JPH0740924B2

JPH0740924B2 - 形質転換体および融合蛋白質の製造方法

Info

Publication number: JPH0740924B2
Application number: JP2221478A
Authority: JP
Inventors: 久人山崎; 隆幸池田; 浩明山本
Original assignee: エム・ディ・リサーチ株式会社
Priority date: 1990-08-22
Filing date: 1990-08-22
Publication date: 1995-05-10
Anticipated expiration: 2010-05-10
Also published as: JPH04104794A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、遺伝子組換え技術により、バソアクティブ・
インテスティナル・ポリペプチド（以下、VIPと略称す
る）の前駆体を得る上で有用な形質転換体、及び融合蛋
白質の製造方法に関する。

［従来の技術と発明が解決しようとする課題］分子量が比較的小さな生理活性ペプチドとして、VIPが
知られている。このVIPは28個のアミノ酸残基からな
り、サッド（Said）とムット（Mutt）により、ブタ十二
指腸粘膜から血管拡張作用などの薬理作用を持つペプチ
ドとして単離され、かつその構造が決定されている［Sc
ience 169,1217（1970）］。このVIPは腸管や脳のニュ
ーロンで合成され、消化管や血管を弛緩させ小腸分泌を
促進する。

現在、VIPの持つ気管拡張作用や血流増加作用を利用し
て、医薬品の開発検討が行われているが、VIPの産生、
分泌量は極めて微量であり、生体から大量に得ることは
困難である。

一方、VIPはペプチドであるので、遺伝子組換え法によ
り微生物に生産させることも考えられる。しかし、微生
物により比較的分子量の小さいペプチドを直接発現させ
る場合、生産されるペプチドが宿主由来のプロテアーゼ
により分解されるため、効率よく多量のVIPを得ること
が困難である。

ヒトVIPと同等の薬理作用を有するペプチドに関し、特
開平１−296996号公報およびEur.J.Biochem.,178.,343
−350（1988）には、VIP前駆体又はVIPアナログを、大
腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質とし
て、大腸菌を宿主として産生させることが提案されてい
る。この方法においては、産生された融合蛋白質は分泌
発現せず、菌体内に蓄積する。

従って、本発明の目的は、キャリアー蛋白質とVIP前駆
体とがスペーサー配列を介して連結した融合蛋白質を菌
体外に効率よく多量に産生する上で有用な形質転換体を
提供することにある。

本発明の他の目的は、VIP前駆体を効率よく多量に得る
ことができる製造方法を提供することにある。

［発明の構成］本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意検討の結果、
VIP前駆体を、スペーサ配列を介してキャリアー蛋白質
と連結した融合蛋白質として、プロテアーゼ生産性が低
く、形質転換された特定の宿主微生物から分泌発現場合
には、宿主由来のプロテアーゼによるVIP前駆体の分解
を抑制でき、融合蛋白質が菌体外に多量に産生すること
を見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、遺伝子の発現に関与するプロモー
ター、リボソーム結合部位、分泌シグナル及びキャリア
ー蛋白質をコードする領域と、バソアクティブ・インテ
スティナル・ポリペプチド前駆体をコードする遺伝子と
が、化学的又は酵素的に切断可能なスペーサ配列を介し
て連結しているDNA断片が、ベクターDNAに結合している
融合蛋白質分泌発現プラスミドにより、宿主微生物が形
質転換された形質転換体であって、宿主微生物が、アル
カリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼの生産能を欠
き、かつプロテアーゼ活性が野生株の３％以下である枯
草菌に、spoOA△677変異遺伝子を導入した宿主微生物で
ある、形質転換体を提供する。

また、本発明は、前記形質転換体を培養し、キャリアー
蛋白質とバオアクティブ・インテスティナル・ポリペプ
チド前駆体とがスペーサー配列を介して連結した融合蛋
白質を分泌させ、回収する融合蛋白質の製造方法を提供
する。

本発明で用いるプラスミドに含まれるキャリアー蛋白質
は、特に制限されないが、発現量が多く安定なものが好
ましく、さらには発現された融合蛋白質を簡単に分離精
製できるものが好ましい。このようなキャリアー蛋白質
としては、例えば、大腸菌由来のβ−ラクタマーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ、枯草菌由来のα−アミラー
ゼ、黄色ブドウ状球菌（Staphylococcus aureus）由来
のプロテインＡなどが例示できる。黄色ブドウ状球菌由
来のプロテインＡは、大腸菌や枯草菌において安定に発
現することが報告されている［Proc.Nat.Acad.Sci.USA,
80,697〜701,（1983）;J.Bacteriol.,165,796〜804,（1
986）］。特に、プロテインＡは、免疫グロブリンＧ（I
gG）のFc領域と特異的に結合する５つの繰返し領域と、
細菌壁と結合する領域とを有している。このことを利用
して、Fc領域と特異的に結合する領域の後に、目的とす
るVIP前駆体を連結し、融合蛋白質として発現させた
後、アフィニティークロマトグラフィーで簡単に精製す
ることができる。従って、キャリアー蛋白質は、黄色ブ
ドウ状球菌のプロテインＡ中のIgG結合能を有する領域
であるのが好ましい。

以下、プロテインＡの塩基配列とそれに対応するアミノ
酸配列を下記式［II］に示すと共に、プロテインＡにつ
いてより詳細に説明する。

プロテインＡは、黄色ブドウ状球菌の細胞壁成分の５％
を占める蛋白質であり、ヒト、マウス、ウサギなどの哺
乳類のIgGのFc部分と特異的に結合するが、ヒトIgG3と
は結合しない。またプロテインＡは、遺伝子の発現に関
与するプロモーター領域とリボソーム結合部位とを有し
ている。プロモーター領域は、例えば、黄色ブドウ状球
菌8325−４株［ウーレンら、J.Biol.Chem.,259,1695（1
984）］に由来し、−131〜−120番目のヘアピン構造と
−151〜−138番目のパリンドローム配列とを有するプロ
モーターであってもよいが、好ましいプロモーター領域
は、本出願人が特開昭63−245677号公報において提案し
た塩基配列で表される領域である。このプロモーター領
域は、前記式［II］中、−300〜１番目の配列に対応
し、その特徴は、前記黄色ブドウ状球菌8325−４株に由
来するプロモーター領域と異なり、前記ヘアピン構造及
びパリンドローム配列が存在しない点にある。

プロモーター領域の下流（１〜108番目の塩基配列）に
は、分泌に関与するＳ領域をコードする遺伝子が存在
し、この分泌シグナル領域の下流（109〜1524番目の塩
基配列）には構造遺伝子が存在する。

プロテインＡの構造遺伝子は、Ｅ（109〜276番目の塩基
配列）、Ｄ（277〜459番目の塩基配列）、Ａ（460〜633
番目の塩基配列）、Ｂ（634〜807番目の塩基配列）、Ｃ
（808〜981番目の塩基配列）、およびＸ（982〜1524番
目の塩基配列）からなる６つのユニットで構成され、Ｎ
末端から、上記の順序に結合している。なお、1525〜15
52番目の塩基配列はノンコーティング部分であり、1525
〜1527番目のTAAは終始コドンである。上記６つのユニ
ットは、トリプシンによる分解で得られ、Ｅ、Ｄ、Ａ、
Ｂ、Ｃのユニットのアミノ酸配列には高い類似性がみら
れる。Ｅ領域は、プロテインＡのＮ末端に存在するユニ
ットであり、IgGとの結合能力が比較的小さい。Ｄ、
Ａ、Ｂ、及びＣ領域は、それぞれIgGのFc部分との強い
結合能力を有し、Ｘ領域は、プロテインＡ分子を黄色ブ
ドウ状球菌の細胞壁に結合させる機能を有するユニット
である。従って、キャリアー蛋白質は、IgGのFc部分に
対して結合能を有する領域、特に、プロテインＡの成熟
蛋白質中の440番目のアミノ酸まで、すなわち、プロテ
インＡの構造遺伝子中の440番目のアミノ酸（シグナル
ペプチドを除いて）であるAspまでの領域であるのが好
ましい。また、キャリアー蛋白質は、プロテインＡの成
熟蛋白質中の187番目のアミノ酸まで、すなわち、プロ
テインＡの構造遺伝子中の187番目のアミノ酸（シグナ
ルペプチドを除いて）であるLeuまでの領域であるのが
好ましい。

以上のように、黄色ブドウ状球菌のプロテインＡには、
遺伝子の発現に関与するプロモーター、リボソーム結合
部位、分泌シグナル及びキャリアー蛋白質をコードする
領域が含まれている。従って、プロテインＡを導入した
プラスミドは、分泌発現能を有し、キャリアー蛋白質を
コードする領域の後に、VIP前駆体をコードする遺伝子
を、スペーサー配列を介して連結すると、キャリアー蛋
白質とスペーサー配列とVIP前駆体とからなる融合蛋白
質を分泌発現する。

キャリアー蛋白質をコードする領域とVIP前駆体をコー
ドする遺伝子は、化学的又は酵素的に切断可能なスペー
サー配列（アミノ酸配列）を介して連結されている。キ
ャリアー蛋白質をコードする領域とVIP前駆体をコード
する遺伝子とを前記スペーサー配列で連結すると、産生
した融合蛋白質からVIP前駆体を容易に切断して分離す
ることができる。

化学的に切断可能なスペーサー配列としては、例えば、
シアノゲンブロミドにより切断されるMet［Metの後方が
切断される。J.Biophys.Chem.,237,1856（1962）］、ギ
酸により切断されるAsp−Pro鎖［Biochem.Biophys.Res.
Commun.,40,1173（1970）］などが挙げられる。また、
酵素的方法には、例えば、ファクターXaが認識する配列
Ile−Glu−Gly−Arg［Argの後方が切断される。J.Biol.
Chem.,249,7782（1974）］、トロンビンが認識する配列
Gly−Pro−Arg［Argの後方が切断される。Nature,218,3
14（1968）］、カリクレインが認識する配列Phe−Arg
［Argの後方が切断される。Hemostasis,7,76（197
8）］、V8プロテアーゼが認識するGlu［Gluの後方が切
断される。Pro.Nat.Acad.Sci.USA,69,3506（1972）］、
プロリルエンドペプチダーゼが認識するPro［Proの後方
が切断される。Biochemistry,16,2942（1977）］などが
含まれる。なお、融合蛋白質を産生させる方法として、
特表昭60−500480号公報には、プロテインＡをキャリア
ー蛋白質として用いることが開示されている。しかしな
がら、VIP前駆体を融合蛋白質として分泌発現させるこ
とについては何ら開示されていない。

VIP前駆体としては、VIPのＣ末端にグリシン（Gly）が
付加したアミノ酸配列を有するVIP前駆体が好ましく使
用される。このVIP前駆体は下記式［Ｉ］で表される。

Ｈ−His−Ser−Asp−Ala−Val−Phe−Thr−Asp−Asn−T
yr−Thr−Arg−Leu−Arg−Lys−Gln−Met−Ala−Val−L
ys−Lys−Tyr−Leu−Asn−Ser−Ile−Leu−Asn−Gly−
Ｘ［Ｉ］（式中、Ｘは、OH、Lys−OH、Arg−OH、Lys−Arg−OH、
またはArg−Lys−OHを示す。）このアミノ酸配列で表されるVIP前駆体は、17番目のア
ミノ酸がLeuではなくMetである点で、前記先行技術［特
開平１−296996号公報およびEur.J.Biochem.178,343−3
50（1988）］に記載のVIP前駆体と異なる。

融合蛋白質は、前記スペーサー配列を介して、キャリア
ー蛋白質をコードする領域とVIP前駆体をコードする遺
伝子とを連結したDNAに、発現のための制御部位である
プロモーター、リボソーム結合部位及び分泌シグナルを
結合し、得られたDNA断片を、ベクターDNAに結合するこ
とにより、融合蛋白質分泌発現プラスミドを得ることが
できる。なお、プロモーター、リボソーム結合部位、分
泌シグナル及びキャリアー蛋白質を含む前記プロテイン
Ａなどを用いる場合には、プロモーター、リボソーム結
合部位、分泌シグナル及びキャリアー蛋白質を、ベクタ
ーに導入する必要はない。

ベクターは、宿主に応じて、慣用のベクター、例えば、
pUB110、ColE1、pSC101、RSF2124、pBR322、Tiプラスミ
ド、pTUB4［Takeich,Y.et al.agric.Biol.Chem.,47,159
（1983）;Yamazaki,H.et al.J.Bacterial.156（１）,32
7（1983）］などのプラスミド、バクテリオファージλ
などのファージ、SV40ウィルスなどから選択できる。

DNA断片のベクターDNAへの組込みによるDNA組換え体
は、従来慣用の方法、例えば、制限酵素を用いて断片し
たDANとベクターDNAとをリガーゼを用いて連結する制限
酵素法、リンカー法などにより作製できる。

上記融合蛋白質分泌発現プラスミドを宿主微生物に移入
し形質転換することにより、本発明の微生物（形質転換
体）が得られる。

宿主微生物としては、安全性が高く、菌体外に蛋白質を
分泌するバチルス・ズブチリス（Bacillus Subtilis）
のうち、菌体外へのプロテアーゼ生産性を低下させた微
生物を用いる。このような菌株を前記プラスミドにより
形質転換する場合には、宿主に由来するプロテアーゼに
よる融合蛋白質の分解を著しく抑制でき、VIP前駆体を
効率よく多量に得ることができる。

プロテアーゼ生産性の低い枯草菌としては、アルカリプ
ロテアーゼ及び中性プロテアーゼの生産能を欠き、かつ
プロテアーゼ活性が野生株の３％以下である枯草菌バチ
ルス・ジブチリス（Bacillus subtilis）に、spoOA△67
7変異遺伝子を銅入した宿主微生物を用いる。このよう
な菌株には、例えば、特願平１−281440号において、本
発明者らが提案したように、バチルス・サブチリス104H
L株［Biochem.Biophys.Res.Commun.,128;601−606,（19
85）］にspo OA△677変異遺伝子を導入したバチルス・
サブチリスSP011株（微工研菌寄第10987号）、バチルス
・サブチリスDY−16株（微工研菌寄9488号）にspoOA△6
77変異遺伝子を導入したバチルス・サブチリスSPL14株
（微工研菌寄第10988号）などが含まれる。

DNA組換え体の宿主への移入は、従来慣用の方法、例え
ば、プロトプラスト化技術や細胞融合技術などを利用し
て行なうことができる。

本発明の融合蛋白質の製造方法では、融合蛋白質分泌発
現プラスミドにより形質転換された形質転換体を培養す
る。本発明の製造方法の特徴は、融合蛋白質分泌発現プ
ラスミドが保持する分泌シグナル領域に起因して、前記
培養により融合蛋白質を分泌発現させるとともに、宿主
微生物に由来するプロテアーゼによるVIP前駆体の分解
を抑制することにある。形質転換体の培養は、慣用の成
分、例えば、無機塩、炭素源、窒素源、増殖因子成分な
どを含む培地で行なうことができる。好ましい培地は、
液体培地である。液体培地による培養は、通常、振盪培
養又は通気攪拌培養法が採用できる。培地のpHは、通常
７〜８程度である。培養は、微生物の培養に採用される
通常の条件、例えば、温度15〜45℃、好ましくは25〜40
℃、培養時間６〜60時間程度の条件で行なうことができ
る。

融合蛋白質、すなわちキャリアー蛋白質とVIP前駆体と
がスペーサー配列を介して連結した融合蛋白質を、化学
的又は酵素的に切断することにより、VIP前駆体を効率
よく多量に得ることができる。化学的又は酵素的切断
は、融合蛋白質に、前記スペーサー配列を切断する化学
薬剤や酵素を作用させることにより行なうことができ
る。

なお、下記の28個のアミノ酸残基からなる生理活性ペプ
チドとしてのVIP: Ｈ−His−Ser−Asp−Ala−Val−Phe−Thr−Asp−Asn−T
yr−Thr−Arg−Leu−Arg−Lys−Gln−Met−Ala−Val−L
ys−Lys−Tyr−Leu−Asn−Ser−Ile−Leu−Asn−NH₂ を遺伝子組換え技術を利用して生産させる場合には、Ｃ
末端がアミノ基のアミド体は得られない。VIPは、VIP前
駆体と、アミド化酵素、又はカルボキシペプチダーゼＢ
及びアミド化酵素とを反応させ、Ｃ末端をアミノ化する
ことにより得られる。より具体的には、前記式［Ｉ］で
表されるVIP前駆体に、前記アミド化酵素などを作用さ
せ、アミノ酸配列のＣ末端のAsn−Gly−Ｘ（Ｘは前記に
同じ）をAsn−NH₂に変換することにより、VIPを得るこ
とができる。

［発明の効果］本発明の形質転換体は、VIP前駆体を含む融合蛋白質を
菌体外に効率よく多量に産生する。

また、本発明の融合蛋白質の製造方法は、VIP前駆体の
プロテアーゼによる分解を抑制しながら、融合蛋白質を
分泌発現させることができ、VIP前駆体を効率よく多量
に産生できる。

［実施例］以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明する
が、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。なお、実施例で用いた酵素は、いずれも寳酒造
（株）製の酵素であり、それらの使用条件で反応を行っ
た。

実施例１枯草菌によるプロテインＡ−VIP−Gly融合蛋白質の分泌
発現−１（１）プラスミドpMD200の作製プロテインＡ遺伝子を含むプラスミドpDCP2411（特開昭
63−245677号公報参照）（10μｇ）を制限酵素EcoR Iと
BamH I（各々20untis）で消化し、プロテインＡ遺伝子
を含む2.25kbのEcoR I/BamH I断片を得た。次いで、こ
の2.25kbのEcoR I/BamHI断片（１μｇ）と、プラスミド
pUB110のEcoR I/BamH I長鎖断片（0.5μｇ）とを、T₄DN
Aリガーゼ（100units）を用いて連結し、枯草菌Bacillu
s subtilisPLS1株（オハイオ州立大学のバチルスジェ
ネティックストックセンターより入手可能）をプロトプ
ラスト法で形質転換した］Mol.Gen.Genet.,168,111〜11
5,（1979）］。

得られたカナマイシン耐性（Km^r）株をLB培地（1.0％ト
リプトン、0.5％酵母エキス、0.5％NaCl、pH7.2）10ml
（カナマイシンKmを10μg/ml含有）で37℃、16時間培養
した。その培養上清液について、ELISA［Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,80,697〜701,（1983）］によってプロテイン
Ａの生産性を検討し、その結果、プラスミドpMD200を含
む枯草菌Ｂ.subitilisPSL1株を得た。

プラスミドpMD200の構築図を第１図に示す。

（２）VIP−Gly遺伝子の化学合成 29アミノ酸残基からなるVIP−GlyをコードするDNA配列
と、そのＮ末端に、制限酵素Pst Iの切断部位と、カリ
クレインの認識配列であるPhe−Argを含むスペーサー領
域のDNA配列、さらにＣ末端側に、終始コドンTAA TAG
と、制限酵素BamH Iの切断部位を付加した122bpのVIP−
Gly（以下、VIP−G1という）遺伝子をDNA合成装置（ア
プライド・バイオシステムズ社モデル381A）で化学合
成した。

得られたVIP−G1の塩基配列および対応するアミノ酸配
列を以下に示す。

（３）プロテアーゼ生産性の低い宿主バチルス・ズブチ
リスSPL14株の作製 spoOA△677遺伝子及びリンコマイシン耐性遺伝子（以
下、Lin^rと表す）を有する枯草菌であるバチルス・サブ
チリスATCC39096株を、表１に示すLB培地を用いて、温
度37℃で対数増殖期まで振盪培養した。

培養液50ml中に含まれる菌体を集め、斎藤・三浦の方法
（H.Saito,K.Miura,Biochim.Biophis.Acta,72,619（196
3））により染色体DNAを抽出精製した。

得られた染色体DNAを用いて、コンピテントセルトラン
スフォーメーション法により、バチルス・サブチリスDY
−16株を形質転換した。次に、得られた形質転換株を、
５μg/mlのリンコマイシンを含むLB寒天平板培地を用い
て培養し、Lin^rの導入された株を選択した。

その結果、約800株のリンコマイシン耐性形質転換株を
得た。次いで、以下のようにして、これらのリンコマイ
シン耐性形質転換株から胞子形成能欠損株を51株分離し
た。

ヒスチジンを50mg/含む最小寒天培地に形質転換した
枯草菌をまき、温度37℃で48時間培養した。以下の指標
１〜３に合致する菌株を、胞子形成能欠損株として選別
した。

1.胞子形成培地に形質転換株を植菌しそのコロニーがメ
ラニン色素生産能を失ったこと、 2.温度80℃で10分間の熱処理に耐性を示さないこと、及
び 3.顕微鏡検査により胞子形成を認めないこと。

得られた胞子形成能欠損株173株の中でプロテアーゼ活
性が最も低い株を、下記のようにして選別し、プロテア
ーゼ活性を測定した。

１重量％のカゼインを含むLB寒天平板培地に、防止形成
能欠損形質転換株と、親株であるバチルス・サブチリス
DY−16株とを別々に植菌し、温度37℃で24時間培養し
た。菌体が分泌するプロテアーゼによりカゼインが分解
されるので、カゼインの分解により形成される菌体の回
りのハローの大きさを指標として、バチルス・サブチリ
スDY−16株よりもプロテアーゼ生産能が低下した菌株を
40株分離した。

バチルス・サブチリスDY−16株と、プロテアーゼ活性が
低下した形質転換株40株とを、それぞれ、LB培地10mlを
用いて一晩培養した後、培養液1mlを遠心分離し、その
上清に存在するプロテアーゼの活性を測定した。すなわ
ち、0.2％FITC−カゼイン（シグマ社製）、100mMトリス
−塩酸緩衝液（pH7.5）、2mM塩化カルシウムを含む基質
溶液100μ、プロテアーゼを含む上清試験溶液100μ
を添加し、37℃で３時間反応させた。反応終了後、反応
液に200μの7.5％トリクロロ酢酸を添加して反応を停
止し、遠心分離により上清を得、500mMトリス−塩酸緩
衝液（pH8.5）で中和した後、励起波長490nm、発光波長
525nmの螢光を測定した。

なお、カゼインから、１分間に１μＭのTyr相当のトリ
クロロ酢酸可溶性ペプチドを遊離する酵素活性を1Uと
し、プロナーゼ（科研製薬製）を基準として換算した。

その結果、プロテアーゼ活性が親株バチルス・サブチリ
スDY−16株に比べて、極端に低下した４株を得、これら
の菌株を、それぞれ、バチルス・サブチリスSPL9株、SP
L11株、SPL14株、SPL39株とした。

そして、バチルス・サブチリスDY−16株及びこれらのプ
ロテアーゼ活性が低下した形質転換株を10mlのLB培地で
18時間培養した後、50mlのMedium A培地（Journal Of B
acteriology,165,796−804,1986）に菌体を移し、培養2
4時間及び48時間培養した後、培養上清中のプロテアー
ゼの活性を上記と同様にして測定した。

その結果を表２に示す。

表２より、形質転換株４株は、親株よりもプロテアーゼ
活性が1/20以下と低いことが確認された。特にSPL14株
は、プロテアーゼ活性が、親株であるDY−16株の３％程
度に抑制されていることが確認された。このSPL14株
は、前記の遺伝子マーカーを有している。またこれらの
菌株は、いずれも、ヒスチジンとロイシンに対する要求
性を有しており、遺伝子組換え実験において宿主に要求
される複数の栄養要求性を確認した。

なお、形質転換に供したバチルス・サブチリスDY−16株
のプロテアーゼ活性を、プロテアーゼの野生株であるバ
チルス・サブチリス207−25株と比較したところ、表３
に示す結果が得られた。なお、プロテアーゼ活性は、前
記と同様にして、菌株を24時間培養し、測定した。

表３より、バチルス・サブチリスDY−16株は野生株207
−25株の約１％しかプロテアーゼを生産しない。

上記のようにして得られたバチルス・サブチリスSPL14
株を下記の融合蛋白質発現プラスミドpMD235の宿主とし
て用いた。

（４）プロテインＡ−VIP−Gly融合蛋白質発現プラスミ
ドpMD235の作製化学合成したVIP−G1遺伝子（５μｇ）の５′末端をリ
ン酸化し、次いで、T₄DNAリガーゼ（200units）を用い
て、前記式［II］で表されるプロテインＡ（成熟型）中
の440番目のAspをコードする部分まで含んだプラスミド
pMD200のPst I/BamH I長鎖断片（１μｇ）と連結し、枯
草菌バチルス・ズブチリスSPL14株をプロトプラスト法
で形質転換した。得られたKm^r株よりプラスミドpMD235
を得た。pMD235中に挿入された部分について、M13ダイ
デオキシ法でDNAシーケンシングを行ったところ、目的
通りにVIP−G1遺伝子が挿入されていた。

プラスミドpMD235の構築図を第２図に示す。

（５）VIP−Glyの酵素免疫測定法による定量 VIP−Glyの酵素免疫測定法による定量は、「酵素免疫測
定法」（石川栄治他編集、医学書院）記載の方法により
行った。

先ず、VIPを用いてウサギを免疫し、抗VIP血清を得た。
この抗VIP血清より「酵素免疫測定法」の第83−92頁記
載のマレイミド−ヒンジ法により抗VIP−IgG、抗VIP−
Ｆ（ab′）_２、抗VIP−ペルオキシダーゼ標識−Fab′を
調製した。

酵素免疫測定法によるVIP−Glyの測定は、以下の手順で
行った。

ELISAプレート（96穴）に抗VIP−Ｆ（ab′）_２を吸着さ
せ、１％牛血清アルブミンでブロッキングした。このプ
レートに被試験液を添加したVIP−Glyを、固相に吸着し
た抗VIP−Ｆ（ab′）_２に結合させた後、洗浄し、更に
抗VIP−ペルオキシダーゼ標識−Fab₂を添加し、固相に
結合したVIP−Glyをサンドイッチした。遊離の標識抗体
を除去した後、10mMオルトーフェニレンジアミン（OP
D）、0.025％過酸化水素、50mM酢酸ナトリウム緩衝液
（pH5.0）を含む反応液を添加し、ペルオキシダーゼの
反応により生成する色素を波長490nmの吸収で測定し
た。

標準物質として、アプライド・バイオシステムズ（AB
I）社製のペプチド合成装置により固相合成し、逆相高
速液体クロマトグラフィーにより精製し、アミノ酸組成
を確認したVIP−Glyを用いた。

（６）プロテインＡ−VIP−Gly融合蛋白質の分泌発現プラスミドpMD235で形質転換された枯草菌バチルス・ス
ブチリスSPL14/pMD235株を500mlのヒダ付き三角フラス
コを用いて、3.3％のトリプトン、2.0％の酵母エキス、
2.0％のカザミノ酸、1.0％のグルコース、0.74％のNaC
l、0.8％のNa₂HPO₄、0.4％のKH₂PO₄、36mMのNaOH、0.06
mMのMnCl₂からなる培地100ml（カナマイシンKm10μg/ml
含有）で37℃、12時間培養した。培養終了後、プロテア
ーゼ阻害剤であるフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド（PMSF）、EDTAを各々10mMになるように添加して、遠
心分離し、培養上清液を得た。次いで、得られた培養上
清液を用いて、分泌発現された融合蛋白質を酵素免疫測
定法により定量したところ、培養液１当り49.9μｇの
VIP−Glyを分泌発現していた。

実施例２枯草菌によるプロテインＡ−VIP−Gly融合蛋白質の分泌
発現−２（１）VIP−Gly遺伝子の化学合成 29アミノ酸残基からなるVIP−GlyをコードするDNA配列
と、そのＮ末端に制限酵素Hind IIIの切断部位と、カリ
クレインの認識配列であるPhe−Argを含むスペーサー領
域のDNA配列、さらにＣ末端側に、終始コドンTAA TAG
と、制限酵素BamH Iの切断部位を付加した122bpのVIP−
Gly（以下、VIP−G2という）遺伝子をDNA合成装置（ア
プライド・バイオシステムズ社モデル381A）で化学合
成した。

得られたVIP−G2の塩基配列および対応するアミノ酸配
列を以下に示す。

（２）プロテインＡ−VIP−Gly融合蛋白質発現プラスミ
ドpMD245の作製化学合成したVIP−G2遺伝子（５μｇ）の５′末端をリ
ン酸化し、次いで、T₄DNAリガーゼ（200units）を用い
て、前記式［II］で表されるプロテインＡ（成熟型）中
の187番目のLeuをコードする部分まで含んだプラスミド
pMD20のHind III/BamH I長鎖断片（１μｇ）と連結し、
枯草菌バチルス・ズブチリスSPL14株をプロトプラスト
法で形質転換した。得られたKm^r株よりプラスミドpMD24
5を得た。pMD245中に挿入された部分について、M13ダイ
デオキシ法でDNAシーケンシングを行ったところ、目的
通りにVIP−G2遺伝子が挿入されていた。プラスミドpMD
245の構築図を第２図に示す。

（３）プロテインＡ−VIP−Gly融合蛋白質の分泌発現プラスミドpMD245で形質転換された枯草菌バチルス・ス
ブチリスSPL14/pMD245株を500mlのヒダ付き三角フラス
コを用いて、3.3％のトリプトン、2.0％の酵母エキス、
2.0％のカザミノ酸、1.0％のグルコース、0.74％のNaC
l、0.8％のNa₂HPO₄、0.4％のKH₂PO₄、36mMのNaOH、0.06
mMのMnCl₂からなる培地100ml（カナマイシンKm10μg/ml
含有）で37℃、12時間培養した。培養終了後、プロテア
ーゼ阻害剤であるフェニルメチルスルホニルフルオライ
ド（PMSF）、EDTAを各々10mMになるように添加して、遠
心分離し、培養上清液を得た。次いで、得られた培養上
清液を用いて、分泌発現された融合蛋白質を酵素免疫測
定法により定量したところ、培養液１当り4.5μｇのV
IP−Glyを分泌発現していた。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドpMD200の構築図、第２図はプラスミドpMD235及びプラスミドpMD245の構築
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝子の発現に関与するプロモーター、リ
ボソーム結合部位、分泌シグナル及びキャリアー蛋白質
をコードする領域と、バソアクティブ・インテスティナ
ル・ポリペプチド前駆体をコードする遺伝子とが、化学
的又は酵素的に切断可能なスペーサ配列を介して連結し
ているDNA断片が、ベクターDNAに結合している融合蛋白
質分泌発現プラスミドにより、宿主微生物が形質転換さ
れた形質転換体であって、宿主微生物が、アルカリプロ
テアーゼ及び中性プロテアーゼの生産能を欠き、かつプ
ロテアーゼ活性が野生株の３％以下である枯草菌に、sp
oOA△677変異遺伝子を導入した宿主微生物である、形質
転換体。
【請求項２】キャリアー蛋白質が、黄色ブドウ球菌のプ
ロティンＡ中のIgG結合能を有する領域である請求項１
記載の形質転換体。
【請求項３】遺伝子の発現に関与するプロモーター、リ
ボソーム結合部位、分泌シグナル及びキャリアー蛋白質
をコードする領域が、黄色ブドウ状球菌のプロテインＡ
遺伝子に由来する請求項１記載の形質転換体。
【請求項４】バソアクティブ・インテスティナル・ポリ
ペプチド前駆体が下記式［Ｉ］で表されるアミノ酸配列
からなる請求項１記載の形質転換体。Ｈ−His−Ser−Asp−Ala−Val−Phe−Thr−Asp−Asn−T
yr−Thr−Arg−Leu−Arg−Lys−Gln−Met−Ala−Val−L
ys−Lys−Tyr−Leu−Asn−Ser−Ile−Leu−Asn−Gly−
Ｘ［Ｉ］（式中、Ｘは、OH、Lys−OH、Arg−OH、Lys−Arg−OH、
またはArg−Lys−OHを示す。）
【請求項５】宿主微生物が、バチルス・ズブチリス104H
L株にspoOA△677変異遺伝子を導入したバチルス・ズブ
チリスSP011株（微工研菌寄第10987号）、バチルス・ジ
ブチリスDY−16株にspoOA△677変異遺伝子を導入したバ
チルス・ズブチリスSPL14株（微工研菌寄第10988号）で
ある請求項１記載の形質転換体。
【請求項６】請求項１記載の形質転換体を培養し、キャ
リアー蛋白質とバソアクティブ・インテスティナル・ポ
リペプチド前駆体とがスペーサー配列を介して連結した
融合蛋白質を分泌させ、回収する融合蛋白質の製造方
法。