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JPH0698018B2 - 細菌生産物の外在化法 - Google Patents

細菌生産物の外在化法

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Publication number
JPH0698018B2
JPH0698018B2 JP59167705A JP16770584A JPH0698018B2 JP H0698018 B2 JPH0698018 B2 JP H0698018B2 JP 59167705 A JP59167705 A JP 59167705A JP 16770584 A JP16770584 A JP 16770584A JP H0698018 B2 JPH0698018 B2 JP H0698018B2
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JP
Japan
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gene
lambda
phage
genes
strain
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JP59167705A
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JPS6062985A (ja
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マーチン・ローゼンバーグ
ジエフリイ・イラ・オーエルバツチ
Original Assignee
スミスクライン・ベツクマン・コ−ポレイシヨン
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Filing date
Publication date
Application filed by スミスクライン・ベツクマン・コ−ポレイシヨン filed Critical スミスクライン・ベツクマン・コ−ポレイシヨン
Publication of JPS6062985A publication Critical patent/JPS6062985A/ja
Publication of JPH0698018B2 publication Critical patent/JPH0698018B2/ja
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は遺伝子工学の分野、さらに詳しくは、遺伝子工
学的に操作された微生物によつて産生される生産物の外
在化法に関する。
発明の背景 イー・コリ（E.coli）および他の原核性微生物を、所望
の蛋白質の表現用宿主として使用する際に伴なう１つの
問題として、しばしば、精製のために該宿主細胞から蛋
白質を外在化させることが挙げられている。この問題を
解消するための試みには、均質化または超音波処理のよ
うな細胞もしくは菌体の物理的破壊、洗浄剤またはリゾ
チームによる処理のような細胞もしくは菌体の化学的破
壊および排泄シグナルペプチドをコードするDNA配列
を、所望の生産物をコードする構造遺伝子へ融合させる
ことが包含される。例えば、ヨーロツパ特許出願第6125
0号（Weissman et al.）は宿主細胞の溶解剤または滲透
剤による処理を開示しており、米国特許第4336336号（S
ilhawy et al.）は、得られるハイブリツド蛋白が宿主
細胞表面近く、またはそれを越えて輸送されるように細
胞質蛋白用の遺伝子を非細胞質蛋白用の遺伝子に融合さ
せる方法を開示し、また、米国特許第4338397号（Gilbe
rt et al.）はプレ蛋白質用の構造遺伝子を表現ベクタ
ーに挿入することからなる成熟分泌蛋白質の製法を開示
している。
イー・コリは二本鎖DNAウイルスである偏性寄生体のラ
ムダ・フアージによつて感染される。イー・コリ遺伝学
同様、ラムダ遺伝学はよく研究されている（例えば、
“The Bacteriophage Lambda",edit.A.D.Hershey,Cold
Spring Harbor Laboratory,New York,1971参照）。
ラムダはテンペレート・フアージで、イー・コリ中で、
２相のうちの１つの相で増殖する。１つの相、溶菌相に
おいて、フアージDNAは自律的に複製し、キヤンプシド
蛋白質の形成、包装および宿主細胞の溶解を紙令する。
溶菌相の間のラムダDNAの表現は非常に効率的である。
転写は両方のDNA鎖上で、また、１本の鎖上で右側方向
へ向つて、およびもう１本の鎖上で左側方向へ向つて起
る。誘発は37℃で50分間に約100個のフアージ粒子の放
出をもたらすことができる（前記Hershey参照）。
もう１つの相、溶原相において、ラムダDNAは宿主細胞
ゲノムに組込まれ、宿主複製酵素により、宿主染色体DN
Aと共に受動的に複製される。溶原相におけるフアージ
はプロフアージとして知られ、宿主は溶原菌として知ら
れ、免疫性であるといわれる。
免疫性は溶菌相を誘発する種々の事象の発生により失な
われうる。ラムダintおよびxis遺伝子の生産物はイー・
コリゲノムからのラムダゲノム除去の触媒作用をし、自
律複製できる共有的に閉じた環を形成する。これらの遺
伝子および、直接的または間接的に、全ての他のラムダ
遺伝子の合成はラムダcI遺伝子の生産物により抑制され
る。ある種の化学薬品またはDNA損傷剤に応答して、細
菌は細菌性rec A遺伝子の生産物の合成を指令する。該r
ec A遺伝子生産物は蛋白加水分解的にcIレプレツサ蛋白
質を開裂し、溶菌相遺伝子の表現を可能にさせる。つい
で、フアージの増殖は、最終的にラムダDNAの自律複製
を開始させるいくつかのラムダ調節因子の相互作用を必
要とする。ラムダＰおよびＯ遺伝子の生産物がDNA複製
に必要とされる。DNA複製についで、フアージはウイル
ス構造蛋白質、すなわち、頭部および尾部蛋白質の合成
および無垢な中空ウイルス粒子中でのそれらの組立を指
令しなければならない。これを完了するには少なくとも
18個の遺伝子の相互作用を必要とする。最後に、該DNA
が中空ウイルス粒子中に包装されて感染性無垢ウイルス
粒子が形成され、菌体は、Ｑ遺伝子の生産物によつて活
性化されるラムダＳおよびＲ遺伝子によつてコードされ
た細胞内溶解素によつて破壊され、それにより、フアー
ジが放出する。Ｑ遺伝子はＮ機能によつて活性化され
る。Ｎ遺伝子はcI機能によつて抑制される。
キヤプシド組立に必要な該18個の遺伝子は遺伝地図の右
側転写鎖の約３位および36位の間（遺伝地図上の位置は
総ラムダDNAのパーセンテイジで表わしている）に存在
する。左から右へ、第１の遺伝子はＡ、ＷおよびＢで、
最後はＪである。正常な溶原菌では、Ｊ遺伝子の右側に
８個の細菌遺伝子がある。そのうちの５個、bio A、
Ｂ、Ｃ、ＤおよびＦがビチオンの生合成に包含される。
第６番目のuvr Bは紫外線照射耐性を与える。最後の２
つ、chl AおよびＥは塩素酸塩に対する感受性を与える
〔Guest,Mol.Gen,Genet.,105:285〜289（1969）;Steven
s et al.,“The Bacteriophage Lambda",ed.Hershey,前
出,pp515〜534参照〕。
天然の宿主細胞溶解において機能する他のラムダ遺伝子
はkil遺伝子である。kil遺伝子の機能は余りよく判明し
ていない。kil遺伝子を表現する細胞は誘発後、細胞増
殖速度が減少する。kil機能の喪失は細胞の正常な速度
での増殖、すなわち、誘発後、溶菌が起るまで対数期増
殖を可能とする。ＳおよびＲ遺伝子と同様、Kil遺伝子
はcIレプレツサーにより、Ｎ遺伝子を介し、間接的に制
御されている〔Greer,Virology,66:589〜604（1975）参
照〕。
温度感受性溶原菌はよく研究されている〔例えば、Camp
bell,Virology,14:22〜32（1961）参照〕。cI857遺伝子
は温度感受性cI変異体で、38℃以下で機能する〔Sussma
n et al.,C.R.H.Acad.Sci.Paris,254:1517〜1519（196
2）参照〕。同様なフアージ系が他の属で起ることが知
られている。例えば、ロモフスカヤら〔Lomovskaya et
al.,J.Virol.,９:258〜262（1972）〕はストレプトマイ
セス（Streptomyces）に感染するテンペレート・フアー
ジの温度感受性変異株を報告している。フロツク〔Floc
k,Mol.Gen.Genet.,155:241〜247（1977）〕はバチルス
（Bacillus）に感染するテンペレート・フアージphi−1
05の温度感受性変異株を報告している。ボトスタインら
〔Botstein et al.,Nature,251:584〜588（1974）〕は
サルモネラ（Salmonella）に感染するテンペレート・フ
アージP22の温度感染性変異株を報告している。ジヨス
トロームら〔Jostrom et al.,J.Bacteriol.,119:19〜32
（1974）〕およびトムプソン〔Thompson,J.Bacteriol.,
129:778〜788（1977）〕はスタフイロコツカス（Staphy
lococcus）に感染するテンペレート・フアージphi−11
の温度感受性変異株を報告している。ミラーら〔Miller
et al.,Virol.,59:566〜569（1974）〕はシウドモナス
（Pseudomonas）のテンペレート・フアージを報告して
いる。
ボトスタインら〔Botstein et al.,Ann.Rev.Genetics,1
6:61〜83（1982）〕による報告のようにラムダ細胞内溶
解素がフアージを吸収できるサルモネル株を溶解するこ
とが判明している。
ペリシヨーダら〔Perricaudet et al.,FEBS Lett.,56:7
〜11（1975）〕は、ラムダint、xis、red、gam、cIIIお
よびKil遺伝子を含むセグメントである遺伝地図の58位
および71位の間（△58〜71）のラムダ遺伝子の欠失を記
載している。
ヨーロツパ特許出願2084584号（Hershberger et al.）
はプラスミドの安定化および選択のため、宿主細胞とし
て溶原菌の使用を開示している。この発明者らは、例え
ば、欠損cI遺伝子を有する溶原菌の、機能cI遺伝子を有
するプラスミドによる形質転換を開示している。１つの
開示された具体例において、該機能cI遺伝子はcI857遺
伝子である。
転置因子、すなわち、宿主の染色体組換機構とは独立し
て組換できる遺伝子がマーカーとして宿主細胞に挿入で
きることが知られている。ロスら〔Ross et al.,Cell,1
6:721〜731（1979）〕は、転置テトラサイクリン耐性因
子tn10によつてプロモートされる欠失および逆位の物理
的構造を報告している。デイビスら〔Davis et al.,“B
acterial Genetics",Cold Spring Harbor Laboratory,N
ew York（1980）〕は転置因子の使用を記載している。
ラブカンら〔Ruvkun et al.,Neture,289:85〜88（198
1）〕は、転置カナマイシン耐性およびネオマイシン耐
性因子tn5を有するプラスミドの接合、ついで、相同組
換によるtn5のリゾビウム・メリロチ（Rhizobium melil
oti）染色体DNAへの組込みを報告している。相同フラン
キング配列の存在に由来する組換による非対応遺伝子の
組込もヨーロツパ特許出願第74808号に開示されてい
る。
発明の概要 本発明はテンペレート・フアージからの細胞内溶解素コ
ード付け遺伝子を用いる細菌内で生産物を産生する方法
を提供するものである。本発明の方法は、（ｉ）（ａ）
遺伝子生産物を細胞内に表現し、（ｂ）宿主細胞のゲノ
ムからランダファージを除去する機能及びランダファー
ジの複製機能を欠いている、遺伝子地図の58位と71位の
間の遺伝子が欠失し、ＯおよびＰ遺伝子が変異してＯお
よびＰ遺伝子機能を損失させるDNA配列を有するラムダ
ファージによる溶原菌であって、（ｃ）プロファージDN
A配列内に温度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子お
よび機能性ファージ・リゾチーム・コード付け遺伝子を
有する温度感受性細菌を遺伝子生産物が細胞内で表現さ
れ、かつリゾチーム・コード付け遺伝子が抑制されるよ
うな許容条件下で培養し、次いで、 （ii）温度を上昇させて、リゾチーム・コード付け遺伝
子が表現されるような制限条件を生じさせることからな
る。
発明の詳説 温度感受性細菌は、温度感受性レプレツサー遺伝子を含
み、１つの温度範囲（許容条件）にて培養した場合、レ
プレツサーが機能するが、もう１つの温度範囲（制限条
件）で培養した場合、レプレツサーが機能せず、レプレ
ツサーが表現されず、または安定でないフアージDNA配
列を有する細菌である。制限条件下、フアージ・リゾチ
ーム・コード付け遺伝子を含め、フアージ遺伝子が表現
され、菌体の溶解をもたらす。かかる温度感受性細菌が
溶菌性細菌である。本明細書に記載のようないずれの溶
菌性細菌も本発明の方法に使用できる。
温度感受性フアージ・レプレツサー遺伝子は入手するこ
とができ、あるいは公知の方法でかかる遺伝子を変異さ
せることにより調製できる。例えば、キヤンベル〔Camp
bell,Virology,14:22〜32（1961）〕は温度感受性フア
ージ変異株の単離を記載している。一般に、この方法
は、フアージ感染細菌に、紫外線照射によるなどして変
異誘発処理を行ない、生存菌を高温でインキユベートし
て、いずれかの温度感受性レプレツサー変異株の誘導を
生じさせることからなる。ついで、溶解質を感受性細菌
の感染に用いる。この新たな溶原菌を加熱誘発に付し、
加熱誘発後に生じたフアージを温度感受性細菌からの溶
原菌調製に用いる。このサイクル（溶原菌調製、誘発、
再調製）はフアージ・レプレツサー変異体の同定に通じ
る。典型的には、３〜４回のかかるサイクルがかかる変
異株を得るのに充分である。
以下の記載は大部分、溶菌性イー・コリ、ことに、cI85
7イー・コリ溶原菌に関する。けれども、これに限定す
るものではなく、ラムダまたは前記したテンペレート・
フアージのような他のテンペレート・フアージからのレ
プレツサーおよび細菌内溶解素コード付け遺伝子を用い
て他の溶菌性イー・コリならびに他の溶菌性細菌につい
ても同様に行なうことができる。
cI857溶原菌は公知であり、一般的に入手でき、38℃以
下で活性であるが、38℃を超えると不活性なcIレプレツ
サーを産生する。これらは、レプレツサーが38℃を超え
ると不活性になる変異に加えて、cI857遺伝子が、ラム
ダrec A遺伝子の生産物による蛋白加水分解的開裂に対
して該cIレプレツサー蛋白を不感性にする第２の変異を
含有するので他の温度感受性イー・コリ溶原菌より好ま
しい。すなわち、許容条件下で培養した場合、cIレプレ
ツサー蛋白は安定で、したがつて、免疫性を維持するの
に効率的である。
イー・コリUC5822株はcI857変異を有する溶原菌であ
る。また、該株はint遺伝子（int 6 am、アンバー変
異）およびＰ遺伝子（P3 am、アンバー変異）に点変異
を有する（アンバー変異は翻訳の終止を合図する。）。
一般に、UC5822株は、欠損性、すなわち、一般に感染性
フアージ粒子を生成しないので、例えば、MM294（cI85
7）株よりも好ましい。欠損性溶原菌は、ことに、ポリ
ペプチドを哺乳類に投与するのに用いる場合に好まし
い。しかしながら、UC5822株は低レベルのリゾチームを
産生し、これは、多分、該株が誘発後、ＳおよびＲ遺伝
子のより低い複写数、すなわち、MM294（cI857）より低
い複写数、すなわち、50〜100を有するためであるにも
かかわらず、UC5822株は誘発後、容易に溶解する。
本発明の方法における１つの態様において、温度感受性
細菌は、直接または間接的に所望の生成物をコードする
DNA分子により形質転換される。この形質転換は、DNA分
子が宿主細胞に入り、生産物を表現することを可能にす
るいずれの技術によつても行なうことができる。これら
の技術には、例えば、形質転換、形質導入、接合および
細胞融合が包含される。多くの適当な表現ベクターがよ
く知られており、生産物用の遺伝子クローニングおよび
細胞のかかる分子による形質転換のための技術と同様に
広く利用されている。一般に、生産物は非排泄性の非対
応遺伝子生産物、すなわち、天然には宿主によつて生産
されない、外在化されない物質である。直接表現される
生産物にはポリペプチドが包含され、間接的に表現され
る生産物にはポリペプチド、糖蛋白質、抗生物質およ
び、例えば、金属チオネイン産生細菌内に隔離すること
のできるような金属イオンのごとき他の分子が包含され
る。
形質転換宿主cI857溶原菌は、所望の生産物の表現に至
適な許容条件下（38℃、通常、32〜36℃）、無際限に
増殖できる。充分な増殖が達成されたとき、すなわち、
通常、対数増殖期中期（A650＝0.5）に達したとき、溶
原菌を制限条件下で培養したラムダ細胞内溶解素の合成
を誘発させる。これは、培養培地またはその濃縮物の温
度を、cI857株の場合、38℃より高く、好ましくは、42
〜44℃に約90〜120分間上昇させることにより行なえ
る。別法として、培養培地またはその濃縮物の温度を38
℃より高く、好ましくは、42〜44℃に短時間、すなわ
ち、フアージDNAを誘発するに充分な時間、好ましく
は、少なくとも約５分間上昇させ、ついで、温度を０〜
38℃、好ましくは、２〜36℃に低下させる。
溶菌がより効率的で、迅速であるので、制限条件を90〜
120分間維持することが好ましい。しかしながら、場合
により、例えば、所望の蛋白質が熱不安定性な場合また
は制限条件を維持する経費をさけるような場合には後者
の方法も好ましい。
宿主cI857株が機能ラムダcro遺伝子を有する場合、溶菌
が起るまで、細胞は細胞が機能するいずれの温度におい
てもリゾチームを合成しつづける。ラムダ細胞内溶解素
は０℃のごとき低温でも活性であるが、一般的に、蛋白
合成速度および触媒活性の低下ゆえに、溶菌に要する時
間は低温ではより長くなる。
誘発の直前または誘発後、好ましくは、細胞を、過、
遠心分離または他の手段により濃縮し、この濃縮物を溶
菌するまでインキユベートする。かかる方法は所望の生
産物の収集および精製を容易にする。誘発につづき、細
胞壁は実質的に分解する。プロトプラストの形の細胞は
所望の生産物を合成しつづけ、生産物は細胞膜を通して
多量に培地中に放出される。培地中への完全な放出は溶
菌によつて達成される。溶菌は培養培地またはその濃縮
物の清澄化および／または培養培地または濃縮物の粘度
増加によつて観察できる。溶菌は、例えば、機械的撹拌
または急激な培養条件の変化、例えば、温度を２〜25℃
の間で急激に変化させるか、培地または濃縮物の浸透圧
強度を変化させることにより増強することができる。好
ましくは、細胞を濃縮し、生産物含有上澄液をデカンテ
ーシヨンした後、誘発細胞を最少塩緩衝液または0.1Mト
リス緩衝液、50mM NaClおよび1mM EDTAに懸濁させ、撹
拌して溶菌を行なう。
ついで、公知の方法により、培地またはその濃縮物から
所望の生産物を回収し、所望により、精製する。
別法として、溶菌相の誘発前に全細胞を濃縮し、哺乳類
に経口投与する。ついで、体内で誘発が起り、所望のポ
リペプチドの放出をもたらす。この方法はことに、全細
胞ならびに所望の抗原が免疫保護応答を起させるのに好
適な場合に、動物に該抗原を投与するのに有用である。
例えば、LT−Ｂ抗原のような抗原をコードする遺伝子を
有する温度感受性溶原菌は直接ブタおよび／またはウシ
に摂取させることができる。各動物に投与する菌体の量
は有効用量を含有する菌体量である。単位量の菌体によ
つて産生される蛋白質量は公知の方法で計算することが
できる。
本発明の１つの態様は本発明の方法に用いる溶菌性細菌
を調製するのに使用できるDNAフラグメントを提供する
ことである。かかるDNAフラグメントは温度感受性レプ
レツサー遺伝子および機能性リゾチーム・コード付け遺
伝子を有する欠損フアージ配列からなる。かかる欠損ラ
ムダ配列からなるDNAフラグメントは細胞内溶解素が制
限条件下で表現されるような温度感受性cI遺伝子および
機能性ラムダ細胞内溶解素コード付け遺伝子（Ｎ、Ｑ、
ＳおよびＲ）、選択マーカーおよび、好ましくは、宿主
細胞染色体における隣接DNAと相同のフランキングDNA配
列を有する。１つの具体例において、該DNAフラグメン
トは、遺伝子地図の58位および71位間の遺伝子が欠失し
ており、したがつて、int、xisおよびkil遺伝子を欠
き、温度感染性cI遺伝子を有し、ＯおよびＰ遺伝子に変
異を有し、該cI遺伝子がcI857変異体で、制限条件下で
細胞内溶解素を産生するラムダDNAからなる。Ｏおよび
Ｐ変異は欠失または点変異とすることができる。O29、P
3およびP80変異のような点変異は、それらが容易に利用
できるので好ましい。P3変異はP80変異より好ましい。
他の具体例においては、フラグメントは、遺伝子地図の
３位および71位の間の遺伝子に実質的な欠失があるラム
ダDNAからなる。かかるフラグメントはラムダ・キヤプ
シド組立に必須の実質的に全ての遺伝子ならびにint、x
isおよびkil遺伝子が欠失している。
所望の生産物を産生する、または、例えば、遺伝子工学
的技術により、予めもしくはその後に所望の生産物を産
生するようにした宿主細胞、イー・コリまたは他の細菌
は、公知の技術により、温度感受性フアージ・レプレツ
サー遺伝子およびフアージ・リゾチーム・コード付け遺
伝子を有するフアージDNA配列で形質転換される。これ
には、かかる温度感受性レプレツサー遺伝子を有するテ
ンペレート・フアージ、好ましくは、欠損フアージでの
細菌の感染が包含される。また、公知の方法、例えば、
形質転換、形質導入、接合および融合により、細菌を本
発明のDNAフラグメントで形質転換させることが包含さ
れる。一般に、形質転換にはフアージまたはプラスミド
のようなベクターへのフラグメントの組込が包含され
る。例えば、フラグメントはpBR322等のようなプラスミ
ド中でクローンすることができ、該フラグメントに隣接
する配列に相同する隣接配列を欠くか、組換事象を欠損
している（rec-）適当な宿主中、invivoで生育できる。
該プラスミドは回収し、所望の生産物産生用の適当な宿
主の形質転換に使用できる。かかる宿主の形質転換につ
いで、宿主染色体における隣接DNA配列と相同のフラン
キングDNA配列を有するフラグメントを相同隣接配列の
サイトで自然に組換えることにより組込む。別法とし
て、所望の生産物を産生する適当な宿主は線型または環
型の分離DNAフラグメントで形質転換できる。
該DNAフラグメントは選択マーカーを有し、形質転換体
の選択を容易にする。選択マーカーは、典型的には、分
析可能な酵素をコードし、栄養要求宿主に原栄養性を復
元するか、致死もしくは抑制化合物、一般に、抗生物質
に対する耐性を与える遺伝子である。好ましくは、選択
マーカーは抗生物質耐性を与える遺伝子で、これらは、
入手できないか、あるいは自然に原栄養性に復帰する栄
養要求性宿主の使用を要しない。テトラサイクリンは安
価で、また、テトラサイクリン耐性は通常、自然には獲
得されないので、テトラサイクリン耐性が好ましい。
形質転換体におけるマーカーの存在は宿主が該DNAフラ
グメントからなつていることを示す。該DNAフラグメン
トと宿主細胞DNAの間の相同はラムダDNAに隣接する領域
およびマーカー中にのみ存在するので、該フラグメント
が組込まれれば、全フラグメントが組込れる。
DNAフラグメント中にマーカーがない場合、形質導入ま
たは形質転換操作後、ラムダDNAを有する宿主細胞の選
択は欠損フアージによる推定的形質導入体の重複感染
（非組込み）および免疫性生存細菌の選択が必要とされ
る。
本発明のDNAフラグメントの組込みにより溶菌性にした
イー・コリ株には、例えば、MG株が包含される。これら
の株は、そのラムダDNAが遺伝子地図の58位および71位
の間の遺伝子を欠失し、したがつて、int、xis、red、g
am、kilおよびeIII遺伝子を欠き、cI857変異を有し、Ｏ
およびＰ遺伝子に遺伝子を有し、制限条件下で細胞内溶
解素が表現されるように機能性Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝
子を有する溶原菌である。１つの具体例において、アン
バー・サプレツサー、すなわち、UAG翻訳終止コードン
の翻訳サプレツサーの宿主細胞DNAによる産生のため、
点（アンバー）変異株であるMG1株〔C600（λ△58〜71,
cI857,P3,O29）,SuII+,gal K,lac Z,thi,gal::tn10tet
Ｒ〕が解読され、ＯおよびＰ遺伝子が表現される。
本発明の方法で用いるさらに好ましい宿主細胞は表現型
的にO-およびP-のものである。１つの具体例において、
MG3株〔N99（λ△58〜71,cI857,P3,O29）,gal K,lac Z,
thi,gal::tn10 tetＲ〕はMG1株と同様なラムダDNAを有
する。しかし、この株は表現型的にO-およびP-で、tet
Ｒ，△kil,△intおよび△xisである。
もつとも好ましい溶菌性イー・コリはMG4株である。こ
れは実質的に全てのラムダ構造蛋白質、組立遺伝子およ
び正常な右側プロフアージー細菌接合点、すなわち、右
側結合サイト（attＲ）を欠失する株である。ことに、
これらは遺伝子地図の３位および71位間のラムダ遺伝子
の実質的に全てを欠失し、ＯおよびＰ遺伝子に点変異を
有し、制限条件下で細胞内溶解素が表現されるように温
度感受性cI遺伝子、機能性Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子を
有し、選択マーカー、すなわち、tn10テトラサイクリン
耐性転置因子を有する溶原菌である。かかる欠損溶原菌
はウイルス増殖に対する４つの独立した遮断を有してい
る。すなわち、（ｉ）ＯおよびＰ複製機能の喪失、（i
i）プロフアージの重複感染フアージからのintおよびxi
s遺伝子による相補をできなくさせるattＲの喪失、（ii
i）ラムダ構造遺伝子のコード不能および（iv）ラムダD
NAの大きさが包装に必要な最小の大きさよりはるかに小
さいことである。これらは、最初に、MG株のようなcI85
7、O-、P-溶原菌株に塩素酸塩ストレスを加えて塩素酸
塩耐株性を産生し、ＡおよびＢ機能欠損の重複感染異種
免疫もしくはビルレント・ラムダまたはラムドイド・フ
アージの増殖を相補できない変異株を選択することによ
り調製できる。該マーカー、ラムダDNAおよび該イー・
コリ染色体からのフランキング配列からなるDNAフラグ
メントは、例えば、制限エンドヌモレアーゼによる処理
またはP1形質導入によつてMG4株から単離できる。
MG4は、ウイルス構造成分をコードするバクテリオフア
ージ遺伝子の全部または大部分を欠失させることにより
MG3から誘導できる。これらの遺伝子の喪失を保証する
ためには、MG4中のウイルス・ゲノムが、それ自体これ
らの遺伝子を欠損している重複感染フアージを相補およ
び増殖させることができないことを証明すれば充分であ
る。λシヤロン3A（λA-,B- imm80）がこの重複感染に
使用できるフアージの例である。別法として、異種免疫
またはビルレント・フアージ（λvir）の存在下、Ａま
たはＢにアンバー変異を有するか、他のウイルス構造シ
ストロンを有するいずれかのフアージを感受性イー・コ
リ上で平板培養することができる。該２つのフアージ間
で組換が起り、組換体、例えば、virA-の形成をもたら
す。組換体の頻度は実験条件に依存して、１〜50％の間
である。組換体は、それらがサプレツサー含有溶原菌
〔Ymel（λ）〕上で平板培養できることおよび、それら
がN99のような非抑圧、λ感受性株上でプラークを形成
しないことにより認識できる。この交差で得られるプラ
ークをYmel（λ）またはN99を入れたペトリ皿上で平板
培養し、組換体を精製する。Ａおよび／またはＢ遺伝子
機能を欠損するラムダ・フアージは、それらのラムダ・
ゲノム上の位置ゆえに、これらの機能を相補できないMG
4株が他のラムダ構造遺伝子の全てを欠失することにな
るので好ましい。欠損フアージおよび宿主をこのように
使用することは「マーカー救済」と称され、広く実施さ
れている（例えば、“The Bacteriophage Lambda",ed.
A.D.Hershey,Cold Spring Harbor Laboratory,1971,Ste
vens et al.,pp515〜533参照）。
本発明はいずれの細菌生産物の製造にも使用できる。そ
の例は非常に多く、とりわけ、インシユリン、狂犬病糖
蛋白質、K99および987P抗原、抗生物質、生長ホルモ
ン、金属チオネイン、α−１−抗トリプシン、インフル
エンザ抗原、リンフオカインおよびインターフエロンが
包含される。加えて、本発明は、従来必要とされている
溶菌工程を回避して、操作を非常に簡単に、かつ、操作
時間を短縮できるので、コロニー・スクリーニング、RN
A単離およびプラスミド調製にも用いることができる。
つぎに実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明する
が、これらに限定されるものではない。実施例中、全て
の出発材料は容易に入手できるか、公知の技術によつて
容易に調製できる。形質導入は実質的にエクスペリメン
ツ・イン・モレキユラー・ジエネテイツクス〔“Experi
ments in Molecular Genetics",ed.J.H.Miller,Cold Sp
ring Harbor Laboratory,New York（1972）,pp.201〜20
5〕の記載に従つて行なつた。
実施例１ MGOの調製 C600株（イー・コリSuII+,K12,gal K,lac Z,suII,thi）
をλcI857 P3 O29（ウイスコンシン大学、W.Syzbalski
氏提供）の存在下でインキユベーシヨンした。32℃で一
夜増殖させ、生存細菌を分離、精製した。これらの細菌
の80％が重複感染に対して免疫性であり、44℃で増殖で
きず、44℃にさらした後、λcI857 P3 O29と区別できな
いラムダ・フアージ〔該フアージがC600株上ではプラー
クを生じるが、N99株（イー・コリK12,gal K,lac Z,su
O,thi）上では生じないことで判定〕を産生することが
判明した。これらの生存細菌群の１つを精製し、MGO（C
600（λcI857 P3 O29））と命名した。
実施例２ MGO−AR6の調製 N5151株（イー・コリK12,SA500,gal K,lac Z,pro,thr,h
is,gal 8（λcI857△58〜71△H1））を、予めAR4株（イ
ー・コリK12,gal::tn10（Plcm100））上で増殖させたPl
m100フアージの存在下でインキユベーシヨンした。N515
1およびAR4上で増殖させたPlm100の交差はテトラサイク
リン耐性、UV感受性、温度感受性溶原菌を生じさせた。
これらの単離物の１つを精製し、MGO−AR6（イー・コリ
K12,gal 8,gal::tn10λ△58〜71 cI857△H1（bio uvr
B））と命名した。
実施例３ MG1の調製 MGO−AR6は、Plcm 100の存在下にインキユベーシヨンし
たAR6の生存菌を単離することによりPlcm 100溶原菌に
なつた。MGO−AR6のPlcm100溶原菌をMGO−AR18と命名し
た。
MGO株を、MGO−AR18上で増殖させたPlcm100によりP1形
質導入して交差させた。フアージを吸収させた後、菌体
を4J/m2のUV照射（UV線量計で測定した場合、2J/m2/sの
割合の254nmの光の照射）に付し、テトラサイクリンの
存在下でインキユベーシヨンした。テトラサイクリン耐
性コロニーの11％がUV光に耐性を示し、それらがH1欠失
を有せず、したがつて、それらがcIからフアージの右側
端までのラムダ遺伝子を有していることを示した。こと
に、このことはこれらのコロニーがP3およびO29変異
と、無垢のＳおよびＲ遺伝子を有していることを意味し
ている。UV耐性、テトラサイクリン耐性菌の1/3はフア
ージを産生しなかつた。したがつて、これらはラムダの
58〜71欠失を獲得し、それ故、int、xisおよびkil遺伝
子を欠失したと判断された。この群を精製し、MG1（（C
600）（λ△58〜71,cI857 P3 O29）,SuII+,gal K,lac
Z,thi,gal::tn10 tetＲ）と命名した。
実施例４ MG1をPlcm100の存在下でインキユベーシヨンし、生存菌
を精製した。これらの生存菌のうち、非常に高い割合で
Plcm100溶原菌となつたMG1菌体が同定された。MG1のPlc
m100溶原菌を精製し、MG2と命名した。
N99株を、MG2上で増殖させたPlcm100でPlcm100形質導入
により交差させた。テトラサイクリン耐性の形質導入体
を選択した。これらの全てはラムダに対して免疫性で、
したがつて、ラムダ溶原菌と判断された。これらの溶原
菌の１つを精製し、MG3（N99（λ△58〜71 cI857 P3 O2
9））と命名した。
MG3を44℃に90〜120分間さらして溶菌を測定した。該温
度にさらす前および後、菌体培養中には全くフアージは
見出されなかつた（3.3×108細胞/mlの培養0.1ml当り＜
１）。フアージの存在はC600菌体上で検定した。非欠損
ラムダ・プロフアージを有するイー・コリ株の対照培養
は3.3×108細胞/mlの培養1ml当り、105〜109個のフアー
ジを含有していた。
実施例５ MG3の調製 実質的に前記実施例と同様に、ただし、N99株をλcI857
P3 O29で直接溶原菌化してMG3株を調製した。得られた
溶原菌をMGO−AR18株でP1形質導入することにより交差
させ、温度誘発により溶菌するが、フアージを産生しな
いテトラサイクリン耐性溶原菌を選択した。
実施例６ UC5822の調製 N99株をλint 6 red 3 cI857 P80およびλ hy 5 cI imm
21 △b2で感染させてUC5822株を調製した。λhy 5 cI
imm21 △b2はフアージλおよびフアージ21のハイブリツ
ドである。この調製におけるλhy 5 cI imm 21 △b2の
目的は、λ int 6 red 3 cI857 P80がこの株を溶原菌化
するために必要なトランス状態でint機能を付与するこ
とにある。△b2変異は△hy5 cI imm 21 △b2フアージの
それ自体の該株への組込の指令をできなくする。ラムダ
の重複感染に免疫性であるが、フアージ21に対して感受
性を示すこの交差の生存菌を精製し、UC5822と命名し
た。この株は44℃にさらすと生存しなかつた。44℃にお
けるインキユベーシヨンの前後で、UC5822の培養中にフ
アージは全く検出できなかつた。
実施例７ MG4の調製 MG3の培養菌をルリア（Luria）ブロスまたは他の完全培
地中、A650＝0.5となるまで32℃で増殖させた。培養物
は約５×108細胞/mlを含有していた。ついで、培養物
を、0.2％グルコースおよび0.2％KClO3を補足した栄養
寒天平板上で平板培養した。平板を嫌気性条件下、32℃
でコロニーが形成されるまで（３〜５日間）インキユベ
ーシヨンした。かかる条件下、この培地上での増殖によ
り、chl A、Ｂ、ＣまたはＤ遺伝子に変異を有するイー
・コリを選択した（“Expts.in Molecular Genetics",
J.Miller,pp.226〜227参照）。
chl B、ＣまたはＤにおける変異はMG4の単離にはつなが
らない。変異のうち、chl Aの表現に影響するのはchl A
における点変異およびchl Aの左側または右側に伸びる
欠失である。chl Aの左側に伸びる欠失は隣接するuvr B
遺伝子の破壊をきたし得、それ故、生物にUV感受性表現
型を与える。同じ理由で、chl Dから右側へ伸びる欠失
も生物にUV感受性表現型を与え得る。嫌気性インキユベ
ーシヨンで得られた塩素酸塩耐性コロニーがUV感受性で
あるか否かを決定するためにテストする。これは、塩素
酸塩耐性コロニーをペトリ皿上で画線し、ペトリ皿の1/
2をカバーし、他の半分を254nmUV光の10J/m2照射に付す
ことにより、都合よく行なえる。この線量はUV感受性菌
体を殺すが、UV耐性変異株は殺さないために充分な量で
ある。UV感受性変異株（chl Aまたはchl Dにおける変異
からなる）の欠損ラムダ・フアージの存在をテストす
る。これは、同種免疫フアージの画線を介して菌体を交
差画線することにより行なえる。ラムダ感受性細菌は交
差画線のところでフアージによつて殺され、ラムダ溶原
菌は重複感染に対して免疫性であり、殺されない。chl
Aおよびchl D遺伝子、ラムダ・ゲノムおよびuvr B遺伝
子の所在の結果、全てのUV感受性chl A変異株はラムダ
溶原菌となりうる。したがつて、UV感受性、ラムダ溶原
菌は左側にuvr B中へ伸びるchl Aの欠失を含む。該欠失
がuvr Bを通過して伸びる場合、ビオチン・オペロン
中、また、多分、構造ラムダ遺伝子中へ伸びることがで
きる。この方法により、構造ラムダ遺伝子の欠失が得ら
れている（Grier,Virology,66:589〜604（1975））。全
てのuv感受性、chl A-、ラムダ溶原菌をλvir A-で感染
させる。2.5時間後、λvir A-フアージおよびλvir A+
組換体について、溶解物の平板培養を行なう。λvir A-
の増殖および／またはλvir A+フアージの産生のあつた
MG4候補株をすてる。λvir A-の相補またはvir A+の産
生をしない株はchl AからラムダのＡ遺伝子まで伸びる
欠失を有している。chl AからラムダのＡ遺伝子までの
欠失を有するMG4候補株の溶菌細菌特性（＞38℃の増殖
の際の溶菌）についてテストする。欠失を有し、溶菌細
菌特性を保持している株をMG4として精製する。
実施例８ MM294（cI857）およびUC5822におけるクローニング イー・コリMM294株をλcI857の存在下でインキユベート
した。32℃で一夜増殖後、生存細菌を単離し、精製し
た。重複感染に免疫で、44℃で増殖できず、フアージを
産生できないクローンを分離した。得られたcI857溶原
株、MM294（λcI857）およびイー・コリUC5822株をCaCl
2処理によつてコンピテント菌とし、イー・コリLT−Ｂ
抗原ならびにアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性
についての遺伝子を有するプラスミド、pND5で形質転換
した。
両方の溶菌細菌株のアンピシリンおよびテトラサイクリ
ン耐性形質転換体は標準栄養ブロス中、30〜32℃でよく
増殖し、LT−Ｂ抗原を表現した。細菌を遠心分離により
ペレツト化し、42℃の標準栄養ブロスに移す。約90〜12
0分以内に、細胞溶解が明白になり、実質的に完了し
た。LT−Ｂ抗原がブロス中に放出された。４×107細胞/
mlからなるMM294（cI857）形質転換体の試料において、
1ml当り、約２×108個のラムダ・フアージを収集した。
UC5822形質転換体の同様な試料中では、全くフアージは
収集されなかつた（＜20個/ml）。
実施例９ UC5822におけるクローニング イー・コリLT−Ｂ抗原の遺伝子を有するプラスミドpESS
2を含有するイー・コリUC5822の種培養をアンピシリン
含有Ｌブロスの5ml試験管中でインキユベートした。６
時間後、試験管内容物をアンピシリンを含有する培地50
0mlに移し、32℃で一夜振とうしながらインキユベート
した。該一夜培養物400mlを、バーテイス（Virtis）・
ベンチ・トツプ醗酵器中、アンピシリン含有培地10に
移した。培養物を32℃に保持し、各時間ごとに試料100m
lについてA420における増殖をモニターした。４時間目
に、培養物に50％デキストロース200mlおよび消泡剤0.1
mlを加えた。８時間目、培養物は4.8A420単位となり、4
3℃に変化させた。10時間目、培養物に再び50％デキス
トロース200mlを加え、14時間目に培養を停止した。４
時間目、６時間目、８時間目、９時間目、10時間目、1
0.6時間目および14時間目の細胞濃縮物（ペレツト）お
よび細胞上澄液の試料のLTＢについて、既知濃度のLTＢ
を標準とするエライサ（ELISA）テストを用いてテスト
した。
結果を第１表に示す。最初の４〜８時間、LT−Ｂの90％
以上が細胞内に存在していたが、温度変化後２時間（接
種後10時間）、LT−Ｂの90％が上澄液中に存在した。温
度変化後６時間目、LT−Ｂの95％が上澄液中にあり、LT
−Ｂは総蛋白質の8.5％に相当した。LT−Ｂの収率はpES
S2で形質転換したイー・コリMM294からの収率よりもは
るかに大きかつた。
温度変化後、２〜４時間以内に培地の粘度上昇および可
視細胞片によつて溶菌が明らかとなつた。温度変化後４
〜６時間まで、粘度は大いに減少し、培養物は容易にポ
ンプで限外過装置に通して全細胞片および残つた未溶
解細胞を除去できた。粘度の増加は高分子量DNAおよびR
NAの培地への放出を反映し、内因性ヌクレアーゼの作用
が究極的に著しい粘度の減少をもたらす。
実施例10 溶菌性サルモネラの調製 接合またはDNA形質転換により、サルモネラおよびMG3の
間で種間交差を行なう。サルモネラ株は正常にはテトラ
サイクリン感受性であり、MG3はテトラサイクリン耐性
である。テトラサイクリン耐性となつたサルモネラ組換
体の42℃における増殖能力をテストする。この温度で溶
解するサルモネラは組換を通じてMG3の溶菌性細菌機能
を獲得する。この実験は、（１）ラムダ溶菌性機能がサ
ルモネラで表現されること、および（２）サルモネラと
イー・コリ（MG3）の間に該遺伝子と側面を接するイー
・コリ配列のサルモネラ中への組換を可能にする充分な
相同性が存在することにより可能である。
実施例11 溶菌性バチルスの調製 第１法 宿主の溶解を指令するに充分な遺伝因子にはλcI857、
Ｎ、Ｑ、ＳおよびＲ遺伝子およびＰＬプロモータが包含
される。これらの遺伝子の制限地図は公知である（Mole
cular Cloning,Maniatis et al.,Cold Spring Harbor L
aboratory,N.Y.）。これらの遺伝子はラムダからプラス
ミド（例えば、pBR322）上にサブクローンされる。バチ
ルスからのDNAのフラグメントをプラスミド中、非必須
部分のサイトに挿入する。宿主株DNAの性質または機能
あるいはそのプラスミド中における方向づけに特性を与
える必要はない。ついで、バチルスを精製プラスミドDN
Aと共にインキユベーシヨンし、抗生物質耐性形質転換
体を選択する。これらの形質転換体をテストし、高温に
さらした後、溶菌するか否かを測定する。これらの形質
転換体において、ラムダ遺伝子を含有するプラスミドは
自律的複製単位として存在するか、プラスミドおよび染
色体上の相同バチルスDNA間の組換事象を介して宿主染
色体中に組込まれる。バチルス染色体中に複製できない
プラスミドによつて担持されるDNAの組込みは公知であ
る（Haldenway et al,J.Bact.142:90〜98,1980）。この
方法は受容宿主株中でのラムダ溶菌遺伝子の表現を必要
とするが、MG3のイー・コリ配列と受容細菌株との間の
相同性は要求しない。
第２法 フアージphi−105はバチルスに感染し、テンペレート・
フアージで、変異できるcI様レプレツサーを有してい
る。このレプレツサーに影響を及ぼす温度感受性変異を
有するphi−105の誘導体を調製することができる。除去
もしくは複製機能を欠くフアージ誘導体は変異誘発処理
または欠損株の単離によつて分離できる（Flock,Mol.Ge
n.Genet.,155:241〜247,1977）。熱不安定性レプレツサ
ーを有するフアージ誘導体を得る。この変異体の溶原菌
は、感受性細胞を30℃にて該フアージ感染し、生存細胞
を分離し、これらの細胞の重複感染フアージに対する免
疫および40℃において増殖不能なことをテストすること
により調製される。かかる生物はフアージ産生溶菌性細
菌である。欠損溶菌性細菌を分離するため、細菌を変異
誘発処理し、生存コロニーを、phi−105感受性バチルス
の未発達ローン上でレプリカ平板培養を行なう。高温に
さらした後、ローン上でほとんど、または全くフアージ
を産生しない温度感受性コロニーはフアージ増殖に影響
を及ぼす変異を有している。変異誘発処理のくり返しに
より、より多くのストリンジエント変異株を得ることが
できる。この構造を可動化し、この構造の移動を容易に
選択するために、phi−105ゲノムに結合した抗生物質耐
性マーカーを有する誘導体を分離することが好ましい。
これは、バチルス染色体のラムダム・フラグメントを、
pBR322のような、抗生物質耐性決定子を有する、バチル
ス中で複製できないプラスミドにクローニングすること
により行なえる。形質転換した、薬剤耐性細胞が単離さ
れ、これは組込みプラスミドを有している。これらの細
胞のいくつかにおいて、プラスミドはphi−105のサイト
の近くに組込まれている。薬剤耐性コロニーの非分割プ
ールを普遍バチルス導入フアージ、pBS1で感染させる。
pBS1のストツクは、イー・コリにおけるPlcm100が機能
すると正確に同じ方法でバチルス中で機能し、バチルス
細胞を薬剤耐性に形質導入するために用いられる。これ
らの薬剤耐性形質導入体をテストし、それらが温度感受
性で、溶菌性細菌であるか否かを測定する。形質導入体
の約１％が溶菌性細菌特性を獲得している。
以上説明した本発明の方法および組成物は細菌生産物の
産生および外在化に有用である。以上は本発明の好まし
い具体例についての記載であるが、本発明の精神を逸脱
することなく、種々の変形を加えることができ、それら
も本発明範囲のものである。

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ｉ）（ａ）遺伝子生産物を細胞内に表現
    し、 （ｂ）宿主細胞のゲノムからラムダファージを除去する
    機能及びラムダファージの複製機能を欠いている、遺伝
    子地図の58位と71位の間の遺伝子が欠失し、ＯおよびＰ
    遺伝子が変異してＯおよびＰ遺伝子機能を損失させるDN
    A配列を有するラムダファージによる溶原菌であって、 （ｃ）プロファージDNA配列内に温度感受性ファージ・
    レプレッサー遺伝子および機能性ファージ・リゾチーム
    ・コード付け遺伝子を有する温度感受性細菌を遺伝子生
    産物が細胞内で表現され、かつリゾチーム・コード付け
    遺伝子が抑制されるような許容条件下で培養し、次い
    で、 （ii）温度を上昇させて、リゾチーム・コード付け遺伝
    子が表現されるような制限条件を生じさせること を特徴とする遺伝子生産物の産生法。
  2. 【請求項２】温度感受性ファージ・レプレッサー遺伝子
    が温度感受性ラムダcI遺伝子である特許請求の範囲第
    （１）項記載の産生法。
  3. 【請求項３】cI遺伝子がcI857変異体である特許請求の
    範囲第（２）項記載の産生法。
  4. 【請求項４】細菌がイー・コリ（E.coli）ラムダ溶原菌
    である特許請求の範囲第（２）項記載の産生法。
  5. 【請求項５】細菌がイー・コリUC5822株である特許請求
    の範囲第（４）項記載の産生法。
  6. 【請求項６】ラムダ・プロファージDNA配列が、選択可
    能な形質をコードしている遺伝子である選択マーカーに
    隣接し、ＯおよびＰ変異が点変異である特許請求の範囲
    第（１）項記載の産生法。
  7. 【請求項７】ラムダ・プロファージDNA配列が上流端でt
    n10転置テトラサイクリン耐性因子に隣接し、Ｏおよび
    Ｐ遺伝子がO29およびP3遺伝子である特許請求の範囲第
    （６）項記載の産生法。
  8. 【請求項８】細菌がイー・コリMG株である特許請求の範
    囲第（６）項記載の産生法。
  9. 【請求項９】細菌がMG3株である特許請求の範囲第
    （６）項記載の産生法。
  10. 【請求項１０】ラムダ・プロファージDNA配列が遺伝子
    地図の３位と71位との間の遺伝子を欠失している特許請
    求の範囲第（１）項記載の産生法。
  11. 【請求項１１】ラムダ・プロファージDNA配列が選択可
    能な形質をコードしている遺伝子である選択マーカーに
    隣接し、ＯおよびＰ変異が点変異である特許請求の範囲
    第（10）項記載の産生法。
  12. 【請求項１２】ラムダ・プロファージDNA配列が上流端
    でtn10転置テトラサイクリン耐性因子に隣接し、Ｏおよ
    びＰ遺伝子がO29およびP3遺伝子である特許請求の範囲
    第（11）項記載の産生法。
  13. 【請求項１３】細菌がイー・コリMG4株である特許請求
    の範囲第（11）項記載の産生法。
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