JPH07504982A - 乳中尿素の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 乳中尿素の測定方法 本発明は、乳（ｍｉ　ｌｋ）サンプル中の尿素（ｕｒｅａ）６度の測定方法に関 する。

尿素は、正常には０．０１−０．０６％のレンジ内の非常に低い濃度において乳 中に存在する。タンパク質の濃度と組み合わされた、乳、特に原乳（ｒａｗ　ｍ １ｌｋ）中の尿素の濃度は、家畜の飼養の調節において重要な要因である。それ 故、通例の原理に基き乳中の尿素の濃度を測定することができることは非常に重 要なことである。しかしながら、今までの上記目的のために使用できる方法であ ってウレアーゼ（ｕｒｅａｓｅ）による酵素的分解において形成されるアンモニ アの測定に基くものは、時間が掛かるものであり、そして比較的高価な試薬を必 要とし、この理由のために、この測定は、正常には比較的長い間隔、例えば、Ｉ −３力月間において行われる。しがしながら、それは、効率的な農場管理を行う という観点からは満足できるものではない。

赤外光測定は、乳成分の迅速な且つ安価な測定の手段を提供する。

しかしながら、乳の主要成分の変化の比較しての比較的少量の尿素のために、及 びこれらの成分のスペクトル上の特徴が尿素のスペクトル上の特徴と一致すると いう事実のために、尿素のみに特徴的な特異的な吸収ウェーブバンドは存在せず 、赤外光測定による乳成分の公知の測定法は、尿素濃度についての有用な情報を 提供することができない。

乳成分の赤外測定のための公知の方法は、以下のように行われる。

測定されるべき成分、例えば、脂肪の特徴的な吸収を示すウェーブバンド内の光 の減衰を測定することとは別に、その近接における及び実質的に背景（他の成分 からの影響）を提示するウェーブハント内の吸収を、測定し、最初の測定の結果 から差し引き、それにより、妨害成分により生じるスペクトルの現象についての 補正を得る。

しかしながら、乳の主要成分に比較しての尿素のはるかに低い濃度のために（し たがって、例えば、脂肪であって尿素と同じウェーブバンド内で吸収するものは 、正常には、尿素の量よりも約１００−５００倍大きな量で存在し、そしてそれ 自体の量的に変化することかでき、例えば、その量は存在子る尿素の絶対量の５ ０−２００倍であり、そして類似の効果がより小さな程度で乳の他の主要成分に 適用される。）、そしてまた、それらの成分からのスペクトル上の高程度の妨害 のために、公知の方法を使用することができない。

上記に加えて、乳は溶解性物質、脂肪球、及びタンパク質ミセルから成る均一系 であり、それらの全てか赤外光の減衰に寄与し、それ故、吸収に帰することかで きるこの寄与の測定をよりさらに複雑なものとする。

本発明に従って、赤外測定を使用して乳サンプル中で定量的に、そして高程度の 精度で尿素を測定することかできることか今般発見された。

したかって、本発明は、赤外減衰測定技術により、少なくとも１％の脂肪、少な くとも１％の溶解ラクトース、及び少なくとも１％のタンパク質を含む乳サンプ ル中て叶０．１％の濃度レンジ内で尿素濃度を測定するための方法であって、そ のサンプル上で、１０００から４０００ｃＦ　’までの赤外照射の領域内の減衰 を測定し、少なくとも１の測定を１０００から１８００ｃｍ”’までの領域内の ウェーブハント内で行い、少なくとも１の他の測定を脂肪が吸収するウェーブバ ンド内で行い、少なくとも１のさらなる測定をラクトースが吸収するウェーブバ ンド内で行い、そして少なくとも１のさらなる測定をタンパク質が吸収するウェ ーブバンド内で行い：そして０．００７％より良好な予測の標準誤差（Ｓｔａｎ ｄａｒｄ　Ｅｒｒｏｒ　ｏｆ　Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（以下ＳＥＰという））と して表された正確さをもって、尿素が吸収するウェーブバンド内の吸収に基づき 尿素の濃度を、計算（予報）し、脂肪、ラクトース、及びタンパク質からの寄与 を、これらの成分が吸収するウェーブバンド内で行われた測定からの結果を組み 合わせることによる多変量換算に基づき補正する、ことを含んで成る方法に関す る。

本発明の方法を使用して、妨害成分の変化よりも数オーダー良好な大きさである 正確さの程度をもって尿素含量を測定することができる、減衰系としての先に述 へた乳の高く複雑な特性のために、０゜００７％の、及び典型的には０．００５ ％よりも又はさらに０．００４％よりも良好な（以下に定義するような）予報（ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）の標準誤差よりもよい正確さに達することがいずれかの 技術により可能になるであろうということは予期されることができなかった。

本発明に従って達成される全＜驚＜へき正確さの印象を与えるために、乳中の脂 肪、タンパク質及びラクトースの測定において得られる正確さが０．０１−０． ０２％絶対のオーダーの内にあることを述べることができる。これは、約０．０ ２５％である尿素の正常レベルに匹敵することができる。言い換えれば、尿素の 全含量は、他の成分の測定において得られる正確さとほとんど同じである。これ にもかかわらず、本発明に係る方法は、０．００３−０．００４％絶対のオーダ ーの内にある標準誤差をもってかなり微量な成分である尿素を測定することがで きる。

したがって、本発明は、農場管理を改善するために牛腸群（ｈｅｒｄ）動物に対 する周期的な分析を行うことが現実のものとなるように、乳中の尿素を測定する 簡易且つ経済的な方法を提供する。

使用した多変量換算パラメーターは、好ましくは、既知濃度の尿素を含む乳サン プル、又は既知濃度の尿素が添加された乳サンプルを使用して得られたパラメー ターである。

多変量換算は、好ましくは、サンプル中の成分とそのサンプルの他の物理的条件 （例えば、均質化及び温度）との間の相関が可能な限り低（なるようなやり方で その換算サンプルを選ぶことにより行われ：それ故、例えば、その時に高含量の 尿素をもつサンプルか優勢には高程度の均質化、等を有するということが回避さ れるべきである。換算サンプルの好適な選択は、例えば、大量の換算サンプルを もつことにより、そしてその設定が低い相関を示すように使用されるへきもの、 又は先に示したものを選ぶことにより、成分の添加、もしくはサンプルの他の修 飾により、得られる。

用語′乳すンプル“とは、乳のサンプル及び関連製品、例えば、原乳（ｒａｗ　 ｒｎｉｉｋ）、全乳（ｗｈｏｌｅ　ｍ１ｌｋ）、スキム・ミルク（ｓｋｉｍ　ｍ １ｌｋ）、クリーム（ｃｒｅａｍ）　、再溶解及び／又は再懸濁扮ミルクをいう 。このサンプルは、均質化されることができるし、又はされないこともてきる。

本発明の好ましい態様に従えば、サンプルは、原乳のサンプルである。

正常の原乳サンプルは正常には約３．７％の脂肪、３．４％のタンパク質、４． ８％のラクトース、及び０．０２５％の尿素を含むけれども、本発明は、そのサ ンプルが１以上のその成分の非常に低い含量をもつかなり普通でない組成をもつ 場合にも最も有用であるように考慮されている。

本文脈中、用語”赤外減衰技術（ｉｎｆｒａｒｅｄ　ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ　 ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）”とは、赤外レンジ内の光がサンプルを透過し、そしてそ のサンプルにより引き起こされた赤外光の減衰（光散乱又はエネルギー吸収によ ることかできるもの）が測定されるような測定技術をいうと意図される。

この赤外測定技術は、その赤外光を透過する材料から作られているサンプルを保 持する容器を通しての赤外光の透過を含んで成る透過技術であることができる。

その透過光を好適な数の好適に選択されたウェーブバンドに分け、そしてそのウ ェーブバンドのそれぞれの内で吸収された光の量を測定するとき、そのサンプル 中の１以上の成分の濃度を測定することができる。

サンプル中に赤外光を導入する他の方法は、ＡＴＲ−セルを使用することであり 、ここでは、光の吸収がその光をサンプルと乳よりも高い屈折率をもつ材料、例 えば、Ｚｎ５ｅ又はＧｅとの境界上に発射する（ｌａｕｎｃｈｉｎｇ）ことによ り容易にされる。光の性質により、電磁場がその境界を横切って数μｍ広がり、 それにより、それがそのサンプルの影響を経験するであろう。

記事、λ！ｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ　Ｃａ１ｉｂｒａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ａｓ５ ａｙｓ　ｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｕｓｉｎｇ　ＡＴＲ− ［Ｒ５ｐｅｃｔｒａ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　ｂｌｏｏｄ　ｐｌａｓｍａ”、　Ａｎ ａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈａｍｉｓｔｒｙ、１９８９．　６１．　ｐｐ　２０１６ −２０２３　ｂｙ　Ｇｕｅｎｔｅｒ　Ｊａｎａｔｓｃｈ　ｅｔａｌ、、中では、 ＦＴＩＲ−ＡＴＲは、ヒト血液血漿中の尿素、尿酸、コレステロール、トリグリ セリド、及びグルコースの濃度を測定するために使用される。

血液血漿は、ａ、０．脂肪（トリグリセリド、コレステロール）、タンパク質及 び炭水化物（グルコース）を含む液体である。血液血漿中の成分の濃度のための 典型的な値、及びそれからこれらの濃度が測定されることができるところのウェ ーブバンドを、表１中に原乳中の成分の典型的な濃度と対比する。

化合物　レンジ（ｃｍ　−’）　濃度（％）血液血漿　乳 タンパク質　１７００−１３５０　６．７　３．４グルコース／ ラクトース　１１８０−９５０　０．１　４．８脂肪　＋５００−１４００　０ ．３　３．７＋２７５−１０００ 尿素　１７００−１４００　０．０３　０．０２５＋２００−１０００ 尿素おける変動　０．００５−０．１３　０．０１−０．０６表１から、上記２ つの系ががなり異なる組成をもっことが明白である。原乳は、普通には血液血漿 よりも１オ一ダー以上の大きさを含む。血液中の脂肪は、はとんどが溶解したコ レステロールであるが、乳中では、それは、はとんとか、懸濁した乳脂防球の形 態にある。

乳中ては、タンパク質の８０％が直径０．０１−０．３μｍをもっミセル内に存 在するカゼインであり、はんの２０％が溶解している。血液中では、すべてのタ ンパク質が溶解している。

血液中よりも１オ一ダー以上の大きさでより多く乳中に炭水化物が存在し、血液 中の炭水化物は、はとんどがグルコースであるが、乳中ては、それはラクトース である。

本発明の方法においては、測定を、＋０００がら４０００ｃＦ　’までの赤外照 射の領域内の１以上のウェーブバンド内で行い、これらのウェーブバンドの中で 、その少なくともｌが１０００から１８００ｃｍ−’までの領域内にあり、そし てその内で尿素が吸収する。好ましい態様においては、尿素が吸収するウェーブ バンドは、１１００−１８００ｃｍ−’、＋４００−１５００ｃｍ−’、１５０ ０−１８００ｃｍ−’、及び１１００−１２００ｃｍ　−’から成る群から選ば れる。これらのウェーブバンドは、好ましくは、サンプル中の成分か異なるウェ ーブバンド内で異なる且つ変化する影響比（吸収比）をもつように選ばれる。ウ ェーブバンドの好適な選択により、尿素濃度の測定が最小数のウェーブバンドを 使用することにより行われることができる。

吸収か測定されるへきウェーブバンドを定めるために、多数のウェーブバンド選 択要素を使用することができる：光学フィルター、回折格子（ｇｒａｔｉｎｇｓ ）、プリズム（ｐｒｉｓｍｓ）、音響光学調節装置（ａｃｏｕｓｔｏ　ｏｐｔｉ ｃ　ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）。

本明細書及びクレーム中では、用語“ウェーブバンド（ｗａｖｅｂａｎｄ）”と は、その輻及び中心値が、使用され実際のウェーブバンド選択要素の適当な選択 により輻レンジ内で選ばれることができるような　。

波長領域をいう。したがって、例えば、光学フィルターは、正常には約１０−１ ０−４Ｏ’のオーダーの輻をもつことができるウェーブバンドを定めるが、本発 明に従って測定が行われるところのウェーブバンドは、主に、より広くてもよく 又はより狭くてもよい。

個々のウェーブバンドを定めるために光学フィルターを使用するとき、多数のフ ィルターを光源と検出装置との間の光ビームの経路内に連続的に置くことができ る。他の態様は、それぞれが１以上の静止した又は可動性の光学フィルターを通 過する多数のビーム内にそのビームを分けることを含んで成る。

回折格子を使用して、多数のウェーブバンドを、可動性回折格子と１以上の静止 した又は可動性検出装置とを組み合わせることにより、又は静止した回折格子と １以上の可動性及び／又は静止した検出装置とを組み合わせることにより、選択 することができる。

ＦＴＩＲ技術を使用するとき、サンプルの透過のスペクトルは、干渉計（ｉｎｔ ｅｒｆｅｒｏｒｎｅｔｅｒ）により作られたインターフェログラム（ｉｎｔｅｒ ｆｅｒｏｇｒａｍ）のフーリエ変換（Ｆｏｕｒｉｅｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔ ｉｏｎ）から作られる。

透過スペクトルから、ウェーブバンド内の吸収を計算することができる。

特定の赤外透過減衰技術が使用されるにもかかわらず、サンプル容器は、好まし くは、ＣａＦ　２から作られ、そして２００μｍよりも長くない、好ましくは５ ０μｍよりも長くない光路をもつキュヘノ１−（ｃｕｖｅｔｔｅ）である。脂肪 球のサイズを減少させるために、サンプルを、そのサンプル中の脂肪球の平均直 径が大きくても３μｍ、好ましくは大きくても２μｍであるように均質化するこ とができる。

多変量換算は、多数の方法、例えば、部分最小二乗法（Ｐａｒｔｉａｌ　Ｌｅａ ｓｔ　５ｑｕａｒｅｓ　ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）　、主要成分回帰（Ｐｒｉｎｃｉ ｐａｌ　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）、多線型回帰（Ｍｕｌｔ ｉｐｌｅ　Ｌｉｎｅａｒ　Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）又は人工神経ネットワーク学 習（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｎｅｕｒａｌ　Ｎｅｔｗｏｒｋ　ｌｅａｒｎｉｎｇ ）を使用して行われることができる。

好ましい態様においては、部分最小二乗法及び主要成分回帰の方法か使用され、 そのウェーブバンド情報をより本質的な情報に減少させ、それにより、それらは 、その予報を過剰適合（ｏｖｅｒｆ目ｔｉｎｇ）することを避ける。過剰適合は 、他の方法の欠点であることができる。

予報の標準誤差（Ｔｈｅ　５ｔａｎｄａｒｄ　Ｅｒｒｏｒ　ｏｆ　Ｐｒｅｄｉｃ ｔｉｏｎ（ＳＥＰ））は、尿素のアンモニア及び炭酸塩への酵素的分解、その後 の尿素の間接的測定としてのアンモニアの分光光度的測定、及び本発明に従った 予報値を含んで成る化学関連方法の結果の間の差異の標準偏差として定義される 。

好ましい態様においては、本発明に係る方法は、それがまた乳サンプル中の脂肪 、タンパク質、及びラクト−スの濃度を予報するように改良される。この目的の ために、多変量換算が、既知濃度の脂肪、タンパク質、ラクトース、及び尿素を 含む乳サンプルに基づき、及び／又は既知濃度の尿素、脂肪、ラクトース、及び ／又はタンパク質が添加された乳サンプルに基つき、行われる。さらに、この多 変量換算を行うために使用される乳サンプルの物理的条件（温度、均質化の程度 ）か変更されることができる。

本方法は、尿素測定に対する影響のための補正か、さらに、ｌ又は数回の以下の 成分：クエン酸、遊離脂肪酸、抗生物質、リン酸塩、体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ　 ｃｅｌｌ）、バクテリア、保存剤及びカゼインについて、それぞれの成分につい て、その成分が吸収するところのウェーブバンド内の赤外減衰の測定、その成分 が吸収するところのウェーブバンド内で行われた測定からの結果を補正が行われ るへき全での成分について組み合わせることによる多変量換算に基づいて行われ る補正を行うことにより、実施される。

換算のために使用される乳サンプルの数は、好ましくは、実際に実行可能なほと 多い。正常には、その数は、少なくとも４であるが、より多くの数を使用するこ とが好ましく、そして問題のより多い数のいずれかは主に、例えば、５．６、又 は７がら１０．２ｏ、３ｏ、等を超えて、主に４０．５０又はそれ以上までであ るが、実際の考慮も適用され、そしてそれ故、妥当な好ましさは、少なくとも８ 、より好ましくは少なくとも１２サンプル、さらにより好ましくは少なくとも１ ５サンプル、そしてさらにより好ましくは少なくとも１６．１７、又は１８ある いはおそらくさらに２５サンプルまでとして表され、そこでは、換算が、尿素、 脂肪、ラクトース、タンパク質、及びクエン酸、こに討議したような様々な成分 の含有量の有用な変動を示し、そのサンプルの非相関変動の重要度がサンプル数 の減少を伴って増加するように妥当に選択される。

サンプル材料を、３７の原乳サンプルから成る出発サンプル採取物から調製した 。

３７サンプルのそれぞれの一部を、脂肪、タンパク質、ラクトース、及び尿素の 測定のための関連方法により分析し、そしてその関連方法は、アンモニア及び炭 酸への尿素の酵素的分解、その後の尿素の間接的測定としてのアンモニアを分光 光度計による測定を含んで成る方法をそれぞれ使用したＲｏｅｓｅ−Ｇｏｔｔｌ ｉｅｂ、　Ｋｊｅｌｄａｈｌ、　Ｌｕｆｆ−５ｃｈｏ。

ｒｌ及びＦｌｏｗ　Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓである。サンプルの 組成を、以下の表中に示す。

脂肪　タンパク質　ラクトース　尿素　尿素強化２９　５．６６５　：１．０４ ５　４＋５２０　０−０２９４元のサンプルの１２の部分か尿素により強化され （すなわち、それに尿素か添加され）、そしてそれら及び３７の元サンプルの吸 収スペクトルを、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　ＩＲ−Ｄａｔａ−Ｍａｎａｇｅｒ ソフトウェア−を走らせた１Ｂｈｌ−ＰＣ互換性コンピューターにより割面され たＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　１７１０　Ｆｏｕｒｉｅｒ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ 　Ｉｎｆｒａ−Ｒｅｄ　（ＦＴ［Ｒ）分光光度計を使用して得た。

この装置の測定コンパートメントはフッ化カルシウム（ＣａＦｚ　）　窓及び３ ７μｍのサンプル経路をもつ２つの同一の交換可能なキュベツト（サンプル・シ ャトル）を含んでいた。それぞれのキュベツトを４０℃に保温した。

本発明に従った換算 ４９サンプルを均質化し、上記サンプル・キュベツト内にインジェクトし、そし てレンジ４０００−９００ｃｍ−’内の［Ｒスペクトルを記録した。

蒸留水を対照として使用し、そして２ｃｍ”となるべく分解能（ｒｅｓｏｌｕｔ ｉｏｎ）を選択し、全部で３１０１のデータ点を与えた。このスペクトルをディ ジタル形態で採取し、そして以降の数値分析のためにディスク上に保存した。

統計的分析に先立って、５０のスペクトル（４９サンプル及び蒸留水）を、第一 に、水の吸収領域（３７００−３０００ｃｍ−’及び１６８９−１６１０ｃｍ　 −’）内のデータ点を除去し、そして第二に、はとんどスペクトル情報を含まな いそれらのスペクトル領域（４０００−３７００ｃｍ−’及び２７５９−１８０ ９ｃｍ−１）内のデータ点の数を減少させることにより、１１６５デ一タ点に減 少させた。この４９サンプルを、部分最小二乗分析（例えば、”λＩｕｌｔｉｖ ａｒｉａｔｅ　Ｃａ１ｉｂｒａｔｉｏｎ＋　ｂｙ　Ｈａｒａｌｄ　Ｍａｒｔｔｅ ｎｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｍｏｄ　Ｎａｅｓ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ 、　Ｌｏｎｄｏｎ、　１９８９．　ｐｐ　１１６−１２５中に記載されているよ うなもの）に供し、それにより、その系を換算し、その換算系に特徴的な１セツ トの回帰方程式をもたらした。

結果 尿素についての回帰方程式は、部分最小二乗回帰法により見いたされるような回 帰係数ＣＢ−ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）　、及び＋１６５スペクトル点のそれぞ れにおける対応する吸収値を含んで成るｌセントの項（ｔｅｒｍ）から成る。図 １中に、平均中心データに対する７つの換算因子を使用して見いだされた回帰係 数を、１６００から１００１００Ｏ’までのスペクトル領域内の（約５％溶液の ）水中の純尿素の吸収スペクトルと一緒に示す。

尿素の最も強い吸収は、１７００と１６５０ｃｍ”との間にあるが、このスペク トル領域は、その同一領域内での水の強い吸収のために使用される実験条件下で 使用されることができない。図１は、ＰＬＳ換算により見いだされた回帰係数が 水中に溶解した尿素のスペクトル特性にかなり似ている特性を示している。この 回帰スペクトルにおける他の特徴は、乳の主要成分、脂肪、タンパク質及びラク トースに起因することができる。

図２は、サンプル１５（０，０１６８％尿素）の吸収スペクトル及び純尿素によ り強化された（０．０５５２％尿素）後に記録された同一サンプルのスペクトル を示す。図３中に示すｌ５００と１５４０ｃｍ〜１との間の尿素吸収における２ つのスペクトルの間の差異は、約０．０５吸収単位の量であり、同一領域内の＋ １！Ｇ定ノイズの約２倍である。

結論 以上の結果は、尿素の変動の１００−５００倍の濃度変動を示す尿素と抵触する スペクトル特徴をもつ化合物、脂肪（３，３−７，３％）、タンパク質（２，９ −４，５％）及びラクト−ス（４，０−４，８％）の存在牛乳中で０．０１％未 満の濃度において尿素についての換算を行うことができることを証明している。

本実験において使用したサンプル材料は、別々のウシからの３８０の天然の乳サ ンプルであった。

それぞれのサンプルの一部を、アンモニア及び炭酸への尿素の酵素的分解、その 後の尿素の間接的測定としてのアンモニアの分光光度計による測定を含んで成る 方法を使用したセグメント化フロー・アナライザー内で尿素のついて分析した。

また、それぞれのサンプルのＩＲ膜吸収、Ｍｉ　ＩｋｏＳｃａｎのヒルトーイン ・ホモゲナイザーにより均質化した後に９つの異なるウェーブバンド内てＦｏｓ ｓεＪｅｃｔｒｉｃ、　Ｈ目１ｅｒｏｄ、　Ｄｅｎｍａｒｋにより製造されたＡ １１ｌｋｏＳｃａｎ　６０５１Ｒ装置を使用して測定した。この装置は、以下の 波数２８１７．２８５３．１７３９．１４９３．１５３８．１２９９．１０５３ ．１３８８及び１４６４ｃｍ−’におけるＩＲ膜吸収測定を可能にする９つのフ ィルターを備えており、すべてのフィルターが約２０ｃｍ−’のスペクトルのバ ンド幅（５０％強度ＦＷＨＶにおける全体幅）をもつ。

この３８０の天然乳サンプルを、部分最小二乗分析（例えば、”＆Ｉｕｌｔｉｖ ａｒｉａｔｅ　Ｃａ１ｉｂｒａｔｉｏｎ”　ｂｙ　Ｈａｒａｌｄ　Ｍａｒｔｔｅ ｎｓ　ａｎｄ　Ｔｈｒｍｏｄ　Ｎａｅｓ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ 、　Ｌｏｎｄｏｎ、　＋９８９．　ｐｐ　１＋６−１２５中に記載されているよ うなもの）に供し、それにより、その系を換算し、換算のために使用できるサン プルのすべてを使用してその換算系に特徴的な１セツトの回帰方程式をもたらし た。

上記サンプル・セットの吸収値を、満足できる換算を許容するようなやり方でそ の３８０サンプルのスペクトル変動を提示するサンプルのサブセットを同定する ために、因子分析に供した。因子分析の結果として、１６サンプルを換算セット として選んだ。

この換算セットを、部分最小二乗分析に供し、それにより、その系を換算し、そ の換算系に特徴的な１セツトの回帰方程式をもたらした。

結果 上記の換算セットに適用された部分最小二乗回帰法により見いだされるような回 帰係数（Ｂ−ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）　、及び上記９つのフィルターのそれぞ れにおける対応する吸収値を含んで成る１セツトの項から成る尿素についての回 帰方程式を、両方の換算について天然乳サンプルのそれぞれにおける尿素濃度を 予報するために使用した。第−Ｅ　３８０サンプルのすへてを使用して、そして 第二にその換算のための因子分析を使用して選択した１６サンプルを使用して得 られた尿素の予報を、それぞれ図４及び５中に示す。これらは、測定された尿素 濃度対予報尿素濃度のプロットを示している。

３８０サンプルのすへて、又は因子分析を使用して選択された１６サンプルを使 用して得られた予報の標準誤差（Ｔｈｅ　５ｔａｎｄａｒｄ　Ｅｒｒｏｒ　ｏｆ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ（ＳＥＰ））は、それぞれ、０．００３７及び０．００４ ０％尿素であることが見つかった。同一サンプルが１回以上測定されるときに予 報尿素濃度における差異として定められる再現可能な誤差は、両方の換算モデル において０．００１７％尿素であることが見つかった。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　１年２　月Ｊ−ｔ　日

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．赤外吸収測定技術により、少なくとも１％の脂肪、少なくとも１％の溶解ラ クトース、及び少なくとも１％のタンパク質を含む乳サンプル中の０−０．１％ の濃度レンジ内の尿素の濃度を、予報の標準誤差として表される０．００７％よ りもよい正確さをもって、測定する方法であって、以下の： （ａ）乳サンプルの１０００ｃｍ−１（１０．０μｍ）から４０００ｃｍ−１（
2. ２．５０μｍ）までの赤外照射ウェーブバンド内で吸収を測定し、少なくとも１ の測定を尿素が吸収する１０００ｃｍ−１（１０．０μｍ）から１８００ｃｍ− １（５．５６μｍ）までのウェーブバンド内で行い、少なくとも１の測定を脂肪 が吸収するウェーブバンド内で行い、少なくとも１の測定をラクトースを吸収す るウェーブバンド内で行い、そして少なくとも１の測定をタンパク質が吸収する ウェーブバンド内で行い；（ｂ）尿素が吸収するウェーブバンド内での脂肪、ラ クトース、及びタンパク質からの寄与を、上記の吸収測定及び多変量換算により 確立された前もって決定されたパラメーターに基づき、測定し、そして （ｃ）尿素が吸収するウェーブバンド内の吸収に基づき並びにそのウェーブバン ド内での脂肪、ラクトース、及びタンパク質からの測定された寄与に基づき、上 記サンプル中の尿素の濃度を定量的に評価すること、 を含んで成る方法。 ２．多変量換算により確立された前測定パラメーターを、既知濃度の尿素を含む 乳サンプル又は既知濃度の尿素が添加された乳サンプルを使用して得る、請求項 １に記載の方法。
3. ３．１以上の測定を、尿素、脂肪、ラクトース、及びタンパク質が吸収するウェ ーブバンド内で行う、請求１又は２に記載の方法。
4. ４．尿素に加えて、脂肪、ラクトース、及びタンパク質の成分の濃度をも計算（ 予報）し、それぞれの測定が、問題の成分が吸収するところのウェーブバンド内 での少なくとも１の測定に基づいているような先の請求項のいずれかに記載の方 法。
5. ５．多変量換算を、既知濃度の尿素、脂肪、ラクトース、及びタンパク質を含む 乳サンプル、及び／又は既知濃度の尿素、脂肪、ラクトース、及び／又はタンパ ク質が添加された乳サンプル、及び／又は修飾された物理的条件（温度、均質化 の程度）を、使用して行う、先の請求項のいずれかに記載の方法。
6. ６．多変量換算を少なくとも４の乳サンプルを使用して行う、先の請求項のいず れかに記載の方法。
7. ７．多変量換算を少なくとも８の乳サンプルを使用して行う、請求項６に記載の 方法。
8. ８．多変量換算を少なくとも１２の乳サンプルを使用して行う、請求項７に記載 の方法。
9. ９．多変量換算を少なくとも１８の乳サンプルを使用して行う、請求項８に記載 の方法。
10. １０．多変量換算を少なくとも２５の乳サンプルを使用して行う、請求項９に記 載の方法。
11. １１．予報の標準誤差（ＳＥＰ）が０．００５％よりもよい、先の請求項のいず れかに記載の方法。
12. １２．予報の標準誤差（ＳＥＰ）が０．００４％よりもよい、請求項１１に記載 の方法。
13. １３．尿素の測定を行う領域が１１００ｃｍ−１（９．０９μｍ）〜１８００ｃ ｍ−１（５．５６μｍ）の領域である、先の請求項のいずれかに記載の方法。
14. １４．尿素の測定を行う領域が１４００ｃｍ−１（７．１４μｍ）〜１５００ｃ ｍ−１（６．６７μｍ）の領域である、先の請求項のいずれかに記載の方法。
15. １５．尿素の測定を行う領域が１５００ｃｍ−１（６．６７μｍ）〜１８００ｃ ｍ−１（５．５６μｍ）の領域である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法 。
16. １６．尿素の測定を行う領域が１１００ｃｍ−１（９．０９μｍ）〜１２００ｃ ｍ−１（８．３３μｍ）の領域である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法 。
17. １７．吸収測定を光学フィルターにより定められたウェーブバンド内で行う、先 の請求項のいずれかに記載の方法。
18. １８．吸収測定を、静止した回折格子及び可動性及び／若しくは多数の検出装置 により又は可動性の回折格子及び１以上の静止した若しくは可動性の検出装置に より定められたウェーブバンド内で行う、請求項１〜１６のいずれかに記載の方 法。
19. １９．吸収測定を、干渉計を使用して広いスペクトル・レンジにわたり行い、そ してその干渉計から得たデータをフーリエ変換を使用して処理する、請求項１〜 １６のいずれかに記載の方法。
20. ２０．吸収測定を、ＡＴＲ技術を使用して行う、先の請求項のいずれかに記載の 方法。
21. ２１．吸収測定を、透過技術を使用して行う、請求項１〜１９のいずれかにに記 載の方法。
22. ２２．赤外光が乳サンプルを含むキュベットを通して透過され、そのキュベット の経路長が長くとも２００μｍである、請求項２１に記載の方法。
23. ２３．赤外光が乳サンプルを含むキュベットを通して透過され、そのキュベット の経路長が長くとも５０μｍである、請求項２２に記載の方法。
24. ２４．多変量換算が、部分最小二乗法、主要成分回帰、多線型回帰、及び人工神 経ネットワーク学習から成る群から選ばれる、先の請求項のいずれかに記載の方 法。
25. ２５．乳サンプル中の脂肪球のいずれも、大きくとも３μｍの平均直径をもつ、 先の請求項のいずれかに記載の方法。
26. ２６．尿素測定に対する影響についての補正を、さらに、１以上の以下の成分： クエン酸、遊艇脂肪酸、抗生物質、リン酸塩、体細胞、バクテリア、保存剤及び カゼインについて、それぞれの成分についてその成分が吸収するところのウェー ブバンド内の赤外吸収を行うことにより行い、その補正を、それについて補正を 行うべきすべての成分についてその成分が吸収するところのウェーブバンド内で 行った測定からの結果を組み合わせることによる多変量換算に基づいて行う、先 の請求項のいずれかに記載の方法。