JPH0772200B2 - 人フィブリンｉｉのｎｈ２ 末端フラグメントに対するモノクロナール抗体 - Google Patents
人フィブリンｉｉのｎｈ２ 末端フラグメントに対するモノクロナール抗体Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規なハイブリドーマ
（ハイブリット細胞系）、すなわち各々１９８３年１１
月９日および１９８３年１１月１６日に提出されたＡＴ
ＣＣＨＢ８４１８およびＡＴＣＣＨＢ８４２６に関す
る。さらに詳細には、本発明は、そのような新規なハイ
ブリドーマの各々からモノクロナール抗体たとえばフィ
ブリノーゲンから誘導される生体内フラグメントに対し
て特異性のある抗体の製造、およびこれらの抗体を用い
る診断および治療方法および組成物に関する。
（ハイブリット細胞系）、すなわち各々１９８３年１１
月９日および１９８３年１１月１６日に提出されたＡＴ
ＣＣＨＢ８４１８およびＡＴＣＣＨＢ８４２６に関す
る。さらに詳細には、本発明は、そのような新規なハイ
ブリドーマの各々からモノクロナール抗体たとえばフィ
ブリノーゲンから誘導される生体内フラグメントに対し
て特異性のある抗体の製造、およびこれらの抗体を用い
る診断および治療方法および組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】フィブリノーゲンは、３つの異なるポリ
ペプチド鎖からなる大きな（Ｍｒ３４０，０００）二量
体分子である。フィブリノーゲン−フィブリン遷移はフ
ィブリノペプチドの継続的放出を伴う。この二段トロン
ビン媒介プロセスでは、フィブリンＩは初期生成物であ
り、ＦＰＡ〔フィブリノペプチドＡ（Ａα１−１６）〕
の放出に続いて形成される。
ペプチド鎖からなる大きな（Ｍｒ３４０，０００）二量
体分子である。フィブリノーゲン−フィブリン遷移はフ
ィブリノペプチドの継続的放出を伴う。この二段トロン
ビン媒介プロセスでは、フィブリンＩは初期生成物であ
り、ＦＰＡ〔フィブリノペプチドＡ（Ａα１−１６）〕
の放出に続いて形成される。
【０００３】よりコンパクトな構造体であるフィブリン
IIはＦＰＢ〔フィブリノペプチドＢ（Ｂβ１−１４）〕
が放出された際に生成する（Blombaeck et al., Natur
e,Lond.,257,501-505,1978)。血管統合性を回復するに
は、フィブリン（フィブリンＩであれまたはIIであれ）
沈着物の溶解が必要である。これは主としてプラスミン
経路を介して達成される（Kernoff and McNicol,Br.Me
d.Bull.,33,239-244,1977およびCollen, Thromb. Haemo
stas., 43,77-89,1980)。
IIはＦＰＢ〔フィブリノペプチドＢ（Ｂβ１−１４）〕
が放出された際に生成する（Blombaeck et al., Natur
e,Lond.,257,501-505,1978)。血管統合性を回復するに
は、フィブリン（フィブリンＩであれまたはIIであれ）
沈着物の溶解が必要である。これは主としてプラスミン
経路を介して達成される（Kernoff and McNicol,Br.Me
d.Bull.,33,239-244,1977およびCollen, Thromb. Haemo
stas., 43,77-89,1980)。
【０００４】フィブリノーゲンまたはフィブリンの初期
プラスミン分解産物の１つは、Ｂβ鎖のＮＨ2 −末端部
分から誘導される。結合Ｂβ４２Ａｒｇ−４３Ａｌａは
プラスミンに特に敏感である（Mosesson et al.,J.Bio
l.Chem.,247,5210-5219,1972;Takagi and Doolittle, B
iochemistry, 14,940-946,1975)。プラスミンにより放
出されるＢβ鎖ペプチドの性状は利用出来る基質に依存
する。フィブリノーゲンまたはフィブリンＩの分解によ
り、ペプチドＢβ１−４２を含有するＦＰＢが生じる。
もちろん、後者は、ペプチドＢβ１５−４２の放出を生
じるフィブリンIIのプラスミンタンパク質加水分解にお
いて生じ得ない。
プラスミン分解産物の１つは、Ｂβ鎖のＮＨ2 −末端部
分から誘導される。結合Ｂβ４２Ａｒｇ−４３Ａｌａは
プラスミンに特に敏感である（Mosesson et al.,J.Bio
l.Chem.,247,5210-5219,1972;Takagi and Doolittle, B
iochemistry, 14,940-946,1975)。プラスミンにより放
出されるＢβ鎖ペプチドの性状は利用出来る基質に依存
する。フィブリノーゲンまたはフィブリンＩの分解によ
り、ペプチドＢβ１−４２を含有するＦＰＢが生じる。
もちろん、後者は、ペプチドＢβ１５−４２の放出を生
じるフィブリンIIのプラスミンタンパク質加水分解にお
いて生じ得ない。
【０００５】フィブリノーゲンおよびフィブリンのトロ
ンビンおよびプラスミン分解産物の同定および定量は貴
重な診断テストとして役立ち得る。過去１０年間の間、
この目的のために多数の免疫検定法が開発された。これ
らの免疫検定法のほとんどで通常の免疫感作により調製
される抗血清が使用されている。そのような抗血清は種
々の力価、親和性および特異性の抗体を含有しているの
で、多数の問題に遭遇する。
ンビンおよびプラスミン分解産物の同定および定量は貴
重な診断テストとして役立ち得る。過去１０年間の間、
この目的のために多数の免疫検定法が開発された。これ
らの免疫検定法のほとんどで通常の免疫感作により調製
される抗血清が使用されている。そのような抗血清は種
々の力価、親和性および特異性の抗体を含有しているの
で、多数の問題に遭遇する。
【０００６】たとえば、フィブリノーゲンおよびフィブ
リンのあるフラグメントに見い出される分解−会合した
ネオ抗原に対する抗体は一般に著しく低い力価で存在す
る（Plow and Edgington, J.Clin.Invest., 52,273-28
2,1973:J.Biol.Chem., 250 ,3386-3392,1975)。交差反
応性に関しては、大抵の抗血清は無傷のフィブリノーゲ
ンと反応し、したがって、血漿サンプルは無傷フィブリ
ノーゲンを選択的に除去するために処理工程を必要とす
る。調製された抗血清では、ＦＰＡおよびＦＰＢの両方
に対する免疫反応性に著しい差が見られる（Confiold e
t al.,Biochemistry, 15,1203-1208,1976;Wilner et a
l.,Biochemistry, 15,1209-1213,1976;Bilezikian at a
l.,J.Clin.Invest.,56,438-445,1975)。これらの抗血清
のあるものは、遊離ＦＰＡまたはＦＰＢより長いごく少
数のアミノ酸残基であるペプチドとの交差反応性に限界
がある。
リンのあるフラグメントに見い出される分解−会合した
ネオ抗原に対する抗体は一般に著しく低い力価で存在す
る（Plow and Edgington, J.Clin.Invest., 52,273-28
2,1973:J.Biol.Chem., 250 ,3386-3392,1975)。交差反
応性に関しては、大抵の抗血清は無傷のフィブリノーゲ
ンと反応し、したがって、血漿サンプルは無傷フィブリ
ノーゲンを選択的に除去するために処理工程を必要とす
る。調製された抗血清では、ＦＰＡおよびＦＰＢの両方
に対する免疫反応性に著しい差が見られる（Confiold e
t al.,Biochemistry, 15,1203-1208,1976;Wilner et a
l.,Biochemistry, 15,1209-1213,1976;Bilezikian at a
l.,J.Clin.Invest.,56,438-445,1975)。これらの抗血清
のあるものは、遊離ＦＰＡまたはＦＰＢより長いごく少
数のアミノ酸残基であるペプチドとの交差反応性に限界
がある。
【０００７】Koebler and Milstein, Nature, 256 ,495
-497,1975,によるハイブリドーマ技術の開発により、フ
ィブリノーゲンまたはフィブリン分解産物を取り扱うほ
とんどの免疫検定法の改善が可能になるかも知れない。
-497,1975,によるハイブリドーマ技術の開発により、フ
ィブリノーゲンまたはフィブリン分解産物を取り扱うほ
とんどの免疫検定法の改善が可能になるかも知れない。
【０００８】Koebler and Milstein による免疫された
マウスからの脾細胞へのマウス骨髄腫細胞の融合によ
り、モノクロナール抗体を産生する無限増殖性細胞系を
得ることが出来ることが始めて証明された。その後、種
々のハイブリッド細胞系（ハイブリドーマ）の形成およ
びこれらのハイブリドーマにより産生される抗体の使用
に多くの努力が向けられた（たとえば、F.Melchers,M.P
otler,and N.Warner,eds.,Current Topics in Microbio
logy and Immunology, 81-"Lymphocyte Hybridomas",S
pringer-Verlag,1978 およびそこに引用されている文
献；C.J.Barnstable,et al.,Cell, 14,9-20,May,1978;
P.Parham and W.F.Bodmer, Nature, 276 ,397-399 Nove
mber,1978;D.M.Wier,ed.,Handbook of Experimental Im
munology,第３版、２,Blackwell,1978,Chapter 25; お
よびChemical and Engineering News.,Jan.1,1979,15-1
7)。
マウスからの脾細胞へのマウス骨髄腫細胞の融合によ
り、モノクロナール抗体を産生する無限増殖性細胞系を
得ることが出来ることが始めて証明された。その後、種
々のハイブリッド細胞系（ハイブリドーマ）の形成およ
びこれらのハイブリドーマにより産生される抗体の使用
に多くの努力が向けられた（たとえば、F.Melchers,M.P
otler,and N.Warner,eds.,Current Topics in Microbio
logy and Immunology, 81-"Lymphocyte Hybridomas",S
pringer-Verlag,1978 およびそこに引用されている文
献；C.J.Barnstable,et al.,Cell, 14,9-20,May,1978;
P.Parham and W.F.Bodmer, Nature, 276 ,397-399 Nove
mber,1978;D.M.Wier,ed.,Handbook of Experimental Im
munology,第３版、２,Blackwell,1978,Chapter 25; お
よびChemical and Engineering News.,Jan.1,1979,15-1
7)。
【０００９】これらの文献には、ハイブリドーマからモ
ノクロナール抗体を産生しようとする際に固有に存在す
る問題が指摘されている。一般的な技術は良く理解され
ているけれども、各特定の場合には多くの困難と変更が
存在する。実際の所、ある一定のハイブリドーマを調製
しようとする前に、所望のハイブリドーマが得られるこ
と、得られた場合にそのハイブリドーマが抗体を産生す
ること、またはそのようにして得られる抗体が所望の特
異性を有すること、の保証はない。成功の度合は、主と
して使用する抗原の種類および所望のハイブリドーマの
単離に使用される選択技術によって左右される。
ノクロナール抗体を産生しようとする際に固有に存在す
る問題が指摘されている。一般的な技術は良く理解され
ているけれども、各特定の場合には多くの困難と変更が
存在する。実際の所、ある一定のハイブリドーマを調製
しようとする前に、所望のハイブリドーマが得られるこ
と、得られた場合にそのハイブリドーマが抗体を産生す
ること、またはそのようにして得られる抗体が所望の特
異性を有すること、の保証はない。成功の度合は、主と
して使用する抗原の種類および所望のハイブリドーマの
単離に使用される選択技術によって左右される。
【００１０】従来の研究によれば、ＣＮＢｒによるフィ
ブリノーゲンの生体内分解により主要ＮＨ2 末端フラグ
メント、いわゆるＮ−ＤＳＫが放出されることが判明し
ている（Blombaeck et al., Nature, 218 ,130-134,196
8)。フィブリノーゲンのＮ−ＤＳＫ部分は酵素活性化の
結果として現われかつフィブリノーゲンのフィブリンへ
の遷移において作用する結合または重合ドメインを含有
する（Kudryk et al.,J.Biol.Chem., 249 ,3322-3325,1
974)。酵素トロンビンは、フィブリノーゲンからＦＰＡ
およびＦＰＢを開裂させることが出来、両ペプチドの放
出はフィブリンIIの生成をもたらす。
ブリノーゲンの生体内分解により主要ＮＨ2 末端フラグ
メント、いわゆるＮ−ＤＳＫが放出されることが判明し
ている（Blombaeck et al., Nature, 218 ,130-134,196
8)。フィブリノーゲンのＮ−ＤＳＫ部分は酵素活性化の
結果として現われかつフィブリノーゲンのフィブリンへ
の遷移において作用する結合または重合ドメインを含有
する（Kudryk et al.,J.Biol.Chem., 249 ,3322-3325,1
974)。酵素トロンビンは、フィブリノーゲンからＦＰＡ
およびＦＰＢを開裂させることが出来、両ペプチドの放
出はフィブリンIIの生成をもたらす。
【００１１】トロンビンとは異なって、ヘビ毒酵素バト
ロキソビンはフィブリノーゲンからＦＰＡしか放出させ
ることが出来ず（Laurent & Blombaeck,Acta Chem.Scan
d.,12,1875-1877,1958)、これはフィブリンＩと呼ばれ
る種類のフィブリンの生成を与える方法である。フィブ
リノーゲンおよびＮ−ＤＳＫのＮＨ2 末端は同一である
から、トロンビンおよびバトロキソビン誘導フィブリン
ゲンから異なるＮ−ＤＳＫ種を得ることが出来る。ネオ
ペプチドを同定しようとして、Qureshi et al., Throm
b.Res. ６,357-374,1975,において、人（Ｔ）Ｄ−ＤＳ
Ｋに対するラビット抗血清が調製された。高力価血清が
得られたにもかかわらず、これらの研究者等はＮ−ＤＳ
Ｋと（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫの免疫化学的差を何ら証明するこ
とが出来なかった。
ロキソビンはフィブリノーゲンからＦＰＡしか放出させ
ることが出来ず（Laurent & Blombaeck,Acta Chem.Scan
d.,12,1875-1877,1958)、これはフィブリンＩと呼ばれ
る種類のフィブリンの生成を与える方法である。フィブ
リノーゲンおよびＮ−ＤＳＫのＮＨ2 末端は同一である
から、トロンビンおよびバトロキソビン誘導フィブリン
ゲンから異なるＮ−ＤＳＫ種を得ることが出来る。ネオ
ペプチドを同定しようとして、Qureshi et al., Throm
b.Res. ６,357-374,1975,において、人（Ｔ）Ｄ−ＤＳ
Ｋに対するラビット抗血清が調製された。高力価血清が
得られたにもかかわらず、これらの研究者等はＮ−ＤＳ
Ｋと（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫの免疫化学的差を何ら証明するこ
とが出来なかった。
【００１２】１９８２年、Kudryk et al. は、フィブリ
ノーゲンまたはフィブリンから誘導されたＢβ１５−４
２配列を含むペプチドの血漿水準の測定に使用出来るラ
ジオイムノアッセイを開発した（Kudryk et al.,Throm
b.Res.,25,277-291,1982)。これらのペプチドは生体内
プラスミン分解の結果として生じるので、ラジオイムノ
アッセイは血栓症が起りそうなまたははっきりしている
疾病状態に関する臨床研究において重要な情報を与え得
ることが提案された。しかしながら、ラジオイムノアッ
セイはＢβ１５−４２のＮＨ2 −またはＣＯＯＨ−末端
に延長部を含有するペプチド間の識別を行うことが出来
ず、したがって、全Ｂβ１５−４２免疫反応性しか測定
出来なかった。
ノーゲンまたはフィブリンから誘導されたＢβ１５−４
２配列を含むペプチドの血漿水準の測定に使用出来るラ
ジオイムノアッセイを開発した（Kudryk et al.,Throm
b.Res.,25,277-291,1982)。これらのペプチドは生体内
プラスミン分解の結果として生じるので、ラジオイムノ
アッセイは血栓症が起りそうなまたははっきりしている
疾病状態に関する臨床研究において重要な情報を与え得
ることが提案された。しかしながら、ラジオイムノアッ
セイはＢβ１５−４２のＮＨ2 −またはＣＯＯＨ−末端
に延長部を含有するペプチド間の識別を行うことが出来
ず、したがって、全Ｂβ１５−４２免疫反応性しか測定
出来なかった。
【００１３】Nossel et al.,J.Chin.Invest., 64,1371-
1378,1979,において、臨床血液サンプル中でＢβ１−４
２が同定され、したがって、それはいわゆるフィブリン
Ｉのプラスミンタンパク質加水分解から生じることが示
唆された。第２の種類のフィブリンも生体内で形成され
る。定義によれば、フィブリンIIはＦＰＡもまたＦＰＢ
も含んでおらず、したがって、プラスミンでそれを溶解
してもＢβ１−４２は生成し得ない（第８図）。
1378,1979,において、臨床血液サンプル中でＢβ１−４
２が同定され、したがって、それはいわゆるフィブリン
Ｉのプラスミンタンパク質加水分解から生じることが示
唆された。第２の種類のフィブリンも生体内で形成され
る。定義によれば、フィブリンIIはＦＰＡもまたＦＰＢ
も含んでおらず、したがって、プラスミンでそれを溶解
してもＢβ１−４２は生成し得ない（第８図）。
【００１４】Nossel (Nature.,Lond.,291 ,165-167,198
1)は、フィブリンＩは生体内フィブリノーゲンタンパク
質加水分解における重要な基質であり、そしてフィブリ
ンIIは閉塞性血栓症をより生じやすいと示唆している
（第８図）。閉塞性血栓症は患者の生命を危険にさらす
ので、血栓症の初期を検出しなければならない。生体内
でのフィブリノーゲン分解は、フィブリノーゲンタンパ
ク質加水分解時に起る一般的な酵素反応に依存して血栓
症を引き起す生成物を生じる。
1)は、フィブリンＩは生体内フィブリノーゲンタンパク
質加水分解における重要な基質であり、そしてフィブリ
ンIIは閉塞性血栓症をより生じやすいと示唆している
（第８図）。閉塞性血栓症は患者の生命を危険にさらす
ので、血栓症の初期を検出しなければならない。生体内
でのフィブリノーゲン分解は、フィブリノーゲンタンパ
ク質加水分解時に起る一般的な酵素反応に依存して血栓
症を引き起す生成物を生じる。
【００１５】フィブリノーゲンのトロンビン活性化から
生じるフィブリンＩポリマーが次いでトロンビンまたは
プラスミンにより活性化されるかどうかを信頼出来る方
法で調らべることは困難であるという問題が存在する。
主としてプラスミンにより活性化されると、フィブリン
ＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するフラグメ
ントを含む分解産物が産生される。後者が主な経路であ
れば、閉塞性血栓症は起らない。その代り、フィブリン
Ｉポリマーがトロンビンによりさらに活性化されると、
フィブリンIIが生成し、これはしばしば血栓症を伴う。
生じるフィブリンＩポリマーが次いでトロンビンまたは
プラスミンにより活性化されるかどうかを信頼出来る方
法で調らべることは困難であるという問題が存在する。
主としてプラスミンにより活性化されると、フィブリン
ＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するフラグメ
ントを含む分解産物が産生される。後者が主な経路であ
れば、閉塞性血栓症は起らない。その代り、フィブリン
Ｉポリマーがトロンビンによりさらに活性化されると、
フィブリンIIが生成し、これはしばしば血栓症を伴う。
【００１６】上記に照らして、フィブリンＩ分子がどの
ような生化学的ルートを取るのかを決定することは非常
に望ましいことである。これを行う１つのアプローチ
は、臨床サンプル中のＢβ鎖ペプチドの分子性状を同定
することである。たとえば、Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−
１４および１５−４２を含有するペプチドフラグメント
の一指標と合せて、患者の血漿中で無傷Ｂβ１−４２が
支配的であることが確認されれば、フィブリンＩのプラ
スミンタンパク質加水分解が強く示唆されるであろう。
他方、逆の発見であれば、フィブリンＩがさらに分解さ
れてフィブリンIIが生じることが指摘されるであろう。
前述したように、フィブリンIIのプラスミン分解はＢβ
１−４２を決して生じることがない。
ような生化学的ルートを取るのかを決定することは非常
に望ましいことである。これを行う１つのアプローチ
は、臨床サンプル中のＢβ鎖ペプチドの分子性状を同定
することである。たとえば、Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−
１４および１５−４２を含有するペプチドフラグメント
の一指標と合せて、患者の血漿中で無傷Ｂβ１−４２が
支配的であることが確認されれば、フィブリンＩのプラ
スミンタンパク質加水分解が強く示唆されるであろう。
他方、逆の発見であれば、フィブリンＩがさらに分解さ
れてフィブリンIIが生じることが指摘されるであろう。
前述したように、フィブリンIIのプラスミン分解はＢβ
１−４２を決して生じることがない。
【００１７】Matsueda et al.,Science, 222 ,1129-11
32,1983,においてＳＰ２／０骨髄腫細胞系の細胞と、人
フィブリンのＢβ鎖のアミノ末端の合成ヘプタペプチ
ド、ヘプタペプチドのカルボキシ末端に位置するシステ
ィン残基およびＭＢ−ＫＬＨ（マレイミドベンゾイル化
キーホールリンペットヘモシアニン）からなる複合体で
免疫にされた雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスからの脾臓細胞との
融合から調製されるハイブリドーマから人フィブリンに
結合する３つのモノクロナール抗体を開発したことが述
べられている。モノクロナール抗体の１つは、人以外の
種からのフィブリンたとえばラビットフィブリンと交差
反応した。
32,1983,においてＳＰ２／０骨髄腫細胞系の細胞と、人
フィブリンのＢβ鎖のアミノ末端の合成ヘプタペプチ
ド、ヘプタペプチドのカルボキシ末端に位置するシステ
ィン残基およびＭＢ−ＫＬＨ（マレイミドベンゾイル化
キーホールリンペットヘモシアニン）からなる複合体で
免疫にされた雌ＢＡＬＢ／Ｃマウスからの脾臓細胞との
融合から調製されるハイブリドーマから人フィブリンに
結合する３つのモノクロナール抗体を開発したことが述
べられている。モノクロナール抗体の１つは、人以外の
種からのフィブリンたとえばラビットフィブリンと交差
反応した。
【００１８】定義 ＦＰＡ ：フィブリノペプチドＡ（Ａα１−１
６）。ＦＰＢ ：フィブリノペプチドＢ（Ｂβ１−１
４）。フィブリンＩ ：フィブリノーゲンをヘビ毒酵素バトロキ
ソビンで凝固させることにより調製されるＦＰＡを欠除
しているフィブリン。フィブリンII ：フィブリノーゲンのトロンビン分解から
得られる完全形成フィブリン（ＦＰＡおよびＦＰＢを含
まない）。ＨＰＬＣ ：高性能液体クロマトグラフィー。
６）。ＦＰＢ ：フィブリノペプチドＢ（Ｂβ１−１
４）。フィブリンＩ ：フィブリノーゲンをヘビ毒酵素バトロキ
ソビンで凝固させることにより調製されるＦＰＡを欠除
しているフィブリン。フィブリンII ：フィブリノーゲンのトロンビン分解から
得られる完全形成フィブリン（ＦＰＡおよびＦＰＢを含
まない）。ＨＰＬＣ ：高性能液体クロマトグラフィー。
【００１９】ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ８４１８：１
９８３年１１月９日に寄託されたAmerican Type Cultur
e Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryla
nd 20852 (以下「ＡＴＣＣ」）によるＨＢ８４１８の名
称が与えられたマウスリンパ球ハイブリドーマ（寄託者
記号：１−８ｃ６）。ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ８４２６ ：１９８３年１１
月１６日に寄託されたＡＴＴＣによりＨＢ８４２６の名
称が与えられたマウスリンパ球ハイブリドーマ（寄託者
記号：Ｔ２Ｇｌｓ）。
９８３年１１月９日に寄託されたAmerican Type Cultur
e Collection,12301 Parklawn Drive,Rockville,Maryla
nd 20852 (以下「ＡＴＣＣ」）によるＨＢ８４１８の名
称が与えられたマウスリンパ球ハイブリドーマ（寄託者
記号：１−８ｃ６）。ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ８４２６ ：１９８３年１１
月１６日に寄託されたＡＴＴＣによりＨＢ８４２６の名
称が与えられたマウスリンパ球ハイブリドーマ（寄託者
記号：Ｔ２Ｇｌｓ）。
【００２０】単一特異性抗体 ：単一の抗原と結合する抗体。単一の抗原決定基に対し
て単一特異性である単一特異性抗体は前記抗原決定基
（エピトープ）とのみ結合する。ヘテロ分子抗体 ：同一抗体の多数の異なる分子形態を含
有する抗体。ホモ分子抗体 ：単一分子形態のみを含有する抗体、すな
わち、各抗体分子は各他の抗体分子と同じである。
て単一特異性である単一特異性抗体は前記抗原決定基
（エピトープ）とのみ結合する。ヘテロ分子抗体 ：同一抗体の多数の異なる分子形態を含
有する抗体。ホモ分子抗体 ：単一分子形態のみを含有する抗体、すな
わち、各抗体分子は各他の抗体分子と同じである。
【００２１】モノクロナール抗体：発生的には同一でホ
モ分子抗体を産生する単一細胞系から誘導される抗体。ＭＡｂ／１−８ｃ６ ：モノクロナール抗体１−８ｃ６、
ＡＴＣＣＨＢ８４１８と称されるハイブリドーマクロー
ンの大量培養の廃培地からのＩｇＧ画分。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ ：モノクロナール抗体Ｔ２Ｇｌｓ、
ＡＴＣＣＨＢ８４２６と称されるハイブリドーマクロー
ンの大量培養の廃培地からのＩｇＧ画分。
モ分子抗体を産生する単一細胞系から誘導される抗体。ＭＡｂ／１−８ｃ６ ：モノクロナール抗体１−８ｃ６、
ＡＴＣＣＨＢ８４１８と称されるハイブリドーマクロー
ンの大量培養の廃培地からのＩｇＧ画分。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ ：モノクロナール抗体Ｔ２Ｇｌｓ、
ＡＴＣＣＨＢ８４２６と称されるハイブリドーマクロー
ンの大量培養の廃培地からのＩｇＧ画分。
【００２２】Ｎ−ＤＳＫ：ＣＮＢｒ分解により得られる
人フィブリノーゲンのＮＨ2 末端部分、分子式（Ａα１
−５１、Ｂβ１−１１８、γ１−７８）2 、分子量５
８，０００（分子量はゲル電気泳動により測定）。（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ ：フィブリノーゲンをヘビ毒酵素バト
ロキソビンで凝固させることにより調製された人フィブ
リンから得られるＣＮＢｒフラグメント。（Ｂ）Ｎ−Ｄ
ＳＫは、ＦＰＡを欠除し、したがって、その分子式は
（Ａα１７−５１、Ｂβ１−１１８、γ１−７８）2 で
分子量５５，０００（分子量はゲル電気泳動により測
定）である点においてＮ−ＤＳＫと異なる。
人フィブリノーゲンのＮＨ2 末端部分、分子式（Ａα１
−５１、Ｂβ１−１１８、γ１−７８）2 、分子量５
８，０００（分子量はゲル電気泳動により測定）。（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ ：フィブリノーゲンをヘビ毒酵素バト
ロキソビンで凝固させることにより調製された人フィブ
リンから得られるＣＮＢｒフラグメント。（Ｂ）Ｎ−Ｄ
ＳＫは、ＦＰＡを欠除し、したがって、その分子式は
（Ａα１７−５１、Ｂβ１−１１８、γ１−７８）2 で
分子量５５，０００（分子量はゲル電気泳動により測
定）である点においてＮ−ＤＳＫと異なる。
【００２３】（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ：フィブリノーゲンを人
トロンビンで凝固させるかまたはＮ−ＤＳＫを同じ酵素
で活性化することにより調製された人フィブリンから得
られるＣＮＢｒフラグメント。（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＦＰ
ＡもまたＦＰＢも欠除しており、分子式（Ａα１７−５
１、Ｂβ１５−１１８、γ１−７８）2 および分子量５
２，０００（分子量はゲル電気泳動により測定）を有す
る。ＣＮＢｒ ：臭化シアン。ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム。
トロンビンで凝固させるかまたはＮ−ＤＳＫを同じ酵素
で活性化することにより調製された人フィブリンから得
られるＣＮＢｒフラグメント。（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＦＰ
ＡもまたＦＰＢも欠除しており、分子式（Ａα１７−５
１、Ｂβ１５−１１８、γ１−７８）2 および分子量５
２，０００（分子量はゲル電気泳動により測定）を有す
る。ＣＮＢｒ ：臭化シアン。ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム。
【００２４】ＴＰＢＳ ：０．０５％トゥイーン２０を
さらに含有する燐酸塩−生理的食塩水緩衝液。ＥＬＩＳＡ ：エンザイムリンクドイムノソルベントアッ
セイ。ＲＩＡ ：ラジオイムノアッセイ。Ａ490 ：波長４９０nmにおける吸光度。Ｓａｃ−Ｃｅｌ ：ロバ抗マウスセルロース懸濁液。動物 ：ことわりがない限り、本発明で使用する
「動物」は、人間以外の温血動物を意味する。
さらに含有する燐酸塩−生理的食塩水緩衝液。ＥＬＩＳＡ ：エンザイムリンクドイムノソルベントアッ
セイ。ＲＩＡ ：ラジオイムノアッセイ。Ａ490 ：波長４９０nmにおける吸光度。Ｓａｃ−Ｃｅｌ ：ロバ抗マウスセルロース懸濁液。動物 ：ことわりがない限り、本発明で使用する
「動物」は、人間以外の温血動物を意味する。
【００２５】
【発明の概要】モノクロナール抗体の製造方法が新たに
見い出された。そのようなモノクロナール抗体は単一特
異性でもある。そのようにして産生される新規なモノク
ロナール抗体は、ＭＡｂ／１−８ｃ６およびＭＡｂ／Ｔ
２Ｇｌｓと称される。これらのモノクロナール抗体を産
生するハイブリドーマは各々１−８ｃ６（ＡＴＣＣＨＢ
８４１８）およびＴ２Ｇｌｓ（ＡＴＣＣＨＢ８４２６）
と称される。ハイブリドーマ、したがってモノクロナー
ル抗体の産生方法は、動物細胞たとえばマウス骨髄腫細
胞たとえばマウスＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３を、動物た
とえばマウスたとえばＢＡＬＢ／ｃＪマウスからの脾臓
細胞と融合させることを含んでなる。
見い出された。そのようなモノクロナール抗体は単一特
異性でもある。そのようにして産生される新規なモノク
ロナール抗体は、ＭＡｂ／１−８ｃ６およびＭＡｂ／Ｔ
２Ｇｌｓと称される。これらのモノクロナール抗体を産
生するハイブリドーマは各々１−８ｃ６（ＡＴＣＣＨＢ
８４１８）およびＴ２Ｇｌｓ（ＡＴＣＣＨＢ８４２６）
と称される。ハイブリドーマ、したがってモノクロナー
ル抗体の産生方法は、動物細胞たとえばマウス骨髄腫細
胞たとえばマウスＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３を、動物た
とえばマウスたとえばＢＡＬＢ／ｃＪマウスからの脾臓
細胞と融合させることを含んでなる。
【００２６】ＭＡｂ／１−８ｃ６の場合、マウスは人フ
ィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＮＨ2 末端フラグ
メントにより免疫され、新規なハイブリドーマすなわち
１−８ｃ６が形成される。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場合、
マウスは人フィブリンIIのＮＨ2 末端フラグメントによ
り免疫され、新規なハイブリドーマすなわちＴ２Ｇｌｓ
が形成される。得られるハイブリドーマは分離され、Ｍ
Ａｂ／８ｃ６の場合には人フィブリノーゲンまたはフィ
ブリンＩのＮＨ2 末端フラグメントに対して、またＭＡ
ｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場合、人フィブリンIIのＮＨ2 末端フ
ラグメントに対して単一特異性抗体を産生するハイブリ
ドーマが選ばれる。
ィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＮＨ2 末端フラグ
メントにより免疫され、新規なハイブリドーマすなわち
１−８ｃ６が形成される。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場合、
マウスは人フィブリンIIのＮＨ2 末端フラグメントによ
り免疫され、新規なハイブリドーマすなわちＴ２Ｇｌｓ
が形成される。得られるハイブリドーマは分離され、Ｍ
Ａｂ／８ｃ６の場合には人フィブリノーゲンまたはフィ
ブリンＩのＮＨ2 末端フラグメントに対して、またＭＡ
ｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場合、人フィブリンIIのＮＨ2 末端フ
ラグメントに対して単一特異性抗体を産生するハイブリ
ドーマが選ばれる。
【００２７】人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩの
フラグメントは、人フィブリノーゲンまたはフィブリン
ＩのＣＮＢｒによる分解により形成することが出来る。
そのようなＣＮＢｒ分解の人フィブリノーゲンのフラグ
メントはＮ−ＤＳＫである。使用出来る人フィブリノー
ゲンまたはフィブリンＩの他のフラグメントはＢβ１−
１１８およびＢβ１−４２である。本発明において使用
出来るフィブリンＩのフラグメントは（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ
である。人フィブリンIIのフラグメントは、フィブリン
IIのＣＮＢｒによる分解により形成することが出来る。
人フィブリンIIのフラグメントは（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫであ
る。使用出来る人フィブリンIIの他のフラグメントはＢ
β１５−１１８およびＢβ１５−４２である。
フラグメントは、人フィブリノーゲンまたはフィブリン
ＩのＣＮＢｒによる分解により形成することが出来る。
そのようなＣＮＢｒ分解の人フィブリノーゲンのフラグ
メントはＮ−ＤＳＫである。使用出来る人フィブリノー
ゲンまたはフィブリンＩの他のフラグメントはＢβ１−
１１８およびＢβ１−４２である。本発明において使用
出来るフィブリンＩのフラグメントは（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ
である。人フィブリンIIのフラグメントは、フィブリン
IIのＣＮＢｒによる分解により形成することが出来る。
人フィブリンIIのフラグメントは（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫであ
る。使用出来る人フィブリンIIの他のフラグメントはＢ
β１５−１１８およびＢβ１５−４２である。
【００２８】ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ８４１
８は、単一特異性抗体ＭＡｂ／１−８ｃ６を産生する。
このＭＡｂ／１−８ｃ６は、人フィブリノーゲンまたは
フィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有す
るペプチドフラグメントと反応するが、しかし人フィブ
リノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基
１−１４または１５−４２を含有するペプチドフラグメ
ントとは反応しない。したがって、ＭＡｂ／１−８ｃ６
はＢβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合内のまたはその周り
のエピトープ（抗原決定基）と認められ、したがって人
フィブリノーゲン、またはフィブリンＩおよびフィブリ
ンIIのＢβ鎖から誘導されるＮＨ2 末端ペプチド間の識
別を行う。
８は、単一特異性抗体ＭＡｂ／１−８ｃ６を産生する。
このＭＡｂ／１−８ｃ６は、人フィブリノーゲンまたは
フィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有す
るペプチドフラグメントと反応するが、しかし人フィブ
リノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基
１−１４または１５−４２を含有するペプチドフラグメ
ントとは反応しない。したがって、ＭＡｂ／１−８ｃ６
はＢβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合内のまたはその周り
のエピトープ（抗原決定基）と認められ、したがって人
フィブリノーゲン、またはフィブリンＩおよびフィブリ
ンIIのＢβ鎖から誘導されるＮＨ2 末端ペプチド間の識
別を行う。
【００２９】ハイブリドーマ細胞系ＡＴＣＣＨＢ８４２
６は、単一特異性抗体ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを産生する。
このＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは人フィブリンIIのＢβ鎖のア
ミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグメント
と反応するが、しかし人フィブリノーゲンまたはフィブ
リンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２または１−１４
を含有するペプチドフラグメントと反応しない。したが
って、ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓはフィブリンIIのＢβ鎖上の
エピトープと認められるが、しかしフィブリノーゲンま
たはフィブリンＩのＢβ鎖上のエピトープでない。
６は、単一特異性抗体ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを産生する。
このＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは人フィブリンIIのＢβ鎖のア
ミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグメント
と反応するが、しかし人フィブリノーゲンまたはフィブ
リンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２または１−１４
を含有するペプチドフラグメントと反応しない。したが
って、ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓはフィブリンIIのＢβ鎖上の
エピトープと認められるが、しかしフィブリノーゲンま
たはフィブリンＩのＢβ鎖上のエピトープでない。
【００３０】ＭＡｂ／１−８ｃ６は、人フィブリノーゲ
ン、フィブリンＩまたはこのいずれかから誘導されたペ
プチド（アミノ酸残基１−４２を含有する）のＢβ鎖上
の単一決定基に対して単一特異性である。ＭＡｂ／１−
８ｃ６は他の抗人フィブリノーゲン抗体を含有しない。
このことは、本来的に汚染されている従来技術の抗血清
およびＢβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合中またはその周
囲のエピトープに対して特異性でない従来技術のモノク
ロナール抗体と対照をなす。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは、人
フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有
するペプチドフラグメント上の単一決定基に対して単一
特異性である。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは、本来的に汚染さ
れる従来技術の抗血清とは違ってまたフィブリンIIのＢ
β鎖上のエピトープに対して特異性でない従来技術のモ
ノクロナール抗体とは違って、他の抗人免疫グロブリン
を実質的に含有しない。
ン、フィブリンＩまたはこのいずれかから誘導されたペ
プチド（アミノ酸残基１−４２を含有する）のＢβ鎖上
の単一決定基に対して単一特異性である。ＭＡｂ／１−
８ｃ６は他の抗人フィブリノーゲン抗体を含有しない。
このことは、本来的に汚染されている従来技術の抗血清
およびＢβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合中またはその周
囲のエピトープに対して特異性でない従来技術のモノク
ロナール抗体と対照をなす。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは、人
フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有
するペプチドフラグメント上の単一決定基に対して単一
特異性である。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは、本来的に汚染さ
れる従来技術の抗血清とは違ってまたフィブリンIIのＢ
β鎖上のエピトープに対して特異性でない従来技術のモ
ノクロナール抗体とは違って、他の抗人免疫グロブリン
を実質的に含有しない。
【００３１】ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは、フィブリンIIのア
ミノ酸残基１５−４２を含有する人ペプチドフラグメン
トに対しても特異性である。すなわち、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ
ｌｓは人フィブリノーゲンのトロンビン分解により生じ
る産物と反応するが、しかしある動物フィブリノーゲン
たとえばラビットフィブリノーゲンのトロンビン分解か
ら得られる産物とは反応しない。
ミノ酸残基１５−４２を含有する人ペプチドフラグメン
トに対しても特異性である。すなわち、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ
ｌｓは人フィブリノーゲンのトロンビン分解により生じ
る産物と反応するが、しかしある動物フィブリノーゲン
たとえばラビットフィブリノーゲンのトロンビン分解か
ら得られる産物とは反応しない。
【００３２】本発明の新規なハイブリドーマは、培養し
て抗体を産生させることが出来るが、この際動物に免疫
し、殺すこと、およびついで従来技術の不純な抗血清を
得るためにさえ必要な冗長な吸着・精製工程を必要とし
ない。免疫グロブリン分子はすべて２つの同じＬ鎖（Ｍ
Ｗ２５，０００）と２つの同じＨ鎖（ＭＷ５０，００
０）がジスルフィド結合により四量体として結合された
ものからなる。各鎖は概念上構造的および機能的意味を
有する特異性ドメインまたは領域に分けることが出来
る。カルボキシ末端側のＬ鎖の半分は不変部と呼ばれ、
アミノ末端の半分はＬ鎖の可変部である。アミノ末端に
位置するＨ鎖のほぼ１／４は可変部と呼ばれ、Ｈ鎖の他
の３／４はＨ鎖の不変部と呼ばれる。
て抗体を産生させることが出来るが、この際動物に免疫
し、殺すこと、およびついで従来技術の不純な抗血清を
得るためにさえ必要な冗長な吸着・精製工程を必要とし
ない。免疫グロブリン分子はすべて２つの同じＬ鎖（Ｍ
Ｗ２５，０００）と２つの同じＨ鎖（ＭＷ５０，００
０）がジスルフィド結合により四量体として結合された
ものからなる。各鎖は概念上構造的および機能的意味を
有する特異性ドメインまたは領域に分けることが出来
る。カルボキシ末端側のＬ鎖の半分は不変部と呼ばれ、
アミノ末端の半分はＬ鎖の可変部である。アミノ末端に
位置するＨ鎖のほぼ１／４は可変部と呼ばれ、Ｈ鎖の他
の３／４はＨ鎖の不変部と呼ばれる。
【００３３】４クラスのＨ鎖がマウスに見い出されてお
り、これらのクラスは化学的差異により識別することが
出来る。Ｈ鎖の種類は免疫グロブリンのクラスを、した
がって、そのエフェクター作用を決定する。５つの免疫
グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよ
びＩｇＥが存在する。マウスＩｇＧの４クラスはＩｇＧ
1 、ＩｇＧ2a、ＩｇＧ2bおよびＩｇＧ3 と呼ばれる。Ｍ
Ａｂ／１−８ｃ６はクラスＩｇＧおよびサブクラスＩｇ
Ｇ2aに属している。ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓはクラスＩｇＧ
およびサブクラスＩｇＧ1 に属している。
り、これらのクラスは化学的差異により識別することが
出来る。Ｈ鎖の種類は免疫グロブリンのクラスを、した
がって、そのエフェクター作用を決定する。５つの免疫
グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよ
びＩｇＥが存在する。マウスＩｇＧの４クラスはＩｇＧ
1 、ＩｇＧ2a、ＩｇＧ2bおよびＩｇＧ3 と呼ばれる。Ｍ
Ａｂ／１−８ｃ６はクラスＩｇＧおよびサブクラスＩｇ
Ｇ2aに属している。ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓはクラスＩｇＧ
およびサブクラスＩｇＧ1 に属している。
【００３４】したがって、前述の利点を達成するに当っ
て、本発明は２つのハイブリドーマ、すなわち人フィブ
リノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基
１−４２を含有するペプチドフラグメントに対して抗体
を産生するハイブリドーマおよび人フィブリンIIのＢβ
鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグ
メントに対して抗体を産生するハイブリドーマを提供す
る。
て、本発明は２つのハイブリドーマ、すなわち人フィブ
リノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基
１−４２を含有するペプチドフラグメントに対して抗体
を産生するハイブリドーマおよび人フィブリンIIのＢβ
鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有するペプチドフラグ
メントに対して抗体を産生するハイブリドーマを提供す
る。
【００３５】さらに、本発明は、生体内でのフィブリノ
ーゲンタンパク質加水分解経路の性質を決定する方法を
提供する。また、本発明は、本発明のモノクロナール抗
体を用いる疾病の診断方法を提供する。また、本発明
は、閉塞性血栓症になる恐れのあるまたは現にかかって
いる患者の血流からフィブリンIIを治療により除去する
方法を提供する。
ーゲンタンパク質加水分解経路の性質を決定する方法を
提供する。また、本発明は、本発明のモノクロナール抗
体を用いる疾病の診断方法を提供する。また、本発明
は、閉塞性血栓症になる恐れのあるまたは現にかかって
いる患者の血流からフィブリンIIを治療により除去する
方法を提供する。
【００３６】一般に、本発明によるモノクロナール抗体
を産生するハイブリドーマは、Koehlor and Milsteinの
方法により調製される。ＭＡｂ／１−８ｃ６の産生の場
合はＮ−ＤＳＫの溶液をまたはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの産
生の場合は（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫの溶液によりマウスを免疫
した後、免疫したマウスの脾臓細胞を、マウス骨髄腫系
からの細胞と融合させる。
を産生するハイブリドーマは、Koehlor and Milsteinの
方法により調製される。ＭＡｂ／１−８ｃ６の産生の場
合はＮ−ＤＳＫの溶液をまたはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの産
生の場合は（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫの溶液によりマウスを免疫
した後、免疫したマウスの脾臓細胞を、マウス骨髄腫系
からの細胞と融合させる。
【００３７】得られたハイブリドーマからのクローン培
養液をスクリーニングし、人フィブリノーゲンまたはフ
ィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有する
ペプチドフラグメントに（ＭＡｂ／１−８ｃ６の産生の
場合）、または人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基
１５−４２を含有するペプチドフラグメントに（ＭＡｂ
／Ｔ２Ｇｌｓの産生の場合）選択的に結合する抗体を含
有する上澄液を含む培養液を得る。強調すべきことは、
ハイブリッド調製物の性状は予知出来ないために、１つ
の抗原または細胞系からの他の抗原または細胞系への外
挿が不可能なことである。
養液をスクリーニングし、人フィブリノーゲンまたはフ
ィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有する
ペプチドフラグメントに（ＭＡｂ／１−８ｃ６の産生の
場合）、または人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基
１５−４２を含有するペプチドフラグメントに（ＭＡｂ
／Ｔ２Ｇｌｓの産生の場合）選択的に結合する抗体を含
有する上澄液を含む培養液を得る。強調すべきことは、
ハイブリッド調製物の性状は予知出来ないために、１つ
の抗原または細胞系からの他の抗原または細胞系への外
挿が不可能なことである。
【００３８】本発明の方法により製造されるハイブリド
ーマから誘導されるモノクロナール抗体は、血栓症にか
かる恐れのあるまたはかかっている患者の血液に発生す
るフィブリン分子の性状を決定するために臨床研究にお
いて診断薬として有用である。血栓症は多数の症状と関
連があるが、また手術前、中または後ならびに他の外傷
状態でも起り得る。血液透析患者に対するヘパリン治療
の効果を、本発明の診断薬を介してフィブリノーゲンま
たはフィブリン分解産物の血漿濃度を測定することによ
り検査することも出来る。ストレプトキナーゼまたは組
織型プラスミノーゲンアクチベータを用いる血栓症治療
の効果を、本発明の抗体を用いて検査することも出来
る。
ーマから誘導されるモノクロナール抗体は、血栓症にか
かる恐れのあるまたはかかっている患者の血液に発生す
るフィブリン分子の性状を決定するために臨床研究にお
いて診断薬として有用である。血栓症は多数の症状と関
連があるが、また手術前、中または後ならびに他の外傷
状態でも起り得る。血液透析患者に対するヘパリン治療
の効果を、本発明の診断薬を介してフィブリノーゲンま
たはフィブリン分解産物の血漿濃度を測定することによ
り検査することも出来る。ストレプトキナーゼまたは組
織型プラスミノーゲンアクチベータを用いる血栓症治療
の効果を、本発明の抗体を用いて検査することも出来
る。
【００３９】
【発明の具体的説明】本発明による、ハイブリドーマお
よびそのハイブリドーマによって産生される抗体の製造
方法は、形質転換された動物細胞たとえば骨髄腫細胞を
動物の脾臓細胞と融合させることにより行うことが出来
る。しかしながら、マウス骨髄腫細胞およびマウス脾臓
細胞を使用することが好ましく、したがって、以下、本
発明はマウス骨髄腫細胞およびマウス脾臓細胞を用いて
記載される。本発明によれば、ＭＡｂ／１−８ｃ６（人
フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ
酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメントと反応
するがしかし人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩの
Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−１４または１５−４２を含有
するペプチドフラグメントと反応しない）またはＭＡｂ
／Ｔ２Ｇｌｓ（人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基
１５−４２を含有するペプチドフラグメントと反応する
がしかし人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ
鎖のアミノ酸残基１−１４または１−４２を含有するペ
プチドフラグメントと反応しない）を産生するハイブリ
ドーマの調製方法は、一般に下記工程からなる：
よびそのハイブリドーマによって産生される抗体の製造
方法は、形質転換された動物細胞たとえば骨髄腫細胞を
動物の脾臓細胞と融合させることにより行うことが出来
る。しかしながら、マウス骨髄腫細胞およびマウス脾臓
細胞を使用することが好ましく、したがって、以下、本
発明はマウス骨髄腫細胞およびマウス脾臓細胞を用いて
記載される。本発明によれば、ＭＡｂ／１−８ｃ６（人
フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ
酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメントと反応
するがしかし人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩの
Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−１４または１５−４２を含有
するペプチドフラグメントと反応しない）またはＭＡｂ
／Ｔ２Ｇｌｓ（人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基
１５−４２を含有するペプチドフラグメントと反応する
がしかし人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ
鎖のアミノ酸残基１−１４または１−４２を含有するペ
プチドフラグメントと反応しない）を産生するハイブリ
ドーマの調製方法は、一般に下記工程からなる：
【００４０】Ａ．ＭＡｂ／１−８ｃ６の産生の場合には
Ｎ−ＤＳＫ、Ｂβ１−１１８、Ｂβ１−４２または
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫを、またはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの産生
の場合には（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、Ｂβ１５−１１８または
Ｂβ１５−４２によりマウスを免疫する工程。Ｎ−ＤＳ
Ｋはフィブリノーゲンから調製され、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ
はＮ−ＤＳＫのトロンビン分解により調製される。ＢＡ
ＬＢ／ｃＪマウスが好ましいが、他のマウス系統が使用
出来る。免疫感作スケジュールおよび免疫原濃度は、適
当に感作された脾細胞の有効量を生じるものとする。Ｍ
Ａｂ／１−８ｃ６を産生するためには、Ｎ−ＤＳＫ溶液
（４mg／ml) のエマルジョン０．１mlおよび等容量の完
全フロイントアジュバントを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射
し、次いで一週間おきに不完全フロイントアジュバント
を用いて同じ投与量の二次免疫注射を４回行い、次いで
１０週間後に０．１mgＮ−ＤＳＫをトリス−生理的食塩
水に溶解したものを静脈（ｉ．ｖ．）注射してマウスを
免疫する。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを産生するには、１００
μｇの（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを完全フロイントアジュバント
と混合したものを腹腔内に注射し、次いで不完全フロイ
ントアジュバントを用いて同じ投与量の二次免疫静脈注
射を４回行い、次いで１００μｇの（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを
トリス−生理的食塩水に溶解したものを静脈注射して、
マウスを免疫する。
Ｎ−ＤＳＫ、Ｂβ１−１１８、Ｂβ１−４２または
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫを、またはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの産生
の場合には（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、Ｂβ１５−１１８または
Ｂβ１５−４２によりマウスを免疫する工程。Ｎ−ＤＳ
Ｋはフィブリノーゲンから調製され、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ
はＮ−ＤＳＫのトロンビン分解により調製される。ＢＡ
ＬＢ／ｃＪマウスが好ましいが、他のマウス系統が使用
出来る。免疫感作スケジュールおよび免疫原濃度は、適
当に感作された脾細胞の有効量を生じるものとする。Ｍ
Ａｂ／１−８ｃ６を産生するためには、Ｎ−ＤＳＫ溶液
（４mg／ml) のエマルジョン０．１mlおよび等容量の完
全フロイントアジュバントを腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射
し、次いで一週間おきに不完全フロイントアジュバント
を用いて同じ投与量の二次免疫注射を４回行い、次いで
１０週間後に０．１mgＮ−ＤＳＫをトリス−生理的食塩
水に溶解したものを静脈（ｉ．ｖ．）注射してマウスを
免疫する。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを産生するには、１００
μｇの（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを完全フロイントアジュバント
と混合したものを腹腔内に注射し、次いで不完全フロイ
ントアジュバントを用いて同じ投与量の二次免疫静脈注
射を４回行い、次いで１００μｇの（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを
トリス−生理的食塩水に溶解したものを静脈注射して、
マウスを免疫する。
【００４１】Ｂ．各免疫されたマウスから脾臓を摘出
し、各脾臓からの細胞を適当な媒体たとえばＲＰＭＩ１
６４０に分散させた懸濁液を調製する工程。
し、各脾臓からの細胞を適当な媒体たとえばＲＰＭＩ１
６４０に分散させた懸濁液を調製する工程。
【００４２】Ｃ．懸濁脾臓細胞を適当な細胞系からのマ
ウス骨髄腫細胞とたとえば適当な融合促進剤たとえばＰ
ＥＧ１０００を用いて融合させる工程。好ましい割合
は、ＭＡｂ／１−８ｃ６産生の場合、骨髄腫細胞当り１
ｇで４個の脾臓細胞であり、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場
合、骨髄腫細胞当り７個の脾臓細胞である。約１０8 個
の脾細胞に対して全量で約０．５−１．０mlの融合媒体
が適当である。多くのマウス骨髄腫細胞系は公知であ
り、一般に学界のメンバーまたは種々の寄託バンクたと
えばSalk Institute Cell Distribution Center,La Jol
la,CA から入手出来る。使用する細胞系は、融合しない
骨髄腫細胞が選択培地で生き残らず、ハイブリッドが生
き残るように、いわゆる「薬物耐性」型であるのが好ま
しい。最も普通のクラスは８−アザグアニン耐性細胞系
であるが、このものは酵素ヒポキサンチングアニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼを欠除しており、したが
って、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび
チミジン）培地によって育成されない。また、使用する
骨髄腫細胞系は、それ自身では抗体を全く産生しないの
でいわゆる「非分泌」型であるのが好ましい（分泌型も
使用出来るけれども）。しかしながら、ある場合には、
分泌型骨髄腫系が好ましい。好ましい融合促進剤は平均
分子量が約１０００〜約４０００のポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ１０００等として市販されている）である
が、当業界で公知の他の融合促進剤も使用することが出
来る。
ウス骨髄腫細胞とたとえば適当な融合促進剤たとえばＰ
ＥＧ１０００を用いて融合させる工程。好ましい割合
は、ＭＡｂ／１−８ｃ６産生の場合、骨髄腫細胞当り１
ｇで４個の脾臓細胞であり、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場
合、骨髄腫細胞当り７個の脾臓細胞である。約１０8 個
の脾細胞に対して全量で約０．５−１．０mlの融合媒体
が適当である。多くのマウス骨髄腫細胞系は公知であ
り、一般に学界のメンバーまたは種々の寄託バンクたと
えばSalk Institute Cell Distribution Center,La Jol
la,CA から入手出来る。使用する細胞系は、融合しない
骨髄腫細胞が選択培地で生き残らず、ハイブリッドが生
き残るように、いわゆる「薬物耐性」型であるのが好ま
しい。最も普通のクラスは８−アザグアニン耐性細胞系
であるが、このものは酵素ヒポキサンチングアニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼを欠除しており、したが
って、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよび
チミジン）培地によって育成されない。また、使用する
骨髄腫細胞系は、それ自身では抗体を全く産生しないの
でいわゆる「非分泌」型であるのが好ましい（分泌型も
使用出来るけれども）。しかしながら、ある場合には、
分泌型骨髄腫系が好ましい。好ましい融合促進剤は平均
分子量が約１０００〜約４０００のポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ１０００等として市販されている）である
が、当業界で公知の他の融合促進剤も使用することが出
来る。
【００４３】Ｄ．別個の容器、たとえばミクロタイター
プレートの別個のウエルで、未融合脾細胞、未融合骨髄
腫細胞および融合細胞の混合物を、未融合骨髄腫細胞が
生育しない選択培地で未融合細胞を死滅させるのに十分
な時間（約１４−１６日）の間希釈して培養する工程。
希釈は、希釈剤の容量が各別々の容器（たとえばミクロ
タイタープレートの各ウエル）である数の細胞（たとえ
ば１−４）を単離させるように統計的に計算された限界
希釈でよい。培地は薬物耐性（たとえば８−アザグアニ
ン耐性）未融合骨髄腫細胞系が生育しないもの（たとえ
ばＨＡＴ培地）である。したがって、これらの骨髄腫細
胞は死滅する。未融合脾細胞は悪性でないから、有限の
世代数しか有しない。したがって、ある時間（約１４−
１６日）後、これらの未融合脾細胞は生殖することが出
来ない。他方、融合細胞は骨髄腫親の悪性特性および選
択培地で生き残る能力を有しているので生殖し続ける。
プレートの別個のウエルで、未融合脾細胞、未融合骨髄
腫細胞および融合細胞の混合物を、未融合骨髄腫細胞が
生育しない選択培地で未融合細胞を死滅させるのに十分
な時間（約１４−１６日）の間希釈して培養する工程。
希釈は、希釈剤の容量が各別々の容器（たとえばミクロ
タイタープレートの各ウエル）である数の細胞（たとえ
ば１−４）を単離させるように統計的に計算された限界
希釈でよい。培地は薬物耐性（たとえば８−アザグアニ
ン耐性）未融合骨髄腫細胞系が生育しないもの（たとえ
ばＨＡＴ培地）である。したがって、これらの骨髄腫細
胞は死滅する。未融合脾細胞は悪性でないから、有限の
世代数しか有しない。したがって、ある時間（約１４−
１６日）後、これらの未融合脾細胞は生殖することが出
来ない。他方、融合細胞は骨髄腫親の悪性特性および選
択培地で生き残る能力を有しているので生殖し続ける。
【００４４】Ｅ．ハイブリドーマを含有する各容器（ウ
エル）の上澄み液について、（１）ＭＡｂ／１−８ｃ６
産生の場合は、Ｎ−ＤＳＫおよび関連構造体〔フィブリ
ノーゲン、Ｎ−ＤＳＫ、またはそれらのフラグメント、
たとえば（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ（Ｎ−ＤＳＫのバトロキソビ
ン分解産物）およびＢβ１−１１８〕に対する抗体の存
在およびＮ−ＤＳＫのＡα１−５１またはα１−７８
鎖、トロンビン分解Ｂβ１−１１８、（Ｔ）Ｎ−ＤＳ
Ｋ、遊離Ｂβ１−１４（ＦＰＢ）またはＢβ１５−４２
に対する抗体の不存在についておよび（２）ＭＡｂ／Ｔ
２Ｇｌｓ産生の場合は、（Ｔ）Ｄ−ＤＳＫおよび関連構
造体（フィブリンII、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、トロンビン分
解Ｂβ１−４２およびＢβ１５−４２）に対する抗体の
存在および無傷フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳＫまたは
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫまたはＢβ１−４２に対する抗体の不
存在について評価する工程。
エル）の上澄み液について、（１）ＭＡｂ／１−８ｃ６
産生の場合は、Ｎ−ＤＳＫおよび関連構造体〔フィブリ
ノーゲン、Ｎ−ＤＳＫ、またはそれらのフラグメント、
たとえば（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ（Ｎ−ＤＳＫのバトロキソビ
ン分解産物）およびＢβ１−１１８〕に対する抗体の存
在およびＮ−ＤＳＫのＡα１−５１またはα１−７８
鎖、トロンビン分解Ｂβ１−１１８、（Ｔ）Ｎ−ＤＳ
Ｋ、遊離Ｂβ１−１４（ＦＰＢ）またはＢβ１５−４２
に対する抗体の不存在についておよび（２）ＭＡｂ／Ｔ
２Ｇｌｓ産生の場合は、（Ｔ）Ｄ−ＤＳＫおよび関連構
造体（フィブリンII、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、トロンビン分
解Ｂβ１−４２およびＢβ１５−４２）に対する抗体の
存在および無傷フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳＫまたは
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫまたはＢβ１−４２に対する抗体の不
存在について評価する工程。
【００４５】Ｆ．所望の抗体、たとえばＭＡｂ／１−８
ｃ６の場合、人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩの
Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラ
グメントと反応するが、しかし前記Ｂβ鎖のアミノ酸残
基１−１４または１５−４２のみしか含有しないペプチ
ドフラグメントと反応しない抗体を、またはＭＡｂ／Ｔ
２Ｇｌｓの場合、人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残
基１５−４２を含有するペプチドフラグメントと反応す
るが、しかし人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩの
Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−１４または１−４２を含有す
るペプチドフラグメントと反応しない抗体を産生するハ
イブリドーマを選択（たとえば限界希釈により）・クロ
ーン化する工程。
ｃ６の場合、人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩの
Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラ
グメントと反応するが、しかし前記Ｂβ鎖のアミノ酸残
基１−１４または１５−４２のみしか含有しないペプチ
ドフラグメントと反応しない抗体を、またはＭＡｂ／Ｔ
２Ｇｌｓの場合、人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残
基１５−４２を含有するペプチドフラグメントと反応す
るが、しかし人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩの
Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−１４または１−４２を含有す
るペプチドフラグメントと反応しない抗体を産生するハ
イブリドーマを選択（たとえば限界希釈により）・クロ
ーン化する工程。
【００４６】所望のハイブリドーマを選択し、クローン
化したら、生成抗体を２つの方法のうち１つの方法で産
生することが出来る。最も純粋なモノクロナール抗体
は、所望のハイブリドーマを適当な培地で適当な時間の
間生体外培養し、次いでクローンの上澄み液から所望の
抗体を取得することにより産生される。適当な培地およ
び適当な培養時間は公知でありまたは容易に決定され
る。
化したら、生成抗体を２つの方法のうち１つの方法で産
生することが出来る。最も純粋なモノクロナール抗体
は、所望のハイブリドーマを適当な培地で適当な時間の
間生体外培養し、次いでクローンの上澄み液から所望の
抗体を取得することにより産生される。適当な培地およ
び適当な培養時間は公知でありまたは容易に決定され
る。
【００４７】この生体外技術により他の抗人免疫グロブ
リンを含まないモノクロナール抗体が産生される。培地
は異種血清（たとえば、ウシ胎児血清）を含有するので
少量の他の免疫グロブリンが存在する。しかしながら、
この生体外方法では、ある目的に対して十分な量または
濃度の抗体を産生することが出来ない。これは、モノク
ロナール抗体の濃度が約５０μｇ／mlに過ぎないからで
ある。
リンを含まないモノクロナール抗体が産生される。培地
は異種血清（たとえば、ウシ胎児血清）を含有するので
少量の他の免疫グロブリンが存在する。しかしながら、
この生体外方法では、ある目的に対して十分な量または
濃度の抗体を産生することが出来ない。これは、モノク
ロナール抗体の濃度が約５０μｇ／mlに過ぎないからで
ある。
【００４８】さらに高濃度の純度がわずかに劣るモノク
ロナール抗体を産生するには、所望のハイブリドーマク
ローンをマウス、好ましくは同系または半同系マウスに
転移、すなわち腹腔内注射することが出来る。ハイブリ
ドーマは適当な培養時間後、抗体産生腫瘍を形成し、こ
の腫瘍は、宿主マウスの血流および腹腔滲出液（腹水）
中に高濃度（約５−２０mg／ｌ）の所望の抗体を生じ
る。これらの宿主マウスも血液および腹水中に正常抗体
を有するけれども、これらの正常抗体の濃度はモノクロ
ナール抗体の濃度の約５％に過ぎない。さらに、これら
の正常抗体は特異性が抗人性でないので、産生された悪
性腹水からまたは血清から得られたモノクロナール抗体
は汚染性抗人免疫グロブリンを実質的に含んでいない。
このモノクロナール抗体は高力価を有し、非特異性免疫
グロブリンに対する特異性の割合が大きい。
ロナール抗体を産生するには、所望のハイブリドーマク
ローンをマウス、好ましくは同系または半同系マウスに
転移、すなわち腹腔内注射することが出来る。ハイブリ
ドーマは適当な培養時間後、抗体産生腫瘍を形成し、こ
の腫瘍は、宿主マウスの血流および腹腔滲出液（腹水）
中に高濃度（約５−２０mg／ｌ）の所望の抗体を生じ
る。これらの宿主マウスも血液および腹水中に正常抗体
を有するけれども、これらの正常抗体の濃度はモノクロ
ナール抗体の濃度の約５％に過ぎない。さらに、これら
の正常抗体は特異性が抗人性でないので、産生された悪
性腹水からまたは血清から得られたモノクロナール抗体
は汚染性抗人免疫グロブリンを実質的に含んでいない。
このモノクロナール抗体は高力価を有し、非特異性免疫
グロブリンに対する特異性の割合が大きい。
【００４９】専門技術者が血漿サンプルをテストして本
発明のモノクロナール抗体が単一特異性を示す対象であ
る抗原の存在量（たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６の場合、
人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミ
ノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメントの
量、またはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場合、人フィブリンII
のＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有するペプチド
フラグメントの量）を測定出来る方法は次のようであ
る。
発明のモノクロナール抗体が単一特異性を示す対象であ
る抗原の存在量（たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６の場合、
人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミ
ノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメントの
量、またはＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの場合、人フィブリンII
のＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有するペプチド
フラグメントの量）を測定出来る方法は次のようであ
る。
【００５０】患者からある間隔で血液を集め、その血液
から血漿を取り出す。血漿サンプルを迅速に「処理」
（processed)」し、すなわち氷冷エタノールで処理し
〔５０％最終濃度〕、Ｂβ鎖から誘導されるフィブリノ
ーゲン／フィブリンペプチドを単離する。エタノール上
澄液は一般に凍結乾燥して溶剤を除去すると共に抽出液
を濃縮する。「処理」血漿サンプルを２つの部分すなわ
ち、Ｂβ１−４２の存在を検出するために使用される部
分と、Ｂβ１５−４２の存在を検出するために使用され
る部分に分割することが出来る。
から血漿を取り出す。血漿サンプルを迅速に「処理」
（processed)」し、すなわち氷冷エタノールで処理し
〔５０％最終濃度〕、Ｂβ鎖から誘導されるフィブリノ
ーゲン／フィブリンペプチドを単離する。エタノール上
澄液は一般に凍結乾燥して溶剤を除去すると共に抽出液
を濃縮する。「処理」血漿サンプルを２つの部分すなわ
ち、Ｂβ１−４２の存在を検出するために使用される部
分と、Ｂβ１５−４２の存在を検出するために使用され
る部分に分割することが出来る。
【００５１】エタノール抽出液中に存在するペプチド水
準は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）かまたはエンザ
イムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
により測定することが出来る。たとえば、エタノール抽
出液の種々の希釈液を、一定量の動物モノクロナール抗
体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６およびたとえば人フィブ
リノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基
１−４２を含有する放射能標識ペプチドフラグメントか
らなる競合的放射能標識抗原、たとえば動物モノクロナ
ール抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６と結合することが
出来る 125ＩＢβ１−４２リガンドと混合する。
準は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）かまたはエンザ
イムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
により測定することが出来る。たとえば、エタノール抽
出液の種々の希釈液を、一定量の動物モノクロナール抗
体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６およびたとえば人フィブ
リノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基
１−４２を含有する放射能標識ペプチドフラグメントか
らなる競合的放射能標識抗原、たとえば動物モノクロナ
ール抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６と結合することが
出来る 125ＩＢβ１−４２リガンドと混合する。
【００５２】また、エタノール抽出液の種々の希釈液
を、一定量の動物モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／
Ｔ２Ｇｌｓおよび人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残
基１５−４２を含有する放射能標識ペプチドフラグメン
トからなる競合的放射能標識抗原と混合する（この競合
的放射能標識抗原たとえば 125ＩＢβ１５−４２リガン
ドは動物モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌ
ｓと結合することが出来る。両方の場合共、適当なイン
キュベーション期間後、場合により、動物モノクロナー
ル抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６またはＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓに特異的である第二の抗体（たとえばラビット抗
マウス全抗体またはＳａｃ−Ｃｅｌ）を添加する。
を、一定量の動物モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／
Ｔ２Ｇｌｓおよび人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残
基１５−４２を含有する放射能標識ペプチドフラグメン
トからなる競合的放射能標識抗原と混合する（この競合
的放射能標識抗原たとえば 125ＩＢβ１５−４２リガン
ドは動物モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌ
ｓと結合することが出来る。両方の場合共、適当なイン
キュベーション期間後、場合により、動物モノクロナー
ル抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６またはＭＡｂ／Ｔ２
Ｇｌｓに特異的である第二の抗体（たとえばラビット抗
マウス全抗体またはＳａｃ−Ｃｅｌ）を添加する。
【００５３】第二のインキュベーション期間後、抗体が
結合した放射能標識抗原（リガンド）を分離して定量す
る、すなわち結合放射能標識抗原の放射能を計数する。
サンプル中に存在するＢβ１−４２（または１５−４
２）が「コールド」であるほど、そのサンプルでは結合
リガンドが少ない。
結合した放射能標識抗原（リガンド）を分離して定量す
る、すなわち結合放射能標識抗原の放射能を計数する。
サンプル中に存在するＢβ１−４２（または１５−４
２）が「コールド」であるほど、そのサンプルでは結合
リガンドが少ない。
【００５４】未知サンプル中の正確な量（すなわちＢβ
１−４２または１５−４２ペプチドの濃度）は、未知サ
ンプルの阻止値を各々Ｂβ１−４２または１５−４２標
準を用いて得られる阻止値と比較することにより、すな
わち、血漿サンプルを用いるＲＩＡテストの結果を、標
準量の既知抗原たとえば人フィブリノーゲンまたはフィ
ブリンＩのＢβ鎖の酸残基１−４２を含有するペプチド
フラグメントまたはフィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残
基１５−４２を含有するペプチドフラグメントを用いて
得られるＲＩＡテスト結果と比較することにより、測定
することが出来る。
１−４２または１５−４２ペプチドの濃度）は、未知サ
ンプルの阻止値を各々Ｂβ１−４２または１５−４２標
準を用いて得られる阻止値と比較することにより、すな
わち、血漿サンプルを用いるＲＩＡテストの結果を、標
準量の既知抗原たとえば人フィブリノーゲンまたはフィ
ブリンＩのＢβ鎖の酸残基１−４２を含有するペプチド
フラグメントまたはフィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残
基１５−４２を含有するペプチドフラグメントを用いて
得られるＲＩＡテスト結果と比較することにより、測定
することが出来る。
【００５５】別法として、前記抗原（すなわち、Ｂβ１
−４２または１５−４２）の存在はＥＬＩＳＡにより検
出することが出来る。この方法では、固体担体たとえば
ミクロタイタープレートに、たとえばＢβ１−４２、Ｎ
−ＤＳＫまたは無傷フィブリノーゲンを含有する人フィ
ブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のペプチドフ
ラグメントからなる競合的抗原を一晩被覆する。洗浄
「遮断」（非特異性結合を最小限にする）工程後、ＭＡ
ｂ／１−８ｃ６および血漿サンプル中の未知のペプチド
抗原（またはＢβ１−４２標準）を適当に希釈したもの
をミクロタイタープレートの適当なウエルに添加する。
−４２または１５−４２）の存在はＥＬＩＳＡにより検
出することが出来る。この方法では、固体担体たとえば
ミクロタイタープレートに、たとえばＢβ１−４２、Ｎ
−ＤＳＫまたは無傷フィブリノーゲンを含有する人フィ
ブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖のペプチドフ
ラグメントからなる競合的抗原を一晩被覆する。洗浄
「遮断」（非特異性結合を最小限にする）工程後、ＭＡ
ｂ／１−８ｃ６および血漿サンプル中の未知のペプチド
抗原（またはＢβ１−４２標準）を適当に希釈したもの
をミクロタイタープレートの適当なウエルに添加する。
【００５６】そのようなサンプル中に大過剰のＢβ１−
４２ペプチドが存在する場合、ＭＡｂ／１−８ｃ６はペ
プチドと反応し、ミクロタイタープレートの表面に最初
に被覆された前記抗原または関連抗原との結合にこの抗
体のほとんどは利用出来ない（前記参照）。抗原被覆プ
レートに結合することがある場合この抗体たとえばＭＡ
ｂ／１−８ｃ６の量は、プレートに結合した酵素結合抗
体（この抗体はマウス免疫グロブリンたとえばＭＡｂ／
１−８ｃ６に結合する、すなわち特異的である）の量を
すでに述べた方法（Engall,E.,In Methods in Enzymolo
gy, 70,Part A,419-439,1980) により測定することによ
って検出する。
４２ペプチドが存在する場合、ＭＡｂ／１−８ｃ６はペ
プチドと反応し、ミクロタイタープレートの表面に最初
に被覆された前記抗原または関連抗原との結合にこの抗
体のほとんどは利用出来ない（前記参照）。抗原被覆プ
レートに結合することがある場合この抗体たとえばＭＡ
ｂ／１−８ｃ６の量は、プレートに結合した酵素結合抗
体（この抗体はマウス免疫グロブリンたとえばＭＡｂ／
１−８ｃ６に結合する、すなわち特異的である）の量を
すでに述べた方法（Engall,E.,In Methods in Enzymolo
gy, 70,Part A,419-439,1980) により測定することによ
って検出する。
【００５７】未知サンプル中のたとえばＢβ１−４２の
量は、未知サンプルの阻止値をたとえばＢβ１−４２標
準を用いて得られる阻止値と比較することにより（すな
わち血漿サンプルを用いるＥＬＩＳＡテストの結果を既
知抗原すなわち、人フィブリノーゲンまたはフィブリン
ＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチド
フラグメントの標準量を用いて得られるＥＬＩＳＡテス
ト結果と比較することにより）測定する。前記ＥＬＩＳ
Ａ法は血漿サンプル中のＢβ１５−４２の存在の検出に
使用される。
量は、未知サンプルの阻止値をたとえばＢβ１−４２標
準を用いて得られる阻止値と比較することにより（すな
わち血漿サンプルを用いるＥＬＩＳＡテストの結果を既
知抗原すなわち、人フィブリノーゲンまたはフィブリン
ＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチド
フラグメントの標準量を用いて得られるＥＬＩＳＡテス
ト結果と比較することにより）測定する。前記ＥＬＩＳ
Ａ法は血漿サンプル中のＢβ１５−４２の存在の検出に
使用される。
【００５８】たとえば、ミクロタイタープレートに、人
フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有
するペプチドフラグメントからなる競合的抗原たとえば
Ｂβ１５−４２を被覆する。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓおよび
血漿サンプル中の未知のペプチド抗原（またはＢβ１５
−４２標準）をプレートのウエルに添加する。抗原被覆
プレートに結合したＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの量は、プレー
トに結合した酵素結合抗体（この抗体はマウス免疫グロ
ブリンたとえばＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓに結合する、すなわ
ち特異的である）の量を測定することにより検出する。
フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有
するペプチドフラグメントからなる競合的抗原たとえば
Ｂβ１５−４２を被覆する。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓおよび
血漿サンプル中の未知のペプチド抗原（またはＢβ１５
−４２標準）をプレートのウエルに添加する。抗原被覆
プレートに結合したＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの量は、プレー
トに結合した酵素結合抗体（この抗体はマウス免疫グロ
ブリンたとえばＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓに結合する、すなわ
ち特異的である）の量を測定することにより検出する。
【００５９】未知サンプル中のＢβ１５−４２の量は、
未知サンプルの阻止値をＢβ１５−４２標準を用いて得
られる阻止値と比較することにより（すなわち、血漿サ
ンプルを用いるＥＬＩＳＡテストの結果を、人フィブリ
ンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有する標準
ペプチドフラグメントを用いて得られるＥＬＩＳＡテス
ト結果と比較することにより）測定する。専門技術者が
患者に閉塞性血栓症が発病する可能性を検出出来る方法
は、血漿サンプルを２つの部分に分割し、そして（１）
１つの部分で人フィブリノーゲンまたはフィブリンIIの
Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラ
グメントの量を、および（２）もう１つの部分で人フィ
ブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有する
ペプチドフラグメントの量を測定することからなる。技
術者は、前述したようにＥＬＩＳＡまたはＲＩＡテスト
のいずれかを用いることが出来る。
未知サンプルの阻止値をＢβ１５−４２標準を用いて得
られる阻止値と比較することにより（すなわち、血漿サ
ンプルを用いるＥＬＩＳＡテストの結果を、人フィブリ
ンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有する標準
ペプチドフラグメントを用いて得られるＥＬＩＳＡテス
ト結果と比較することにより）測定する。専門技術者が
患者に閉塞性血栓症が発病する可能性を検出出来る方法
は、血漿サンプルを２つの部分に分割し、そして（１）
１つの部分で人フィブリノーゲンまたはフィブリンIIの
Ｂβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラ
グメントの量を、および（２）もう１つの部分で人フィ
ブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２を含有する
ペプチドフラグメントの量を測定することからなる。技
術者は、前述したようにＥＬＩＳＡまたはＲＩＡテスト
のいずれかを用いることが出来る。
【００６０】次に、患者の血漿中のペプチドフラグメン
トの相対量を比較することが出来る。Ｂβ１−４２がＢ
β１５−４２より優勢である場合、フィブリノーゲンま
たはフィブリンＩポリマーのプラスミンタンパク質加水
分解が行われていることが指摘される。Ｂβ１５−４２
がＢβ１−４２より優勢である場合、フィブリンIIが形
成されている。すなわち、患者に閉塞性血栓症の発病の
可能性があることが指摘される。
トの相対量を比較することが出来る。Ｂβ１−４２がＢ
β１５−４２より優勢である場合、フィブリノーゲンま
たはフィブリンＩポリマーのプラスミンタンパク質加水
分解が行われていることが指摘される。Ｂβ１５−４２
がＢβ１−４２より優勢である場合、フィブリンIIが形
成されている。すなわち、患者に閉塞性血栓症の発病の
可能性があることが指摘される。
【００６１】また、本発明は、フィブリノーゲンおよび
（または）フィブリンの生体内発生ペプチドの性状を調
らべるためのテストキットに関する。１つのそのような
テストキット、すなわち単一ペプチドキットでは、たと
えば人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメント
の存在が検出される。凍結乾燥した動物モノクロナール
抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６のアリコート（たとえ
ば０．５mg) を用意する。
（または）フィブリンの生体内発生ペプチドの性状を調
らべるためのテストキットに関する。１つのそのような
テストキット、すなわち単一ペプチドキットでは、たと
えば人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２を含有するペプチドフラグメント
の存在が検出される。凍結乾燥した動物モノクロナール
抗体たとえばＭＡｂ／１−８ｃ６のアリコート（たとえ
ば０．５mg) を用意する。
【００６２】また、フィブリノーゲンのアリコート（た
とえば２−４mg) も用意する。技術者はこのアリコート
を用いてＥＬＩＳＡテストで使用するミクロリットルプ
レートを被覆する。さらに、人フィブリノーゲンまたは
フィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有す
るペプチドフラグメントのアリコート（たとえば２０μ
ｇ）を用意する。これは、技術者により、フィブリノー
ゲン被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合するＭＡｂ／１−８
ｃ６の量が色強度（下記で説明）により示されるよう
に、テストサンプル溶液中の競合性抗原（Ｂβ１−４
２）の量が増加するにつれて減少する標準曲線をつくる
ために使用される。技術者は、競合性ＥＬＩＳＡテスト
で溶液として使用する既知量の抗原を得るために用意さ
れたＢβ１−４２の希釈液を調製する。
とえば２−４mg) も用意する。技術者はこのアリコート
を用いてＥＬＩＳＡテストで使用するミクロリットルプ
レートを被覆する。さらに、人フィブリノーゲンまたは
フィブリンＩのＢβ鎖のアミノ酸残基１−４２を含有す
るペプチドフラグメントのアリコート（たとえば２０μ
ｇ）を用意する。これは、技術者により、フィブリノー
ゲン被覆ＥＬＩＳＡプレートに結合するＭＡｂ／１−８
ｃ６の量が色強度（下記で説明）により示されるよう
に、テストサンプル溶液中の競合性抗原（Ｂβ１−４
２）の量が増加するにつれて減少する標準曲線をつくる
ために使用される。技術者は、競合性ＥＬＩＳＡテスト
で溶液として使用する既知量の抗原を得るために用意さ
れたＢβ１−４２の希釈液を調製する。
【００６３】この技術は良く知られている。また、動物
たとえばマウス免疫グロブリンに対する酵素結合（たと
えばペルオキシダーゼ結合）免疫グロブリン（たとえば
ラビット）を用意して、動物免疫グロブリンたとえばＭ
Ａｂ／１−８ｃ６のフィブリノーゲン被覆プレートへの
結合を検出する。酵素結合ＩｇＧ結合はＨ2 Ｏ2 −ｏ−
ジアニシジン溶液を用いて検出する。色強度はたとえば
ＭＲ５８０・マイクロエリサオートリーダー（Dynatec
h,Alexandria,VA) を用いて自動的に測定することが出
来る。
たとえばマウス免疫グロブリンに対する酵素結合（たと
えばペルオキシダーゼ結合）免疫グロブリン（たとえば
ラビット）を用意して、動物免疫グロブリンたとえばＭ
Ａｂ／１−８ｃ６のフィブリノーゲン被覆プレートへの
結合を検出する。酵素結合ＩｇＧ結合はＨ2 Ｏ2 −ｏ−
ジアニシジン溶液を用いて検出する。色強度はたとえば
ＭＲ５８０・マイクロエリサオートリーダー（Dynatec
h,Alexandria,VA) を用いて自動的に測定することが出
来る。
【００６４】標準曲線をつくったら、フィブリノーゲン
を除去すべく処理された血漿サンプル（たとえば例７に
記載）（この血漿サンプルは未知量のＢβ１−４２を含
有し得る）を用いてＥＬＩＳＡテストを行うことが出来
る。色強度を測定し、血漿サンプル中のＢβ１−４２量
を標準曲線から読み取ることが出来る。本発明による他
のテストキットすなわち単一ペプチド検出キットは、前
述の如く操作されるが、しかし血漿サンプル中に存在す
るＢβ１５−４２の量を測定する。凍結乾燥した動物モ
ノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓのアリコ
ート（たとえば０．５mg）を用意する。また、ミクロタ
イタープレートの被覆に用いるフィブリンのアリコート
（たとえば２−４mg）を用意する。また、動物たとえば
マウス免疫グロブリンに対する酵素結合免疫グロブリン
（たとえばラビット）と同様に人フィブリンIIのＢβ鎖
のアミノ酸残基を含有するペプチドフラグメントのアリ
コート（たとえば２０μｇ）を用意する。
を除去すべく処理された血漿サンプル（たとえば例７に
記載）（この血漿サンプルは未知量のＢβ１−４２を含
有し得る）を用いてＥＬＩＳＡテストを行うことが出来
る。色強度を測定し、血漿サンプル中のＢβ１−４２量
を標準曲線から読み取ることが出来る。本発明による他
のテストキットすなわち単一ペプチド検出キットは、前
述の如く操作されるが、しかし血漿サンプル中に存在す
るＢβ１５−４２の量を測定する。凍結乾燥した動物モ
ノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓのアリコ
ート（たとえば０．５mg）を用意する。また、ミクロタ
イタープレートの被覆に用いるフィブリンのアリコート
（たとえば２−４mg）を用意する。また、動物たとえば
マウス免疫グロブリンに対する酵素結合免疫グロブリン
（たとえばラビット）と同様に人フィブリンIIのＢβ鎖
のアミノ酸残基を含有するペプチドフラグメントのアリ
コート（たとえば２０μｇ）を用意する。
【００６５】本発明による本発明の好ましいテストキッ
トである。第三のテストキットすなわち２つの異なるペ
プチド検出用のペプチド検出キットを用いて血漿サンプ
ル中のＢβ１−４２およびＢβ１５−４２の両方を測定
することが出来る。血漿サンプルを２つの部分すなわち
Ｂβ１−４２の存在のテストに用いる部分と、Ｂβ１５
−４２の存在のテストに用いる部分に分割する。
トである。第三のテストキットすなわち２つの異なるペ
プチド検出用のペプチド検出キットを用いて血漿サンプ
ル中のＢβ１−４２およびＢβ１５−４２の両方を測定
することが出来る。血漿サンプルを２つの部分すなわち
Ｂβ１−４２の存在のテストに用いる部分と、Ｂβ１５
−４２の存在のテストに用いる部分に分割する。
【００６６】動物モノクロナール抗体たとえばＭＡｂ／
１−８ｃ６、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ、フィブリノーゲンお
よびフィブリン（プレート被覆用）、Ｂβ１−４２およ
びＢβ１５−４２（標準曲線作製用）および動物たとえ
ばマウス免疫グロブリンに対する酵素結合免疫グロブリ
ン（たとえばラビット）をすべて用意する。技術者は、
各単一ペプチド検出キットについて前述した手順に従
う。このようにして、各血漿サンプルにおいてＢβ１−
４２およびＢβ１５−４２の量を測定し、比較すること
が出来る。
１−８ｃ６、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ、フィブリノーゲンお
よびフィブリン（プレート被覆用）、Ｂβ１−４２およ
びＢβ１５−４２（標準曲線作製用）および動物たとえ
ばマウス免疫グロブリンに対する酵素結合免疫グロブリ
ン（たとえばラビット）をすべて用意する。技術者は、
各単一ペプチド検出キットについて前述した手順に従
う。このようにして、各血漿サンプルにおいてＢβ１−
４２およびＢβ１５−４２の量を測定し、比較すること
が出来る。
【００６７】前述したように、ＥＬＩＳＡの使用が好ま
しい。しかしながら、技術者は、キットの構成部分を用
いてＥＬＩＳＡの代りにＲＩＡを行ってペプチドフラグ
メントの量を測定することが出来る。前述したように、
本発明は、生体内で産生されつつあるフィブリン分子の
性状の迅速な分析手段を提供する。血漿テストサンプル
中でＢβ１−４２抗原がＢβ１５−４２の抗原より優勢
である場合、フィブリノーゲンまたはフィブリンＩポリ
マーのプラスミンタンパク質加水分解が起りつつあるこ
とが指摘される。他方、Ｂβ１５−４２抗原がＢβ１−
４２抗原より優勢である場合、フィブリンIIが循環して
いるかまたは血管壁に付着しつつある可能性がある（こ
の過程は閉塞性血栓症に至る）ことが臨床医に指摘され
る。
しい。しかしながら、技術者は、キットの構成部分を用
いてＥＬＩＳＡの代りにＲＩＡを行ってペプチドフラグ
メントの量を測定することが出来る。前述したように、
本発明は、生体内で産生されつつあるフィブリン分子の
性状の迅速な分析手段を提供する。血漿テストサンプル
中でＢβ１−４２抗原がＢβ１５−４２の抗原より優勢
である場合、フィブリノーゲンまたはフィブリンＩポリ
マーのプラスミンタンパク質加水分解が起りつつあるこ
とが指摘される。他方、Ｂβ１５−４２抗原がＢβ１−
４２抗原より優勢である場合、フィブリンIIが循環して
いるかまたは血管壁に付着しつつある可能性がある（こ
の過程は閉塞性血栓症に至る）ことが臨床医に指摘され
る。
【００６８】本発明では、免疫マウスからの脾細胞およ
び骨髄腫細胞を使用することが好ましいけれども、他の
動物たとえばラット、モルモットおよびラビットからの
細胞を使用することも出来る。
び骨髄腫細胞を使用することが好ましいけれども、他の
動物たとえばラット、モルモットおよびラビットからの
細胞を使用することも出来る。
【００６９】本発明の方法を用いて人間以外の種からの
フィブリノーゲンまたはフィブリンＩフラグメントに対
して抗体を生じさせることも出来る。たとえばラビット
またはドッグフィブリノーゲン、フィブリンＩまたはフ
ィブリンIIからのフラグメントを用いて、獣医学用に、
フィブリノーゲンまたはフィブリンＩに対して抗体を生
じさせることが出来る。このような抗体は、実験的血栓
症または血栓崩壊治療を取り扱う研究で使用することも
出来る。しかしながら、注目すべきことは、特定の種の
動物を治療する場合、抗体は異なる種の動物から誘導し
なければならないことである。
フィブリノーゲンまたはフィブリンＩフラグメントに対
して抗体を生じさせることも出来る。たとえばラビット
またはドッグフィブリノーゲン、フィブリンＩまたはフ
ィブリンIIからのフラグメントを用いて、獣医学用に、
フィブリノーゲンまたはフィブリンＩに対して抗体を生
じさせることが出来る。このような抗体は、実験的血栓
症または血栓崩壊治療を取り扱う研究で使用することも
出来る。しかしながら、注目すべきことは、特定の種の
動物を治療する場合、抗体は異なる種の動物から誘導し
なければならないことである。
【００７０】本発明の検定法を用いて、多数の外傷患者
群たとえば火傷患者、頭部および他の身体部位の損傷を
受けている患者、開心および冠状バイパス手術を含む手
術中の患者（検定法は手術前、中および後に行うことが
出来る）、血液透析患者、癌患者および深部静脈血栓症
患者においてフィブリノーゲンまたはフィブリン分解産
物を測定することが出来る。たとえば、股の手術を受け
ている初老の患者は、急性深部静脈血栓症を引き起すこ
とがある。
群たとえば火傷患者、頭部および他の身体部位の損傷を
受けている患者、開心および冠状バイパス手術を含む手
術中の患者（検定法は手術前、中および後に行うことが
出来る）、血液透析患者、癌患者および深部静脈血栓症
患者においてフィブリノーゲンまたはフィブリン分解産
物を測定することが出来る。たとえば、股の手術を受け
ている初老の患者は、急性深部静脈血栓症を引き起すこ
とがある。
【００７１】この状態を軽減するために、２つの治療方
法すなわちトロンビン（凝固）を除去する手術かまたは
フィブリン溶解剤たとえばストレプトキナーゼまたは組
織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）によ
るトロンビンの溶解を使用することが出来る。本発明の
方法を用いて前述した血栓崩壊剤により指摘されるよう
に、血餅溶解のごく初期の段階を検出することが出来
る。本発明の方法を用いて閉塞性血栓症にかかり得るま
たは潜在的にかかり得る患者においてフィブリノーゲン
またはフィブリン分解産物を検出することが出来る。
法すなわちトロンビン（凝固）を除去する手術かまたは
フィブリン溶解剤たとえばストレプトキナーゼまたは組
織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）によ
るトロンビンの溶解を使用することが出来る。本発明の
方法を用いて前述した血栓崩壊剤により指摘されるよう
に、血餅溶解のごく初期の段階を検出することが出来
る。本発明の方法を用いて閉塞性血栓症にかかり得るま
たは潜在的にかかり得る患者においてフィブリノーゲン
またはフィブリン分解産物を検出することが出来る。
【００７２】本発明のＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを治療に用い
て、閉塞性血栓にかかりつつあるかも知れない患者の血
流からフィブリンIIを除去することが出来る。たとえ
ば、血液透析を用いてそのような除去を行うことが出来
る。血液透析を用いる場合、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは固体
担体たとえばガラスビーズ上で固定化される。
て、閉塞性血栓にかかりつつあるかも知れない患者の血
流からフィブリンIIを除去することが出来る。たとえ
ば、血液透析を用いてそのような除去を行うことが出来
る。血液透析を用いる場合、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは固体
担体たとえばガラスビーズ上で固定化される。
【００７３】次いで、固定化ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ−固体
担体複合体は、血液透析室のある位置に置かれ、次いで
血液が患者に戻される。したがって、血液透析中、血液
は血液透析室を血液が固定化モノクロナール抗体と接触
するように流れてフィブリンIIが血液から実質的に除去
され、その後血液は患者の循環系に戻される。本発明を
さらに下記の非限定的例により説明する。
担体複合体は、血液透析室のある位置に置かれ、次いで
血液が患者に戻される。したがって、血液透析中、血液
は血液透析室を血液が固定化モノクロナール抗体と接触
するように流れてフィブリンIIが血液から実質的に除去
され、その後血液は患者の循環系に戻される。本発明を
さらに下記の非限定的例により説明する。
【００７４】
次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。例１ ：Ｎ−ＤＳＫ、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよび関連フラグ
メントの調製 IMCO corporation Ltd.(ストックホルム. スェーデン)
から人フィブリノーゲンを得た。このフィブリノーゲン
から、実質的にBlomack et al.,J.Biol. Chem.,248 ,5
806-5820,1973,の技術に従ってＮ−ＤＳＫを調製した。
しかしながら、向流分配を用いる代りに、セファデック
スＤＥＡＥＡ５０（Pharmacia,Piscataway,New Jersey)
によるイオン交換クロマトグラフィーを使用した。部分
的に純粋なＮ−ＤＳＫを０．１Ｍトリス中pH７．５でイ
オン交換樹脂に適用した。。Ｎ−ＤＳＫを、０．１Ｍト
リス、pH７．５（出発緩衝液）および０．１Ｍトリス、
pH７．５でつくりかつさらに０．３ＭＮａＣｌ（限界緩
衝液）を含有する線状塩勾配でカラムから溶離した。精
製工程の任意の段階からのＮ−ＤＳＫまたはＮ−ＤＳＫ
含有画分は、凍結乾燥により決して濃縮しなかった。
メントの調製 IMCO corporation Ltd.(ストックホルム. スェーデン)
から人フィブリノーゲンを得た。このフィブリノーゲン
から、実質的にBlomack et al.,J.Biol. Chem.,248 ,5
806-5820,1973,の技術に従ってＮ−ＤＳＫを調製した。
しかしながら、向流分配を用いる代りに、セファデック
スＤＥＡＥＡ５０（Pharmacia,Piscataway,New Jersey)
によるイオン交換クロマトグラフィーを使用した。部分
的に純粋なＮ−ＤＳＫを０．１Ｍトリス中pH７．５でイ
オン交換樹脂に適用した。。Ｎ−ＤＳＫを、０．１Ｍト
リス、pH７．５（出発緩衝液）および０．１Ｍトリス、
pH７．５でつくりかつさらに０．３ＭＮａＣｌ（限界緩
衝液）を含有する線状塩勾配でカラムから溶離した。精
製工程の任意の段階からのＮ−ＤＳＫまたはＮ−ＤＳＫ
含有画分は、凍結乾燥により決して濃縮しなかった。
【００７５】フィブリンゲルのトロンビン〔人トロンビ
ン、３０００ＮＩＨ単位／タンパク質１mg（Sigma,St.L
ouis,MO)〕およびバトロキソビン〔バスロップスアトロ
ックス マラジョエンシス（Bathropsatrox marajoen
sis)の毒液からの不溶化酵素、２０バトロキソビン単位
／懸濁液１ml（Pentapharm Ltd.,Balse,Switzerland)〕
分解から（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫを各
々調製した。フィブリノーゲン溶液を、Koehn and Canf
ield, Analyt.Biochem.,116,349-356,1981, に記載の如
くしてつくった。５単位／ml（トロンビンまたはバトロ
キソビン）を添加して凝固を開始し、３７℃で約６時間
分解を続けた。ＣＮＢｒ分解および続くすべての単離手
順は、Ｎ−ＤＳＫの場合と同じであった。
ン、３０００ＮＩＨ単位／タンパク質１mg（Sigma,St.L
ouis,MO)〕およびバトロキソビン〔バスロップスアトロ
ックス マラジョエンシス（Bathropsatrox marajoen
sis)の毒液からの不溶化酵素、２０バトロキソビン単位
／懸濁液１ml（Pentapharm Ltd.,Balse,Switzerland)〕
分解から（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫを各
々調製した。フィブリノーゲン溶液を、Koehn and Canf
ield, Analyt.Biochem.,116,349-356,1981, に記載の如
くしてつくった。５単位／ml（トロンビンまたはバトロ
キソビン）を添加して凝固を開始し、３７℃で約６時間
分解を続けた。ＣＮＢｒ分解および続くすべての単離手
順は、Ｎ−ＤＳＫの場合と同じであった。
【００７６】また、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＮ−ＤＳＫから
直接調製した。Ｎ−ＤＳＫの溶液（０．５−１．０mg／
ml）を０．１５ＭＮａＣｌを含有する０．１Ｍトリス
（pH７．５）でつくり、これらの溶液を２つの等しい部
分に分割した。トロンビン（１０ＮＩＨ単位１ml）を１
つのアリコートに添加し、等容量の生理的食塩水をもう
一方のアリコートに添加した。両サンプル共３７℃で４
時間培養し、その後、高特異性トロンビン阻害剤Ｄ−Ｐ
ｂｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ2 Ｃｌ（Calbiochem-Behri
ng,SanDiego,Califonia)のアリコート（１０μｌの０．
９×１０-4Ｍ原液／分解液１ml）を両サンプルに添加し
た。
直接調製した。Ｎ−ＤＳＫの溶液（０．５−１．０mg／
ml）を０．１５ＭＮａＣｌを含有する０．１Ｍトリス
（pH７．５）でつくり、これらの溶液を２つの等しい部
分に分割した。トロンビン（１０ＮＩＨ単位１ml）を１
つのアリコートに添加し、等容量の生理的食塩水をもう
一方のアリコートに添加した。両サンプル共３７℃で４
時間培養し、その後、高特異性トロンビン阻害剤Ｄ−Ｐ
ｂｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＣＨ2 Ｃｌ（Calbiochem-Behri
ng,SanDiego,Califonia)のアリコート（１０μｌの０．
９×１０-4Ｍ原液／分解液１ml）を両サンプルに添加し
た。
【００７７】フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）およびフ
ィブリノペプチドＢ（ＦＰＢ）ラジオイムノアッセイを
用いてトロンビン分解産物を測定する。IMCO Corporati
on Ltd.(ストックホルム、スエーデン) から供給される
キットおよび方法を用いてＦＰＡ検定を行った。ＦＰＢ
検定は、Bilezikian et al.,J.Clin.Invest, 56,438-4
45,1975,の方法により行った。Ｎ−ＤＳＫの鎖およびフ
ィブリノーゲンのプラスミン分解産物を前述の如くして
調製した（Blombaeck et al., J.Biol.Chem.,241 ,1496
-1512,1972 およびJ.biol.Chem., 248 ,5806-5820,197
3;Gardlund etal. Thromb. Res., １,371-388,1972)。
種々の技術を用いてＮ−ＤＳＫおよびその関連フラグメ
ントの純度を測定した。
ィブリノペプチドＢ（ＦＰＢ）ラジオイムノアッセイを
用いてトロンビン分解産物を測定する。IMCO Corporati
on Ltd.(ストックホルム、スエーデン) から供給される
キットおよび方法を用いてＦＰＡ検定を行った。ＦＰＢ
検定は、Bilezikian et al.,J.Clin.Invest, 56,438-4
45,1975,の方法により行った。Ｎ−ＤＳＫの鎖およびフ
ィブリノーゲンのプラスミン分解産物を前述の如くして
調製した（Blombaeck et al., J.Biol.Chem.,241 ,1496
-1512,1972 およびJ.biol.Chem., 248 ,5806-5820,197
3;Gardlund etal. Thromb. Res., １,371-388,1972)。
種々の技術を用いてＮ−ＤＳＫおよびその関連フラグメ
ントの純度を測定した。
【００７８】１０８４Ｂヒューレット−パッカード液体
クロマトグラフィーを用いて分析および分取クロマトグ
ラフィーを行った。カラムおよびクロマトグラフィー条
件は、Koehn and Canfield, Analyt. Biochem.116,349-
356,1981, に記載されているものと同じであった。Ｎ−
ＤＳＫおよび関連構造体のエレクトロイムノアッセイは
前述と同様であった (Kudryk et al.,前出、1982) 。Ｎ
−ＤＳＫ抗血清（２４１６）を熱ゲル溶液と混合して約
０．４％の抗血清濃度とすることによりゲルをつくっ
た。ゲル電気泳動およびアミノ酸分析は、記載された通
りであった（Blombaeck et al., J.Biol.Chem. 248 ,5
806-5820,1973;Hessel et al.,Eur. J. Biochem., 9
8,521-534,1979)。
クロマトグラフィーを用いて分析および分取クロマトグ
ラフィーを行った。カラムおよびクロマトグラフィー条
件は、Koehn and Canfield, Analyt. Biochem.116,349-
356,1981, に記載されているものと同じであった。Ｎ−
ＤＳＫおよび関連構造体のエレクトロイムノアッセイは
前述と同様であった (Kudryk et al.,前出、1982) 。Ｎ
−ＤＳＫ抗血清（２４１６）を熱ゲル溶液と混合して約
０．４％の抗血清濃度とすることによりゲルをつくっ
た。ゲル電気泳動およびアミノ酸分析は、記載された通
りであった（Blombaeck et al., J.Biol.Chem. 248 ,5
806-5820,1973;Hessel et al.,Eur. J. Biochem., 9
8,521-534,1979)。
【００７９】ジスルフィド結合Ｎ−ＤＳＫ、（Ｔ）Ｎ−
ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫは、図１に示すように、
ＳＤＳの存在下７％アクリルアミドゲル中でわずかであ
るが検出可能な移動度差を示した。還元後、ＳＤＳの存
在下１０％アクリルアミドゲル中で各フラグメントの鎖
について特性帯パターンを得た（図示せず）。すなわ
ち、Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはＡα鎖の移動
度のみが異なっていた。Ｎ−ＤＳＫと比較すると、還元
（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＡαおよびＢβ鎖の両方について異
なる移動度を示した。これらの観察は他の人々によって
報告されているものと一致した（Hessel,Doctoral thes
is,Chem.Dept.Karolinska Institute,Stockholm,Swede
n,1975; Hessel et al., Eur.J.Biochem., 98, 521-53
4,1979) 。各々の成分フィブリノペプチド含量を測定す
るために、３つのＮ−ＤＳＫ種をトロンビンで処理し
た。この後、各分解液を９％トリクロル酢酸に調節し、
もしあればトロンビン分解ペプチドを、前述したように
Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ18カートリッジに吸着させて上澄み
液から単離した (Koehn and Canfield, 前出,1981)。
ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫは、図１に示すように、
ＳＤＳの存在下７％アクリルアミドゲル中でわずかであ
るが検出可能な移動度差を示した。還元後、ＳＤＳの存
在下１０％アクリルアミドゲル中で各フラグメントの鎖
について特性帯パターンを得た（図示せず）。すなわ
ち、Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはＡα鎖の移動
度のみが異なっていた。Ｎ−ＤＳＫと比較すると、還元
（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＡαおよびＢβ鎖の両方について異
なる移動度を示した。これらの観察は他の人々によって
報告されているものと一致した（Hessel,Doctoral thes
is,Chem.Dept.Karolinska Institute,Stockholm,Swede
n,1975; Hessel et al., Eur.J.Biochem., 98, 521-53
4,1979) 。各々の成分フィブリノペプチド含量を測定す
るために、３つのＮ−ＤＳＫ種をトロンビンで処理し
た。この後、各分解液を９％トリクロル酢酸に調節し、
もしあればトロンビン分解ペプチドを、前述したように
Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ18カートリッジに吸着させて上澄み
液から単離した (Koehn and Canfield, 前出,1981)。
【００８０】その後、図２に示すように、ペプチドを高
性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により同定し
た。ＦＰＡおよびＦＰＢ共Ｎ−ＤＳＫから放出された
（図２のａ）。（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫのトロンビン分解物か
ら取得された主要ペプチドはＦＰＢであった（図２の
ｂ）。ゲル濾過（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫをトロンビンで２回分
解した場合、ペプチドは放出されなかった。Ｎ−ＤＳＫ
の成分鎖は１０％アクリルアミドゲルで単一帯を示し、
すでに記載されたものと一致するアミノ酸組成を示した
（Blombaeck et al., 前記,1972,1973;Hessel et al.,
前記,1979)。
性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により同定し
た。ＦＰＡおよびＦＰＢ共Ｎ−ＤＳＫから放出された
（図２のａ）。（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫのトロンビン分解物か
ら取得された主要ペプチドはＦＰＢであった（図２の
ｂ）。ゲル濾過（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫをトロンビンで２回分
解した場合、ペプチドは放出されなかった。Ｎ−ＤＳＫ
の成分鎖は１０％アクリルアミドゲルで単一帯を示し、
すでに記載されたものと一致するアミノ酸組成を示した
（Blombaeck et al., 前記,1972,1973;Hessel et al.,
前記,1979)。
【００８１】次のようにしてプラスミノーゲン含有フィ
ブリノーゲン溶液を活性化することによりペプチドＢβ
１−４２を調製した。ＩＭＣＯフィブリノーゲン（Ｌｏ
ｔＦ−１７１）を０．０５Ｍトリス（pH７．４）中で約
４．０mg／ml濃度に希釈した。１００Ｕ／mlのストレプ
トキナーゼ〔Ｌｏｔ １１２Ｆ−０３７３）、４５００
Ｕ／固体１mg、Sigma,St.Louis,MO 〕を添加後、３７℃
／６０分で分解を進行させた。
ブリノーゲン溶液を活性化することによりペプチドＢβ
１−４２を調製した。ＩＭＣＯフィブリノーゲン（Ｌｏ
ｔＦ−１７１）を０．０５Ｍトリス（pH７．４）中で約
４．０mg／ml濃度に希釈した。１００Ｕ／mlのストレプ
トキナーゼ〔Ｌｏｔ １１２Ｆ−０３７３）、４５００
Ｕ／固体１mg、Sigma,St.Louis,MO 〕を添加後、３７℃
／６０分で分解を進行させた。
【００８２】この後、６０℃／３０分で加熱することに
より非分解フィブリノーゲンのほとんどを沈殿させた。
遠心分離後、上澄み液をＳｃｐ−Ｐａｃ Ｃ18カートリ
ッジ（Waters Associates,Milford,MA) に通した。Ｂβ
１−４２を含む吸着ペプチドを５０％アセトニトリルを
用いて溶離した。その後、高性能液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）を用いてＢβ１−４２ペプチドを精製し
た。カラムおよび手順は、Koehm & Canfield, Analyt.B
iochem. 116 ,349-356,1981,に記載のものと実質的に同
じであった。
より非分解フィブリノーゲンのほとんどを沈殿させた。
遠心分離後、上澄み液をＳｃｐ−Ｐａｃ Ｃ18カートリ
ッジ（Waters Associates,Milford,MA) に通した。Ｂβ
１−４２を含む吸着ペプチドを５０％アセトニトリルを
用いて溶離した。その後、高性能液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）を用いてＢβ１−４２ペプチドを精製し
た。カラムおよび手順は、Koehm & Canfield, Analyt.B
iochem. 116 ,349-356,1981,に記載のものと実質的に同
じであった。
【００８３】ストレプトキナーゼ活性化の結果としてフ
ィブリノーゲンから放出されたペプチドは、非常に複雑
なＨＰＬＣパターン（図示せず）を示した。ＨＰＬＣ画
分の免疫反応性を前述のように（Kudryk et al.,前出,1
982)Ｂβ１５−４２ラジオイムノアッセイで追跡するこ
とにより、幾つかの反応性ピークを得た。これらの画分
の１つを分取ＨＰＬＣ操作で単離した。図９のａに示す
ように、画分１６またはその近くで溶離するピークはＢ
β１５−４２に対するラビット抗血清と反応した。この
抗血清はＢβ１５−４２とＢβ１−４２を区別しないの
でこれらの結果は予期された（Kudryk et al.,前出,198
2)。この同じ物質Ｂβ１−４２のアリコートを人トロン
ビンで分解し、同じ条件下で再びクロマトグラフィーに
かけると、図９のｂに示すパターンが観察された。
ィブリノーゲンから放出されたペプチドは、非常に複雑
なＨＰＬＣパターン（図示せず）を示した。ＨＰＬＣ画
分の免疫反応性を前述のように（Kudryk et al.,前出,1
982)Ｂβ１５−４２ラジオイムノアッセイで追跡するこ
とにより、幾つかの反応性ピークを得た。これらの画分
の１つを分取ＨＰＬＣ操作で単離した。図９のａに示す
ように、画分１６またはその近くで溶離するピークはＢ
β１５−４２に対するラビット抗血清と反応した。この
抗血清はＢβ１５−４２とＢβ１−４２を区別しないの
でこれらの結果は予期された（Kudryk et al.,前出,198
2)。この同じ物質Ｂβ１−４２のアリコートを人トロン
ビンで分解し、同じ条件下で再びクロマトグラフィーに
かけると、図９のｂに示すパターンが観察された。
【００８４】トロンビン分解の結果として、図９のａに
示すピークは消失し、２つの新しいピークが現われた。
これらのピークの１つは画分６−８またはその近くで溶
離し、Ｂβ１５−４２イムノアッセイで反応した。この
物質はＢβ１５−４２として同定され、１４Ａｒｇ−１
５Ｇｌｙ結合でＢβ１−４２のトロンビン分解から生じ
た。ＨＰＬＣにより同じ条件下で分離した場合、ＩＭＣ
Ｏ標準Ｂβ１５−４２もこの位置で溶離した（図示せ
ず）。画分２１またはその付近で溶離する第２のピーク
はＦＰＢと同定された。これは、ＨＬＰＣ系におけるＦ
ＰＢ標準の公知溶離位置から確認された。さらに、画分
２１ピークはＦＰＢラジオイムノアッセイで反応した
（図示せず）。
示すピークは消失し、２つの新しいピークが現われた。
これらのピークの１つは画分６−８またはその近くで溶
離し、Ｂβ１５−４２イムノアッセイで反応した。この
物質はＢβ１５−４２として同定され、１４Ａｒｇ−１
５Ｇｌｙ結合でＢβ１−４２のトロンビン分解から生じ
た。ＨＰＬＣにより同じ条件下で分離した場合、ＩＭＣ
Ｏ標準Ｂβ１５−４２もこの位置で溶離した（図示せ
ず）。画分２１またはその付近で溶離する第２のピーク
はＦＰＢと同定された。これは、ＨＬＰＣ系におけるＦ
ＰＢ標準の公知溶離位置から確認された。さらに、画分
２１ピークはＦＰＢラジオイムノアッセイで反応した
（図示せず）。
【００８５】ペプチドＢβ１５−４２はＩＭＣＯから得
または前述したように人トロンビン〔３０００ＮＩＨ単
位／タンパク質１mg、Sigma,St.Louis,MO 〕で分解する
ことによりＢβ１−４２から直接調製した。後者の方法
では、Ｂβ１−４２を０．２ＭＮＨ4 ＨＣＯ3 ＣＰＨ
８．０）に溶解し、３７℃／９０分で分解を行った。こ
の後、高特異性トロンビン阻害剤Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−ＣＨ2 Ｃｌ（Calbiochem-Behring,SanDiego,C
A) のアリコート（１０μｌの０．９×１０-4Ｍ原液／
分解液１ml）を添加して分解を停止した。
または前述したように人トロンビン〔３０００ＮＩＨ単
位／タンパク質１mg、Sigma,St.Louis,MO 〕で分解する
ことによりＢβ１−４２から直接調製した。後者の方法
では、Ｂβ１−４２を０．２ＭＮＨ4 ＨＣＯ3 ＣＰＨ
８．０）に溶解し、３７℃／９０分で分解を行った。こ
の後、高特異性トロンビン阻害剤Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ−ＣＨ2 Ｃｌ（Calbiochem-Behring,SanDiego,C
A) のアリコート（１０μｌの０．９×１０-4Ｍ原液／
分解液１ml）を添加して分解を停止した。
【００８６】例２：モノクロナール抗体の産生 ＭＡｂ／１−８ｃ６を産生するために、ＢＡＬＢ／ｃＪ
マウス（Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME.)の各々
に、Ｎ−ＤＳＫ溶液（４mg／ml）のエマルジョン０．１
mlおよび等容量の完全フロイントアジュバントを腹腔内
（ｉ．ｐ．）注射して免疫した。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌを産
生するために、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの各々に、１００
μｇ（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを完全フロイントアジュバントと
混合したものをｉ．ｐ．注射して免疫した。
マウス（Jackson Laboratories,Bar Harbor,ME.)の各々
に、Ｎ−ＤＳＫ溶液（４mg／ml）のエマルジョン０．１
mlおよび等容量の完全フロイントアジュバントを腹腔内
（ｉ．ｐ．）注射して免疫した。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌを産
生するために、ＢＡＬＢ／ｃＪマウスの各々に、１００
μｇ（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを完全フロイントアジュバントと
混合したものをｉ．ｐ．注射して免疫した。
【００８７】両方の場合共、マウスに１週間おきに同じ
投与量（不完全フロイントアジュバントを用いて）を４
回追加注射した。ＭＡｂ／１−８ｃ６産生の場合、１０
週間休止後、トリス−生理的食塩水中１００μｇのＮ−
ＤＳＫを用いて動物の腹腔内（ｉ．ｖ．）に追加注射し
た。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌ産生の場合、最初の注射ｉ．ｖ．
後５週間してトリス−生理的食塩水中１００μｇの
（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを追加注射した。両方の場合共、３日
後にマウスから脾臓を摘出し、組織をステンレス鋼金網
から押し出して単一細胞懸濁液をつくった。
投与量（不完全フロイントアジュバントを用いて）を４
回追加注射した。ＭＡｂ／１−８ｃ６産生の場合、１０
週間休止後、トリス−生理的食塩水中１００μｇのＮ−
ＤＳＫを用いて動物の腹腔内（ｉ．ｖ．）に追加注射し
た。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌ産生の場合、最初の注射ｉ．ｖ．
後５週間してトリス−生理的食塩水中１００μｇの
（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫを追加注射した。両方の場合共、３日
後にマウスから脾臓を摘出し、組織をステンレス鋼金網
から押し出して単一細胞懸濁液をつくった。
【００８８】両方の場合共、細胞融合は、Kohler and M
ilstein,Eur.J.Immun.,6,511-519,1976,に記載の方法に
より行った。脾細胞を、ＰＰＭＩ １６４０培地（GIBC
O Labs,Grand Island N.Y.) で３５％ポリエチレングリ
コール１０００（Koch-LightLabs,Colmbrook,U.K.) 中
で骨髄腫細胞〔Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３〕と４：１
（ＭＡｂ／１−８ｃ６）または７：１（ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ
ｌｓ）の割合で室温で１分間融合させた。
ilstein,Eur.J.Immun.,6,511-519,1976,に記載の方法に
より行った。脾細胞を、ＰＰＭＩ １６４０培地（GIBC
O Labs,Grand Island N.Y.) で３５％ポリエチレングリ
コール１０００（Koch-LightLabs,Colmbrook,U.K.) 中
で骨髄腫細胞〔Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３〕と４：１
（ＭＡｂ／１−８ｃ６）または７：１（ＭＡｂ／Ｔ２Ｇ
ｌｓ）の割合で室温で１分間融合させた。
【００８９】細胞を小球形にし、洗浄し、そして１０％
ＮＣＴＣ １０９（ＭＡバイオプロダクツ、Nalkersvil
le,MO)および２０％ウシ胎児血清（ステリルシステム
ズ、Logan,VT) を含有する２１５mlＲＰＭＩ １６４０
に再懸濁させた。正常脾細胞（１０8 ）を支持細胞層と
して添加した。湿潤した５％ＣＯ2 雰囲気中、３７℃で
一晩培養後、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジ
ン（ＨＡＴ）培地（Littlefield,Science,145,709-710,
1964) を添加してＨＡＴ選択を開始した。５％ＣＯ
2 中、３７℃で一晩培養後、９６−ウエル培地プレート
〔コースター３５９６（Cambridge,MA) 〕で限界希釈を
行って前記ＨＡＴ培地中の細胞をクローン化した。ハイ
ブリドーマクローンを１６日間培養し、次いで培地の抗
体を検定した。
ＮＣＴＣ １０９（ＭＡバイオプロダクツ、Nalkersvil
le,MO)および２０％ウシ胎児血清（ステリルシステム
ズ、Logan,VT) を含有する２１５mlＲＰＭＩ １６４０
に再懸濁させた。正常脾細胞（１０8 ）を支持細胞層と
して添加した。湿潤した５％ＣＯ2 雰囲気中、３７℃で
一晩培養後、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジ
ン（ＨＡＴ）培地（Littlefield,Science,145,709-710,
1964) を添加してＨＡＴ選択を開始した。５％ＣＯ
2 中、３７℃で一晩培養後、９６−ウエル培地プレート
〔コースター３５９６（Cambridge,MA) 〕で限界希釈を
行って前記ＨＡＴ培地中の細胞をクローン化した。ハイ
ブリドーマクローンを１６日間培養し、次いで培地の抗
体を検定した。
【００９０】例３：ハイブリドーマにより産生される抗
Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ抗体の検出 ハイブリドーマ培地の最初のテストは、Engavall, Meth
ods in Enzymology,70(PartA),419-439,1980,Acad.Pre
ss,N.Y. のＥＬＩＳＡ方法により行った。クローン培地
液をポリビニルミクロタイタープレート（Costar,Cambr
idge,MA.) 上でスクリーニングした。 各ウエルは６個の抗体：フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳ
Ｋ、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、Ｎ−ＤＳＫのＡα１−５１、Ｂ
β１−１１８またはγ１−７８鎖の１つを、Ｎａ2 ＣＯ
3 ／ＮａＨＣＯ3 （pH９．６）中約５−１５μｇ／mlの
濃度で含有した。未希釈クローン培地液のアリコートを
６個の「抗原」ウエルの各々に添加した。
Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ抗体の検出 ハイブリドーマ培地の最初のテストは、Engavall, Meth
ods in Enzymology,70(PartA),419-439,1980,Acad.Pre
ss,N.Y. のＥＬＩＳＡ方法により行った。クローン培地
液をポリビニルミクロタイタープレート（Costar,Cambr
idge,MA.) 上でスクリーニングした。 各ウエルは６個の抗体：フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳ
Ｋ、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、Ｎ−ＤＳＫのＡα１−５１、Ｂ
β１−１１８またはγ１−７８鎖の１つを、Ｎａ2 ＣＯ
3 ／ＮａＨＣＯ3 （pH９．６）中約５−１５μｇ／mlの
濃度で含有した。未希釈クローン培地液のアリコートを
６個の「抗原」ウエルの各々に添加した。
【００９１】培養・洗浄サイクル後、マウス免疫グロブ
リン〔Accurate Chemicals,Westbury,N.Y.〕試薬に対す
るペルオキシダーゼ結合ラビット免疫グロブリンを適当
に希釈したものを添加した。Ｈ2 Ｏ2 −ｏ−ジアニシジ
ン溶液を用いて酵素結合ＩｇＧ結合を検定した。ＭＲ５
８０マイクロエリサオートリーダー（Dynatech,Alexand
ria,VA.)を用いて色強度を自動的に測定した。検定可能
な抗Ｎ−ＤＳＫ抗体についてテストした１８２のハイブ
リドーマクローンの中で、１つ（ＡＴＣＣＨＢ８４１
８）は、抗原（Ｎ−ＤＳＫ）とばかりでなく、無傷フィ
ブリノーゲン、（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ、Ｂβ１−１１８およ
びＢβ１−４２とも反応する抗体をきわめて高濃度で産
生した。１０％ＮＣＴＣ１０９および２０％ウシ胎児血
清を含有するＲＰＭＩ １６４０でハイブリドーマを培
養することにより、多量のＭＡｂ／１−８ｃ６を得た。
リン〔Accurate Chemicals,Westbury,N.Y.〕試薬に対す
るペルオキシダーゼ結合ラビット免疫グロブリンを適当
に希釈したものを添加した。Ｈ2 Ｏ2 −ｏ−ジアニシジ
ン溶液を用いて酵素結合ＩｇＧ結合を検定した。ＭＲ５
８０マイクロエリサオートリーダー（Dynatech,Alexand
ria,VA.)を用いて色強度を自動的に測定した。検定可能
な抗Ｎ−ＤＳＫ抗体についてテストした１８２のハイブ
リドーマクローンの中で、１つ（ＡＴＣＣＨＢ８４１
８）は、抗原（Ｎ−ＤＳＫ）とばかりでなく、無傷フィ
ブリノーゲン、（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ、Ｂβ１−１１８およ
びＢβ１−４２とも反応する抗体をきわめて高濃度で産
生した。１０％ＮＣＴＣ１０９および２０％ウシ胎児血
清を含有するＲＰＭＩ １６４０でハイブリドーマを培
養することにより、多量のＭＡｂ／１−８ｃ６を得た。
【００９２】その後、半飽和硫酸アンモニウムで沈殿さ
せてＭＡｂ／１−８ｃ６を精製し、第２沈殿から得られ
たＩｇＧを０．０２％ＮａＮ3 を含有する０．１Ｍトリ
ス（pH７．５）に溶解した。最終溶液は培地の最初の容
量の１／１０であった。ＩｇＧクラスの測定を、ラビッ
ト抗マウス免疫グロブリンクラス−特異性抗血清（Litt
on Bionetics Inc.,Charleston,SC)を用いてオクテルロ
ニー法によりテストした。図３に示すように、ＭＡｂ／
１−８ｃ６はＩｇＧ2a抗血清とのみ反応した。抗体のＬ
鎖クラスは測定されなかった。
せてＭＡｂ／１−８ｃ６を精製し、第２沈殿から得られ
たＩｇＧを０．０２％ＮａＮ3 を含有する０．１Ｍトリ
ス（pH７．５）に溶解した。最終溶液は培地の最初の容
量の１／１０であった。ＩｇＧクラスの測定を、ラビッ
ト抗マウス免疫グロブリンクラス−特異性抗血清（Litt
on Bionetics Inc.,Charleston,SC)を用いてオクテルロ
ニー法によりテストした。図３に示すように、ＭＡｂ／
１−８ｃ６はＩｇＧ2a抗血清とのみ反応した。抗体のＬ
鎖クラスは測定されなかった。
【００９３】抗（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ抗体についてテストし
た１６３２のハイブリドーマクローンの中で、２４７の
クローンはそのような抗体を非常に高濃度産生した。ま
た、これらのクローン培地液のほとんどはＮ−ＤＳＫお
よびフィブリノーゲン被覆プレートと反応した。しかし
ながら、クローンＴ２Ｇ１は、前述の３種類のものを被
覆したプレートすべてと結合する他に、溶解した 125Ｉ
Ｂβ１５−４２リガンドとも結合する抗体を産生した。
種々の交差反応性を有するために、Ｔ２Ｇｌは混合クロ
ーンと見なされ、したがって、サブクローン化した。ク
ローン化工程後、テストした９６の中で単一個クローン
（Ｔ２Ｇｌｓ）は、ＥＬＩＳＡにより、（Ｔ）Ｎ−ＤＳ
Ｋ被覆プレートと反応するばかりでなく、溶解した 125
ＩＢβ１５−４２と結合することも出来る抗体を分泌す
ることが判明した。
た１６３２のハイブリドーマクローンの中で、２４７の
クローンはそのような抗体を非常に高濃度産生した。ま
た、これらのクローン培地液のほとんどはＮ−ＤＳＫお
よびフィブリノーゲン被覆プレートと反応した。しかし
ながら、クローンＴ２Ｇ１は、前述の３種類のものを被
覆したプレートすべてと結合する他に、溶解した 125Ｉ
Ｂβ１５−４２リガンドとも結合する抗体を産生した。
種々の交差反応性を有するために、Ｔ２Ｇｌは混合クロ
ーンと見なされ、したがって、サブクローン化した。ク
ローン化工程後、テストした９６の中で単一個クローン
（Ｔ２Ｇｌｓ）は、ＥＬＩＳＡにより、（Ｔ）Ｎ−ＤＳ
Ｋ被覆プレートと反応するばかりでなく、溶解した 125
ＩＢβ１５−４２と結合することも出来る抗体を分泌す
ることが判明した。
【００９４】サブクローン化後、１０％ＮＣＴＣ １０
９および２０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６
４０中でクローンＴ２Ｇｌｓの大量培養物を調製した。
このハイブリドーマの廃培地に蓄積した抗体〔ＭＡｂ／
Ｔ２Ｇｌｓ〕を半飽和硫酸アンモニウムで沈殿させるこ
とにより精製し、第二沈殿から得られたＩｇＧを０．０
２％ＮａＨ3 を含有する０．１Ｍトリス（pH７．５）に
溶解した。最終溶液は培地の最初の容量の１／１０であ
った。前述したようにオクテルロニーテストにより測定
した際、ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓはＩｇＧｌ抗血清とのみ反
応した。ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓのＬ鎖クラスは測定されな
かった。
９および２０％ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ １６
４０中でクローンＴ２Ｇｌｓの大量培養物を調製した。
このハイブリドーマの廃培地に蓄積した抗体〔ＭＡｂ／
Ｔ２Ｇｌｓ〕を半飽和硫酸アンモニウムで沈殿させるこ
とにより精製し、第二沈殿から得られたＩｇＧを０．０
２％ＮａＨ3 を含有する０．１Ｍトリス（pH７．５）に
溶解した。最終溶液は培地の最初の容量の１／１０であ
った。前述したようにオクテルロニーテストにより測定
した際、ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓはＩｇＧｌ抗血清とのみ反
応した。ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓのＬ鎖クラスは測定されな
かった。
【００９５】例４：ＭＡｂ／１−８ｃ６のＮ−ＤＳＫお
よび関連構造体に対する特異性 前述したようにハイブリドーマクローン１−８ｃ６（Ａ
ＴＣＣＨＢ８４１８）からの最初の培養液を、Ｎ−ＤＳ
Ｋまたは前述した関連構造体のいずれかを被覆したプレ
ート上でＥＬＩＳＡによりテストした。Ｎ−ＤＳＫ、フ
ィブリノーゲンまたはＢβ１−１１８を有するプレート
で強いプラス反応が得られた。ＥＬＩＳＡおよびラジオ
イムノアッセイの両方を用いて競合免疫検定法によりＭ
Ａｂ／１−８ｃ６の特異性をさらに検討した。ＥＬＩＳ
Ａは二段法であった。
よび関連構造体に対する特異性 前述したようにハイブリドーマクローン１−８ｃ６（Ａ
ＴＣＣＨＢ８４１８）からの最初の培養液を、Ｎ−ＤＳ
Ｋまたは前述した関連構造体のいずれかを被覆したプレ
ート上でＥＬＩＳＡによりテストした。Ｎ−ＤＳＫ、フ
ィブリノーゲンまたはＢβ１−１１８を有するプレート
で強いプラス反応が得られた。ＥＬＩＳＡおよびラジオ
イムノアッセイの両方を用いて競合免疫検定法によりＭ
Ａｂ／１−８ｃ６の特異性をさらに検討した。ＥＬＩＳ
Ａは二段法であった。
【００９６】ミクロタイタープレートに、Ｂβ１−１１
８（５μｇ／ml）を＋４℃／１６hrで被覆した。ＭＡｂ
／１−８ｃ６をＴＰＢＳ（洗剤トウイーンを含有する燐
酸塩緩衝生理的食塩水）中で希釈し、Ａ490 ／１０分値
を１．５−２．０とした。この抗体希釈液を標準（Ｂβ
１−１１８）または他の所望の競合抗原と混合し、プレ
ートに添加した。洗浄後、固相に結合したＭＡｂ／１−
８ｃ６の量を、前述した酵素抗免疫グロブリン結合基質
および色原体溶液（例３）を用いて検出した。
８（５μｇ／ml）を＋４℃／１６hrで被覆した。ＭＡｂ
／１−８ｃ６をＴＰＢＳ（洗剤トウイーンを含有する燐
酸塩緩衝生理的食塩水）中で希釈し、Ａ490 ／１０分値
を１．５−２．０とした。この抗体希釈液を標準（Ｂβ
１−１１８）または他の所望の競合抗原と混合し、プレ
ートに添加した。洗浄後、固相に結合したＭＡｂ／１−
８ｃ６の量を、前述した酵素抗免疫グロブリン結合基質
および色原体溶液（例３）を用いて検出した。
【００９７】これらの検定法で、Ｂβ１−１１８、Ｎ−
ＤＳＫおよび無傷フィブリノーゲンはＭＡｂ／１−８ｃ
６と反応することが判明した。（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、Ａα
１−５１およびγ１−７８は、検出に用いた各々の溶液
がＢβ１−１１８、Ｎ−ＤＳＫまたは無傷フィブリノー
ゲンと比較して約１００Ｘモル過剰であったにもかかわ
らず反応しなかった。Ｎ−ＤＳＫまたは無傷フィブリノ
ーゲンを被覆したプレートを用いたＥＬＩＳＡで同じ結
果が得られた。
ＤＳＫおよび無傷フィブリノーゲンはＭＡｂ／１−８ｃ
６と反応することが判明した。（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、Ａα
１−５１およびγ１−７８は、検出に用いた各々の溶液
がＢβ１−１１８、Ｎ−ＤＳＫまたは無傷フィブリノー
ゲンと比較して約１００Ｘモル過剰であったにもかかわ
らず反応しなかった。Ｎ−ＤＳＫまたは無傷フィブリノ
ーゲンを被覆したプレートを用いたＥＬＩＳＡで同じ結
果が得られた。
【００９８】ラジオイムノアッセイでは、リガンドは
125Ｉ−Ｂβ１−１１８であった。 125Ｉ−Ｂβ１−１
１８は人フィブリノーゲンからのＢβ１５−４２の沃素
化について述べた方法を用いて調製した（Kudryk et a
l, 前出、1982) 。製造業者 (Wellcome Diagnostics,Re
search Triangle Park,NC) により略述された示唆に従
ってＳａｃ−Ｃｅｌ（ロバ抗マウスセルロース懸濁液）
を用いて結合リガンドを分離した。ラジオイムノアッセ
イは、４つの区分からなり、２つの別々の培養時間を含
むものであった。検定手順は、前述したリガンドおよび
第二抗体を除いて、最近記載（Kudryk et al.,前出、19
82) のものとほぼ同じであった。
125Ｉ−Ｂβ１−１１８であった。 125Ｉ−Ｂβ１−１
１８は人フィブリノーゲンからのＢβ１５−４２の沃素
化について述べた方法を用いて調製した（Kudryk et a
l, 前出、1982) 。製造業者 (Wellcome Diagnostics,Re
search Triangle Park,NC) により略述された示唆に従
ってＳａｃ−Ｃｅｌ（ロバ抗マウスセルロース懸濁液）
を用いて結合リガンドを分離した。ラジオイムノアッセ
イは、４つの区分からなり、２つの別々の培養時間を含
むものであった。検定手順は、前述したリガンドおよび
第二抗体を除いて、最近記載（Kudryk et al.,前出、19
82) のものとほぼ同じであった。
【００９９】ＭＡｂ／１−８ｃ６およびＳａｃ−Ｃｅｌ
の適当な希釈液は 125Ｉ−Ｂβ１−１１８リガンドのほ
ぼ９０％結合することが出来た。ラジオイムノアッセイ
では、これらの試薬の希釈液はコールド競合抗原の不在
下でリガンドの約４０％結合をもたらすように選ばれ
た。これらの実験で、ＭＡｂ／１−８ｃ６の代りに緩衝
液または対照クローン培養液から単離したＩｇＧを用い
た場合、リガンドの非特異性結合は５％を越えなかっ
た。
の適当な希釈液は 125Ｉ−Ｂβ１−１１８リガンドのほ
ぼ９０％結合することが出来た。ラジオイムノアッセイ
では、これらの試薬の希釈液はコールド競合抗原の不在
下でリガンドの約４０％結合をもたらすように選ばれ
た。これらの実験で、ＭＡｂ／１−８ｃ６の代りに緩衝
液または対照クローン培養液から単離したＩｇＧを用い
た場合、リガンドの非特異性結合は５％を越えなかっ
た。
【０１００】リガンドの特異性結合は、寒冷Ｂβ１−１
１８の量を増大させることにより徐々に阻止された。図
４に示すように、約５×１０-9Ｍ濃度でリガンド結合の
５０％阻止率が得られた。フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳ
Ｋおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはすべて強い競合を示した。
図４において、Ｎ−ＤＳＫは無傷フィブリノーゲンおよ
び（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫに比較して幾らか弱い競合抗原と思
われる。
１８の量を増大させることにより徐々に阻止された。図
４に示すように、約５×１０-9Ｍ濃度でリガンド結合の
５０％阻止率が得られた。フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳ
Ｋおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはすべて強い競合を示した。
図４において、Ｎ−ＤＳＫは無傷フィブリノーゲンおよ
び（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫに比較して幾らか弱い競合抗原と思
われる。
【０１０１】しかしながら、その後の実験で、異なるロ
ットのＮ−ＤＳＫを用いた場合、フィブリノーゲンおよ
び（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫと一致する阻止曲線が得られた（図
示せず）。比較すると、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫは図４に示す
濃度範囲では競合せず、したがってＭＡｂ／１−８ｃ６
により結合されなかった。このことは、テストしたあら
ゆるロットの（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫで見られた。（Ｔ）Ｎ−
ＤＳＫとのわずかの競合が検出されたが、しかし１０-6
Ｍより大きい濃度においてのみであった。
ットのＮ−ＤＳＫを用いた場合、フィブリノーゲンおよ
び（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫと一致する阻止曲線が得られた（図
示せず）。比較すると、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫは図４に示す
濃度範囲では競合せず、したがってＭＡｂ／１−８ｃ６
により結合されなかった。このことは、テストしたあら
ゆるロットの（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫで見られた。（Ｔ）Ｎ−
ＤＳＫとのわずかの競合が検出されたが、しかし１０-6
Ｍより大きい濃度においてのみであった。
【０１０２】トロンビンの公知の特異性およびＢβ１−
１１８と（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ間のＭＡｂ／１−８ｃ６との
反応性の差から、Ｂβ１−１１８をラジオイムノアッセ
イで競合抗原として使用するためにトロンビンで分解し
た。図５に示すように、トロンビン分解後Ｂβ１−１１
８では移動度に明確な変化が認められた。これは、ＳＤ
Ｓの存在下７％および１０％アクリルアミドゲルの両方
で認められた。この移動度変化は、Hessel et al.,前
出,1979,により報告されている発見と一致し、したがっ
てＢβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合のトロンビンによる
分解を反映している。
１１８と（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ間のＭＡｂ／１−８ｃ６との
反応性の差から、Ｂβ１−１１８をラジオイムノアッセ
イで競合抗原として使用するためにトロンビンで分解し
た。図５に示すように、トロンビン分解後Ｂβ１−１１
８では移動度に明確な変化が認められた。これは、ＳＤ
Ｓの存在下７％および１０％アクリルアミドゲルの両方
で認められた。この移動度変化は、Hessel et al.,前
出,1979,により報告されている発見と一致し、したがっ
てＢβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合のトロンビンによる
分解を反映している。
【０１０３】図６は、トロンビン分解前後にＢβ１−１
１８で得られた競合曲線を示す。明らかなように、非分
解Ｂβ１−１１８で得られる同じ阻止率を達成するに
は、約２０００モル過剰の分解鎖が必要であった。純Ｆ
ＰＢ、Ｂβ１５−４２またはこれら２つのペプチドの混
合物は、ラジオイムノアッセイにおいて図６に示す濃度
範囲では競合しなかった。Ｂβ１−１１８に対する反応
性の差およびＢβ１−１１８が多重鎖構造の一部である
場合の前記差は、ＭＡｂ／１−８ｃ６が対象とするエピ
トープがフィブリノーゲンおよび関連ジスルフィド結合
フラグメント上で表面配向されている場合のみ十分反応
性であるという事によると思われる。
１８で得られた競合曲線を示す。明らかなように、非分
解Ｂβ１−１１８で得られる同じ阻止率を達成するに
は、約２０００モル過剰の分解鎖が必要であった。純Ｆ
ＰＢ、Ｂβ１５−４２またはこれら２つのペプチドの混
合物は、ラジオイムノアッセイにおいて図６に示す濃度
範囲では競合しなかった。Ｂβ１−１１８に対する反応
性の差およびＢβ１−１１８が多重鎖構造の一部である
場合の前記差は、ＭＡｂ／１−８ｃ６が対象とするエピ
トープがフィブリノーゲンおよび関連ジスルフィド結合
フラグメント上で表面配向されている場合のみ十分反応
性であるという事によると思われる。
【０１０４】図６に示すように、Ｂβ１−１１８鎖がト
ロンビンで分解された場合、Ｂβ１−１１８反応性のほ
とんどは失われた。この結果は、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、遊
離Ｂβ１−１４（ＦＰＢ）ならびにＢβ１５−４２がＭ
Ａｂ／１−８ｃ６と反応することが出来なかったという
事実と相俟って、この抗体がトロンビン感受性Ｂβ１４
Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合中またはその周囲のエピトープ
に向うということを明示するものである。Ｂβ１４Ａｒ
ｇ−１５Ｇｌｙ結合がトロンビンにより完全に分解され
た場合、Ｂβ１−１１８および関連構造体によるすべて
の免疫反応性は完全に失われる。
ロンビンで分解された場合、Ｂβ１−１１８反応性のほ
とんどは失われた。この結果は、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ、遊
離Ｂβ１−１４（ＦＰＢ）ならびにＢβ１５−４２がＭ
Ａｂ／１−８ｃ６と反応することが出来なかったという
事実と相俟って、この抗体がトロンビン感受性Ｂβ１４
Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結合中またはその周囲のエピトープ
に向うということを明示するものである。Ｂβ１４Ａｒ
ｇ−１５Ｇｌｙ結合がトロンビンにより完全に分解され
た場合、Ｂβ１−１１８および関連構造体によるすべて
の免疫反応性は完全に失われる。
【０１０５】例５：ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの特異性 ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの特異性をＥＬＩＳＡ法によりテス
トした。ミクロタイタープレートに、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ
（０．８μｇ／ml）を＋４℃／１６時間で被覆した。Ｍ
Ａｂ／Ｔ２ＧｌｓをＴＰＢＳ中で希釈してＡ490 ／５分
値を約１．６とした。この抗体希釈液を所望の競合抗原
の希釈液と混合し、プレートに添加した。洗浄後、固相
に結合した抗体を前記と同様にして（例３）検定した。
ＥＬＩＳＡにおいて、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは（Ｔ）Ｎ−
ＤＳＫ被覆プレートと強く反応した。この抗体は溶解し
た 125ＩＢβ１５−４２リガンドとも結合するので、プ
レート上にペプチドを被覆し、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓがそ
のようなプレーハに結合することを証明する試みを行っ
た。これらの実験で、前述のカップリング緩衝液でＢβ
１５−４２ペプチドの原液〔０．０５−０．１μｇ／m
l〕をつくった。
トした。ミクロタイタープレートに、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ
（０．８μｇ／ml）を＋４℃／１６時間で被覆した。Ｍ
Ａｂ／Ｔ２ＧｌｓをＴＰＢＳ中で希釈してＡ490 ／５分
値を約１．６とした。この抗体希釈液を所望の競合抗原
の希釈液と混合し、プレートに添加した。洗浄後、固相
に結合した抗体を前記と同様にして（例３）検定した。
ＥＬＩＳＡにおいて、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは（Ｔ）Ｎ−
ＤＳＫ被覆プレートと強く反応した。この抗体は溶解し
た 125ＩＢβ１５−４２リガンドとも結合するので、プ
レート上にペプチドを被覆し、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓがそ
のようなプレーハに結合することを証明する試みを行っ
た。これらの実験で、前述のカップリング緩衝液でＢβ
１５−４２ペプチドの原液〔０．０５−０．１μｇ／m
l〕をつくった。
【０１０６】これらの溶液を被覆したプレートは、ＭＡ
ｂ／Ｔ２Ｇｌｓと特異的に結合することが分った。トロ
ンビン分解Ｂβ１−４２を被覆したプレートで同様の結
果が得られた。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは、Ｂβ１−４２を
被覆したプレートと結合しなかった。図１０は、（Ｔ）
Ｎ−ＤＳＫ被覆プレートおよびＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを用
いた競合的ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。用いた競合抗
原はトロンビン分解前後のＢβ１−４２であった。Ｂβ
１５−４２ペプチドはトロンビン分解Ｂβ１−４２で見
られるものと同じ競合曲線を与えた。
ｂ／Ｔ２Ｇｌｓと特異的に結合することが分った。トロ
ンビン分解Ｂβ１−４２を被覆したプレートで同様の結
果が得られた。ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓは、Ｂβ１−４２を
被覆したプレートと結合しなかった。図１０は、（Ｔ）
Ｎ−ＤＳＫ被覆プレートおよびＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを用
いた競合的ＥＬＩＳＡ実験の結果を示す。用いた競合抗
原はトロンビン分解前後のＢβ１−４２であった。Ｂβ
１５−４２ペプチドはトロンビン分解Ｂβ１−４２で見
られるものと同じ競合曲線を与えた。
【０１０７】また、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓの特異性を検討
するためにラジオイムノアッセイを用いた。用いたリガ
ンドは 125ＩＢβ１５−４２であった。 125ＩＢβ１５
−４２はすでに述べた方法（Kudryk et al.,前出,1982)
を用いて調製した。製造業者(Wellcome Diagnostics,Re
search Triangle Park,NC) により略述されている示唆
に従いＳａｃ−Ｃｅｌ（ロバ−抗マウス免疫グロブリン
セルロース懸濁液）を用いて結合リガンドを分離した。
ラジオイムノアッセイは４つの区分からなり、２つの別
々のインキュベーション時間を含み、前述した特異性
〔ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ〕および第二抗体を除いて最近の
記載（Kudryk et al.,前出,1982)のものとほとんど同じ
であった。
するためにラジオイムノアッセイを用いた。用いたリガ
ンドは 125ＩＢβ１５−４２であった。 125ＩＢβ１５
−４２はすでに述べた方法（Kudryk et al.,前出,1982)
を用いて調製した。製造業者(Wellcome Diagnostics,Re
search Triangle Park,NC) により略述されている示唆
に従いＳａｃ−Ｃｅｌ（ロバ−抗マウス免疫グロブリン
セルロース懸濁液）を用いて結合リガンドを分離した。
ラジオイムノアッセイは４つの区分からなり、２つの別
々のインキュベーション時間を含み、前述した特異性
〔ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ〕および第二抗体を除いて最近の
記載（Kudryk et al.,前出,1982)のものとほとんど同じ
であった。
【０１０８】抗体および第二抗体（Ｓａｃ−Ｃｅｌ）の
適当な希釈液は、競合抗原の不在下で 125ＩＢβ１５−
４２リガンドの約４０％結合を与えるように選んだ。図
１１に示すように、このリガンドの結合は「コールド」
Ｂβ１５−４２標準の量を増大させることにより阻害さ
れた。約２×１０-8Ｍ濃度で５０％置換水準が得られ
た。トロンビン分解Ｂβ１−４２および（Ｔ）Ｎ−ＤＳ
Ｋで同じ阻止率が見られた（図示せず）。無傷Ｂβ１−
４２、Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはもしあって
もほとんど阻止率を示さなかった。異なるロットのＩＭ
ＣＯフィブリノーゲンはわずかの阻止率を示した。しか
しながら、Ｂβ１５−４２のリガンド最大置換対無傷フ
ィブリノーゲンのそれとを比較するモル比は１：２５０
程度であった。
適当な希釈液は、競合抗原の不在下で 125ＩＢβ１５−
４２リガンドの約４０％結合を与えるように選んだ。図
１１に示すように、このリガンドの結合は「コールド」
Ｂβ１５−４２標準の量を増大させることにより阻害さ
れた。約２×１０-8Ｍ濃度で５０％置換水準が得られ
た。トロンビン分解Ｂβ１−４２および（Ｔ）Ｎ−ＤＳ
Ｋで同じ阻止率が見られた（図示せず）。無傷Ｂβ１−
４２、Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはもしあって
もほとんど阻止率を示さなかった。異なるロットのＩＭ
ＣＯフィブリノーゲンはわずかの阻止率を示した。しか
しながら、Ｂβ１５−４２のリガンド最大置換対無傷フ
ィブリノーゲンのそれとを比較するモル比は１：２５０
程度であった。
【０１０９】図１０および図１１に示すデータに基い
て、前記結果を以下に説明する。ＦＰＢはＢβ１−４２
の一部でありかつ（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよびＢβ１５−４
２の両方から欠除しているので、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓと
フィブリノーゲンまたはそのフラグメント間の免疫反応
性には、すべての抗原において結合Ｂβ１４Ａｒｇ−１
５Ｇｌｙの前分解が必要であると思われる。
て、前記結果を以下に説明する。ＦＰＢはＢβ１−４２
の一部でありかつ（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫおよびＢβ１５−４
２の両方から欠除しているので、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓと
フィブリノーゲンまたはそのフラグメント間の免疫反応
性には、すべての抗原において結合Ｂβ１４Ａｒｇ−１
５Ｇｌｙの前分解が必要であると思われる。
【０１１０】図１１に示すように、ＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓ
と無傷フィブリノーゲンでわすかであるが測定可能な交
差反応が検出された。すでに述べたように、これは幾つ
かの異なるロットのＩＭＣＯフィブリノーゲンの場合に
観察された。これに対する１つの説明は、そのようなフ
ィブリノーゲン調製物が溶解して残るある少量のフィブ
リノーゲン−フィブリン複合体として含有しているとい
うことである〔Shainoff & Page,1962〕。
と無傷フィブリノーゲンでわすかであるが測定可能な交
差反応が検出された。すでに述べたように、これは幾つ
かの異なるロットのＩＭＣＯフィブリノーゲンの場合に
観察された。これに対する１つの説明は、そのようなフ
ィブリノーゲン調製物が溶解して残るある少量のフィブ
リノーゲン−フィブリン複合体として含有しているとい
うことである〔Shainoff & Page,1962〕。
【０１１１】そのような調製物のＮＨ2 末端分析で少量
のグリシンがほとんど常に検出されるという事実がこれ
を支持している。このアミノ酸は、トロンビン作用の結
果としてＦＰＡもまたＦＰＢも放出された場合、新規な
ＮＨ2 末端残基である〔Blombaeck & Yamarhina,195
8〕。
のグリシンがほとんど常に検出されるという事実がこれ
を支持している。このアミノ酸は、トロンビン作用の結
果としてＦＰＡもまたＦＰＢも放出された場合、新規な
ＮＨ2 末端残基である〔Blombaeck & Yamarhina,195
8〕。
【０１１２】例４で述べたように、ＭＡｂ／１−８ｃ６
は無傷フィブリノーゲンと完全に交差反応した。ＭＡｂ
／Ｔ２Ｇｌｓは種々のフィブリノーゲン調製物とごくわ
ずかしか反応しなかったので、そのような反応は恐らく
フィブリンの微量汚染によるものと思われた。これら２
つの抗体のフィブリノーゲンに対する反応性の差を比較
するために、フィブリノーゲン被覆ＥＬＩＳＡプレート
を用いて非常に簡単な実験を試みた。フィブリノーゲン
およびフィブリン−被覆ＥＬＩＳＡプレートの調製に際
して、ＩＭＣＯフィブリノーゲン（Ｌｏｔ Ｆ−１５
５，４．３mg／ml）をＮａ2 ＣＯ3 ／ＮａＨＣＯ3 （pH
９．６）中で１／５００に希釈し、ポリビニルミクロタ
イタープレート上に＋４℃／１６時間で被覆した。
は無傷フィブリノーゲンと完全に交差反応した。ＭＡｂ
／Ｔ２Ｇｌｓは種々のフィブリノーゲン調製物とごくわ
ずかしか反応しなかったので、そのような反応は恐らく
フィブリンの微量汚染によるものと思われた。これら２
つの抗体のフィブリノーゲンに対する反応性の差を比較
するために、フィブリノーゲン被覆ＥＬＩＳＡプレート
を用いて非常に簡単な実験を試みた。フィブリノーゲン
およびフィブリン−被覆ＥＬＩＳＡプレートの調製に際
して、ＩＭＣＯフィブリノーゲン（Ｌｏｔ Ｆ−１５
５，４．３mg／ml）をＮａ2 ＣＯ3 ／ＮａＨＣＯ3 （pH
９．６）中で１／５００に希釈し、ポリビニルミクロタ
イタープレート上に＋４℃／１６時間で被覆した。
【０１１３】洗浄、５％ＢＳＡ〔ＲＩＡ級ＢＳＡ、Sigm
a,St.Louis,MO 〕による阻止および続く洗浄後、人トロ
ンビン〔Shigma,St.Louis MO〕原液（１ＮＩＨ単位／ｎ
−生理的食塩水１ml）１００μｌを各ウエルに添加し
た。選定した間隔で、前述のＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ−ＣＨ2 Ｃｌ原液を等容量添加してトロンビンを阻止
した。その後の洗浄、反応および結合抗体の検出は、す
でに述べたものと同じであった。
a,St.Louis,MO 〕による阻止および続く洗浄後、人トロ
ンビン〔Shigma,St.Louis MO〕原液（１ＮＩＨ単位／ｎ
−生理的食塩水１ml）１００μｌを各ウエルに添加し
た。選定した間隔で、前述のＤ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｇ−ＣＨ2 Ｃｌ原液を等容量添加してトロンビンを阻止
した。その後の洗浄、反応および結合抗体の検出は、す
でに述べたものと同じであった。
【０１１４】図１２に示すように、トロンビン溶液で９
０秒以下処理したフィブリノーゲン被覆ウエルにＭＡｂ
／１−８ｃ６を添加した場合、かなりのＡ490 ／５分値
が得られた。この抗体をトロンビンで９０秒より長い時
間処理されたウエルに添加した場合、色の急激な減少が
見られたが、これは抗体結合の低下を意味した。ＭＡｂ
／Ｔ２Ｇｌｓで、完全に予知出来る逆の結果が得られ
た。この抗体を非処理ウエルに添加した場合、バックグ
ランドの色のみが観察された。しかしながら、トロンビ
ンに対する暴露時間が増大すると、非常に有意のＡ490
／５分値が記録された。これらの結果は、トロンビン分
解によりＥＬＩＳＡプレートの表面にネオエピトープが
漸次現われることおよびＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓがこのネオ
エピトープと反応・結合することが出来ることを示唆し
ている。
０秒以下処理したフィブリノーゲン被覆ウエルにＭＡｂ
／１−８ｃ６を添加した場合、かなりのＡ490 ／５分値
が得られた。この抗体をトロンビンで９０秒より長い時
間処理されたウエルに添加した場合、色の急激な減少が
見られたが、これは抗体結合の低下を意味した。ＭＡｂ
／Ｔ２Ｇｌｓで、完全に予知出来る逆の結果が得られ
た。この抗体を非処理ウエルに添加した場合、バックグ
ランドの色のみが観察された。しかしながら、トロンビ
ンに対する暴露時間が増大すると、非常に有意のＡ490
／５分値が記録された。これらの結果は、トロンビン分
解によりＥＬＩＳＡプレートの表面にネオエピトープが
漸次現われることおよびＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓがこのネオ
エピトープと反応・結合することが出来ることを示唆し
ている。
【０１１５】例６：ＭＡｂ／１−８ｃ６の臨床的応用 ＭＡｂ／１−８ｃ６の特異性が確認されたら、臨床研究
におけるその有用性を研究することが興味あることであ
った。この目的のために、尿毒症患者から血液透析中選
定された間隔で血液を集めた。捕集および処理はすでに
述べたものと同じであった（Kudryk et al.,Thromb. Re
s.,25,277-291,1982) 。フィブリノーゲンを最後の微量
まで除去するために、患者血漿の凍結乾燥したエタノー
ル抽出液を使い捨てＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ18カートリッジ
（Waters Associates,Milford,MA)でKoehn and Canfiel
d, Analyt.Biochem, 116 ,349-456,1981,の方法により
さらに精製した。
におけるその有用性を研究することが興味あることであ
った。この目的のために、尿毒症患者から血液透析中選
定された間隔で血液を集めた。捕集および処理はすでに
述べたものと同じであった（Kudryk et al.,Thromb. Re
s.,25,277-291,1982) 。フィブリノーゲンを最後の微量
まで除去するために、患者血漿の凍結乾燥したエタノー
ル抽出液を使い捨てＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ18カートリッジ
（Waters Associates,Milford,MA)でKoehn and Canfiel
d, Analyt.Biochem, 116 ,349-456,1981,の方法により
さらに精製した。
【０１１６】従来の実験で、そのような患者は、正常の
被検者に見い出される０．４１pmoles／mlの４０倍以上
の非常に高い水準のＢβ１５−４２免疫反応性物質を有
することが確定された（Kudryk et al.,前出、1982) 。
本発明の研究では、この患者群に普通見い出されるＢβ
１５−４２免疫反応性物質の何％がＭＡｂ／１−８ｃ６
と交差反応するかを測定することが興味あることであっ
た。フィブリノーゲンはＭＡｂ／１−８ｃ６と反応する
ので（図４）、前述した方法（Kudryk et al.,前出,198
2)により調製した患者の血漿抽出液をＳｅｐ−Ｐａｋ
Ｃ18カートリッジでさらに精製した。その後、サンプル
を２つの部分に分割し、その１つの部分をトロンビンで
分解した（９０ＮＩＨ単位／ml、３７℃／６０分）。最
後に、各サンプルの適当な希釈液をつくり、例４と同じ
ラジオイムノアッセイで用いた。
被検者に見い出される０．４１pmoles／mlの４０倍以上
の非常に高い水準のＢβ１５−４２免疫反応性物質を有
することが確定された（Kudryk et al.,前出、1982) 。
本発明の研究では、この患者群に普通見い出されるＢβ
１５−４２免疫反応性物質の何％がＭＡｂ／１−８ｃ６
と交差反応するかを測定することが興味あることであっ
た。フィブリノーゲンはＭＡｂ／１−８ｃ６と反応する
ので（図４）、前述した方法（Kudryk et al.,前出,198
2)により調製した患者の血漿抽出液をＳｅｐ−Ｐａｋ
Ｃ18カートリッジでさらに精製した。その後、サンプル
を２つの部分に分割し、その１つの部分をトロンビンで
分解した（９０ＮＩＨ単位／ml、３７℃／６０分）。最
後に、各サンプルの適当な希釈液をつくり、例４と同じ
ラジオイムノアッセイで用いた。
【０１１７】表１は、３人の患者のフィブリノーゲン、
ＦＰＡおよびＢβ１５−４２免疫反応物質の血漿濃度を
示す。サンプルは、透析前および透析プログラム中の２
つの異なる時点で取った。後者の２つのサンプルは静脈
（出口側）血管からのものであった。各患者からの透析
前サンプル中のＦＰＡ濃度は、ＩＭＣＯ検定キット（Wi
lhelmsson et al., Clin.Nephrol.,15,252-258,1981)を
用いた場合、正常の被検者に見い出される１．４±０．
６pmoles／ml水準よりわずかに大きい値であった。３人
の患者のうち２人にサンプル２においてＦＰＡの低下が
見られた。３人の患者全部からの最後サンプルはサンプ
ル２に比較して大きい値を示した。
ＦＰＡおよびＢβ１５−４２免疫反応物質の血漿濃度を
示す。サンプルは、透析前および透析プログラム中の２
つの異なる時点で取った。後者の２つのサンプルは静脈
（出口側）血管からのものであった。各患者からの透析
前サンプル中のＦＰＡ濃度は、ＩＭＣＯ検定キット（Wi
lhelmsson et al., Clin.Nephrol.,15,252-258,1981)を
用いた場合、正常の被検者に見い出される１．４±０．
６pmoles／ml水準よりわずかに大きい値であった。３人
の患者のうち２人にサンプル２においてＦＰＡの低下が
見られた。３人の患者全部からの最後サンプルはサンプ
ル２に比較して大きい値を示した。
【０１１８】これらの結果は、ヘパリン水準が０．５IU
／mlより大きい場合透析の初期段階時ではＦＰＡは正常
かまたは正常に近いことを示す従来の発見と一致する。
ヘパリンがこの値以下になると、一般にＦＰＡ濃度の増
大が見られた（Wilhelmssonet al., 前出,1981)。ヘパ
リン治療の効果はこの様にして検査することが出来る。
たとえば、ＦＰＡの血漿水準の増大は、脈管内のフィブ
リン沈着をもたらし得る高トロンビン活性の指標として
考えることが出来る。
／mlより大きい場合透析の初期段階時ではＦＰＡは正常
かまたは正常に近いことを示す従来の発見と一致する。
ヘパリンがこの値以下になると、一般にＦＰＡ濃度の増
大が見られた（Wilhelmssonet al., 前出,1981)。ヘパ
リン治療の効果はこの様にして検査することが出来る。
たとえば、ＦＰＡの血漿水準の増大は、脈管内のフィブ
リン沈着をもたらし得る高トロンビン活性の指標として
考えることが出来る。
【０１１９】Ｂβ１５−４２免疫反応性に関しては、ラ
ビット抗血清で検出された水準は、正常の血漿で見い出
される０．４１pmoles／mlよりかなり大きかった（Kudr
yk et al.,前出,1982)。患者１７２は３つのサンプルす
べてにおいてきわめて似た濃度を示した。これは、特に
透析前の水準およびサンプル３の水準を比較した場合、
他の２人の患者ではそうでなかった。ＭＡｂ／１−８ｃ
６で検出されたＢβ１５−４２免疫反応物質の濃度は、
ラビット抗血清を用いた場合に見い出されるものと類似
していたが、しかし同じではなかった。
ビット抗血清で検出された水準は、正常の血漿で見い出
される０．４１pmoles／mlよりかなり大きかった（Kudr
yk et al.,前出,1982)。患者１７２は３つのサンプルす
べてにおいてきわめて似た濃度を示した。これは、特に
透析前の水準およびサンプル３の水準を比較した場合、
他の２人の患者ではそうでなかった。ＭＡｂ／１−８ｃ
６で検出されたＢβ１５−４２免疫反応物質の濃度は、
ラビット抗血清を用いた場合に見い出されるものと類似
していたが、しかし同じではなかった。
【０１２０】前述したＭＡｂ／１−８ｃ６の特異性か
ら、これらの結果は、全部ではないがほとんどのＢβ１
５−４２免疫物質は無傷Ｂβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結
合を含有するペプチド上に存在することを示唆した。こ
れは、各サンプルをトロンビンで分解し、２つの系を用
いて再検定した場合、部分的に立証された。ラビット抗
血清の場合に検出されるＢβ１５−４２免疫反応性物質
の濃度はトロンビン分解前後において同じであった。他
方、トロンビン分解サンプルにおいてＭＡｂ／１−８ｃ
６で非常の少しの免疫反応性物質を測定することが出来
た（データは示されていない）。
ら、これらの結果は、全部ではないがほとんどのＢβ１
５−４２免疫物質は無傷Ｂβ１４Ａｒｇ−１５Ｇｌｙ結
合を含有するペプチド上に存在することを示唆した。こ
れは、各サンプルをトロンビンで分解し、２つの系を用
いて再検定した場合、部分的に立証された。ラビット抗
血清の場合に検出されるＢβ１５−４２免疫反応性物質
の濃度はトロンビン分解前後において同じであった。他
方、トロンビン分解サンプルにおいてＭＡｂ／１−８ｃ
６で非常の少しの免疫反応性物質を測定することが出来
た（データは示されていない）。
【０１２１】生体内分解産物の性状をさらに特徴づける
ため、プールされた患者の血漿から抽出液を調製した。
用いた血漿は表１に示す患者を除く数人の患者からのも
のであり、透析や種々の時点で集めた。抽出液を、Koeh
n and Canfield, Analyt. Biochem, 116 ,349-356,198
1,に記載されているような高性能液体クロマトグラフィ
ーで分別した。その後、画分のＦＰＡおよびＢβ１５−
４２免疫反応性について検定した。
ため、プールされた患者の血漿から抽出液を調製した。
用いた血漿は表１に示す患者を除く数人の患者からのも
のであり、透析や種々の時点で集めた。抽出液を、Koeh
n and Canfield, Analyt. Biochem, 116 ,349-356,198
1,に記載されているような高性能液体クロマトグラフィ
ーで分別した。その後、画分のＦＰＡおよびＢβ１５−
４２免疫反応性について検定した。
【０１２２】高Ｂβ１５−４２活性を示す画分をトロン
ビンで分解し、その後Ｂβ１５−４２検定法ならびにＦ
ＰＢ免疫検定法を用いて再分析した。図７に示すよう
に、ＦＰＡは画分１１−１４において取得された。画分
５−８ではラビット抗血清およびＭＡｂ／１−８ｃ６の
両方を用いてＢβ１５−４２免疫反応性を検出した。各
画分をトロンビンで分解し、再検定した場合、ラビット
抗体では免疫反応性の変化はもしあっても非常に小さか
った。
ビンで分解し、その後Ｂβ１５−４２検定法ならびにＦ
ＰＢ免疫検定法を用いて再分析した。図７に示すよう
に、ＦＰＡは画分１１−１４において取得された。画分
５−８ではラビット抗血清およびＭＡｂ／１−８ｃ６の
両方を用いてＢβ１５−４２免疫反応性を検出した。各
画分をトロンビンで分解し、再検定した場合、ラビット
抗体では免疫反応性の変化はもしあっても非常に小さか
った。
【０１２３】これに対し、他の２つの検定法を用いた場
合、トロンビン分解画分で大きな差が得られた。ＭＡｂ
／１−８ｃ６との免疫反応性が実質的にすべて失われ
た。画分５−８ではトロンビン分解後だけかなりの水準
のＦＰＢ免疫反応性が得られた。画分５−８および１７
−１９ではトロンビン分解前に若干のＦＰＢ免疫反応性
が検出されたことも指摘すべきことである。
合、トロンビン分解画分で大きな差が得られた。ＭＡｂ
／１−８ｃ６との免疫反応性が実質的にすべて失われ
た。画分５−８ではトロンビン分解後だけかなりの水準
のＦＰＢ免疫反応性が得られた。画分５−８および１７
−１９ではトロンビン分解前に若干のＦＰＢ免疫反応性
が検出されたことも指摘すべきことである。
【０１２４】すでに説明したＭＡｂ／１−８ｃ６の特異
性から、これらの結果は、Ｂβ１５−４２免疫反応性物
質のほとんどがＦＰＢを含有するペプチド上に存在する
ことを示唆している。図７に示すデータもこの結論を支
持している。すなわち、遊離ＦＰＢより非常に早く溶離
するペプチドはＦＰＢ抗血清と特異的に反応した。した
がって、そのようなペプチドはフィブリノーゲンまたは
フィブリンＩからのみ生じることが出来、フィブリンII
から生じ得なかった。
性から、これらの結果は、Ｂβ１５−４２免疫反応性物
質のほとんどがＦＰＢを含有するペプチド上に存在する
ことを示唆している。図７に示すデータもこの結論を支
持している。すなわち、遊離ＦＰＢより非常に早く溶離
するペプチドはＦＰＢ抗血清と特異的に反応した。した
がって、そのようなペプチドはフィブリノーゲンまたは
フィブリンＩからのみ生じることが出来、フィブリンII
から生じ得なかった。
【０１２５】表１および図７に示すデータに関してはさ
らに幾つかの意見を加える必要がある。ラビット抗血清
およびＭＡｂ／１−８ｃ６で検出される免疫反応性物質
の水準に関しては、患者５８９からのサンプル２が、モ
ノクロナール抗体でかなり大きい量が測定されたことを
示す。この１つの説明として、ラビット抗血清により普
通検出出来るあるＢβ１５−４２免疫反応性物質はサン
プル調製時に失われたということが挙げられる。
らに幾つかの意見を加える必要がある。ラビット抗血清
およびＭＡｂ／１−８ｃ６で検出される免疫反応性物質
の水準に関しては、患者５８９からのサンプル２が、モ
ノクロナール抗体でかなり大きい量が測定されたことを
示す。この１つの説明として、ラビット抗血清により普
通検出出来るあるＢβ１５−４２免疫反応性物質はサン
プル調製時に失われたということが挙げられる。
【０１２６】Ｂβ１５−４２標準は正常または患者の血
清に添加した場合急速な崩壊を受けることはすでに示さ
れている（Kudryk et al.,前出,1982)。この研究で述べ
た３つのＢβ鎖関連検定法の場合、高性能液体クロマト
グラフィー画分について多数の免疫反応性輪郭が得られ
た。図７に示すものは、プールされた患者血漿からの抽
出液を用いた実験結果であった。他のサンプルのクロマ
トグラフィーでは全く異なる結果が得られた。あるサン
プルでは、Ｂβ鎖免疫反応性は、遊離ＦＰＡの近くで溶
離する画分にも見られた。
清に添加した場合急速な崩壊を受けることはすでに示さ
れている（Kudryk et al.,前出,1982)。この研究で述べ
た３つのＢβ鎖関連検定法の場合、高性能液体クロマト
グラフィー画分について多数の免疫反応性輪郭が得られ
た。図７に示すものは、プールされた患者血漿からの抽
出液を用いた実験結果であった。他のサンプルのクロマ
トグラフィーでは全く異なる結果が得られた。あるサン
プルでは、Ｂβ鎖免疫反応性は、遊離ＦＰＡの近くで溶
離する画分にも見られた。
【０１２７】これらの結果から、そのような患者はこの
報告に記載の抗体と交差反応し得る多数のペプチドを有
することが明らかである。これら生体内ペプチドの正確
な分子性状の同定は現在研究されている。最後に、これ
ら患者の高水準のＢβ１５−４２免疫反応性物質に関し
てある論評を行わなければならない。サンプル１および
２ではＦＰＡ濃度は正常または正常に近かったので、用
いたヘパリン法により３人の患者すべてにおいてフィブ
リン形成が効果的に抑制されたことは明らかであると思
われる。
報告に記載の抗体と交差反応し得る多数のペプチドを有
することが明らかである。これら生体内ペプチドの正確
な分子性状の同定は現在研究されている。最後に、これ
ら患者の高水準のＢβ１５−４２免疫反応性物質に関し
てある論評を行わなければならない。サンプル１および
２ではＦＰＡ濃度は正常または正常に近かったので、用
いたヘパリン法により３人の患者すべてにおいてフィブ
リン形成が効果的に抑制されたことは明らかであると思
われる。
【０１２８】このことならびにＢβ１５−４２免疫反応
性物質の透析前水準さえ著しく向上したという事実を念
頭に入れて、これら分解産物の損われた異化作用の問題
を考慮しなければならない。この点において、シャーマ
ンおよび共同者は、幾つかの動物モデルにおいて非常に
多くのフィブリノーゲン分解産物の回転について研究し
た。
性物質の透析前水準さえ著しく向上したという事実を念
頭に入れて、これら分解産物の損われた異化作用の問題
を考慮しなければならない。この点において、シャーマ
ンおよび共同者は、幾つかの動物モデルにおいて非常に
多くのフィブリノーゲン分解産物の回転について研究し
た。
【０１２９】彼等の結果は、尿毒症それ自体よりは機能
性腎組織の不全はフィブリノーゲン分解産物のクリアラ
ンスの低下に原因があることを示唆した（Hayne and Sh
erman,Am.J.Path.,71,219-236,1973;Iio et al.,J.Lab.
Clin.Med. 87,934-946,1976)。表１から分るように、あ
る患者は透析時これらのペプチドが一様に増加する。こ
れは、初期段階ではＦＰＡ濃度の増加を伴わないフィブ
リン溶解（fibrinogenolysis) から生じ得る (Bileziki
an et al.,J.Clin.Invest., 56,438-445,1975)。
性腎組織の不全はフィブリノーゲン分解産物のクリアラ
ンスの低下に原因があることを示唆した（Hayne and Sh
erman,Am.J.Path.,71,219-236,1973;Iio et al.,J.Lab.
Clin.Med. 87,934-946,1976)。表１から分るように、あ
る患者は透析時これらのペプチドが一様に増加する。こ
れは、初期段階ではＦＰＡ濃度の増加を伴わないフィブ
リン溶解（fibrinogenolysis) から生じ得る (Bileziki
an et al.,J.Clin.Invest., 56,438-445,1975)。
【０１３０】
【表１】
【０１３１】１）血液サンプルは透析前（１）、透析に
入って２時間目（II）および各患者を透析器から外す直
前、約３時間後（III)に採集した。サンプルＩは動脈瘻
針により取り出した。他の２つのサンプルは静脈（出口
側）血管の穿刺により採集した。 ２）前述した（Kudryk et al,1982)エレクトロイムノア
ッセイにより測定した。 ３），４）IMCO.Corporation Ltd.,Stockholm,Swedenか
ら購入されるＦＰＡおよびＢβ１５−４２ラジオイムノ
アッセイキットにより測定した。各アッセイの方法は製
造業者により推奨されたものであった。 ５）ラジオイムノアッセイは、Materials and Methods
に記載されたものであった。人Ｂβ１−１１８をリガン
ドとしてもまた標準としても用い、抗体はＭＡｂ／１−
８ｃ６であった。
入って２時間目（II）および各患者を透析器から外す直
前、約３時間後（III)に採集した。サンプルＩは動脈瘻
針により取り出した。他の２つのサンプルは静脈（出口
側）血管の穿刺により採集した。 ２）前述した（Kudryk et al,1982)エレクトロイムノア
ッセイにより測定した。 ３），４）IMCO.Corporation Ltd.,Stockholm,Swedenか
ら購入されるＦＰＡおよびＢβ１５−４２ラジオイムノ
アッセイキットにより測定した。各アッセイの方法は製
造業者により推奨されたものであった。 ５）ラジオイムノアッセイは、Materials and Methods
に記載されたものであった。人Ｂβ１−１１８をリガン
ドとしてもまた標準としても用い、抗体はＭＡｂ／１−
８ｃ６であった。
【０１３２】前記データに基いて、ＭＡｂ／１−８ｃ６
は、フィブリン溶解（fibrino(geno)lysis) に関連する
疾病状態の臨床研究において有用な試薬として役立つと
結論される。生体内発生フィブリンの性状およびその溶
解動力学に関する重要な情報は、Ｂβ鎖標識を測定する
免疫検定法を用いることにより得ることが出来る。
は、フィブリン溶解（fibrino(geno)lysis) に関連する
疾病状態の臨床研究において有用な試薬として役立つと
結論される。生体内発生フィブリンの性状およびその溶
解動力学に関する重要な情報は、Ｂβ鎖標識を測定する
免疫検定法を用いることにより得ることが出来る。
【０１３３】例７：臨床テストサンプル中のＢβ１−４
２およびＢβ１５−４２の存在の測定 １．４mm針をつけたきずのない静脈穿刺により患者から
血液を集めた。最初の２−３mlを捨てた後、続いて９ml
の血液を、１０００IUヘパリンおよび１０００ＫＩＵト
ラシロールを含有する１mlの０．１５ＭＮａＣｌを含む
１２mlポリスチレン管に直流流し込んだ。管をただちに
プラスチックフィルムに対して３回逆さにし、３０００
−３５００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。各血漿サ
ンプルを直接処理するかまたは−７０℃で保存した。
２およびＢβ１５−４２の存在の測定 １．４mm針をつけたきずのない静脈穿刺により患者から
血液を集めた。最初の２−３mlを捨てた後、続いて９ml
の血液を、１０００IUヘパリンおよび１０００ＫＩＵト
ラシロールを含有する１mlの０．１５ＭＮａＣｌを含む
１２mlポリスチレン管に直流流し込んだ。管をただちに
プラスチックフィルムに対して３回逆さにし、３０００
−３５００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。各血漿サ
ンプルを直接処理するかまたは−７０℃で保存した。
【０１３４】凍結血漿サンプルを３７℃で迅速に溶か
し、次いで直ちに前述の如くして処理した。血漿処理は
次のようにして行った。３mlプラスチック管中の１．０
mlの血漿に、１．０mlの冷却（氷浴）エタノールを添加
した。氷浴で３０分間混合・培養した後、サンプルを前
記と同様にして遠心分離した。上澄み液を新しい遠心分
離管に移し、氷浴でさらに３０分間保持し、そして再び
遠心分離した。第二の上澄み液を「処理血漿サンプル」
とする。「処理血漿サンプル」からフィブリノーゲンを
最後の微量まで除去するために、サンプルを、使い捨て
Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ18カートリッジ（Waters Associate
s,Milford,MA) でKoehn and Canfield, Analyt.Bioche
m.,116,349-356(1981) 、の方法によりさらに精製し
た。
し、次いで直ちに前述の如くして処理した。血漿処理は
次のようにして行った。３mlプラスチック管中の１．０
mlの血漿に、１．０mlの冷却（氷浴）エタノールを添加
した。氷浴で３０分間混合・培養した後、サンプルを前
記と同様にして遠心分離した。上澄み液を新しい遠心分
離管に移し、氷浴でさらに３０分間保持し、そして再び
遠心分離した。第二の上澄み液を「処理血漿サンプル」
とする。「処理血漿サンプル」からフィブリノーゲンを
最後の微量まで除去するために、サンプルを、使い捨て
Ｓｅｐ−Ｐａｋ Ｃ18カートリッジ（Waters Associate
s,Milford,MA) でKoehn and Canfield, Analyt.Bioche
m.,116,349-356(1981) 、の方法によりさらに精製し
た。
【０１３５】各「処理血漿サンプル」を、競合的免疫検
定法：エンザイムリンクドイムノアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）またはラジオイムノアッセイによりテストした。
「処理血漿サンプル」は、２つの部分すなわち、Ｂβ１
−４２の存在の検出に使用する部分およびＢβ１５−４
２の存在の検出に使用する部分に分割することが出来
る。ＥＬＩＳＡを用いてＢβ１−４２抗原の存在につい
てテストするために、ミクロリットルプレートにたとえ
ばＢβ１−４２またはＢβ１−１１８（５μｇ／ml）を
＋４℃／１６時間で被覆した。
定法：エンザイムリンクドイムノアッセイ（ＥＬＩＳ
Ａ）またはラジオイムノアッセイによりテストした。
「処理血漿サンプル」は、２つの部分すなわち、Ｂβ１
−４２の存在の検出に使用する部分およびＢβ１５−４
２の存在の検出に使用する部分に分割することが出来
る。ＥＬＩＳＡを用いてＢβ１−４２抗原の存在につい
てテストするために、ミクロリットルプレートにたとえ
ばＢβ１−４２またはＢβ１−１１８（５μｇ／ml）を
＋４℃／１６時間で被覆した。
【０１３６】ＭＡｂ／１−８ｃ６をＴＰＢＳ（洗剤トウ
イーン−２０を含有する燐酸塩緩衝生理的食塩水）で希
釈して１．５−２．０のＡ490 ／１０分値とした。この
希釈液を「処理血漿サンプル」の希釈液と混合し、プレ
ートに添加した。培養・洗浄後、固相に結合した抗体を
前述（例３）と同様にして検出した。ＥＬＩＳＡを用い
てＢβ１５−４２抗原の存在についてテストするため
に、ミクロリットルプレートにＢβ１５−４２を４℃／
１６hrで被覆した。ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓをＴＰＢＳで希
釈して約１．６のＡ490 ／５分値とした。この抗体希釈
液を「処理血漿サンプル」の希釈液と混合し、プレート
に添加した。培養・洗浄後、固相に結合した抗体を前述
（例３）と同様にして検出した。
イーン−２０を含有する燐酸塩緩衝生理的食塩水）で希
釈して１．５−２．０のＡ490 ／１０分値とした。この
希釈液を「処理血漿サンプル」の希釈液と混合し、プレ
ートに添加した。培養・洗浄後、固相に結合した抗体を
前述（例３）と同様にして検出した。ＥＬＩＳＡを用い
てＢβ１５−４２抗原の存在についてテストするため
に、ミクロリットルプレートにＢβ１５−４２を４℃／
１６hrで被覆した。ＭＡｂ／Ｔ２ＧｌｓをＴＰＢＳで希
釈して約１．６のＡ490 ／５分値とした。この抗体希釈
液を「処理血漿サンプル」の希釈液と混合し、プレート
に添加した。培養・洗浄後、固相に結合した抗体を前述
（例３）と同様にして検出した。
【０１３７】ＲＩＡを用いてＢβ１−４２抗原の存在に
ついて「処理血漿サンプル」をテストするために、前述
した方法（例４）を行った。リガンドは 125Ｉ−Ｂβ１
−４２または 125Ｉ−Ｂβ１−１１８であり、抗体はＭ
Ａｂ／１−８ｃ６であり、第二抗体はロバの抗マウス抗
体をセルロースに懸濁させたもの、すなわちＳａｃ−Ｃ
ｅｌであった。（例４）。ＲＩＡを用いてＢβ１５−４
２抗原の存在についてテストするために、前記と同じ手
順に従った。リガンドは 125Ｉ−Ｂβ１５−４２であ
り、抗体はＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓであり、第二抗体はＳａ
ｃＣｅｌであった。
ついて「処理血漿サンプル」をテストするために、前述
した方法（例４）を行った。リガンドは 125Ｉ−Ｂβ１
−４２または 125Ｉ−Ｂβ１−１１８であり、抗体はＭ
Ａｂ／１−８ｃ６であり、第二抗体はロバの抗マウス抗
体をセルロースに懸濁させたもの、すなわちＳａｃ−Ｃ
ｅｌであった。（例４）。ＲＩＡを用いてＢβ１５−４
２抗原の存在についてテストするために、前記と同じ手
順に従った。リガンドは 125Ｉ−Ｂβ１５−４２であ
り、抗体はＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓであり、第二抗体はＳａ
ｃＣｅｌであった。
【０１３８】本発明は、その精神または本質的な属性か
ら逸脱することなく他の特定の形態で具体化することが
出来、したがって、本発明の範囲を指摘するものとして
前記明細書の記載でなく、添付の特許請求の範囲を参照
することが必要である。
ら逸脱することなく他の特定の形態で具体化することが
出来、したがって、本発明の範囲を指摘するものとして
前記明細書の記載でなく、添付の特許請求の範囲を参照
することが必要である。
【図１】図１は、ＳＤＳの存在下７％ポリアクリルアミ
ドゲル中のＮ−ＤＳＫ（１）、（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ
（２）、および（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ（３）の電気泳動パタ
ーンを示す。各Ｎ−ＤＳＫ種の移動度が示される。
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはバトロキソビン誘導フィブリンから
単離し、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＮ−ＤＳＫから人トロンビ
ン分解により調製した。
ドゲル中のＮ−ＤＳＫ（１）、（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ
（２）、および（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ（３）の電気泳動パタ
ーンを示す。各Ｎ−ＤＳＫ種の移動度が示される。
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫはバトロキソビン誘導フィブリンから
単離し、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫはＮ−ＤＳＫから人トロンビ
ン分解により調製した。
【図２】図２においてａおよびｂは、Ｎ−ＤＳＫ（図２
のａ）および（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ（図２のｂ）からのトロ
ンビン分解ペプチドの高性能液体クロマトグラフィーに
よる分別を示すグラフである。溶離パターンは２０６nm
での吸光度を測定することにより得た。カラムおよびク
ロマトグラフィー条件は、Koehn and Canfield,Analyt.
Biochem.,116 ,349-356,1981 、に記載のものと同じで
あった。
のａ）および（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫ（図２のｂ）からのトロ
ンビン分解ペプチドの高性能液体クロマトグラフィーに
よる分別を示すグラフである。溶離パターンは２０６nm
での吸光度を測定することにより得た。カラムおよびク
ロマトグラフィー条件は、Koehn and Canfield,Analyt.
Biochem.,116 ,349-356,1981 、に記載のものと同じで
あった。
【図３】図３は、クラス特異性抗血清を用いるＭＡｂ／
１−８ｃ６のオクテルロニー分析を示す。抗原は正常マ
ウス血漿（Ａ）およびＭＡｂ／１−８ｃ６（Ｂ）であ
り、クラス特異性抗血清は：抗ＩｇＧ1 （１）：抗Ｉｇ
Ｇ2a（２）：抗ＩｇＧ2b（）：抗ＩｇＧ3 （４）であっ
た。
１−８ｃ６のオクテルロニー分析を示す。抗原は正常マ
ウス血漿（Ａ）およびＭＡｂ／１−８ｃ６（Ｂ）であ
り、クラス特異性抗血清は：抗ＩｇＧ1 （１）：抗Ｉｇ
Ｇ2a（２）：抗ＩｇＧ2b（）：抗ＩｇＧ3 （４）であっ
た。
【図４】図４は、種々の「コールド」競合抗原による
125Ｉ−Ｂβ１−１１８リガンドの結合阻止を示すグラ
フである。ＭＡｂ／１−８ｃ６の１／４０希釈液を使用
した。ＭＡｂ／１−８ｃ６は競合抗原の不在下でリガン
ドの約４０％と結合した。非特異性結合は５％未満であ
った。少なくとも５つの異なる実験の平均値を示す。Ｎ
−ＤＳＫの他の２つの鎖（すなわち、Ａα−１−５１お
よびγ１−７８）でここに示す濃度範囲では阻止が見ら
れなかった。フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳＫおよび
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫは、２モルのＢβ鎖（フィブリノーゲ
ンの場合）またはＢβ１−１１８（両Ｎ−ＤＳＫ種の場
合）を有する二量体である。したがって、計算に用いた
演算分子量（mol.wt.)は各々の実際の分子量の１／２で
あった。
125Ｉ−Ｂβ１−１１８リガンドの結合阻止を示すグラ
フである。ＭＡｂ／１−８ｃ６の１／４０希釈液を使用
した。ＭＡｂ／１−８ｃ６は競合抗原の不在下でリガン
ドの約４０％と結合した。非特異性結合は５％未満であ
った。少なくとも５つの異なる実験の平均値を示す。Ｎ
−ＤＳＫの他の２つの鎖（すなわち、Ａα−１−５１お
よびγ１−７８）でここに示す濃度範囲では阻止が見ら
れなかった。フィブリノーゲン、Ｎ−ＤＳＫおよび
（Ｂ）Ｎ−ＤＳＫは、２モルのＢβ鎖（フィブリノーゲ
ンの場合）またはＢβ１−１１８（両Ｎ−ＤＳＫ種の場
合）を有する二量体である。したがって、計算に用いた
演算分子量（mol.wt.)は各々の実際の分子量の１／２で
あった。
【図５】図５は、トロンビン分解前（ゲル１および３）
および後（ゲル２および４）のＢβ１−１１８の電気泳
動パターンを示す。ゲル１および２はＳＤＳ中１０％ア
クリルアミドであり、ゲル３および４はＳＤＳ中７％ア
クリルアミドであった。各ゲルのＢβ鎖の移動度を示
す。
および後（ゲル２および４）のＢβ１−１１８の電気泳
動パターンを示す。ゲル１および２はＳＤＳ中１０％ア
クリルアミドであり、ゲル３および４はＳＤＳ中７％ア
クリルアミドであった。各ゲルのＢβ鎖の移動度を示
す。
【図６】図６は、トロンビン分解前後における標準量の
「コールド」Ｂβ１−１１８による 125Ｉ−Ｂβ１−１
１８の結合阻止を示すグラフである。抗体希釈、特異的
および非特異的結合は図４に示す通りであった。８つの
連続実験の平均を示し、標準偏差を垂直バーで示す。
「コールド」Ｂβ１−１１８による 125Ｉ−Ｂβ１−１
１８の結合阻止を示すグラフである。抗体希釈、特異的
および非特異的結合は図４に示す通りであった。８つの
連続実験の平均を示し、標準偏差を垂直バーで示す。
【図７】図７において、ａ，ｂおよびｃは、プールされ
た（５．７ml）患者血漿からつくった抽出液を用いた高
性能クロマトグラフィー操作から得られた画分について
の免疫反応性輪郭を示すグラフである。カラムおよび条
件は図２に示すものと同じであった。クロマトグラフィ
ー後、アセトニトリルを留去し、各画分を１．０mlの
０．２ＭＮＨ4 ＨＣＯ3 に溶解し、免疫検定法で用い
た。トロンビン分解前後に画分５−８のみを分析した。
サンプルのＦＰＡをトロンビン分解前のみ測定した。ト
ップパネル：商用Ｂβ１５−４２ラジオイムノアッセイ
キット〔IMCO Corporation,Ltd.,Stockholm,Sweden〕を
用いる免疫反応性；中間パネル：ＭＡｂ／１−８ｃ６で
測定した免疫反応性；底部パネル：トロンビン後のみの
画分５−８のＦＰＢ免疫反応性。画分５−８および１７
−１９にＦＰＢが見い出された。
た（５．７ml）患者血漿からつくった抽出液を用いた高
性能クロマトグラフィー操作から得られた画分について
の免疫反応性輪郭を示すグラフである。カラムおよび条
件は図２に示すものと同じであった。クロマトグラフィ
ー後、アセトニトリルを留去し、各画分を１．０mlの
０．２ＭＮＨ4 ＨＣＯ3 に溶解し、免疫検定法で用い
た。トロンビン分解前後に画分５−８のみを分析した。
サンプルのＦＰＡをトロンビン分解前のみ測定した。ト
ップパネル：商用Ｂβ１５−４２ラジオイムノアッセイ
キット〔IMCO Corporation,Ltd.,Stockholm,Sweden〕を
用いる免疫反応性；中間パネル：ＭＡｂ／１−８ｃ６で
測定した免疫反応性；底部パネル：トロンビン後のみの
画分５−８のＦＰＢ免疫反応性。画分５−８および１７
−１９にＦＰＢが見い出された。
【図８】図８は、Nosselおよび共同者により仮定された
トロンビンおよびプラスミンによる生体内フィブリノー
ゲンタンパク質加水分解の図解を示す（Nossel et al.,
J.Clin.Invest., 64,1371-1378,1979 、からの修正図)
。
トロンビンおよびプラスミンによる生体内フィブリノー
ゲンタンパク質加水分解の図解を示す（Nossel et al.,
J.Clin.Invest., 64,1371-1378,1979 、からの修正図)
。
【図９】図９は、人トロンビンによる分解前（ａ）およ
び後（ｂ）のＢβ１−４２ペプチドのＨＰＬＣ溶離パタ
ーンを示すグラフである。画分の免疫反応性輪郭（陰影
領域）は、 125Ｉ−Ｂβ１５−４２リガンドおよびＢβ
１５−４２に対するラビット抗血清を用いてラジオイム
ノアッセイにより得た（Kudryk et al.,前出、1982) 。
（ｂ）でカラムに適用されたトロンビン分解ペプチドの
量は（ａ）の場合の約３倍であった。研究によれば、指
摘された画分で抗原の７０％超を取得出来ることが分っ
た。
び後（ｂ）のＢβ１−４２ペプチドのＨＰＬＣ溶離パタ
ーンを示すグラフである。画分の免疫反応性輪郭（陰影
領域）は、 125Ｉ−Ｂβ１５−４２リガンドおよびＢβ
１５−４２に対するラビット抗血清を用いてラジオイム
ノアッセイにより得た（Kudryk et al.,前出、1982) 。
（ｂ）でカラムに適用されたトロンビン分解ペプチドの
量は（ａ）の場合の約３倍であった。研究によれば、指
摘された画分で抗原の７０％超を取得出来ることが分っ
た。
【図１０】図１０は、（Ｔ）Ｎ−ＤＳＫ被覆プレート
（０．８μｇ／ml）およびＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを用いる
競合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。阻害剤はトロンビ
ンによる分解前後のＢβ１−４２であった。緩衝液対照
ウエル（阻害剤添加せず）のＡ490 ／５分値は約０．８
であった。
（０．８μｇ／ml）およびＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓを用いる
競合ＥＬＩＳＡを示すグラフである。阻害剤はトロンビ
ンによる分解前後のＢβ１−４２であった。緩衝液対照
ウエル（阻害剤添加せず）のＡ490 ／５分値は約０．８
であった。
【図１１】図１１は、 125Ｉ−Ｂβ１５−４２リガンド
のＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓへの結合の指摘された「コール
ド」競合抗原による阻止を示すグラフである。（Ｔ）Ｎ
−ＤＳＫはＢβ１５−４２またはトロンビン分解Ｂβ１
−４２で示されるものと同じ阻止曲線を与えた。無傷Ｂ
β１−４２、Ｂβ１−１１８、Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）
Ｎ−ＤＳＫは、図示の濃度範囲で交差反応しなかった。
正常の人血漿を用いた場合わずかの競合が見られたが、
非常に低い希釈率で添加した場合だけであった。
のＭＡｂ／Ｔ２Ｇｌｓへの結合の指摘された「コール
ド」競合抗原による阻止を示すグラフである。（Ｔ）Ｎ
−ＤＳＫはＢβ１５−４２またはトロンビン分解Ｂβ１
−４２で示されるものと同じ阻止曲線を与えた。無傷Ｂ
β１−４２、Ｂβ１−１１８、Ｎ−ＤＳＫおよび（Ｂ）
Ｎ−ＤＳＫは、図示の濃度範囲で交差反応しなかった。
正常の人血漿を用いた場合わずかの競合が見られたが、
非常に低い希釈率で添加した場合だけであった。
【図１２】図１２は、トロンビン分解後のフィブリノー
ゲン被覆ＥＬＩＳＡプレート上における２つの異なるモ
ノクロナール抗体の反応性を示すグラフである。実験
は、トロンビンを添加した単一プレート（９６ウエル）
上で行った。指摘された時点における分解は、トロンビ
ン阻害剤Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｎｇ−ＣＨ2 Ｃｌを添
加して停止させた。対照（非分解）フィブリノーゲン被
覆プレート上のＭＡｂ／１−８ｃ６に対するＡ490 ／５
分値は約１．７であった。同じプレート上で、ＭＡｂ／
Ｔ２Ｇｌｓのみがバックグラウンドの色を与えた。
ゲン被覆ＥＬＩＳＡプレート上における２つの異なるモ
ノクロナール抗体の反応性を示すグラフである。実験
は、トロンビンを添加した単一プレート（９６ウエル）
上で行った。指摘された時点における分解は、トロンビ
ン阻害剤Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｎｇ−ＣＨ2 Ｃｌを添
加して停止させた。対照（非分解）フィブリノーゲン被
覆プレート上のＭＡｂ／１−８ｃ６に対するＡ490 ／５
分値は約１．７であった。同じプレート上で、ＭＡｂ／
Ｔ２Ｇｌｓのみがバックグラウンドの色を与えた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (13)
- 【請求項１】 次の性質： ａ）人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２
のペプチドフラグメントと反応し； ｂ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−１４のペプチドフラグメントと反応せ
ず；そして ｃ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２のペプチドフラグメントと反応し
ない； を有するモノクロナール抗体。 - 【請求項２】 ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ８４２６に
よって産生される請求項１に記載のモノクロナール抗
体。 - 【請求項３】 人フィブリノーゲンのトロンビン分解に
よって産生される産物と反応するが、しかしラビットフ
ィブリノーゲンのトロンビン分解から生じる産物とは反
応しない請求項１に記載のモノクロナール抗体。 - 【請求項４】 血漿サンプルを、 次の性質： ａ）人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２
のペプチドフラグメントと反応し； ｂ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−１４のペプチドフラグメントと反応せ
ず；そして ｃ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２のペプチドフラグメントと反応し
ない； を有するモノクロナール抗体、 と接触させることによるエンザイムリンクドイムノソル
ベントアッセイまたはラジオイムノアッセイによって前
記血漿中の人フィブリンIIのＢβ鎖の前記フラグメント
の存在を検出する方法。 - 【請求項５】 前記モノクロナール抗体を前記サンプル
と、人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２
の放射能標識フラグメントの存在下で接触せしめ、前記
モノクロナール抗体に結合した放射能標識フラグメント
を前記モノクロナール抗体に特異性のある抗体を用いて
分離する請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 前記モノクロナール抗体を前記サンプル
と混合し、得られた混合物を人フィブリンIIのＢβ鎖の
アミノ酸残基１５−４２のポリペプチドフラグメントと
接触せしめ、そして前記モノクロナール抗体に特異性の
ある抗体が酵素と結合している請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】 エンザイムリンクドイムノソルベントア
ッセイである請求項４に記載の方法。 - 【請求項８】 ラジオイムノアッセイである請求項４に
記載の方法。 - 【請求項９】 前記エンザイムリンクドイムノソルベン
トアッセイまたは前記ラジオイムノアッセイの結果を、
既知の標準と比較し、正常サンプルに対するテストサン
プル中の相対抗原濃度を測定する請求項４に記載の方
法。 - 【請求項１０】 血漿サンプル中に存在する、人フィブ
リンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２のペプチドフ
ラグメントの量を測定する方法であって、 （１）前記サンプルを、 次の性質： ａ）人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２
のペプチドフラグメントと反応し； ｂ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−１４のペプチドフラグメントと反応せ
ず；そして ｃ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２のペプチドフラグメントと反応し
ない； を有するモノクロナール抗体、 人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２のペ
プチドフラグメントを含んでなる固体担体上の競合抗
原、およびマウス免疫グロブリンと結合する酵素結合抗
体の各々の既知量と接触させ； （２）結合した酵素結合抗体の量を測定することによ
り、固体担体上の競合抗原と結合した前記モノクロナー
ル抗体の量を検出し；そして （３）工程（１）および（２）の結果を、人フィブリン
IIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２のペプチドフラグ
メントを含んでなる既知抗原の標準量を用いて得られる
結果と比較する； ことを特徴とする方法。 - 【請求項１１】 血漿サンプル中に存在する、人フィブ
リンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２のペプチドフ
ラグメントの量を測定する方法であって、 （１）前記サンプルを、 次の性質： ａ）人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２
のペプチドフラグメントと反応し； ｂ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−１４のペプチドフラグメントと反応せ
ず；そして ｃ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２のペプチドフラグメントと反応し
ない； を有するモノクロナール抗体、 および人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４
２のペプチドフラグメントからなる競合放射能標識抗原
の各々の既知量と、競合放射能標識抗原が前記モノクロ
ナール抗体と結合出来るように接触させ； （２）工程（１）の前記サンプル、前記モノクロナール
抗体および競合放射能標識抗原を、マウス免疫グロブリ
ンに特異性のある抗体と接触させ； （３）工程（２）の抗体と結合した放射能標識抗原を工
程（２）の抗体を用いて分離し； （４）工程（３）の結合した放射能標識抗原の放射能を
計数し；そして （５）工程（１），（２），（３）および（４）の結果
を、人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２
のペプチドフラグメントを含んでなる既知抗原の標準量
を用いて得られる結果と比較する； ことを特徴とする方法。 - 【請求項１２】 テストサンプル中に含まれる血漿が特
定のアミノ酸配列を有するペプチドを含有するか否かを
決定するためのキットであって、 （ｉ）次の性質： ａ）人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４２
のペプチドフラグメントと反応し； ｂ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−１４のペプチドフラグメントと反応せ
ず；そして ｃ）人フィブリノーゲンまたはフィブリンＩのＢβ鎖の
アミノ酸残基１−４２のペプチドフラグメントと反応し
ない； を有するモノクロナール抗体、 （ii）人フィブリンIIのＢβ鎖のアミノ酸残基１５−４
２のペプチドフラグメント、 （iii) 人フィブリンII、および （iv）動物免疫グロブリンに対して特異性のある酵素結
合免疫グロブリン、を含んで成るキット。 - 【請求項１３】 前記モノクロナール抗体がマウスモノ
クロナール抗体であり、そして動物の免疫グロブリンが
マウス免疫グロブリンである、請求項１２に記載のキッ
ト。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55083683A | 1983-11-14 | 1983-11-14 | |
| US550836 | 1983-11-14 | ||
| US567462 | 1984-01-03 | ||
| US06/567,462 US4722903A (en) | 1983-11-14 | 1984-01-03 | Monoclonal antibodies specific to in vivo fragments derived from human fibrinogen, human fiberin I or human fibrin II |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59237691A Division JPH0616717B2 (ja) | 1983-11-14 | 1984-11-13 | モノクロナ−ル抗体 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06237786A JPH06237786A (ja) | 1994-08-30 |
| JPH0772200B2 true JPH0772200B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=27069567
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59237691A Expired - Lifetime JPH0616717B2 (ja) | 1983-11-14 | 1984-11-13 | モノクロナ−ル抗体 |
| JP5203770A Expired - Fee Related JPH0772200B2 (ja) | 1983-11-14 | 1993-07-27 | 人フィブリンｉｉのｎｈ２ 末端フラグメントに対するモノクロナール抗体 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59237691A Expired - Lifetime JPH0616717B2 (ja) | 1983-11-14 | 1984-11-13 | モノクロナ−ル抗体 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0151239B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0616717B2 (ja) |
| AU (1) | AU576788B2 (ja) |
| CA (1) | CA1248472A (ja) |
| DE (1) | DE3486030T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US4927916A (en) * | 1984-04-23 | 1990-05-22 | The General Hospital Corporation | Method of producing fibrin-specific monoclonal antibodies lacking fibrinogen-cross-reactivity using fibrin-specific peptides |
| US5357042A (en) * | 1984-04-23 | 1994-10-18 | The General Hospital Corporation | Synthetic peptides capable of eliciting fibrin-specific monoclonal antibodies lacking fibrinogen-cross-reactivity |
| JPS60233553A (ja) * | 1984-05-04 | 1985-11-20 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | フイブリノゲン・フイブリン分解産物の測定方法 |
| JPS60257363A (ja) * | 1984-06-05 | 1985-12-19 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | Ｆｄｐの測定法 |
| JPS60257364A (ja) * | 1984-06-05 | 1985-12-19 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | フイブリノゲン・フイブリン分解産物の測定法 |
| US5116613A (en) * | 1985-01-08 | 1992-05-26 | The General Hospital Corporation | Antibody-thrombolytic agent product and method of use |
| US5256413A (en) * | 1985-01-08 | 1993-10-26 | The General Hospital Corporation | Method and use for site-specific activation of substances |
| CA1302919C (en) * | 1985-07-03 | 1992-06-09 | Robert T. Buckler | Histamine derivatives, immunogen conjugates and antibodies raised thereto |
| JPS6393800A (ja) * | 1986-10-08 | 1988-04-25 | Mitsubishi Gas Chem Co Inc | 抗人フイブリンモノクロ−ナル抗体ならびにその使用法 |
| SE8701437L (sv) * | 1987-04-06 | 1988-10-07 | Rolf Kenth Sigvard Wallin | Diagnostiskt foerfarande in vitro samt medel som kan utnyttjas vid foerfarandet |
| US5679583A (en) * | 1987-05-02 | 1997-10-21 | Hoechst Aktiengesellschaft | Monoclonal antibodies for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids |
| US5382522A (en) * | 1987-07-21 | 1995-01-17 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Immunoassay for creatine kinase-MB and creatine kinase-BB isoforms and reagents |
| US5382515A (en) * | 1987-07-21 | 1995-01-17 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | Creative kinase-MB immunoassay for myocardial infarction and reagents |
| US4900662A (en) * | 1987-07-21 | 1990-02-13 | International Immunoassay Laboratories, Inc. | CK-MM myocardial infarction immunoassay |
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| DE3730059A1 (de) * | 1987-09-08 | 1989-03-30 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung von "loeslichem" fibrin |
| US6541275B1 (en) | 1988-02-03 | 2003-04-01 | Dade Behring Inc. | Immunoassay for F1.2 prothrombin fragment |
| US5582862A (en) | 1988-04-04 | 1996-12-10 | General Hospital Corporation | Antibodies that bind to α2-antiplasmin crosslinked to fibrin which do not inhibit plasma α2-antiplasmin |
| US5372812A (en) * | 1988-04-04 | 1994-12-13 | The General Hospital Corporation | Composition and method for acceleration of clot lysis |
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| US5453359A (en) | 1988-06-13 | 1995-09-26 | American Biogenetic Sciences, Inc. | Immunoassay and kit for in vitro detection of soluble DesAABB fibrin polymers |
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