JPH07304796A - 肝実質細胞増殖因子誘導体 - Google Patents
肝実質細胞増殖因子誘導体Info
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- JPH07304796A JPH07304796A JP6117506A JP11750694A JPH07304796A JP H07304796 A JPH07304796 A JP H07304796A JP 6117506 A JP6117506 A JP 6117506A JP 11750694 A JP11750694 A JP 11750694A JP H07304796 A JPH07304796 A JP H07304796A
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- JP
- Japan
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- hgf
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- cell
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 血管内皮細胞損傷部位で特異的に活性化し、
他の部位では不活性型を維持させるようにすることによ
って、血管損傷部位の内皮細胞を標的とした治療を可能
とする肝実質細胞増殖因子誘導体を提供すること。 【構成】 肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列のＮ末端
より４９２番目から４９４番目のアミノ酸配列が、Ｇｌ
ｎ／Ｇｌｕ−Ｘａａ−Ａｒｇ（Ｇｌｎはグルタミン，Ｇ
ｌｕはグルタミン酸、Ａｒｇはアルギニン、Ｘａａはグ
リシン、セリン、スレオニン、のうちいずれか一つ）に
置換された肝実質細胞増殖因子誘導体。
他の部位では不活性型を維持させるようにすることによ
って、血管損傷部位の内皮細胞を標的とした治療を可能
とする肝実質細胞増殖因子誘導体を提供すること。 【構成】 肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列のＮ末端
より４９２番目から４９４番目のアミノ酸配列が、Ｇｌ
ｎ／Ｇｌｕ−Ｘａａ−Ａｒｇ（Ｇｌｎはグルタミン，Ｇ
ｌｕはグルタミン酸、Ａｒｇはアルギニン、Ｘａａはグ
リシン、セリン、スレオニン、のうちいずれか一つ）に
置換された肝実質細胞増殖因子誘導体。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規肝実質細胞増殖因
子誘導体、該誘導体をコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ
配列を有する発現ベクター、該発現ベクターを導入され
た形質転換細胞、及び該誘導体の製造方法に関わる。さ
らに、本発明の肝実質細胞増殖因子誘導体のＰＴＣＡ処
置等による血管損傷を伴う疾患の治療薬としての用途に
関する。
子誘導体、該誘導体をコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ
配列を有する発現ベクター、該発現ベクターを導入され
た形質転換細胞、及び該誘導体の製造方法に関わる。さ
らに、本発明の肝実質細胞増殖因子誘導体のＰＴＣＡ処
置等による血管損傷を伴う疾患の治療薬としての用途に
関する。
【０００２】
【従来の技術】肝実質細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙ
ｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、以下ＨＧＦとい
う）は、初代培養ラット肝細胞のＤＮＡ合成促進物質と
して、ラット血液中［Nakamura, T. Nawa, K. and Ichi
hara, A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 122, 1450
(1984).］で初めて見いだされ、部分精製により既知の
細胞増殖因子とは異なる因子であることが明かとなっ
た。その後、ヒトｃＤＮＡがクローニングされ、全一次
構造が決定された［Nakamura,T.et al. Nature 342,440
(1989).Miyazawa,K.et al. Biochem. Biophys. Res. C
ommun. 163,967(1989).］。
ｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、以下ＨＧＦとい
う）は、初代培養ラット肝細胞のＤＮＡ合成促進物質と
して、ラット血液中［Nakamura, T. Nawa, K. and Ichi
hara, A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 122, 1450
(1984).］で初めて見いだされ、部分精製により既知の
細胞増殖因子とは異なる因子であることが明かとなっ
た。その後、ヒトｃＤＮＡがクローニングされ、全一次
構造が決定された［Nakamura,T.et al. Nature 342,440
(1989).Miyazawa,K.et al. Biochem. Biophys. Res. C
ommun. 163,967(1989).］。
【０００３】ＨＧＦは、４６３アミノ酸残基のα鎖と２
３４アミノ酸残基のβ鎖から成るヘテロダイマーであ
る。ＨＧＦは、Ｎ末端に３１アミノ酸残基のシグナルペ
プチドを有する７２８アミノ酸残基からなる１本鎖の前
駆体として合成される。ＨＧＦの活性化はセリン系プロ
テアーゼ［Miyazawa, K. et al. J. Biol. Chem. 268,1
0024 (1993)］によるプロセッシングであり、Ｎ末端か
ら４９４番目のアルギニンと４９５番目のバリンのペプ
チド結合が切断され、２本鎖構造［Naka, D. etal. J.
Biol. Chem. 267 20114 (1992) ］をとることである。
３４アミノ酸残基のβ鎖から成るヘテロダイマーであ
る。ＨＧＦは、Ｎ末端に３１アミノ酸残基のシグナルペ
プチドを有する７２８アミノ酸残基からなる１本鎖の前
駆体として合成される。ＨＧＦの活性化はセリン系プロ
テアーゼ［Miyazawa, K. et al. J. Biol. Chem. 268,1
0024 (1993)］によるプロセッシングであり、Ｎ末端か
ら４９４番目のアルギニンと４９５番目のバリンのペプ
チド結合が切断され、２本鎖構造［Naka, D. etal. J.
Biol. Chem. 267 20114 (1992) ］をとることである。
【０００４】当初、ＨＧＦは肝実質細胞に対する特異的
な増殖因子であると考えられていたがその後、内皮細
胞、上皮細胞の増殖活性［Rubin, J. S. et al. Proc.
Natl.Acad. Sci. USA 88, 415 (1991).］、上皮細胞の
分散活性［Matumoto, K. et al. Exp. Cell. Res. 196,
144 (1991).］を有することが明かとなった。また、血
管内皮細胞の増殖活性促進によるｉｎ ｖｉｖｏでの血
管管腔形成能［Derrick,S. Grant. et al.Proc. Natl.
Acad. Sci. 90 ,1937 (1993)］を有することが明かとな
った。
な増殖因子であると考えられていたがその後、内皮細
胞、上皮細胞の増殖活性［Rubin, J. S. et al. Proc.
Natl.Acad. Sci. USA 88, 415 (1991).］、上皮細胞の
分散活性［Matumoto, K. et al. Exp. Cell. Res. 196,
144 (1991).］を有することが明かとなった。また、血
管内皮細胞の増殖活性促進によるｉｎ ｖｉｖｏでの血
管管腔形成能［Derrick,S. Grant. et al.Proc. Natl.
Acad. Sci. 90 ,1937 (1993)］を有することが明かとな
った。
【０００５】ＨＧＦは、細胞増殖活性の他、細胞運動性
促進活性、形態形成誘導活性、巨核球刺激活性等を有す
る多機能な因子であるため、標的部位以外での活性型Ｈ
ＧＦの作用は副作用が懸念される。従って、血管損傷部
位で特異的、且つ速やかに活性化するＨＧＦが得られれ
ば、損傷を受けた内皮細胞に特異的な作用が可能とな
り、上記問題点が解決、または、軽減する事が期待さ
れ、その開発の意義は極めて大きい。
促進活性、形態形成誘導活性、巨核球刺激活性等を有す
る多機能な因子であるため、標的部位以外での活性型Ｈ
ＧＦの作用は副作用が懸念される。従って、血管損傷部
位で特異的、且つ速やかに活性化するＨＧＦが得られれ
ば、損傷を受けた内皮細胞に特異的な作用が可能とな
り、上記問題点が解決、または、軽減する事が期待さ
れ、その開発の意義は極めて大きい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子工学
的手法により新規ＨＧＦ誘導体を作製し、正常状態では
ＨＧＦを不活性型として存在させ、血管内皮細胞損傷部
位で特異的に活性化する事で、血管損傷部位の内皮細胞
を標的とした治療を可能とするＨＧＦ誘導体を、提供す
るものである。
的手法により新規ＨＧＦ誘導体を作製し、正常状態では
ＨＧＦを不活性型として存在させ、血管内皮細胞損傷部
位で特異的に活性化する事で、血管損傷部位の内皮細胞
を標的とした治療を可能とするＨＧＦ誘導体を、提供す
るものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題は、肝実質細胞
増殖因子のアミノ酸配列のＮ末端より４９２番目から４
９４番目のアミノ酸配列が、Ｇｌｎ／Ｇｌｕ−Ｘａａ−
Ａｒｇ（Ｇｌｎはグルタミン，Ｇｌｕはグルタミン酸、
Ａｒｇはアルギニン、Ｘａａはグリシン、セリン、スレ
オニン、のうちいずれか一つ）に置換された肝実質細胞
増殖因子誘導体によって解決される。また、肝実質細胞
増殖因子のアミノ酸配列のＮ末端より４９３番目のアミ
ノ酸がグリシンに置換された肝実質細胞増殖因子誘導体
によっても解決される。さらに上記課題は、これらの肝
実質細胞増殖因子誘導体を有効成分として含有する医薬
品組成物によっても解決される。
増殖因子のアミノ酸配列のＮ末端より４９２番目から４
９４番目のアミノ酸配列が、Ｇｌｎ／Ｇｌｕ−Ｘａａ−
Ａｒｇ（Ｇｌｎはグルタミン，Ｇｌｕはグルタミン酸、
Ａｒｇはアルギニン、Ｘａａはグリシン、セリン、スレ
オニン、のうちいずれか一つ）に置換された肝実質細胞
増殖因子誘導体によって解決される。また、肝実質細胞
増殖因子のアミノ酸配列のＮ末端より４９３番目のアミ
ノ酸がグリシンに置換された肝実質細胞増殖因子誘導体
によっても解決される。さらに上記課題は、これらの肝
実質細胞増殖因子誘導体を有効成分として含有する医薬
品組成物によっても解決される。
【０００８】血管損傷部位では、損傷内皮細胞上で、血
小板の活性化した組織因子が血液凝固因子と複合体を形
成し、血液凝固反応系の活性化が起こる。血液凝固因子
である活性型第X因子は、基質特異性が高く、プロトロ
ンビンを特異的に活性化する。第X因子の認識アミノ酸
配列はＧｌｎ／Ｇｌｕ−Ｘａａ−Ａｒｇ（Ｇｌｎはグル
タミン，Ｇｌｕはグルタミン酸、Ａｒｇはアルギニン、
Ｘａａはグリシン、セリン、スレオニン、のうちいずれ
か一つ）である。
小板の活性化した組織因子が血液凝固因子と複合体を形
成し、血液凝固反応系の活性化が起こる。血液凝固因子
である活性型第X因子は、基質特異性が高く、プロトロ
ンビンを特異的に活性化する。第X因子の認識アミノ酸
配列はＧｌｎ／Ｇｌｕ−Ｘａａ−Ａｒｇ（Ｇｌｎはグル
タミン，Ｇｌｕはグルタミン酸、Ａｒｇはアルギニン、
Ｘａａはグリシン、セリン、スレオニン、のうちいずれ
か一つ）である。
【０００９】ＨＧＦは、不活性型の１本鎖を、Ｎ末端か
ら４９４番目のアルギニンのＣ末端側で切断され、ヘテ
ロダイマーを形成することで活性型となる［Mizuno, K.
Takehara, T. and Nakamura, T. Biochem. Biophys. R
es. Commun. 189, 1631 (1992)］。本発明者らは、その
切断領域を改変することにより、活性を制御可能となる
事を見いだし、本発明を完成するに至った。
ら４９４番目のアルギニンのＣ末端側で切断され、ヘテ
ロダイマーを形成することで活性型となる［Mizuno, K.
Takehara, T. and Nakamura, T. Biochem. Biophys. R
es. Commun. 189, 1631 (1992)］。本発明者らは、その
切断領域を改変することにより、活性を制御可能となる
事を見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１０】すなわち、ＨＧＦのＮ末端より、４９１番
目から４９５番目のアミノ酸配列を血液凝固第X因子の
認識可能なアミノ酸配列に改変することにより、血管損
傷部位で特異的に活性化する新規ＨＧＦ誘導体を作製し
た。
目から４９５番目のアミノ酸配列を血液凝固第X因子の
認識可能なアミノ酸配列に改変することにより、血管損
傷部位で特異的に活性化する新規ＨＧＦ誘導体を作製し
た。
【００１１】投与方法としては、静注投与、または筋肉
注射、またはコラーゲンゲルと調合して局所へ注入する
ことが望ましい。投与量は、投与方法により異なるが、
静注投与の場合、新規ＨＧＦ誘導体を、体重１ｋｇ当た
り１μｇ〜１００μｇを数日に渡り、４回以上投与す
る。
注射、またはコラーゲンゲルと調合して局所へ注入する
ことが望ましい。投与量は、投与方法により異なるが、
静注投与の場合、新規ＨＧＦ誘導体を、体重１ｋｇ当た
り１μｇ〜１００μｇを数日に渡り、４回以上投与す
る。
【００１２】本発明のＨＧＦ誘導体は、主に、遺伝子工
学的手法、または、タンパク質工学的手法によって達成
されるものである。以下に、本発明の新規ＨＧＦ誘導体
の作製方法について詳細に説明するが、目的のＨＧＦ誘
導体が得られれば、作製方法はこれに限定しない。
学的手法、または、タンパク質工学的手法によって達成
されるものである。以下に、本発明の新規ＨＧＦ誘導体
の作製方法について詳細に説明するが、目的のＨＧＦ誘
導体が得られれば、作製方法はこれに限定しない。
【００１３】ＨＧＦ、またはその一部、或いはその改変
体、誘導体をコードするＤＮＡをほ乳類動物細胞用発現
プラスミドベクターに組み込む。この時用いるプラスミ
ドは、宿主中でＨＧＦ誘導体を産生できるものであれば
良いが、ｐＧＭ、ｐＫＣＲ、ｐＳＶＬ等が好ましく、特
にｐＧＭが好ましいい。プラスミドに組み込まれたＨＧ
ＦｃＤＮＡの目的の領域に変異を導入する。変異の導入
は、インビトロミュータゲネシスシステム Ｖｅｒ２．
１（アマシャム社製）を用いると便利であるが、他の方
法でも良い。又、予めＨＧＦｃＤＮＡに、変異を導入さ
せた後に、ほ乳類動物細胞用発現ベクターに組み込んで
も良い。
体、誘導体をコードするＤＮＡをほ乳類動物細胞用発現
プラスミドベクターに組み込む。この時用いるプラスミ
ドは、宿主中でＨＧＦ誘導体を産生できるものであれば
良いが、ｐＧＭ、ｐＫＣＲ、ｐＳＶＬ等が好ましく、特
にｐＧＭが好ましいい。プラスミドに組み込まれたＨＧ
ＦｃＤＮＡの目的の領域に変異を導入する。変異の導入
は、インビトロミュータゲネシスシステム Ｖｅｒ２．
１（アマシャム社製）を用いると便利であるが、他の方
法でも良い。又、予めＨＧＦｃＤＮＡに、変異を導入さ
せた後に、ほ乳類動物細胞用発現ベクターに組み込んで
も良い。
【００１４】変異を導入したＨＧＦｃＤＮＡを組み込ん
だプラスミド、または、変異を導入したＨＧＦｃＤＮＡ
をほ乳類動物細胞にトランスフェクションする。この時
の宿主としては、ＣＯＳ１細胞、チャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞等のほ乳類動物細胞を用いるのが
望ましいが、この限りではない。トランスフェクション
の方法としては、リポフェクチン（ギブコ社製）等のリ
ポソームを用いる方法や、燐酸カルシウム法［Chen, C.
et al. Mol. Cell Biol. 7, 2745 (1987).］、ＤＥＡ
Ｅデキストラン法［Maes, R. et al. Biochem. Biophi
s. Acta 134,269(1967)］、エレクトロポレーション法
等が挙げられるが、その他の方法でも良い。
だプラスミド、または、変異を導入したＨＧＦｃＤＮＡ
をほ乳類動物細胞にトランスフェクションする。この時
の宿主としては、ＣＯＳ１細胞、チャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞等のほ乳類動物細胞を用いるのが
望ましいが、この限りではない。トランスフェクション
の方法としては、リポフェクチン（ギブコ社製）等のリ
ポソームを用いる方法や、燐酸カルシウム法［Chen, C.
et al. Mol. Cell Biol. 7, 2745 (1987).］、ＤＥＡ
Ｅデキストラン法［Maes, R. et al. Biochem. Biophi
s. Acta 134,269(1967)］、エレクトロポレーション法
等が挙げられるが、その他の方法でも良い。
【００１５】得られた形質転換細胞を、数日間適切な培
地中で培養する。培地はイーグルＭＥＭ培地、ダルベッ
コ改変イーグル培地等を例として挙げる事ができ、必要
に応じて添加物を加える。培養は、通常３７℃で、５％
二酸化炭素存在下で行われるが、細胞が生育すればこれ
に限定はしない。数日間の培養を行った後、培養上清を
回収する。得られた培養上清を抗体、またはヘパリン等
のアフィニティカラムを用いたアフィニティクロマトグ
ラフィーにより精製する。精製品は更に、燐酸緩衝液
（ＰＢＳ）等にたいし透析、または、セントリコン１０
（グレースジャパン社製）にかけることにより、適当な
塩濃度に調製する事ができる。
地中で培養する。培地はイーグルＭＥＭ培地、ダルベッ
コ改変イーグル培地等を例として挙げる事ができ、必要
に応じて添加物を加える。培養は、通常３７℃で、５％
二酸化炭素存在下で行われるが、細胞が生育すればこれ
に限定はしない。数日間の培養を行った後、培養上清を
回収する。得られた培養上清を抗体、またはヘパリン等
のアフィニティカラムを用いたアフィニティクロマトグ
ラフィーにより精製する。精製品は更に、燐酸緩衝液
（ＰＢＳ）等にたいし透析、または、セントリコン１０
（グレースジャパン社製）にかけることにより、適当な
塩濃度に調製する事ができる。
【００１６】
【実施例】次に、本発明のＨＧＦ誘導体の調整法、およ
びその薬理作用について具体的に述べる。
びその薬理作用について具体的に述べる。
【００１７】［ＨＧＦ誘導体の作製］発現ベクターに使
用するプラスミドｐＣＤＬ−ＳＲα２９６［Takebe Y.
et al.,Mol. Biol. 8,466(1988).]のプロモーター領域
の下流にＢｇ１２認識部位を設けた後、Ｓａｌ１で消化
した。このプロモーター領域を含むＳａｌ１消化断片と
ｐＳＧ５（フナコシ社製）のｆ１ ｏｒｉを含むＳａｌ
１消化断片とを結合させてｐＧＭベクターを構築した。
このｐＧＭベクターをＢｇ１２で消化し、ＨＧＦｃＤＮ
ＡのＢａｍＨ１断片を結合することによりｐＧＭ／ＨＧ
Ｆを作製した。構築した発現プラスミドを図１に示す。
用するプラスミドｐＣＤＬ−ＳＲα２９６［Takebe Y.
et al.,Mol. Biol. 8,466(1988).]のプロモーター領域
の下流にＢｇ１２認識部位を設けた後、Ｓａｌ１で消化
した。このプロモーター領域を含むＳａｌ１消化断片と
ｐＳＧ５（フナコシ社製）のｆ１ ｏｒｉを含むＳａｌ
１消化断片とを結合させてｐＧＭベクターを構築した。
このｐＧＭベクターをＢｇ１２で消化し、ＨＧＦｃＤＮ
ＡのＢａｍＨ１断片を結合することによりｐＧＭ／ＨＧ
Ｆを作製した。構築した発現プラスミドを図１に示す。
【００１８】このＨＧＦｃＤＮＡを組み込んだほ乳類動
物細胞発現ベクターｐＧＭ／ＨＧＦを用いて、ＨＧＦｃ
ＤＮＡに対してＨＧＦのアミノ酸配列のＮ末端より４９
１番目から４９５番目のアミノ酸配列が配列番号１〜４
に記載したアミノ酸配列と置換されるように点突然変異
を導入した。点突然変異の導入については、インビトロ
ミュータゲネシスシステム Ｖｅｒ２．１（アマシャム
社製）を用いて行った。突然変異の導入で使用したＤＮ
Ａプライマーは、自動ＤＮＡ合成機ＭＯＤＥＬ３９２
（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いてホスフ
ェイト法により化学合成し、それぞれの配列は配列番号
５〜８に記載した。
物細胞発現ベクターｐＧＭ／ＨＧＦを用いて、ＨＧＦｃ
ＤＮＡに対してＨＧＦのアミノ酸配列のＮ末端より４９
１番目から４９５番目のアミノ酸配列が配列番号１〜４
に記載したアミノ酸配列と置換されるように点突然変異
を導入した。点突然変異の導入については、インビトロ
ミュータゲネシスシステム Ｖｅｒ２．１（アマシャム
社製）を用いて行った。突然変異の導入で使用したＤＮ
Ａプライマーは、自動ＤＮＡ合成機ＭＯＤＥＬ３９２
（アプライド・バイオシステムズ社製）を用いてホスフ
ェイト法により化学合成し、それぞれの配列は配列番号
５〜８に記載した。
【００１９】配列番号１〜４で置換して得られたＨＧＦ
誘導体（ＦＸ１〜４）の突然変異を導入した箇所を以下
に示す。 ＦＸ１：４９１番目のリジンをイソロイシンに置換、且
つ、４９２番目のグルタミンをグルタミン酸に置換、且
つ、４９３番目のロイシンをグリシンに置換、且つ、４
９５番目のバリンをスレオニンに置換。 ＦＸ２：４９３番目のロイシンをグリシンに置換、且
つ、４９５番目のバリンをイソロイシンに置換。 ＦＸ３：４９３番目のロイシンをグリシンに置換、且
つ、４９５番目のバリンをスレオニンに置換。 ＦＸ４：４９３番目のロイシンをグリシンに置換。
誘導体（ＦＸ１〜４）の突然変異を導入した箇所を以下
に示す。 ＦＸ１：４９１番目のリジンをイソロイシンに置換、且
つ、４９２番目のグルタミンをグルタミン酸に置換、且
つ、４９３番目のロイシンをグリシンに置換、且つ、４
９５番目のバリンをスレオニンに置換。 ＦＸ２：４９３番目のロイシンをグリシンに置換、且
つ、４９５番目のバリンをイソロイシンに置換。 ＦＸ３：４９３番目のロイシンをグリシンに置換、且
つ、４９５番目のバリンをスレオニンに置換。 ＦＸ４：４９３番目のロイシンをグリシンに置換。
【００２０】［ＨＧＦ誘導体の精製］配列番号１〜４の
アミノ酸配列に置換されるように突然変異を導入したプ
ラスミドベクターをそれぞれＤＥＡＥ−デキストラン法
によりＣＯＳ１細胞にトランスフェクションした。即
ち、直径１００ｍｍの組織培養用デイッシュに、６ｘ１
０5個のＣＯＳ１細胞をまき、一晩、３７℃で、５％二
酸化炭素存在下で培養した。細胞を燐酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）で２回洗浄した後、５μｇのｐＧＭ／ＨＧＦを含む
４ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン培地（５０ｍＭ トリ
ス ｐＨ７．４／ＤＭＥ培地／０．４ｍｇ/ｍｌ ＤＥ
ＡＥ−デキストラン溶液）を加え、４時間培養した後、
燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、クロロキン−ＤＭＥ培
地（１００μＭ クロロキン／２％ウシ胎児血清を含む
ＤＭＥ培地）を加えた。２．５時間、３７℃で、５％二
酸化炭素存在下で培養する事により、ｐＧＭ／ＨＧＦを
ＣＯＳ１細胞に取り込ませた。トランスフェクション
後、燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄し、ＤＭＥ
培地を１０ｍｌ加え、３７℃で、５％二酸化炭素存在下
で３日間培養した。培養終了後、培養上清を回収した。
アミノ酸配列に置換されるように突然変異を導入したプ
ラスミドベクターをそれぞれＤＥＡＥ−デキストラン法
によりＣＯＳ１細胞にトランスフェクションした。即
ち、直径１００ｍｍの組織培養用デイッシュに、６ｘ１
０5個のＣＯＳ１細胞をまき、一晩、３７℃で、５％二
酸化炭素存在下で培養した。細胞を燐酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）で２回洗浄した後、５μｇのｐＧＭ／ＨＧＦを含む
４ｍｌのＤＥＡＥ−デキストラン培地（５０ｍＭ トリ
ス ｐＨ７．４／ＤＭＥ培地／０．４ｍｇ/ｍｌ ＤＥ
ＡＥ−デキストラン溶液）を加え、４時間培養した後、
燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、クロロキン−ＤＭＥ培
地（１００μＭ クロロキン／２％ウシ胎児血清を含む
ＤＭＥ培地）を加えた。２．５時間、３７℃で、５％二
酸化炭素存在下で培養する事により、ｐＧＭ／ＨＧＦを
ＣＯＳ１細胞に取り込ませた。トランスフェクション
後、燐酸緩衝液（ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄し、ＤＭＥ
培地を１０ｍｌ加え、３７℃で、５％二酸化炭素存在下
で３日間培養した。培養終了後、培養上清を回収した。
【００２１】培養上清中に含まれているＨＧＦ誘導体を
ヘパリンアフィニティクロマトクロマトグラフィーによ
り精製した。システムは島津製作所製のＬＣ７Ａ型高速
液体クロマトグラフを用い、カラムはＴＳＫ−Ｈｅｐａ
ｒｉｎ ５ＰＷカラム（東ソー社製）を使用した。ま
ず、カラムを０．５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸緩衝液でカ
ラムを平衡化し、培養上清をカラムにかけ、ＨＧＦ誘導
体を吸着させた。０．５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸緩衝液
でカラムを洗浄した後、０．５ｍｌ／分の流速で、燐酸
緩衝液存在下で、塩濃度０．５Ｍから２．０Ｍまでの直
線濃度勾配をかけることにより、ＨＧＦ誘導体を溶出し
た。溶出塩濃度０．９Ｍから１．２Ｍの画分をＨＧＦ溶
出画分とした。得られた溶出画分を燐酸緩衝液に透析す
る事により、ＨＧＦ誘導体の精製品を得た。
ヘパリンアフィニティクロマトクロマトグラフィーによ
り精製した。システムは島津製作所製のＬＣ７Ａ型高速
液体クロマトグラフを用い、カラムはＴＳＫ−Ｈｅｐａ
ｒｉｎ ５ＰＷカラム（東ソー社製）を使用した。ま
ず、カラムを０．５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸緩衝液でカ
ラムを平衡化し、培養上清をカラムにかけ、ＨＧＦ誘導
体を吸着させた。０．５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸緩衝液
でカラムを洗浄した後、０．５ｍｌ／分の流速で、燐酸
緩衝液存在下で、塩濃度０．５Ｍから２．０Ｍまでの直
線濃度勾配をかけることにより、ＨＧＦ誘導体を溶出し
た。溶出塩濃度０．９Ｍから１．２Ｍの画分をＨＧＦ溶
出画分とした。得られた溶出画分を燐酸緩衝液に透析す
る事により、ＨＧＦ誘導体の精製品を得た。
【００２２】［ＨＧＦ誘導体の血清存在下での安定性］
得られたＨＧＦ誘導体（ＦＸ４）精製品を５０ｍＭトリ
ス/塩酸／２％ＳＤＳ／１０％グリセロール／０．１％v
/ｗブロモフェノールブルー（ｐＨ６．８）の緩衝液中
に溶解し、還元下で９５℃で５分間の熱処理を行い、Ｌ
ａｅｍｍｌｉの方法［Laemmli, U. K. Nature, 227, 68
0 (1970) ］に従って、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行った。試料濃縮ゲルとしては、０．１２
５Ｍ トリス（ｐＨ６．８）／０．１％ＳＤＳ／０．０
２５％ＴＥＭＥＤを含む３％アクリルアミドゲルを用い
た。分離ゲルのアクリルアミド濃度は９％に調製した。
電気泳動終了後、シルベストステインキット（ナカライ
テスク社製）を用いて、ゲルの銀染色を行い、ゲル上の
バンドとしてＨＧＦ誘導体を検出した。
得られたＨＧＦ誘導体（ＦＸ４）精製品を５０ｍＭトリ
ス/塩酸／２％ＳＤＳ／１０％グリセロール／０．１％v
/ｗブロモフェノールブルー（ｐＨ６．８）の緩衝液中
に溶解し、還元下で９５℃で５分間の熱処理を行い、Ｌ
ａｅｍｍｌｉの方法［Laemmli, U. K. Nature, 227, 68
0 (1970) ］に従って、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行った。試料濃縮ゲルとしては、０．１２
５Ｍ トリス（ｐＨ６．８）／０．１％ＳＤＳ／０．０
２５％ＴＥＭＥＤを含む３％アクリルアミドゲルを用い
た。分離ゲルのアクリルアミド濃度は９％に調製した。
電気泳動終了後、シルベストステインキット（ナカライ
テスク社製）を用いて、ゲルの銀染色を行い、ゲル上の
バンドとしてＨＧＦ誘導体を検出した。
【００２３】結果、ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地から
精製して得られたＨＧＦは約３２ＫＤａと５７ＫＤａの
ヘテロダイマー構造であるのに対し、ＨＧＦ誘導体いず
れもは約９０ＫＤａの一本鎖構造であった。つまり、Ｈ
ＧＦ誘導体は、血清中のＨＧＦ活性化酵素による修飾を
受けず、不活性型の構造を維持していることが明らかと
なった。
精製して得られたＨＧＦは約３２ＫＤａと５７ＫＤａの
ヘテロダイマー構造であるのに対し、ＨＧＦ誘導体いず
れもは約９０ＫＤａの一本鎖構造であった。つまり、Ｈ
ＧＦ誘導体は、血清中のＨＧＦ活性化酵素による修飾を
受けず、不活性型の構造を維持していることが明らかと
なった。
【００２４】［ＨＧＦ誘導体のＦａＸａ反応性］得られ
た１本鎖のＨＧＦ誘導体（ＦＸ１〜４）精製品各３０ｎ
ｇ及び無血清培地（ＤＭＥ培地）で培養して得られた１
本鎖のＨＧＦ３０ｎｇに、活性型血液凝固第X因子（Ｆ
ａＸａ、シグマ社製）をそれぞれ６００ｎｇ加えて、ト
リス緩衝液中で３７℃で、５分、１０分、３０分、６０
分間インキュベートした。
た１本鎖のＨＧＦ誘導体（ＦＸ１〜４）精製品各３０ｎ
ｇ及び無血清培地（ＤＭＥ培地）で培養して得られた１
本鎖のＨＧＦ３０ｎｇに、活性型血液凝固第X因子（Ｆ
ａＸａ、シグマ社製）をそれぞれ６００ｎｇ加えて、ト
リス緩衝液中で３７℃で、５分、１０分、３０分、６０
分間インキュベートした。
【００２５】反応後のＨＧＦ誘導体及び、ＨＧＦは、５
０ｍＭトリス/塩酸／２％ＳＤＳ／１０％グリセロール
／０．１％v/ｗブロモフェノールブルー（ｐＨ６．８）
の緩衝液中に溶解し、還元下で９５℃で５分間の熱処理
を行い、Ｌａｅｍｍｌｉの方法［U. K. Laemmli, Natur
e, 227, 680 (1970) ］に従って、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行った。試料濃縮ゲルとして
は、０．１２５Ｍ トリス/塩酸（ｐＨ６．８）／０．
１％ＳＤＳ／０．０２５％ＴＥＭＥＤを含む３％アクリ
ルアミドゲルを用いた。分離ゲルのアクリルアミド濃度
は９％に調製した。電気泳動終了後、ゲルを１０％メタ
ノール／１０ｍＭＣＡＰＳ（３−シクロヘキシルアミノ
プロパンスルホン酸、ナカライテスク社製）緩衝液に３
０分間浸し、平衡化した。同時に、タンパク質を転写す
るポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜は、１００
％メタノールに１０秒間浸した後、１０％メタノール／
ＣＡＰＳ緩衝液に浸して平衡化した。平衡化されたＰＶ
ＤＦ膜をゲルに対して陽極側に密着させ、その両側をろ
紙、スポンジパッドの順にゲルホルダーではさみ、ブロ
ッティング装置（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）にセットして緩
衝液で満たした。電気泳動槽には１００Ｖの電圧を１．
３時間かけて、電気泳動によるタンパク質の転写を行っ
た。
０ｍＭトリス/塩酸／２％ＳＤＳ／１０％グリセロール
／０．１％v/ｗブロモフェノールブルー（ｐＨ６．８）
の緩衝液中に溶解し、還元下で９５℃で５分間の熱処理
を行い、Ｌａｅｍｍｌｉの方法［U. K. Laemmli, Natur
e, 227, 680 (1970) ］に従って、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行った。試料濃縮ゲルとして
は、０．１２５Ｍ トリス/塩酸（ｐＨ６．８）／０．
１％ＳＤＳ／０．０２５％ＴＥＭＥＤを含む３％アクリ
ルアミドゲルを用いた。分離ゲルのアクリルアミド濃度
は９％に調製した。電気泳動終了後、ゲルを１０％メタ
ノール／１０ｍＭＣＡＰＳ（３−シクロヘキシルアミノ
プロパンスルホン酸、ナカライテスク社製）緩衝液に３
０分間浸し、平衡化した。同時に、タンパク質を転写す
るポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜は、１００
％メタノールに１０秒間浸した後、１０％メタノール／
ＣＡＰＳ緩衝液に浸して平衡化した。平衡化されたＰＶ
ＤＦ膜をゲルに対して陽極側に密着させ、その両側をろ
紙、スポンジパッドの順にゲルホルダーではさみ、ブロ
ッティング装置（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）にセットして緩
衝液で満たした。電気泳動槽には１００Ｖの電圧を１．
３時間かけて、電気泳動によるタンパク質の転写を行っ
た。
【００２６】転写終了後に、ＰＶＤＦ膜を取り出し、分
子量マーカー（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）の転写部分をカッ
ターナイフで切り出して、クーマシーブリリアントブル
ーＲ−２５０（ＣＢＢ）による染色を行った。残りのＰ
ＶＤＦ膜は、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／トリ
ス緩衝液（２０ｍＭトリス／０．１５塩化ナトリウムｐ
Ｈ７．５）に室温で２時間浸して、ブロッキングをし
た。
子量マーカー（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）の転写部分をカッ
ターナイフで切り出して、クーマシーブリリアントブル
ーＲ−２５０（ＣＢＢ）による染色を行った。残りのＰ
ＶＤＦ膜は、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／トリ
ス緩衝液（２０ｍＭトリス／０．１５塩化ナトリウムｐ
Ｈ７．５）に室温で２時間浸して、ブロッキングをし
た。
【００２７】ブロッキング終了後、ＰＶＤＦ膜を、５μ
ｇ／ｍｌ抗ＨＧＦα鎖マウスモノクローナル抗体／３％
ＢＳＡ−トリス緩衝液に浸して、室温で、２時間反応さ
せた後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ Ｒａｄ
社製）／トリス緩衝液で、６分間の洗浄を３回行った。
洗浄後、ＰＶＤＦ膜を、２００ｎｇ／ｍｌ ＡＰ−ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｓ
ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）／３％ＢＳＡ−トリス緩衝液
に浸し、室温で、１．５時間反応させた後、０．１％
Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）／トリス緩衝
液で、６分間の洗浄を４回行った。
ｇ／ｍｌ抗ＨＧＦα鎖マウスモノクローナル抗体／３％
ＢＳＡ−トリス緩衝液に浸して、室温で、２時間反応さ
せた後、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ Ｒａｄ
社製）／トリス緩衝液で、６分間の洗浄を３回行った。
洗浄後、ＰＶＤＦ膜を、２００ｎｇ／ｍｌ ＡＰ−ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｓ
ＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）／３％ＢＳＡ−トリス緩衝液
に浸し、室温で、１．５時間反応させた後、０．１％
Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｂｉｏ Ｒａｄ社製）／トリス緩衝
液で、６分間の洗浄を４回行った。
【００２８】ＰＶＤＦ膜を、二次抗体の標識酵素（Ａ
Ｐ）基質溶液（１ｍｌＮＢＴ／１ｍｌＢＣＩＰ／２０ｍ
ｌ ０．１Ｍトリス（ｐＨ９．５））に浸し、酵素反応
をさせて、膜上のバンドとして、新規ＨＧＦ誘導体のα
鎖を検出した。バンド検出後のＰＶＤＦ膜を、バイオイ
メージシステムＶｅｒ２．１（ミリポア社製）によりデ
ンシトグラムとして処理し、各反応時間でのα鎖量を膜
上の濃度として数値化した。
Ｐ）基質溶液（１ｍｌＮＢＴ／１ｍｌＢＣＩＰ／２０ｍ
ｌ ０．１Ｍトリス（ｐＨ９．５））に浸し、酵素反応
をさせて、膜上のバンドとして、新規ＨＧＦ誘導体のα
鎖を検出した。バンド検出後のＰＶＤＦ膜を、バイオイ
メージシステムＶｅｒ２．１（ミリポア社製）によりデ
ンシトグラムとして処理し、各反応時間でのα鎖量を膜
上の濃度として数値化した。
【００２９】結果（表１）より、ＨＧＦ誘導体はＦａＸ
ａ反応開始から５分以内に、α鎖の１００％が修飾を受
け、約５７ＫＤａのバンドとして検出された。天然型Ｈ
ＧＦでは、反応開始から５分後、１０分後、３０分後、
６０分後で、それぞれ約２０％、２４％、８２％、８３
％の修飾率であった。つまり、ＦａＸａ存在下におい
て、ＨＧＦ誘導体は速やかに活性型二本鎖構造となるこ
とが明かとなった。
ａ反応開始から５分以内に、α鎖の１００％が修飾を受
け、約５７ＫＤａのバンドとして検出された。天然型Ｈ
ＧＦでは、反応開始から５分後、１０分後、３０分後、
６０分後で、それぞれ約２０％、２４％、８２％、８３
％の修飾率であった。つまり、ＦａＸａ存在下におい
て、ＨＧＦ誘導体は速やかに活性型二本鎖構造となるこ
とが明かとなった。
【００３０】 表 １ デンシトグラムによる各反応時間でのα鎖量検定 ＨＧＦ ＦＸ１、２、３、４ （ｋＤａ） （ｋＤａ） ９０ ５７ ９０ ５７ 反応時間 （分） （％） （％） ０ １００ ０ １００ ０ ５ ８０ ２０ ０ １００ １０ ７６ ２４ ０ １００ ３０ １８ ８２ ０ １００ ６０ １７ ８３ ０ １００
【００３１】［内皮細胞増殖活性の測定］ＢＡＥＣ（ウ
シ大動脈血管内皮細胞、Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ社）を２４穴プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）の各穴
に、５ｘ１０3個細胞ずつ加え、１０％ウシ胎児血清を
含むＤＭＥ培地（Ｎｉｓｓｕｉ社製）中で、３７℃で、
５％二酸化炭素存在下で培養を開始した。一晩培養後、
培地を５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地に交換し、同
時にＨＧＦ及び、各ＨＧＦ誘導体（ＦＸ１，３，４）を
それぞれ３ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌとなるように添
加した。陽性対照はｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）１ｎｇ／ｍ
ｌとした。培養開始から５日目に、各穴に０．０５％ト
リプシン／ＥＤＴＡを加えて、細胞を剥し、懸濁した。
細胞懸濁液にアイソトンIII（日科機社製）を加えた
後、コールターカウンター（コールターエレクトロニク
ス社製）を用いて細胞数を計測した。
シ大動脈血管内皮細胞、Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ社）を２４穴プレート（ＣＯＲＮＩＮＧ社製）の各穴
に、５ｘ１０3個細胞ずつ加え、１０％ウシ胎児血清を
含むＤＭＥ培地（Ｎｉｓｓｕｉ社製）中で、３７℃で、
５％二酸化炭素存在下で培養を開始した。一晩培養後、
培地を５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地に交換し、同
時にＨＧＦ及び、各ＨＧＦ誘導体（ＦＸ１，３，４）を
それぞれ３ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌとなるように添
加した。陽性対照はｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ社製）１ｎｇ／ｍ
ｌとした。培養開始から５日目に、各穴に０．０５％ト
リプシン／ＥＤＴＡを加えて、細胞を剥し、懸濁した。
細胞懸濁液にアイソトンIII（日科機社製）を加えた
後、コールターカウンター（コールターエレクトロニク
ス社製）を用いて細胞数を計測した。
【００３２】結果（図２）より、ＨＧＦ誘導体の内皮細
胞増殖促進活性とＨＧＦの活性は、同程度であることが
明かとなった。
胞増殖促進活性とＨＧＦの活性は、同程度であることが
明かとなった。
【００３３】［ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＨＧＦ誘導体構
造の検出］体重１６０ｇのラット（ＳＤ／ｗｉｓｔａ
ｒ、雄）の尾静脈より、ＨＧＦ誘導体及び、ＨＧＦをそ
れぞれ別々のラットに、２０μｇ注射投与し、１分後に
断頭して血液を回収した。回収時にはＥＤＴＡ・２Ｎａ
を加えて、血液凝固反応を阻止し、１０℃で、３０００
ｒｐｍ、１０分間の遠心の後、上清をプラズマとして回
収した。プラズマ５ｍｌに、０．５Ｍ塩化ナトリウム／
燐酸緩衝液を２５ｍｌ加えて希釈した後、ヘパリンアフ
ィニティークロマトグラフィーにより精製した。カラム
はＴＳＫ−Ｈｅｐａｒｉｎ ５ＰＷカラム（東ソー社
製）を使用した。カラムを０．５Ｍ塩化ナトリウム／燐
酸緩衝液でカラムを平衡化し、プラズマ希釈液をカラム
にかけ、０．５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸緩衝液でカラム
を洗浄した後、０．５ｍｌ／分の流速で、燐酸緩衝液存
在下で、塩濃度０．５Ｍから２．０Ｍまでの直線濃度勾
配をかけることにより、ＨＧＦ誘導体及び、ＨＧＦを溶
出し、精製品を得た。
造の検出］体重１６０ｇのラット（ＳＤ／ｗｉｓｔａ
ｒ、雄）の尾静脈より、ＨＧＦ誘導体及び、ＨＧＦをそ
れぞれ別々のラットに、２０μｇ注射投与し、１分後に
断頭して血液を回収した。回収時にはＥＤＴＡ・２Ｎａ
を加えて、血液凝固反応を阻止し、１０℃で、３０００
ｒｐｍ、１０分間の遠心の後、上清をプラズマとして回
収した。プラズマ５ｍｌに、０．５Ｍ塩化ナトリウム／
燐酸緩衝液を２５ｍｌ加えて希釈した後、ヘパリンアフ
ィニティークロマトグラフィーにより精製した。カラム
はＴＳＫ−Ｈｅｐａｒｉｎ ５ＰＷカラム（東ソー社
製）を使用した。カラムを０．５Ｍ塩化ナトリウム／燐
酸緩衝液でカラムを平衡化し、プラズマ希釈液をカラム
にかけ、０．５Ｍ塩化ナトリウム／燐酸緩衝液でカラム
を洗浄した後、０．５ｍｌ／分の流速で、燐酸緩衝液存
在下で、塩濃度０．５Ｍから２．０Ｍまでの直線濃度勾
配をかけることにより、ＨＧＦ誘導体及び、ＨＧＦを溶
出し、精製品を得た。
【００３４】精製されたＨＧＦ誘導体及び、ＨＧＦを、
［ＨＧＦ誘導体の血清存在下での安定性］の項と同様に
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色または、［ＨＧＦ誘導体の
ＦａＸａ反応性］の項と同様に電気泳動ブロッティング
後の酵素抗体法によりバンドとして検出した。
［ＨＧＦ誘導体の血清存在下での安定性］の項と同様に
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、銀染色または、［ＨＧＦ誘導体の
ＦａＸａ反応性］の項と同様に電気泳動ブロッティング
後の酵素抗体法によりバンドとして検出した。
【００３５】結果より、ＨＧＦはラット生体内を循環す
る間に、一本鎖構造（不活性型）から二本鎖構造（活性
型）への修飾を受けるが、ＨＧＦ誘導体は、ラットの生
体内循環後においても、一本鎖構造（不活性型）が保持
されていることが明かとなった。
る間に、一本鎖構造（不活性型）から二本鎖構造（活性
型）への修飾を受けるが、ＨＧＦ誘導体は、ラットの生
体内循環後においても、一本鎖構造（不活性型）が保持
されていることが明かとなった。
【００３６】［肝実質細胞に対するＤＮＡ合成促進活性
の測定］肝実質細胞を、高橋らの方法［組織培養 １２
（８），３０８（１９８６）］に従って調製した。この
肝実質細胞をＷＥ播種用培地（５％ウシ胎児血清、１０
-8Ｍデキサメタゾンを含むＷＥ基礎培地に懸濁して、コ
ラーゲンコートした２４穴組織培養用プレートに、５．
０ｘ１０4個細胞／０．４ｍｌ／穴となるように播いて
培養した。培養開始から４時間後にＷＥ基礎培地に交換
し、この際に、ＨＧＦ誘導体を添加して培養を継続し
た。培養開始２４時間後に、3Ｈ−チミジンを添加し培
養を継続して、２０時間のパルスラベリングを行った。
ラベリング後に、培養上清を除き、冷燐酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）、冷２％過塩素酸／ＰＢＳ、冷９５％エタノールの
順にそれぞれ３回洗浄した後、室温で乾燥させた。乾燥
後、１％ＳＤＳ／０．１Ｎ水酸化ナトリウムを０．５ｍ
ｌずつ添加し、室温で１時間以上静置して細胞を溶解さ
せた。各穴から細胞溶解液０．２５ｍｌをミニシンチレ
ーションバイアルにとり、シンチレーター（オプティフ
ロー、パッカード社製）を３ｍｌ加えて混合後、シンチ
レーションカウンターで放射活性を測定して、3Ｈ−チ
ミジンの取り込みを調べた。ＤＮＡ合成促進活性値は、
各穴における１分間あたりの放射壊変数（ＤＰＭ／穴）
で示した。
の測定］肝実質細胞を、高橋らの方法［組織培養 １２
（８），３０８（１９８６）］に従って調製した。この
肝実質細胞をＷＥ播種用培地（５％ウシ胎児血清、１０
-8Ｍデキサメタゾンを含むＷＥ基礎培地に懸濁して、コ
ラーゲンコートした２４穴組織培養用プレートに、５．
０ｘ１０4個細胞／０．４ｍｌ／穴となるように播いて
培養した。培養開始から４時間後にＷＥ基礎培地に交換
し、この際に、ＨＧＦ誘導体を添加して培養を継続し
た。培養開始２４時間後に、3Ｈ−チミジンを添加し培
養を継続して、２０時間のパルスラベリングを行った。
ラベリング後に、培養上清を除き、冷燐酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）、冷２％過塩素酸／ＰＢＳ、冷９５％エタノールの
順にそれぞれ３回洗浄した後、室温で乾燥させた。乾燥
後、１％ＳＤＳ／０．１Ｎ水酸化ナトリウムを０．５ｍ
ｌずつ添加し、室温で１時間以上静置して細胞を溶解さ
せた。各穴から細胞溶解液０．２５ｍｌをミニシンチレ
ーションバイアルにとり、シンチレーター（オプティフ
ロー、パッカード社製）を３ｍｌ加えて混合後、シンチ
レーションカウンターで放射活性を測定して、3Ｈ−チ
ミジンの取り込みを調べた。ＤＮＡ合成促進活性値は、
各穴における１分間あたりの放射壊変数（ＤＰＭ／穴）
で示した。
【００３７】結果（図３）より、ＨＧＦ誘導体ＦＸ２及
び、ＦＸ４の肝実質細胞ＤＮＡ合成促進活性はＨＧＦの
活性と同程度であり、ＦＸ１とＦＸ３は共に、ＨＧＦと
比較して、低い活性であった。ＦａＸａ存在下での肝実
質細胞ＤＮＡ合成促進活性を測定したところ、ＨＧＦと
ＦＸ３の活性にはＦａＸａの効果がみられなっかった
が、ＦＸ１、ＦＸ２、ＦＸ４は、より高い活性値を示す
ことが明らかとなった。
び、ＦＸ４の肝実質細胞ＤＮＡ合成促進活性はＨＧＦの
活性と同程度であり、ＦＸ１とＦＸ３は共に、ＨＧＦと
比較して、低い活性であった。ＦａＸａ存在下での肝実
質細胞ＤＮＡ合成促進活性を測定したところ、ＨＧＦと
ＦＸ３の活性にはＦａＸａの効果がみられなっかった
が、ＦＸ１、ＦＸ２、ＦＸ４は、より高い活性値を示す
ことが明らかとなった。
【００３８】また、上記［ＨＧＦ誘導体の血清存在下で
の安定性］より、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＨＧＦ誘
導体の活性化が、天然型ＨＧＦに比べ、速やかに行われ
ることから、ｉｎ ｖｉｖｏでは、血管損傷部位など、
血液凝固反応系の促進している局所において、ＨＧＦ誘
導体がＦａＸａにより速やかに活性化されると推測され
る。このことは同時に、多くの標的細胞と多機能な活性
を持つ活性型ＨＧＦの副作用が懸念される中で、ＨＧＦ
誘導体は不活性型一本鎖構造で体内を循環する為、副作
用の問題についても軽減されることが期待される。ま
た、上記［内皮細胞増殖活性の測定］より、血管内皮細
胞に対する増殖促進活性も同程度であることから、速や
かに活性化したＨＧＦ誘導体により血管の再構築が可能
であると推定される。
の安定性］より、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＨＧＦ誘
導体の活性化が、天然型ＨＧＦに比べ、速やかに行われ
ることから、ｉｎ ｖｉｖｏでは、血管損傷部位など、
血液凝固反応系の促進している局所において、ＨＧＦ誘
導体がＦａＸａにより速やかに活性化されると推測され
る。このことは同時に、多くの標的細胞と多機能な活性
を持つ活性型ＨＧＦの副作用が懸念される中で、ＨＧＦ
誘導体は不活性型一本鎖構造で体内を循環する為、副作
用の問題についても軽減されることが期待される。ま
た、上記［内皮細胞増殖活性の測定］より、血管内皮細
胞に対する増殖促進活性も同程度であることから、速や
かに活性化したＨＧＦ誘導体により血管の再構築が可能
であると推定される。
【００３９】図３よりＦＸ１及びＦＸ３については肝細
胞に対するＤＮＡ合成促進活性は、天然型ＨＧＦに比べ
有意に低い値であるが、図２より血管内皮細胞に対する
細胞増殖活性は天然型ＨＧＦと同程度であった。つま
り、４９５番目のアミノ酸がバリンからスレオニンに置
換されているＦＸ３、さらに４９１番目のアミノ酸がイ
ソロイシンに置換されているＦＸ１は、細胞選択性を有
するＨＧＦ誘導体であると考えられる。このように、４
９２〜４９４番目の前後の４９１、４９５番目のアミノ
酸を含めた配列を変えることで各種活性にみられること
より、４９１〜４９５番目のアミノ酸配列を置換するこ
とによって、シャープな細胞特異性を有するＨＧＦ誘導
体の作製が可能である。
胞に対するＤＮＡ合成促進活性は、天然型ＨＧＦに比べ
有意に低い値であるが、図２より血管内皮細胞に対する
細胞増殖活性は天然型ＨＧＦと同程度であった。つま
り、４９５番目のアミノ酸がバリンからスレオニンに置
換されているＦＸ３、さらに４９１番目のアミノ酸がイ
ソロイシンに置換されているＦＸ１は、細胞選択性を有
するＨＧＦ誘導体であると考えられる。このように、４
９２〜４９４番目の前後の４９１、４９５番目のアミノ
酸を含めた配列を変えることで各種活性にみられること
より、４９１〜４９５番目のアミノ酸配列を置換するこ
とによって、シャープな細胞特異性を有するＨＧＦ誘導
体の作製が可能である。
【００４０】［急性毒性］非臨床試験での毒性ＬＤ50は
１ｍｇ／ｋｇ（ラット）以上であった。
１ｍｇ／ｋｇ（ラット）以上であった。
【００４１】
配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状
【００４２】配列番号：２ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状
【００４３】配列番号：３ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状
【００４４】配列番号：４ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状
【００４５】配列番号：５ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTTGTGCCAA AACGATAGAA GGGCGAACTG TAAATGGGAT TCCAAC 46
【００４６】配列番号：６ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCCAAAACGA AACAAGGGCG AATTGTAAAT GG 32
【００４７】配列番号：７ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCCAAAACGA AACAAGGGCG AACTGTAAAT GG 32
【００４８】配列番号：８ 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCCAAAACGA AACAAGGGCG AGTTGTAAAT GG 32
【図１】発現プラスミドｐＧＭ／ＨＧＦを示した図であ
る。
る。
【図２】ＨＧＦ誘導体とＨＧＦの内皮細胞増殖促進活性
を比較したものである。
を比較したものである。
【図３】ＨＧＦ誘導体とＨＧＦの肝実質細胞ＤＮＡ合成
促進活性を比較したものである。
促進活性を比較したものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） 7729−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 下田 雅美 神奈川県足柄上郡中井町井ノ口1500 テル モ株式会社内 (72)発明者 伊藤 美紀子 神奈川県足柄上郡中井町井ノ口1500 テル モ株式会社内
Claims (3)
- 【請求項１】 肝実質細胞増殖因子のアミノ酸配列のＮ
末端より４９２番目から４９４番目のアミノ酸配列が、
Ｇｌｎ／Ｇｌｕ−Ｘａａ−Ａｒｇ（Ｇｌｎはグルタミ
ン，Ｇｌｕはグルタミン酸、Ａｒｇはアルギニン、Ｘａ
ａはグリシン、セリン、スレオニン、のうちいずれか一
つ）に置換された肝実質細胞増殖因子誘導体。 - 【請求項２】 アミノ酸配列のＮ末端より４９２番目の
アミノ酸がグルタミンであり、４９３番目のアミノ酸が
グリシンである請求項１に記載の肝実質細胞増殖因子誘
導体。 - 【請求項３】請求項１または２に記載の肝実質細胞増殖
因子誘導体を有効成分として含有することを特徴とする
医薬品組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11750694A JP3612348B2 (ja) | 1994-05-07 | 1994-05-07 | 肝実質細胞増殖因子誘導体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11750694A JP3612348B2 (ja) | 1994-05-07 | 1994-05-07 | 肝実質細胞増殖因子誘導体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07304796A true JPH07304796A (ja) | 1995-11-21 |
| JP3612348B2 JP3612348B2 (ja) | 2005-01-19 |
Family
ID=14713448
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11750694A Expired - Lifetime JP3612348B2 (ja) | 1994-05-07 | 1994-05-07 | 肝実質細胞増殖因子誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3612348B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6133231A (en) * | 1995-10-05 | 2000-10-17 | Genentech, Inc. | Angiogenesis using hepatocyte growth factor |
| US7297475B2 (en) | 2003-05-16 | 2007-11-20 | Terumo Kabushiki Kaisha | Medicament injection kit and medicament injection method |
-
1994
- 1994-05-07 JP JP11750694A patent/JP3612348B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6133231A (en) * | 1995-10-05 | 2000-10-17 | Genentech, Inc. | Angiogenesis using hepatocyte growth factor |
| US7297475B2 (en) | 2003-05-16 | 2007-11-20 | Terumo Kabushiki Kaisha | Medicament injection kit and medicament injection method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3612348B2 (ja) | 2005-01-19 |
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