JPH07501442A

JPH07501442A - Ｃ型肝炎ウイルス検査

Info

Publication number: JPH07501442A
Application number: JP5509110A
Authority: JP
Inventors: シモンズ　ピーター; チャン　シュイ　ワン; ヤップ　ペン　リー
Original assignee: コモン　サーヴィシス　エージェンシー
Priority date: 1991-11-21
Filing date: 1992-11-20
Publication date: 1995-02-16
Anticipated expiration: 2020-08-24
Also published as: DE69232906T2; DE610436T1; EP0610436B1; FI113967B; ES2065863T1; US20110287410A1; AU671967B2; EP0610436B9; US8318421B2; AU3088792A; US20070128221A1; WO1993010239A3; ES2065863T3; JP3688290B2; DE69232906D1; US7709006B2; CA2123875C; FI942369A0; US20130164733A1; US5763159A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明ハ、Ｃ型肝炎ウィルス３型（ＨＣｖ−３）および４型（ＨＣＶ−４）　と呼ばれる、Ｃ型肝炎ウィルスの新型の発見に関する。特に、本発明はＣ型肝炎ウィルス３型および４型の病原体に関し、さらに、生物学的サンプル中のＨＣＶ− ３およびＨＣＶ−４を検出するための免疫アッセーに有用なポリヌクレオチドおよび免疫反応性ポリペプチドに関し、さらにまた、抗原性を有するＨＣＶ−３およびＨＣＶ−４特異的ポリペプチドのワクチンにおける使用に関する。

発明の背景急性ウィルス性肝炎は、慢性肝障害をもたらすことがある疾患である。該疾患は、患者が示す、黄痘、肝痛覚、並びにアラニンアミノトランスフェラーゼおよびアスパルテートアミノトランスフェラーセの血清レベルの増加を含む明瞭な一組の症状によって臨床的には診断がつく。血清学的免疫アッセーは一般的には、ウィルス性病原体の個々の型を診断するために行われる。歴史的には、肝炎症状を有するが、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、エプスタイン−バーまたはサイトメガロウィルスには感染していない患者は、臨床的には非Ａ、非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）罹患と仕方無ぐ診断されていた。

長い間、非Ａ、非Ｂ肝炎の病原体は定義が困難なままであった。現在、ＮＡＮＢＨの症例の多くが、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）と呼ばれる別個のウィルスによって引き起こされることが分かった。欧州特許出願公開公報ＥＰ−Ａ−０３１８２１６号は、ＨＣＶ由来ｃＤＮＡ配列、免疫アッセーにおけるポリヌクレオチドプローブおよびポリペプチドの使用を開示している。欧州特許出願公開広報ＥＰ −Ａ−０３８８２３２号は、さらに進んだ情報を提供している。

ＨＣＶゲノムは大きなポリプロティン前駆体をコードするが、この前駆体は構造領域および非構造領域を含んでいる。この単一蛋白は、産生後に明らかに種々の蛋白に切断される。現在、構造蛋白および非構造蛋白の多くは、組換え体（すコンビナンド）蛋白としてインビトロＲＮＡ翻訳および発現によって同定されている。ＣおよびＥ領域は、それぞれ、ヌクレオカプシドの構造蛋白およびエンベロープの構造蛋白をコードする。その後に少なくとも５つの付加領域が続くが、これらは、その機能が未同定の非構造（ＮＳ）蛋白をコードする。その構造は以下のようなものであると考えられている（Ａ、　Ａｌｂｅｒｔｉ、　Ｊ、　ｏｆ　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、　１９９１；　１２；　２７９−２８２）　：５・　３゜ＮＣＲ：Ｃ：Ｅｌ：Ｅ２：ＮＳＩ：ＮＳ２：ＮＳ３・ＮＳ４・ＮＳ５特定の免疫反応性蛋白が、リコンビナント蛋白、例えばＣ２２（コアー領域内）、Ｃ３３（ＮＳ３領域内）、５−１−１およびｃｉｏｏ　くともにＮＳ４領域内）として記載されている。Ｃ型肝炎の診断は未だに、多くがＣ−１００クローンの生成物に対する抗体を検出する方法に基づいている。このクローンは、Ｎ５３−ＮＳ４ゲノム領域部分に対応するより大きなウィルス抗原（Ｃ１００）を産生させるために部分的に共通するに連結された。Ｃ１００をその後ヒトの超酸化物ディスミューターゼ（ＳＯＤ）遺伝子と融合させ、大型のりコンビナンド融合蛋白（Ｃ１００−３）として使用して発現させ、さらに、固相上で用いて、放射能標１１（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着アッセー（ＥＬＩＳＡ）を起こさせる。

ＨＣＶのスクリーニングのために有用なポリヌクレオチドは、欧州特許出願公開公報ＥＰ−Ａ−０３９８７４８号に開示されている。欧州特許出願公開公報ＥＰ −Ａ−０４１４４７５号は、培養細胞でのＨＣＶの増殖および診断で使用する抗原の製造を開示することを目的としている。欧州特許出願公開公報ＥＰ−Ａ−０４４５４２３号はＨＣＶ抗体検出用の改良免疫アッセーを開示する。

英国の血液銀行は、最近、ＨＣＶ成分に対する抗体について血液供与者の常用検査を開始した。１つのアソセーはＣ１００−３ポリペプチドに対するＨＣＶ抗体の検出を含む。ＣＩ　ＯＯ−３抗体は該ウィルスの非構造領域内の複合ポリプロティン抗原を認識し、ＨＣＶ感染の一貫したマーカーである。しかしながら、急性感染では、ウィルス曝露後の血清変化が遅いので（典型的には２２週間）、この抗体は信頼できない。さらに、ＣＩ　ＯＯ−３抗体検査はＣ型肝炎ウィルスに対する特異性を欠いている。

第二世代抗体検査は、非構造抗原と同様、該ウィルスの高度に保存されたコアー領域の構造抗原を表すリコンビナントまたは合成直線状ペプチドを用いる。しかし、第二世代ＥＬＩＳＡ検査のいくつかは偽陽性反応を生じる可能性があることが分かった。ＨＣＶゲノムの４種の抗原を取り入れたりコンビナンド免疫プロットアッセー（ＲＩＢＡ−２）は、本物の抗ＨＣＶ反応性を順１１する方法を提供する。しかしながら、その結果は“非確定的”である可能性がある。本発明者らは、ＨＣＶ陽性血液供与者（７）５−１−１．Ｃ１００、Ｃ３３ＣおよびＣ２２抗原に対する反応性の変動を報告しくＬａｎｃｅｔ、　３３８；　１０月１９日号；　１９９１）、さらに、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を用いてＨＣＶポリヌクレオチドを増幅させて、血液サンプル中に存在するＨＣＶＲＮＡを直接検出した結果とこれらを比較した。しかし、この作業は、ＨＣＶ感染の明白な診断は未だ可能でないことを明らかにした。

最近、Ｋ２と呼ばれるＨＣＶの第二の型が発見された（参考文献ｌ、２）。これは、発表された基本型（参考文献３）または第一の型のＫｌ配列（参考文献４および５）とは非常に配列が異なる。

発明の要旨本発明は、以前は知られていなかったＨＣＶ３型および４型の変種の発見に基づいている。これは、ＰＣＲで増幅させ、系統発生学的分析によって確認したＨＣｖゲノムの一定の領域の配列を比較することによって発見された。したがって、本発明は、ＨＣＶ−３およびＨＣＶ−４に特異的なポリヌクレオチド配列およびポリペプチドを識別した。これらは、ＨＣＶ−３およびＨＣＶ−４感染を診断するために用いることができ、したがって、ＨＣＶ感染について確定的ないずれの検査においても用いることができる。

本発明の一局面は、Ｃ型肝炎ウィルス３型および４型（ＨＣＶ−３およびＨＣｖ −４）に固有のポリヌクレオチド配列を提供する。該配列は、ＲＮＡ配列でもＤＮＡ配列でもよい。第一に、非コード部分、コアー、Ｅｌ、Ｅ２またはＮ５Ｉ− ５ゲノム領域のＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４に特異的ないずれのポリヌクレオチド配列もハイブリダイゼーシコンブローブとして用いることができる。該配列は組換え体（すなわち形質転換細胞で発現）でも合成でもよ（、必要な場合にはより長い配列内に含ませてもよい。同様に、ポリヌクレオチドが特異的プローブとしてなお機能しえる場合は、欠失、挿入または置換もまた許される。抗原蛋白をコードする、例えばコアー、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５のようなポリヌクレオチド配列が特に有用である。

また別の局面は、抗原性を有するＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異的ポリペプチド（特にコアー、ＮＳ３、ＮＳ４またはＮＳ５領域由来）（例えばＣ１００水リペプチド、５−１−１ポリペプチド、Ｃ３３ポリペプチドもしくはＣ２２ポリペプチドのＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４対応物またはそれらのエピトープ）またはこれらの抗原を含むポリペプチドを提供する。

本発明のまた別の局面は、免疫アッセーで使用する、抗原性を有する標識ＨＣＶ −３またはＨＣＶ−４特異的ポリペプチド（またはその混合物、特にコアーおよびＮＳ４領域由来）を提供する。

本発明のまた別の局面は、治療および診断に使用する、ＨＣＶ−３またはＨＣＶ −４特異的抗原に対する抗体、特に単クローン抗体を提供する。したがって、標識抗体はインビボでの診断に使用してもよい。細胞毒性物質を含む抗体は、ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４感染細胞を攻撃するために使用することができる。

本発明のまた別の局面は、ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異的免疫誘発ポリペプチドを含むワクチンを提供する。

該ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異的ポリヌクレオチド配列は、ＨＣＶウィルス自体（通常はＰＣＲによって増幅させる）をｌ＼イブリダイゼーション技術によって同定するために用いることができる。

ＮＳ−４領域の種々の領域に該当するオリゴヌクレオチドは、型特異的ＰＣＲのために用いることができる。アウターセンスおよびインナーセンスプライマーは、ＨＣＶＩ型、２型、３型および４型の特異的検出方法のために、２種の保存アンチセンスプライマーと組み合わせて用いることができる。

免疫反応性を有するＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異的ポリペプチド（特にコアーおよびＮＳ４領域由来）は、生物学的サンプル中のＨＣＶ−３およびＨＣＶ− ４抗体を検出するために用いることができ、さらにまたワクチンに含まれる免疫原の主成分を提供する。“ペプチド”という用語は、本明細書では抗原性を有する最小数のアミノ酸残基を有するエピトープペプチド、オリゴペプチドから蛋白までを含んで用いられている。該ペプチドは、形質転換細胞で発現されたりコンビナンドペプチドでも、また化学的合成によって製造された合成ペプチドでも　゛よい。

特に、本発明は、通常のアッセーによる血液供与者のスクリーニングを第二の検査で補うことを可能にする。この検査は、ＨＣＶａ型のＮＳ−４配列に見出される第一および第二の抗原領域に対応する２種のオリゴペプチド（１６９１から１７０８位まで；配列ＫＰＡＬＶＰＤＫＥＶＬＹＱＱＹＤＥＭオヨび１７１０から１７２８位まで；配列ＥＣＳＱＭＰＹＩＥＱＡＱＶＩＡＨＱＦ）　、並ヒｉ：ＨＣＶ　２　型１７１対応スル領域に由来する２種、Ｒ（Ａ／Ｖ）Ｖ　（Ｖ／Ｉ）（Ａ／Ｔ）ＰＤＫＥ　（１／Ｖ）ＬＹＥＡＦＤＥＭおよびＥＣＡＳ　（Ｋ／Ｒ）ＡＡＬＩＥＥＧＱＲ（Ｍ／Ｉ）ＡＥＭＬを含んでいる。

実質的に１６９１から１７０８位および１７１０から１７２８位由来の対応するＨＣＶ−４抗原は、ＨＣＶ−４検出に用いることができる。

したがって、本発明はまた対応するポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を識別し、これはＣ型肝炎２型ウイルス感染を同定するために用いることができる。

抗原抗体免疫複合体の生成および検出は、当該技術分野で現在知られているいずれの方法によっても実施することができる。例えば、酵素、放射性同位元素、蛍光、ルミネッセンスまたは化学ルミネッセンス標識のような標識が用いられ、通常抗原に結合させることができる。標識抗−抗体系もまた用いることができる。

リコンビナント抗原は、液相で用いても、また固形基材に結合させてもいずれでもよい。

３種のすべての主要型の抗原領域に該当するオリゴペプチドはまた、異なる型のＨＣＶに感染した個々人を血清学的に区別するために別々に用いてもよい。そのようなアノセーは、ＨＣＶ４．３および２型の主要な２種の抗原領域のオリゴペプチド、並びに１型（ＫＰＡ　ｆｆ／Ｉ　）Ｉ　ＰＤＲＥＶＬＹＲＥＦＤＥＭオヨｒＪＲＰＡＶ（１／Ｖ　）ＰＤＲＢＶＬＹＱＥＦＤＥＭおよびＥＣ３ＱＨＬＰＹＩＥＧ（Ｍ／Ａ）ＡＥＱＦ）で被覆した数組のくぼみ（ウェル）またはビーズを用いる間接酵素免疫アッセー形式であってもよい。些細な程度の交差反応性が存在する場合には、それを阻止量の可溶性異種型オリゴペプチドを含む希釈液で被験血清を希釈して吸収し、型特異的な抗体反応性を有する抗体のみが固相に結合していることを確認することができる。

ワクチン製剤で使用する免疫原は、当該技術分野で現在知られている技術にしたがって製剤化することができる。これは、適切なアジュバントの使用および免疫刺激系を含む。

最後に、本発明はまた、ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４抗原の少なくとも１っΦエピトープを含むポリペプチド（またはそれに対する抗体）を、必要な調製用試薬、洗浄用試薬、検出試薬およびシグナル発生試薬と同様に含むアツセーキットも包含する。

図面の説明本発明の実施例は、単なる一例としてこれから詳述する。

図１およびｌａは、１８人の血液供与者のＨＣＶサンプルの５゛非コード領域の領域−２５５から−６２のＰＣＲによる増幅、および以前に発表されたヌクレオチド配列（表２参照）との比較によって得られたｃＤＮＡ配列を示している。

配列の数字はプロトタイプのＨＣＶ−１配列（参考文献４）に対応し、さらにｌ型または２型の以前の名称か示されている。

図２は系統発生学的分析であるが、最大公算アルゴリズムを用いた図１の５′ＮＣＲの結果により、配列が３種の型ぐすなわちＨＣＶｌ、ＨＣＶ−２およびＨＣＶ−３）の集団（根幹をもたない系統樹として示す）に分けられることを示している。白丸内の数字１〜１８は、血液供与者配列Ｅ−ｂＩからＥ−ｂ　Ｉ　８に該当する。白丸内の数字１〜２６は、表２で明らかにした先に発表された配列に該当する。

図３は、血液供与者（Ｅ−ｂｌ、Ｅｂ２、Ｅ−ｂ３、Ｅ−ｂ７　（３型）およびＥ−ｂｌ２（２型））のＮ５−５領域の推定アミノ酸配列と以前に発表されたもの（表２）との比較である。アミノ酸残基の数字はＨＣＶ−１ポリプロテインのそれ（４）に従い、１文字のアミノ酸コードを用いている。

図４は、最大公算アルゴリズムを用いた、ＭＳ−５領域の系統発生学的分析を根幹のない系統樹として示している。記号は図２について説明した通りである。

図５は、血液供与者（Ｅ−ｂｌ、Ｅｂ２、Ｅ−ｂ６、Ｅ−ｂ７　（３型））のＮ５−３領域の推定アミノ酸配列と以前に発表されたもの（表２）との比較である。

グループＩ／１：ｆｌｆ３、Ｔ４、Ｔ５、ｈｌ、ｈ３、ｈ４　（１名）、１２．１３．１４、ｐＬｐ２のアミノ酸配列；グループｌ／２＋ｉ５のアミノ酸配列ニゲループ１／３・ｈｌ、ｈ３、ｈ４（１名）、ｈ５、［２、ｐ３．１１のアミノ酸配列；グループＩ／４：ｈｌ（１名）のアミノ酸配列ニゲループＩ１５　：　ｈｌ　（１名）のアミノ酸配列。数字、記号および略字は図３について説明した通り。

である。

図６は、最大公算アルゴリズムを用いた、Ｎ５−３領域の系統発生学的分析を根幹のない系統樹として示している。図５に示したｌ型の配列の５グループの代２０（黒丸）ｉ４；２１　（黒丸）ｈ５；２２（黒丸）ｈ３；２３（黒丸）ｈ１０記号は図２について説明した通りである。

図７は、血液供与者Ｅ−ｂｌ（３型）のコアー領域の推定アミノ酸配列と以前に発表されたもの（表２）との比較である。数字、記号および略字は図３について説明した通りである。

図８は、最大公算アルゴリズムを用いた、コアー領域の系統発生学的分析を根幹のない系統樹として示している。記号は図２について説明した通りである。

図９ａおよび図９ｂは、ＨＣＶの推定Ｎ５−４領域で５人のスコツトランド人血液供与者（４０，３８，３６，２６および１７８７番）かう増幅させた、ＨＣＶ３型変種のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列をそれぞれ示している（ヌクレオチドおよびアミノ酸残基はクーら（Ｃｈｏｏら、（＋９９１））のように番号付けされている）。ヌクレオチドコード　Ｇ　グアニジン；Ｃシチジン、Ａ・アデニン１Ｕ・ウリジン。アミノ酸コード、Ａ、アラニン、Ｒ・アルギニン、Ｎ゛アスパラギンＤ　アスパラギン酸、Ｃシスティン；Ｑ・グルタミン、Ｅ：グルタミン酸、Ｇ、グリシン：Ｈ，ヒスチジン、■　イソロイシン、Ｌ　ロイシン；にリジン、Ｍ、メチオニン：Ｆ　フェニルアラニン：Ｐ・プロリン；Ｓ　セリン：Ｔ　スレオニン：Ｗ、トリプトファン；Ｙ　チロシン：Ｖ　バリン。“・”は未定の配列である。一致性から外れているものは肉太活字で示されている。

図１０（ａ）は、ＨＣＶの主要３変種の残基１６７９と１７６８との間のアミノ酸残基の比較を示している（Ｃｈｏｏら、＋９９１）。Ｔ１６、Ｔ４２、Ｔ７７、Ｔ１８０１、Ｔ１８２５：ＨＣＶＩ型感染スコツトランド人血液供与者　Ｔ３５１：ＨＣＶ２型感染スコツト−ｙンド人血液供与者：Ｔ５９、Ｔ９４０．　Ｔ８１０　ＨＣＶ２型感染スコツトラント人血液供与者：Ｔ４０、Ｔ３８、Ｔ３６、Ｔ２６、Ｔ１７８７：ＨＣＶ３型感染スコツトランド人血液供与者。図１０（ｂ）は、ＨＣＶ３．２およびｌ型オリゴペプチド列の一致（コンセンサス）配列の変動を示している。一致性から外れているものは肉太活字で示されている。アミノ酸コード　Ａ：アラニン、Ｒアルギニン、Ｎ　アスパラギン、Ｄ　アスパラギン酸：Ｃシスティン：Ｑ　グルタミン、Ｅ　グルタミン酸：Ｇ、グリシン；Ｈ：ヒスチジン：■　イソロイシン、Ｌ　ロイシン；Ｋ　リジン、Ｍ・メチオニン：Ｆ：フェニルアラニン、Ｐ・プロリン、Ｓ、セリン；Ｔ・スレオニン：Ｗ・トリプトファン、Ｙ　チロシン、Ｖ　バリン。“・”は未定である。

図ＩＩ（ａ）からＩＩ（ｃ）は、ＨＣＶ３．２および１型のコンセンサス配列からそれぞれ由来した、エピトープマンピングに用いた９−重合オリゴヌクレオチドのアミノ酸配列を示している。アミノ酸コード・Ａ・アラニン：Ｒアルギニン、Ｎ・アスパラギン、Ｄ　アスパラギン酸；Ｃシスティン；Ｑ；グルタミン、Ｅ　グルタミン酸：Ｇ　グリシン、Ｈ，ヒスチジン、■　イソロイシン、Ｌロイシン、Ｋ　リジン、Ｍ　メチオニン、Ｆ、フェニルアラニン；Ｐ　プロリン、Ｓ　セリン、Ｔ　スレオニン、Ｗ・トリプトファン：Ｙ　チロシン、Ｖ　バリン。

図１２ａ、１２ｂおよび１２ｃは、ＨＣＶ３型感染血液供与者の３種の血清の、ＭＳ−４の抗原領域（図１１ａに示した配列１−８２）のＨＣＶ３型コートオリゴペプチドに対する抗体反応性を示している。オリゴペプチド（ｙ軸）に対する抗体反応性は−０１から０．７５（および＞０．７５）の範囲で光学的濃度としてｙ軸に表されている。

図」３は、多様化ＨＣＶ配列と代表的１．２および３型との５°ＮＣＲの種々の領域における比較である。−２５５から−２４６、−２１５から−１８６、−１１５から−１０２および−６９から−６２の配列はプロトタイプの配列と同一である。“　ＨＣＶ−１との配列同一性：“、”　直線性を保持するために配列に導入されたギャップ、“−”　：未定配列。配列の由来：Ｅｇ−１−３３：エジプト；ＮＬ−２６：オランダ；ＨＫ−１−４：香港；　ＩＱ−４８：イラク；ＸＸ−９６：ｘｘｘｘｘｏ　Ｏ内の数字は各々同一でない配列の数字を表している。

図１４は、最大公算アルゴリズムを用いた、５°ＮＣＲ領域の系統発生学的分析で、根幹をもたない系統樹として表されている。黒丸の配列１−１７は、図１゜３と同様に数字が付けられている。先に発表された配列は（９９２）の表１と同様に数字が付けられている。スコツトランド人の血液供与者の配列Ｅｂ−＋ＬＥｂ１２は、白丸の数字５１−６２である。明快にするために、同一でない配列のみを系統樹に示す；例えば、配列１はサンプルＥｇ−１６およびＥｇ−２９などで見出されたものと一致する（図１）。白四角はすでに発表されたザイールからの配列で、白い小円は南アフリカからの配列で；黒い小円は世界のその他の地域で得られた配列である。

図１５Ａ／Ｂは、コアー領域のヌクレオチド（Ａ）およびアミノ酸（Ｂ）配列の比較である。記号は図１３と同様である。１文字のアミノ酸コードが使用されている。

図１６は、最大公算アルゴリズムを用いた、コアー領域の一部分の系統発生学的分析で根幹をもたない系統樹として示されている。配列は図１４と同様に数字を付けられている：配列３０はＨＣ−Ｊ８のそれである（才力モトら、ＶｉｒｏｌｏｇＹ１８８：３３１−３４１）。

図１７は、Ａ）　（Ｈａｅｌｌｌ／Ｒｓａｌ）および、Ｂ）　（ＳｃｒＦｌ）による５°ＮＣＲにおける切断パターンを示している。

英国の個々の感染者の血漿から増幅されたＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）の５゜非コート領域の配列分析によって、ＨＣＶの３種の異なるグループ（ヌクレオチド配列において９−１４％の違い）の存在が明らかにされた。同定されたグループのうちの２種は、１型および２型と以前に呼ばれたＨＣＶの変種のそれと同じであったが、第三のグループは新規なウィルス型を表しているようであった。続いて配列の比較が３種のウィルス型の間で該ウィルスゲノムの他の領域において行われた。Ｎ５−５領域においては、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の高度な多様性が認められ、この場合“３”型として分類したサンプルについては、再度１型および２型の変種とは系統発生的に異なる別個のグループを形成していた。

３型配列は、同じようにＮ５−３およびファー領域においてＨＣＶｌ型配列から分化していた。観察された１型間列の地理的に異なる変種への下位区分を含めて、ウィルス型の名称を、本研究で得られた新規な配列のデータとの関連において考察する。

複製は最近確立された技術である。合成の相補的プライマー配列が、複写されるべきゲノム領域のいずれかの側の一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズされる。耐熱性ポリメラーゼの作用の下、第二の鎖がプライマー間の領域で構築される。その後の加熱は二本鎖を分離させ、再び複製過程が開始する。このＰＣＲ技術は、プライマー配列を合成するために十分な配列情報が存在することを条件として、微量のポリヌクレオチドを増幅させることを可能にする。

ＰＣＲを用いて配列変動を調べるためにＰＣＲを使用することに付随する主要な問題は、プライマーと変種の配列との間のミスマツチが増幅を阻害する可能性である。我々は、この問題を克服するために幾つかの戦略を用いた。第一のウィルス検出のためには、５’　ＮＣＲ内のプライマーを用いたが、これは１型変種間において（４，１１Ｓ　Ｌ３．１６．２３．２４．２６．３３）、さらにＫｌおよびに２の間で高度に保存されていることが報告されている。血液供与者の配列分析は、すでに発表された配列データとの比較によって、亜型および２型の変種の同定を可能にした。この分析によって、２型と同様に１型と異なるようにみえるＨＣＶの第三の“型”の存在が明らかにされた（図１．２；表３）。我々の初めの仮定的分類に基づいて、該ウィルスゲノムの他の（コード）領域およびより変動しうる領域におけるわれわれの知見を確証することを試みた。

Ｎ５−５領域の分析（これは３種の型の各々のいくつかの配列を基にした）によって、３種の主要なグループが存在し、３型配列は１型および２型とは全く異なる比較的同質のグループを形成することが確認された。１型間列をＰＴおよびＫｌ“亜型”に、２型間列をに２ａおよびに２ｂに分けることを提唱する区分は、この分析によって支持されるが、このとき、本研究で得られたただ１例の２型血液供与者配列はに２ｂに最も類似しているようである。ＨＣＶｌ型配列の２つのグループへの分化は、コアー領域（図７）およびＮ５−３領域（図５）においてもまた明瞭に示され、両方の事例において３型配列はその関係が顕著に遠くなり。

ているようである。

系統発生的に異なるグループの集合、単一の地理的領域におけるそれらの混合分布（ｌ、７．２３．２７．３５）および個々の血友病患者が二重または三重感染しているという我々自身の知見はすべて、ここに述べた３種の型は、単一のグループで高度に変化しうるが一元論的なグループの地理的変種または疫学的集団の変種を単純に表しているというよりはむしろ、異なるウィルスであることを強く主張している。

５′ＮＣＲの我々自身の系統発生学的分析は、３種の異なるグループの存在を明らかにした。これはコード領域の分析と対照的で、この場合はｌ型配列の２つの “亜型”への顕著な分化が存在するようである。しかしながら、２型および３型変種と違って、この２つの“亜型”は地理的に異なっており、１つの亜型は専ら日本人の患者から得られた配列を含み、他は専ら米国／欧州人の配列を含んでいる（表２）。実際、この地理的分類の唯一の例外はＨＣ−Ｊ１配列（２６）で、明白な１つの例外（Ｐｔ−１）は、米国起源の輸入第Ｖｌｌｌ因子（これは他の亜型に対応するＨＣＶ変種を含んでいた可能性が大きい）の治療を受けた日本人の血友病患者から得られた（７．２３）。提唱される２型の２つの亜型、Ｋ２ａおよびに２ｂ（７，２３）が地理的に異なる変種を代表しているか否かを示すには不十分な配列データしかない。

ＨＣＶのゲノム構成は、ポリプロティン（これは続いて構造蛋白と非構造蛋白に切断される）をコードする単一の解放型読み枠を有するワラビウイルスおよびペスチウイルスのそれと一致する。弱い配列相同性が、正の方向のＲＮＡゲノムを有するいくつかの他のウィルス群について検出された（１９．２１）。亜型、２型および３型間の配列の非類似性の全体的な程度は、本研究で調べた小領域の比較によっては測定できないけれども、蛋白コード領域における相違度の大雑把な評価は、部分的なコアー配列の相違を調べることによって与えられる。これは、ＨＣＶｌ型および３型のコアー領域間の違い（はぼ１０％のアミノ酸配列の相違）は、フラビウイルス（ダニ媒介脳炎ウィルス）の異なる血清型間に存在する違い（１４％、参考文献１４）に匹敵するが、蚊が媒介するワラビウイルス（デング熱ウィルスの血清型間の違い（３３％）および西ナイル（ＷＮ）亜群のそれ（２゜８−３４％相違）より低いことを示している。ＷＮ亜群の異なる構成種の５ ′ＮＣＲ配列はまた、ＨＣＶの３種の型（＝５０％類似性；参考文献５）よりも多様性がより顕著である（といってもそれら構成種の各々、例えばマレ−バレー脳炎ウィルス内では、５’　ＮＣＲは極めて良好に保存されている（〉９５％類似性、参考文献５）。これらの類似性を基に、我々は、ＨＣＶの主要な型は異なる“血清型”を表し、各々は、他のＨＣＶ型に対して装備された免疫反応にもかかわらずヒトに感染することができると推測する。

方法サンプル　１８人の異なる血液供与者（Ｅ−ｂｌからＥ−ｂ　Ｉ　８）の血漿（これらは、アボット第二世代酵素免疫アッセー（ＥＩＡ）によるスクリーニングで繰り返し反応性を示し、リコンビナント免疫プロットアッセー（ＲＩＢＡ；オルト、参考文献１）によっては確定的または非確定的であった）が、この研究で用いた主なサンプルであった。５人の抗ＨＣＶ陽性ＩＶＤＵ　（参考文献３１のｌｌ−１５のように省略）由来、非加熱処理血餅濃縮物を与えられた５人の血友病患者で抗ＨＣＶ陽性でもあった血友病患者（ｈｌ−ｈ５）由来、１９８３年に収集された１０００人の献血をプールしたちの３種類（ｐｌ−ｐ３）由来、さらに市販の非加熱処理策ＶＴＩ＋因子の別々の５バツチ（ｆｌ−ｆ５）由来Ｎ５− ３領域の配列が先に記載されたもの（３１）に一致する。

プライマー：ｃＤＮＡ合成およびポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）に用いたプライマーは表１に挙げる。それらはオズエルＤＮＡサービス（Ｏｓｗｅｌ　ＤＮＡ　５ｅｒｖｉｃｅ）　（化学科、ニシンバラ大学）によって合成された。

ＲＮＡ抽出およびＰＣＲ：０．２〜１．０ｍｌ容量の血漿中のＨＣＶウィルス粒子をｔｏｏｏｏｏｇで２時間、４℃で超遠心して血漿から沈澱させた。先に述べたように（２，３１）、沈殿物からＲＮＡを抽出した。第一の鎖のｃＤＮＡは、７単位のニワトリ骨髄芽球症ウィルスの逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）とともに、５０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，０）、５ｍＭのＭｇＣＩｔ　、５ｍＭジチオスレイトール、５０ｍＭのＫＣＩ、０．０５μｇ／μｌのＢＳＡ、１５％ＤＭＳＯ１各々６００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ、１．５μＭのプライマー並びにＩＯ単位のＲＮＡ合成酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ　）を含む２０ μｍの緩衝液中で４２゜℃３０分間、３μｌのＲＮＡサンプルから合成された。

ＰＣＲは、ＩＢＩのｃＤＮＡから出発して２５サイクルにわたって実施したが、各サイクルは９４℃２５秒、５０℃３５秒および６８℃２．５分から成る。最後のサイクルの伸長時間は９．５分まで延長した。反応は、０．　４単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｎｏｒｔｈｕｍｂｒｆａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ）を用い、１０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ８，８）　、５０ｍＭのＫＣＬ　１．５ｍＭのＭｇＣ１ｔ、０．　１％のトリトンＸ−１００、各々３３μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ並びに各々０．５μＭの外側ネスト（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを含む２０μｌの緩衝液中で実施した。続いて１μｍの反応混合物を、同じ液であるがネストプライマーの内側対を含む第二の試験管に写し、さらに２５回の熱サイクルを同じプログラムで実施した。ＰＣＲ生成物は、３％低融点アガロースゲル（ＩＢＩ）で電気泳動し、フラグメントを臭化エチジウム染色およびＵＶ照射によって検出した。配列分析のために、陽性および陰性結果のポアソン分布が得られる適切な制限希釈でｃＤＮＡの単一分子を得た（３０）。

ＰＣＲ生成物の直接配列決定：ＰＣＲ生成物をガラス−ミルク抽出（“ＧｅｎｅＣＩｅａｎ”；　ＢｉｏｌＯｌ、　Ｉｎｃ、　）によって精製した。精製生成物の１／４を、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ：　ｔｌｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）とともに配列決定反応に用いた。反応をｌＯ％ＤＭＳＯ中で実施し、鋳型ＤＮＡはプライマーアニーリング前に熱変性させるという点を除き、製造元の指示に従い該反応を実施した。

系統発生学的方法；配列をスターデン（Ｓｔａｄｅｎ）プログラムのバージョン２゜０（３２）でコンパイルし、ライスコンシン大学遺伝学コンピューターグループの配列分析パッケージ（バージョン７．０）（６）で分析した。フエルゼンシュタイン（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ）のＰＨＹＬＩＰ（バージョン３．４　１９９１年６月；参考文献９）で利用可能な２種の異なるプログラムを用いて、系統発生相を推論した。プログラムＤＮＡＭＬは、分子の進化について特定の確率的モデルとなる最も可能性の高い系統樹を見つ（九良好な模擬実験を実施できることを示した（２８）。ここで実施した分析では、可能性のある全ての系統樹のうちより多くのものを検索できるので、グローバル（Ｇ）オプションを用いた。

使用した第二のプログラムはＮＥＩＧＨＢＯＲであったが、これは、プログラムＤＮＡＤＩＳＴ・（これ自体はＤオプションを用いてセットし、多数の置換の可能性について修正した相違の評価を行うために、ＤＮＡ、ＭＬの根底にあるのと同じ確率的モデルを用いた）を用いて先に評価を行ったヌクレオチドの相違に関する行列の集合を形成する（Ｓａｉｔｏｕ　＆　Ｎｅｉ　（参考文献２９）のアルゴリズムに従う）。すべての事例で、最も可能性が高い工程および近縁種を含むことができる工程は調和の取れた系統樹を作製し、したがって、前者のみをここでは提示する。

ＨＣＶの主要な型の相互関係を確立するために、配列の可変性および進化上の拘束において異なるウィルスゲノムのい（つかの領域を別々に分析した。したがって、配列比較から得られた結論は、特定の領域に影響を与える可能性がある擬似的な進化現象には左右されない。しかしながら、ここに提示する分析についての１つの問題は、グループから外すために必要な、ＨＣＶとの関係において十分に相違しているウィルス配列が存在しなかったということである。したがって、ＨＣＶの異なる配列変種の相互関係を記載するが、どの配列がその他のものに対して先祖となっているかを決定する手段を現在もっていないことは強調されるべきであろう。したがって、このことを示すために、該系統樹はあまり周知ではない根幹をもたない形で描かれている。

これらは、アボットの第二世代酵素免疫アソセーで繰り返し反応性を示し、さらに、キロンの４−ＲＴＢＡでは確定的または非確定的であった（Ｅ−ｂｌ〜Ｅ− ｂｌ８、参考文献１０）。各供与者からの保存血漿サンプル中に存在するＨＣＶ配列は、全ての既知のＨＣＶＩ型および２型変種間でよく保存されている（４．１１、＋３、＋６．２３．２４．２６．３３）５’　ＮＣＲ内の部位に該当するプライマーを用いて増幅されたく１２．２５）。増幅前にｃＤＮＡの単一分子を分離するために制限希釈を行った後でのＰＣＲの生成物の配列決定は、該領域の中央のほぼ１９０塩基対と既に発表された配列との比較を可能にした（図１）。

配列内で、可変領域と同様に定常領域が見出された。Ｅ−ｂ　１３〜Ｅ−ｂｌ８の供与者からの６配列は以前に１型として記載されたもの（４，１１１３、＋６．２３．２４．２６．３３）と密接に類似し、他は２型（２３）配列と類似していた（Ｅ−ｂ９〜Ｅ−ｂ　ｌ　２）。しかしながら、８配列（Ｅ−ｂ　１−Ｅ− ｂ　８）は両型とは異なっており、暫定的に３型と命名した。これら配列の３つの型への分離は、最大公算アルゴリズム（図２）および近縁合流アルゴリズム（データは示さず）を用いた、これら血液供与者の配列と先に報告された配列（表２で識別）との正規の系統発生分析によって支持される。３つのグループ内での配列変動性は、各々の事例において、型を分離する変動性より逼かに小さい。この３つの型の間の中間形の配列は認められなかった。この系統樹は、先に同定された３型グループは、２型と同様、ｌ型とは異なることを示している。ＤＮＡＭＬモデルを用いて、冬型内の配列間の修正相違は、各事例において３％未満であった。グループ間ではそれらは９％（ｌ型および３型間、並びに１型および２型間）から１４％（２型および３型間）の範囲であった（表３）。

２）ＮＳ−５領域の分析　ＮＳ−５領域のヌクレオチド配列は、先に記載されたＨＣＶのＫｌおよびに２変種間で顕著に変動することが見出された（７）。５′ ＮＣＲの場合と同様にこの領域において３型配列が同じように他の２つの型と相違するか否かを調べるために、４人の３型血液供与者（Ｅ−ｂｌ、Ｅ−ｂ２、Ｅ −ｂ３およびＥ−ｂ７）および１人の２型供与者（Ｅ−ｂ　１２）からの配列を先に報告された配列と比較した（図３１図４：表３）。

顕著な変動がこの領域において３つの型の配列間で認められた。また、３型配列は、この領域において１型および２型とは別のグループを形成する。しかしながら、５°ＮＣＲと異なり、１型および２型のグループ内の亜区分が存在するように見える。１型間列は、日本人感染者で発見されたもの（例えばＨＣＶ−Ｊ　；ＨＣＶ−ＢＫ；表２の配列番号は１２、＋３．１６−２０）および米国由来のもの（ＨＣＶ−１、Ｐｔ−１、Ｈ７７、Ｈ２Ｏ：配列番号Ｉ〜４；図４）の間で分割される。２型配列の間でも（先にに２ａ　（７）と命名されたものに該当し、Ｋ２ｂ型配型配は異なるようにみえるもの、およびスコツトランド人の血液供与者、Ｅ−ｂ　１２に対応するもの）分割についてのいくつかの証拠が存在する。

表３は、ＨＣＶｌ型配列の２つのグループ間の平均的ヌクレオチド相違は２５％（ここではｌａ型〔米国〕およびｌｂ型印本人〕と記載）で、各グループ内ではわずかに４〜７％の変動があるということを示している。２つのｌ型グルー。

ブ内のヌクレオチド配列の多様性は、Ｋ２ａおよびＫＺｂ間に存在するものと類似している（表３）。しかしながら、これらの相違は両方とも、ｌ型および２型配列間（５２〜６２％）、ｌ型および３型配列間（４８〜４９％）に存在するもの、並びに２型および３型配列間（５３〜６０％）相違より遥かに少ない。

３）ＮＳ−３領域の分析、増幅反応は、先に報告されたＮＳ−３領域のプライマー配列（３７）および実験的に得られた１対の内側プライマー（３１）を用いて実施した。これらのプライマーは、高い比率の血友病患者由来抗Ｃ−１００陽性血清（３Ｉ）の大部分からＨＣＶ配列を増幅させたが、ＴＶＤＵ由来血清（３１）および血液供与者サンプル（調べた１５例のうち３例が陽性；データは示さず）については、それらは効果はより少なかった。増幅フラグメント内の２つの保存部位を血友病患者およびＩＶＤＵ患者からのＮＳ−３領域の配列分析によって同定し、さらにこれらに該当する２つの新規なプライマーを特定した（２０７．２０８：表１）。２８８−２０８　（、第一ラウンド）プライマーおよび２９０ −２０７（第二ラウンド）プライマーの組み合わせは、ＨＣＶａ型に感染した４人の供与者（Ｅ−ｂｌ、Ｅ−ｂ２、Ｅ−ｂ６およびＥ−ｂ７）からのサンプルを上手（増幅させたが、ＨＣＶ２型に感染したもののいずれも増幅させなかった。

このことは、この新規な型と我々自身の１型間列（３１）および先に報告された１型間列との比較を可能にした（図５．６１表３）。明快にするために、本研究で得られた１型間列の７例（Ｅ−ｂ　Ｉ　６、Ｅ−ｂ　ｌ　７．１３．１３、ｈ５、ｈ３およびｈｌ）のみを系統樹に示す。これらの配列は、英国で感染した患者におｐｚてこの領域で発見された変動の範囲の代表的なものである。先に報告された系統樹（３１）と図６との比較は、前者は、日本人のｌ型および３型配列が加えられた後で得られた全体的な系統樹の非常に小さな構成部分を形成していると（１うことを示している。

最大公算系統樹は、ｌ型および３型は各々から顕著に多様化したことを示している。ＮＳ−５領域で発見されたように、１型間列の亜型がＮＳ−３において発見された。また、日本人由来の配列（ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ−ＢＫおよびＪＨ）は、原型（ＰＴ）配列、並びにスコツトランド人血液供与者（Ｅ−ｂ　１６、Ｅ−ｂ　１７、ｐ　１−３）　、ＩＶＤＵ　（ｉ　１−５）および血友病患者（ｈｌ− ５）−１１’発見さ。

れたもの（これらは全て原型配列に該当する）とは異なっている（図５）。しかし平均的な亜型の相違（２３％）は、４種の３型配列とＨＣＶ−１およびＨＣＶ −２との間に存在するもの（３７〜４３％）より小さい。以前に報告されたように、１現記列間に存在するヌクレオチド置換の大半は活動していない（サイレントである）　（すなわちコードされるアミノ酸配列に影響を与えない）が、一方、多数のアミノ酸置換が１型および３型配列間に存在する（図５）。ＮＳ−３領域の分析は、ＮＡＢＡ肝炎罹患日本人患者から得られたクローンＡの配列（３５）を含むが、これは現存するＨＣＶｌ型配列とは異なることが報告されている。

図６では、この配列は、修正配列相違がそれぞれ３３〜４３％および３６％であるＨＣＶＩ型とも３型とも異なるようである。この段階ではこの配列をいずれかの既知のグループに分類することはできないが、これらの相違は、それが２型配列または同様に異なる新規なＨＣＶ型を代表するという仮説とは矛盾しない。

４）ＨＣＶの推定コアー領域の部分的配列・推定コアー蛋白をコードする領域は、既知の１型変種間でそのヌクレオチド配列において比較的よく保存されている。これは、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の類似性がそれぞれ９０〜９８％および９８〜９９％であることによって示されている（１【、２４）。血液供与者Ｅ−ｂｌ（この者はコアー領域以外の他の分析領域では３型配列を有する）からのコアー領域の一部分をプライマー４１０および４０６で増幅し、先に報告されたｌ型配列と比較した（図７．８：表３）。この分析は、３型配列はｌ型のものと異なっており、また、ｌ型配列の日本人型配列（ＨＣＶ−Ｊ、ＨＣＶ−ＢＫ、ＨＣ−Ｊ４、ＪＨおよびＪ７）および米国／欧州型配列（ＨＣＶ−１，Ｈ７７、Ｈ２Ｏ、（ＪＨ１ＧＭ２）への主要な下位区分が存在したということを確認した。

ＮＳ−３で発見されたように、非常に小さなアミノ酸配列の変化がｌ型配列のコアー領域で発見され；２つのグループ間の殆ど全てのヌクレオチドの違いは“サイレント“部位に存在する。対照的に、３現記列は、ｌ型配列と比較したとき７〜８個のアミノ酸置換を示す。

表１ＨＣＶゲノムの増幅に用いたプライマーの配列とその起源２１１　５°ＮＣＲ− ２９、ＣＡＣＴＣＴＣ（ＩＡＧＣＡＣＣＣＴＡ丁ＣＡＧＧＣＡＧＴ　１＋２）４１０　：）７−　Ｊｌｏ　・　ＡＴＧＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＯＧＣ’９０　ＮＳ−３４９３２、ＧＴＡＴ′ｒ′ｒＣＪＧＴＯＡＣＴＯＣＧＴＧＣＣｒＣ＋　３１１５５５　Ｎ５−５　１１ｕ７　、　ＣＣＡＣＧＡＣＴＡＧＡＴＣＡＴＣＴＣＣＧ＝４３ＮＳ−５７９０４−ＴＧＧＯＧＡＴＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＡＣＣＣＧＣＴＧＣｎｏｒてコＡ＋７ン５５４　ＮＳ・５　７９３５　−　ＣＴＣＡＡＣＣＧＴＣＡＣＴＧ＾＾ＣＡＧＧＡＣＡＴ°文献番号（４）のＨＣＶのゲノム配列に対応する５”塩基の位置。

１プライマ一配列の方向性（＋：正方向、−二叉方向）↑略号：Ａ：アデニン、Ｃ，シチジン、Ｇ：グアニジン、Ｔ：チミジン。

町各々のＨＣＶ型の増幅を可能にするために、別々の方向のプライマーが要求される。

本研究で使用したこれまでに報告されたＨＣＶ配列の起源と参考文献番号　型　略号　地理的起源　参考文献　文献番号１　１　ＨＣＶ、Ｉ　米国　・Ｃｈｏｏｅｒａｌ、、　１９９１　（ａｌ２　１　Ｐ＋−１日本　Ｎａｋａｏ　ｔｔ　ａｌ、、　＋９９１　４２３１Ｅｎｏｒｎｏｔｏ　ｔｒ　ａｔ、　１９９０　（７）３、Ｊ　Ｉ　Ｎ７７、Ｎ９０　米国　ＯｇａＬ：Ｉｔｒ　ａｌ、、　＋９９１　（２４１５、６１０Ｍ−１，ＧＭ−２ドイツＦｕｃｌｕ　ｔｒａｌ、、　１９９１　ｔｌｌ１７　１　月　日本　Ｈａｎ　ｔｔ　ａｌ、、　＋９９１　＋１３１８　１　Ａ１　オーストラリア　Ｈａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９９１　＋１３１９　１　Ｓｉ　１１７フリカ　−ｅｒ　ａｌ、、　１９９１　（１３１１Ｑ　！　ＴＩ　台清　Ｈａｎ　ｔｒ　ａｌ、、　＋９９１　〔１３１１１１じ１３／１２４　米国／イタリア　）（ａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　＋９９１　（１３＋ｉ２　ｌ　ＨＣＶ４　日本　Ｋｓｗ　ｅｒ　ａｌ、、　１９９０　（１６１１３１ＨＣＶ−ＢＫ　８本　ＴＪｋ＋１１１１＋ｚａｗａ　ｅｒ　ａＬ、　１９９１　０３＋１４．１５　１　ＨＣｌ１．Ｍ　８本　Ｏｋ＋ＩＪＴＩｏ＋ｏ　ｅｒ　ａｌ、、　１９９＋＋　（ス６）＋６−Ｘｉ　ｌ　に１．　Ｋｌ−１−４日本　Ｅ＊ｏｍｏｔｏ　ｅｒ　ａｔ、、　１９９＋１　（７１コｌ１ｊＨ日本　Ｋａｏａ　ｅｒａｔ、、１９９０　（１７１２コ１ニア日本Ｔａｋｅｕｃｒ＋＋ｅｔａｉ、、’ｈ９９０（３４１Ｄ−２６２ＫｈｂＫ２ｔ、１　日本　Ｎａｋａｏ　ｅｒａｌ、、１９９１　イ２３）ｉｔ：二：、に２１＞ｌＥｎｏｍｏ＋ｏｅｒａｒ、、！９９υ（７１２７゛　り０−）Ａ　日本　Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−にｏｈｗ＝　ｌ’ｊνｌ　１３５１ＨＣＶゲノムの４つの領域における３種のＨＣＶ型間のヌクレオチドの相違領域　Ｍ　ｆｎ’ｌ　Ｉａ　ｌｂ　ム　２ｂ　３５’ＮＣＲＩ（二０１　０．０＋６３　ｒｖａ’２　Ｃ６ｒ　Ｏ，０８６９Ｉｖａ　Ｏ，０！＋４３１８１　０．０９４８　Ｎａ　０．１３３Ｉ　ｎ／ａ　Ｏ，Ｏ１ｊファー　ｌユ１６１　０．０３５８ｉｂ（５２０，０１１５５０，０２２７３ｒｌ＋　０．１１１０１　０．１！ＩＩ　ｎＩ　ｎ／ｄ　０．０００ＯＮＳ−３Ｉｌｌ　＋３４３　０．０６９９１ｂｆ３１　０涛り　Ｑ、Ｑ５３５３（４Ｊ　Ｏ，３６８９０４２？９　ｎ／ｄ　Ｉｖｄ　Ｏ，Ｑ４６ＯＮＳ−５１４１４）　０．０７４３ＩｂＣ７）Ｑ、２４７７０．０３７２２ｍ１２１つ６０９２０．６ス０６０．０６１２２ｂ　＋３）　（１，５２１Ｊ　Ｑ、５７３Ｚ　Ｏ，ｎ工０．０６５５３Ｃ４）ｆ）、４７５ＪＯ，Ａｌ＋９００．５９１１３０．５ｍ９９０．０３コＣ１分析した配列数。

ゝｎ／ａ　：適用せず。

’ｎ／ｄ・実施せず。

ＩＩ）Ｃ型肝炎ウィルスの３種の異なる型に感染した血液供与者の血清反応性血液供与者、血友病患者および静脈内薬物乱用者からのＨＣＶ配列が、５′非コード領域（５’　ＮＣＲ）　、コアー、ＮＳ−３およびＮＳ−５領域において増幅された。

アボット第二世代酵素免疫アッセー（ＥＩＡ）によるスクリーニングに際して繰り返し反応し、さらに、オルトリコンビナント免疫プロットアッセー（ＲＩＢＡ）では陽性または不確定反応を示す献血血液が、５°ＮＣＲにおいてプライマーによって増幅された（参考文献１０）。最初の１４例のＰＣＲ陽性献血血液（この場合、ＰＣＲは増幅のため、したがって血液中に存在するＨＣＶＲＮＡを検出するために用いられた）は、続いて、該増幅領域の配列分析によって型分けされ、−続きの構造ペプチドおよび非構造ペプチドに対するそれらの血清学的反応性を、２種の第一世代ＥＩＡ（オルトＨＣＶＥＬＩＳＡ；７ボツトＨＣｖＥＩＡ）および２種のＲＴＢＡアッセー（オルトＲＩＢＡおよびイノシネティクス（ｌｎｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）　Ｌ　Ｉ　Ａ　；表４）で比較した。ＨＣＶｌ型配列全配列５例の献血血液が、両方のＥＬＩＳＡで陽性で、オルトＲＩＢＡアソセーですべての抗原と反応し、さらに、ＬＩＡでは広（反応した。しかしながら、２型および３型感染の供与者からの２例の血清を除いて全てが抗Ｃ−１００ＥＩＡスクリーニングで完全に陰性で、５−１−Ｌ　Ｃ１００（ＲＩＢＡ）およびＮＳ４　（ＬＩＡ）と反応しなかった。

さらに、ＨＣＶａ型変種のキャリアーの幾人かはオルトＲＩＢＡでＣ３３（ＮＳ −３）ペプチドとわずかしか反応せず、２例の“非確定的”な結果を生じた（供与者番号１１および１３）。

したがって、オルトＲＩＢＡおよび（より少ない程度に）イノシネティクスしＩＡテストを用いる現在のテストでは、ＨＣＶ−２およびＨＣＶ−３遺伝子型の信頼に足る検出は可能ではない。すべてのＨＣＶ型の信頼に足る検査のために、ＨＣＶの３種の型の各々についての５−１−Ｉ　Ｃ１００およびＮＳ４からの抗原か好ましくは抗原パネルに含まれるべきである。

微生物学部門に委託された。該血漿サンプル中のＨＣＶＲＮＡを抽出し、先に記載４Ｃ型肝炎ウィルスの３種の型に感染した血液供与者の血清の血清学的反応性＊オルトＨＣＶＥＬＩＳＡ ↑アボットＨＣＶＥＩＡ（Ｃ型肝炎リコンビナントＤＮＡ抗原）：コアーすりゴペプチド１−４９バント評価、製造元の指示に従い−（陰性）から４　（強陽性）まで血清学的なスクリーニングアノセーを改良するという全体的な目的で、２型および３型のＣＩ　ＯＯ−３に該当する領域の抗原領域の配列データを得た。この情報を該領域のエピトープのマツピングのため、さらに、抗ＨＣＶの血清学的アッセーの改良に使用しうるまた別の免疫反応性ペプチドの同定のために用いた。

は、第二世代抗ＨＣＶスクリーニング（アボットまたはオルト）で繰り返し反応し、さらにＲＩＢＡ（キロン）による確認検査では確定的または非確定的であった）は、スコツトランド国立輸血サービス微生物学委託研究室（Ｓｃｏｆｆ　ｉｓｌ＋　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　５ｅｒｖｉｃｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）■辷繩w 結果載されたように（Ｃｈａｎら、＋９９２）５’　ＮＣＲ内のプライマーで増幅させた。ＨＣＶは、先に記載されたように（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、１９９０）増幅ＤＮＡの配列分析およびＲＦＬＰ分析によって型分けした。

ＨＣＶａ型に感染した別々の供与者からの５例のサンプル（４０，３８，３６，２６および１７８７番）、２型感染の４例（３５Ｉ、５９．９４０および８１０番）およびｌ型感染の５例（１６，４２，７７，１８０１および１８２５番）を、ＮＳ−４の抗原領域に広がる、正方向および反方向の配列に該当するプライマーで増幅させた。増幅させたＤＮＡから得たヌクレオチド配列を比較し、各ＨＣＶ型のコンセンサス配列の範囲を限定するために用いた。このヌクレオチド配列の枠内翻訳によって、連続したコンセンサスアミノ酸配列が得られ、これは、エピトープマツピングのために、一連の共通オリゴヌクレオチドの範囲を特定するために用いられた。

エピトープマツピングおよび抗体特異性の決定９合成共通ペプチドをケンブリッジリサーチバイオケミカル社から市販されているキットを用いてポリプロピレンピン上で合成した。この付加反応の原理は参考文献に記載されている（Ｇｅｙｓｅｎら、１９８４；　Ｇｅｙｓｅｎら、１９８５）。抗体反応は、超音波処理（３０分）で破壊したピン上で、１％ドデシル硫酸ナトリウム、Ｏ，１％２−メルカプトエタノール、０゜１Ｍオルト燐酸二水素ナトリウム中で実施した。ピンは燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１％卵白アルブミン、１％ウシ血清アルブミン、Ｏ，１％トウイージー２０で、室温で１時間予め被覆した。血清または血漿を、ＰＢＳ＋０．１％トウイージー２０（ＰＢＳＴ）中で１．４０希釈し、ブロックしたピンと４°Ｃで１８時間インキュベートした。ＰＢＳＴを４回交換して洗浄（撹拌しながら室温で１０分）した後、結合抗体を、アフィニティー分離抗ヒトＩｇＧ、ベルオキシダーセ結合物（シグマ）の１／２００００希釈液中で室温で１時間インキュベートして検出した。洗浄（ＰＢＳＴで４回交換）した後、０．０３％過酸化水素含有０．１Ｍ燐酸ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，０）中のアジノージ−３−二チルーベンズチアゾノンスルホネートの０．０５％溶液で、ピンを２０分インキュベートした。光学濃度を４１０ｎｍで読み取った。

ＨＣＶａ型に感染（５’　ＮＣＲの配列分析による）した５人の供与者の血漿サンプル中のＨＣＶＲＮＡを、表１に挙げたプライマーを用いてＮＳ−４で増幅させた。この領域の高い配列変動性のために、異なるＨＣＶ型の増幅には別個の方向のプライマーを用いることが必要であった。しかしながら、反方向プライマーは高度に保存された領域にあり、３種の全ての型の増幅に用いることができる。

配列分析は先に記載されたように実施した。これは４９１１から５２７１位（Ｃｈｏｏら（１９９１）の記載にしたがって番号付けされている）の連続配列を生じた（図５ａ）。この領域においては、４人の異なる供与者間で配列変動性は殆ど認められなかった。

”ヌクレオチド配列はコードされたペプチドの配列を推定するために用いた（図ｓｂ）。この推定蛋白は主に親水性残基を含むが、Ｎ−結合糖付加反応のための潜在的能力を有する部位は含まない。ＨＣＶａ型のアミノ酸配列の変動性は５残基のみに制限されていた（図５ｂ）。しかしながら、この領域は、ＨＣＶＩ型および２型感染の他の血液供与者のアミノ酸配列とは顕著に異なっていた（Ｔ１６．４２．７７．１８０１．１８２５．３５１．９４０および８１Ｏ；図６ａ）ｏ主要なＨＣＶ型の残基１６７９から１７６９の間の配列比較によって、アミノ酸配列の顕著な変動性を有する３領域が明らかにされた。型間で認められた違いの殆どは、非同義的アミノ酸置換、特に親水性領域における酸性および塩基性残基の変更を含む。これらの変化は、蛋白の全体的な構成、およびその抗原性を太き（変化させると考えられる。

１型〜３型のこの領域におけるコンセンサスアミノ酸配列（図６ｂ）を、３種のシリーズの８２個の９アミノ酸重合オリゴペプチド（９残基のうち８個が共通）を該シリーズ内の前後のものを用いて明らかにするために使用した（図７ａ−ｃ）。

これらはＩ２×８アレーのポリプロピレンのビン上で方法の項で記載したように合成された。ピン上に固定された抗原に対する抗体反応性は、４℃で一晩１／４０希釈の被験血清でインキュベートし、洗浄後、抗ヒトＩｇＧ−ベルオキシダーセ結合物および適切な基質で検出（方法の項参照）して、間接ＥＬＩ　ＳＡによってめた。

ＨＣＶ感染について既知の危険因子をもたない、抗ＨＣＶ陰性でＰＣＲ陰性供与者の３種のペプチドシリーズに対する反応性を調べた。ＨＣＶコードオリゴペプチドのいずれに対しても顕著な反応性は示されなかった。３人のＨＣＶａ型感染供与者の血清のこれらオリゴペプチドの各々に対する反応性は図９ａ−９ｃに示した。３例の血清の全てが、１３番（配列ＫＰＡＬＶＰＤＫＥ、図７）から２２番（配列ＷＹＱＱＹＤＥＭ）の範囲のペプチドと第一の抗原領域において反応した。しかし認識された正確なペプチドは個々人の間で僅かに変動していた。３例の血清は全て、オリゴペプチド３２から４２　（ＥＣＳＱＭＰＹＩからＱＡＱＶＩＡＩ（ｗＱ〕配列）ノ範囲ニアル第二の抗原領域と程度は異なるが反応した。

より弱くさらにより変動性のある反応性がペプチド４８から５３で認められた。

最後に、顕著な反応性が、単一のオリ°ゴヌクレオチド２　（３サンプルのうち２サンプル）、６１（３例のうち２例）、６６（３例のうち３例）、７３（３例のうち３例）および８０（３例のうち２例）に対してもまた認められた。

ＨＣＶＳ型の主要な抗原領域の配列は、ｌ型または２型変種のいずれかによってコードされたものとは顕著に異なる。ペプチド１３から２２が結合する領域は、ＨＣＶＺ型変種とは５０％、ｌ型とは６７％の平均相同性を示す。ペプチド３２から４２の間では、２型とは３９％、１型変種とは５８％の相同性が存在する。

したがって、各Ｎ５−４配列の同様な領域が抗原性を有するが、実際のエピトープはＨＣＶの型間で顕著に異なる。

考察ＨＣＶ３型のＮＳ−４領域はＨＣＶの他の変種とは顕著な配列多様性を示し、この多様性は、以前に分析された（Ｃｈａｎら、＋９９２）コアー、ＮＳ−３またはＮＳ−５領域で認められたそれを越える。ＨＣＶゲノムのこの領域によつてフードされる蛋白の機能は未知で、さらにウィルス増殖および病原性におけるこの変動性の結果は未知である。フラビウイルスおよびペスチウイルスにおけるＮＳ −４領域の機能もまた殆ど明らかにされていない。

アミノ酸配列変動性の程度およびアミノ酸置換の性質は、抗体反応の主要部位はまた抗原変動のそれでもあるということを示している。このことは、疑いもなくＨＣＶＩ型Ｎ５−４がコードする抗原の、異なるＨＣＶ型に感染した患者の血清との制限された交差反応を生じる。現在、感染の血清学的診断は、完全にＨＣＶｔ型から由来したりコンビナンドまたは合成オリゴペプチド配列を基にしている（Ｃｈｏｏら、１９９１）。感染に対する血清反応は、スクリーニングに用いたりコンビナンド抗原のうちのただ一つに対する抗体について、その最初の段階で極めてしばしば制限される。このことは、２種のＨＣＶコード抗原に対する反応性が確認に必要な補充抗体検査における困難性をもたらすだけでなく、ＨＣＶ２型および３型による初期感染の検出の失敗の可能性を増大させる。

表７は、ＰＣＲにより決定したＨＣＶ型決定と型特異的抗原（ＴＳＡ）を用いて得た結果とを関連付け、ＨＣＶ３型との相関性を示している。

表５Ｂ）ＩＳ２　ａｍ＋　Ｃ１６９ｌ−１７０８１１１１１２ｆ１７ＩＱ−１７２８１↑ アミノ酸コード　Ａ・アラニン：Ｒ・アルギニン、Ｎ　アスパラギン；Ｄ＝アスパラギン酸、Ｃ：ンステイン：Ｑ、グルタミン；Ｅ：グルタミン酸；Ｇニゲリシン：Ｈ：ヒスチヂン：■：イソロイシン１Ｌ　ロイシン、に、リジン；Ｍ：メチオニン：Ｆ：フェニルアラニン、Ｐニブロリン、Ｓ：セリン二Ｔ：スレオニン：Ｗ・トリプトファン、Ｙ、チロシン、Ｖ：バリン。

ｊＨＣＶ型内変動性が存在するまた別のペプチド。

ポリメラーゼ・チェーン・リアクションによる臨床標本中の二〇　ＮＳ−１５２ −、３−ＣＡＣＡＴＧＴＧＣｒＴＣＧＣＣＣ，ＡＧＡＡＴＳ−３ｂ　ＮＳ−−５１６１−Ｇｌコ℃ＡＧＧＴＡＡＴＡＧＣＣＣＡＣＣＡＴＳ−２ｂ　ＮＳ−！　！＋６１　−　ＧＧＧＣＡＧＣＧＧＡＴＧＯＣＧＧＡＧＡＴＴＳ−１ｂ　ＮＳ−１！１６１　−　ＧＯＧＡＴＧＡＴＧＣＴＣＧＣＣＧＡＧＣＡ＊クーら（１９９＋）のＨＣＶゲノム配列に対応する５°塩基の位置。

↑プライマー配列の方向性（十　正方向；−：反方向）。

：略号　Ａ　アデニン：Ｃシチジン、Ｇ：グアニジン；Ｔ・チミジン。

９ＨＣＶ３．２および１型の増幅のための型特異的正方向プライマー。

表７ＰＣＲを用いた）ＩｃＶ−ＴＳＡによる血清学的型決定の比較血友病ぞ者　ニー　ＩＩ　、Ｊ　ｌ　４　−　３　４’ＰＣＲにより増幅し、ＲＦＬＰ＋ニーより型決定しり（ＭｃＯｍ　ｉ　ｓｈ　ラ、＋９９２）ＨＣＶ配列の遺伝子型。

’　ＮＴＳ・型特異的抗体は検出されず。

’ＮＲ：Ｎ５−４ペプチドとは反応せず。

’ＨＣＶ感染血友病患者サンプル。ＰＣＲによる型決定（ま為されて（ＸなＬＮｏＩＶ、ＨＣＶＪ型の同定Ｒ）（図１３）およびコアー領域（図１５Ａおよび１５Ｂ）の配列変動について調査を行った（図１３）。系統発生学的分析（図１４および１６）は、ここでＨＣＶ−４と呼ぶ、別個の新規なＨＣＶ型を明らかにした。

方法サンプル・ＨＣＶ用第二世代スクリーニングアッセーで繰り返し反応し、さらに確定的（キロンリコンビナント免疫プロットアッセー（Ｃｈｉｒｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ。

エメリービル、カリフォルニア、米国）で２種以上の抗原と顕著に反応する）であるか、または非確定的（ただ１種の抗原とのみ反応する）である、血液供与者およびＮＡＮＢＨの患者から得た血漿サンプルからＲＮＡを抽出した。既知のＨＣＶ型とは実質的に異なる配列を含むサンプルの殆どはエジプトからのサンプル（ＥＧＩ〜３３）であった。他のものはオランダ（ＮＬ−２６）　、香港（）（Ｋｌ〜４）、イラク（ＩＱ−４８）およびＸＸ　（ｘｘ−６）からのものであった。

配列決定：ＨＣＶ配列を逆転写し、先に報告されたように（１）５″ＮＣＲの保存領域と適合するプライマーで増幅した。コアー領域の分析には、配列ＣＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＴ　（Ａ／Ｇ）ＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＧＡＣ（５°塩基：ＸＸＸ、（２０）のように番号付け）のプライマーを用いて、ＲＮＡを逆転写した。このプライマーおよび配列ＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＧＧＴＧＣＴＴＧＣＧＡＧ　（５ ’塩基ニー５４）の５°ＮＣＲのプライマーを用いて、ｃＤＮＡを増幅した。第二のＰＣＲは、配列ＡＧＧＴＣＴＣＧＴＡＧＡＣＣＧＴＧＣＡＴＣＡＴＧ　（５ ’塩基ニー２１）およびＴＴＧＣＧ　（Ｇ／Ｔ／Ｃ）ＧＡＣＣＴ　（Ａ／Ｔ）ＣＧＣＣＧＧＧＧＧＧＴＣ（５°塩基：ＸＸＸ）のプライマーを用いた。両領域で増幅されたＤＮＡを先に報告されたように（参考文献１ａ）直接配列決定した。

配列分析、配列は、ライスコンシン大学ＧＣＧパッケージのＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて直線に並べた（参考文献６）。系統樹は、フエルゼンシュタインのＰＨＹＬＩＰパッケージのＤＮＡＭＬプログラム（バージョン３．４．１９９１年６月（参考文献９））により、グローバルオプションを用いて構築した。

４種の代表的ＨＣＶ変種（参考文献）の５’ＮＣＲのＲＮＡ二次構造はプログラムＦＯＬＤを用いて予測された。広範囲の可能な相互反応を許容するために、ヌクレオチド−３４１から−ｌ、−３４１から＋３００および−３４１から＋９００の間の各配列から３種の予想が行われた。異なる長さにわたる、各配列についての予想構造の比較によって、比較的小さな規模の特徴（例えば結果の項で分析した幹／ループ）は完全に保存されていることが示された（データは示さず）。

この章で報告した全ての配列はシーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ　）に寄託した。

並びにイラクおよびＸＸＸのＮＡＮＢＨ患者のサンプルで検出された５°　ＮＣＲのいくつかの配列は、スコツトランド人の血液供与者で認められたものおよび他の場所で報告されたものとは実質的に異なっていた（図１３）。ＨＣＶＩ、２および３型を互いに区別する、十分に特徴が明らかにされたヌクレオチド置換を示す代わりに、配列相違の新規な組み合わせが、新しい変種で発見され、このことは、現在のシステムのウィルス分類の枠外にそれらを置くように思われた。これは、該配列の系統発生を再構築し、さらに進化系統樹として結果を提示することによってより簡単に表すことができる（図１４）。この分析は、配列１〜１０は以前に１．２および３型として型分けされた変種と別な集団を作ることを確認する。便宜的に、この新規なグループの配列をＨＣＶ４型と呼ぶ。４型内並びに４型および他のＨＣＶ型間の５°ＮＣＲにおける平均的相違は、先に１〜３型について記載されたものに匹敵した。４型内の配列は比較的緊密なグループを作り、配列１１．１２および１３は、既知の型のいずれとも顕著に異なっている。

この系統発生樹を用いて、先に報告された５’　ＮＣＲの大半は、１．２および３型として容易に区別することができることを知ることができる。さらに、ザイールの配列の殆ど全て（白四角として示されている）は４型内で緊密な集団を作り、このことは、アフリカでのより広範囲な分布を提唱している。しかしながら、さらに複雑なことは、南アフリカの患者から得た３例の同一な配列は１型および４型グループの両方と異なっているようで、さらに、また別のＨＣＶ型を表しているかもしれないということである。

３例の代表的４型変種（Ｅｇ２９．３３．２１；１〜３番の５°ＮＣＲＩ：該当）からのＲＮＡは、ＨＣＶポリプロティンのコアー領域のプライマーを用いて増幅された。３例の全ての配列は、ＨＣＶＩ型から３型のヌクレオチドおよびアミノ酸レベルの両方で顕著に異なっていた（ＩＮ　Ｉ　Ｓ　Ａ／Ｂ）。これらの配列および以前に分析された系統発生分析は、それらは、他の型とは異なる別個の、比較的同質のグループを形成することを示した（図」６）。４型と工〜３型との間の再構成したヌクレオチドの相違は、ＨＣＶの３種の既知のＨＣＶ型の間に存在するものに匹敵していた。ヌクレオチド配列の相違の殆どはサイレントであったけれども、新規な変種と他の型との間には４および９個のアミノ酸の相違が存在した。

ＨＣＶｌ、２．３および４型の間の配列変動の見地から、制限酵素切断部位における相違が存在し、これはエンドヌクレアーゼ切断パターンの相違をもたらす。

この技術を、世界各地の種々の起源の血液サンプル中のＨＣＶ遺伝子を同定するために用いた。

一ストラリアおよび日本）の血液供与者のサンプルが、常用第二世代抗ＨＣＶＥＬＩＳＡスクリーニング（オルトまたはアボンド）から利用可能であった。上記の検査で繰り返し反応した供与者サンプルを、さらに補足的検査（オルトＲＩＢＡ、フィンランド、オランダ、オーストラリア、エジプト、アボットマトリックス　香港）を用いて調べ、または抗ＨＣＶについてＥＬＩＳＡでサンプル（日本）の力価を測定した。ＲＩＢＡ検査で陽性（２種以上のＨＣＶ抗原と顕著な反応（ｌ＋から４＋）もしくはまたは非確定的（１種の抗原とのみ反応）であるか、またはＥＬＩＳＡで＞ｘ４０９６（日本のみ）の力価を有するサンプルをポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）によってウィルスＲＮＡについて検が記載したように、ネストＰＣＲにおいて５°非コード領域（５°ＮＣＲ）を用いて、第一および第二の反応でそれぞれプライマー２０９／９３９および２１１換パターンの存在は、ＨＣＶ遺伝子型の同定に有用なシグナチャー配列を提供する。多数の異なるＨＣＶＩ、２および３型の配列を比較することによって、我々は、増幅ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ切断でＨＣＶ１〜３型を区別する方法を開発した。しかしながら、１９例の４現記列は１型のようであり（１！気泳動による型はＡａおよびＡｂ）、一致する研究のためには、新規なＨＣＶ型を同定するための条件を修飾する必要があった。すべての４現記列は、全てのｌ型（および２型）配列に存在しない、新規なＨｉｎｆ１部位をもたらす、−１６７位のＴ−−＞Ｃの変化を示した。５ｃｒＦ１　（およびＨａ　ｅ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｒｓ　ａ　Ｉ）との比較では、それは、中東および他の地域の多くの国々における新規な型の信頼に足る同定を可能にすることを証明した。

結果ＨＣＶｌ、２および３型についての結果は表８に要約した。エジプトのサンプルは、単一の５ｃｒＦＩ消化で異常な制限パターンを生じ、４型として同定された。

表８異なる国におけるＨＣＶ型の流行国　ＨＣＶ型（％）ＨＣＶＩ型　ＨＣＶ２型　ＨＣＶ３型スコメスコツトランド６（５１％）　２１（１３％）　６０（３６％）フィンランド　３　（２５に）　５（４２％）　４（３３％）オランダ　１８（６０％）　７（２３％）　５（１７％）香港　２２（６３％）　０（０％）　０（０％）オーストラリア　１３（５７％）　３（１３％）　？（３０％）日本　３］（７７％）　９（２３％）　０　（０％）エジプト　０（０％）　Ｏ（０％）　０（ＯＸ）１ｍｌのＲＮＡゾル溶液（２Ｍグアニジンチオシアネート、１２．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）　、０．２５％Ｗ／Ｖ（７）Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０５Ｍ２−メルカプトエタノール、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，ｏ）、５０％Ｗ／Ｖ水飽和フェノール）を加えることによって、先に報告されたように（Ｃｈａｍｃｚｙｎｓｋｉら、１９８７）抽出し、沈殿物が溶解するまで混合した。１００μｍのクロロホルムを添加した後、各サンプルを＋４０００Ｘｇで５分間遠心し、水相を０．５ｍｌクロロホルムで再抽出した。ＲＮＡを等量のインプロパツールを添加し、少なくとも１時間−２０℃に置いて沈澱させた。ＲＮＡ沈殿物を１４０００×ｇで１５分４℃で遠心して生成し、１ｍｌの７０に冷エタノール溶液で洗浄し、乾燥させ、さらにジエチルピロカーボネート処理蒸留水２０μｍに再懸濁させた。１００例の直接抽出したサンプルのうち、総数１９例がＰＣＲ陰性であった（下記参照）。陰性サンプル２ｍｌ容量を２０００００Ｘｇで２時間超遠心し、沈殿物を上記のように再抽出した。より大容量の血漿からの抽出によってさらに３例の陽性サンプル（６６，８０，８５番）を得た。

ＰＣＲおよび型分け・ＲＮＡをプライマー９４０で逆転写し、ｃＤＮＡを２段階のネストＰＣＲ反応でプライマー９４０／９３９、続いて２０９／２１１で先に報告されたように（Ｃｈａｎら、１９９２）増幅した。ＰＣＲ生成物を（”５） −ｄＡＴＰで放射能標識しＭ限エンドヌクレアーゼ切断によって（Ｍｃｌｒｓｈら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、　３２：　１１号１９９２）分析した。サンプルを、５ｃｒＦＩおよびＨａｅｌｌｌ／Ｒｓａｌの組み合わせで２つの別々の反応で切断し、ｆ（ＣＶＩ／４．２．３型を同定した。図１７はエンドヌクレアーゼ切断パターンを示す。ＨＣＶｌおよび４型はＨｉｎｆｌによる三番目の反応によって区別された（結果を参照）。２例のサンプルは、ＨＣＶの４種の既知の型のそれと異なる制限パターンを生じ、これを増殖ＤＮＡの直接配列分析（Ｃｈａｎら、１９９２）によって分析した。これら２例血漿から増幅したＨＣＶの５’　ＮＣＲにおける予備的配列分析によって、５’ＮＣＲおよびファー領域の両方において比較的同質のグループの新規な配列変種が明らかにされた。これは、ＨＣＶｌ、２および３型が互いに異なる程度に、これら１．２．３型と異なっていた（先の文献参照）。この新規なグループはＨＣＶ４型と命名された。４型間列の切断パターンと先に同定された４型間列のＲＦＬＰ型分析のそれとの比較は、ＨＣＶｌ型のそれと類似の５ｃｒＦＩおよびＨａｅＩｌｌ／Ｒｓａ（による電気泳動タイプの区分を生じた（表９）。１型配列は、ａＡｒＢの９パターン、ｂＡ／ＢおよびＩｂｃの３５パターンを生じた。これらの酵素のみでは、４型間列はしたがって１型とは区別できない（１４ａＡ／Ｂ、４ｂＡ／Ｂ）。しかしながら、１型および４型間列は、Ｈｉｎｆ　１部位の数が常に異なっている。１８例の４型間列の全ては、１つまたは２つの潜在的切断部位を含むが（バンドＣのパターンを生じる；表５）、一方分析した４５例のｌ型配列のいずれにおいても何も認められない（パターンａ）。４型間列の１例は、Ｒｓａｌに対する制限部位の消失によってｌ型および他のＨＣＶ型とはさらに異なり、ｈと命名された新規なバンドパターンをもたらした（４４．１７２．９．２６；表９の１段目）。最後に、ただ１つの配列、ＥＧ−２８は２つの部位を失っており、２１６．９および２６塩基対のバンド（パターン１１表９）を生じた。

この配列は既知のＨＣＶ型のいずれ（４型も含めて）のそれとも異なっており、表のＵ（未分類）と標識した段に示しである。

調査物の型分け・ＮＡＢＡ肝炎の患者のサンプル１００例からＲＮＡを抽出し、５°ＮＣＲ内のプライマーで増幅した。これらのうち、８４例がＰＣＲ陽性で、ＲＦＬＰによってＨＣＶ型分けを実施することができた。これはまずＨａｅＩＴ１／５ｃｒＦＩで実施し、１０例の２型および１０例の３型変種の同定が可能であった（表１０）。電気泳動パターンａＡ／ＢまたはｂＡ／Ｂをさらに、ｈｉｎｆＩによる切断でさらに分析し、パターンａをもつサンプル３８例（したがって１型と同定される）、パターンｂをもつ２２例およびパターンＣをもつ２例（両方と１４型と同定される）を得た。最後に、２例のサンプルは、Ｈａ　ｅ　Ｉ　Ｉｊ／ＲｓａＩで通常とは異なる切断パターンｈおよびｉを、さらにＨｉｎｆｌでパターンｂを示したので直接配列決定を行った。これら２つの配列は互いに類似していたが、既知のＨＣＶ型のいずれとも異なっており、ＥＧ−２８（Ｈａｅｌｌｌ／ＲｓａＩでパターンｉを示した別の配列）とも異なっていた（表１０）。それらは現時点では分類できないので、それらをＵ型と呼ぶ。

表９ＨＣＶｌ、２．３および４型のＲｓａｌ／ＨａｅＩＩＬ　５ｃｒＦ１およびｌ勉１　５ｔｒＦＩ　Ｈｉｎｆｌ　１　２　３　４　Ｕ”ａＡｒＢ　ｈ’　９　−　 −　−　− ｂＡ／Ｂ　ａ　３５　−　−　・− ａ　Ａ／Ｂ　ｂ’　−・−１３− ＠　Ａ／Ｂ　Ｃ’　−−−’　− ｂＡ／Ｂ　ｂ　−−・　４　− °既に記載されたように（Ｍｃｏｍｉｓｈら、１９９２）Ｈａ　ｅ　Ｉ　Ｉ　Ｉ／Ｒｓ　ａ　Ｉおよび５ｃｒＦＩについて指摘された切断パターン。

ゝ未分類型のＨＣＶ変種の切断パターン１パターンａ：Ｈｉｎｆｌよって切断されない。

４パターンｂ：ＤＮＡが切断され、サイズＩＯＴおよび１４２塩基対（５°→３゛）の２つのフラグメントを生じる。

１パターンｃ：ＤＮＡが切断され、５６．５１および＋４２塩基対の３つのフラグメントを生じる。

ｊｈと呼ぶＨａｅＩ１１／Ｒｓａｌによる新規な切断パターン（４４，１７２，９，２６塩基対）。

１　’ｒと呼ぶＨａｅｌｌｌ／Ｒｓａｌによる新規な切断パターン（２１６，９，２６塩基対）。

表ｌ０Ｒｓａ［／ＨａｅｌＩ　１．５ｃｒＦＩおよびＨｉｎｆ　Ｉによる５′ＮＣＲ配列のＲＦＬＰ分析による被験者のＨＣＶ１〜４型の同定°２サンプルが通常と異なるＨａｅＩＩＩ／Ｒｓａｌ　（ｈ、ｔ）による制限パタＶ１．発現および分析などの技術本発明はまた、本明細書で定義された通りのＤＮＡ配列を含む発現ベクターを提供するが、このベクターは、適切な宿主中で該ＤＮＡ配列を発現し、本明細書で定義された通りのペプチドを産生ずることができる。

該発現ベクターは、普通には、適切な宿主中で該ＤＮＡ配列の発現を達成するＤＮＡの制御要素を含む。これら要素は宿主に応じて変えることができるが、通常は、プロモーター、リポソーム結合部位、翻訳開始および停止部位、並びに転写終了部位を含む。そのようなベクターの例は、プラスミドおよびウィルスを含む。本発明の発現ベクターは、染色体外ベクターおよび宿主細胞染色体に組み込まれるベクターの両方を含む。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）で使用する場合、該発現ベクターは、場合によって例えばβ−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡ配列の５゜もしくは３″末端に、または例えばｔ　ｒｐＥ遺伝子をコードするＤＮＡ配列の３″末端に結合させた融合物として本発明のＤＮＡ配列を含むことができる。昆虫のバキュロウィルス（ＡｃＮＶＰ）系で使用する場合は、該ＤＮＡ配列は場合によってポリヒドリンをコードする配列に融合される。

本発明はまた、本明細書で定義されたような発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。本発明で使用する宿生細胞の例は、原核細胞および真核細胞、例えば細菌、酵母、哺乳類および昆虫の細胞を含む。そのような細胞の具体例は、大腸菌、ビール酵母菌（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Ｐ、パストリス（Ｐ、　ｐａｓｔｏｒｉｓ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞およびマウス細胞、並びにスポドブテラ＝フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）およびトリコブルシア＝：　−（Ｔｒｉｃｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）である。宿主細胞の選択は多数の因子によって左右されるが、ＨＣＶウィルスペプチドの翻訳後修飾が重要な場合は、真核細胞宿主が好ましい。

本発明はまた、ここで定義されたようなペプチドを製造する工程を提供し、これは、ここで定義したＤＮＡ配列のＨＣＶゲノムからの分離、またはここで定義したペプチドをコードするＤＮＡ配列の合成、または該ペプチドをコードするＤＮＡ配列の作製、該ＤＮＡ配列を適切な宿主中で発現させることができる発現ベクターへの該ＤＮＡ配列の挿入、該発現ベクターによる宿主細胞の形質転換、該形質転換宿主細胞の培養および該ペプチドの分離を含む。

このペプチドをコードするＤＮＡ配列は標準的な方法（Ｇａ山オリゴヌクレオチド合成、実践入門（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ）、　１９８４オツクスフオード、ＩＲＬプレス）で合成できる。

上記のように得られた所望のＤＮＡ配列は、既知の標準的な技術を用いて発現ベクターに挿入することができる。発現ベクターは通常は制限酵素を用いて切断し、ＤＮ／’、配列は平滑端または粘着端結合を用いて挿入される。切断は通常、発現ベクター内の好都合な部位（こねは、一旦挿入されると、該ＤＮＡ配列がその発現を達成するＤＮＡの機能的要素の制御下に置かれるような部位である）で制限酵素で行われる。

宿主細胞の形質転換は、標準的技術を用いて実施できる。いくつかの表現型マーカーが通常用いられ、上手（発現ベクターを取り込んだ形質転換細胞とそうでないものとが区別される。形質転換宿主細胞の培養および所望のペプチドの分離もまた、標準的な技術を用いて実施できる。

本発明のペプチドは、合成手段またはりコンビナンドＤＮＡ技術によっても製造できる。該ペプチドは好ましくは自動合成装置を用いて合成できる。

本発明のペプチドに特異的な抗体を該ペプチドを用いて作製することができる。

該抗体は多クローン性でも単クローン性でもよい。該抗体は、該ペプチドのバッチの品質管理検査に、ペプチドまたはウィルス溶解物の精製に；エピトープマツピングに、抗体検出のために標識された場合は競合型アソセーにおける結合物として１さらに抗原検出アッセーに用いることができる。

本発明のペプチドに対する多クローン性抗体は、ペプチドを（場合によって免疫応答を促進するために担体に結合させる）＠乳類宿主（例えばマウス、ラットヒツジまたはウサギ）に注射し、その結果産生された抗体を回収することによって得ることができる。該ペプチドは一般には注射が可能な製剤形で投与されるが、その場合、ペプチドは生理的に許容できる希釈剤と混合されている。゛アジュバント（例えば７０インドの完全アジュバント（ＦＣＡ）または７０インドの不完全アジュバント（ＦＩＡ））を該製剤に含ませてもよい。製剤は通常は、適切な期間にわたって宿主に注射され、血漿サンプルを適切な間隔で抗ＨＣＶウィルス抗生を失血させる。続いて、例えばプロティンＡまたはイオン交換クロマトグラフィーによる標準的な方法を用いて血漿から、抗体を抽出、精製する。

本発明のペプチドに対する単クローン性抗体は、無限増殖細胞株の細胞を、該ウィルスまたは局所構造的に関係を有するペプチドに対する抗体を産生ずる細胞と融合させ、該融合無限増殖細胞株を培養することによって得ることができる。

典型的には、非ヒト補乳類宿主、例えばマウスまたはラットに該ペプチド接種する。宿主が抗体反応を惹起するために十分な期間が経過した後、抗体産生細胞（例えば牌細胞）を取り出す。無限増殖細胞株（例えば、マウスまたはラットミエローマ細胞株）の細胞を該抗体産生細胞と融合させ、生じた融合物を所望の単クローン性抗体を分泌する細胞株（例えばハイブリドーマ）を識別するためにスクリーニングする。融合細胞株を培養し、単クローン性抗体を多クローン性抗体の精製と同じ態様で培讐液から精製することかできる。

本発明に基づく診断アッセーを、ＨＣＶ感染の有無を決定するために用いることができる。それらはまた、そうした感染の治療をモニターするために、例えばインターフェロン療法において使用することもできる。

ウィルス感染の診断用アソセーでは、基本的には利用可能な３種類の異なる方法があるが、これは、ウィルス核酸、ウィルス抗原またはウィルス抗体の検出を含む。ウィルス核酸は一般には、ウィルス自体の存在の最良のインジケーターと考えられ、材料がおそらく感染性があることを示すことができるであろう。しかし、核酸の検出は、通常は抗原または抗体の検出はど容易ではない。なぜならば、標的のレベルが非常に低いことがあるからである。ウィルス抗原は、ウィルスの存在のマーカーとして、さらに感染性のインジケーターとして用いられる。ウィルスによってはサンプル中に存在する抗原の量は非常に低く、検出が困難な場合がある。抗体検出は比較的容易である。なぜならば、事実、宿主免疫系は、大量の循環抗体を産生ずることによって感染に対する反応を増幅させるからである。

抗体応答の性状は臨床的にしばしば有用である。例えば、ＩｇＧよりむしろ１ｇＭクラスの抗体は感染が最近であることを示し、また、特定のウィルス抗原に対する応答は、そのウィルスの除去を伴う。したがって、ウィルス感染の診断に用いることができる正確な方法は、特定の環境およびめられている情報に左右される。ＨＣＶの場合には、診断アッセーはこれら３種の方法のいずれでも具体化できる。

ウィルス核酸の検出を含むＨＣＶの診断用アッセーでは、該方法は、検査サンプル中に存在するウィルスＲＮＡ、またはそのようなウィルスＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを、本発明のヌクレオチド配列に該当するＤＮＡ配列、または本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列とハイブリダイズさせ、生じた核酸ハイブリッドをスクリーニングして、いずれのＨＣＶウィルス核酸かを同定することを含む。この方法の応用は、通常、ウィルスＲＮＡが高いレベルでおそらく存在する、適切な組織の検査サンプル（例えば肝生検）に限られる。本発明の核酸配列に該当するか、または本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドまたは、場合によってはプラスミツド内に含まれるｃＤＮＡ配列の形を取ることができる。該核酸ハイブリッドのスクリーニングは、好ましくは、標識ＤＮＡ配列を用いることによって実施される。好ましくは、本発明のペプチドは、ウィルス核酸への該ペプチドの結合が標識が結合部位に近すぎるために干渉されることがないよう、該標識がペプチドから十分な距離にあるオリゴヌクレオチドの部分である。一種または別の種類のスクリーニングをさらに１回または２回以上行って、該ハイブリッドの特性を調べて、いずれのＨＣＶウィルス核酸かを同定する。ハイブリダイゼーションおよびスクリーニング工程は、当該技術分野で既知の方法にしたがって実施する。

本発明はまた、ＨＣＶウィルス核酸検出用キットを提供するが、これは、１）本発明のＤＮＡ配列または本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む標識オリゴヌクレオチド、およびｌｌ）洗浄溶液、反応緩衝液および、標識が酵素の場合、基質を含む。

有利には、検査キットはまた、ウィルス核酸の同定を促進するために陽性コントロールサンプルを含む。

ウィルス抗原または抗体の検出を含むＨＣＶ診断用アッセーでは、該方法は、検査サンプルを本発明のペプチドまたは該ペプチドに対する多クローン性もしくは単クローン性抗体と接触させ、さらに、検査サンプル内に含まれる何らかの抗は、ここに定義されたペプチドまたはそれに対する多クローン性もしくは単クローン性抗体、および検査サンプル中に含まれる抗体もしくは抗体のそれぞれとの結合が存在するか否かを決定するための手段を含んで提供される。該検査サンプルは、ウィルス核酸の検出について上記に述べた、いずれの適切な組織および生理的液体から採取してもよい。生理的液体を得た場合には、場合によって、存在するいずれのウィルス抗原または抗体のためにも濃縮することができる。

多様なアッセー形式を用いることができる。該ペプチドは溶液中のＨＣＶに対する抗体を選択的に捕捉するために、または既に捕捉した抗体を選択的に標識するために、または該抗体を捕捉し標識するために用いることができる。さらに、該ペプチドは、種々の均質アッセー形式で用いることができ、この場合、ペプチドと反応する抗体は相を分離することなく溶液中で検出される。

溶液から抗体を捕捉するためにペプチドが用いられるタイプのアッセーは、固形表面上にペプチドを固定することを含む。この表面は何らかの方法で洗浄することができるべきである。適切な表面の例は、種々のタイプ（マイクロタイターのくぼみに流し込んで固めたもの、ビーズ；種々のタイプのディツプスティック、吸引チップ１電極：および光学装置）のポリマー、通常の粒子のサイズが０゜０２から５ミクロンの粒子（例えばラテックス、固定赤血球細胞；細菌もしくは微細胞、芽胞、金もしくは他の金属性もしくは金属含有ゾル：および蛋白性コロイド）、膜（例えば、ニトロセルロース、紙、酢酸セルロース、および有機または無機材料の多孔性／高表面積膜）を含む。

該表面へのペプチドの付着は、至適組成（界面活性剤、溶媒、塩および／またはカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）を含むことができる）の溶液からの受動的吸着、または能動的化学結合によることができる。能動的結合は、該表面に露出させることが可能な、種々の反応性または励起可能官能基（例えば縮合剤、活性酸エステル、ハロゲン化物および酸無水物：アミ人ヒドロキシル、またはカルボキシル基、スルヒドリル基：カルボニル基ニジアゾ基、または不飽和基）を介して行われてもよい。場合によって、能動結合は、蛋白（それ自体表面に受動的に、またによっても化学的に結合させることができる。この方法での蛋白の使用は、等電点、電荷、親水性または他の物理化学的特性のために有利であろう。ウィルスペプチドはまた、反応混合物の電気泳動的分離、例えば免疫沈澱反応に続いて、該表面（通常は膜であるが、必ずしもその必要はない）に結合させることができる。

ペプチドが付着している表面を検査サンプルと接触（反応）させ、反応の時間を与え、必要な場合には種々の手段（例えば洗浄、遠心、ろ過、磁力または毛細管作用）のいずれかで過剰なサンプルを除いた後、該捕捉抗体を検出可能な信号を生じるいずれかの手段によって検出する。例えば、これは、上記で述べたような捕捉抗体と反応する標識分子または粒子（例えば、蛋白Ａまたは蛋白Ｇなど：抗種もしくは抗免疫グロブリン亜型、類リューマチ因子：または競合的態様もしくはブロッキングの態様で用いられる該ペプチドに対する抗体）、または該ペプチドに含まれるエピトープを含む一切の分子を使用することによって達成することができる。

検出可能な信号は光学的または放射能活性または物理化学的なものが可能で、例えば色素、放射能標識、電気的活性種、磁気共鳴種またはフルオロフォアによって該分子または粒子を標識することによって直接的に、またはいずれがの種類の測定可能な変化を発生させることができる酵素自体で分子または粒子を標識することによって間接的に提供することができる。また別に検出可能な信号は、例えば凝集反応を用いて、または、表面が粒子の形状の場合は回折もしくは複屈折効果によって得ることができる。

ペプチド自体が既に捕捉された抗体を標識するために用いられるアッセーは、ペプチドが検出されることを可能にする、ペプチド標識のある種の形を必要とする。該標識は、例えば放射能標識、磁気共鳴種、ペプチドへの粒子もしくは酵素標識を化学的にもしくは受動的に結合させることによって直接、または、それ自体ペプチドと反応する分子に何らかの形の標識を結合させることによって間接的に行うことができる。ペプチドへ標識を結合させるための反応は、ペプチドに既に存在する分子部分（例えばアミノ基）を介して、または中間体分子部分（例え能動的吸着を含むいずれかの試薬によって行われる。特に、抗体の捕捉は、抗種もしくは抗免疫グロブリン亜型によって、類リューマチ因子、蛋白Ａ、Ｇなどによって、または該ペプチド中に含まれるエピトープを含むいずれかの分子によって行われる。

標識ペプチドは競合的な結合態様で用いることができ、この場合、上記で例示したいずれかの表面上でのいずれかの特異的分子へのその結合は、サンプル中の抗原によって阻害される。また別に、それは非競合的態様で用いることができるが、この場合、サンプル中の抗原は上記のいずれかの表面に特異的または非特異的に結合し、さらにまた、標識ペプチドを捕捉するために用いられる特異的な二価または多価分子（例えば抗体）と残存する価標で結合する。

均質アッセーではしばしば、ペプチドおよび抗体は別々に標識され、それによって、抗体が拘束されずに溶液中のりコンビナンドペプチドと反応するとき、この二種の標識は相互反応によって、例えば、１つの標識によって捕捉されたエネルギーの他の標識への非放射性転移（励起された第二の標識または消去された第一の標識が適切に検出される（例えばフルオリメトリー、磁気共鳴または酵素測定）を可能にする。サンプルにウィルスペプチドまたは抗体を添加することによって、標識ペアーの相互反応が制限され、したがって、検出体において異なるレベルの信号が生じる。

ＨＣＶ抗体検出の適切な形式は、直接サンドイッチ酵素免疫アッセー（Ｅ　Ｉ　Ａ）形式である。ペプチドはマイクロタイターのくぼみに被覆される。検査サンプルおよび酵素結合ペプチドを同時に加える。検査サンプル中に存在する一切のＨＣＶ抗体は、くぼみを被覆しているペプチドおよび酵素結合ペプチドの両方に結合する。典型的には、同じペプチドがサンドイッチの両側に用いられる。洗浄後、結合酵素は、色の変化を伴う特異的な基質を用いて検出される。そのようなＥＩＡで使用する検査キットは下記の（１）〜（４）を含む：（１）酵素で標識された、ここで定義されたペプチド；（２）該酵素のための基質；（３）ペプチドが固定される表面を提供する手段；（４５場合によって、洗浄溶液および／または緩衝液。

ＩｇＧ／ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩ　ＳＡもまた用いることができる。この場合、抗ヒト抗体がマイクロタイターのくぼみに被覆され、検査サンプルが該（ぼみに添加される。検査サンプル中に存在する一切のＩｇＧまたはＩｇＭ抗体は続いて抗ヒト抗体に結合する。本発明のペプチド（これは標識されている）が該くぼみに添加され、ペプチドは、ＨＣＶ感染により生じた一切のＩｇＧまたはＩｇＭに結合するであろう。ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体はペプチド上の標識によって視覚化できる。

したがって、本発明のペプチドは、古典的ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＴＳＡ、膜結合ＥｒＡおよび免疫沈澱反応を含むアッセーにおいて、多くの形式（換言すれば遊離ペプチドとして）でＨＣＶ感染の検出に使用できることが理解されよう。ペプチド結合物は増幅アッセーおよびＩｇＧ／ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡにおいて用いることができる。

本発明のアッセーは、例えば献血血液のスクリーニングまたは臨床的な目的のため、例えばＨＣＶ感染の検出およびモニターに用いることができる。スクリーニングの目的のためには、好ましいアソセー形式は、自動化できるもの、特にマイクロタイター形式およびビーズ形式である。臨床的な目的のためには、そのような形式に加え、小規模用または星回使用用（例えばラテックスアッセー）もまた使用できる。スクリーニング工程における確認アッセーのためには、抗原はウェスタンブロッティングまたは他の免疫プロッティング検査での使用に適した小片上で与えられる。

上記に示したように、検査サンプル中の抗ＨＣＶ抗体の存在を検出するために（特に献血血液のスクリーニングにおいて）現在用いられているアンセーは、ＨＩｎ型のみから得られた抗原性ペプチドを利用しており、本明細書で明らかにしたように、そのような抗漿は他のＨＣ〜７遺伝子遺伝倍型に足る検出を行うことができない。したがって、ＨＩＶ−１のための検査を他の全ての遺伝子型、例えば２．３および４型、並びに発見されうるさらに別の遺伝子型のための検査で補充することが明らかに望ましい。

ペプチド、例えばマイクロタイタープレートの一連のくぼみ、またはビーズ形式を用いた同等のシリーズを含む。そのようなアッセー形式は、サンプル中に存在するＨＣＶの遺伝子型を決定するために用いることができる。また別に、または付は加えるに、アッセ一手段は、ｌ遺伝子型以上の抗原性ペプチドを含んでいてもよく、例えば、マイクロウェルまたはビーズはｌ遺伝子型以上のペプチドで被覆することができる。

検査には１つ以上のＨＣＶ抗原、特に遺伝子の構造領域由来の少なくとも１つの抗原性ペプチドおよび非構造領域由来の少なくとも１つの抗原性ペプチドの組み合わせ、特にコアー抗原およびＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５領域から選ばれる少なくとも１つの抗原の組み合わせを用いることが有利であることが分かった。

くぼみおよびビーズは、別々に抗原で被覆することができる。しかし、２つまたは２つ以上の抗原性ペプチドを単一のポリペプチドとして、好ましくはりコンビナンド融合ポリペプチドとして融合させることが有利であることが分かった。そのような方法の利点は、個々の抗原は一定の、予め定めた比率（通常は等モル）で組み合わせることができ、さらにただ１つのポリペプチドの製造、精製および特性検査が必要とされるということである。１つまたは２つ以上のそのような融合ポリペプチドは、所望の場合には１つまたは２つ以上の非融合ペプチドに加えて用いることができる。融合ペプチドには多くの可能な抗原組み合わせが有るということは理解しえよう。例えば、融合ポリペプチドは、ただ１種の血清型由来の所望の範囲の抗原を含むことができ、または１つ以上の血清型由来の抗原を含むこともできる。血清型２．３および４型の抗原性ペプチドは、好ましくは本明細書に記載したようなものである。

複数のペプチドを含むポリペプチドを得るためには、個々のコーディング配列を単一の開放型読み枠に融合させることが好ましい。もちろんこの融合は、各成分ペプチドの抗原活性がもう１つのペプチドとの位置関係によって顕著に損なわれないように実施されるべきである。特別の関心は、もちろんペプチド間の実際の接合点の配列に払われるべきである。一般には得られたコーディング配列は、ペプチド得る方法は、当該技術分野において既知であり、ＨＣＶＩ型株の複数の抗原を含むリコンビナント融合ポリペプチドの製造は、英国特許出願公開公報ＧＢ −Ａ２２３９２４５号免疫沈澱反応に開示されている。ペプチド結合物は増幅アッセーおよびＩｇＧ／ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡにおいて用いることができる。

本発明のペプチドは、ヒトにＨＣＶに対する免疫を誘発するためのワクチン製剤に包含させることができる。この目的のために、該ペプチドは医薬的に許容できる担体とともに提供することができる。

ワクチン製剤での使用には、該ペプチドは、Ｂ型肝炎コア一部分の融合粒子とペプチドは場合によって、特定の構造（例えばリボゾームまたはｌＳＣ０Ｍ５）に結合させてもよい。

医薬的に許容できる担体は、該ペプチド患者に導入するための賦形剤としての使用に適した流動性媒体を含む。そのような流動性媒体の例は金塩溶液である。

ペプチドは該担体中に溶解されるか、または固形物として懸濁される。

ワクチン製剤はまた、免疫反応を刺激し、それによってワクチンの効果を増強させるためにアジュバントを含むことができる。アジュバントの例は、水酸化アルミニウムおよび燐酸アルミニウムである。

ワクチン製剤は、０．０１から５ｍｇ／ｍｉ好ましくは０．０３から２ｍｇ／ｍｌの範囲の最終濃度のペプチドを含むことができる。ワクチン製剤は滅菌容器に入れることができる。これは、続いて密封され、低温（例えば４℃）で保存、または凍結乾燥してもよい。

ＨＣＶに対する免疫をヒトに誘発させるために、ｌ用量または２用量以上のワクチン製剤を投与することができる。各用量は、０．１から２ｍｍ好ましくは０２から１ｍｍである。ヒトにＨＣＶに対する免疫を誘導する方法は、前記に規定したように有効量のワクチン製剤を投与することを含む。

本発明はまた、ヒトにＨＣＶに対する免疫を誘発するために使用するワクチンの調製における、本明細書で定義したペプチドの使用を提供する。

本発明のワクチンは、ワクチン投与のためにいずれの手頃な方法によっても投与できる。この方法は、経口および非経口（例えば、静脈内、皮下または筋肉内）注射を含む。この処置は、単一用量ワクチンまたは一定期間の間の複数用量から成る。

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ａｏｕｎ、１７２：５１１−５１６゜２３、　Ｔ、　Ｎａｋａｏ、　Ｎ、　Ｅｎｏｍｏｔｏ、　Ｎ、　Ｔａｋａｄａ、　Ａ、　Ｔａｋａｄａ、　Ｔ、　Ｄａｔｅ、１９９１．　制■t ラグメントの長さの多様性によるＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）ゲノムの型分け　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　７２＋２１０５−２１１２゜２４、　Ｎ、　Ｏｇａｔａ、　ＨＪ、　Ａｌｔｅｒ、　Ｒ，Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｒ，Ｈ，Ｐｕｒｃｅｌｌ、　１９９１．　Ｃ型肝炎ウィルスのＨ株のヌクレオチド配列および変異頻度　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υＳＡ　８８：３３９２−３３９６゜２５、　Ｈ，Ｏｋａｍｏｔｏ、　Ｓ、　０ｋａｄａ、　Ｙ、　Ｓｕｇｉｙａｍａ、　Ｔ、　Ｔａｎａｋａ、　Ｙ、　Ｓｕｇａｉ、　Ｙ、　Ａ汲≠ ■≠獅■B Ａ、　Ｍａｃｈｉｄａ、　Ｓ、　Ｍｉｓｈｉｒｏ、　Ｈ，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ、　Ｙ、　Ｍｉｙａｋａｗａ、　ＩｉＬ　Ｍａｙｕｍｉ、　１X９０゜５′非コード領域から推定した２対のプライマーを用いた２段階ポリメラ２６、　Ｉｔ　０ｋｕ１０ｔｏ、　Ｓ、　０ｋａｄａ、　Ｙ、　Ｓｕｇｉｙａｘｘ、　Ｓ、　Ｙｏｔｓｕｍｏｔｏ、　Ｔ、　Ｔａｎａｋａ、@Ｈ，Ｙｏｓｈｉｚａｗａ、　Ｆ、　Ｔｓｕｄａ、　Ｙ、　Ｍｉｙａｋａｗａ、　ｔ　Ｍａｙｕｍｉ、　１９９０．　Ｃ型肝炎ウィルスゲノムの５′末端配列　Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｂｘｐ、　Ｍｅｄ、　６０：１６７−１７７゜２７、　Ｇ、　Ｐｏｚｚａｔｏ、　ｌｉＬ　ｍｏｒｅｔｔｉ、　Ｆ、　Ｆｒａｎｚｉｎ、　Ｌ、Ｓ、　Ｃｒｏｃｅ、　Ｃ，Ｔｉｒｉｂｅｌｌ堰A　Ｔ、　Ｍａｓａｙｕ、　Ｓ、　Ｋａｎｅｋｏ、　ｉｔ　ｔｌｎｏｕｒａ、　Ｋ、　Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、　１９９１．　異なるＣ型肝炎ウィルスクローンを有する肝疾患の重篤度　Ｌａｎｃｅｔ　３３８：５０９゜２８、　Ｎ、　５ａｉｔｏｕ、　Ｔ、　Ｉｍａｎｉｓｈｉ、　１９８９．正確な系統発生相を得ることニツイテノフィッチューマルゴリアシュの最大窮乏、最大公算、最小進化および近縁合流法の正確な系統樹構築の相対能率　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｂｖｏｌ、　６：５１４ −５２５゜２９、　Ｎ、　５ａｉｔｏｕ、　ｉｔ　Ｎｅｉ、　１９Ｂ？、近傍合流法：系統発生相の再構築のための新規な方法Ｍａｔ、　Ｒｉｏｔ、　Ｅｖｏｌ、　４：４０６−４２５゜３０、　Ｐ、　５ｉｏｓｌｏｎｄｓ、　Ｐ、　Ｂａ１ｆｅ、　Ｊ、Ｆ、　Ｐｅｕｔｈｅｒｅｒ、　Ｃ，Ａ、　Ｌｕｄｌａ＆Ｊ、０１Ｂｉｓｈ盾吹B んＪ、　Ｌｅｆｇｈ　Ｂｒｏｗｎ　１９９０．　ヒト免疫不全ウィルスに感染した個々人は少数の抹消単核球内に少ないコピー数のプロウィルスを含んでいる　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６４：８６４−８７２゜３１、　Ｐ、　５ｉａＩ＋１０ｎｄｓ、　Ｌ、Ｑ、　Ｚｈａｎｇ、　ＬＧ、　Ｗａｔｓｏｎ、　Ｓ、　Ｒｅｂｕｓ、　Ｅ、Ｄ、　Ｆｅｒｇｕ唐盾氏A　Ｐ。

Ｂａ１ｆｅ、　Ｇ、Ｈ，Ｌｅａｄｂｅｔｔｅｒ、　Ｐ、Ｌ、　Ｙａｐ、　Ｊ、Ｆ、　Ｐａｕｔｈｅｒｅｒ、　Ｃ，Ａ−Ｌｕｄｌａｍ、　１９i１０、血液製剤、血友病患者および麻薬使用者のＣ型肝炎の定性および配列決定　Ｌａｎｃｅｔ　３３６：１４６９−１４７２゜３２、　Ｒ，５ｔａｄｅｎ、　１９８４．　核酸配列機能を決定するグラフ法　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｊｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：５２１−５３８゜３３、んＴａｋａｍｉｚａｗａ、　Ｃ，Ｍｏｒｉ、　１．　Ｆｕｋｅ、　Ｓ、　Ｍａｎａｂｅ、　Ｓ、　Ｍｕｒａｋａｍｉ、　Ｊ、　Ｆｕｊ奄狽■ 、　Ｅ、　０ｎｉｓｈｉ、　Ｔ、　Ａｎｄｏｈ、１．　Ｙｏｓｈｉｄａ、　Ｈ，Ｏｋａｙａｍａ、１９９１．　ヒトキャリアーから分離されたＣ型肝炎ウィルスゲノムの構造および機構　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。

６５：１１０５−１１１３３４、　Ｋ、　Ｔａｋｅｕｃｈｉ、　Ｙ、　Ｋｕｂｏ、　Ｓ、　Ｂｏｏｒｕｍｒ、　Ｙ、　Ｗａｔａｎａｂｅ、　Ｔ、　Ｋａｔａｙａｍ、　pル、ｃｈｏｏ、　Ｇ、　Ｋｕｏ、　随Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、　１．５ａｔｏ、　Ｔ、　Ｍｉｙａｍｕｒａ、　１９９０．　ヒト健常キャリアー直接由来Ｃ型肝炎ウィルスゲノムのコアーおよびエンベロープ遺伝゛　子のヌクレオチド配列　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１８：４６２６゜３５、　Ｋ、　Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａ、　Ｍ、　Ｋｏｈａｒａ、　Ｋ、　Ｙａｍｇｕｃｈｉ、　Ｎ、　Ｍａｋｉ、＾、　Ｔｏｙ盾唐■奄■ ａ、　Ｋ、　Ｍｉｋｉ、　Ｓ、　Ｔａｎａｋａ、　Ｎ、　Ｈａｔｔｏｒｉ、　Ｎ、　Ｎｏｍｏｔｏ、　１９９１．第二のグループのＣ型肝炎ウィルス　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅｓ　５：２４３−２５４゜３６、　Ｃ，Ｌ、　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｏｅｌ、　Ｈ，Ｔ、　Ｃｕｙｐｅｒｓ、　Ｈ，Ｗ、　Ｒｅｅｓｉｎｋ、　Ａ、Ｊ、　Ｗｅｉｎｅｒ、@Ｓ、　Ｑｕａｎ、　Ｒ，Ｄｉ　Ｎｅ１ｌｏ、　Ｊｊ、　Ｖａｎ　Ｒａｖｅｎ、　１．　Ｗｉｎｋｅｌ、　Ｄ、　Ｍｕｌｄｅｒ　Ｆｏｌｋｅｒｓ、　Ｐ、ＪB Ｅｘｅｌ　０ｅｈｌｅｒｓ、　Ｗ、　Ｓｃｈｕｓｂｅｒｇ、　Ａ、　Ｌｅｅｎｔｙａａｒ−Ｋｕｙｐｅｒｓ、　Ａ、　Ｐｏ１ｏｔｏ、　ｉｔ@Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、　Ｐ、Ｎ、　Ｌｅｌｉｅ、　１９９１．新規な４−抗原リコンビナント免疫プロ・ソト°　アッセーによるＣ型肝炎ウィルス感染の確認　Ｌａｎｃｅｔ　３３７：３１７−３１９゜３７、　Ａｊ、　Ｗｅｉｎｅｒ、　ｃ、　Ｋｕｏ、　Ｄ、Ｗ、　Ｂｒａｄｌｅｙ、　Ｆ、　Ｂｏｎｉｎｏ、　Ｇ、　５ａｒａｃｃｏ、　Ｃ，kｅｅ。

Ｊ、　Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ、　Ｑ、Ｌ、　Ｃｈｏｏ、　Ｉｔ　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、　１９９０．　非Ａ非Ｂ肝炎におけるＣ型肝炎ウィルス配列の検出［コメント参照］　Ｌａｎｃｅｔ　３３５：ｌ−３。

配列の長さ　＝１９４塩基対鎖の形状　ニ一本鎖形態　：直線状分子の種類　：ＨＣＶ１〜３型のゲノムＤＮＡ使用目的　：寄託特色ＨＣＶｌ〜３型間でｃＤＮＡ配列の変動を示す５゛非コード領域の塩基−２５５から−６２゜配列表（図３）配列識別番号＝２配列の種類　：推定ペプチド配列配列の長さ　二８５アミノ酸鎖の形状　・−重鎮形態　：直線状分子の種類　：ＨＣＶペプチド由来由来組織　ヒト血液サンプル使用目的　・寄託特色ＨＣＶＩ〜３型間でペプチド配列の変動を示すＮ５−５領域のアミノ酸２６４８から２７３２゜配列表（図５）配列識別番号、３配列の種類　：推定ペプチド配列配列の長さ　：５７アミノ酸鎖の形状　二一本膜形態　：直線状分子の種類　：ＨＣＶペプチド由来由来組織　、ヒト血液サンプル使用目的　：寄託　・特色ＨＣＶｌ〜３型間でペプチド配列の変動を示すＭＳ−３領域のアミノ酸１５７７から１６３３゜配列表（図７）配列識別番号・４配列の種類　、推定ペプチド配列配列の長さ　、１２４アミノ酸鎖の形状　二一本膜形態　：直線状分子の種類　：ＨＣＶペプチド由来由来組織　ヒト血液サンプル使用目的寄託特色ＨＣＶ］〜３型間でペプチド配列の変動を示すコアー領域のアミノ酸５から１２８゜配列表（図９ａ）配列識別番号・５配列の種類　：ヌクレオチド配列配列の長さ　：３６７塩基対鎖の形状　二一本膜形態　：直線状分子の種類　：ＨＣＶゲノムＤＮＡ由来由来組織　、ヒト血液サンプル使用目的　・寄託特色個々の変動および共通配列を示すＮ５−４領域の塩基４９１１から５２７７゜配列表（図９ｂ）配列都Ｉ１１番号−６配列の種類　：推定ペプチド配列配列の長さ　；１２８アミノ酸鎖の形状　ニ一本鎖形態　：直線状分子の種類　：ＨＣＶゲノムＤＮＡ由来由来組織　：ヒト血液サンプル使用目的　：寄託　・特色個々の変動および共通配列を示すＨＣＶ−３のＮ５−４領域のアミノ酸１６３８から１７６５゜配列表（図１０ａおよび１０ｂ）配列識別番号＝７配列の種類　：ペプチド配列配列の長さ　：９０アミノ酸鎖の形状　ニ一本鎖形態　：直線状分子の種類　：ＨＣＶペプチド由来由来組織　：ヒト血液サンプル使用目的　：寄託　・特色個々の変動および共通配列を示すＨＣＶＩ−３のＮ５−４領域のアミノ酸１６７９から１７６８゜配列表（図１１ａおよび１ｌｃ）配列創り番号：８配列の長さ　：各々９アミノ酸鎖の形状　ニ一本鎖形態　：直線状分子の種類　：９−重合ＨＣＶペプチド由来由来組織　：合成使用目的　：エピトープマツピング寄託　・特色エピトープマツピングに使用したＨＣＶＩ−３のＮＳ４領域に該当する９−重合ペプチド。

配列表（図１３）配列識別番号：９配列の種類　：ヌクレオチドｃＤＮＡ配列配列の長さ　：３０．７０および３２塩基対鎖の形状　ニ一本鎖形態　：直線状分子の種類　：ＨＣＶＩ型から４型のゲノムＤＮＡ由来由来組織　：ヒト血液サンプル使用目的　：寄託　・特色ＨＣＶＩＷ　〜４型（７）５’　ＮＣＲ領域の塩基−２４５から−２１６；−１８５から−１１６，−１０１から−７０゜配列表（図１５Ａおよび１５Ｂ）配列順１１番号：ｌＯ配列の種類　；得られた蛋白配列をもつヌクレオチド配列の長さ　＝２４０塩基対酸鎖の形状　ニ一本鎖形態　：直線状分子の種類　、ゲノムＤＮＡ使用目的　：寄託　・特色ＨＣＶｌ型〜４型のコアー領域の塩基対２３から２６２およびアミノ酸５から８９゜ＦＩＧＵＰ、Ｅ　＋ｌ：　：〜−〜−丁−−−−−−−−−−１ＦＩＧＵＰ、、Ｅ　４ＦＩＧＵＰ、Ｅ　６ｌ：Ｓどｌ：９ａヌクレオチド配列Ｔ工ＧＵＲＥ　９ｂ推定アミノ酸配列Ｔ：二ニ三二　二二二３型１２型：″二二ビＰ三　二二二８　８　８　呂　呂　呂　二　０　邑ＮＣり＝の〜− 呂　呂　呂　呂　呂　呂　呂　０　呂ｋＨり＋？０〜−０Ｆ工ＧＵＰ、Ｅ　１６Ｆ工ＧＵＲＥ　１７Ａ　ＨａｅｌｌｌＪＲｓａ１国際調査報告国際調査報告フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｑ　１／６８　９４５３−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５７６　Ｚ　９０１５−２ＪＩ（７２）発明者　ヤツプ　ペン　リーイギリス　ニブインバラ　イーエイチ９１ジェイゼット　メト−ブレイス　５

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｃ型肝炎ウイルス３型または４型（ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４）に固有のポリヌクレオチド配列。２．それがｃＤＮＡ配列である、請求の範囲第１項に記載のポリヌクレオチド。３．コアー、ＮＳ３、ＮＳ４またはＮＳ５領域のＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異的ポリヌクレオチド配列。４．図１および１ａ、９ａ、１３並びに１５ａに示した配列内に含まれる、ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異的ポリヌクレオチド配列。５．抗原性ペプチドをコードするＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４ポリヌクレオチド配列。６．ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４に固有の配列変更を有するＣ−１００、５−１ −１、Ｃ３３またはＣ２２ペプチドをコードするＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４ポリヌクレオチド配列。７．ポリペプチドＫＰＡＬＶＰＤＫＥＶＬＹＱＱＹＤＥＭもしくはポリペプチドＥＣＳＱＡＡＰＹＩＥＱＡＱＶＩＡＨＱＦ、または実質的に同等な抗原性をもつポリペプチドをコードするＨＣＶ−３ポリヌクレオチド配列。８．ポリペプチドＲ（Ａ／Ｖ）Ｖ（Ｖ／１）（Ａ／Ｔ）ＰＤＫＥ（１／Ｖ）ＬＹＥＡＦＤＥＭもしくはポリペプチドＥＣＡＳ（Ｋ／Ｒ）ＡＡＬＩＥＥＧＱＲ（Ｍ／１）ＡＥＭＬまたは実質的に同等な抗原性をもつポリペプチドをコードするＣ型肝炎ウイルス２型（ＨＣＶ−２）ポリヌクレオチド配列。９．ＨＣＶ−ａまたはＨＣＶ−４特異的抗原性ペプチド。１０．コアー、ＮＳ３またはＮＳ５領域由来のＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異的抗原性ペプチド。１１．図３、５または７に示した配列内に含まれるＨＣＶ−３特異的抗原性ペプチド。１２．ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４に固有の配列変更を有するＣ−１００、５− １−１、Ｃ３３またはＣ２２蛋白に対応する、ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異的抗原性ペプチド。１３．ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４に特異的な抗原性ＮＳ４ペプチド。１４．それが、Ｒ（Ａ／Ｖ）Ｖ（Ｖ／１）（Ａ／Ｔ）ＰＤＫＥ（１／Ｖ）ＬＹＥＡＦＤＥＭまたはＥＣＡＳ（Ｋ／Ｒ）ＡＡＬＩＥＥＧＱＲ（Ｍ／１）ＡＥＭＬである、ＨＣＶ−２特異的抗原性ペプチド。１５．それが、ＫＰＡＬＶＰＤＫＥＶＬＹＱＱＹＤＥＭまたはＥＣＳＱＡＡＰＹＩＥＱＡＱＶＩＡＨＱＦである、ＨＣＶ−３特異的抗原性ペプチド。１６．実質的に１６９１から１７０８位までのＨＣＶ−４配列、または実質的に１７１０から１７２８位までのＨＣＶ−４配列を含む、ＨＣＶ−４に特異的な抗原性ＮＳ４ペプチド。１７．請求の範囲第９項から第１６項の少なくとも２っの抗原を含む融合ペプチド。１８．β−ガラクトシダーゼ、ＧＳＴ、ｔｒｐＥまたはポリヘドリンをコードする配列と融合された、請求の範囲第９項から第１６項の少なくとも１つの抗原を含む、請求の範囲第１７項に記載の融合ペプチド。１９．標識されている、請求の範囲第９項から第１８項のいずれかに記載のペプチド。２０．請求の範囲第９項から第１８項のいずれかに記載の抗原を含むワクチン製剤２１．請求の範囲第９項から第１９項のいずれかの抗原性ペプチドに対する抗体。２２．請求の範囲第９項から第１９項のいずれかに記載の抗原を結合させた固形基材を含む免疫アッセー装置。２３．抗原の混合物を含む、ＨＣＶスクリーニング用の、請求の範囲第２２項に記載の装置。２４．該抗原がコアーおよびＮＳ４領域由来である、請求の範囲第２３項に記載の装置。２５．それぞれＨＣＶ−１、ＨＣＶ−２およびＨＣＶ−３特異的抗原を含む一連の占有箇所を有する平板を含む、ＨＣＶ型分けのための請求の範囲第２２項に記載の装置。２６．さらにＨＣＶ−４特異抗原を入れる占有箇所を含む、請求の範囲第２５項に記載の装置。２７．請求の範囲第２１項に記載の抗体を結合させた固形基材を含む免疫アッセー装置。２８．存在する一切のＨＣＶポリヌクレオチドを逆転写し、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）で増幅し、さらにこの増幅ＨＣＶポリヌクレオチドをＨＣＶ−２、ＨＣＶ−３またはＨＣＶ−４特異的ポリヌクレオチドプローブを用いて検出することを含むインビトロＨＣＶ検査方法。２９．ＰＣＲに用いられる該プライマーが表１に挙げたものから選ばれる、請求の範囲第２８項に記載のインビトロＨＣＶ検査方法。３０．以下の工程を含むインビトロＨＣＶ型分け方法；−ＳｃｒＦＩまたはＨａｅＩＩＩ／ＲｓａＩエンドヌクレアーゼを用いてＨＣＶ含有サンプルのエンドヌクレアーゼ消化を実施し、さらに−この制限パターンを代表的な型特異的パターンと比較する。３１．別々の消化で、または一体消化でさらにＨｊｎｆ１を用いる、請求の範囲第３０項または３１項に記載の方法。３２．以下の工程を含むインビトロＨＣＶ型分け方法；−その制限パターンがＨＣＶ−１、ＨＣＶ−２およびＨＣＶ−３に特徴的である、ＳｃｒＦＩエンドヌクレアーゼを用いてＨＣＶ含有サンプルのエンドヌクレアーゼ消化を実施し、 −その制限パターンがＨＣＶ−４に特徴的である、ＨｉｎｆＩエンドヌクレアーゼを用いるエンドヌクレアーゼ消化を実施する。３３．以下の工程を含む、ＨＣＶ抗体についてサンプルをインビトロでスクリーニングする方法； −請求の範囲第１項から第１９項のいずれかに記載の抗原性ペプチドまたはその混合物を用いて免疫アッセーを実施し、−生じた一切の抗体抗原複合物を検出する。３４．抗体を含む可能性がある１つのサンプルまたは複数のサンプルを一連のＨＣＶ型特異的抗原と別々に接触させ、さらに生じた一切の抗体抗原複合物を各型特異的抗原で検出する、ＨＣＶ抗体のインビトロ型分け方法。