JPH07504222A - 化学的に規定されるオリゴ糖，該オリゴ糖の誘導体，擬態物及び該オリゴ糖に対する抗体による細胞接着の抑制 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 化学的に規定されるオリゴ糖、該オリゴ糖の誘導体、擬態物及び該オリゴ糖に対 する抗体による細胞接着の抑制関連出願のクロスレファｌノンス 本出願は、１９９０年８月３０日出願の米国特許出願第０７１５７５５３９号（ 放棄）の一部継続出願である。１９９１年７月２日出願の継続中である米国特許 出願第０７／７２４．９８３号の一部継続出願である。１９９１年１１月１２日 出願の継続中である米国特許出願第０７／７８９，９６９号の一部継続出願であ る；１９９２年２月１９日出願の継続中である米国特許出願第０７／８３６゜９ ７８号の一部継続出願である。１９９２年９月２５日出願の継続中の米国特許出 願第０７／９５０，７２０号の一部継続出願である。

上記５つの出願全ては、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。

技術分野 本発明は、一般的に特異的な種類の細胞に対する腫瘍細胞又は炎症白血球の接着 の抑制に基づく、腫瘍細胞の転移及び侵入並びに炎症プロセスの抑制に関する。

より詳細には、本発明は、腫瘍関連炭水化物抗原、白血球関連炭水化物抗原、そ れらのオリゴ糖誘導体、腫瘍関連炭水化物抗原及び白血球関連炭水化物抗原の擬 態物並びに腫瘍関連炭水化物抗原に対する抗体を使用することによる上記抑制に 関する。

発明の背景 資金及び人的資源の膨大な投資にもかかわらず、癌は、いまだ主要な死因の一つ である。現在の癌の治療法では、悪性腫瘍にかかった全ての患者の約半分しか治 癒しない。はとんどのヒト悪性腫瘍において、転移が死の主要原因である。

転移とは、一箇所以上の遠隔部位での二次腫瘍コロニーの形成である。転移は、 腫瘍侵入が第一工程である多工程プロセスである。

腫瘍細胞は、上皮基底膜等の宿主組織バリヤに局部的に侵入し、間質ストロマに 到達して、そこで腫瘍細胞は血管（又はリンパ管）にアクセスしてさらに内転移 する。管壁の内皮層に侵入後、循環腫瘍細胞は循環流動に追い出され、内皮細胞 内腔表面又は露出基底膜に付着することにより、標的臓器の毛細血管前の小静脈 に留まる。腫瘍細胞は、再び血管壁に侵入し、臓器の実質組織に入る。最後に、 浸潤した腫瘍細胞は、腫瘍が生したのと（」異なる組織で成長する。

はとんとのヒト悪性腫瘍では、遠隔転移は小さすぎて一次腫瘍の治療のときに検 出することができない。さらに、転移性コロニーの広範囲に及ぶ初発が、通常転 移性疾病の臨床的症状が明らかとなる前に生じる。転移のサイズ、患者の年令、 解剖学的位置及び不均一組成の全てにより、腫瘍の外科的除去が妨げられ、転移 性コロニーに届くことのできる抗癌剤の濃度が限られる。

転移の治療・予防の現在の手法が困難なため、腫瘍細胞の転移性を抑制すること ができる改善された方法及び組成物が当該技術分野において必要とされている。

本発明は、これらの必要性を満たし、さらに、他の関連した利点を提供する。

一方、炎症プロセスと転移の開始の間には共通の機構がある。例えば、両方のプ ロセスは、細胞（前者の場合には白血球で後者の場合には腫瘍細胞）の微小血管 内皮細胞への接着が引き金となり、白血球又は腫瘍細胞が内皮細胞を通過して組 織空間に移動する。両方のプロセスは、活性化血小板により増強される。また、 両方のプロセスは、腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）又は白血球関連炭水化物 抗原（ＬＡＣＡ）等の特異な種類の炭水化物が強く介在する。ある種のＴＡＣＡ は、ＬＡＣＡと構造を共有している。

本発明は、例えば、ＴＡＣＡ又はＬＡＣＡを介した細胞接着を、例えば、それら の抗体を用いて抑制することに関し且つそれに基つくものである。

発明の概要 簡単に述べると、本発明によれば、炭水化物構造物又はそれらの抗体による腫瘍 細胞接着のブロックに基づき腫瘍細胞の転移及侵入を抑制する組成物及び方法が 提供される。また、本発明によれば、炭水化物構造物又はそれらの抗体による白 血球接着の遮断に基づき白血球の炎症を抑制する組成物及び方法が提供される。

この手法の原理は、（ａ）炭水化物−炭水化物相互作用：　（ｂ）炭水化物−セ レクチン相互作用；又は（Ｃ）それらの両方をブロックすることである。例えば 、 ｌ）高転移性及び低転移性を有するマウスメラノーマＢ１６変異体を用いたモデ ル実験において、高転移性変異体ＢＬ６及びＦＩＯは、低転移性又は非転移性変 異体Ｆ１又はＷａ４よりも多くのＧＭ３を発現する。内皮細胞に対する高転移性 変異体の接着性は低転移性変異体の場合よりも大きく、この接着性は、Ｍｅ−β −ラクトシト、ＧＭ３若しくはＬａｃＣｅｒ　（各々リポソーム内）又は他のラ クトシト誘導体により抑制される。糖類及び誘導体も、Ｂ１６メラノーマ転移性 を抑制する。これは、上記（ａ）、即ち、炭水化物−炭水化物相互作用の抑制の 一例である。

ｉｊ）ヒト癌に関して、−次腫瘍がＨ／Ｌｅ’／Ｌｅｂ　（モノクローナル抗体 Ｍ　Ｉ　Ａ−１５−５）　、シアロシルＴｎ（モノクローナル抗体ＴＫＨ２によ り確認される）又はシアロシル−Ｌｅｆ　（モノクローナル抗体ＦＨ６，５ＮＨ ３又はＳ　Ｎ　Ｈ４’）等の既知腫瘍関連炭水化物抗原を発現する患者は、−次 腫瘍がこれらの抗原を発現しないか発現が弱い患者よりも生存率がはるかに低か った。

１ｉｉ）これらの腫瘍関連炭水化物抗原（マウスメラノーマモデルにおけるＧＭ ３及びヒト腫瘍におけるＨ／Ｌｅ’　／Ｌｅ’　、シアロシル−Ｌｅｘ又はシア ロシル−Ｔｎ）は、標的細胞、特に血小板又は内皮細胞により認識される実質的 に接着分子である。上記は、組み合わせ手法、即ち、（ａ）と（ｂ）を抑制する 手法の一例である。

ｉｖ）腫瘍細胞と内皮細胞及び血小板との相互作用では、活性化内皮細胞及び活 性化血小板上に発現されるＬＥＣＣＡＭ　（セレクチン）　、ＥＬＡＭ−１又は ＧＭＰ−１４０が介在する。シアロシル−Ｌｅ’抗原は、これらのＬＥＣＣＡＭ により認識されることが知られている。上記は、炭水化物−セレクチン相互作用 に影響を及ぼす（ｂ）の−例である。

Ｖ）血小板又は内皮細胞上での発現がトロンビン、ＡＤＰ又は（ＡＭＰ）フォル ボールエステルにより誘発されるＧＭＰ−１４０は、血小板−腫瘍細胞相互作用 に重要な役割を果たし、腫瘍細胞転移性に介在する。セレクチンにより認識され るエピトープはシアロシル−Ｌｅ’　（Ｐｏ　ｌ　］　ｅｙ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａ 　ｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、８８：６２２４．１９９１参照）として以前に同定されたが、シアロン ルーＬｅ”　（モノシアロンルーＬｅ’　Ｔとしても知られている）、モノシア ロシル−Ｌｅ’ｌｌ（シアロシル−Ｌｅ’の位置異性体）及びジンアロンルーＬ ｅ”もＧＭＰ−１４０により認識されることが判明した。ＧＭＰ−１４０は、ノ アロシルーＬｅ’に対してよりもシアロシルＬｅ”に対してよりよく結合する。

上記は、プロセス（ｂ）の別の例である。

ｖｊ）内皮細胞上での発現がインターロイキン−１、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α又 はリポ多糖類により誘発されるＥＬＡＭ−１は、内皮細胞−白血球及び内皮細胞 −腫瘍細胞相互作用に重要な役割を果たし、腫瘍細胞転移に介在し、内皮細胞− 白血球相互作用に介在し、そして白血球と腫瘍細胞の内皮細胞経由移動に介在す る。上記選択により認識されるエピトープは、以前はノアロシルーＬｅ’及びシ アロンルーＬｅ’　（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ等、５ｃｉｅｎｃｅ２５０：１１３０． １９９０；Ｂｅｒｇ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６６：１４８６９．１９９ １．高山等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、１７９ ニア１３．１９９１参照）として同定されたが、セレクチンエピトープも、特に 動的フロー系においてモノシアロシル＝Ｌｅ’　ＩＩ及びジンアロンルーＬｅ” 等の内部シアリル化次体フコ／ル化ｌ型又は２型鎖であることが判明した。しか しながら、結合現象は、ビプラントである。静的又は低剪断応力動的条件下では 、ＥＬＡＭ−１（Ｅ−セレクチンとしても知られている）は、主にＳＬｅ’及び ＳＬｅ“等のα２→３ソアリル化及びＳＬｅ’及びＳＬｅ″等のαｌ→３又はα １→４フコシル化炭水化物を認識する。しかしながら、中〜高剪断応力動的条件 下では、Ｌｅ”／　Ｓ　Ｌ　ｅ　’等の式（１）または（ｉ　Ｉ）で表される分 子（例えば、第２０図参照）は、Ｅ−セレクチンに対して高親和性結合部位を提 供するのに重要な役割を果たす。この役割は、高剪断応力条件下では、特に顕著 である。

ｖｉｉ）ヌードマウスにおいて転移性について特異な発現を示すヒト結腸腫瘍細 胞は、ノアロンルーＬｅ’の発現と密接な相関を示した。即ち、高転移性を有す る細胞は高レベルのシアロシル−Ｌｅ”を発現し、逆の場合も同しである。

ｖ　ｉ　ｉ　１）ＳＬｅ’に対するＥ−セレクチン発現細胞の接着性は、ＳＬｅ ’を種々の量のＬｅゞを有するリポソームに混合したときに大きく増強される。

したがって、ハイブリッドＳＬｅ”／Ｌｅ“だけでなくＳＬｅ”及びＬｅ’を有 する混合グリコリポソームにおいて大きく増強された接着性が観察される。

ｉｘ）ヒト内皮細胞はＨ（Ｆｕｃα１→２Ｇａ　１）を高発現する特徴があり、 そして数多くのヒト癌はモノクローナル抗体ＭＩＡ−１５−５により確認される Ｌｅ’、Ｈ又はＬｅｂを発現する特徴がある。ＨとＬｅ’との相互作用又はＨと Ｈとの相互作用は明確に確認されており、したがって、Ｈ／Ｌｅ’／Ｌｅ’を発 現するこれらのヒト腫瘍は、Ｌ　ｅ　’　−Ｈ又はＨ−Ｈ相互作用が介在してＨ 発現内皮細胞に接着することがある。上記は、炭水化物−炭水化物相互作用に影 響を及ぼすプロセス（ａ）の−例である。

ｘ）Ｈ／Ｌｅ’　／Ｌｅ’に対するモノクローナル抗体ＭＩＡ−１５−５は、マ ウスにおいて高転移性ＦＩＯ及びＢＬ６変異体細胞の肺転移を抑制した。さらに 、ジンアロンルーＬｅ“及びモノシアロシルーＬｅ’ＴＩに対するモノクローナ ル抗体Ｆ　Ｈ７は、動的フロー系において上記抗原を発現するヒト癌細胞の接着 を抑制した。

上記及び他の種々の考察及び検討の結果、本発明によれば、下記のものが提供さ れる。

ａ）実施例３において構造１〜１４に示されているようなＧＭ３、Ｉ］、Ｌｅ’ 　、Ｌｅ”　、モノシアロシル−Ｌｅ’　（ＳＬｅ’　）　、Ｌｅ’　、Ｌｅ’ 　、Ｌｅ”　／ＳＬｅ”　ハイブリッド（第２０図の構造Ｉ）等のハイブリッド 糖類、モノシアロシルーＬｅ’　Ｉ　（ＳＬｅ”）、モノシロシル−Ｌｅ’ｌｌ 、シアロシルＴｎ、ラクトノル及び他の構造物を含んでなるオリゴ糖により、炭 水化物抗原が介在する腫瘍細胞接着による腫瘍細胞転移を抑制する組成物及び方 法。

ｂ）Ｌｅ’　／ＳＬｅ”　ハイブリッド又はＬｅ’及びＳＬｅ”等の関連成分の 適当な混合物であることができ、動的フロー系において特に高剪断応力条件下で 高親和性接着結合部位を提供する第２０図に示されているような化合物。したが って、このような化合物は、内皮細胞に対する腫瘍細胞又は白血球のＥ−セレク チン介在接着をブロックする。

Ｃ）上記構造物に基つくオリゴ糖誘導体であって、適当な担体に結合したオリゴ 糖誘導体。

ｄ）糖構造物を適当に変更して、オリゴ糖−レクチン（セレクチン；ＬＥｃｃＡ Ｍ）又はオリゴ糖−オリゴ糖相互作用に基つく腫瘍細胞接着に対してよりよいブ ロック活性を示すようにしたオリゴ糖誘導体。

ｅ）腫瘍関連炭水化物抗原を含んでなり及び腫瘍関連炭水化物抗原を表すオリゴ 糖類を認識する抗体を利用することによっても、内皮細胞、血小板又は標的細胞 に対する腫瘍細胞接着を抑制し、転移性を抑制することができる。

ｅ）細胞接着に関与し且つ腫瘍関連抗原を表すオリゴ糖を認識する抗体の組み合 わせの利用。

即ち、本発明の一態様によれば、生物学的試料内の腫瘍細胞転移性及び炎症を抑 制する方法が提供される。この方法は、生物学的試料を、前記製剤の転移を抑制 する（ａ）特異な予後有意性を示す腫瘍関連炭水化物抗原（または白血球関連炭 水化物抗原）、（ｂ）上記抗原に特異的に結合する抗体、（ｃ）上記抗原のオリ ゴ糖成分、（ｄ）上記抗原又はオリゴ糖の複合体及び（ｅ）腫瘍関連炭水化物抗 原（又は白血球関連炭水化物抗原）の擬態物からなる群から選択される少なくと も一種の薬剤とともにインキュベーションすることを含んでなる。適当な生物学 的試料には、細胞培養及び生体液が含まれる。

本発明の別の態様によれば、温血動物において腫瘍細胞の転移又は炎症を抑制す る方法が提供される。この方法は、温血動物に対して、腫瘍細胞転移及び炎症を 抑制する（ａ）特異な予後有意性を示す腫瘍関連炭水化物抗原（又は白血球関連 炭水化物抗原）、（ｂ）上記抗原に特異的に結合する抗体、（ｃ）上記抗原のオ リゴ糖成分、（ｄ）上記抗原又はオリゴ糖の複合体及び（ｅ）腫瘍関連炭水化物 抗原（又は白血球関連炭水化物抗原）の擬態物からなる群から選択される効果的 な量の少なくとも一種の薬剤を投与することを含んでなる。

関連態様において、本発明は、オリゴ糖成分の生体内半減期を延ばすのに有効な 多種多様なグリコ複合体が提供される。これらの複合体は、オリゴ糖をポリエチ レングリコールに結合して含んでなる。

本発明の方法及び組成物の範囲内で使用されるさらなるオリゴ糖成分には、ラク トース、ラクト−Ｎ−テトロース、メチルβ−Ｄ　−ラクトンド及びフェニルβ −Ｄ−チオラクトンドが含まれる。オリゴ糖成分は、個々に使用してもよいし、 組み合わせて使用してもよい。

さらに、本発明によれば、腫瘍部位で転移及びある部位で炎症反応を生じるＧＭ Ｐ−１４０介在又はＥＬＡＭ−１介在細胞集合又は接着を抑制する種々の方法が 提供される。

このような一方法は、生物学的製剤内でのＧＭＰ−１４０介在又はＥＬＡＭ−１ 介在細胞集合又は接着が抑制する方法で、この方法は、生物学的試料を、細胞集 合又は接着を抑制する（ａ）Ｌｅ’及びＳＬｅ’　（第２０図の構造ｌ、分岐Ｉ Ｉ型鎖）を含んでなるもの等のハイブリッド糖分子；　（ｂ）Ｌｅ”及びＳ　Ｌ 　ｅ　’等の（ａ）のハイブリッド糖の成分の混合物；　（Ｃ）モノノアロンル ーＬｅ’　Ｉ、Ｌｅ“、Ｌｅ’、モノシアロシル−Ｌｅ”　ＩＩ、ジンアロンル ーＬｅ′又はシアロシルＬｅ’　；　（ｄ）Ｌｅ”　／ＳＬｅ’等のハイブリッ ド糖又はそれらの成分に特異的に結合する抗体：　（ｅ）モノノアロンルーＬｅ ’　Ｉ、Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、モノノアロンルーＬｅ’ｌｌ、ジンアロシルーＬ ｅ’又はシアロシルＬｅ’に特異的に結合する抗体；　（ｆ）Ｌｅ’　／ＳＬｅ ’　、モノシアロシル−Ｌｅ’　Ｉ、Ｌｅ’、Ｌｅ’、モノノアロンルーＬｅ’ ｌｌ、シソアロツルーＬｅ“又はシアロシルＬｅ”等のハイブリッド糖類のオリ ゴ糖成分；　（ｇ）、ＳＬｅ’／Ｌｅ’、モノノアロンルーＬｅ’　１．Ｌｅ’ 　、Ｌｅ’　、モノノアロノルーＬｅ’ｌｌ、ジシアロンル−ＬｅＡ又はシアロ シルＬｅ”等のハイブリッド糖類の複合体又はオリゴ糖成分の複合体：並びに（ ｈ）Ｌｅ”　／ＳＬｅ’　、モノノアロンルーＬｅ”　Ｉ、Ｌｅ″、Ｌｅ’　、 モノシアロンルーＬｅ’ｌｌ、ジンアロシルーＬｅ“又はシアロシルＬｅ”等の ハイブリッド糖類の擬態物からなる群から選択される少なくとも一種の薬剤とと もにインキュベーションすることを含んでなる。

別の方法では、温血動物において腫瘍細胞又は炎症部位でのＧＭＰ−１４０介在 又はＥＬＡＭ−１介在細胞集合又は接着を抑制することにより、上記部位での転 移又は炎症が減少する。この方法は、混血動物に対して、温血動物において腫瘍 細胞部位での転移又は炎症を減少する（ａ）ＳＬｅ’　／Ｌｅ’等のハイブリッ ド糖１　（ｂ）Ｌ　ｅ　’及びＳＬｅ’等のハイブリッド糖（ａ）の成分の混合 物；（ｃ）モノシアロシル−Ｌｅ’ｌ、Ｌｅ’　、Ｌｅ”　、モノシアロシル　 −Ｌｅ’ｌｌ、ジンアロンルーＬｅ”又はシアロシルＬｅ’　；（ｄ）Ｌｅ’　 ／ＳＬｅ”４のハイブリッド糖、モノノアロンルーＬｅ’　１．Ｌｅ’　、Ｌｅ ’　、モノノアロンルーＬｅ’ｌｌ、ンシアロシルーＬｅ’又はシアロシルＬｅ ’に特異的に結合する抗体；　（ｅ）特にＬｅ’　、ＳＬｅ’　、Ｌｅ“又はＳ Ｌｅ“等のハイブリッド糖の成分に対する抗体の混合物；　（ｆ）Ｌｅ’　／Ｓ Ｌｅ″等のハイブリッド糖、モノシアロンルーＬｅ”　Ｔ、Ｌｅ“、Ｌｅ’、モ ノシアロシル−Ｌｅ“　ＩＩ、ジンアロシル−Ｌｅ′又はシアロシルＬｅ８のオ リゴ糖成分；　（ｇ）Ｌｅ”　／ＳＬｅ”等のハイブリッド糖、モノノアロンル ーＬｅ″　ｌ５Ｌｅ″、Ｌｅ’、モノシアロシル−Ｌｅ”ＩＩ、ノシアロンルー Ｌｅ’又はシアロシルＬｅ’の複合体又はオリゴ糖成分の複合体：並びに（ｈ） Ｌｅ”　／ＳＬｅ”等のハイブリッド糖、モノシアロシル−Ｌｅ’　Ｌ　Ｌｅ’ 　、Ｌｅ’　、モノシアロシル−Ｌｅ’ｌｌ、ジンアロンルーＬｅ”又はシアロ シルＬｅ’″の擬態物からなる群から選択される少なくとも一種の薬剤の効果的 な量を投与することを含んでなる。

また、本発明によれば、温血動物における炎症の部位でのＧＭＰ−１４０介在又 はＥＬＡＭ−１介在細胞集合又は接着を抑制することにより、上記部位での炎症 性を減少する方法が提供される。この方法は、温血動物に対して、温血動物の炎 症部位で炎症性を減少すＳＬｅ’等のハイブリッド糖（ａ）の成分である糖類の 適当な混合物：　（Ｃ）モノシアロシル−Ｌｅ’　Ｌ　Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、モ ノシアロノルーＬｅ’ＩＩ、ジシアロシルーＬｅＩ又はシアロシルＬｅ８；　（ ｄ）Ｌｅゞ／　Ｓ　Ｌ　ｅ　’等のハイブリッド糖、モノシアロシル−Ｌｅ’　 Ｌ　Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、モノシアロシル−Ｌｅ”ｌＩ、ジンアロ　シル−１， ｅ　’又はシアロシルＬｅ’″に特異的に結合する抗体；（ｅ）特にＬｅ”　、 ＳＬｅ’　、Ｌｅ’及びＳＬｅ’等のハイブリッド糖の成分に対する抗体の混合 物；　（ｆ）ＳＬｅ’　／Ｌｅ”等のハイブリッド糖、モノシアロシル−Ｌｅ’ 　Ｌ　Ｌｅ’　、Ｌｅ”　、モノノアロンルーＬｅ″　ＩＩ、ジンアロシルーＬ ｅ’又はシアロシルＬｅ′のオリゴ糖成分：　（ｇ）ＳＬｅ’　／Ｌｅ８等のハ イブリッド糖、モノシアロシル−Ｌｅ’　Ｉ、Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、モノシアロ シル＝Ｌｅ’ｌｉ　シソアロシルーＬｅ’又はシアロシルＩ−ｅ　ｘの複合体又 はオリゴ糖成分の複合体；並びに（ｈ）Ｌｅ’　／ＳＬｅ’等のハイブリッド糖 、モノシアロンルーＬｅ“　１、Ｌｅ”　、Ｌｅ’　、モノシアロシル−Ｌｅ’ ｌｌ、シソアロシル−Ｌｅ“又はシアロシルＬ　ｅ　”の擬態物からなる群から 選択される少なくとも一種の薬剤の効果的な量を投与することを含んでなる。

本発明の別の態様によれば、（Ａ）ＧＭＰ−１４０の標的となると思われるＴＡ ＣＡエピトープを塗布した螢光プラスチックビーズを含んでなる螢光プローブを 構築する工程と：　（Ｂ）前記螢光プローブを血小板の懸濁液とともにインキュ ベーションする工程と；（Ｃ）血小板に対する螢光プローブの結合の程度を測定 する工程とを含んでなるＧＭＰ−１４０のレクチン活性に対する腫瘍関連炭水化 物抗原（ＴＡＣＡ）エピトープの同定方法が提供される。

本発明の上記及び他の態様は、以下の詳細な説明及び添付図面を参照することに より明らかとなるであろう。

図面の簡単な説明 第１図は、ＢＬ６細胞の肺コロニー付着数及びサイズに及はすメチルβ−Ｄ−ラ クトンド又はメチルβ−Ｄ−チオラクトシトの影響を示すグラフである。ＢＬ６ 細胞を、対照培地（０，１Ｍメチルβ−Ｄ−ラクトシト（ｒＭｅ−β−ラクトシ ト」）又は０，１Ｍフェニルβ−Ｄ−チオラクトンド（ｒｐｈｅ−β−８−ラク トシト」））で予備インキュベーションした。２００００個の細胞をＣ５７Ｂ＋ マウスに静脈注射した。肺コロニー数を２１日１にカウントし、各バー毎に示す ように直径基準（＞１ｍｍと＜１ｍｍとの対比）で分類した。コロニー数は、単 −肺当たりについて表されている。実験Ｉ　数（ｒｒｚ　）を、（）内に示す。

第２図は、ＢＬ６細胞の肺コロニー付着数及びサイズに及はすメチルβ−Ｄ−ラ クトシトの事前投与の影響を示すグラフである。メチルβ−Ｄ−ラクトシト（投 与量１ｍ１）を、Ｃ５７ＢＩマウスに腹腔的注射した。１０分後、ＢＬ６メラノ ーマ細胞を静脈注射した。

１９日１に肺コロニーをカウントし、選別した。グループＡは対照動物（メチル β−Ｄ−ラクトシトを投与しない）を表し、グループＢ及びＣはメチルβ−Ｄ− ラクトンドをそれぞれ０．２５Ｍおよび０．５Ｍ注射した動物を表す。各グルー プ毎に、カラム１はコロニー総数を表し、カラム２は直径＞１ｍｍのコロニー数 を表し、カラム３は直径＜１ｍｍのコロニー数を表す。実験数は、ｒｎＪで表し である。

第３図は、腫瘍において規定された腫瘍関連炭水化物抗原（ＴＡＣＡ）の発現の あった癌患者又は発現のない癌患者の生存率を表すグラフである。パネル３Ａは 、モノクローナル抗体ＭＩＡ−１５−５により測定した肺偏平上皮細胞癌におけ るＨ／Ｌｅ’／Ｌｅｂ抗原の発現を表す。パネル３Ｂは、抗体ＦＨ６を用いた結 腸癌におけるシアロシル−Ｌｅ’発現を表す。パネル３Ｃは、抗体ＴＫＨ２を用 いた結腸癌におけるシアロシル−Ｔｎ発現を表す。パネル３Ｄは、卵巣癌患者の 血清中のシアロンルーＴｎ濃度を表す。

第４図は、ＬａｃＣｅｒに対するメラノーマ細胞接着は、ＧＭ３−Ｌ　ａ　ｃ　 Ｃｅ　ｒ相互作用によるものであることを示すグラフである。

転移性の順序は、ＢＬ６＞ＦＩ　Ｏ＞Ｆｌ＞＞Ｗａ４である。パネル４Ａは、Ｌ ａｃＣｅｒ塗布固相に対するメラノーマ細胞接着の順序を示す。パネル４Ｂは、 ＬａｃＣｅｒ／フィブロネクチン（ＦＮ）共塗布固相に対するメラノーマ細胞接 着の順序を示す。パネル４Ｃは、インテグリン依存接着を示す。

第５図は、ＬａｃＣｅｒ　（パネル５Ａ）及び内皮細胞（ＨｕＶＥＣ）（パネル ５Ｂ）に対するメラノーマ細胞（ＢＬ６）接着は、Ｌａ、　ｃ　Ｃｅ　ｒ及びＧ Ｍ３により抑制されることを示すグラフである。

第６図は、メチル（Ｍｅ）−β−ラクトシトの転移抑制効果を示すグラフである 。腫瘍細胞を静脈注射した後、ＰＢＳ　（Ａ）；　０゜２５ＭＭｅ−β−ラクト シト（Ｂ）；０．５Ｍ　Ｍｅ−β−ラクトシト（Ｃ）；０１５Ｍ　ラクトース（ Ｄ）；０．２５Ｍ　Ｎ−アセチルラフトスアミン、（Ｅ）；又は０．５Ｍ　Ｍｅ −β−ガラクトシド（Ｆ）を腹腔注射した。

第７図は、Ｈ−Ｌｅ’及びＨ−Ｈ相互作用を示すグラフである。

パネル７Ａは、種々の糖脂質に対するＨｌ−リポソーム結合を示す。

パネル７Ｂは、種々の糖脂質に対するＬｅ’−リポソーム結合を示す。

第８Ａ図〜第８Ｄ図は、非活性（パネル８Ａ及び８Ｃ）血小板及び抗−〇ＭＰ− １４０モノクローナル抗体を用いた活性化（パネル８Ｂ及び８Ｄ）血小板の流動 細胞光度測定プロフィールである。

第９図は、種々のＧＳＬを塗布した螢光ビーズに対する血小板の結合指数を示す グラフである。ハツチングを施したバーは非活性化血小板を表し、オーブンバー は活性化血小板を表す。

第１θ図は、ノアロシルーＬｅ’塗布ビーズに対する活性化血小板の結合に及ぼ す種々のモノクローナル抗体の影響を示すグラフである。横軸は、抑制率を表す 。カラムｌは抗−ＧＭＰ−１４０−ｍＡｂ、ｌ０Ｐ６２を表し；カラム２は抗− ノアロシルーＬｅ″モノクローナル抗体、ＣＡｌ９−９を表し：カラム３は抗− ノアロシル−Ｌ　ｅ　’モノクローナル抗体、５ＮＨ４を表し：そしてカラム４ は正常マウスＩｇＧを表す。

第１１Ａ図〜１１Ｄ図は、流動系における細胞の動的接着を明らかにする実験シ ステムを示す。パネルＩＩＡは、層流チャンバーの構造を示す。パネルｌ　１． 　Ｂは、層流チャンバーの断面を示す。この層流チャンバーでは、流動チャンバ ー本体（１６）は、細胞又は接着分子（９）が固定されているカバースリップ（ ３）にしっかりと固定されている。パネルＩＩＣは、記録システムのアセンブリ ー全体を示す。パネルＩＩＤは、細胞層又は接着分子上を通過する腫瘍細胞懸濁 液の流れを示す概略図である。

第１２図は、動的流れ系におけるインターロイキン−１−活性化ヒト謄脈内皮細 胞に対するヒト結腸癌Ｃｏ１ｏ２０５細胞の接着に及ぼす種々のモノクローナル 抗体の影響を示すグラフである。白丸は、無関連マウスＩｇＧとＩｇＭとの混合 物（対照）のデータを表し、黒三角は、モノンアロノルーＬｅ”ｉに対するモノ クローナル抗体ＣＡ１９−９のデータを表し、白玉角は、シアロシル−Ｌｅ’に 対するモノクローナル抗体５ＮＨ４のデータを表し、黒丸は、モノンアロシルー Ｌｅ’ｌｌ及びジンアロシルーＬｅ’に対するモノクローナル抗体ＦＨ７のデー タを表し、黒画角は、無関連マウスＩｇＧ＋　Ｉ　ｇＭ及び非活性化内皮細胞の 混合物のデータを示す。

第１３図は、ＨＬ６０細胞に対するｍＡｂの結合及びこれに及ぼすシアリダーゼ の影響を示す。結合活性は、フローサイトメトリーによりめた。横軸二対数螢光 強度。縦軸・相対細胞数。パネルＣ：実線は一次抗体としてｍＡｂＳＮＨ４で染 色した細胞についての結果であり、点線は一次抗体としてマウスＩ’ｇＧ＋Ｉ　 ｇＭ　（１０μｇ／ｍｌ）で染色した対照細胞の結果である。パネルＢ、−次抗 体がｍＡｂＳＮＨ３；対照はパネル八と同様。パネルＣ：実線はニューカッスル 病ウィルス（ＮＤＶ）シアリダーゼで処理後ｍＡｂｓＮＨ４で染色した細胞の結 果であり、点線は対照細胞（シアリダーゼ処理後であることを以外はパネルＡと 同様）の結果である。パネルＤ　：　ＮＤＶシアリダーゼ処理後ｍＡｂＳＮＨ３ で染色したものの結果であり、対照はパネルＣと同様。パネルＥ：コレラ菌（Ｖ Ｃ）シアリダーゼ処理後ｍＡｂＳＮＨ４で染色。パネルＦ：ＶＣンアリダーゼ処 理後ｍＡｂＳＮＨ３で染色。（Ｓ　Ｎ　Ｈ３及び５ＮＨ４の両方により確認され る）ＳＬｅ’の発現は、ＮＤＶ及びＶＣシアリダーゼの両方により完全に消滅し た。

第１４図は、静的系におけるＥ−セレクチン塗布プレートに対するＨＬ６０細胞 の接着を示す。横軸は、処理の種類を示す。縦軸は、未処理対照細胞に対する細 胞接着率を示す。パネルＡ二種々のシアリダーゼの効果。パネルＢ、抗−Ｌｅ’ 及び抗−３Ｌｅ’ｍＡｂ単独並びに組み合わせ（３７°Ｃで９０分間のインキュ ベーション）。

パネルＣ：　ＮＤＶンアノアーゼ＋ｍＡｂの効果。パネルＡ：　（末端Ｇａｌで α２→３ンアロノルを開裂する）ＮＤＶシアリダーゼは、ＳＬｅ’構造体を消失 させ、ｍＡｂＳＮＨ３及び５ＮＨ４との反応性を消失させる（第１３図参照）が 、接着は消失しなかった。ｖＣ及びアルトロバクターウレアファノエンス（Ａ　 Ｖ）シアリダーゼは、接着を消滅した。パネルＢ：抗−５Ｌｅ’ｍＡｂは、抗− Ｌｅ’　ｍＡｂよりも効果が小さかった。両方の種類のｍＡｂの組み合わせが、 最も効果的であった。パネルＣ接着は、ＮＤＶンアノアーゼ＋抗−Ｌ　ｅ　’　 ｍＡ　ｂによって最も効果的に抑制された。

第１５図は、動的流れ系におけるＥ−セレクチン塗布プレートに対するＨＬ６０ 細胞の接着を示す。トランケートＥ−セレクチンを、プラスチックプレート上の マークの付けた領域（直径約０．５ｃｍ）に塗布し、既知の壁剪断応力下の接着 を、本明細書に記載の方法でアッセイした。横軸は、剪断応力（ダイン／ｃｍ’ ）である。縦軸は、３分間で接着した細胞数である。パネルＣ：実線は対照（未 処理）細胞、黒三角はＮＤＶンアリダーゼで処理した細胞；黒丸はＶＣシアリダ ーゼ、及び白玉角はＡＵシアリダーゼである。パネルＢ白丸は対照、黒三角は抗 −８Ｌｅ’　ＩｇＣｚ　ｍＡｂＳＮＨ４を含有する培地で培養した細胞；黒丸は 抗−Ｌｅ’　ＩｇＭｍＡｂＦＨ２；及び白玉角は抗−Ｌｅ’　Ｉ　ｇＧｘ　ｍＡ ｂｓＨＩである。パネルＣ１白丸は対照；黒三角はＮＤＶンアリダーゼ；黒丸は ｍＡｂｓＨｌ、及び白玉角はＮＤＶンアノアーゼ＋ｍＡｂｓＨ１である。パネル Ｄ・白丸は対照、黒丸はｍＡｂＳＮＨ４とＦＨ２との（１：　Ｉ）混合物、そし て白玉角はｍＡｂＳＮＨ４とＳＨＩとの（１：　ｌ）混合物である。ＮＤＶンア リダーゼによる末端Ｇａｌでのα２→３ンアロノル化の開裂により、接着が多少 減少したが、接着は低剪断応力で残存した。これに対して、ＶＣ及びＡＵシアリ ダーゼは強力に接着を抑制しくパネル１５Ａ）、内部シアロンル化（ＮＤＶンア リダーゼにより影響をうけない）が重要であることが示された。このことは、（ ｉ）ＮＤＶンアノアーゼ＋ｍＡｂｓＨＩか接着を強力を抑制したこと及び（１１ ）抗−８Ｌｅ’ｍＡｂＳＮＨＪ＋抗−Ｌｅ’ｍＡｂＦＨ２又はＳＨＩが５ＮＨ４ 単独よりも強力に接着を抑制したこと（パネル１５Ｂ及び１５Ｄ）により明らか である。

第１６図は、シアリダーゼ処理をした場合としない場合におけるＣｏ１ｏ２０１ 細胞と種々のｍＡｂとの反応性を示す。Ｃｏ１ｏ２０１細胞は、抗−５Ｌｅ’　 ＩｍＡｂＣＡｌ９−９及びＮＫＨＩ（パネルＡ）、抗−Ｌｅ’　ｍＡｂＣＡ３Ｆ ４　（パネルＢ）及び抗−３Ｌｅ’　Ｉ　ＩｍＡｂＦＨ７（パネルＣ）との反応 性が高かった。ＣＡ１９−９との反応性は、ＮＤＶンアリダーゼ（パネルＤ）に より減少し、ＶＣシアリダーゼにより消失した（パネルＧ）。Ｃａ３Ｐ２との反 応性は、ＮＤＶ及びＶＣンアリダーゼにより僅かに増加した（パネルＥ及びＨ） 。ＦＨ７との反応性は、ＮＤＶンアリダーゼによっては変化せず（パネルＦ）、 そしてＶＣンアリダーゼにより僅かに減少した（パネルＩ）。

第１７図は、静的系におけるＥ−セレクチン塗布プレートに対するＣｏ１ｏ２０ １の接着を示す。横軸と縦軸は、第１４図と同様である。パネルＡ二種々のシア リダーゼ（３７°Ｃで９０分間インキュベーション）の効果。パネルＢ：ンアリ ダーゼ（３７°Ｃで１８時間インキュベーション）の効果。細胞は、まず０．５ ％バラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定した。パネルＣ；シアリダーゼ処 理後ｍＡｂで処理した時の効果。末端Ｇａｌてα２→３シアロンルを開裂するＮ ＤＶンアリダーゼは接着に影響を及ぼさなかったのに対して、位置に無関係にノ アル酸を開裂するＶＣ及びＡＵシアリダーゼは接着を消滅させた（パネルＢ）。

パネルＣにおいて、ＶＣ又はＡＵンノアダーゼ＋ｍＡｂＣＡ３Ｆ４の場合に、最 も効果的な抑制が観察された。

第１８図は、動的流れ系におけるＥ−セレクチン塗布プレートに対するＣｏ１ｏ ２０１細胞の接着を示す。接着アッセイは、本明細書に記載する方法で行った。

横軸と縦軸は、第１５図と同様である。

パネルＡ　白丸は対照、黒丸はＮＤＶシアリダーゼ；白玉角はＡＵノアリダーゼ 、及び黒三角はＶＣシアリダーゼである。パネルＢ白丸は対照：黒丸は抗−８Ｌ ｅ’　ＩｍＡｂＣＡｌ　９−９　；白玉角は抗−５Ｌｅ’　Ｉ　ＩｍＡｂＦＨ７ ；及び黒三角は抗−Ｌｅ’　ｍＡｂＣＡ３Ｆ４である。パネルＣ：白丸は対照、 黒丸はＣａ３Ｐ２．黒三角はＶＣンアリダーゼ、白道三角はＶＣシアリダーゼ＋ ＣＡｌ９−９．そし゛ＣＣ正三角ＶＣンノアグーゼ−←ＣＡ３Ｆ４　（接着は、 この組み合わゼで最も強）Ｊに抑制された）である。パネルＤ：白丸は対照：黒 三角はＮ　Ｉ）　Ｖシアリダーゼ１黒逆三角はＣＡ３Ｆ４：白道三角ｉｊｌ　Ｎ 　Ｄ　Ｖノアリダーゼ十ＣＡ１９−９．黒丸はＮＤＶシアリダーゼ十ＦＨ７＋そ して白三角はＮＤＶシアリダーゼ＋ＣＡ３Ｆ４　（接着は、この組み合わせで最 も強力に抑制された）である。

第１９図は、種々の剪断強度条件下での動的流れ系におけるＥＬＡＭ塗布プレー トへのｌ（Ｌ　６０結合に対するニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）シアリダ ーゼ、ビブリオコレラ（Ｖ　Ｃ）シアリダーゼ又は■ηＡｂＳＮＨ４又はＳ　） （＋の影響を示す。縦軸は、未処理対照細胞に対する細胞結合を表す。抗体を１ ５μｇ／ｍｌで使用し、ＮＤＶシアリダーゼを０．２Ｕ／ｍｌで使用し、ＶＣン アリダーゼをＯ，ＩＵ／ｍｌで使用した。各点は、３回の実験の平均である。

剪断応力１５．５．７．７５．３．Ｉ３．１．５６及び０．７８ダイン／ｃｍ２ で結合した未処理細胞数は、それぞれ４．５．２７．１０９．６．２０６．２及 び２８３．８個／　ｍ　ｍ　２であった。

第２０図は、種々の分岐糖類を示す。）＼イブリント糖、Ｌｅ’　／ＳＬｅ’、 は構造体ｌとして示されている。このような構造体を含有する糖脂質を、結腸癌 から分離するか、酵素触媒αｌ→３フコンル化によりヒト赤血球由来の構造体５ 　（Ｗａｔａｎａｂｅ等、Ｊ。

１３ｉｏ１．Ｃｂｅｍ、、２５４　：　８２２３．１９７９）で表されるＧ８ガ ングリオシドから調製した。構造体２は、ヒト胎盤由来の化合物６のαＩ−３フ コンル化により得られた。しかしながら、構造体２は、Ｅ−セレクチンに対して 高親和結合を示さなかった。構造体３及び４は、同し分子内にＬｅ’及びノアリ ルーＧａ１１３１→３ＧａｌＮａｃを有する高親和結合部位を有する類似体（構 造体３）又はハイブリッド分子Ｌｅ’／ＳＬｅ“、構造体ｌの位置異性体である 。

第２１図は、プラスチック表面に塗布した種々の「グリコ−リポソームｊについ てのＥ−セレクチンを発現するＮ　Ｓ−１細胞の接着性を示す。パネル２１Ａは 、中剪断応力条件（７，７５ダイン／Ｃｍ’）下での動的流れ系での上記相対接 着の結果である。最初の７つのバーは、表示した各グリコリポソームについての ＳＬｅ’に対するＮＳ−１細胞の相対接着性を示す。ｃｐａ　Ｉは第２０図の構 造体１てあり、ＣｐｄｌＩは第２０図の構造体２である。ロッド８〜１０は、Ｌ ｅ’と表示した異種の化合物との混合物を示す。相対接着性の値は、ＳＬｅ’− リポソームの接着性を１００％とした場合との比較で表される。値は、５回の測 定の平均である。パネル２１Ｂは、高剪断応ノＪ条件（１１，８ダイン／ａｍ’ ）下での同しＮＳ−１細胞の相対接着性を示す。この値は、ＳＬｅ”塗布プレー トについての接着性で表されている。値は、５回の測定の平均である。

第２２図は、異なる剪断応力条件でのプラスチックプレートに塗布した種々のグ リコリポソームについてのＥ−セレクチンを発現するＮＳ−，１細胞の相対接着 性を示す。ＣＰＤＩ及びＣＰＤＩＩは、第２０図の構造体Ｉ及び２である。ＣＰ ＤＩ塗布プレートについての接着性の増加は、中〜高剪断応力条件でのみ見られ た。縦軸は、ＳＬｅ’　リポソームに対する相対接着性である。横軸は、動的流 れにおける壁剪断応力（ダイン／ｃｍ’）である。ＤＳＩは、ジノアロシルー■ 抗原を表す。

第２３図は、異なる糖脂質濃度でプラスチック表面に塗布した種々のグリコリポ ソームへの結合細胞数（ｍｍ’当たり）である。第２０図の構造体ｌは、高剪断 応力で、ＳＬｅ“塗布プレートよりもはるかに多くＥ−セレクチン発現細胞を接 着する。この差は、低剪断応力では明確ではない。縦軸は結合細胞数／　ｍ　ｍ 　２であり、横軸は糖脂質濃度（単位、μＭ）である。各点は、５回の測定の平 均である。

第２４図は、ＳＬｅ’と種々の他の糖脂質との混合物を有するグリコリポソーム へのＥ−セレクチンを発現するＮＳ−１細胞の接着性を示す。縦軸は、ｌ領域光 たりの接着細胞数である。黒丸は、ＳＬｅ’　＋ＳＰＧである。白丸は、ＳＬｅ ’　＋８２である。黒三角は、ＳＬｅ’　十Ｌｅ’である。白三角は、ＳＬｅ’ ＋Ｌｅ’ｔ’ある。各点は、５回の測定の平均値である。

発明の詳細な説明 上記したように、本発明の一態様によれば、腫瘍細胞転移及び浸入を抑制する方 法及び組成物が提供される。種々の腫瘍細胞が、転移する、即ぢ、遠隔部位で二 次腫瘍コロニーを形成する能力を有している。悪性腫瘍細胞源には、メラノーマ 、肺癌、乳癌、結腸直腸癌並びに膀胱癌及び前立腺癌等の尿生殖器癌が含まれる 。本発明において、腫瘍細胞の転移性（即ち、腫瘍細胞が転移する能力）は、（ ａ）腫瘍関連炭水化物抗原［ＴＡＣＡ（本明細書では、ＴＡＣＡとはＬＡＣＡも 含むことを意味する））；（ｂ）これらのＴＡＣＡに対する抗体：　（Ｃ）これ らのＴＡＣＡのオリゴ糖成分；　（ｄ）リンルリジン又はＴＡＣＡ担持グリコス フィンゴリピド（ＧＳＬ）リポソームの多価複合体のようなＴＡＣＡ又はこのよ うなＴＡＣＡのオリゴ糖成分の＋Ｕ合体、又は（ｅ）ＴＡＣＡの擬態物を使用す ることにより抑制される。一般的に、特記のない限りは、腫瘍細胞と白血球は、 両方とも炭水化物構造体により内皮細胞に結合するので、両者は実質的に等偽物 である。

ＴＡＣＡエピトープは、内皮細胞、血小板及び基底膜との相互作用により腫瘍細 胞接着に主要な役割を果たすことにより、腫瘍転移と侵入が生じると考えられる 。接着機構は、炭水化物（ＣＨＯ）ＣＨＣＩ−ＣＨＯ相互作用、ＣＨＯ−レクチ ン相互作用又はＣＨＯ−セレクチンファミリー相互作用によると考えられる。

非活性化内皮細胞に対する種々の腫瘍細胞の接着は、最初炭水化物−炭水化物相 互作用が介在し、それが引き金となって内皮細胞を活性化し、ＥＬＡＭ−］及び ＧＭＰ−１４０等のセレクチンを発現する（Ｋｏ　ｊ　ｉｍａ及びＨａｋｏｍｏ ｒｉ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２６６：１７５５２、＋９９］；Ｋｏｊｉｍａ等 、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　、２６７　：１７２６４．１９９２；Ｈａｋｏｍｏｒｉ。

Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｊ、　、２４　ニア７１、ｌ９９２参照）。続いて、活性 化内皮細胞と血小板に対する種々の腫瘍細胞の接着に、主にＬＥＣＣＡＭ又はセ レクチンスーパーファミリー（例えば、ＥＬＡＭ−１及びＧＭＰ−１４０）が介 在する。

シアロンルーＬｅ“が介在する腫瘍細胞接着は、抗−シアロシル−Ｌ　ｅ　’モ ノクローナル抗体（ＦＨ６、Ｃ５ＬＥＸＳＳＮＨ３及び５ＮＨ４）により抑制さ れ、モノシアロシル−Ｌｅ″　Ｉが介在スる腫瘍細胞接着は、そのエピトープに 対するモノクローナル抗体（ＣＡｌ！Ｊ−９、Ｃ３ＬＥＡＳＮＫＨＩ及びＮ　Ｋ 　Ｈ２）により抑制される（Ｈａｎｄａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、ｌ　８　］　：１２２３．１９９１：Ｋｏｊｉｍａ等、 Ｂｉｏｃｈｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、＋　８２　：１２８８ ．１９９２　＋Ｈａｋｏｍｏｒｉ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、Ｊ、、２４・７７１． １９９２参照）。

内皮細胞に対する、主にｌ車路シアロシル−Ｌｅ″及び（より少ない程度に）シ アロンルーＬｅ’を発現するＣｏ１ｏ２０５腫瘍細胞の接着は、抗−ノアロシル ーＬｅ’モノクローナル抗体及び（より少ない程度に）抗−シアロシル−Ｌｅ’ モノクローナル抗体により抑制される。これらの知見は、シアロンルーＬｅ’だ けでなくシアロシル−Ｌｅ’　も、ＥＬＡＭ−１及びＧＭＰ−１４０（以前にＣ Ｄ６２又はＰＡＤＧＥＭと称せられ、Ｅ−セレクチン及びＰ−セレクチンとして も知られている）によって認識される重要なリガンドであることを示唆している 。

活性化内皮細胞に対する腫瘍細胞の接着は、モノシアロシル＝Ｌｅ’ｌｌ及びジ ンアロンルーＬｅ”の認識にもよることが現在知られている。モノシアロンルー Ｌｅ’ｌｌ及びジンアロシルーＬｅ’の両方は、セレクチンを介した活性化内皮 細胞又は血小板に対する種々の上皮癌細胞（特に結腸直腸、胃腸及び膵臓）の接 着を強力に抑制することが知られているモノクローナル抗体ＦＨ７により確認さ れる。

特に、ＧＭＰ−１４０は、血小板のα−顆粒又は内皮細胞（Ｅ　Ｃ）のワイベル ーバラード（Ｗｅｉｂｅｌ−Ｐａｌｌａｄｅ）体に位置する主要なセレクチン（ ＬＥＣＣＡＭ）である。これらの細胞が活性化すると、ＧＭＰ−１，４０は細胞 表面に迅速に再分布し、そこでＧＭＰ−１４０血球又は腫瘍細胞について発現さ れるある種の炭水化物エピトープに対する血小板又はＥＣの接着に重要な役割を 果たし、その結果、血小板又は腫瘍細胞の凝集又はそれらの毛細血管内皮への接 着が生しる。本発明者等によれば、ＧＭＰ−１４０介在細胞接着は、腫瘍細胞の 転移付着の開始や炎症プロセスの開始に関与していると思われる。

また、ＥＬＡＭ−１は、インターロイキン−１、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α又はリ ポ多糖類で活性化後の内皮細胞上で発現される。ＥＬＡＭ−１介在細胞接着も、 腫瘍細胞の転移付着の開始に関与していると思われる。

したがって、本発明の別の態様によれば、とりわけ腫瘍細胞部位でのＧＭＰ−１ ４０介在又はＥＬＡＭ−１介在細胞集合又は接着の抑制に関する。本発明では、 ＧＭＰ−１４０介在又はＥＬＡＭ−１介在細胞集合又は接着は、（ａ）Ｌｅ“／ 　Ｓ　Ｌ　ｅ　’等のハイブリッド糖；　（ｂ）Ｌｅ”及びＳＬｅ’等のハイブ リッド糖（ａ）の成分である糖類の混合物；　（Ｃ）モノシアロシル＝Ｌｅ”　 ｉ　Ｌｅ’、Ｌｅｗ、モノ／アロ／ルーＬｅ’ＩＩ、シソアロンルーＬｅ゛また はシアロシルＬｅ’　；　（ｄ）Ｌｅ’　／ＳＬｅ“等のノ＼イブリント糖（ａ ）、モノ／アロ／ルーＬｅ’　Ｉ、Ｌｅ”　、Ｌｅ’　、モノ／アロツルーＬｅ ’ｌＴ、シソアロンルーＬｅ″又はシアロシルＬｅ°に特異的に結合する抗体、 （ｅ）特にＳＬｅ’及びＬｅ’に対する等のハイブリッド糖の成分に対する抗体 の混合物；　（ｆ）Ｌｅ’　／ＳＬ　ｅ　’等のハイブリッド糖、モノ／アロツ ルーＬｅ’　ｉ　Ｌｅ’、Ｌｅ’　、モノ／アロ／ルーＬｅ’ｌｌ、シソアロン ルーＬｃ’又はノアロンルＬ　ｅ　’のオリゴ糖成分：　（ｇ）Ｌｅ’　／ＳＬ ｅ’等の／＼イブリ、ド糖、モノ／アロンルーＬｅ’　ｌ　Ｌｅ’　、Ｌｅ’　 、モノシアロンルーＬｅ’ｌｒ、シソアロンルーＬｅ’又はシアロシルＬｅ゛の 複合体又はオリゴ糖成分の複合体、並びに（ｈ）Ｌｅ’／ＳＬｅ’等のハイブリ ッド糖、モノ／アロツルーＬｅ’　Ｉ、Ｌｅ’、Ｌｅ’　、モノシアロ／ルーＬ ｅ’ｌｌ、ジシアロシルーＬｅ”又はシアロシルＬｅ’の擬態物を使用すること により抑制できる。

本発明において、腫瘍の転移と侵入は、腫瘍細胞接着をブロックすることにより 転移性細胞の拡散を減少又はなくすことで抑制される。

また、本発明では、腫瘍の転移と侵入は、（１）（ａ）腫瘍細胞の血小板への接 着、（ｂ）血小板を介した腫瘍細胞への腫瘍細胞の接着、（Ｃ）血小板を介した ＥＣへの腫瘍細胞の接着及び（ｄ）　ＧＭＰ−１４０を介したＥＣの腫瘍細胞へ の直接接着による腫瘍部位でのＧＭＰ−１４０介在腫瘍細胞集合又は接着；並び に（２）ＥＬＡＭ−１を介したＥＣへの細胞の直接接着による腫瘍細胞部位での ＥＬＡＭ−１介在腫瘍細胞集合又は接着を抑制することにより最小田に抑えられ る。

さらに、本発明において、炎症は、（ａ）血小板への白血球の接着、（ｂ）血小 板を介した内皮細胞（ＥＣ）への白血球の接着、（Ｃ）セレクチンを介したＥＣ への白血球の直接接着及び（ｄ）白血球の内皮細胞経由移動による炎症の可能性 のある部位でのＧＭＰ−１４０介在白血球集合、接着又は移動を抑制することに より最小限に抑えられる。

本発明で使用するのに適当なＴＡＣＡは、示差予後徴候有意性を示すもの（即ち 、侵入性又は転移性と明確な相関のあるＴＡＣＡ）である。本発明においては、 上記ＴＡＣＡは、このようなＴＡＣＡの発現−非発現を示す同様の腫瘍の侵入性 、転移性及び臨床予後を比較することにより識別できる。本発明で使用するのに 好ましいＴＡＣＡには、Ｈ／Ｌｅ’／Ｌｅ″′、ノアロシルーＬｅ’　（ＳＡ　 −Ｌｅ′又はＳＬｅ’　）　、Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、モノシアロシル−Ｌｅ’　 １（Ｓ　Ｌ　ｅ　’又はＳ　Ａ　−Ｌ　ｅ　’　）及びシアロンルーＴｎ（ＳＡ −Ｔｎ又は５Ｔｎ）が含まれる。このようなＴＡＣＡの誘導体には、Ｌｅ’　／ ＳＬｅ’　、Ｌｅ’二量体、ノンアロツルーＬｅ’二量体、トリフコツル■、ｅ ′、ノンアロツルーＬｅＩ及びモノノアロノルーＬｅ’ＩＩ等のハイブリット糖 類が含まれる。

上記したように、本発明で使用されるＴＡＣＡは、示差予後有意性を示す。例え ば、示差予後有意性は、（モノクローナル抗体Ｍ　ＩＡ−１５−５により確認さ れる）Ｈ／Ｌｅ’　／Ｌｅ’抗原を発現する腫瘍が、このような抗原を発現しな い腫瘍よりも、中音の予後かはるかに悪いことにより明らかにてきる。例えば、 第３Ａ図に示すように、Ｈ／Ｌｅ’／Ｌｅ’を発現する偏平上皮肺癌を患った患 者は、５年間の生存率が１１％（即ち、死亡率・８９％）であったのに対して、 これに匹敵するＨ／Ｌｅ’／Ｌｅｂを発現しない患者は、同期間での生存率は、 約６２％であった。

ノアロノルーＬｅ’及びシアロンルーＴｎ抗原の発現−非発現を示す腫瘍につい ても、同様の結果が得られた。より具体的には、第３Ｂ図に示すように、シアロ シル−Ｌｅ’を発現する結腸癌を患った患者は、５年間の生存率がわずか１５％ であったのに対して、これに担当する上記抗原を発現しない患者は、同期間での 生存率は、約５０％であった。別に行われた研究では、ノアロシルーＴｎを発現 しない初期結腸癌を患った患者の５年生存率は、１００％であったのに対して、 ノアロシルーＴｎを発現する患者の生存率は、７５％であった（第３Ｃ図参照） 。第３Ｄ図に示すように、シアロソルーＴｎ抗原を発現する卵巣癌を患った患者 と発現しない患者において、同様であるがより明確な差が観察された。

また、上記したように、適当なＴＡＣＡに対する抗体又は抗体の混合物を、本発 明で使用できる。ここで使用される抗体には、モノクローナル抗体とポリクロー ナル抗体の両方が含まれ、無傷分子、このような分子の断片又はその機能的等傷 物であることができる。

抗体は、遺伝学的に構築できる。抗体断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’　）ｒ 　、Ｆａｂ’　、Ｆａｂ及びＦｖが挙げられる。

簡単に述へれば、ポリクローナル抗体は、動物を免疫後、そこから血清を採取す ることにより得ることができる。免疫化は、例えば、兎、ラット又はマウスへの 皮下、牌臓内又は筋肉内注射による等の全身投与により行うことができる。一般 的に、最初の免疫後、血清採取前に一回以上の追加免疫を行うことが好ましい。

このような方法論は、周知であり、多数の文献に記載されている。

ポリクローナル抗体を本発明で用いることができるが、モノクローナル抗体が好 ましい。本発明で使用するのに適当なモノクローナル抗体には、マウス若しくは ヒト由来ポリクローナル抗体、又はヒト及びマウス抗体の一部分づつを組み合わ せたもの（即ち、マウス抗体の抗原結合領域＋ヒト抗体の定常領域）等のキメラ 抗体が含まれる。ヒト及びキメラ抗体は、当業者により公知の方法を用いて製造 できる。ヒト抗体とキメラヒト−マウス抗体は、マウス抗体よりも、臨床投与し たときに抗−抗体の産生を生しにくいので有利である。

モノクローナル抗体は、一般的にＫｏｅｈｌｅｒ及びＭｉ　Ｉ　ｓ　ｔｅｊｎの 方法（Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５．１９７５；ＥｕｒＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、６ ：５１１．１９７６）だけでなく、Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎの最初 の方法を改良した種々の手法（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（編集者）、”Ａｎｔ ｉｂｏｄｉｅｓ”　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａビ、Ｃｏ１ｄ　ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８８参照；この文献 全体は、引用することにより本明細書の開示の一部とされる）により製造される 。

簡単に述へれば、ＴＡＣＡの一種又はオリゴ糖成分で免疫した動物のリンパ節及 び／又は牌臓を骨髄腫細胞と融合して、ハイブリッド細胞系（［ハイブリドーマ Ｊ又は「クローン」）を形成する。各ハイブリドーマは、単一種の免疫グロブリ ンを分泌し、そして骨髄腫細胞のように、無限細胞分裂する可能性かある。この ような分子を担体に結合して、免疫抗原性を増加することか望ましいことがある 。適当ｆｆ担体に（Ｊ、キーホールリンベットヘモノアニン、ザイログロブリン 、ウノ血清アルブミン及びそれらの誘導体が含まれる。

ハイブリドーマを介してモノクローナル抗体を製造することの代替法は、バクテ リオファージ及び細菌（例えば、５ａｓＬｒｙ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａ ｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、米国８６：５７２８．１９８９　；　Ｈｕ　ｓｅ等、５ｃｉ ｅｎｃｅ２４６：１２７５．１．２８９）を用いてモノクローナル抗体発現ライ ブラリーを創製する、二とである。適当な特異性を示す抗体の選択は、当業者に とって明白な多種多様な方法で行うことができる。

本発明に使用するのに適当なモノクローナル抗体の代表例としては、Ｍ　Ｉ　Ａ −１５−５（Ｍ　ｉ　Ｖ　ａ　ｋ　ｅ及びＨａｋｏｍｏｒ　ｉ、Ｂ　ｉｏｃｈｅ ｍ、３０：３３２８、＋９９１）や、Ｈａｋｏｍｏｒｉ、Ａｄｖａｎｃｅｓ　Ｉ ｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ５２：２５７〜３３１．１９８９で引用さ れているモノクローナル抗体が挙げられる。

」二記したように、適当なＴＡＣＡのオリゴ糖成分も、本発明で使用できる。本 明細書において使用される用語「オリゴ糖」には、天然オリゴ糖類、合成オリゴ 糖類及びＴＡＣＡオリゴ糖成分の一部分を含むそれらのいずれかの擬態誘導体が 含まれる。

本発明に有用なさらなるオリゴ糖成分には、ラクトース並びにメチルβ−ｐ−ラ クトノド、ラクト−Ｎ−テトロース（Ｇａｌβｌ−３ＧＩｃＮＡｃβ］→３Ｇａ ｌβ］→４ＧＩｃ）及びフェニルβ一旦−チオラクトノド等のラクトース誘導体 か含まれる。例えば、両成分は、マウス肺におけるメラノーマ細胞の転移を抑制 することか判明した。エチル又はフェニルラクトンド及びメチル又はエチルチオ ラクトンドを含む池のラクト・−ス誘導体も使用できる。上記ラクトース誘導体 は、ＥＣのラクトノルセラミドとのメラノーマ細胞ＧＭ３ガングリオノド相互作 用を抑制することにより、ＥＣへのメラノーマ細胞の結合をブロックすると思わ れる。

特定の腫瘍の細胞の転移性を抑制するのに適当な他のオリゴ糖成分は、腫瘍の転 移能に関与する特異的炭水化物鎖（単−又は複数）の構造を決定することにより 同定できる。腫瘍転移能に関与する炭水化物含有分子の同定は、グリコシダーゼ 及びグリコジルトランスフェラーゼの抑制剤の使用によることを含む種々の方法 で行うことができる。

脂質又はタンパク質に結合した炭水化物の構造は、分解、電子衝撃直接プローブ （Ｅ＋）及び高速原子衝撃（ＦＡＢ）を含む質量分析並びにメチル化分析（例え ば、Ｎｕｄｅｌｍａｎ等、Ｊ、Ｂｉ。

１、Ｃｈｅｍ、２６１　：５４８７．１９８６に記載されている手法）により決 定できる。分解分析は、化学的及び／又は酵素的、例えば、グリコツダーゼ類に より行うことができる。分解分析により示唆される炭水化物配列は、メチル化分 析（Ｈａｋｏｍｏｒｉ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５５　：　２０５．１９６４）後 、過メチル化糖類の化学イオン化質量分析（Ｓｔｅｌｌｎｅｒ等、Ａｒｃｈ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、１５５：４６４．１９７４　；Ｌｅｖｅｒｙｅ ｔ　ａｌ、　、Ｍｃｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、１３８＋１３．１９８７）により決 定できる。

上記手法の代わり又は上記手法とともに、Ｅｌ質量分析を、過メチル化グルカン について行うか、無傷グリカンを適当に分解した後に行うことができる（Ｋａｎ ｎａｇｉ等、Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５９：８４４４．１９８４：Ｎｕｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、２６３：１３９４２．１．９８８）。炭水化物配列の均一性は、無 傷又はメチル化グリカン類のプロトンＮＭＲ分光分析法及びＦＡＢ質員分光分析 を含む種々の化学的及び物理的基準に基ついて示すことができる。一旦炭水化物 配列が決定されれば、当業者には、腫瘍細胞の転移性を抑制するのに適当なオリ ゴ糖を選択することは明らかであろう。

上記で簡単に述べたように、リシルリジン又はＴＡＣＡ担持グリコスフィンゴリ ピド（ＧＳＬ）リポソーム（又はグリコ−リポソーム）との多価複合体等の適当 なＴＡＣＡ又はそれらのオリゴ糖成分の複合体も、本発明で使用できる。

複合体の成分は、直接又はリンカ−基を介して互いに共有結合できる。成分間の 直接反応は、各々が他と反応できる置換基を有するときに可能である。例えば、 −成分についてのアミノ又はスルフヒドリル基等の核性基は、他成分についての 無水物若しくはアシルハライド等のカルボニル含有基と反応できるか、脱離基、 例えば、ハライド、を含有するアルキル基と反応できる。

リンカ−基を介して成分を共有結合することが望ましいことがある。リンカ−基 は、置換基の化学的反応性を増加することによって結合効率を増加する役割を果 たす。化学反応性の増加によっても、使用ができない成分での官能基の使用が容 易になる。例えば、カルボキシル基を活性化することかできる。カルボキシル基 の活性には、スクシンイミンルエステル等の「活性エステル」の形成が含まれる 。

用語「活性エステルＪは請求核性置換基反応において非常に反応性が高いエステ ル類を意味することか知られている。

また、成分が非共有的に結合している複合体を製造することか望ましいことがあ る。例えば、一種以上のＴＡＣＡをグリコスフィンゴリピド（ＧＳＬ）リポソー ムの外表面に組み込むことができる。

オリゴ糖の生体内半減期を増加することが望ましいことがある。

本発明で開示されているように、オリゴ糖を、ポリエチレングリコール等の直鎖 両性ポリマーに結合（即ち、共存結合）できる。オリゴ糖−ポリエチレングリコ ール複合体の製造方法の代表例は、スクノンイミンル基を含有するように誘導し たオリゴ糖と、末端アミノ基を有するポリエチレングリコールとを反応させるこ とである。後者の化合物は、一般式Ｎ）４．−（ＣＨ，−ＣＨ２−０）ｎ−ＣＨ 。

（式中、ｎは、典型的には平均４４．７（即ち、分子量約２，０００）〜１１２ ．９（即ち、分子量約５，０００）で表される。

さらに、セレクチン類、ＥＬＡＭ−１又はＧＭＰ　１４０．が介在する細胞接着 は、セレクチン分子のＮ−末端領域に存在するレクチン配列領域によるシアリル 化及びフコノル化ラクトシリーズ１型及び２型鎖の認識に基ついているので、天 然エピトープよりも効果的なレクチン領域のブロッキング活性を示すことがある いずれの構造も、本発明に有効である。天然エピトープの表面構造に類似してい るが炭水化物依存接着よりもよいブロック活性を示すこのような非天然合成化合 物、例えば、シアロンルーＬｅ’又はシアロシル−Ｌｅ’ｌ若しくは同の「擬態 物」と称せられるこのような非天然合成化合物か考えられる。

有用な擬態物としては、例えば、トリフルオロ−し−フコース、Ｎ、−１−リフ ルオロ−アセチル−グルコサミン又は天然シアロンルー１、ｅ′、モノノアロン ルーＬｅ’　Ｉ及び１１に見られるのと同じ距離及び空間位置にノアル酸類似体 及びフコース類似体を有する複素環若しくは芳香族環構造、又はトリフルオロ− Ｌ−フコース、Ｎ−トリフルオロ−アセチル−グルコサミン若しはＮ−１−リフ ルオロ−アセチル−ノイラミン酸を含有する／アロツルーＴｎ類似体を有するＨ ／Ｌｅ’／Ｌｅｌ′構造を有するシアロシル−Ｌｅ’又はモノシアロンルーＬｅ ’　Ｉ若しくはＩＩが挙げられるが、これらには限定されない。

したがって、天然エピトープよりも効率的に腫瘍関連炭水化物をを介する細胞接 着をブロックする変性炭水化物エピトープ又は炭水化物エピトープの表面構造に 類似している他の「擬態物Ｊは、本発明の範囲内である。

腫瘍細胞の転移性及びＧＭＰ−１４０介在若しくはＥＬＡＭ−１介在細胞集合又 は接着の抑制は、生体外及び生体内で、例えば、単離腫瘍細胞の処理又は腫瘍担 持宿主及びＧＭＰ−１４０又はＥＬＡＮｌ−１が関与する疾病プロセスの処理に 多種多様に使用される。

上記のように、生体外に関して、本発明により、生物試料内での腫瘍細胞転移性 を抑制する方法が提供される。この方法は、生物試料を、（ａ）異なる予後有意 性を示す腫瘍関連炭水化物抗原、（ｂ）上記抗原に特異的に結合する抗体、（Ｃ ）上記抗原のオリゴ糖成分、（ｄ）上記抗原又はオリゴ糖成分の複合体及び（ｅ ）腫瘍関連炭水化物抗原の擬態物からなる群から選択される試料の転移性を抑制 する少なくとも一種の薬剤とともにインキュベーションすることを含んでなる。

さらに生体外に関して、本発明により、生物試料におけるＧＭＰ−１４０介在若 しくはＥＬＡＭ−１介在細胞の集合又は接着を抑制する方法も提供される。本方 法は、生物試料を、（ａ）Ｌｅ’／ＳＬ　ｅ“等のハイブリッド糖；　（ｂ）Ｌ ｅ’及びＳＬｅ”等のハイブリッド糖（ａ）の糖成分：　（Ｃ）モノシアロシル −Ｌｅ’　ｌ　Ｌｅｏ、Ｌｅ’、モノシアロシル−Ｌｅｏ　ＩＩ、ンシアロシル ーＬｅ’又はシアロシル■、ｅ’　：　（ｄ）Ｌｅ’　／ＳＬｅ’等のノーイブ リッド糖又はその成分糖類、モノノアロンルーＬｅ’　Ｉ、Ｌｅ’　、Ｌｅ’、 モノシアロシル−Ｌｅ”　ＩＩ、ジンアロンルーＬｅ’若しくはシアロシルＬｅ ’に特異的に結合する抗体；　（ｅ）Ｌｅ”　／ＳＬｅ’等のハイブリッド糖、 モノシアロンルーＬｅ’　ｌ　Ｌｅ’　、Ｌｅ’、モノシアロシル−Ｌｅ’ｌｌ 、シソアロシル−Ｌｅ’又はシアロシルＬｅ’のオリゴ糖成分；　（ｆ）Ｌｅ” 　／ＳＬｅ’等の／１イブリッド糖、モノシアロシル−Ｌｅ’　Ｉ、Ｌｅ’　、 Ｌｅ”、モノシアロシル−Ｌｅ’ｌｌ、シソアロシル−Ｌｅ”若しくはシアロシ ルＬｅ’の複合体またはオリゴ糖成分の複合体：並びに（ｇ）ＳＬｅ’／Ｌｅ′ 等のハイブリッド糖、モノシアロシル−Ｌｅ’　１．Ｌｅ’　、Ｌｅ　ｆ、モノ シアロシル−Ｌｅ’ｌｌ、ジンアロシルーＬｅ′又はシアロシルＬ　ｅ　’の擬 態物からなる群から選択される細胞集合又は接着を抑制する少なくとも一種の薬 剤とともにインキュベーションすることを含んでなる。

適当な生物試料には、血液、尿、リンパ液、滑液及び髄液等の生体液における細 胞培養及び細胞懸濁液が挙げられる。ＴＡＣＡ、オリゴ糖又はその複合体は、一 般的に最終濃度約０．　１〜ＩＭ、典型的に約０．　２〜０．５Ｍでインキュベ ーションされる。インキュベーションは、典型的には３７°Ｃて５〜１５分間行 う。生物試料の処理後、この試料を、動物に注射するか移植して、例えば、転移 性の抑制効果を確認する。

また、本発明によれば、ヒト等の温血動物において腫瘍細胞転移性を抑制する方 法が提供される。本方法は、温血動物に、（ａ）異なる予後有意性を示す腫瘍関 連炭水化物抗原、（ｂ）上記抗原に特異的に結合する抗体、（ｃ）上記抗原のオ リゴ糖成分、（ｄ）上記抗原又はオリゴ糖成分の複合体及び（ｅ）モノシアロン ルーＬｅ“■、Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、モノシアロンルーＬｅ’ｌｌ、シソアロシ ル−Ｌ　ｅ　’又はシアロシルＬｅ’の擬態物からなる群から選択される試料の 転移性を抑制する効果的な量の少なくとも一種の薬剤を投与することを含んでな る。

同様に、本発明により、温血動物における腫瘍部位でのＧＭＰ−１４０介在若し くはＥＬＡＭ−１介在細胞集合又は接着を抑制する方法も提供される。本方法は 、温血動物に、（ａ）Ｌｅ”　／ＳＬｅ’等のハイブリッド糖：　（ｂ）Ｌｅ’ 及びＳＬｅ”等のノ＼イブｉルノド糖（ａ）の成分糖類、（Ｃ）モノシアロシル −Ｌｅ”　Ｉ、Ｌｅ”、Ｌｅ’　、モノシアロンルーＬｅ”　ＩＩ、ジンアロシ ルーＬｅ”又はシアロシルＬｅ’　；　（ｄ）Ｌｅ”　／ＳＬｅ’等のハイブリ ッド糖、モノシアロシル−Ｌｅ’　Ｌ　Ｌｅ’　、Ｌｅ”　、モノシアロシル− Ｌｅ“　ＩＩ、ジンアロシル−Ｌｅ’又はシアロシルＬｅ’に特異的に結合する 抗体；　（ｅ）Ｌｅ’　／ＳＬｅ’糖のハイブリツド糖、モノシアロンルーＬｅ ″　１１モノシアロンルーＬｅ’　Ｉ　ｌ５Ｌｅ’　、Ｌｅｏ、シソアロシル− Ｌｅ’又はシアロシルＬｅ”のオリゴ糖成分；　（ｆ）Ｌｅ’　／ＳＬｅ’等の ノーイブリッド糖、モノシアロシル−Ｌｅ’　Ｌ　Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、モノシ アロシル−Ｌｅ’ｌｌ、ジンアロシル−Ｌｅ’若しくはシアロシルＬｅ’の複合 体又はオリゴ糖成分の複合体、並びに（ｇ）Ｌｅ’　／ＳＬｅ”等の／’ｌイブ 肝ソドノドモノシアロシルーＬｅ’　ｌ５Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、モノシアロシル −Ｌｅ’ｌｌ、ジンアロンルーＬｅ’又はシアロシルＬｅ’の擬態物からなる群 から選択される温血動物における腫瘍部位での転移性を減少する効果的な量の少 なくとも一種の薬剤を投与することを含んでなる。

また、本発明によれば、混血動物における炎症部位でのＧＭＰ−１４０介在細胞 集合又は接着を抑制する方法が提供される。

本方法は、温血動物に、（ａ）Ｌｅ’　／ＳＬｅ’等のノ１イブ―Ｊ　ノド糖； 　（ｂ）Ｌｅ”及びＳＬｅ’等の／％イブリ・ノド糖（ａ）の成分糖類；　（Ｃ ）モノシアロシル−Ｌｅ”　■、Ｌｅｏ、Ｌｅ”、モノシアロシル−Ｌｅ’ｌＩ 、ジノアロンルーＬｅ’又（まシアロシルＬ　ｅ　’＋　（ｄ）Ｌｅ’　／ＳＬ ｅ’等のハイブリツド糖、モノシアロシル−Ｌｅ’　Ｉ、Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、 モノシアロシル−Ｌｅ’ｌｌ、ジンアロシルーＬｅ“またはシアロシルＬｅ’に 特異的に結合する抗体。

（ｅ）Ｌｅ’　／ＳＬｅ°等の７１イブ１ルソド糖、モノシアロシル−Ｌｅ’　 ｌ　Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、モノシアロシル−Ｌｅ’ｌｌ、シソアロシル−Ｌｅ’ またはシアロシルＬ　ｅ　’のオリゴ糖成分＋（ｆ）Ｓｌ−ｅ’／Ｌｅ’等のハ イブリツド糖、モノシアロシル−しＣ′　Ｉ、Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、モノシアロ シル−Ｌｅ’１１、ンシアロンル−１−　ｅ　’若しくはシアロシルＬｅ’の複 合体又はオリゴ糖成分の複合体、並びに（ｇ）Ｌｅ’　／ＳＬｅ’等のノ＼イブ １ルノド糖、モノシアロシル−Ｌｅ’　ｉ　Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、モノノアロシ ルーＬｅ’ｌ＋、ジンアロツルーＬｅ’又はシアロシルＬｅ’の擬態物力１らな る群カ）ら選択される温血動物における炎症部位での炎症性を減少する効果ｔ４ ′］ｆ、；量の少なくとも一種の薬剤を投与することを含んでなる。

両方法の場合、ＴＡＣＡオリゴ糖又はそれらの複合体を、一般ｉノに約０．１〜 ＩＭの濃度、典型的には約０．　２〜０．５Ｍの濃度で投与する。例えば、非ヒ ト動物における生体外及び生体内研究（こ基ついて特定の物質に最適投与量を決 定する方法は、当業者（こ（よ明らかであろう。投与は、多種多様な経路で行う ことができる。典型Ｖ）には、例えば、胸膜若しくは腹膜腔、切除した腫瘍の床 又Ｇよ炎症部位に、静脈内又は体腔内投与を行う。

上記て述べたＴＡＣＡ、抗体、オリゴ糖又は誘導体を、薬学ｖＢこ・　許容され る担体又は生理食塩水等の希釈剤と組み合わせて投与する。

さらに、転移性を抑制又は減少する薬剤は、免疫療法又は化学療法物質と組み合 わせて投与され、炎症性を減少する薬剤は、抗炎症物質と組み合わせて投与する ことができる。

このような薬剤及び物質の組み合わせが望ましいときには、各化合物は、順次、 同時又は組み合わせて投与し、且つ単一組成物として投与できる。投与前及び投 与後にＣＡＴスキャン等の診断を行って、転移性又は炎症性の抑制の効果を確認 できる。

他の細胞（例えば、ＥＣ）への腫瘍細胞の接着若しくは集合の測定又は接着若し くは集合の抑制がうまくいったことを確認する一つの生体外系は、Ｍ、Ｂ、Ｌａ ｗｒｅｎｃｅ等（ＢＩｏｏｄ７０　：　１２８４、Ｉ　９８７）により記載され 、そして第１１Ａ図、第１１Ｂ１第１１Ｃ図及び第１１Ｄ図に示されているのと 類似の動的流れ系である。

平行板層流チャンバー（１）（便宜上さかさまに示しである）を管（１８）を介 して圧力ポンプ（２）に接続して使用して、微小血管環境に存在する流動剪断応 力のシュミレーンヨンを行う。フローチャンバーは、平行透明プラスチック表面 （４）をゴム又はノリコーンガスケット（５）を用いて固定したチャンバー本体 （１６）に載置したプラスチック又はガラスカバースリップ（３）からなり；２ つの表面間に１１４μｍの間隙があり、この間隙は、入口マニホールド（８）に 接続した人口スロット（６）及び出口マニホールド（１９）に接続した出口スロ ット（７）に接続されている（第１１Ａ図）。既知の流量及び壁剪断応力を有す る層流は、管（１８）を介してフローチャンバーの入口マニホールド（８）に接 続した圧力ポンプ（２）の操作によって達成される。第１１Ｂ図は、フローチャ ンバーの組立体（１）の構成を示す。

カバースリップ（３）とチャンバー本体（１６）とを非常に緊密に一緒に固定す るために、チャンバー本体（１６）の周囲に連続円形溝空間（２０）がある。円 形溝空間は、上にカバースリップ（３）を有するゴム又はノリコーンゴムガスケ ント（５）を配置することにより真空ポンプに接続している。（、たがって、（ ２０）に真空（２１）をかけることにより、カバースリップ（３）とチャンバー 本体（１Ｇ）は、強力に固定され動かなくなる。チャンバー本体（１６）におり る薄い入口及び出口スロットは、それぞれ入口及び出口マニホールドに解放して いる。出口マニホールドは、圧力ボンブ（２）に接続されている。圧力ボンブは 、負モード又は正モードで運転できる。

細胞（例えば、内皮細胞）はガラス又はプラスチックカバースリップ（３）上で 成長するか、種々の接着分子が（３）に付着し、そして培地中の腫瘍細胞懸濁液 は、入ロマニボールド（１６）から出口マニホールド（１９）に流れる。第１１ Ｂ図におけるフローチャンバー（１）は、便宜上さかさまに示されている。チャ ンバーを、右側を上にして倒立顕微鏡ステージ下（第１１Ｃ図）に配置し、細胞 層（例えば、内皮細胞層）上の腫瘍細胞の流れを、顕微鏡で観察する。腫瘍細胞 の観察されるローリングと停止のパターン（即ち、接着のパターン）は、ビデオ テープて記録てきる。

第１１ｃ図において、カバースリップ（３）上に、細胞（９）は単層として成長 するか、接着分子が１寸着し、そして水浴（１７）の容器に保持されている腫瘍 細胞懸濁液（Ｉ４）の層流は、管（１８）を介してチャンバーを通過する。細胞 の動きは、逆相コントラスト顕微鏡（ｌＯ）で観察し、ビデオカメラ（１２）と デジタルイメーノプロセッサー（Ｉ３）を用いて時間差ビデオカセットレコーダ ー（１１）で記録する。接着は、ローリング後細胞を停止して観察する。異なる 剪断応力、例えば、０．４〜４８ダイン／　ｃ　ｍ　”で、設定時間（例えば、 ３分間）に結合した細胞数を、ビデオテープに（記録したいくつかのフィールド からカラン［・する（第１１　Ｂ図）。

壁剪断応力（Ｔ）を、３μＱ／２ｂａ２　（式中、μ＝粘度係数、例えば、１． ＯｃＰ、Ｑ−容積流ｊｌ（ｃｍ”／′秒）、ａ−半チヤンネル高さ、例えば、５ ．７ｘｌＯ’　ｃｍ及びｂ＝チャンネル幅、例えば、］、３３ｃｍとして算出す る。

第１．１．　Ｉ）図は、−表面に内皮細胞（９）を塗布したチャンバーを介した 腫瘍細胞懸濁液（１４）の層流である。ローリング又は停止細胞（１５）を、」 二記したよ・うに倒立顕微鏡で観察し、ビデオテープに記録する。矢印は、腫瘍 細胞懸濁液（１４）の流れの方向を示す。

上記したように、本発明によれば、ＧＭＰ−−１４０等のセレクチンのレクチン 活性が指向するＴＡＣＡエピトープを同定する方法が提供される。

以前、Ｔ　Ａ　ＣＡユービトープは、活性化血小板を塗布した固相（例えば、プ ラスチック表面）に対する血液細胞又は腫瘍細胞の接着についての種々のグリコ スフィンゴリピド（ＧＳＬ）、ＧＳＬオリゴ糖又はＧＳＬ含有リポソームの抑制 効果に基づいて検討された。実際には、固相をゼラチンで塗布した後活性化血小 板を塗布した：血小板は、主要な血小板インテグリンリセブターであるＧｐＨｂ ／１１１ａを介してゼラチン塗布固相に容易に結合する。

この方法を用いた研究では一血小板塗布固相に対する前骨髄球白血病１（１，、 ６０細胞の結合は、ノアロンルーＬｅ’決定基を含有するリポソームにより抑制 されたが、シアロノルバラグロボシド（ＳＰＧ）を含有するリポソームによって は抑制されず、そしてα１→３フコンル化２型鎖（Ｌｅ’）を含有するリポソー ムによっては若干抑制されただけだった（以下の実施例３の表１参照）。これら の結果は、シアロンルーＬｅ’はＧＭＰ−１４０により確認される炭水化物エピ トープであることを示唆するものであった（Ｐｏｌｌｅｙ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、米国８８：６２２４、＋９９１）。

しかしながら、上記した方法は、ｌ車路ＧＳＬのみを発現する細胞系が入手てき ないという重大な制限があった。骨髄性細胞系ＨＬ６０及び単球性細胞系Ｕ９３ ７は、専ら２型鎖を発現し、もしあったとしても１型鎖はほとんど発現しない。

一方、結腸癌、胃癌又は肺癌由来の全ての公知のヒト腫瘍細胞系は、１型鎖と２ 型鎖の両方を発現する。これらの理由から、ＧＭＰ−１４０が結合する真のエピ トープを決定することは困難である。この問題に対処するために、下記する新規 な方法か開発された。

螢光プラスチック（例えば、ポリスチレン）ビーズ（直径約０゜５μｍ）にＧＳ Ｌを塗布する。ＧＳＬは、上記ビーズに強ノｊに吸着され、そのため特異的ＧＳ Ｌを含有する螢光プローブを構成できることが知られている。血小板（活性化又 は非活性化）を上記ＧＳＬ塗布ヒービーともにインキュベーンコン後、フローサ イトメトリーにより血小板螢光強度を測定する。

この方法を用いて、活性化血小板は、関連ＧＳＬを塗布したビーズに対してより もモノンアロンルーＬｅ″　■　（第３図参照）を塗布した螢光ビーズに対する 結合がはるかに強力であることが判明した。

ノアロンルーＬｅ’塗布ビーズに対する血小板の結合は、抗−ＧＭＰ−１４０モ ノクローナル抗体又は抗−ノアロンル＝Ｌｅ’モノクローナル抗体により抑制さ れたが、抗−シアロシル−Ｌｅ’″モノクローナル抗体によっては抑制されなか った。ノアロシルーＬｅ’塗布ビーズに対する活性化血小板の結合は観察された が、結合レベルは、シアロシル−Ｌｅ”塗布ビーズに対する結合よりもはるかに 低かった。これらの結果は、ＧＭＰ−１４０により確認される主要なエピトープ 構造はシアロシル−Ｌｅ’ではなくシアロンルーＬ　ｅ　’であることを示して いる。

勿論、ＧＭＰ−１４０等のセレクチンにより確認される他のエピトープ構造は、 本発明の方法を用いて同定できる。

Ｅ　Ｌ　Ａ　Ｍ〜Ｉ　（Ｅ−セレクチン）は、活性化内皮細胞の表面で発現され る。Ｅ　Ｌ　Ａ　Ｍ　−１は、アミノ末端領域に炭水化物結合ドメインを有し、 実際に、ＥＬＡＭ−１はＳ　Ｉ−ｅ　’及びＳＬｅ’を結合することか知られて いる。

これらの結論は、活性化ヒトＥＣに対する腫瘍細胞又は白血球間の接着は、ＳＬ ｅ’糖脂質又はオリゴ糖により抑制されるが、そのときに入手できた他の試験糖 脂質又はオリゴ糖によっては抑制されなかったという観察結果に基ついている（ Ｐｂｉｌｌｊｐｓ等、５ｃｉｅｎｃｅ２５０　：１１３０、］　Ｉ９９０）　。

後に、上記した接着は、ＳＬｅ’糖脂質の位置異性体であるＳ　Ｌ　ｅ″　Ｉに よっても抑制されることが判明した（Ｂｅｒｇ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２６６　：　］　Ｉ４６９．１９９１　；Ｔａｋａｄａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　、１８９　ニア１３．１９９１）。

接着反応は、ｒｇｃ；８抗−３Ｌｅ’ｍＡｂによって抑制されるとされた（上記 Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ等）。しかしながら、ＳＬｅ”とＳＬ　ｅ　’に関連する他の 構造変異体及びそれらの変異体に対するｍＡｂがあり、仮定のエピトープ構造体 によるセレクチン依存接着の抑制に基づく研究報告がなされている。

本発明は、静的及び動的環境下のセレクチン依存接着についての体系的研究の結 果なされたものである。例えば、用いた方法には、（ｉ）ＩＬ−１−活性化ヒト さい帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に対する腫瘍細胞の接着＋（ｉｉ）例えば、組み 換えＥＬＡＭ−１を用いることによる、Ｅ−セレクチン塗布固体支持体に対する 腫瘍細胞の接着；（ｉｉｉ）活性化血小板又はＰ−セレクチン若しくはＥ−セレ クヂンを発現するＨ　Ｕ　Ｖ　Ｅ　Ｃを有するグリコリポソームを塗布した螢光 粒状固体支持体の接着；及び（ｉｖ）Ｅ−セレクチンをコードする配列を形質移 入し、グリコリポソームを塗布したプレートてＥ−セレクチンを永久に発現する Ｎ５−１骨髄腫細胞の接着が含まれる。

したがって、システム（ｉ）、（ｉ　ｉ）及び（ｉｉｉ）を用いて、ＳＬｅ’　 、ＳＬｅ’　Ｌ　ＳＬｅ’　ＩＬ　Ｌｃ’　、Ｌｅ’及び関連構造体に対する種 々のｍＡｂ；上記ｍＡｂの組み合わせ；種々の基質特異性を有するノアリダーゼ 、又は種々の／アリダーゼとｍＡｂの組み合わせの接着についての影響を評価し た。（ｉｖ）の方法を用いて、動的条件下での接着強度を比較した。

具体的には、本発明は、内部シアロンルー基又は分岐構造によって特徴づけられ る下式（１）、（Ｉ　Ｉ）及び（Ｉ　Ｉ　Ｉ）によって表される炭水化物に関す る。

式（Ｉ）は、内部α２→６ンアロシル置換及びα１→４フコシル置換を有するＩ 型又は延長ｌ車路に関する。

式（Ｉ）において、Ｒ３はα２→３結合におけるＨ又はノアリル酸残基であり： ＲＩはＨ又はα２→６結合におけるシアリル酸残基であり：ｎは０以上であり、 そしてＲ８はＨ又はα１→４結合におけるフコシル残基である。

式（ＩＩ）は、内部ノアロンル及びフコシル置換を有する２型鎖構造に関する。

式（Ｉ　Ｉ）において、Ｒ７は式Ｉに関して定義した通りであり、Ｒ，はＨ又は αｌ→３結合におけるフコシル残基であり、ＲｉはＩ］、α２→３結合における シアリル酸残基、α２→３結合におけるＮｅｕＡｃα２−＋８ＮｅｕＡｃ又はα ２→３結合におけるＲ　ｓ　→Ｎ　ｅ　ｕＡｃである。式中、Ｒ６は／アリル酸 残基以外の一種以上の糖類であり、ｎは０以上である。

式（ＩＩＩ）は、分岐を含んでなるハイブリッド分子である２型鎖構造に関する 。この各分岐は、本明細書で開示される単一炭水化物抗原のエピトープを含んで なる。したがって、ここで使用されるハイブリッド分子は、必ずしもハイブリッ ドを含んでなる２種の成分糖類全体を含んでいない。その代わり、ハイプリント は、成分糖類のエピトープを含んでなる。したがって、第２０因において、構造 ｌは、Ｌｅ’及びＳＬｅ”のエピトープを含んでなるが、以下で述べる種々の糖 類の構造の概略図から明らかなように、Ｌｅ”又はＳＬｅ’分子の全てが、ハイ ブリッドにあるわけではない。ハイブリッドのＳＬｅ’部に関して、無傷ＳＬｅ ”分子の結合したフコシル及びシアリル酸残基と一緒に末端ガラクトース及びグ ルコサミンのみが、ハイブリッドを含んでなる。同様に、Ｌｅ”に関して、末端 に３個の糖残基を生じるエピトープのみが、ノλイブ１ルノドを含んでなる。こ こで使用されるエピトープは、接着現象で相互作用する糖の部分である。

式ＩＩＩにおいて、Ｒ１゜及びＲ１１の各々はガラクトース、Ｇａｌβｌ→４Ｇ ］ｃＮＡｃ又はＧａｌβ−３ＧＩｃＮＡｃを含んでなり、Ｒ１はＧａｌ又はＧａ １ＮＡｃを含んでなり、そしてＲ１はラクトシルセラミド又はＯ結合糖を含んで なる。さらに、Ｒ１゜及びＲ１１はフコシル及びシアリル酸残基を含んでなるこ とができる。７％イブリッド構造は、それらに含まれているそれぞれのエピトー プにより同定される。したがって、第２０図の構造１は、ＳＬｅ”／Ｌｅ°又は Ｌｅ’／ＳＬｅ”と表示される。

式Ｉは、専ら１型鎖、即ち、Ｇａｌβｌ→３Ｇ］ｃＮＡｃβ１→３Ｇａ　Ｉ、そ の反復体及びその置換体を発現する腫瘍細胞（例えば、Ｃｏ１ｏ２０１細胞）の Ｅ−セレクチン依存接着の種々のｍＡｂ及びノアリダーゼ並びにそれらの組み合 わせによる抑制に基づくものである。Ｃｏ１ｏ２０１細胞のＥ−セレクチン依存 接着のｍＡｂＣＡ１９−９（ＳＬｅ”に対する）による抑制は最小であったが、 ｍＡｂＦＨ７（ジンアロシルＬｅ″及びモノシアロンルＬｅ″　ＩＩに対する） は中程度に抑制した。Ｃｏ１ｏ２０１接着は、ｍＡｂＣＡ３Ｆ４　（モノノアロ ンルＬｅ“　ＩＩ及びＬｅ”に対する）又はＣＡ１９−９＋ＣＡ３Ｆ４の組み合 わせにより最も強力に抑制された。

ＦＨ７とジンアロシルＬｅ’及びモノノアロンルＬｅ’ｌｌとの特異的反応性並 びにＣＡ３Ｆ４とモノンアロノルＬ　ｅ″　ＩＩとの特異的反応性は、既に記載 されている（Ｎｕｄｅｌｍａｎ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６１　：５ ４８７．１９８Ｇ）。

エピトープ構造について、以下の考察に基ついてさらに明らかとなった。Ｃｏ１ ｏ２０１細胞をＮｅｕＡｃα２−＋３０ａ！　（式ＩにおけるＲ、）を開裂する ニューカフスル病ウィルス（Ｎ　Ｄ　Ｖ）ノアリダーゼで処理すると、Ｅ−セレ クチン依存接着がわずかに抑制されたが、アルトロバクターウレアファシェンス （図面においてＡＵ又はＡＶとも示されている）又はビブリオコレラ菌（ＶＣ） ノアリダーゼ（両方ともＧｌｃＮＡｃ又はＧａｌに対するＮｅｕＡｃα２−６結 合（即ち、式ＩにおけるＲ、）を開裂する）での処理により、このような接着か 完全に抑制された。したがって、接着に内部２→６ノアロンル化構造か関与して いることは明らかである。ＮＤＶシアリダーゼは、ｍＡｂｃＡ１９−９又はＣＡ ３Ｆ４と組み合わせにおいて、接着を強力に抑制した。上記結果は、本明細書に 記載の静的系及び動的系の両方において得られた。

しかしながら、より厳密に生理的条件をシュミレートする動的流れ系で明らかに されるように、セレクチン類の結合動力学はビブラントてあり、即ち、例えば、 白血球又は腫瘍細胞は、大きな非閉塞小容器ではかなりの速度で動き、閉塞容器 及び組織空間ではより遅い速度で動くことができる。静的条件下では、細胞相互 作用には、共通の特性を共有する第一の一連の分子との相互作用が介在し、非静 的条件下では、細胞相互作用は、第一の一連の分子により共有されるものとは異 なる共通の特性を共有する第２の一連の分子との相互作用か介在する。さらに、 非静的条件下では、結合用件は、細胞か移動する速度により異なる。

例えば、ＨＬ　６０細胞のＥ−セレクチン（ＥＬＡＭ）介在接着は、細胞か静的 又は遅い移動設定において反応するとき、又は細胞か迅速に移動する設定で反応 するとき、炭水化物構造によって異なる。

静的又は低剪断条件下では、ＥＬＡＭは、ＳＬｅ’等のα２→３ノアリル化及び α１−３フコノル化構造に優先的に結合し、一方、高剪断条件下ては、ＥＬＡＭ は、Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、Ｈ等の他の構造及びＬｅ’／ＳＬｅ”等の種々のハイ ブリッド構造に優先的に結合する。

式１１は、種々のｍＡｂ及びノアリダーゼ並びにそれらの組み合わせによる、２ 型鎖のみ、即ち、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβｌ−＋：３Ｇａｌ及びその反復 体及びそれらの置換体を発現する１（Ｌ６０腫瘍細胞のＥ−セレクチン依存接着 の抑制に基つくものである。ＨＬ６０細胞をＮｅｕＡｃα２−＋３Ｇａｌ　（式 ＩＩにおけるＲ、）を開裂するＮＤＶンアリダーゼで処理すると、細胞がＥ−セ レクチン塗布プレート及び活性化ＥＣに強力に接着したままであったが、細胞と 抗−８Ｌｅ’　ｍＡｂとの反応性が完全に消失した。Ｅ−セレクチン又はＥＣへ の接着を完全に抑制するには、ＧＩｃＮＡｃ又はＧａ１に結合したＮｅｕＡｃα ２−＋６（即ち、式ＩＩに示したＮｅｕ、Ａ　ｃα２→６の他に式ＩＩにおける Ｒ２）を開裂するＡＵ又はＶＣノアリダーゼでの処理が必要であった。Ｒ６基は 、ＡＵ及びＶＣソアリダーゼによって開裂されやすいが、ＮＤＶンアリダーゼに よっては開裂されない。

式ＩＩについては、Ｅ−セレクチン依存ＨＬ６０細胞接着に及はす種々のｍＡｂ の影響を観察することによりさらに明らかとなった。

接着は、ＮＤＶンアリダーゼと抗−Ｌｅ’　ｍＡｂｓＨｌとの組み合わせ又は抗 −８Ｌｅ’　ｍＡｂＳＮＨ４とＳＨＩとの組み合わせにより強力に抑制された。

構造ＩＩＩの化合物の関連性を、２型鎖糖類を発現する腫瘍細胞のＥ−セレクチ ン依存接着について種々のｍＡｂ及びノアリダーゼを使用するてけてなく、グリ コリポソームへのＥ−セレクチン形質移入Ｎ５−１細胞接着も用いて演鐸した。

例えば、ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌを除去するＨ　Ｉ−−６０細胞のＮＤＶンア リダーゼ処理により、細胞はＥ−セレクチンプレート及び活性化内皮細胞に接着 したままであったが、細胞と抗−３Ｌｅ’ｍＡｂとの反応性が完全に消失した。

接着は、Ｌｅ’とＳＬｅ’に対するｍＡｂの組み合わせて効果的に抑制された。

内部シアロンル化構造が公知である１型構造（上記Ｎｕｄｅｌｍａｎ等）とは異 なり、内部ノアリル酸残基を有する２型鎖構造はいままで知られていなかった。

本出願で示されるデータは、上記エビＩ・−ブの自然発生を示している。

Ｅｌ、ＡＭ−１に結合可能な構造は、公知の手法を用いて合成できる。例えば、 炭水化物は、公知及び市販の試薬を用いて化学的に合成するか、公知及び入手可 能な酵素を用いて適当な結合を行うことにより合成できる。例えば、公知のノア ロンル転移酵素及びフコンル転移酵素を用いて、炭水化物の基本主鎖を誘導する ことができる。

また、ＥＬＡＭ−１に結合可能な炭水化物類は、吸着剤としてＥＬＡＭ−１を用 いて単離−Ｃきる。例えば、精製ＥＬＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１を発現する細胞又 はＥＬＡＭ−１を発現する細胞の膜試月を使用できる。ＥＬＡＭＩを不活性ビー ズマトリックス又は容器の内壁等の固相に固定化して、分離性を高めることがで きる。次に、公知の手法により得られるＨ　Ｌ　６０又はＣｏ１ｏ２０１細胞の 抽出物等のＥＬＡＭ　Ｉに結合可能な適当な炭水化物を、ＥＬＡ、Ｍ−１親和性 ７トリックスに暴露する。洗浄して望ましくなく且つ非特異的に結合した成分を 除去した後、ＥＬＡＭ−１とそれに結合可能な炭水化物を一緒に採取する。ＥＬ ＡＭ−１に結合した炭水化物類をＥＬＡＭ−１から、例えば、保持緩衝液の塩濃 度を変えることにより分離し、採取する。種々の炭水化物種を、クロマトグラフ ィー等の公知の手順を用いて識別できる。

また、主に１型鎖構造又は２型鎖構造を発現することが知られている細胞を増殖 し、そこから公知の手法により膜試料を得る。膜試料の糖脂質及び糖タンパク質 分画を、公知の手法を用いて得、アフィニティーカラムにかけて、本明細書に記 載するような炭水化物エピトープに対する抗体をアガロースビーズ等のマトリッ クスに固定してアフィニティーマトリックスを形成する。アフィニティークロマ トグラフィー操作において、さらにＨＬ　Ｐ　Ｃ及びＴＬＣ等の公知の手法によ り結合した物質を溶出し分離する。

Ｔ　１．　Ｃを使用するとき、分離媒体に分離した分子を、標識されタグとして の役割を果たすＥＬＡＭ−１発現細胞に暴露できる。即ち、　゛細胞を、放射性 同位元素を用いて代謝的に標識できる。ＥＬＡＭ−１発現細胞は、分離したＥＬ ＡＩＶＩ−１エピトープ類が見出される分離媒体のそれぞれの位置に結合する。

Ｔ　Ｌ　Ｃマトリックスをオートラジオグラフィーにかけて細胞結合部位の位置 を見つけ、ＥＬＡＭ−１工ピトープ担持分子を同定する。ＴＬＣマトリックスの それぞれの部位を切除し、分子を抽出できる。

上記したように、式Ｉ及び■１の炭水化物を誘導して、より望ましい治療特性を 有するオリゴ糖類を提供できる。したがって、式Ｉ又はＩＩを含んでなる構造の 一部分は、例えば、イオウ含有糖類又はフッ素含有糖類で置換できる。オリゴ糖 誘導体は、天然成分の代わりに、式ＩかＩＩにフコース残基として組み込まれる ６−トリフルオローフコシル等の変性置換基を含んでなる適当な試薬を用いるこ と以外は、上記で開示した方法を用いて調製できる。

ＥＬＡＭ−１に結合可能な炭水化物は、免疫抗原として使用してＥＬＡＭ−１に 結合可能な炭水化物に結合可能な抗体を得ることができる。上記で説明した方法 及び本明細書で引用している文献（引用することにより本明細書に組み込まれる ）に記載されている方法等の方法を用いて、ポリクローナル抗体又はモノクロー ナル抗体を生成できる。モノクローナル抗体が好ましい。

ＥＬＡＭ−１は細胞間相互作用に介在する役割を果たすことかあるので、Ｅ　Ｌ 　Ａ　Ｍ−１とそれに結合可能な炭水化物類との間の結合の遮断か有益であろう 。したがって、例えば、ＥＬＡＭ−１に結合可能な炭水化物類、ＥＬＡＭ−１， ＥＬＡＭ−１に対する抗体又はＥ　Ｌ　Ａ〜１−１に結合可能な炭水化物類に対 する抗体を使用して、ＥＬＡＭ−１とそれに結合可能な炭水化物類との間の結合 を遮断てきる。ＥＬＡｌｖｌ−１に結合可能な炭水化物類、ＥＬＡＭ−１，ＥＬ ＡＭ−１に対する抗体又はＥｌ、Ａ　Ｍ　＝’　１に結合可能な炭水化物類に対 する抗体を、治療に効果的な量で、容易且つ日常的に実施している製薬分野にお いて確定した方法である経路を介して投与される。

式（１）及び（ＩＩ）について述へたように、末端シアリル酸は、ＥＬＡＩＶＩ −］に結合可能な炭水化物では必須ではない。共通に保持される主要要素は、末 端ガラクトース、グルコサミン、α２→６シアリル酸及びフコース残基である。

したがって、このような構造に結合できる抗体は、ＥＬＡ〜１−１介在相互作用 を抑制するのに効果的である。適当な抗体は、ＣＡ３ＦＡ及びＦＨ７である。

関連エピトープが分岐鎖構造を含んでなる式（Ｉ　Ｉ　１）の化合物、例えば、 Ｌｅ’／ＳＬｅ’は、高剪断窓ノＪ条件下てＥＬＡＭ−１に対する高アフィニテ ィー結合部位を含んでなることが明瞭に確認された。しかしながら、そのような 構造体は、低剪断応力条件又は静的条件下でのＥＬＡＭ−１に対する単純Ｓ１、 ｅ′よりも結合能が小さいことがある。ハイブリッドを用いたときには、一方の 分岐てのＧｌｃ’ＮＡＣに対する末端ガラクトースα１→３結合フコース及び他 方の分岐でのα２→３結合シアリル酸及びα１→３結合フコースは、ハイブリッ ト構造に重要な部位である。したがって、５Ｈ−−１及びＦＨ−２等のＬｅ’並 びにＰＨ−６，５ＮＨ−４及び５ＮＨ−３等のＳＬｅ’に結合可能な抗体は、高 剪断応力条件てＥＬＡＭ−１介在接着を抑制するのに一緒になって効果を発揮す る。

ＥＬＡＭ及びＧＭＰＩ４０により認識される数多くのエピトープは、Ｏ結合糖鎖 により担持され、セレクチン依存細胞接着は、０−グリコリル化の抑制によりブ ロンつてきる（Ｋｏｊｉｍａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ ｏｍｍｕｎ、１８２　：１２８８．１９９２）。したかって、式（１）、（Ｉ　 Ｉ）及び（ＩＩＩ）の化合物を０結合炭水化物鎖に担持することが好ましいこと がある。

Ｅ、ＬＡＭ−１介在相互作用を遮断することのさらに意味するところは、炭水化 物又は抗体の組み合わせを使用して、関連炭水化物に対するＥＬＡｔ−１結合を 妨害することである。炭水化物又は抗体は、ＥＬＡＭ−１又はそれに結合可能な 炭水化物に関連し、ある状況では、特異的にＥＬＡＭ−１に結合すると思われる 炭水化物ではない炭水化物又は抗体のことがある。例えば、ＳＬｅ″及びＬｅ’ に対する抗体の組み合わせは、ＥＬＡＭ−１相互作用を抑制するのみ効果的であ る。適当なＳＬｅ’抗体は、Ｓ　Ｎ　Ｈ３及びＳ　Ｎ　Ｈ４であり；そして適当 なＬｅ’抗体は、ＳＨＩ及びＦＨ２である。当業者は、以下に述べる実施例を特 に考慮しながら、本明細書で開示されている試薬を用いて本明細書で教示されて いる方法を実施する他の適当な組み合わせを決定できる。

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例には限定され ない。

実施例 実施例１ ラクト−ス誘導体の合成 Ａ、メチルβ−Ｄ−ラクトンド ヘプタアセチルラクトンルイミデーｈ　（Ｚ　ｉｍｍｅ　ｒｍａｎｎ等、Ｊ、Ｃ ａｒｂｏｈｙｄｒ、Ｃｈｅｍ、７　：４３５、Ｉ　９８８）を、標準法により、 トリメチルンリルトリフルオロメタンスルホネートを含有する乾燥ジクロロメタ ン中でメタノールと反応させた（Ｇｒｕｎｄｌｅｒ　＆　Ｓｃｈｍｉｔ、Ｌｉｅ ｂｉｇｓ、Ａｎｎ、Ｃｈｅｍ、１９８４　：ｌ８２６．１９８４）。シリカゲル カラムクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ＝１・１　（容積比））で精 製後、０．０ＩＭナトリウムメトキシドで脱Ｏ−アセチル化して、イミデートか らの収率６８％でメチルβ−Ｄ−ラクトシトを得た：融点２１１〜２１２″Ｃ（ 文献値２０５°Ｃ，Ｓｍ１ｔｈ　＆　ｖａｎ　Ｃ１ｅｖｅＳＪ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ 、Ｓａｃ、７７　：３１５９、１’、ｃ５．０１Ｈ２０）、同書。

Ｂ、フェニルβ−Ｄ−チオラクトシト ラクトースオクタアセテート（Ｈｕｄｓｏｎ　＆　Ｋｕｎｚ、Ｊ。

Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、４７：２０５２．１９２６）を、０°Ｃのジクロロメ タン中においてチオフェノール及び５ｎＣ１，（Ｎｉｃｏ　ｌ　ａｏｕ等、Ｊ、 Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、１１０ニア９１０．１．９８８）で処理して、フェニ ルヘプタアセチルβ−Ｄ−チオラクトシトを収率８０％で得た。生成物を、Ｍｅ ＯＨ中においてＮａＯＭｅで脱アセチル化し、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ　（登録商標 ）１５で中和した。溶離剤として水を用いてＢｉｏＧｅｌ　（登録商標）カラム で生成物を精製した後、糖含有分画の凍結乾燥を行って、フェニルβ−Ｄ−チオ ラクトシトを白色非晶質粉末として得た。

Ｃ，ラクト−Ｎ−テトロース オリゴ糖（Ｇａｌβｌ−３ＧＩｃＮＡｃβ１→３Ｇａｌβｌ→４Ｇｌｃ）を、人 乳から、エタノールで予備処理し、溶離剤として水を用いてＢｉｏＧｅｌＰ−２ カラムクロマトグラフイーを反復後、水を用いて逆相（Ｃ，、）高圧液体クロマ トグラフィー（Ｄｕａ　＆Ｂｕｓｈ、Ａｎａ１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１３３　：　 ｌ、１９８３）を行った。’）Ｉ−ＮＭＲスペクトルを、真正試料（ＢｉｏＣａ ｒｂＣｈｅｍｉ　ｃａ　Ｉ　ｓ、Ｌｕｎｄ、スエーデン）のものと重ね合わせた 。

Ｄ、β−Ｄ−ラクトンドのポリエチレングリコール誘導体反応スキームを以下に 示す。

り β−Ｄ−ラクトンドのポリエチレングリコール誘導体を、容易に人手できる末端 アミノ基２　（Ｚａ　］　１ｐｓｋｙ等、Ｅｕｒ、Ｐｏｌアセチル−〇−β−Ｄ −ガラクトピラノシル）＝（１→４）−２゜３．６−−トリー〇−アセチルーβ −Ｄ−グルコピラノシドｌ及びポリエチレングリコールメチルエーテル（平均分 子量２０００　；Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ウイスコン州ミルウオー キー）から調製した。ｌ　（１００ｍｇ、Ｏ，ｌ　２ｍｍｏ　ｌ）と２　（１６ ３ｍｇ、０．０８２ｍｍｏ　］）を、乾燥Ｎ、　Ｎ−ツメチルホルムアミド（２ ｍｌ）中において室温で２時間処理して、溶離剤としてアセトンを用いてＬＨ− ２０でクロマトグラフィーした後、β−Ｄ−ラクトシトへブタアセテート３を収 率９１％で得た：　〔α）、−５，３゜（ｃＯ，５、クロロホルム）。続いて、 ０．０５Ｍ水酸化ナトリウムで３を室温で１時間ケン化後、凍結乾燥して、定量 的に所望のラクトンド４を得た：　〔α）Ｄ−２，４°　（ｃｌ、０、クロロホ ルム）。

実施例２ ＢＩ６メラノーマ細胞の転移に及はすラクトース及びラクトース誘導体の影響 ＢＩ６メラノーマ細胞系の高度に転移性のあるＢＬ６クローンを、最初Ｊｅａｎ 　５ｔａｒｋｅｙ博士（モノタナ州ＢｏｚｅｍａｎにあるＭｏｎｔａｎａ　５ｔ ａｔｅ　Ｕｎｖ、）力）ら入手し、同系０５７Ｂ１マウスにおいて転移性によっ て再選択した。Ｃ５７Ｂ１マウスを、濾過空気雰囲気下プラスチックケーノに維 持し、水と食物ペレットを不断給餌した。細胞を、２ｍＭグルタミン及び１０％ 牛脂児血清（Ｆｅ２）を補充したＲＰＭＩＩ６４０て培養味２ｍＭＥＤＴＡを含 有するリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で分離した。

生存度を、トリパンブルー排除試験により推定した。

ＢＬ６細胞（１〜３ｘｌｏ″細胞／ｍｌＲＰＭＩ　ｌ　６４０培地）の懸濁液を 調製し、アリコツトを、３７°Ｃて５〜１０分間種々の濃度で、種々のオリゴ糖 の存在下又は不存在下でインキュベーションした。インキュベーション後、典型 的に、３ｘｌＯ’又は２ｘｌＯ１細胞（オリゴ糖前処理を実施又は不実施）　／ ２００μｌを、尾静脈を介して８週令雌マウスに注射した。１８〜２１日後、マ ウスを殺し、肺をＰＢＳ　（ｐＨ７，４）の１０％ホルムアルデヒドに固定し、 そして腫瘍細胞コロニーを解剖顕微鏡でカウントすることにより、上記条件下で の肺における転移性メラノーマコロニー数のバックグランド値を得た。コロニー の数及びサイズのデータを、分散（ＡＮＯＶＡ）分析法により統計処理した。１ ｍｍ以上の直径を有するコロニーを大サイズとみなし、１ｍｍ未満の直径を有す るものを小サイズとみなした。

一つの実験では、ＢＬ６細胞を、種々の濃度のラクトース、ラクト−Ｎ−テトロ ース（Ｇａｌβｌ→３ＧＩｃＮＡｃβｌ→３Ｇａｌβ１→４ＧＬｃ）、メチルβ −Ｄ−ラクトシト又はフェニルβ−Ｄ−チオラクトシトとともに種々の時間イン キュベーションした。大多数の実験では、０、ＩＭの濃度を用い、細胞を３７° ＣでＩＯ分間インキュベーションし、４００ｘｇで１０分間軽く遠心分離して糖 含有培地から分離し、ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、尾静脈を介して注射した（ ０．２ｍｌ懸濁液に３　ｘ、　Ｉ　Ｏ’細胞）。いつかの実験では、２ｘｌＯ’ 細胞を注射し、２１日日日コロニーをカウントした。種々の糖溶液中でのインキ ュベーション後のＢＬ６細胞の生存度及び細胞成長能を、トリパンブルー排除試 験、生体外通常条件下でのＲＰＭ１１６４０平板培養だけでなく、年齢整合Ｃ５ ７Ｂ１マウスにおける皮下接種で腫瘍の成長を試験することにより試験した。

ＢＬ６細胞をラクトース及びラクト−Ｎ−テトロースとともに前インキュベーシ ョン後同−条件下で細胞を静脈注射したとき、ラクトース及びラクト−Ｎ−テト ロースにより、肺における転移性コロニーがそれぞれ２６％及び３６％減少した 。上記と同し条件下でＢＬ６細胞を０．ＩＭ、０．ＯＩＭ又は０．００５Ｍメチ ルβ−り一ラフ［・シトて処理したところ、対照と比して、転移性肺コロニー数 が、それぞれ４３％、１６％及び８％減少した。Ｏ，１，Ｍメチルβ−Ｄ−ラク トンドにより生した顕著な減少を３回別個の実験を行い、この減少が一定して３ ５〜４５％であることが判明した。

第二の独立した一連の実験では、メチルβ−Ｄ−ラクトソド又はフェニルβ−Ｄ −チオラクトシトでの前インキュベーションに続いて、それぞれ異なる条件下で のメチルβ−Ｄ−ラクＩ・シト又はフェニルβ−Ｄ−チオラクトンドでの処理に よっても、転移性コロニー化、即ち、総コロニー数が、対照値の３５〜５０％に 減少した。大サイズコロニーの減少は、全ての実験において小コロニーの減少よ りも明白であった（特にフェニルβ−Ｄ−チオラクトンド（第１図）を用いた場 合）。メチルβ−Ｄ−ラクトンドとフェニルβ−Ｄ−チオラクトノドの両方か、 生体外において細胞数増加とチミジン取り込みにわずかに促進効果を示した。し たがって、腫瘍付着に対する抑制効果は、生体内又は生体外での細胞成長に対す る効果とは関係ない。

別個の実験において、メラノーマ細胞転移に対するメチルβ−り一うクトンドの 効果を、オリゴ糖を投与後腫瘍細胞とインキュベーションして測定した。具体的 には、メチルβ−Ｄ−ラクトンド（ａ度０．２５Ｍ又は０．５Ｍ）投与量１ｍｌ を、マウスに腹腔注射した。１０分後、ＢＩ６メラノーマ細胞を、静脈注射した 。肺コロニーを、１９日後にカウントした。腫瘍細胞を接種する前にメチルβ− Ｄ−ラクトノドを注射することにより、肺転移性コロニーの形成が顕著に減少し た（第２図）。

別個の実験では、異なる転移能を示すマウスメラノーマＢＩ６変異体（ＢＬ６／ Ｆ　Ｉ　Ｏ／Ｆ　ｌ／Ｗａ　４）は、既にメラノーマ関連抗原として同定されて いるＧＭ３ガングリオンド（Ｈｉｒａｂａｙａｓｌ等、Ｊ、Ｂｉｏｉ　Ｃｈｅｍ 、２６０　：１３３２８．１９８５；Ｎｏｒｅｓ等、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３ ９：３１７１．１９８７）を、同し程度で発現した。ＧＭ３は、内皮細胞で高度 に発現するＬ　ａ　ｃ　Ｃｅ　ｒと相互作用する。Ｌａ　ｃＣｅ　ｒ塗布固相又 は内皮細胞に対するＢ１６変異体の接着の程度も、転移性（ＭＰ）と同じ程度で あった。これに対して、８１６変異体のインテグリン依存接着は、Ｂ　Ｌ　６、 ＦＩＯ及びＦｌとほぼ同じであった（第４図参照）。

これらは、ＬａｃＣｅｒのＢＩ６接着は、分子ＧＭ　３−Ｌ　ａ　ｃ　Ｃｅ　ｒ 相互作用に基ついていることを示唆している。また、内皮細胞に対する８１６メ ラノ一マ接着は、メチル−β−ラクトンドだけでなくＬ　ａ　ｃ　Ｃｅ　ｒリポ ソーム、Ｇｇ３Ｃｅｒリポソーム及びＧＭ３リポソームによっても抑制されるこ とも明らかとなった（第５図参照）。

さらに、上記したメチル−β−ラクトンドの転移抑制効果についての観察を、別 個にメチル−β−ラクトンドを注射することに延長した。即ち、腫瘍細胞を静脈 注射後、メチル−β−ラクトンドを腹腔注射した。これらの実験において、０． ２５〜０．５Ｍメチル−β−ラクトソドを注射することにより、肺転移コロニー 数が４０〜７０％減少した（第６図参照；Ａ＝ＰＢＳ対照、Ｂ＝０．２５ＭＭＣ −β−ラクトンド；Ｃ＝０．５ＭＭｅ−β−ラクトンド、Ｄ−０５Ｍラクトース ；Ｅ＝０．２５ＭＮ−アセチルラクトサミン；Ｆ−Ｏ，５ＭＭｅ−β−ガラクト ／ド、腹腔注射）。

毛細血管内皮細胞は、抗体ＭＩＡ−１５−５等のＨ／Ｌｅ’／Ｌｅｂに対する抗 体との反応性が非常に高かった。この観察結果は、Ｕｌｅｘ　Ｅｕｒｏｐ、Ｉが 内皮細胞を染色するという既に報告されている観察結果（Ｈｏｌｔｈｏｆｅｒ等 、Ｌａｂ、Ｉｎｖｅｓｔ。

４５＋３９１．１９８１；４７：６０．１９８２）と一致する。

Ｈ−１又はＬｅ’を含んでなるリポソームを製造し、一連の濃度で種々の糖脂質 を固定したプレートに暴露した。

第７図に示したように、Ｈ担持リポソームは、プレートに塗布したＩ」又はＬ　 ｅ　’に結合した。一方、Ｌｅ’担持リポソームは、Ｈ塗布プレートにのみ結合 することが判明した。Ｈとバラグロボシドは関連かあり、差異は、Ｈに末端フコ ース残基が存在することだけである。

したがって、■４、Ｌｅ’又はＬｅ’を発現する細胞は、Ｉ］を発現する内皮細 胞及びおそら＜　Ｌｅ’にも接着することができる。これらの相互作用は、腫瘍 細胞が内皮細胞接着する第一工程のことがある。

実施例３ ヒト肺腺癌細胞系のノアロシルニ量体Ｌｅ’の発現と転移性ＫＵＭ−ＬＫ−２は 、ヌードマウスにおいて自然肺転移を生しる特徴があるヒト非腺癌細胞系である 。ヌードマウス中で成長する３５種のヒト癌細胞系をスクリーニングした後、ヌ ードマウス肺での転移性付着細胞系のみを得た。ＫＵＭ−ＬＫ−２を親細胞系と して使用して、限界希釈法により、ＩＶ注射て肺転移を生しるサブ細胞系を得た 。

限界希釈は、以下のように行った。Ｋ　Ｕ　Ｍ　−Ｌ　Ｋ　−２を、１０％ＦＣ ３（ユタ州ローガンにあるＨｙｃｌｏｎｅ社製）を補充したＲＩ”ＭＩ１６４０ 培地にューヨーク州グランドアイランドにあるＧＩ　ＢＣＯ社製）で、５％Ｃｏ ｔ　／９５％空気雰囲気中において３７００で培養した。２ｍＭＥＤＴＡ溶液て 簡単に処理し、ＲＰＭＩＩ６４０て２回洗浄して、１０％ＦＣ５含有ＲＰＭＩの 単一細胞懸濁液を調製した。トリパンブルー排除染色によって測定した細胞生存 度は、〉９８％であった。１００μｍ当たりＩ細胞を含有する細胞懸濁液を、９ ６ウエルマイクロタイタープレートにューヨーク州コーニングにあるＣｏｒｎｉ ｎｇ　Ｇｌａｓｓ　Ｗｏｒｋｓ社！８りの各ウェルに移し、２４時間連続培養し た。次に、各ウェルを、位相差顕微鏡で観察した。

異なる転移性（ｒＭＰＪ）を有する３種の細胞系（ＨＡＬ−８、ＨＡＬ−２４及 びＨＡＬ−３３）を、安定な細胞形態に基ついて限界希釈法により得た２５個の クローンから選択した。２５個のクローンは、生体外での細胞成長にばらつきが ないだけでなく安定した形態を示す６３個のクローンから選択した。

全てのクローンが、自然肺転移を生じた。しかしながら、１．Ｖ。

注射て、肺転移付着物形成について、クローン間に明確な差異が観察された。高 ＭＰを有する２個のクローン、低ＭＰを有する５個のクローン及びＭＰを有しな し叫８個のクローンが識別された。

クローンのＩＶ、注射により選別を反復して、ばらつきのないＭＰを示す最も安 定なサブ細胞系を株化した。これらは、ｎ　ｕ　／　ｎＵマウス肺に対してそれ ぞれ高ＭＰ、低ＭＰ及び無ＭＰであるＨＡＬ−８、ＨＡＬ−３３及びＨＡＬ−− ２４であった（下記の表１参照）。肉眼及び顕微鏡での検査から、３種のサブ細 胞系のいずれも他の臓器やリンパ節における転移を示さないと判定された。サブ 細胞系は、ＫＵＭ−ＬＫ−２に最初存在していた安定な変異体を表す。染色体分 析により、サブクローンはそれぞれ別個であることが確認されｔこ。

ヌードマウス″におけるＨＡＬ−８、ＨＡＬ−２４及びＨＡＬ−３３の転移性 ＋１ＡＬ−８１５１５，８（８−２３）２２　１５．０　（１０−２２） ４６　１６．３　（ＩＩ−２５） ＨＡＬ−２４１５０ ）ＩＡＬ−３３１５４，３（３−７） ２２　５．１　（２−８） ４６　５．８　（３−８） ゛　、ヌードマウスに、表記した種々の世代時間で尾静脈を介して注射（２ｘｌ Ｏ’細胞）した。注射５６日後、マウスを殺し、肺表面上の転移性根粒を解剖顕 微鏡でカウントした。

５　・動物６匹の平均（０内は範囲） 種々の炭水化物エピトープの細胞表面発現を、Ｌｅ”　（ｍＡｂＳＨＩ）、シア ロンルーＬｅ’　（ｍＡｂ　５ＮＨ４）　、シアロンルー二量体Ｌｅ’　（ｍＡ ｂ　ＦＨ６）　、Ｔ　（ｍＡｂ　ＨＨ８）　、Ｔｎ（ｍＡｂ　ＩＥ３）及びシア ロンルーＴｎ　（ｍＡｂ　ＴＫＨ２）に対する種々のモノクローナル抗体（ｍＡ ｂ）を用いてサイトフルオロメトリーにより分析した。使用した全ての抗体は、 それぞれのハイブリドーマからの培養上清を１０μｇ／ｍｌ免疫グロブリンとし て調整したものであった。シアロンルーＬｅ’　（構造ｌ）、シアロンル一二量 体−Ｌｅ’　（構造２）、二量体−Ｌｅ”　（構造３）、トリフコシルーＬｅ’ 　（構造４）、Ｌｅ’（構造５）、Ｈ（構造６）、５Ａ−Ｌｅ′　Ｉ　（構造７ ）、５Ａ−Ｔｎ（構造８）、ノシアロンルーＬｅ’（構造９）、モノシアロシル −Ｌｅ’ｌｌ（構造１０）、ＧＭ３（構造１１）、５−ＰＣ（構造１２）、Ｌｅ ”（構造１３）及びＬｅ“　（構造１４）の構造を、以下に示す。Ｒは、担体分 子を表す。

構、ＡＵ二 １直と Ｆ’ｕＣ６１ＦｕＣＱ１ 構】目＝ １垂り 拷Ｕ ＮｅｕＡｃａ２−＊３Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→コＧａｌβｌ→Ｒ豫Ｉ 且− から細胞を分離し、各ｍＡ、ｂ処理ごとに細胞１ｘｌｏ’個を調製した。細胞を 、ｍＡｂとともに、４°Ｃで１時間インキュベーションし、ＲＰＭＩ　１６４　 （１’２回洗浄した。次に、ＰＢＳで５０倍したヤギ抗−マウスＩｇＧ又はＩｇ Ｍ−ＦＩＴＣ（インディアナ州インディアナポリスにあるＢｏｅｈ　ｒ　ｉ　ｎ ｇｅ　ｒ−Ｍａｎｎｈｅ　ｉｍ社製）を添加し、４’Ｃで３０分間インキュベー ションした。最後に、細胞を３回洗浄し、ＰＢＳで再懸濁し、ＥＰＭＣ３ＰＲＯ ＦＩＬＥフローサイトメーター（フロリダ州ハイアリーアにあるＥｐｉｃＳ社製 ）で分析した。実験を、３種の異なる細胞世代を用いて反復した。

サブ細胞系ＨＡＬ−８、ＨＡＬ−２４及びＨＡＬ−３３についての６種の炭水化 物エピトープ（それぞれのｍＡｂにより確認される）の発現パターンは、シアロ ンルー二量体Ｌｅ”の場合を除いてほぼ同一の輪郭（３種のサブ細胞系について のタンパク質輪郭）を示した。特に、ＨＡＬ−８、ＨＡＬ−２４及びＨＡＬ−３ ３は、高度且つ等しくシアロンルーしｅｌ及びシアロシル−Ｔｎ構造を発現する ことが判明した。３種の系の各々は、Ｌｅ’及びＴｎを少量発現したが、■は発 現しなかった。これに対して、シアロンルー二量体Ｌｅ１の発現は、ＨＡＬ−８ が高く、ＨＡＬ−３３が中程度で、ＨＡＬ−２４が低かった。

シアロシル残基の放出を、以下のようにして評価した。細胞をＰＢＳの２ｍＭＥ ＤＴＡを用いて分離し、洗浄し、９容積のＰＢＳに再懸濁した。細胞懸濁液１ｍ ｌを、ウエルチ菌ンアリダーゼ０．　２０／ｍｌ　（Ｘ型、ミズーリ州セントル イスにあるＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、社製）とともに、３７６Ｃで ５分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を３回洗浄し、Ｒ ＰＭ　Ｉ　１６４０で再懸濁し、ＭＰとシアロンルー二量体Ｌｅ’の発現につい て調査した。ＨＡＬ−８及びＨＡＬ−３３のＭＰは、細胞のノアリダーゼ処理に より完全に抑制された（下記の表２参照）。シアロンルー二量体Ｌｅ’の発現は 、血液開運転移に重要な役割をはたしていると思われる。

表２ クローンＨＡＬ−８及びＨＡＬ−３３”の転移性に及ぼすシアリダーゼ処理の影 響 対照（Ｐ　Ｂ　Ｓ　）　１（ＡＬ−８１６，３（９−２４）ＨＡＬ−３３４，６ （３−７） シアリダーゼ　ＨＡＬ−８０ ＨＡＬ−３３０ “　：ヌードマウスに、表記した種々の世代時間で尾静脈を介して注射（２ｘｌ Ｏ’細胞）した。注射５６日後、マウスを殺し、肺表面上の転移性根粒を解剖顕 微鏡でカウントした。

１　：動物６匹の平均（０内は範囲） 実施例４ ＧＭＰ−１４０のレクチンドメインに結合できる炭水化物エピトープの同定 Ｏｒｅｇｏｎ　Ｒｅｄ　Ｃｒｏｓｓ　（オレゴン州ボートランド）から入手した 「血小板に富む血漿」から、血小板を単離した。混入している赤血球を、８０ｘ ｇで１０分間遠心分離して除去した。血小板を３００ｘｇで１０分間遠心分離し 、０．３５％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する２２ｍＭクエン酸緩衝液含 有タイロード緩衝液（ｐＨ６，５）に懸濁した。血小板懸濁液（ｌｘｌＯ”／ｍ １）を、トロンビンの添加（最終濃度：ＩＵ／ｍｌ）後、インキュベーションし た（ｐＨ７，２，３７６Ｃ１５分間）。次に、混合物を、攪拌せずに、３７°Ｃ で１０分間インキュベーションした。トロンビン活性化血小板を、リン酸緩衝生 理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７，２中で同容積の２％ホルムアルデヒドで固定し、 １％ＢＳＡ含有ＰＢＳで２回洗浄した。活性化血小板（非活性化血小板ではない ）は、３７’Ｃで３０分間インキュベーションしたとき、２．５μｇ／ｍｌ抗− ＧＭＰ−１４０ｍＡｂＡＣ１，２（イソタイプＩ　ｇ　Ｇ　＋、カリフォルニア 州すンホセにあるＢｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）に対して高い反応 性を示した。その後、螢光標識ヤギ抗−マウスＩｇ（カリフォルニア州バーリン ゲームにあるＴａｇ。

社製）５０μＩと反応させた。ｍａｂＡｃＩ、２を用いた活性化血小板のフロー サイトメトリー輪郭と非活性化血小板のサイトメトリーとの関係を、第８Ａ図〜 ８Ｄ図に示す。

活性化及び非活性化血小板を、Ｃａ”＋を含有しないＰＢＳ、ｐＨ７，２におい てバラホルムアルデヒドで固定し、１％ＢＳＡを含むＣａ”含有ＰＢＳで２回洗 浄し、１％ＢＳＡ及び０．１％アジドでＣａ”−ＰＢＳに再懸濁し、血小板数を 約１ｘｌＯ’個／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を４’Ｃで保存し、２４時間内に 結合アッセイを行った。

螢光ポリスチレンラテックスビーズを、オレゴン州ニージーンにあるＭｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅ社から入手した。ビーズは、表面に硫酸基を有する直径約 ０．５μｍ（実直径０．４８８μｍ）の黄緑色螢光ビーズであった。ＥＴＯＨ３ ０μＩにビーズ（ｌｘｌＯ’）を入れ、Ｃ＝Ｍ２００μｌにＧＳＬＩＯμｇを添 加した溶液に添加し、よく混合し、Ｎ２流下に乾燥した。残留物をエタノール２ ００μｍに再懸濁し、簡単に音波処理し、Ｎ２流下に乾燥した。

乾燥残留物を、３％ＢＳＡ及び０．　１％アジド含有Ｃａ”　−ＰＢＳ２ｍｌに 懸濁し、１０分間音波処理し、３７°Ｃでε０分間静置して、ＢＳＡによりビー ズ表面をブロックした。懸濁液を３０００ｘｇて１０分間遠心分離し、ビーズベ レットを、１％ＢＳＡ及びアジドを含有するＣａ”−ＰＢＳで２回洗浄し、最後 に、同じ培地５００μｍに懸濁し、４°Ｃで保存した。

パラホルムアルデヒドで固定し、血小板を約２ｘｌＯ’個含有する血小板（非活 性イビ又は活性化）懸濁液２０μｍを、ビーズ約２ｘ１０’個含有する螢光Ｇ　 Ｓ　Ｌ塗布ビーズｌＯμｍと混合し、十分混合後、３７’Ｃで３０分間静置した 。血小板懸濁液を、Ｃａ’−−ＰＢＳ　２００μｌと混合し、フローサイトメト リー（ＥＰＩＣＳプロフィール、コールタ−サイトメトリー、フロリダ州ハイア リーア）により分析した。

血小板により生じる信号のほとんどを含み且つ遊離ビーズにより生じる信号を排 除するためのゲイトを設定するために、血小板単独及びビーズ単独のフローサイ トメトリー分析を行った。結合指数（Ｂｌ）を、螢光ＧＳＬ塗布ビーズとともに インキュベーションした血小板の平均螢光強度（Ｍｆｌ）を螢光弁ＧＳＬ塗布（ 対照）ビーズとともにインキュベーションした血小板のＭＦＩで割ってめた値と して算出した。種々のＧＳＬについてのＢｌ値を、表３及び第９図に示す。第９ 図において、ハンチングしたバーは非活性化血小板を表し、オーブンバーは活性 化血小板を表す。５Ａ−Ｌｅ’、５Ａ−Ｌｅ’　、ＳＰＧ、ＧＭ３及びＬｅ”に 関する活性化血小板の結合指数（Ｂｌ）と非活性化血小板の結合指数（Ｂ　Ｉ） との比も、「比（活性／非活性）」の欄に示す。

表３ Ｇ　Ｓ　Ｌ塗布スルフェート含有ポリスチレンビーズに対するｌ・ロンビン活性 化血小板の結合指数 ＧＭ３　１．０±０．　Ｉ　Ｏ，７±０．５ＳＡ−１、ｅ’　４．２±１．０　 ４．２±０．５ＳＡ−Ｌｅ　’　８．１±１．０　６．　Ｉ±０．２ＳＰＧ　Ｏ ，８±０．２　０．７±０．２１、ｅ′″　１．ｌ±０．３　１．０±０．３″ 　値は、４回の別個の実験の平均値である。

ｍＡｂは、螢光ＧＳＬ塗布ビーズに対する血小板の結合に影響を及はした。血小 板を、抗−〇ＭＰ−］、４０ｍＡｂ　ｌ０Ｐ６２　（フランス国マルセイユにあ るＩｍｍｕｎｏｔｅＣｈ社製）とともに、３７°Ｃて３０分間インキュベーショ ンし、上記した方法でＧＳＬ塗布ビーズを用いて結合アッセイを行った。対照結 合アッセイには、非特異的マウスＩｇＧ（ｔｏμｇ／ｍｌ）を使用した。

また、５Ａ−Ｌｅ’塗布ビーズ（２ｘｌＯ’個）１０μｍを、抗−５Ａ−Ｌｅ’ 　ｍＡｂＣＡ　１９−９　（７ウスＩｇＧ＋；７サチユーセノツ州デダムにある Ｓｉｇｎｅｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）（２０μｇ／ｍ１）２０μＩと ともに、室温で６０分間インキュベーションし、血小板結合アッセイに使用した 。抗−８Ａ−Ｌｅ’ｍＡｂＳＮＨ４と非特異的マウスＩｇＧを、対照として使用 した。

結果を、第１Ｏ図に示す。第１０図において、横軸は抑制率を表し、カラムｌは 抗−ＧＭＰ−１４０ｍＡｂ　ｌ０Ｐ６２を表し、カラム２は抗−３Ａ−Ｌｅ’　 ｍＡｂｃＡｌ　９−１９　（代替ｍＡｂは、ＮＫＨＩ及びＮＫＨ２である）を表 し、カラム３は抗−８Ａ　−Ｌ　ｅ　”ｍＡｂＳＮＨ４及びカラム４は正常マウ スＩｇＧを表す。

活性化血小板は、抗−ＣＤ６２ｍＡｂとの高反応性により明らかなようにＧＭＰ −１４０の高発現性を示した。（第８Ａ図〜第８Ｄ図）ＧＭＰ−１４０を発現す る活性化血小板は、Ｓ　Ａ　−Ｌ　ｅ　’を塗布した螢光ビーズに対して高結合 性を示した（第９図参照）。

５Ａ−Ｌｅ’を塗布したビーズに対する血小板の結合は観察されたが、５Ａ−Ｌ ｅ”の場合よりも程度がはるかに小さかった（第９図）。他のＧＳＬを塗布した ビーズに対しては結合は観察されなか一つだ。さらに、５Ａ−Ｌｅ’塗布ビーズ に対する血小板の結合は、抗−〇ＭＰ−１４０ｍＡｂおよび抗−８Ａ−Ｌｅ’ｍ Ａｂにより抑制されたか、抗−８Ａ−Ｌｅ’ｍＡｂによっては抑制されなかった （第１Ｏ図）。

実施例５ 動的流れ系におけるインターロイキン−１活性化ヒトさい静脈内皮細胞に対する ヒト結腸癌Ｃｏ１ｏ２０５の接着に及はす種々のモノクローナル抗体の影響 第１．＋Ａ図〜第１ＩＤ図に示す動的フロー実験システムを用いて、接着性を測 定した。異なる剪断応力、例えば、０．４〜４．８ダイン／　ｃ　ｍ　’で３分 間の間に結合した細胞数を、ビデオテープに記録したいくつかのフィールドから カウントした。粘度係数は１．ＯＦであり、半チャンネル高さは５．７ｘ、ＩＯ ’−”　ｃｍであり、チャンネル幅は１．：３ｃｍであった。

このシステムを用いて、種々のヒト腫瘍及び種々の腫瘍関連炭水化物抗原に対す るモノクローナル抗体を検討した。活性化ヒト内皮細胞に対するヒｉ・結腸癌Ｃ ｏ１ｏ２０５細胞の接着について一つの検討結果を、第１２図に示す。第１２図 において、横軸は壁剪断応力（ダイン／ｃｍ’）を表し１．縦軸は細胞接着（ｘ ｌＯ−２７フイールド）を表す。

第１２囚において、符号の意味は、以下の通りである。白丸、無関連マウスＩｇ Ｃ；＋ＩｇＭ（対照）の混合物、黒三角、モノノアロシルーＬｅ”　Ｉに対する モノクローナル抗体ＣＡｌ９−１白三角、ノアロノルーＬｅ’に対するモノクロ ーナル抗体５ＮＨ４；黒丸、モノンアロンルーＬ　ｅ″　ＩＩ及びジノアロンル ーＬｃ’　に対するモノクローナル抗体ＦＨ７，及び黒四角、無関連マウスＩ　 ｇＧ＋　ｌ　ｇＭと非活性化内皮細胞との混合物。

結果から、活性化内皮細胞に対するＣｏ１ｏ２０５の接着は、抗体ＦＨ７（特に 高壁剪断応力（５〜１０ダイン／ｃｍ’）のとき）により、最も強力に抑制され たことが分かる。これに対して、抗体Ｃ／’１１９−９は何ら抑制効果を示さな かった。これらの知見は、内皮細胞に対する腫瘍細胞接着は、モノノアロンル− Ｌｅ’ｌｌ又はジンアロンルーＬ　ｅ　’　とイノターロイキン−１活性化セレ クチンとの間の相互作用を介して進行する場合があることを示唆している。

実施例６ ＨＬ　６０細胞のセレクチン依存接着 ＨＵＶＥＣ（ワノントン州カークランドにあるセルノステ１、グ社製）を、４８ ウエルプレート（マサチューセッツ州ケンブリッジにあるコスタ−社製）で、前 面成長するまで培養し、ＩＵ／ｍ１ｌＬ−１で４時間刺激した。非刺激１（ＵＶ ＥＣを、対照として使用した。

ＴＬ−−１刺激ＨＵ　Ｖ　Ｅ　ＣについてのＥ−セレクヂン（ＥＬＡＭ−１）の 発現を、抗−Ｅ−セレクチンｍＡｂ３Ｂ７　（Ｉ　ｇＧ、Ｊ）との反応性により 確認した（Ｇｒａｂｅｒ等１．Ｊ、１ｍｍ、１４５：８１９、＋９９０）。］（ Ｌ６０及びＣｏ１ｏ２０１細胞を、グリコツル化モディファイヤーで前処理した 後〔′Ｈ〕−チミジンの存在下での培養により代謝的に標識し、ＨＵ　Ｖ　Ｅ　 Ｃ塗布プレートに添加した。

１５分間のインキュベーンコン後、プレートをＰＢＳで洗浄し、付着細胞数を、 放射能カウントから換算して推定した。別の一連の実験では、９６ウエルプレー １・にュージャージー州すンコルンにあるＦａｌｃｏｎ社製）に、トランスメン ブレン及び細胞質ドメインの欠如したトランケート組み換えＥ−セレクチン（清 水等、Ｎａｔｕｒｅ３４９ニア９９．１９９１）０．１〜ｊμｇ／ｍｌで、１８ 時間塗布した。次に、プレートに、Ｉ％ＢＳＡを塗布し、ＰＢＳで洗浄し、上記 した代謝的標識グリコリル化改質細胞を塗布した。６０分間インキユベーンヨジ ンた後、ブｌノートをＰＢＳで洗浄し、付着細胞数を、放射能カウントから換算 して推定した。

４８ウエルプレートに塗布し固定した活性化又は未変性血小板に対する細胞接着 のアッセイを、上記と同様の方法で行った（Ｈａｎｄａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ３０　：　］　Ｉ１６８．１９９１）。

Ｆ（Ｌ　６０細胞を、２ｍＭベンツルールーＧａｌＮＡｃで７２時間予備処理し 、〔３Ｈ〕チミジンで標識した。ＰＢＳで洗浄後、１ｘ１０６個の細胞を各ウェ ルに添加し、プレートを、室温で３０分間インキユベーンヨジンた。洗浄して未 結合細胞を除去した後、トリプシンて結合細胞を分離し、液体ノンチ１ノーンヨ ンカウンターによりカランｌ−１，た。プレートに結合した血小板を、抗−Ｐ− セレクチンｍＡｂ　ｌ　ＯＰ　−６２（＋　＋　２、ｌ：６希釈）（フランス国 マルセイユにあるＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製）とともに、室温で３０分間インキ ュベーションした後、ＨＬ６０細胞を添加して、接着のＰ−セレクチン発現依存 性を評価した。非特異的マウスＩｇＧを、対照として使用した。

動的流れ系における接着アッセイ 平行板層流チャンバーを注入ポンプ（９３５型、マサチューセッツ州ケンブリノ ンにあるＨａｒｖａｒｄ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製）に接続したものを使用して 、生理的微小血管環境に存在する流れ剪断応力をソユミレーノヨンした。フロー チャンバーは、サイラスティ、クゴムカスケットを用いて平行透明プラスチック 表面を固定したガラス板から構成されており、二表面間には１１４μｍの間隙が あり、この間隙は入口と出口に接続されている。

所定の速度と壁剪断応力を有する層流は、フローチャンバーの入口に接続した注 入ポンプを操作することにより達成される。ガラス板にＥＣを単層として成長さ せるか、接着分子を塗布し、細胞懸濁液の層流を、チャンバーを介して通過させ る。

細胞の動きを、逆相コントラスト顕微鏡にコン社製Ｄｉａｐｈｏｔ−ＴＭＤ）で 観察し、時間差ビデオカセットレコーダーで記録する。細胞をローリング後停止 して、接着を観察する。異なる剪断応力で（例えば、０．４〜４．８ダイン／　 ｃ　ｍ　２又は０．７６〜１５５ダイン／ｃｍ’）３分間に結合した細胞数を、 ビデオテープに記録したいくつかのフィールドからカウントした。壁剪断応力（ Ｔ）を、Ｌ　ａ　ｗ　ｒ　ｅ　ｎ　ｃ　ｅ等の式により算出した（Ｂ］ｏｏｄ７ ５：２２７．１９９０） Ｔ　＝　３μＱ／２ｂａ’ （式中、μ−粘度係数（＋、０ｃＰ）、Ｑ−容積流量（ｃｍ’　／秒）、ａ−半 チヤンネル高さくここで記載の実験の場合は５．７ｘｌＱ’）、そしてｂ−チャ ンネル幅（１，３ｃｍ）である）。

静的条件下でのＥ−セレクチン塗布プレートに対するＨＬ６０接着航骨髄白血病 細胞系１−ＩＬ６０は、特異的ｍＡｂ　（Ｓｙｍｌｎｇｔｏｎ等、Ｊ、Ｉｒｎｍ ｕｎｏｌ、１３４：２４９８、ｌ　９８５）で探査したところ、２型鎖及びノア ロンル化／フコンル化誘導体のみを発現することが分り、これをＥ−セレクチン 及びＰ−セレクチン介在白血球接着のモデルとして広範に使用した（Ｐｈｉ　ｌ 　Ｉ　ｉｐｓ等、５ｃｉｅｎｃｅ２５０：１１３０．１９９０　；Ｐｏｌ　Ｉｅ ｙ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　、米国８８：６２２４．１９ ９１；Ｈａｎｄａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、Ｉ　８１　：Ｉ２２３．１９９１：Ｋａｊｉｍａ等、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、ｌ　８２　：］２８８．１９９ ２）ａ ）（Ｌ（ｉｏ細胞を、ニューカッスル病ウィルス（ＮＤＶ）又はビブリオコレラ （Ｖ　Ｃ）シアリダーゼで処理したとき、細胞とｍＡｂＳＮＨ３及びＳ　Ｎ　Ｈ ４との反応性は消失した（第１３図）。Ｅ−セレクチン依存ＨＬ６０接着は、Ｎ ＤＶンアリダーゼで処理した後約２０〜５０％しか減少しなかったが、ビブリオ 又はアルトロバクターウレアファンエンス（ＡＵ）シアリダーゼで処理した同し 細胞の接着は、対照値の約５〜１０％まで減少するか、実質的に消失した。

（ＮＤＶ、ＶＣ及びＡＵシアリダーゼは、ＨＬ６０細胞でのＳＬｅ”発現を消失 させるのに同等な効果があった。）ＮＤＶンアリダーゼは、末端Ｇａｌに結合し たα２−３シアロンル残基のみを除去するのに対して、ビブリオ及びアルトロバ クターシアリダーゼは、末端及び内部ノアル酸残基、とりわけα２→６結合ンア ル酸残基を完全に除去する。これらの知見は、ＳＬｅ’及びＳＬｅ’は、Ｅ−セ レクチン及びＰ−セレクチンの単独エピトープではないことを示している。

Ｅ−セレクチン依存ＨＬ６０接着に及ぼす種々のｍＡｂの影響を試験した。抗− ８Ｌｅ’　ｍＡｂＳＮＨ３及び５ＮＨ４は、慎重に制御した条件下でさえ強固な ＨＬ６０細胞集合を生じた。したがって、５ＮＨ３又は５ＮＨ４によるＨＬ６０ 接着の抑制の程度は、集合した細胞はＥ−セレクチン塗布プレートから分離する 傾向があるので、かなり異なった。

一般的に、これらのｍＡｂによる抑制の程度は、上記したＰｈ１１１　ｉｐｓ等 が既に記載している抑制の程度と比較してごく小さがった。抗−Ｌｅ’　ｍＡｂ ｓＨｌ　（Ｉ　ｇＧｚ　）（Ｓ　ｉｎｇｈａ　１等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、５ ０：１３７５．１９９０）とＦＮ２（１ｇＭ）（Ｆｕｋｕｓｈｉ等、Ｊ、Ｂｉｏ ｌ。Ｃｈｅｍ、２５９：４６８ＬＩ９８４）！；ｔ、ｍＡｂＳＮＨ３及び５ＮＨ ４よりも一貫して抑制度が高かった。

５ＮＨ３又は５ＮＨ４とＳＨＩ又はＦＮ２との混合物は、ｍＡｂ単独のいずれよ りも抑制度が高かった。最も強力な抑制は、５ＮＨ４とＳＨＩとの混合物で生じ た（第１４図）。

もしＳＬｅ’がＥ−セレクチン及びＰ−セレクチンに対してＨＬ６０の唯一のエ ピトープであるならば、抗−３Ｌｅ’　ｍＡｂ　（例えば、５ＮＨ３及び５ＮＨ ４）は、セレクチン依存接着を完全に抑制するはずである。ＨＬ６０細胞と５Ｎ Ｈ３及び５ＮＨ４との反応性を消失させたＮＤＶシアリダーゼでの処理によって も、Ｅ−セレクチン依存細胞接着は抑制されるはずである。しかしながら、ＨＬ ６０細胞をＮＤＶシアリダーゼで処理後、５ＮＨ３又は５ＮＨ４て処理しても、 接着はさらには減少しなかった。ＮＤＶシアリダーゼで処理後、抗−Ｌｅ″ｍＡ ｂｓＨ＋又はＦＮ２で処理すると、Ｅ−セレクチン依存ＨＬ　６０接着が強力に 抑制された。

静的系における活性化ＨＵＶＥＣに対するｆ（Ｌ６０接着Ｅ−セレクチン塗布プ レートに対するＨ　Ｌ　６０接着について観察されたのと同様な傾向が、プレー トにおいて成長させた活性化ＨＵＶＥＣに対するＨＬ６０接着についても観察さ れた。ＨＵＶＥＣに対する接着は、上記Ｐｈｉ　Ｉ　Ｉ　ｉｐｓ等により以前報 告されたのとは異なり、抗−８Ｌｅ’　ｍＡｂＳＮＨ２又は５ＮＨ４による影響 は極わずかであった。ｍＡｂ試料は、試料によって１（Ｌｅ０−ＨＵＶＥＣ接着 に対する効果が大きく異なり、あるｍＡｂはＨＬ　６０細胞の強固な集合を生し た。抗−Ｌｅ’ｍＡｂＳＨＩ及びＦ　Ｈ２は、５ＮＨ４＋ＳＨＩ又はＦ　Ｈ２の 組み合わせと同様、−貫して１（Ｌｅ０−−ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃ接着をより強力（ ＳＮＨ３又は５ＮＨ４１：比較して）に抑制した。ＮＤＶシアリダーゼは、ＨＬ ６０−ＨＵＶＥＣ接着を顕著には減少しなかったが、ビブリオンアリダーゼは、 反応性をほとんど完全に消失させた。

動的流れ系におけるガラス板への接着分子又はＥＣの塗布レクチン、フィブロネ クチン（ＦＮ）　、ラミニン（ＬＮ）、トランケートＥ−セレクチン及びＧＳＬ を使用する場合、濃度２０〜２００μｇ／ｍｌの溶液ｌＯ〜５０μｌを、ガラス 板（３８ｘ７５ｍｍ、ニューヨーク州コーニングにあるＣｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａ ｓｓｗｏ　ｒ　ｋ　ｓ）上のマークを付けた領域（直径０．５ｃｍ）に配置し、 冷蔵庫内で４°Ｃで乾燥した。乾燥プレートを、ＰＢＳに３７°Ｃで１時間浸漬 し、ＰＢＳを何回か変えて十分に洗浄した。ＧＳＬ塗布の場合、ＰＢ８１ｍｌに ＧＳＬｊＯＯμｇ、：ｌレスチロール２００μｇ及びホスファチジルコリン４０ ０μｇを添加してＧＳＬ　−’Ｊボソームを調製した。ＧＳＬ−リポソーム溶液 ｌＯμｍを、ガラス板上に配置し、４°Ｃで乾燥し、そしてプレートを上記した ようにしてＰＢＳで洗浄した。

吸着分子の量は、レクチン、ＦＮ又はＬＮについては１２５Ｉ標識を用い、ＧＳ Ｌ−リポソームについてはｌ：’Ｈ）コレステロール標識を用いて測定した。こ れらの条件下で、ＦＮ、ＬＮ又はレクチンには無関係に、タンパク質のほとんど 全量が、ガラス板に吸着された。例えば、１００μｇ／ｍ１ＦＮを適用したとき 、１２．５±１゜８μｇ／ｍｍ’が吸着された。同様に、ガラス板上で乾燥した Ｇ５ｌ７−リポソームのほとんど全てが吸着された；例えば、２００μｇ／　ｍ 　ｌ　Ｇ　Ｓ　Ｌ−リポソームを適用したとき、３１．３±５．２μｇＧＳＬ／ ｍｍ’が吸着された。

２ｘｌＯ”マウス又はヒトＥＣを含有する懸濁液１００μｌをガラス板上に配置 し、ＣＯ２インキュベーター内で３７’Ｃて前面成長が得られるまで培養するこ とにより、ＥＣを塗布した。

接着分子又はＥＣで塗布したプレートをフローチャンバー内に固定し、Ｂ］６メ ラノーマ細胞の懸濁液を、上記したようにしてチャンバーを通過させた。Ｂ１６ 細胞を、０．０２％ＥＤＴＡを含有するＰＢＳを用いて培養から収穫し、１ｘｌ Ｏ’／ｍｌの濃度でＰＢＳに懸濁した。

動的流れ系における活性化ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃに対するＨＬ６０接着ＨＬ６０−Ｈ ＵＶＥＣ接着に及ぼす種々のｍＡｂ及びノアリダーゼ類の影響を、動的流れ系に おいても試験した。一般的に、ｍＡｂの効果は、静的系の場合に観察された効果 と類似していた。ｍＡｂＳＮＨ４は、種々の剪断応力下で全く抑制効果がなかっ た。ｍＡｂＳ　ｌ−ｒ　ＩとＦＮ２は、中程度の抑制を示した。ここでも、５Ｎ Ｈ４＋Ｓ　ＨＩ又はＰＨ２の組み合わせにより、最も強力な抑制が得られた。

接着は、ＮＤＶノアリダーゼにより中程度に減少し、ヒブリオ又はアルトロバク ターンアリダーセによりほとんど完全に抑制された。

第１５図参照。

ＨＬ　６０を用いて得た上記の結果は、炭水化物エピトープにおけるノアル酸の 存在は、Ｅ−セレクチンに対する結合特異性を付与するするのに重要であること を示唆している。しかしながら、シアル酸残基は、末端ＧａｌてＧ２−３結合さ れる必要はなく１代わりに、シアル酸残基は、内部位置、例えば、内部Ｇａｌ又 はＧｌｃＮＡＣに結合して存在することができる。しかしながら、ＧＩｃＮＡｃ でα１→３フコノル化が必須であることは明白である。

動的条件下で、ＮＤＶンアリダーゼは低剪断応力でのみ抑制効果を示したのに対 して、〜ｌＣ又は、へＵノアリダーゼは高剪断応力でさえ接着を顕著に減少させ た。抗−Ｌｅ”　Ｉ　ｇＧｍＡｂＳＨｌは高剪断応力でさえ接着を強力に抑制し たのに対して、抗−８Ｌｅ’　ＩｇＧ３ｍＡｂＳＮ）（４の効果はごく小さかっ た。最も強力な抑制は、ＮＤＶノアリダーゼ＋抗−Ｌｅ’ｍＡｂＳＨＩの組み合 わせにより生した。抗−Ｌ　ｅ　’十抗−８Ｌｅ’ｍＡｂの混合物は、」１記い ずれかのｍＡｂ単独よりも抑制効果が大きかった。

第１９図に示すように、低剪断応力（く４ダイン／ｃｍ２）で、ＮＤＶンアリダ ーゼ又はｍＡｂＳＮＨ４により接着が顕著に抑制されたのに対して、これらの試 薬は、高剪断応力（８〜１６ダイン／ｃｍ’）では何ら効果を示さなかった。こ れに対して、ＶＣンアリダーゼは、高剪断応力で接着を完全に消失させた。ｍＡ ｂｓＨｌは、低剪断応力でより高剪断応力で接着を強力に抑制したが、その差は 比較的小さかった。

Ｌｅ’単独では、Ｅ−セレクチンエピトープとしては明らかに十分てはない。む しろ、α２→３＋α２→６シアリル化構造が必要である。Ｌｅ’−リポソーム及 びＬｅ″−リポソームは、ＥＬＡＭ塗布プレートに結合し、ＳＬｅ’による結合 は、Ｌｅ’又は他の糖脂質による結合よりも強い。しかしながら、これらのエピ トープは、多層Ｏ−グリコリル化ムチン型糖タンパク質の形態で細胞表面に存在 するはすである。Ｓ　Ｌ　ｅ　’だけでなくＬｅ’　も同しＣＨＯ鎖内の内部Ｇ ａｌ又はＧＩｃＮＡｃでα２→６シアリル化されるか、Ｇ２−６シアリル化は隣 接する分岐構造に存在することがある。内部α１→３フコ／ル化（Ｈａｋｏｍｏ ｒｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ。

ｌｙ＋ＩＹｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１１３　：　７９１、＋　９８３ ）を有するＧ２−６シアリル化２型鎖構造である「６−Ｃガングリオシド」は、 Ｅ−セレクチンに結合しなかった。したがって、上記構造は、Ｅ　１．、　Ａ　 Ｍエピトープとしての可能性がない。

実施例７ Ｃｏｌｏ２０１細胞接着：種々のノアリダーセ及びｍＡｂの効果ＨＬ６０細胞（ 主に２型鎖構造を発現する）とは対照的に、Ｃ。

１ｏ２０１細胞は、主に１型鎖を発現し、Ｅ−セレクチン依存Ｃ。

１ｏ２０１接着は、ｌ車路エピトープを介する。Ｃｏ１ｏ２０］細胞を、種々の ノアリダーゼに暴露した浸種々のｍＡｂで処理し、残留結合についてのアッセイ を行った。ＣＱ１０２０１とｍＡｂＣＡ１９−−９（ＳＬｅ″　Ｉに対する）と の反応性は、ビブリオシアリダーゼによりほとんど完全に抑制され、アルトロバ クター及びＮＤＶ／アリダーゼによる抑制程度は、それよりも小さがった。

これに対して、Ｃｏ１ｏ２０１とｍＡｂＦＨ７（ジーＳＬｃ’及びＳＬｅ’ｌｌ に対する）との反応性はアルトロバクターンアリダーゼにより減少したが、ビブ リオ又はＮＤＶシアリダーゼによる影響はごく小さかった。Ｃｏ１ｏ２０Ｊとｍ ＡｂＣＡ３Ｆ４　（Ｎｕｄｅｌｍａｎ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１：５ ４８７．１９８６）との反応性は、シアリダーゼ処理により増強された。ｍＡｂ ＣＡ］９−９は、Ｃｏ１ｏ２０１接着をわずかに抑制し、ビブリオシアリダーゼ による影響はごくわずかでしがながった（第１６図）。

Ｃｏ１ｏ２０１細胞の表面に存在するＳＬｅ”エピトープは、（］）］Ｅ−セレ クチン依存接についてＣＡ］９−９の影響を受けず、そして（１１）シアリダー ゼ処理に感受性がないように構成することが可能である。ｍＡｂＦＨ？（上記Ｎ ｕｄｅ　Ｉｍａｎ等）の抑制効果及び、より厳密には、Ｅ−セレクチン塗布プレ ートに対するＣｏ１ｏ２０１接着についてのｍＡｂＣＡ３Ｆ４の効果は、細胞を ビブリオシアリダーゼで前処理することにより増強された。アルトロバクターン アリダーゼは、ＣｏＩｏ２０１接着を４．少させたが消失はしなかった。第１７ 図参照。

動的流れ系におけるＥ−セレクチン塗布プレートに対するＣｏｌ。

２０１接着 動的流れ系において、ＮＤＶノアリダーゼは、特に高剪断応力ては、Ｃｏ１ｏ２ ０１接着に何ら影響を及ぼさなかった。抗−５Ｌｅ’ＪｍＡｂＣＡ　ｌ　９−９ は効果がなかったのに対して、抗−８Ｌ　ｅ　’１１ｍＡｂＦＨ７は中程度の抑 制効果があった。この結果は、静的系に一ついての結果と一致する。

低剪断応力と高剪断応力の両方で、最も強力な接着の抑制か、次体ＧｌｃＮＡｃ にα２−６ンアロンル置換を有するＩ−ｅ“に対するｍＡｌ〕ｃＡ３Ｆ４におい て観察されｔこ。末端α２→３ノアロノル結合を効率的に開裂するが内部シアル 酸残基の除去ではもっと効果が小さいビブリオシアリダーゼは、高剪断応力であ る程度接着を減少させたが、低剪断応力ではそれほどではなかった。

同様に、ｍＡｂＣＡ３Ｆ４は、高剪断応力では強力に接着を抑制したが、低剪断 応力ではそれよりもはるかに抑制効果が小さかった。

ビブリオシアリダーゼ＋ｍＡｂＣＡ３Ｆ４の組み合わせは、高剪断応力と低剪断 応力の両方で強力に抑制を生じた（第１８図）。

同様の傾向が、末端α２−３シアロンル結合を特異的に開裂するＮＤＶンアリダ ーゼについて観察された。高剪断応力又は低剪断応力て、Ｃｏ１ｏ２０１接着は 、ＮＯＶシアリダーゼ単独処理でも、Ｎ　Ｄ　Ｖノアリダーゼ処理後ｍＡｂｃＡ １９−−９処理したときでも影響されなかった。一方、ＮＤＶシアリダーゼ処理 後ｍ　Ａ　ｂ　Ｆ　ｉ（７又はＣＡ３Ｆ４処理したところ、高剪断応力と低剪断 応力の両方で、接着が強力抑制された。

Ｅ−セレクチン塗布プレートに沿ったＣｏ１ｏ２０］細胞のローリング速度（８ ｍ７秒）を、種々のシアリダーゼ及びｍＡｂでの処理後計価した。３種の異なる 剪断応力で、速度は、ＮＤＶンアリダーゼ及びｍＡｂｃＡ１９−９による影響を 受けなかった；即ち、一旦停止（０μｍ／秒）した細胞は、再びローリングする ことはなかった。しかしながら、ビブリオ又はアルトロバクターシアリダーゼ又 はｍＡｂＣＡ３Ｆ４ては、一旦停止した細胞が再びローリングした：この際、生 じた速度は、剪断応力に依存した。最大速度は、ＣＡ３Ｆ４＋ビブリオンアリダ ーゼの組み合わせでの処理により得られｌこ。

静的系における活性化ＨＵＶＥＣに対するＣｏ１ｏ２０１接着Ｅ−セレクチン塗 布プレートに対するＣｏ１ｏ２０１接着について見られるように、ｍＡｂｃＡ１ ９−９及びＦＨ７の効果は、無視てきる程度であったが、ｍＡｂＣＡ３Ｆ４は、 接着を強力に抑制した。細胞を、末端α２−・３ノアロシル結合を開裂するＮＤ ■シアリダーセで、短時間又は２４時間処理しても、接着は顕著には減少しなか った。ビブリオシアリダーゼで２４時間処理したところ、接着が完全に消失した 。ビブリオ及びアル］・ロバクターノアリダーセでの短時間処理では、なお接着 が顕著に減少した。

動的流れ系における活性化ＨＵ　Ｖ　Ｅ　Ｃに対するＣｏ１ｏ２０１接着接着の 抑制は、ｍＡｂＣＡ３Ｆ４が最も強力てあり、ｍ　Ａ　ｂ　ＣＡ１９−９ては効 果かなかった。未置換ｌ車路に対するｍＡｂｌＮＨｌ又はＳＴ４２１　（Ｓ　ｔ 　ｒｏｕｄ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６６：８４３９、＋　９９１）も、 顕著な抑制を生した。接着は、ＮＤＶンアノアーセによっては影響を受けなかっ たが、ビブリオシアリダーゼによって強力に抑制された。

上記で観察されたＥ−セレクチン塗布プレート及びＩ−Ｉ　Ｕ　Ｖ　Ｅ　Ｃに対 するＣｏ１ｏ２０１接着に及はすシアリダーゼ及びｍＡｂの影響は、Ｅ−セレク チンにより認識される１型鎖エピトープは、内部シアロノル化及びフコンル化さ れていることを示唆している。

実施例８ トランスメンブレン及び細胞質ドメインを欠如したトランケート組み換えＥ　Ｌ 　Ａ　Ｍ　−１を使用して、例えば、標準クロマトグラフィーカラムに充填でき るビーズに塗布する。ＥＬＡＭ−１をＯ，１〜１μｇ７”ｍｌの濃度でビーズと 混合し、混合物をインキュベーションして、ビーズマトリックスにＥ　Ｌ　Ａ　 Ｍ　１を結合させる。適当なインキュベーノジン時間は、４８Ｃ〜室温で１２〜 ２４時間である。

ビーズを洗浄して未結合ＥＬＡＭ−１を除去し、必要に応じて、ＢＳＡ等の不活 性担体てブロックし、再び洗浄する。

ＥＬＡＭ−１塗布ビーズは、バッチプロセスで使用するか、適当な大きさのカラ ムに充填できる。

ＨＬ　６０及びＣｏ１ｏ２０］等のＥＬＡＭ−１に結合可能な炭水化物を担持す ることが知られている細胞が得られる。細胞を溶解して、凍結−解凍サイクルの 反復等の公知の方法を用いて膜分画を得る。膜分画は、例えば、遠心分離により 得られる。

もし細胞源かＥＬＡＭ−１に結合可能な炭水化物のみ又は前記炭水化物を主に発 現することが知られているならば、膜試料は、さらに精製を必要としない適当な 細胞源である。

膜試料を、公知の方法を用いて処理し、膜成分試料を得、特に、細胞表面炭水化 物を含有する分画を得る。炭水化物に富んだ分画を、・　フォーマントに応して ＥＬＡＭ−１アフイニテイーマトリツクスと混合するかそれを通過させ、このマ トリックスを次に洗浄し、そしてマトリックスに結合した炭水化物を、例えば、 マトリックスを高塩緩衝液に暴露することにより溶出させる。

得られた試料は、ＥＬＡＭ−１に結合できる炭水化物を含んでなり、種々の種を 、ＴＬＣやＨＰ　Ｌ　Ｃ等の公知の手法を用いて分離できる。

実施例９ 公知の試薬及び方法を用いて化学的に調製（例えば、上記実施例１参照）するか 、酵素的に調製するか、適当な細胞から得た（例えば、上記実施例８参照）ＥＬ ＡＭ−１に結合できる炭水化物、又はＥＬＡＭ−１に結合可能な炭水化物を発現 することが知られている全細胞は、適当な宿主で免疫抗原としての役割を果たし て、それに対する抗体を生じる。ポリクローナル抗体かモノクローナル抗体が得 られ、適当な宿主は、公知の方法及び優先性に基づいて選択される。炭水化物、 細胞、細胞リゼイト又は膜試料を、アジュバントを用いるか用いずに、免疫応答 を生しるスケジュールで宿主に投与する。

ポリクローナル抗血清の場合、採血し、血清を分離し、試験を行う。

モノクローナル抗体の場合、宿主動物の膵臓を除去し、この膵臓から得た細胞を 、公知の手法を用いて適当な骨髄腫細胞で溶解させる。

抗体の特異性は、例えば、適当な標識試薬及びリポータ−分子を用いた精製組み 換えＥＬＡＭ−１及びｍＡｂ３Ｂ７を含んでなるＥＬＩＳＡを用いてトラッキン グできる。

式（１）、（Ｉ　Ｉ）及び（Ｉ　Ｉ　Ｉ）の炭水化物に対する抗体は、抗原とし て特異的炭水化物種を用い、スクリーニングＥＬＩＳＡにおいて得ることができ る。

また、抗血清は、ＳＬｅ”及び／又はＳＬｅ’を担持した細胞を用いるか、Ｓ　 Ｌ　ｅ″及び／又はＳＬｅ”のみを結合した固体マ］・リックスを用いて吸着に より「単一特異性」とすることができる。ＥＬＡＭ−１に結合できる炭水化物に 対する残留活性は、一部分は式（１）、（ＩＩ）又は（Ｉ　Ｉ　Ｉ）の炭水化物 に対する抗体によることがある。

実施例１Ｏ ＮＳ−−１細胞を、ＡＴＣＣ（メリーランド州ロックビル）から入手し、ＩＯ％ ＨＩＦＣ８を補充しりＲＰＭＩ　１６４０　：ダルヘッコＭＥＭ　（１：　Ｉ） に保持した。ベクターｐＣＤＭ８にＥ−セレクチンのｃＤＮＡを含んてなるプラ スミド（ミネソタ州ミネアポリスにあるＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）５０μｇ と、ｐＳＶ２−ｎｅ。

（ＡＴＣＣ）５μｇとを、電気全孔法によりＮＳ−１細胞（Ｉｘ１０７個）に共 移動させた。培養中で４８時間経過後、細胞を、６５０μｇ／ｍ１Ｇ４１８にュ ーヨーク州グランドアイランドにあるＧｉｂｃｏ社製）を含有する培地に移した 。

１５〜２０日後、得られたコロニーを、ｍＡｂ（メリーランド州ロックビルにあ る大塚製薬株式会社メリーランドリサーチラボラド’Ｊ　−スＷ、　Ｎ　ｅ　ｗ ｍ　ａ　ｎから入手）で染色することによりＥ−セレクチン発現に関してスクリ ーニングした。高レベルのＥ−セレクチンを発現する変異体を、ｍＡｂを用いて バンニングした後限界希釈してクローン性を得ることにより単離した。

ＳＬｅ’　、ＳＬｅ’　、Ｌｅ’　、Ｌｅ’　、Ｈ−２、ノアリルパラグロボン ド（ＳＰＧ）、ジンアロシルＩ　（第２０図の構造６）及び二量体ＳＬｅ″に対 するトランスフエフテッドＮ５−１細胞を用いたＥ−セレクチン依存接着を、種 々の剪断応力条件で比較しｆ＝ｏ１ｍｍ２当たり接着した細胞数を、ＳＬ’ｅ’ 塗布プレートに対する接着（１００％とする）に対する値で表す。

Ｌ　ｅ　’及びＬｅ”に対する接着は、高剪断応力でわずかに増加したのに対し て、接着した細胞の絶対数は、ＳＬｅ”及びＳＬｅ”で観察されたよりも低剪断 応力及び高剪断応力の両方ではるかに低かった。第２０図の構造ｌでの接着は、 中剪断応力及び高剪断応力条件で増強された。

第２０図の構造ｌの高結合能を、リポソーム（グリコリポソーム）に低濃度の糖 脂質を用いてさらに明らかにした。ＳＬｅ”　リポソームに対するトランスフエ フテッドＮ５−１接着は、Ｌｅ’又はＬｅｙを添加し、混合グリコリポソームと して提供したときに増強された。実験結果を、第２１図〜第２４図に示す。

上記の事柄から、具体的実施態様により本発明を説明したが、本発明の精神及び 範囲から逸脱することなく種々の修正ができることは明らかであろう。

本明細書で引用した全ての文献は、引用することにより本明細書の開示の一部と される。

第２図 生存年数 第３Ａ図 生存年数 第３８図 生存年数 第３Ｃ図 調査月数 第３Ｄ図 ＬａｃＣａｒ　、ｕｇ／ｒｎｌ ［ＦＮ］ｐｑ／ｍｌ 抑制剤濃度（μＭ） 糖脂質塗布量（μｇ） 糖脂質塗布量（μｇ） 結合指数　第９図 抑制％　第　、　０図 第１１Ａ図 第１１Ｃ図 第１１Ｄ図 区 派 （Ｉｌｌ／　ｘ　−ｏ　Ｉｘ　）　暑ｇ［ｌｔ凋醜購詳計　醤硯騰聾計　發剛噂 何計 （９１，，１−１：［Ｉ４）　ｉｆｆ　Ｏ９’Ｉ　Ｈ（％９Ｊ−鐸）墓ば）置引 ０９１Ｈ （％９４何″２扉ｔイ）暑ぜ７０９”ＩＨ第１５Ａ図　第１５Ｃ図 壁剪断応力（ダイン／ｃｍ”）　壁剪断応力（ダイン／ｃｍ”第１５Ｂ図　第１ ５Ｄ図 醤晴ｍ鐸附・ 騙ｆ１ｉｌＩｌｌｔｕ街 騙國噂傳街 第１７Ａ図　第１７Ｂ図 第１７Ｃ図 第１８Ａ図 第１３．８図 第１８Ｃ図 （％９科口塵Ｕ）暑折０９］Ｈ Ｆｕ匁１ 第２０図 ｕＣａＩ Ａ２ 第２０図（続き） 第２１Ａ図 第２１Ｂ図 第２２図 ＠　ＳＬｅ”＋５ＰＧ ｏ　ＳＬｅ”　＋　）ｊ２ ＳＬｅ”（μＭ） ＧＳＬ　（μＭ） 第２４図 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８の規定による補正書）１ツ。イ８□１９８Ｉ

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．下式で表される炭水化物又はその置換誘導体；▲数式、化学式、表等があり ます▼ 〔式中、Ｒ２はＨ又はα２→６結合シアル酸であり、Ｒ４はＨ又はα１→３結合 フコースであり、Ｒ５はＨ、α２→３結合シアル酸、α２→３結合ＮｅｕＡｃα ２→８ＮｅｕＡｃ二糖類、又はα２→３結合Ｒ６−シアル酸炭水化物（但し、Ｒ ６は一種以上の糖質である）であり、そしてｎは０以上の数である〕。
2. ２．下式で表される炭水化物又はその置換誘導体：▲数式、化学式、表等があり ます▼ （式中、Ｒ１はＨ又はα２→３結合シアル酸であり、Ｒ２はＨ又はα２→６結合 シアル酸であり、Ｒ３はＨ又はα１→４結合フコースであり、そしてｎは０以上 の数である）。
3. ３．下式で表される炭水化物又はその置換誘導体：▲数式、化学式、表等があり ます▼ （式中、Ｒ１０及びＲ１１の各々はガラクトース、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃ 又はＧａｌβ１→３ＧｌｃＮＡｃを含んでなり；Ｒ■はガラクトース又はＧａｌ ＮＡＣを含んでなり；そしてＲ９はラクトシルセラミド又は炭水化物を結合する 脂質若しくはタンパク質の酸素基を含んでなる）。
4. ４．Ｒ１０はＬｅｘエピトープを含んでなり、Ｒ１１はＳＬｅｋエピトープを含 んでなる請求の範囲第３項に記載の炭水化物。
5. ５．Ｒ■はＧａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃである請求の範囲第４項に記載の炭水化 物。
6. ６．Ｒ９は炭水化物を結合する脂質又はタンパク質の酸素基である請求の範囲第 ５項に記載の炭水化物。
7. ７．Ｒ１０はＬｅ４エピトープを含んでなり、Ｒ１１はＳＬｅ４エピトープを含 んでなる請求の範囲第３項に記載の炭水化物。
8. ８．下式で表される請求の範囲第３項に記載の炭水化物又はその置換誘導体： ▲数式、化学式、表等があります▼
9. ９．請求の範囲第１〜８のいずれか１項項に記載の炭水化物又はその誘導体に特 異的に結合する抗体。
10. １０．前記炭水化物が請求の範囲第４項に記載の炭水化物である請求の範囲第９ 項に記載の抗体。
11. １１．前記炭水化物が請求の範囲第７項に記載の炭水化物である請求の範囲第９ 項に記載の抗体。
12. １２．前記炭水化物が請求の範囲第８項に記載の炭水化物である請求の範囲第８ 項に記載の抗体。
13. １３．内皮細胞に対する腫瘍細胞又は白血球付着に関与する少なくとも二種の炭 水化物を含んでなる組成物。
14. １４．前記少なくとも二種の炭水化物のうちの一種がＳＬｅｘである請求の範囲 第１３項に記載の組成物。
15. １５．さらにＬｅｘを含んでなる請求の範囲第１４項に記載の組成物。
16. １６．さらにＬｅｙを含んでなる請求の範囲第１４項に記載の組成物。
17. １７．前記少なくとも二種の炭水化物がＬｅ４及びＳＬｅ■を含んでなる請求の 範囲第１３項に記載の組成物。
18. １８．さらにリポゾームを含んでなる請求の範囲第１３項に記載の組成物。
19. １９．少なくとも二種の抗体を含んでなる組成物であって、前記二種の抗体の各 々が、請求の範囲第１３〜１７のいずれか１項項に記載の組成物である前記少な くとも二種の炭水化物の一つに特異的に結合する組成物。
20. ２０．抗体がＳＬｅｘに特異的に結合する請求の範囲第１９項に記載の組成物。
21. ２１．Ｌｅｘ又はＬｅｙに特異的に結合する抗体をさらに含んでなる請求の範囲 第２０項に記載の組成物。
22. ２２．抗体がＳＬｅａに特異的に結合する請求の範囲第１９項に記載の組成物。
23. ２３．Ｌｅａ又はＬｅｂに特異的に結合する抗体をさらに含んでなる請求の範囲 第２２項に記載の組成物。
24. ２４．末端に ▲数式、化学式、表等があります▼ を含んでなる１型鎖を発現する細胞のＥＬＡＭ−１が介在する細胞間相互作用を 阻害する方法であって、Ｌｅ４に特異的に結合する抗体に前記細胞を暴露する工 程を含んでなる方法。
25. ２５．前記抗体がＣＡ３ＦＡ又はＦＨ７である請求の範囲第２４項に記載の方法 。
26. ２６．細胞間のＥＬＡＭ−１介在細胞間相互作用を阻害する方法であって、ＥＬ ＡＭ−１に結合できる炭水化物に特異的に結合する少なくとも一種の抗体に前記 細胞を暴露する工程を含んでなる方法。
27. ２７．ＥＬＡＭ−１に結合できる前記炭水化物は、ＳＬｅ′、ハイブリッドＬｅ ｘ／ＳＬｅｘ又はハイブリッドＬｅａ／ＳＬｅａである請求の範囲第２６項に記 載の方法。
28. ２８．前記炭水化物が、下式で表される構造を有している請求の範囲第２７項に 記載の方法。 ▲数式、化学式、表等があります▼
29. ２９．ＳＬｅｘに特異的に結合する抗体を含んでなる請求の範囲第２６項に記載 の方法。
30. ３０．さらにＬｅｘに特異的に結合する抗体を含んでなる請求の範囲第２９項に 記載の方法。
31. ３１．ＳＬｅａに特異的に結合する抗体を含んでなる請求の範囲第２６項に記載 の方法。
32. ３２．さらにＬｅａに特異的に結合する抗体を含んでなる請求の範囲第３１項に 記載の方法。
33. ３３．ＥＬＡＭ−１に結合しない炭水化物に特異的に結合する抗体を含んでなる 請求の範囲第２６項に記載の方法。
34. ３４．ＥＬＡＭ−１に結合しない前記炭水化物は、Ｌｅｘ、Ｌｅγ、Ｌｅａ又は Ｌｅｂである請求の範囲第３３項に記載の方法。
35. ３５．ＳＬｅｘに特異的に結合する前記抗体がＳＮＨ３又はＳＮＨ４であり、Ｌ ｅｘに特異的に結合する前記抗体がＳＨ１又はＦＨ２である請求の範囲第３０項 に記載の方法。
36. ３６．細胞間のＥＬＡＭ−１介在細胞間相互作用を阻害する方法であって、ＥＬ ＡＭ−１、ＥＬＡＭ−１に結合できる炭水化物、シアリダーゼ、ＥＬＡＭ−１に 特異的に結合する抗体及びＥＬＡＭ−１に結合できる炭水化物に特異的に結合す る抗体からなる群から選択される少なくとも一種に前記細胞を暴露する工程を含 んでなる方法。
37. ３７．ＥＬＡＭに結合できる前記炭水化物が、α２→３結合シアル酸を含んでな る請求の範囲第３６項に記載の方法。
38. ３８．ＥＬＡＭに結合できる前記炭水化物が、Ｌｅｘである請求の範囲第３６項 に記載の方法。
39. ３９．ＥＬＡＭに結合できる前記炭水化物が、α２→６結合シアル酸を含んでな る請求の範囲第３６項に記載の方法。
40. ４０．ＥＬＡＭに結合できる炭水化物に特異的に結合する前記抗体は、α２→３ 結合シアル酸を含んでなるＥＬＡＭに結合できる炭水化物に特異的に結合する抗 体である請求の範囲第３６項に記載の方法。
41. ４１．ＥＬＡＭに結合できる炭水化物に特異的に結合する前記抗体は、α２→６ 結合シアル酸を含んでなるＥＬＡＭに結合できる炭水化物に特異的に結合する抗 体である請求の範囲第３６項に記載の方法。
42. ４２．ＥＬＡＭに結合できる炭水化物に特異的に結合する前記抗体は、Ｌｅｘに 特異的に結合する抗体である請求の範囲第３６項に記載の方法。