け遺伝子を有しているラ
   ムダ・プロファージＤＮＡ配列であって、該プロファー
   ジＤＮＡ配列が機能性Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子を有
   し、遺伝地図の５８位と７１位との間の遺伝子を欠失
   し、ＯおよびＰ遺伝子を変異してＯおよびＰ遺伝子機能
   を損失させるラムダ・プロファージＤＮＡ配列；および
   （iii）フラグメントと宿主細胞の染色体との間で組換
   えを生起させる宿主細菌細胞の染色体における隣接配列
   に相同するフランキングＤＮＡ配列からなるＤＮＡフラ
   グメントによって細菌を形質転換させることを特徴とす
   る温度感受性細菌の産生法。
2. 【請求項２】 ｃＩ遺伝子がｃＩ８５７遺伝子であり、
   ＯおよびＰ変異体がＯ２９およびＰ３変異体であり、選
   択マーカーがtn１０転置テトラサイクリン耐性因子であ
   る請求項１記載の産生法。
3. 【請求項３】 プロファージＤＮＡ配列が遺伝地図の３
   位と７１位との間の遺伝子を欠失している請求項１記載
   の産生法。
4. 【請求項４】 ｃＩ遺伝子がｃＩ８５７遺伝子であり、
   ＯおよびＰ変異体がＯ２９およびＰ３変異体であり、選
   択マーカーがtn１０転置テトラサイクリン耐性因子であ
   る請求項３記載の産生法。
5. 【請求項５】 細菌がイー・コリである請求項１記載の
   産生法。
6. 【請求項６】 細菌がイー・コリである請求項３記載の
   産生法。