JPH0760158B2 - 分析物検出のための方法、試薬及び試験ストリップ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明の対象は、分析物測定のための方法並びに、この
方法に使用することができる試薬である。

〔従来の技術〕

分析物の測定は、とりわけ臨床診断学の場合に普及して
いる関心事である。そのために、以前は、達成可能な高
い正確度及び幅広い利用可能性のために、免疫学反応工
程を含む特別な方法が用いられた。容易に取り扱えると
いう利点から、固体担体に結合した、免疫学的反応成分
を用いてこのような方法が実施されることにますます移
行する。例えば、この方法は、完全な一連の反応が専ら
試料をストリツプと接触させることによつて進行する試
験ストリツプの使用を可能にする。

免疫学的測定方法は、関与した反応成分の種類に基づき
種々の分類することができる。これらのうちの１つは、
いわゆる競合的追出し試験（kompetitive Verdraengung
stests）の類である。この場合、標識化された抗体が結
合し、かつ固定化された抗原は、試料と接触させられ
る。固定化された抗原は、平衡反応の際に分析物が存在
する場合には標識化された抗体を有する免疫複合体から
追出される。従つて、以前に固定化され、標識化された
抗体は、測定すべき分析物を有機溶媒する複合体として
液相に移行し、かつ固定相からの液相の分離後、自らの
標識化により測定されることができる。これにより、試
料中の分析物の濃度を確認することができる。

このような免疫試験は、例えば欧州特許出願公開第0173
375号明細書に記載されている。標識化された抗体とし
て、標識化されたFabフラグメントが使用され、この場
合、抗体は試験介し時に複合体中に固定化れている分析
物と共に存在する。

米国特許第4436236号明細書には、類似した方法が記載
されているが、固定化された抗原が使用されており、こ
の抗原は標識化された抗体に対して分析物より劣る親和
性を有するこの方法の場合にも有利に標識化された抗体
フラグメントが使用される。

欧州特許出願公開第0173375号明細書及び米国特許第443
6236号明細書に記載の方法には、分析物が試料中に存在
しない場合であつても、これらの方法は測定の高い盲検
値（Leerwerte）を示すが、しかしながら、信号値は比
較的僅かであるという欠点を有する。

米国特許第4277560号明細書には、１つの免疫検定法（I
mmunoassay）が記載されており、この場合、標識化され
た分析物は固定化された抗体によつて可逆的に固相に結
合されている。標識化された分析物は、試料中に含有さ
れた分析物によつて固相から追出され、かつこの後に、
測定すべき分析物の量の尺度として使用されることがで
きる。この方法には欠点があり、即ち、結果の正確度が
著しく固相の積載の均一性に依存している。十分な正確
度は著しく達成し難い。

〔発明が解決しようとする課題〕

従つて、本発明の課題は、公知技術水準の方法の欠点、
とくに比較的高い盲検値及び製造の際の出費の多い手段
が回避される分析物測定のための方法を提供することで
あつた。方法は、正確かつ容易に自動化可能であるべき
であつた。

〔課題を解決するための手段〕

この課題は、試験液体を固定化された分析物もしくは固
定化された分析物類似物及び標識化された抗体と接触さ
せることによる液体試料中での分析物測定方法により解
決され、この場合、この抗体は、測定すべき分析物並び
に固定化された分析物もしくは固定化された分析物類似
物と免疫学的反応を起こすことができ、かつ固定化され
た分析物ないしは固定化された分析物類似物に結合する
ことによつて固定化されており、また、この方法は、標
識化された抗体が標識化１回つき少なくとも４つの結合
箇所を分析物ないしは分析物類似物に対して有すること
を特徴とする。

〔作用〕

同様に本発明の対象は、上記方法を実施するための試薬
である。

本発明による方法で確実に使用可能な分析物は、殊に抗
原又はハプテンである。測定は定性的に行なうことがで
き、すなわちこれは分析物が試料中に存在しているか否
かを確認するために定性的に行なうことができる。しか
しながらこの測定は定量的にも試料中の分析物の濃度も
しくは量の測定に利用することができる。液体試料は、
有利に水溶液、懸濁液又は乳濁液である。この試料は、
とくに有利に体液又は体液に由来する液体、例えば血
液、血清、血漿もしくは尿である。

分析物の濃度は、本発明の方法により10^-9から10^-5mol/
l、有利に10^-8〜10^-6mol/lの範囲内に決定されることが
できる。とりわけ有利なのは、いわゆる高濃縮された分
析物の測定であり、このようなものとは10^-8mol/lより
高い濃度範囲内の分析物である。尿中のこのような分析
物の例は、アルブミン又はα_１−ミクログロブリン（α
_１Ｍ）である。

分析物類似物とは、分析物に免疫学的に類似している化
合物のことである。類似物は構造的に多少分析物とは異
なるが、分析物に対する抗体により認識される。例えば
本発明の範囲内でこのような分析物類似物が使用される
のは可能であり、このばあい類似物は標識化された抗体
によつて分析物そのものよりも強く結合される。この場
合、盲検値、即ち分析物が存在しない状態での測定値は
とりわけ低い。このような分析物／分析物類似物の組合
せの例は次の通りである：豚アルブミン／ヒトアルブミ
ン、猿アルブミン／ヒトアルブミン。

固定化された分析物ないしは分析物類似物は、固相に結
合された分析物ないし分析物類似物である。結合は、共
有結合、沈降性結合、特定の相互作用による結合又は吸
着性結合であることができる。これらの結合種類のいず
れもが使用することができるが、但し、分析物ないしは
分析物類似物が大したことのない程度で固相から分離す
ることが保証される場合である。いずれの結合種類につ
いても公知の方法が当業者の自由な使用に提供されてい
る。固相の種類は、分析物ないしは分析物類似物の結合
種類によつて決定される。分析物が共有結合されている
場合、例えば、反応性基を有する固相が使用されねばな
らない。特定の相互作用による結合の場合、ビオチン／
ストレプタビジン（Steptavidin）による結合が有利で
ある。さらに、例えば固相にはストレプタビジン含有の
被膜が備えられ、かつ上記固相に結合された分析物ない
しは類似物は、ビオチンに結合される。ストレプタビジ
ンとビオチンによる正に固い結合が生じる。固相は、粒
子、紙、フリース材料、膜、織物、さらにキユベツト、
微量滴定プレート（Mikro−titerplatte）等の形で存在
できる。検出方法を試験ストリツプ上で実施すべき場合
には、吸収力のあるフリースが有利である。

標識化された抗体は、本発明による方法の場合、測定す
べき分析物並びに固定化された分析物ないしは分析物類
似物と免疫学的反応を起こすことができる抗体である。
分析物ないしは分析物類似物に対する抗体は、公知の方
法により得ることができ、かつ選択することができる。
ポリクローナル抗体並びにモノクローナル抗体を使用す
ることができる場合、モノクローナル抗体が有利であ
る。

標識化には、抗体の存在を定量的にか又は定性的に検出
することのできる物質のいずれもが使用されることがで
きる。適当な標識は、例えば酵素、金属、放出もしくは
吸収が光又は放射線によつて測定されることのできる基
或いは化学反応もしくは免疫学的反応によつてこのよう
な基に変化させることのできる基である。当業者は自由
に標識を選択することができる。標識の条件は、この標
識に抗体の複数の結合箇所を固定することが可能でなけ
ればならないことである。従つて、標識は有利に反応性
基、例えばヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基又は
カルボキシル基を有し、この場合、上記の基は抗体と直
接もしくは間接に結合されることができる。

標識として適当な酵素は、例えばヒドロラーゼ、例えば
β−ガラクトシダーゼ又はペルオキシダーゼ、例えばPO
Dである。

金属、特に、極めて微細に分割された粒子状、例えばコ
ロイド状のものは、例えば金を含む。このような標識
は、例えば欧州特許出願公開第0258963号明細書に記載
されている。蛍光化合物は、例えばレゾルフィンであ
り、色素化合物は、例えばフイコエリトリン、着色ラテ
ツクス粒子及び着色テルル及びセレノキシドである（欧
州特許出願公開第0298368号明細書）。有利な標識剤は
酵素及び金属であり、殊に酵素である。本発明による方
法の標識化された抗体は、技術的に現状において挙げら
れる抗体とは矛盾して、少なくとも４、有利に６〜12個
の結合箇所を分析物ないしは分析物類似物に対して有す
る。このような標識化された抗体を次に標識化された低
原子価（Oligovalenter）抗体として記載する。

標識化された低原子価抗体を抗体と標識から得るため
に、有利に標識は複数の抗体と反応させられ、この場
合、抗体は（Fabフラグメント又はIgGのようにより少な
い結合箇所、例えば１個もしくは２個の結合箇所を有す
る。

標識化された低原子抗体を得るための方法の場合、さま
ざまな数の多数の結合箇所を有する標識化された抗体の
混合物もしばしば生じる。この混合物から、標識化され
た抗体の混合物を単離することができ、この場合、上記
混合物は、一定の結合箇所数、例えば標準化１回につき
４〜７個の結合箇所を有する標識化された抗体の混合物
である。この混合物は、本発明による方法で有利に使用
されることができるが、但し、この混合物が主として標
識化１回につき少なくとも４つの結合箇所を有する標識
化された抗体を含有する場合に限る。

酵素標識化された抗体にとつて、５個のIgG又は10個のF
abフラグメントの酵素への結合がとくに有利である。

このような標識化された低原子価抗体の製造は公知であ
り、例えばEnzyme Immunoassayのキチガワ（Kitigawa）
担当部分（Ishikawa,Kuwai,Migui編;Igaku Shoin Tokyo
/New York（1981）,81〜89頁）に記載されている。

有利に本発明による方法で固定化された分析物ないしは
分析物類似物と標識化された抗体からの混合物は、上記
成分からの固定化された免疫複合体として使用される。
免疫複合体を含有するこのような固相は、標識化された
抗体を、試験分析物によつてこれを追出せる状態で含有
しており、かつ以下では追出しマトリツクスとも呼ばれ
る。

製造のために既に固定化された分析物ないしは分析物類
似物と標識化された抗体から免疫学的反応において固定
化された免疫複合体が形成される。

このような追出しマトリツクスの別の方法もしくは製造
は、分析物ないしは類似物に対する固相への分析物ない
しは分析物類似物と抗体間の免疫学的沈降反応の実施で
ある。引続き、このマトリツクスは標識化された抗体と
反応させられる。このような方法は、例えば欧州特許出
願公開第0312907号明細書に記載されている。

ビオチン／ストレプタビジンのように特定の相互作用に
よつて分析物ないしは分析物類似物の固定化を行なうべ
き場合、ビオチニル化分析物又はビオチニル化分析物類
似物は、免疫学的反応の際に標識化された抗体と、可溶
性の免疫複合体へと反応させられ、かつさらに、ストレ
プタビジンで塗布された固相と接触させられることがで
きる。液相の分離後、洗浄工程なしでも追出しマトリツ
クスが得られ、このマトリツクスは実際、複合化されず
標識化されなかつた抗体ないしは余つた標識によつてで
はなく不純化されている。しかし、最初の反応の際にビ
オチニル化分析物又は分析物類似物をストレプタビジン
で塗布された固相と接触させることも可能である。

とりわけ成分の次のような量の割合は有利であると証明
された：測定すべき分析物濃度が高いほど、固定化され
た分析物／分析物類似物の量は高くなる。標識化された
抗体の量が分析物ないしは分析物類似物の量に比例させ
て少なく選択された場合、多くの場合においてこの方法
は役に立ち難いものとなる。

固定化された分析物ないしは分析物類似物の量は、とく
に1ng〜0.1mg/マトリツクスcm²、ことに0.1μｇ〜10μg
/マトリックスcm²である。標識化された抗体の量は、１
〜1000mU/マトリックスcm²、ことに10〜500mU/マトリッ
クスcm²である。

本発明による方法の実施は、一般に競合的追出し試験に
よつて公知の原理と同様にして行なわれるが、しかしな
がら本発明による追出しマトリックスの使用下で行なわ
れる。

この方法は、少量の試料量の測定に好適である。常用の
試験ストリツプを用いての検査に適当なのは、とくに試
料容量５μｌ〜1mlである。容量は使用されたマトリツ
クスの吸収力に依存している。有利に試料容量はマトリ
ツクスの吸収量を超過しない。

本発明による方法開始時に試料一定量は固定化された分
析物もしくは分析物類似物及び標識化された抗体と接触
させられ、一定時間そこに置かれる。この時間の間に試
料中に測定すべき分析物が存在する場合には標識化され
た抗体を有する免疫複合体から固定化された分析物もし
くは固定化された分析物類似物の競合的追出しが行なわ
れる。分析物と標識化された抗体から可溶性の免疫複合
体が形成される。より多くの分析物が試料中に存在する
ほど、より多くの可溶性の免疫複合体が形成される。従
つて、分析物の量を、固相上に残留している標識化され
た抗体の量又は液相中に存在している標識化された抗体
の量から測定することが可能である。このために、液相
は固相から少なくとも部分的に分離されている。さら
に、両方の相の中ないしは表面の標識の量が常法で測定
される。標識が酵素である場合、相は、酵素反応に適当
な条件下で基質と反応させられる。反応させた基質の量
は、同様に試料中の分析物の量の尺度である。

既知の分析物濃度の試料を用いた本発明による方法を実
施することによつて、較正曲線が得られ、この場合、該
曲線からこれまで未知の分析物含有量の試料中で分析物
濃度を、上記の方法によつて得られた測定値から読み取
ることができる： この方法は、種々の変法において実施されることができ
る： １つの実施態様の場合、固定化された分析物ないし分析
物類似物及び酵素標識化された抗体を含有する試験領域
を有するエツペンドルフの容器（Eppendorfhuetchen）
に分析物含有の試料がピペツトで入れられる。例えば５
分間の振盪の後、溶液の一部はキユベツトに移され、こ
の場合、該キユベツトには酵素に対する色原体基質（ch
romogenes Substrat）が入つている。

色形成速度は、生じた有色生成物が吸光する波長での吸
光度測定によつて測定される。

別の実施態様の場合、上記の試験領域を有するキユベツ
トに試料が混入され、この混合物は一定時間、恒温保持
され、液相はキユベツトから除去される。この後に、液
相の残りの完全な除去のための洗浄工程が続くことがで
きる。引続き、標識酵素に対する色原体基質の溶液がキ
ユベツトに入れられる。この方法の場合でも、変色が測
定される。しかしながら、上記の実施態様とは異なり、
より多くの分析物が試料中に存在した場合ほど、色変化
はより小さい。

とくに有利な実施態様は、第１図のクロマトグラフイー
用ストリツプである。ストリツプ１は、基礎シート２か
ら構成され、この場合、基礎シート上に吸収フリース
３、追出しマトリツクス４及び基質フリース５が吸収性
で相互に結合して取付けられている。ストリツプ１は、
フリースのうち吸収フリース３のみが試料と接触するよ
うに試料液体に入れられる。吸収フリースを使用するこ
とは、とりわけ有利であるが、絶対に必要というわけで
はない。試料は、吸収フリースから追出しマトリツクス
４に吸収される。この追出しマトリツクスは、例えば吸
収力のあるフリースであり、この場合、フリースに分析
物もしくは分析物類似物が固定化されており、かつこの
フリースは標識化された抗体を固定化された分析物ない
し分析物類似物を有する免疫複合体の形で含有する。測
定すべき分析物は、この方法の場合でも固定化された分
析物ないしは分析物類似物を標識化された抗体を有する
免疫複合体から追出す。このようにして生じた可溶性の
免疫複合体は試料液体と一緒に領域５中に流れ、この場
合、この領域には酵素標識に適当な色原基質が含浸させ
た状態で存在する。基質領域５中で、変色が測定され
る。必要に応じて追出しマトリツクス４と基質領域の間
に緩やかな吸収性の布地が液体の流れを減速させるため
に取付けられることができる。

もう１つの実施態様は、第２図の試験ストリツプ10であ
る。

基礎シート11上に、固定化された分析物ないしは分析物
類似物及び標識化された抗体を含有する追出しマトリツ
クス12が固定されている。基礎シートに、例えば接着箇
所13を介して少なくとも部分的に透明で可動のフラツプ
14が取り付けられている。フラツプの追出しマトリツク
スと向い合う側に、色原体基質を含有するフイルム15が
ある。恒温保持時間の後、フイルム15は、フラツプがマ
トリツクス12上に下がることにより圧せられ、これによ
り測定の反応が開始する。この試験ストリツプを用いた
試験は、なかんずく光度的並びに反射的成分を付加的に
使用した場合には反射光度的に評価されることができ
る。

本発明による方法は、次のような利点を有し、この利点
とは、盲検値が測定信号と比べて比較的小さいことであ
る。さらに、技術の現状から公知の、使用した標識化さ
れた抗体の不純物を有する競合的追出し試験の場合、結
合しない不純物、例えば余分の標識剤を計算に入れなけ
ればならないことが判明した。この不純物は、例えば技
術現状における固定化された分析物ないしは分析物類似
物と標識化された抗体からの免疫複合体を含有する追出
しマトリツクスを試験実施前に洗浄することにより除去
されなければならない。本発明の方法による標識化され
た抗体中の標識剤に対する結合箇所の有利な比によつ
て、反応した標識剤による不純物が著しく回避される。
本発明による方法の別の利点は、とりわけ少ない工程及
びとりわけ少ないマトリツクスを含むことである。これ
により浪費的かつ経費集約的並びに時間集約的段階がな
くなる。

同様に本発明の対象は、試料中の分析物測定のための本
発明による方法の実施用の試薬であり、この場合、試薬
は固定化された分析物もしくは固定化された分析物類似
物及び標識化された抗体を含有し、この場合、抗体は測
定すべき分析物並びに固定化された分析物もしくは固定
化された分析物類似物と免疫学的反応を起こすことがで
き、かつ標識化された抗体は標識化１回につき少なくと
も４つの結合箇所を分析物ないしは分析物類似物に対し
て有している。

〔実施例〕

次に、本発明を例につき詳説す。

例１ アルブミンの測定 1.追出マトリツクスの製造 ａ）ヒト血清アルブミン（HSA）のジスクシニジルスベ
レート（DSS）によるポリヒト血清アルブミン（pHSA）
への架橋 HSA1.5gを燐酸カリウム緩衝液（200mM、pHは8.0であ
る）30ml中に入れ、かつこれを２時間以内にジオキサン
1ml当りDSS50mgからの溶液2.5mlを混入した。架橋反応
が進行した後、500倍容量の燐酸カリウム緩衝液（20m
M、pH7.2）に対して透析した。650000ダルトン以上の分
子量を有する高分子画分（pHSA）をスペロース６（Supe
rose 6^R）（フアルマシア社（Pharmacia），フライブル
ク、ドイツ連邦共和国）でゲル濾過により分離し、かつ
蛋白質1mg当りサツカロース6mgの添加後、凍結乾燥させ
た。

ｂ）ヒト血清アルブミンの固定化 ポリエステル50％／リンタース（Linters）50％の大き
さ６×8mm及び厚さ0.5mmのフリース片を、pHSA30mg/lの
溶液15μｌとともに燐酸ナトリウム緩衝液pH7.5）10mM
中に含浸させ、かつ50℃で30分間乾燥させた。

ｃ）HSA及びβ−ガラクトシダーゼに対する抗体からの
接合体 接合体Ｉ〜XIをIgG（クローン１（Ｉ〜III）又は２（IV
〜VII））ないしはFab（クローン３（VIII〜XI））から
T.キチガワの方法（Enzyme Immunoassay,Ishikawa,Kawa
i,Migui編;Igaku Shoin Tokyo/New York 1981,81〜89
頁）により製造し、かつそれぞれの場合、スペロース６
（Superose−6^R）−クロマトグラフイーによつて分別し
た。

ｄ）IgGへのマレイミド基の導入 １）燐酸ナトリウム緩衝液（0.1mol/l:pH7.0）0.5ml中
のIgG1.4mg（9.3nmol）の溶液へN,N−ジメチルホルムア
ミド中の３−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシス
クシニミドエステル0.9g/l 50μｌを添加した。

２）該混合物を30℃で30分間、恒温保持し、かつ溶離剤
としての燐酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）0.1mol/lを用
いてセフアデツクスＧ−25（１×45cm）を用いてクロマ
トグラフイーした。

ｅ）β−ガラクトシダーゼを含有する接合体 １）マレイミド−IgG 1.25mg（8.3mmol）を含有する燐
酸ナトリウム緩衝液（0.1mol/l;pH6.5）1.4ml中にβ−
ガラクトシダーゼ（凍結乾燥させた）1.5mg（2.8mmol）
を溶解させた。IgG及び酵素の最終濃度は、６ないしは2
mmol/lであつた。

２）該溶液を４℃で20時間恒温保持した。

３）該溶液を次の組成の溶離剤を含有するセフアロース
6B（1.5×45cmのかラム）で分離した： 燐酸ナトリウム（pH6.5） 10mmol/l 塩化ナトリウム 0.1mol/l 塩化マグネシウム 1mmol/l アジ化ナトリウム 1g/l ４）溶出液吸収を280mmで読み取つた。

５）該溶出液を吸収プロフイールによりプール中で分別
した。

６）プールのβ−ガラクトシダーゼ−活性度を測定し
た。

上記方法は、J.Immunoassay 4（３）,209〜237（1983）
のE.イシカワ（Ishikawa）担当部分にも記載されてい
る。

ｆ）追出しマトリツクス 牛アルブミン0.5％を含有するHEPES−緩衝液（pH7.5）
0.1M中のｃ）の接合体（4U/ml）の溶液15μｌをｂ）の
フリース上に滴下した。引続き、フリースを乾燥させ
た。

ｇ）盲検値及び測定範囲の測定 ６×8mm大のｆ）のフリース２枚のステープルを Ａ）ヒト血清アルブミン（HSA） 0mg/l Ｂ） 〃 100mg/l を含有する緩衝溶液（燐酸塩50mmol/lpH7.5）55μｌで
含浸させた。５分後、液体をマトリツクスから遠心分離
した。液体にクロロフエノールレツド−β−ガラクトシ
ド5mmol/lを与え、かつ光度計を用いて37℃でキユベツ
ト中で吸光度の増加分を576nmで測定した。

測定値Ａ）から毛も盲検値、即ち、分析物が存在しない
場合にも見せかけの信号を出す値が生じた。

Ｂ）について測定値は、分析物100mg/lに対する信号値
に相応した。

盲検値に対する信号値からの係数は、試験の達成可能な
正確度に対する尺度である。

第１表は、各接合体混合物Ｉ〜XIに対する盲検値
（Ａ）、測定値（Ｂ）及び係数B/Aを再現する。

最多の結合箇所を有する標識化された抗体を用いて最良
の正確度を達成できたことは歴然としている。

2.アルブミン測定のための較正曲線の記録 ポリエステル50％／リンタース（Linters）50％の大き
さ６×8mmかつ厚さ0.5mmのフリース片を燐酸塩緩衝液
（pH7.25）0.01mol/l中のpHSA50ないし100mg/lの溶液15
μｌで含浸し、かつ乾燥させた。その後、フリースをそ
れぞれHEPES−緩衝液（100mmol、pH7.5）及びRSA0.5％
中の標識化された抗体14U/mlの溶液15μｌで含浸し、か
つ乾燥させた。

このようにして得られた両フリースＢ及びＣは、アルブ
ミン測定に適当である。フリースの較正曲線の記録のた
めのフリースをHSA0mg/l、10mg/l、50mg/lないしは100m
g/l含有の試料で含浸した。５分後、液体をフリースか
ら遠心分離によつて分離し、かつこのフリースにクロロ
フエノールレツド−β−ガラクトシド（CPRG）5mmol/l
を添加した。吸光度増加分Ｅ（mE/分）をｇ）の場合と
同様に光度的に測定した。

フリースＢ及びＣに対する較正曲線は、第３図に示され
ている。曲線Ｉは、pHSA50mg/lで含浸させたフリースＢ
についての吸光度曲線を表わし、かつ曲線IIは、pHSA10
0mg/lで含浸させたフリースＣで得られた。

3.未知のアルブミン含有量の測定 アルブミン測定のために、フリースＢもしくはＣに未知
の分析物含有量の試料25μｌを添加し、５分後、試料液
体を除去し、該フリースにCPRGを添加し、かつ同様に吸
光度増加分Ｅを測定した。得られた値から、較正曲線を
用いてアルブミン含有量を推定することができた。

例２ α_１−ミクログロブリンの測定 追出しマトリツクスの製造 ａ）熱RSA−ストレプタビジンを塗布したフリースの製
造 熱凝集させたRSA（以下熱−RSAと呼称する）を次の方法
で得た:RSA1gを、燐酸カリウム溶液50mmol 100ml中にpH
7.0で溶解させ、70℃に加熱し、かつこの温度で弱い攪
拌下で４時間維持した。この溶液を冷却し、濾過しかつ
濃度50mg/mlに調整した。引続き、30倍の容量の２回蒸
留した水に対して透析した。

ストレプタビジンと熱−RSAの接合体の製造：ストレプ
トミセス アビジニイ（avidinii）から得られたストレ
プタビジンをマレイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシ
スクシニミドを反応させ、かつこの方法でマレイミド基
を有するストレプタビジンを得た。熱−RSAをＳ−アセ
チルメルカプト琥珀酸アンヒドリドと反応させ、かつ引
続き、保護されたSH基をヒドロキシルアミンの添加によ
つて遊離した。さらに、マレイミド基を有するストレプ
タビジンを、SH基を有する熱−RSAと、所望の接合体の
形成下に混合させた。

ポリエステル50％／リンタース50％の大きさ６×8mmか
つ厚さ0.5mmのフリース片を、燐酸ナトリウム緩衝液（p
H7.5）10mM中の熱−RSA−ストレプタビジン200mg/lの溶
液15μｌで含浸させ、かつ50℃で30分間、乾燥させた。

ｂ）モノクローナル抗体のビオチニル化についての方法
（Peters,Baumgarten,Schulze:Monoklonale Antikoerpe
r,Herstellung und Charakterisierung;Springer出版社
1985による）と同様のビオチニル化α_１−ミクログロブ
リン製造。

ｃ）α_１Ｍの方法を向いたモノクローナルAKとβ−ガラ
クトシダーゼからの接合体。

接合体を、Enzyme Immunoassay（Ishikawa,Kuwai,Migui
編;Igaku Shoin Tokyo/New York（1981）81〜89頁）中
のT.キチガワ（Kitigawa）の方法により得て、かつスペ
ロース（Superose^TM）６−クロマトグラフイーでプール
Ｉ及びIIに分別した。

プールI β−ガラクトシダーゼ１個当りIgG約３〜７個 プールII β−ガラクトシダーゼ１個当りIgG約１〜３個 ｄ）追出しマトリツクス 燐酸塩緩衝液（pH7.5）10mmol/l中のビオチニール化α
_１−ミクログロブリン50mg/lの溶液15μｌをａ）のフリ
ース上に滴下した。引続き、このフリースを乾燥させ
た。その後、フリース上にRSA0.5％を含有するHEPES−
緩衝液（pH7.5）0.1mol/l中の接合体Ｉ（フリースＤ）4
U/mlないしは接合体II（フリースＥ）の溶液15μｌを滴
下した。

例１の場合と同様に、試料 Ａ α_１Ｍ 0mg/l Ｂ α_１Ｍ 100mg/l を用いた測定の場合の盲検値Ａないしは信号値Ｂを測定
した（第２表を参照のこと）。

この表においても、盲検値は、標識化された抗体の減少
する結合箇所数にともない過剰な割合で上昇することが
判明する。

較正曲線の記録及び試料のα_１ミクログロブリンの未知
含有量の測定は、例１と同様にして行なつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はクロマトグラフイー用ストリツプの縦断面図、
第２図はフラツプ付試験ストリツプの縦断面図、かつ第
３図はアルブミン測定のための較正曲線を示す線図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭57−8051（ＪＰ，Ａ) 特表 昭59−500986（ＪＰ，Ａ) 米国特許 4471058（ＵＳ，Ａ) 吹州特許公開 322813（ＥＰ，Ａ)

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料液体を、固定化された分析物もしくは
   固定化された分析物類似物及び標識化された抗体と接触
   させ、この場合、この抗体は測定すべき分析物並びに固
   定化された分析物もしくは固定化された分析物類似物と
   免疫学的反応を起こすことができ、かつ固定化された分
   析物ないしは固定化された分析物類似物に結合すること
   によつて固定化しており、液体試料中で分析物を測定す
   る方法において、標識化された抗体が標識化１回につき
   少なくとも４つの結合箇所を分析物ないしは分析物類似
   物に対して有することを特徴とする、分析物測定のため
   の方法。
2. 【請求項２】試料中の分析物は高濃縮された分析物であ
   る請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】固定化された分析物もしくは固定化された
   分析物類似物を含有しかつ測定すべき分析物並びに固定
   化された分析物もしくは固定化された分析物類似物と免
   疫学的反応を起こすことができる標識化された抗体を含
   有する試料中で分析物を検出するための試薬において、
   標識化された抗体が標識化１回につき少なくとも４つの
   結合箇所を分析物ないしは分析物類似物に対して有する
   ことを特徴とする試料中の分析物検出のための試薬。
4. 【請求項４】固定化された分析物又は固定化された分析
   物類似物がストレプタビジン／ビオチン相互作用によつ
   てフリースに結合している請求項３記載の試薬。
5. 【請求項５】固定化された分析物もしくは固定化された
   分析物類似物を含有しかつ分析物並びに分析物類似物と
   免疫学的反応を起こすことができる、前記分析物に結合
   した標識化された抗体を含有する吸収力のあるフリース
   と、標識化された抗体の量を測定することができるフリ
   ースとを有する液体試料中で分析物の存在又は分析物の
   量を検出するための試験ストリツプにおいて、標識化さ
   れた抗体が標識化１回につき少なくとも４つの結合箇所
   を分析物ないしは分析物類似物に対して有することを特
   徴とする、分析物検出のための試験ストリツプ。