JPH07301632A - イムノアッセイ試薬およびそれを用いたイムノアッセイ法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】感度が高く、特異的で安定な定性的および定量
的なイムノアッセイのための、免疫反応体で被覆した新
規なラテックス微粒子試薬を提供する。また、感度が高
く、特異的で安定かつ信頼性があり、従来技術による検
定の欠点を克服する新規なイムノアッセイ法を提供す
る。 【構成】表面にカルボキシレート基を有するラテックス
粒子と前記粒子に共有結合で結合した免疫反応体とを含
む感作した微粒子であって、前記ラテックス粒子が０．
１〜０．６μｍの直径および８〜３５平方オングストロ
ームの表面カルボキシレート占有領域を有することを特
徴とする、感作した微粒子、および該微粒子と緩衝液と
を含むイムノアッセイ試薬、並びにそれを用いたイムノ
アッセイ法に関する。。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微粒子（microparticl
e）を用いたイムノアッセイ（免疫検定）試薬に関す
る。詳しくは、本発明は、高い感度と良好な分散性とを
有する、免疫反応体で感作した、表面にカルボキシレー
ト基を有するラテックス微粒子に関する。本発明の微粒
子は、粒子を用いた免疫反応体によるイムノアッセイお
よびそれによる検出システムに有用である。

【０００２】また、本発明は、感度が高く特異的な免疫
反応体を用いたイムノアッセイ試薬およびそれによる検
定システムに関するものであり、更に詳しくは、感作し
た固体試薬を非特異的な抗原−抗体反応を低減させる特
定の緩衝液と組合せて使用するシステムに関するもので
ある。本発明のイムノアッセイ試薬は、サンプルの予備
処理の必要性が無く、また臨床化学の分野で使用される
市販の典型的な自動分析装置にも適合するものである。

【０００３】

【従来の技術】粒子を用いたイムノアッセイ（免疫検
定）は周知であり、イムノアッセイの市場の相当の部分
を構成している。これは、粒子を用いたイムノアッセイ
は非常に用途が広く、単純な目視による検出のみを要す
る試験にも、測定装置を用いた定量的な分析方法にも使
用することができるためである。

【０００４】このような粒子を用いたイムノアッセイと
しては、例えば、抗体または抗原をラテックス粒子に結
合させ、それぞれ抗原または抗体の検出のために使用す
るスライドラテックス凝集法が知られている。この場
合、抗原、抗体どちらの場合においても、抗体または抗
原のラテックス粒子に対する結合は、典型的には、受動
的な吸着または共有結合による結合によって行われる。

【０００５】このような粒子凝集法は、抗原または抗体
を直接検出するのに使用することができる（後者は、抗
原が存在することを間接的に示すものである）。この方
法では、目視または測定装置により反応終点を検出する
が、試験される特定の分析対象に応じて、凝集状態とし
て検出するか凝集阻害状態として検出するかが選択され
る。かかるスライドラテックス凝集法を使用するスライ
ドテストは、典型的には陽性／陰性の定性的な様式のテ
ストとして利用され、通常は感染性疾患の検定のために
使用される。免疫反応体（すなわち抗原または抗体）で
感作した微粒子は、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫抗
体法（ＥＬＩＳＡ）、および膜または粒子捕捉型イムノ
アッセイにも用途が認められている。

【０００６】目視による検出（凝集、発色等）は、一般
的なスクリーニングまたはイエス／ノー式定性試験には
満足し得るものであるが、ある種の分析対象は定量的な
検定を必要とする（薬物、ハプテン等）。更に、粒子を
用いたイムノアッセイを大量のスクリーニング用途（例
えばＡＩＤＳ、肝炎等）に適用する場合、完全に自動化
された方法で行うのが望ましい。粒子を用いた機器検定
は、現在この要求に合致するよう開発されつつある。こ
れらの装置およびそれに付随する方法は、必要に応じて
多重のエピトープを用い、またはハプテン（より大きい
分子に結合した小さい分子、例えば薬物−蛋白質接合
体）についての阻害方法として、典型的には免疫反応体
の直接検出のために企図される。

【０００７】一方、感作した粒子と免疫反応体との特異
的な反応によって引起される光の散乱で生ずる変化を利
用することにより、未知のサンプル中の免疫反応体の濃
度を定量するための装置および方法が、いくつか開発さ
れている。前記した半定量的な目視による評価方法では
３０〜４０％の差異を識別するのが困難であるのに対
し、この方法および装置によれば、粒子懸濁物の大きな
表面積および光散乱の物理的原理から、２〜３％の変動
を容易に識別することができる。

【０００８】上述したようなイムノアッセイ法および装
置は、「実験免疫学ハンドブック」第１〜４巻、ブラッ
クウェル・サイアンティフィック、1987（参考としてこ
こに援用する）、米国特許第3,088,875 号、第3,857,93
1 号、第3,992,517 号、第4,080,264 号、第4,174,952
号、第4,203,724 号、第4,480,042 号、第4,590,156
号、第4,690,906 号、第4,716,123 号、第4,772,550
号、第4,851,329 号、第4,960,692 号および第5,100,80
5 号、並びにGrange, J.ら、J. Immuno. Meth., 18, 36
5, 1977 、Hechemy, K. ら、Lab Management, 27 ６月
／７月1984、Looney, C., J. Clin. Immunoassay, 7,
(1), 90, 1984、Von Schulthes, G. ら、MolImmunol,
1, 81, 1980、Craine, J., Am. Biotech. Lab., 34,５
月−６月1987、Heveran, J., J. Forensic Sci., 470,
1977、およびKumura, H. J. Immuno. Meth., 38, 353,
1980（全て参考としてここに援用する）に説明されてい
る。

【０００９】粒子を用いたイムノアッセイおよび感作し
た（すなわち免疫反応体で被覆または修飾された）微粒
子試薬は公知であるが、現在の微粒子は、高い感度、良
好な分散性および安定性という望ましい特性を欠いてい
る。

【００１０】ところで、ジゴキシンは、鬱血性心疾患お
よびある種の心臓リズム異常の調節のために現在処方さ
れている普及したグリコシド系強心薬である。ジゴキシ
ンの変力性作用に起因する心拍出量の増加により、血管
鬱血、浮腫、呼吸困難、坐位呼吸および心臓性喘息のよ
うな心欠陥に特徴的な障害が改善される。ジゴキシンは
心室速度も低下させ、よって血行動態を改善する。動
悸、前胸部の苦痛または衰弱が緩和され、併発する鬱血
性の疾患が改善される。また、ジゴキシンは心臓の動き
を遅くし、規則的な洞リズムを誘導する。ジゴキシンの
使用が、心疾患、心房細動または粗動を調節するためで
あるか／阻害するためであるかに拘らず、臨床試験の開
始の後は、ジゴキシンを継続的に投与することが一般的
には推奨される。

【００１１】しかしながら、ジゴキシンの安全域は非常
に低く、治療投与量と中毒投与量との間には非常にわず
かな差しかない。経口投与における吸収が変動するこ
と、および排泄が変動し、なおかつ非腎臓性の排泄であ
ることから、患者の体内のジゴキシンレベルを予測する
のは困難である場合が多い。このため、血清のジゴキシ
ンレベルをモニターすることは、患者の中毒の危険性を
減少させ、ジギタリス剤の過少投与を検出するのに価値
ある必要な手段である。このことは、例えば、血清のジ
ゴキシンレベルが１．１および４．４ｍｇ／ｍＬの場合
について、中毒の発生率がそれぞれ５％から７１％に増
加することからも、わかる。

【００１２】現在のジゴキシンについてのイムノアッセ
イの技術としては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、
酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ）およびＥＭＩＴ検定が挙
げられる。ＲＩＡでは、一般に放射性のヨウ素を用いて
ジゴキシンを標識し、ガンマ線計数装置を用いて、抗体
に結合した標識されたジゴキシンの量を測定する。しか
しながら、このようなＲＩＡは、放射性元素の使用、サ
ンプルの不安定性、相当な試薬の調製、高価な測定装置
等のような幾つかの欠点を有する。

【００１３】ＥＬＩＳＡおよびＥＭＩＴも、ジゴキシン
の標識（この場合は酵素で行う）を必要とし、且つその
後に酵素−基質の反応をモニターすることを必要とす
る。また、これらの方法は、ＲＩＡと同様に、相当な試
薬の調製等を必要とする。更に、現在の方法では、非特
異的な（すなわち血清の干渉性のジゴキシン抗体）反応
に寄与し偽陽性の結果を導く干渉性の蛋白質を破壊する
ために、血清の予備処理工程を含んでいるのが一般的で
ある。例えば、ＥＭＩＴジゴキシン検定を行う場合、血
清または血漿を水酸化ナトリウムと混合して干渉性の蛋
白質を破壊している。

【００１４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、感度
が高く特異的で安定な、定性的および定量的なイムノア
ッセイのための、免疫反応体で被覆した新規なラテック
ス微粒子、更には、診断試験、特に毒性薬物モニター
（Toxic Drug Monitoring 、ＴＤＭ）の分野で有用な、
ラテックス凝集阻害検定に用いるラテックス微粒子イム
ノアッセイ試薬を提供することである。

【００１５】また、本発明の目的は、グリコシド系強心
薬、特にジゴキシンおよびジギトキシンの検出のために
有用な、ラテックスを用いた微粒子試薬を提供すること
である。

【００１６】また、本発明の目的は、感度が高く特異的
で安定かつ信頼性があり、従来技術による検定の欠点を
克服する新規な検定方法、特に感度が高く特異的なジゴ
キシンの検定方法を提供することである。

【００１７】更に、本発明の目的は、臨床化学の分野で
有用な現在の市販の自動分析装置に適用可能な、感度が
高く特異的なイムノアッセイおよびそれに用いられるキ
ットを提供することである。

【００１８】更に、本発明の目的は、サンプルの予備処
理なしに操作することができ、患者の血清ジゴキシンレ
ベルを、高い信頼性をもって簡単かつ効率的に決定する
のに利用することのできる、感度が高く特異的なグリコ
シド系強心薬の検定方法を提供することである。

【００１９】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意検討した結果、表面積に特定割合でカ
ルボキシレート基を有する特定粒径のラテックス粒子を
用いることにより、上記目的を達成することができるこ
とを見いだし、本発明に到達した。

【００２０】すなわち、本発明は、表面にカルボキシレ
ート基を有するラテックス粒子と前記粒子に共有結合で
結合した免疫反応体とを含む感作した微粒子であって、
前記ラテックス粒子が０．１〜０．６μｍの直径および
８〜３５平方オングストロームの表面カルボキシレート
占有領域を有することを特徴とする、感作した微粒子に
関するものである。

【００２１】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ラテックス粒子を用いた微粒子試薬は、表面にカルボキ
シレート基を有しており、且つ、相補的な免疫反応体と
特異的に反応し得る免疫反応体が共有結合で結合した任
意のラテックス粒子を含むものである。このラテックス
粒子は、好ましくは、全体的な直径が０．０２０〜０．
９６μｍ、より好ましくは０．０５〜０．７５μｍ、更
に好ましくは０．１０〜０．６０μｍ、最も好ましくは
０．１８〜０．５μｍであり、表面カルボキシレート占
有領域が、８〜３５、好ましくは１０〜３０平方オング
ストロームである。

【００２２】ここで使用する「表面カルボキシレート占
有領域（surface carboxylate parking area）」という
用語は、平方オングストロームで測定したラテックス粒
子の表面積を、その表面上のカルボン酸（−ＣＯＯＨ）
およびカルボキシレート（−ＣＯＯ^- ）官能基の総数で
除した値を表す。また、「カルボキシレート基」とは、
−ＣＯＯＨおよび−ＣＯＯ^- の両方の官能基を表す。更
に、本発明による表面にカルボキシレート基を有するラ
テックス粒子は、好ましくは１．００〜１．１０、更に
好ましくは１．０２〜１．０６の範囲の密度を有する。

【００２３】本発明のラテックス粒子は、カルボキシレ
ート基を有する重合体または共重合体からなる粒子であ
り、乳化重合、核剤を使用した乳化重合、および好まし
くは懸濁重合等を含む当業界で一般的に知られたいずれ
の技術によっても製造することができる。また、前記粒
子の製造に際しては、架橋剤を用いても用いなくてもよ
い。更に、いわゆるコア−シェル型の粒子をも含む。表
面に十分なカルボキシレート基を有するものであれば、
いずれの重合体粒子を使用することもできる。

【００２４】特に有用なコア粒子は、既にカルボキシレ
ート基を有するＣ₁ 〜Ｃ₈ −、好ましくはＣ₁ 〜Ｃ₂ −
（メタ）アクリレート、カルボキシレート基を導入した
ポリスチレン、およびアクリル酸とスチレン単量体との
混合物から製造されるようなものを含む。

【００２５】本発明で有用な表面にカルボキシレート基
を有するラテックス粒子を調製する方法は当業界で公知
であり、例えば、米国特許第5,015,695 号、第4,988,77
0 号、第4,978,719 号、第4,962,154 号に記載されてい
る（全て参考としてここに援用する）。

【００２６】前述したように、本発明のラテックス粒子
を用いた微粒子試薬は、好適な直径と好適な表面カルボ
キシレート占有領域とを有する。本発明のラテックス粒
子の全体的な直径は０．２０〜０．９６μｍの範囲で変
動し得るが、好適な直径は０．１〜０．６μｍ、更に好
ましくは０．１８〜０．５μｍである。特に有用な直径
には、０．２０、０．２５、０．２７、０．３０、０．
３５、０．３７、０．４０、０．４５および０．４７μ
ｍが含まれる。また、本発明の微粒子試薬は実質的に球
形、好ましくは完全に球形であるのがよく、更に、その
大きさが実質的に均一であるのが好適である。

【００２７】本発明の微粒子は、表面にカルボキシレー
ト基が導入されたものである。従って、接触する（また
は接触していた）溶媒の酸性度に応じて、その表面上に
カルボン酸残基および／またはカルボキシレート残基部
分を有する。そして、これらのカルボン酸およびカルボ
キシレート残基の密度を、表面カルボキシレート占有領
域として表し、平方オングストロームで測定する。本発
明の微粒子におけるカルボキシレートの残基の好適な表
面カルボキシレート占有領域は、８〜３５、好ましくは
１０〜３０平方オングストロームの範囲である。

【００２８】有用な表面カルボキシレート占有領域とし
ては、例えば５、７、１０、１２、１５、１８、２０、
２２、２５、２８、３０、３２および３５平方オングス
トロームが含まれ、一般には８〜３５平方オングストロ
ームのものが優れた結果を与える。尚、本発明の微粒子
の表面カルボキシレート占有領域は、ラテックス粒子の
全体的な直径と、滴定等によって決定される酸基の数と
によって計算される。また、本発明のラテックス粒子の
全体的な直径は、光散乱技術、電子顕微鏡等により測定
される。

【００２９】本発明の微粒子を感作するのに使用される
免疫反応体としては、そのラテックス粒子の表面カルボ
キシレート基に共有結合で結合し得る公知の任意の免疫
反応体が挙げられる。これに包含されるものとしては、
例えば薬物−蛋白質接合体等のハプテン−担体接合体が
ある。また、所望に応じて複数の免疫反応体の混合物を
使用することもできる。一般に、本発明で有用な免疫反
応体は、直接検定および競合検定、サンドイッチ検定等
を含む公知の任意のイムノアッセイ法において、相補的
な免疫反応体と特異的反応が可能なものである。

【００３０】尚、本発明では、免疫反応体という用語
は、必要に応じて蛋白質または合成もしくは天然重合体
等のような他の分子に共有結合等で結合していてもよい
抗原または抗体のいずれかを意味し、相補的な免疫反応
体は、当該免疫反応体に特異的に結合し得る、必要に応
じて合成もしくは天然重合体等のような他の分子に共有
結合等で結合していてもよい抗体または抗原のいずれか
を意味する。ここで使用するように、免疫反応体は、ラ
テックス粒子に共有結合で結合した分子種であり、相補
的な免疫反応体は、これに特異的に結合する分子種であ
る。しかしながら、ある種のイムノアッセイ法等では、
この種の構成を必要としない場合もある。

【００３１】本発明で有用な免疫反応体および相補的な
免疫反応体の例には次のものが含まれる：

【００３２】ＡＦＰ（α−フェトプロテイン） β−２−ミクログロブリン ＣＥＡ（癌胎児性抗原） フェリチン ＣＡ１９−９（糖質抗原１９−９） ＰＡＰ（前立腺酸性ホスファターゼ） ＰＳＡ（前立腺特異性抗原） ＣＲＰ（Ｃ−反応性蛋白質） Ｍｂ（ミオグロビン） ＲＦ（リウマチ因子） ＡＳＯ（抗ストレプトリジン−Ｏ） ＦＤＰ（フィブリン分解生成物） 抗トロンビンＩＩＩ プラスミノーゲン α−２−プラスミンインヒビター Ｄ−ダイマー（フィブリン分解生成物Ｄ−フラグメント
二量体） ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ） ＩｇＡ（免疫グロブリンＡ） ＩｇＭ（免疫グロブリンＭ） ＩｇＥ（免疫グロブリンＥ） Ｃ３（補体第３成分） Ｃ４（補体第４成分） 尿アルブミン ｈＣＧ（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン） ｈＰＬ（ヒト胎盤性ラクトゲン） インシュリン ＨＢｓ抗原（Ｂ型肝炎表面抗原） ＨＢｓ抗体（抗Ｂ型肝炎表面抗原抗体） ＨＢｃ抗体（抗Ｂ型肝炎コア抗原抗体） ＨＣＶ抗体（抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体） トレポネーマ（抗梅毒トレポネーマ抗体） ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン） ＬＨ（黄体形成ホルモン） ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン） ジゴキシン ジギトキシン キニジン プロカインアミド ＮＡＰＡ（Ｎ−アセチルプロカインアミド） テオフィリン フェニトイン フェノバルビタール カルバマゼピン バルプロン酸（Valproic acid ） エトスクシイミド（Ethosuccimide ） ゲンタマイシン トブラマイシン アミカシン バンコマイシン サイクロスポリンＡ Ｂ１２（ビタミンＢ１２） 葉酸 Ｔ３（トリヨードチロニン） Ｔ４（チロキシン） エステロゲン

【００３３】前述した分子種の全ては、そのイムノアッ
セイにおける役割に応じて、免疫反応体または相補的な
免疫反応体のどちらとも呼ぶことができる。すなわち、
重要なのは組合せであり、名称は重要ではない。そし
て、本発明において免疫反応体とのみ表現する場合は、
上記の分子種および類似する既知の分子種の何れかを意
味する。勿論、上で列記したものに相補的な全ての免疫
反応体が、本発明の免疫反応体に含まれる。本発明に有
用な他の免疫反応体は、ピアス（Pierce）の「免疫技術
カタログおよびハンドブック」（ピアス化学社、１９９
２：参考としてここに援用する）に記載されている。

【００３４】前記したように、ハプテンとヒト血清アル
ブミン（ＨＳＡ）との接合体およびハプテンとウシ血清
アルブミン（ＢＳＡ）との接合体のような蛋白質接合体
も、本発明の免疫反応体に含まれる。この種の担体−ハ
プテン接合体の例としては、ジゴキシン−ＨＳＡ接合体
およびジゴキシン−ＢＳＡ接合体が挙げられる。これら
の接合体を製造する方法は、Erlanger, B. Meth. of En
zym. 70, 85, 1980 およびBauminger ら、Meth. in Enz
ym., 70, 151, 1980に説明されている（両者を参考とし
てここに援用する）。

【００３５】本発明では、表面にカルボキシレート基を
有するラテックス粒子に免疫反応体を共有結合で結合さ
せるが、免疫反応体を一旦ラテックス粒子に結合させる
と、そのラテックス粒子は感作された微粒子として表現
される。

【００３６】本発明の免疫反応体で被覆した微粒子（感
作した微粒子試薬）は、カルボキシレートを導入したラ
テックス粒子に免疫反応体を共有結合で結合させること
によって調製するが、免疫反応体をカルボキシレート基
に共有結合で結合させる方法としては、当業界で公知の
あらゆる方法を使用することができる。

【００３７】本発明で有用な、固体支持体上に免疫反応
体を固定化するためのいくつかの技術は、G. T. Herman
son ら1992による「固定化アフィニティリガンド技
術」、米国特許第4,045,384 号、第4,140,662 号および
第4,680,338 号、Quasla, G.ら、J. Immuno. Meth., 第
22巻、165, 1978 、Srere, P. ら、Meth. Enzym., 44,
11, 1976、Nustad, K.ら、Devel. Biol. Stds. 57, 32
1, 1984、Bahadur, A. ら、Makromol. Chem., 186, 138
7, 1985、Margel, S.ら、J. Immuno. Meth. 28, 341, 1
979、およびSuen, C.ら、Makromol. Chem. 186, 255, 1
985に記載されている（全て参考としてここに援用す
る）。リンカー分子を使用することもできる。

【００３８】本発明の免疫反応体とラテックス粒子とを
共有結合で結合させる好適な方法として、カルボジイミ
ド縮合試薬を使用する方法がある。カルボン酸官能基と
アミンとの縮合を行うためにカルボジイミド縮合試薬を
使用することは当業界で周知であり、Stretweiser とHe
athcock 、マクミラン、1976による「有機化学」、Shee
han, J. C.らによるJ. Amer. Chem. Soc. 95, 875 (197
3)、Thomas, J. O. らによるJ. Mol. Biol., 123, 149
(1978)、Packer, L.らによるFEBS LETT., 108,243 (197
9) 、Anal. Biochem., 63, 485 (1975)、Plant Physio
l., 53, 619 (1974)、およびJ. Org. Chem., 21, 439
(1956) に記載されている（全て参考としてここに援用
する）。

【００３９】表面カルボキシレート基と免疫反応体とを
縮合させるための特に好適なカルボジイミド縮合試薬に
は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ
ジイミド（ＥＤＣ）、および１−シクロヘキシル−３−
（２−モルホリノエチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）が
含まれる。このうち、高い溶解度、温和な条件下での有
効性、および反応制御の容易性から、ＥＤＣが特に好適
である。

【００４０】本発明のラテックス粒子に共有結合で結合
させる免疫反応体の量は、粒子の性質および免疫反応体
に応じて変動するが、一般には、本発明の代表的なラテ
ックス粒子に対し、５０〜１０，０００、好ましくは２
００〜２０００の免疫反応体分子を結合させることがで
きる。ただし、この範囲は、検定技術、反応の所望の速
度等によっても、変化させることができる。

【００４１】縮合に使用するカルボジイミドの量は、典
型的には、ラテックス粒子の重量の０．０１〜５％、好
ましくは０．０５〜２％、またはラテックス粒子の表面
カルボキシレート基の２〜５倍当量である。米国特許第
4,181,636 号および第4,045,384 号を参照することがで
きる（参考としてここに援用する）。

【００４２】しかしながら、カルボジイミドによって触
媒されたカルボキシル基とアミノ基との縮合反応は、非
特異的な反応のための反応部位を提供し得る望ましくな
い副生物を生成する場合がある。そこで、このような副
生物の形成に対向するために、縮合反応が順調に進行し
た後に、過剰量のアミンを添加し、これにより生成する
アミノ酸を使用して、カルボジイミドが結合したした表
面カルボキシレート残基をカルボン酸またはカルボキシ
レート官能基に戻すことができる。このようにして、本
発明の微粒子試薬の表面電荷を相対的に一定に維持し制
御可能とすることができる。カルボジイミドによる縮合
反応を消勢するのに有用な好適なアミンとしては、エタ
ノールアミン、エチレンジアミン、グルコサミン、グリ
シンおよびリジンが挙げられる。このうち、グリシンお
よびリジンが好適であり、グリシンが特に好適である。

【００４３】尚、免疫反応体とラテックス粒子との結合
を行う前に、例えばバイオ・ラドの混合床樹脂ＡＧ５０
１−Ｘ８のようなイオン交換樹脂にラテックス粒子を通
過させることにより、ラテックス粒子を洗浄するのが好
適である。

【００４４】本発明のラテックス粒子を用いる微粒子試
薬は、高い感度および良好な分散性を兼ね備えることが
できる。特に、適切な粒子の大きさと相対的に小さい表
面カルボキシレート占有領域との組合せにより、１ｎｇ
／ｍＬ未満の量で存在する分析対象を定量するのに十分
な感度を有する試薬粒子を得ることができる。このレベ
ルの感度は、ジゴキシン検定を含むいくつかの薬物をモ
ニターするためには必須である。

【００４５】更に、本発明の感作した微粒子は、水性溶
剤に優れた分散性を有し、よって高い再現性と優れた保
存安定性とを共に備えたものであり、粒子を用いたイム
ノアッセイに有用な均一な試薬を提供することができ
る。本発明の微粒子は、特定の表面カルボキシレート占
有領域および特定の粒子サイズ等を有することによっ
て、血清マトリックス効果の影響を受けにくいものとな
っており、よってイムノアッセイ試薬としての特異性が
向上している。

【００４６】言うまでもなく、上述した事柄に照らせ
ば、本発明に対し、多くの改良および応用が可能であ
る。したがって、本発明は、その特許請求の範囲の記載
を逸脱しない範囲内で、ここに特に記載した態様に限定
されるものではないことが容易に理解されよう。

【００４７】更に、本発明は、サンプル中の所望の分子
種の存在および量を決定することができるイムノアッセ
イ法およびイムノアッセイ試薬に関するものである。こ
れらの試薬には、前記した本発明の微粒子と、緩衝剤、
塩化ナトリウム、塩化コリン、脂肪酸非含有血清アルブ
ミン、デキストラン硫酸ナトリウムまたはメチルセルロ
ースのような多糖類、必要に応じて相補的な免疫反応
体、および必要に応じて２級または３級アミンの非特異
的反応抑制剤を含む緩衝液とが含まれる。

【００４８】また、本発明では、一方に前記した微粒子
を含有し、他方に緩衝液を含有する２つの収容手段を備
えるキットも提供される。収容手段としては、あらゆる
手段を使用することができ、これには例えばバイアル、
ジャー、チューブ、ボトル、ホイルパック等が含まれ
る。また、開閉可能なように封止した容器および封止し
ていない容器のいずれをも使用することができる。収容
手段および封止手段は、ガラス、プラスチック、金属、
複合材料等のあらゆる材料から製造することができる。

【００４９】本発明のイムノアッセイ試薬は、免疫反応
体を用いて感作した、前記した微粒子および緩衝液を利
用するあらゆるイムノアッセイシステムおよびイムノア
ッセイ法で使用することができる。本発明の微粒子を使
用することのできるイムノアッセイ法、およびその自動
化または半自動化した装置のいくつかについては、「実
験免疫学ハンドブック」第１〜４巻、ブラックウェル・
サイアンティフィック、1987、米国特許第3,088,875
号、第3,857,931 号、第3,992,517 号、第4,080,264
号、第4,174,952 号、第4,203,724 号、第4,480,042
号、第4,590,156 号、第4,690,906 号、第4,716,123
号、第4,772,550 号、第4,851,329 号、第4,960,692 号
および第5,100,805 号、並びにGrange, J.ら、J. Immun
o. Meth., 18, 365, 1977 、Hechemy, K. ら、Lab Mana
gement, 27 ６月／７月1984、Looney, C., J. Clin. I
mmunoassay, 7, (1), 90, 1984、Von Schulthes, G.
ら、Mol Immunol, 1, 81, 1980、Craine, J., Am. Biot
ech. Lab., 34,５月−６月1987、Heveran, J., J. Fore
nsic Sci., 470, 1977およびKumura, H. J. Immuno. Me
th., 38, 353, 1980（全て参考としてここに援用する）
に説明されている。尚、これには競合的および非競合的
な方法が含まれる。

【００５０】好ましくは、粒子を用いたイムノアッセイ
を本発明のイムノアッセイ試薬と共に利用して行う、ラ
テックス凝集またはラテックス凝集阻害に基くイムノア
ッセイシステムが最も好適である（米国特許第4,203,72
4 号および第5,100,805 号並びにJ. Clin. Chem. 38
(b), 1012 (1992) を参照することができ、この３つの
全てを参考としてここに援用する）。本発明のイムノア
ッセイ試薬およびイムノアッセイ法を行うのに有用な分
析装置としては、三菱化学株式会社（日本）製ＬＰＩＡ
−１００全自動ラテックス免疫測定装置、ロシェ・ダイ
アグノスティック・システムズ社製ＣＯＢＡＳ・ＦＡＲ
Ａ装置およびＣＯＢＡＳ・ＭＩＲＡ装置、および日立７
０４分析装置等が挙げられる。

【００５１】ラテックス粒子の凝集または凝集阻害方法
を使用する場合、サンプルおよび必要に応じて抗体試薬
をキュベットに分注して予備インキュベートを可能にし
た後、感作した固体試薬をキュベットに分注し、これに
よって起こる反応を光度計等でモニターする能力を有す
る定量的な光度計装置が好適である。勿論、例えば光散
乱技術等によって凝集または凝集阻害を測定し得るすべ
ての装置を使用することができ、サンプルの添加、試薬
の添加等は手動または半自動方法によって行うことがで
きる。

【００５２】本発明の緩衝液は、緩衝剤、塩化ナトリウ
ム、塩化コリン、デキストラン硫酸ナトリウム若しくは
メチルセルロース等の多糖類化合物、必要に応じて本発
明の感作した支持体上の免疫反応体と特異的に反応する
相補的な免疫反応体、脂肪酸非含有血清アルブミン、お
よび必要に応じて２級または３級アミンの非特異的反応
抑制剤を含む。

【００５３】本発明のこのような抗体緩衝液試薬は、好
ましくは水を基材とし、４．５〜１０、好ましくは５．
５〜９．５のｐＨを有する。緩衝液中に存在する塩化ナ
トリウムの量は、１．０〜５重量％、好ましくは１．５
〜４．５重量％、最も好ましくは２．０〜４．０重量％
である。本発明の緩衝液中に存在する塩化コリンの量
は、１〜１５重量％、好ましくは２〜１２重量％、最も
好ましくは４〜８重量％である。

【００５４】また、本発明の緩衝液では、公知のｐＨ緩
衝剤を使用する。尚、ここで、「緩衝剤」という用語
は、酸またはアルカリを添加した際に水素イオン濃度の
変化に抵抗する単一の物質または複数の物質の組合せを
意味する。そのような緩衝剤の例としては、トリス−
（ヒドロキシメチル）−アミノエタン、リン酸緩衝剤、
ピアスの「免疫技術カタログおよびハンドブック」等に
列記されたもの等が含まれる。尚、前記および後記の緩
衝液中の各成分の重量％は、緩衝液の全重量を基準とし
たものである。

【００５５】本発明の緩衝液は、デキストラン硫酸ナト
リウム、メチルセルロース等の少なくとも１つの多糖類
をも含む。他の例としては、カルボキシメチルセルロー
ス、デキストラン等が挙げられる。多糖類は、緩衝液試
薬を許容し得る粘度へと増粘させるものである。本発明
の緩衝液で有用なデキストラン硫酸ナトリウムの量は、
好ましくは０．２〜３．０重量％、より好ましくは０．
６〜２．０重量％、最も好ましくは１．０〜１．８重量
％である。本発明の緩衝液で有用なメチルセルロースの
量は、好ましくは０．０５〜１．０重量％、より好まし
くは０．１〜０．４重量％、最も好ましくは０．１５〜
０．３重量％である。

【００５６】本発明で有用な脂肪酸非含有血清アルブミ
ンは、脂肪酸を実質的に含有しないことを特徴とする。
この材料は、Chen, R. J., J. Biol. Chem., 242, 173
(1967)（参考としてここに援用する）に記載された方法
によって調製することができ、また、シグマ社およびマ
イルス社から種々の分子種および等級で購入することが
できる。また、ヒト、ウシ、ウサギ、ヒツジ等の血清ア
ルブミンを使用することができる。このうち、脂肪酸非
含有ヒト血清アルブミンが最も好適である。また、脂肪
酸を含有せずグロブリンを含有しない材料も好適であ
る。尚、本発明の緩衝液中の脂肪酸非含有血清アルブミ
ンの量は、緩衝液の全容量を基準として５〜１００ｍｇ
／ｍＬ、好ましくは７．５〜６０ｍｇ／ｍＬ、最も好ま
しくは１０〜４０ｍｇ／ｍＬである。

【００５７】本発明の緩衝液に必要に応じて用いられる
相補的な免疫反応体としては、前記したラテックス粒子
を感作するのに使用した免疫反応体と特異的に反応する
すべての相補的な免疫反応体を挙げることができる。た
だし、この成分は任意的である、というのは、例えば、
検出または定量されるサンプル中の分子種が前記微粒子
と直接反応する直接検定では、相補的な免疫反応体は溶
液中では必要ない。

【００５８】この相補的な免疫反応体を使用する場合、
好適なものは、微粒子を感作するのに使用した免疫反応
体と特異的に反応するモノクローナル抗体であり、抗ジ
ゴキシンモノクローナル抗体が特に好適である。モノク
ローナル抗体を製造する方法は当業界で周知であり、D.
E. Yeltonら、Annu. Rev. Biochem., 50, 657, 1981、
Milstein, C., Sci. American, 243(4), 66, 1980 、Ke
nnett, R. H.ら、「モノクローナル抗体」、プレナム・
プレス、ニューヨーク1980、およびKohler, Gら、Natur
e, 256, 495 (1975) （全て参考としてここに援用す
る）に記載されている。

【００５９】上述したように、本発明のもう一つの任意
成分として、非特異的な相互作用を効果的に低減または
除去することにより、本発明のイムノアッセイ試薬およ
びイムノアッセイ法の正確性および信頼性を向上せしめ
る働きを有する１種以上の２級または３級アミンが挙げ
られる。これらの２級および３級アミンは、係属中の米
国出願番号08/194,475号に記載されている（参考として
ここに援用する）。また、それらは単独でまたは混合し
て使用することができる。本発明で有用な２級および３
級アミンからなる非特異的反応抑制剤としては、以下の
式で表されるものである。

【００６０】

【化７】

【００６１】（式中、Ｘは−ＮＨ−（ＣＯ）−ＮＨ−、
−ＮＨ−（ＣＳ）−ＮＨ−、−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−または次の
式で表される残基である。

【００６２】

【化８】

【００６３】Ｒ₁およびＲ₂は同一でも異なってもよいＣ
₁〜Ｃ₅の直鎖状若しくは分岐状アルキル基を表すか、ま
たはＲ₁およびＲ₂は窒素と共に次式で表される残基若し
くはそのメト−ｐ−トルエンスルホン酸塩を形成するも
のである。

【００６４】

【化９】

【００６５】Ｙは同一でも異なってもよく、Ｈ、ＯＨお
よびハロゲンのいずれかである。Ｒ₃は−ＮＲ₁Ｒ₂、−
ＮＨ₂、−ＣＨＹ、シクロヘキシル基またはＨである。
また、ｍは０〜５の整数であり、ｐは０〜５の整数であ
り、ｎは０または１である。但し、ｎが１の場合は、ｍ
およびｐの少なくとも１つは少なくとも１であり、ｍ＝
ｎ＝ｐ＝０の場合はＲ₃はＨまたは−ＣＨ₂Ｙである。） また、本発明の非特異的反応抑制剤には、この前記式で
表されるアミンの酸付加塩、特にそのＨＣｌ塩、リン酸
塩および硫酸塩が含まれる。これらの非特異的反応抑制
剤のうち、好ましいものは、ｎ＝１のときにｍが少なく
とも１であるものである。

【００６６】これらの２級および３級アミンは、Ｈ、Ｏ
Ｈおよびハロゲンの任意の組合せによって何れかのまた
はすべてのｍ個とｐ個のメチレン基上の水素が置換され
ていてもよく、また、ｍ＝ｎ＝ｐ＝０でＲ₃が例えばＨ
またはメチル基である化合物、更にはｍ、場合によって
はｎ、および場合によってはｐが０でなくＲ₃がＨまた
は−ＣＨ₂Ｙ等である化合物を含むものである。

【００６７】これら前記した化合物の幾つかは、ペプチ
ドの調製で有用なカルボジイミドの加水分解生成物であ
る。これについては、Sheehan, J. C.ら、J. Org. Che
m., 26, 2525, 1961 、およびStaros, J. V. ら、Anal.
Biochem., 156, 220, 1986を参照することができる
（両者を参考としてここに援用する）。

【００６８】特に好適な非特異的反応抑制剤は、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）尿素（ＥＤ
Ｕ）、すなわち前記した式でＲ₁ ＝Ｒ₂ ＝メチル、Ｙ＝
Ｈ、ｍ＝３、ｎ＝１、ｐ＝１およびＲ₃ ＝メチルである
化合物である。他には１−シクロヘキシル−３−（２−
モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエン
スルホン酸（ＣＭＣ）がある。これらの化合物およびそ
の加水分解生成物は、イムノアッセイ、特に免疫反応体
が共有結合でまたは吸着によって微粒子に結合したもの
を用いるイムノアッセイにおける非特異的反応を抑制す
るのに有用である。

【００６９】本発明の非特異的反応抑制剤は一般に市販
されており、当業者に周知の簡単な有機反応によって調
製され、例えば「有機化学入門」、A. Streitwieser と
C. Heathcock、マクミラン1976、「有機合成試薬」、Fe
iserとFieser、ジョン・ウイレイ・アンド・サンズ1976
および続巻、「有機合成概観」、ジョン・ウイレン・ア
ンド・サンズ、第ＩおよびＩＩ巻1970、および「現代有
機化学」、３月、ウイレイ1985（全て参考としてここに
援用する）において説明されている。例えば、カルボジ
イミド（−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−）化合物の加水分解によって尿
素化合物（−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−）を調製することがで
きる。

【００７０】前記した式によって示される本発明の非特
異的反応抑制剤は、単独または組合せて使用することが
でき、本発明の緩衝液に添加するか、または感作の前後
に前記したラテックス粒子上に吸着させることができ
る。更に、前記非特異的反応抑制剤は、慣用の非特異的
反応抑制剤と組合せて利用することができる。

【００７１】本発明の特に好ましい態様としては、１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ
ジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）またはＣＭＣ等のカルボジイ
ミド試薬を使用して免疫反応体を固体基質に最初に結合
させて行う系において、非特異的なイムノアッセイ反応
を抑制するために、前記式の化合物を使用する場合が挙
げられる。本発明の更に好ましい態様としては、使用す
る非特異的反応抑制剤が、微粒子へ免疫反応体を結合さ
せるのに使用するカルボジイミドの加水分解生成物であ
る場合が挙げられる。

【００７２】非特異的反応抑制剤の濃度としては、広範
囲の濃度が有効である。一般に、本発明により非特異的
なイムノアッセイ反応を抑制するのに有用な非特異的反
応抑制剤の量は、全イムノアッセイ溶液容量、全緩衝液
容量、および試験すべきサンプルの溶液容量を基準とし
て、または溶剤中に懸濁した感作した微粒子の溶液の容
量を基準として、０．１〜３００ｍＭ、好ましくは０．
５〜５０ｍＭ、更に好ましくは１．２５〜２５ｍＭであ
る。

【００７３】本発明の感作した微粒子および緩衝液を用
いれば、高い感度で特異的なイムノアッセイによる免疫
測定が可能となる。直接測定（すなわち非阻害モード）
による検定で使用する場合、相補的な免疫反応体を本発
明の緩衝液から除外し、塩化ナトリウム、塩化コリン、
多糖類、脂肪酸非含有血清アルブミン、および必要に応
じて１種以上の２級または３級アミンからなる非特異的
反応抑制剤を慣用的な緩衝液構成成分と共に使用する。
阻害反応に基く検定の場合は、相補的な免疫反応体を本
発明の緩衝液中に更に存在させ、試験すべきサンプルと
緩衝液試薬とを接触させ、１〜２０分間インキュベート
する。インキュベートが終了したら、感作した微粒子を
混合物に添加し、占有されていない相補的な免疫反応体
の結合部位と結合させる。結合の速度は、血清サンプル
中の免疫反応体の濃度に反比例して相関する。

【００７４】本発明のイムノアッセイ試薬、イムノアッ
セイ法、およびこれらを含む検定方法により、サンプル
中の、特に患者の血清サンプル中の分子種の濃度が、高
い感度で特異的に決定される。例えば、ラテックス凝集
阻害に基き、本発明の好ましい態様であるラテックス粒
子を用いたジゴキシン−ＨＳＡ接合体により感作した微
粒子試薬を利用し、塩化ナトリウム、塩化コリン、デキ
ストラン硫酸ナトリウムまたはメチルセルロース、抗ジ
ゴキシンモノクローナル抗体、脂肪酸非含有血清アルブ
ミン、および例えば１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−尿素を含む抗体緩衝液試薬を利用する
イムノアッセイは、患者の血清中のジゴキシンの量を測
定するための正確で信頼性のある検定システムを提供す
る。これは、使用する血清または血漿標本の容量が全試
薬の容量の４％未満である場合に、本発明のすべての試
薬について、および好適な試薬について特に当てはまる
ものであり、蛋白質除去、樹脂処理、限外濾過等のサン
プルの特別の予備処理を伴うことなく行うことができ
る。

【００７５】本発明の微粒子試薬を用い、光度計等の市
販の装置であって、自動化された、例えばサンプルおよ
び緩衝液（必要に応じて相補的な免疫反応体を含有す
る）の両者をキュベットに分注し、固体の感作した試薬
を混合しながらキュベットに分注する能力を有するもの
を用いれば、多数の患者のサンプルについて、短い時間
で優れた信頼性および感度をもって、血清の免疫反応体
の量を定量することができる。

【００７６】本発明の試薬およびイムノアッセイシステ
ム並びにこれらを使用する方法（一般的および好適な態
様の両者）によって与えられる優れた結果は、緩衝液試
薬中の（および／または所望に応じて感作した微粒子に
対して予め適用した）脂肪酸非含有血清アルブミンの使
用、および緩衝液試薬中の（および／または所望に応じ
て感作した微粒子上に吸着させた）２級または３級の非
特異的反応抑制剤の任意の使用を含む、前記した本発明
の幾つかの特徴から誘導されるものである。本発明の試
薬およびこれらを使用する方法は感度が高いために、少
量のサンプルであっても正確性および信頼性を維持する
ことができる。従来のイムノアッセイ試薬およびイムノ
アッセイは、サンプル容量が減少した場合は感度を犠牲
にしていたが、本発明の試薬およびこれらを使用するイ
ムノアッセイは、低いサンプル容量であっても高い感度
を維持するものである。

【００７７】

【実施例】以下の実施例は本発明を更に説明するもので
あるが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００７８】［ラテックス粒子の調製］凝縮器および攪
拌装置を備えた１０ガロンのガラス張り反応器に、８３
グラムの重炭酸ナトリウム、１４，０００グラムの脱イ
オン水、および界面活性剤（２２４グラムのＭＡ−８
０）を装填した。この混合物を１６０°Ｆに加熱し、ア
ルゴンを用いて１０分間パージした。２０８グラムのア
クリル酸および１１，２００グラムのスチレンを互いに
混合し、アルゴンでパージし、水相の頂部に装填した。
得られたエマルジョンを１０分間平衡化させた。

【００７９】３３．６グラムの過硫酸カリウムを２００
０グラムの脱イオン水に溶解し、アルゴンでパージし、
ガラス張り反応器に装填して重合を開始した。８時間後
に反応器を冷却して取出し、０．１３８μｍのカルボキ
シレート基を有する粒子の４０重量％懸濁物（２８，０
００グラム）を得た。イオメトリック滴定（iometricti
tration）を行ったところ、グラム当り０．９３１ミリ
当量の弱酸が認められた。

【００８０】［ジゴキシン試薬の調製］ （１）接合体の調製 Smith, T. W.ら、Biochemistry, 9, 331 (1970) および
Bulter, U. P. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S., 5
7, 71 1967 （両者とも参考としてここに援用する）の
改良方法に従い、ジゴキシン−ＨＳＡ接合体を調製し
た。代表的な手順は次の通りである：室温で２０ｍＬの
純メタノールに懸濁した０．５ｇのジゴキシン（シグマ
社製）に対し、２０ｍＬの０．１Ｍメタ過ヨウ素酸ナト
リウムを攪拌しながら滴下添加した。２５分後に０．６
ｍＬの１Ｍエチレングリコールを添加した。５分後に、
反応混合物を、２０ｍＬの水（ｐＨ９．５：Ｋ₂ ＣＯ₃
で調整したもの）中に０．６ｇのヒト血清アルブミン
（シグマ社製）を加えたものに、攪拌しながら滴下添加
した。これに、５％Ｋ₂ ＣＯ₃ を滴下添加することによ
り、水溶液のｐＨを９．０〜９．５の範囲に維持した。
４５分後にｐＨは安定し、これに２０ｍＬの水に新たに
溶解した０．３ｇのホウ化水素ナトリウムを添加した。
３時間後に、７．６ｍＬの１Ｍギ酸を添加してｐＨを
６．５に低下させ、１時間後にＮＨ₄ＯＨを添加するこ
とによりｐＨを８．５に上昇させた。その後、冷却した
流れる水道水に対して全反応混合物を４日間透析し、最
後に０．０５％ＮａＮ₃ を含む０．１ＭのＮａＨＣＯ₃
に対して透析した。溶液は冷蔵庫内で保存した。

【００８１】（２）感作した微粒子試薬の調製 （Ａ）ラテックス粒子のイオン交換処理 １００ｍＬの表面にカルボキシレート基を有するラテッ
クス粒子懸濁物（固体：１０％、直径：０．２９２μ
ｍ、カルボキシレート基量（／ｇ）：０．３１ｍｅｑ、
表面カルボキシレート占有領域：１０．５平方オングス
トローム、粒子はセラダイン社製）に対し、緩く攪拌し
ながら室温で２時間かけて、２０ｇの混合床イオン交換
樹脂（バイオラドＡＧ５０１−Ｘ８）を添加した。その
後、ガラス繊維フィルターを使用して懸濁物を濾過して
樹脂を除去した。これによって、ラテックス粒子を免疫
反応体と結合しうる状態とした。

【００８２】（Ｂ）ジゴキシン−ＨＳＡ接合体とラテッ
クス粒子との結合反応 ５０ｍＬのポリカーボネートの遠心分離チューブに対
し、１５ｍＬの０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液（ｐＨ８．
０）、および５ｍＬの前記洗浄した１０％固体ラテック
ス懸濁物を添加し、攪拌しながら３７℃で１０分間イン
キュベートしてから反応させた。８８ｍｇ／ｍＬの１−
エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボ
ジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、新たに水に溶解したもの）を
混合物に５ｍＬ添加し、ラテックス表面上のカルボキシ
ル残基を１０分間活性化した。活性化の後に、１０ｍｇ
／ｍＬの前記ジゴキシン−ＨＳＡ接合体を激しく攪拌し
ながら２．５ｍＬ添加し、１０分間インキュベートし
た。５００ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ８．５）を５ｍＬ
添加することにより反応を停止させた。更に１０分間イ
ンキュベートし、反応を完全に終了させた。

【００８３】（Ｃ）接合体を結合した（すなわち感作し
た）微粒子試薬の洗浄 ジゴキシン−ＨＳＡ接合体を結合したラテックス粒子を
２６，０００×ｇで２０分間遠心分離した。上澄を除去
し、ペレットに２５ｍＬの水を添加した。その後激しく
攪拌しながらペレットを再懸濁し、洗浄を４回繰返し
た。ただし、最後の再懸濁では、０．０５％のアジ化ナ
トリウム溶液を保存液として使用した。最後に、ラテッ
クス懸濁物を超音波処理し、直ちに使用できる濃度（通
常は０．１〜０．４％固体）に希釈した。

【００８４】（３）抗体試薬組成物の調製（実施例１〜
４で使用） 以下の材料を水に溶解し、塩酸でｐＨを調整することに
より、抗体試薬を調製した。尚、好ましい態様として、
抗体は最後に添加した。

【００８５】・３．７％のＮａＣｌ ・２００ｍＭのトリス−（ヒドロキシメチル）−アミノ
メタン（ｐＨ８．０） ・１．２％のデキストラン硫酸ナトリウム ・１ｍｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ） ・０．０５％のアジ化ナトリウム ・１：６０，０００に希釈した抗ジゴキシンマウスモノ
クローナル抗体（ビークマン社製）

【００８６】（４）抗ジゴキシン抗体緩衝液試薬組成物
の調製（実施例５〜１０で使用） 以下の材料を水に溶解し、塩酸でｐＨを調整することに
より、ジゴキシン抗体試薬を調製した。抗体は最後に添
加した。

【００８７】・４．３７５％のＮａＣｌ ・２５０ｍＭのビス−トリス（ｐＨ６．５） ・６．４％の塩化コリン ・１．２５〜１．７５％のデキストラン硫酸ナトリウム ・２．０％の脂肪酸非含有ヒト血清アルブミン（ＦＡＦ
−ＨＳＡ） ・２５ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）−尿素 ・０．１％のアジ化ナトリウム ・０．０１％の消泡剤１４１０（ダウ・コーニング社
製） ・１：８６，０００〜１２０，０００に希釈した抗ジゴ
キシンモノクローナル抗体

【００８８】［ジゴキシン阻害検定の条件および手順］
（実施例１〜４） 装置として、ＬＰＩＡ−１００（商標名）（三菱化学株
式会社）を検定のために使用した。また、検定条件は、
以下の通りとした。

【００８９】・標本容量：１０μｌ ・押出し緩衝液（０．９％ＮａＣｌ、０．０５％ＮａＮ
₃）容量：５０μｌ ・抗体試薬容量：２００μｌ ・微粒子試薬容量：４０μｌ ・波長：６５０または９５０ｎｍ

【００９０】また、ジコキシンの検定は、抗体と、抗原
を感作した微粒子との間の凝集反応の阻害に基くものと
した。ジゴキシンを含有する血清サンプルを、検定緩衝
液で希釈した抗ジゴキシン抗体と共に３７℃で１０分間
インキュベートした。インキュベートが終了したら、ジ
ゴキシンで被覆した微粒子試薬を添加し、占有されてい
ない抗体結合部位に結合させ、６５０または９５０ｎｍ
での吸光度が１０分間に増加した値により、凝集の速度
（反応速度）を測定した。尚、吸光度の増加速度は、血
清サンプル中のジゴキシン濃度に反比例して相関する。

【００９１】［化学分析装置の検定パラメーター］（実
施例５〜１０） 以下の表１に、使用した４種の装置の各検定パラメータ
ーを示した。

【００９２】

【表１】

【００９３】＜実施例１＞ （１）ジゴキシン試薬の検量曲線 前記した０．２９２μｍ直径の粒子を用いた微粒子試薬
に加えて、同じ粒子を用いて、且つより低い濃度のＥＤ
Ｃ（１１ｍｇ／ｍＬ）を使用して別の微粒子試薬を調製
した。また８８ｎｇ／ｍＬのＥＤＣを使用し、前述した
手順によって直径０．１８４μｍの粒子を用いた微粒子
試薬を調製した。この３つの試薬全てについて、そのジ
ゴキシン検量曲線を測定することによって評価した。図
１に、既知の濃度のジゴキシンサンプル（検量剤）を用
いてＬＰＩＡ−１００装置により６５０ｎｍでの吸光度
の増加の速度（反応速度）を測定して作成した、反応速
度とジゴキシン濃度との関係を表した検量曲線を示す。

【００９４】尚、図１中、□は粒子直径０．２９２μ
ｍ、ＥＤＣ濃度８８ｍｇ／ｍＬの場合の検量曲線を表
し、△は粒子直径０．２９２μｍ、ＥＤＣ濃度１１ｍｇ
／ｍＬの場合の検量曲線を表し、○は粒子直径０．１８
４μｍ、ＥＤＣ濃度８８ｍｇ／ｍＬの場合の検量曲線を
表す。

【００９５】これらの曲線は、より大きい粒度を有する
試薬がより高い感度を有すること（速度の絶対値が大き
い）、および、全ての検量曲線はジゴキシンの治療用途
上の許容範囲（０．５〜２．０ｎｇ／ｍＬ）を考慮した
場合に満足し得るものであることを示している。

【００９６】（２）０．１８４μｍ直径の粒子試薬の正
確性 図１によれば、０．１８４μｍの感作した粒子試薬が最
も感度が低い。しかしながら、この試薬はなお優れた性
能を有しており、表２に示すように優れた正確性を有す
るものである。

【００９７】

【表２】

【００９８】＜実施例２＞感作した表面にカルボキシレ
ート基を有するラテックス粒子１４種について、前記し
たジゴキシン阻害検定における分散性および反応性を比
較した。実施例１と同じ調製手順に基いて、微粒子試薬
の調製を行った。尚、サンプルとして０ｎｇ／ｍＬの血
清検量剤を使用して反応性を測定し、これを標準として
比較した。

【００９９】得られた結果を表３に示すが、これは高い
反応性および分散性を有する微粒子試薬を提供するには
適切なカルボキシレート基の占有率が重要であることを
示す。

【０１００】

【表３】

【０１０１】＜実施例３＞Smith （前記）によるウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）、および前記したヒト血清アル
ブミン（ＨＳＡ）を用いて、２つのジゴキシン接合体を
調製した。前述したように粒子を感作し、ＬＰＩＡ−１
００装置を使用して比較し、５０個の血清標本をＴＤｘ
（商標名：アボット社製）により予備評価した。前記し
た手順に従って０．１８４μｍの粒子を使用して感作し
たラテックス粒子を調製し、２つの異なるロットの抗ジ
ゴキシンモノクローナル抗体を使用して、得られる結果
が感作した粒子に起因するものであって、特定の抗体の
バッチに起因するものではないことを確認した。

【０１０２】図２および図４は、ジゴキシン−ＢＳＡ接
合体を用いて感作したラテックス試薬を用いて得られた
結果（黒点）を示す。図２および図４の結果は、異なる
抗体ロットを使用したものである。図３および図５は、
異なるロットの抗体を使用しジゴキシン−ＨＳＡを用い
て感作した粒子の結果（黒点）を示す。

【０１０３】尚、図２〜５中の△（三角印）は、既知濃
度のジゴキシンサンプル（検量剤）を用いたものを使用
してＬＰＩＡ−１００装置で測定して得られた結果であ
る。図２、３、４、および５で認められるように、抗体
のロットの差異は（あるとしても）試験に与える影響と
しては最小のものであり、ジゴキシン−ＨＳＡ接合体で
感作した微粒子は、ジゴキシン−ＢＳＡ接合体で感作し
た粒子よりも良好なデータの分布を示した。

【０１０４】＜実施例４＞ジゴキシン−ＨＳＡ接合体を
用いて感作した０．１８４μｍの粒子を使用し、カルボ
ジイミド縮合反応の後にグリシン処理を行って調製した
場合と、グリシン処理を行わないで調製した場合とで、
前記したジゴキシン検定を行った。この検定では、ＬＰ
ＩＡ−１００装置で５つの既知濃度の標準サンプルを測
定し、次いで３５の血清標本をＴＤｘ（商標名）法によ
り予備評価した後、ＬＰＩＡ−１００装置で試験した。
図６（グリシンの後処理を行わない場合）および図７
（グリシンの後処理を行った場合）に、検量曲線と併せ
てデータ分布のグラフとして結果を示す。

【０１０５】図６および図７に示すように、グリシン処
理により反応性は幾分低下する（すなわち、より低い速
度の値となる）が、サンプル分布は遥かに緊密となり、
よって試薬の正確性が改良されることがわかった。

【０１０６】本発明の微粒子イムノアッセイ試薬は、係
属中の米国出願08/194,475号（参考としてここに援用す
る）に記載された非特異的反応抑制剤をその表面に吸着
して有するか、またはこれを含む水溶液として提供する
ことができる。好ましくは別々の容器に２種の組成物を
含むキットを提供することもでき、一方の組成物が本発
明の微粒子試薬を含み、他方の組成物が米国出願08/19
4,475号に記載された非特異的反応抑制剤を含むものと
する。

【０１０７】＜実施例５＞前記表１に示した４つの装置
を使用したラテックス凝集阻害検定において、前記微粒
子試薬と緩衝液とを使用し、ジゴキシン濃度についてＴ
Ｄｘ（アボット社製）を用いて予め評価した患者の血清
標本を試験した。ＴＤｘ法により得られた結果に対して
前記４つの装置を用いて得られたデータをプロットし、
解析した。図８に、ＣＯＢＡＳ・ＦＡＲＡの装置を用い
て得られた結果を示す。図９に、ＣＯＢＡＳ・ＭＩＲＡ
の装置を用いて得られた結果を示す。図１０に、ＨＩＴ
ＡＣＨＩ７０４の装置を用いて得られた結果を示す。図
１１に、ＬＰＩＡ−１００の装置を用いて得られた結果
を示す。

【０１０８】図８〜１１に示すように、本発明による試
薬を用いて行ったラテックス凝集阻害検定は優れた結果
を与える。本発明の試薬を用いて得られた結果は、ＴＤ
ｘ系を用いて得られた結果に対して明らかに同程度良好
であるか、またはより良好である。

【０１０９】＜実施例６＞前記したものと同一の装置を
用い、バイオラドの品質調節血清またはロシェの検量剤
を使用し、正確性の検討を行った。表４に示されるよう
に、本発明の試薬により、１ｎｇ／ｍＬで変動係数
（Ｃ．Ｖ．）１０％という現在受容されている標準的な
ものよりも遥かに良好な正確性が与えられた。尚、表４
のデータは、３種類のジゴキシン濃度で１日毎に測定
し、これを１０日間（１０回）継続した結果である。

【０１１０】

【表４】

【０１１１】＜実施例７＞ＬＰＩＡ−１００装置（セラ
ダイン社製）を使用し、本発明の微粒子試薬の長期間の
安定性を評価した。全ての試薬および検量剤は４℃で保
存した。測定は次のように行った。すなわち、血清サン
プルと抗ジゴキシン抗体含有緩衝液とを３７℃で１０分
間インキュベートした。インキュベートが完了したら、
ジゴキシンを結合したラテックス試薬を添加し、占有さ
れていない抗体結合部位と結合させた。９５０ｎｍでの
吸光度の増加により凝集反応の速度を測定し、５分間の
吸光度の測定によって得られる反応速度の値（Ｖ₂₀）
を、時間（日）に対してプロットした（図１２）。図１
２の結果により示されるように、試薬は少なくとも９か
月間は安定であった。

【０１１２】＜実施例８＞前記した手順に従い、０．２
９６μｍおよび０．４３４μｍの直径を有する、ジゴキ
シンを結合したラテックス粒子を含む微粒子試薬を調製
した。ＴＤｘによってジゴキシン濃度について予め評価
した３５の患者サンプルを、ＬＰＩＡ−１００装置を使
用してラテックス凝集阻害検定で測定した。図１３〜図
１６に結果を示す。尚、図１３および図１４は０．２９
６μｍの粒子についてのものであり、図１５および図１
６は０．４３４μｍの粒子についてのものである。

【０１１３】図１３および図１５は、デュポン社製のＡ
ＣＡ（商標名）により測定したジゴキシン濃度に対する
ＬＰＩＡ−１００装置の速度データのプロットであり、
図１４および図１６は、デュポン社製のＡＣＡ（商標
名）により測定したジゴキシン濃度に対するに対する、
ＬＰＩＡ−１００装置により決定した同じサンプルのジ
ゴキシン濃度（ｙ軸）に対する反応速度のプロットであ
る。

【０１１４】＜実施例９＞０．１８４μｍの直径を有す
るラテックス粒子を用いた他は、前記した手順に従い、
ジゴキシン結合微粒子試薬を調製した。２０μｌのサン
プル容量でＬＰＩＡ−１００装置を使用し、以下の組成
を有する抗体緩衝液を使用してジゴキシン濃度について
３０の患者サンプルを評価した。

【０１１５】・０．９または３．５％の塩化ナトリウム ・０または４％の塩化コリン ・２００ｍＭのトリス−（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（ｐＨ７．５） ・１．２〜１．３％のデキストラン硫酸ナトリウム ・１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン ・０．０５％のアジ化ナトリウム ・１：４０，０００に希釈した抗ジゴキシンモノクロー
ナル抗体

【０１１６】図１７および図１８に、それぞれ０．９お
よび３．５％の塩化ナトリウムを用いて得られた結果を
示す（０％の塩化コリンを使用した）。また、図１９お
よび図２０に、それぞれ０および４％の塩化コリンを用
いて得られた結果を示す（３．５％の塩化ナトリウムを
使用した）。

【０１１７】＜実施例１０＞０．２９２μｍの直径を有
するラテックス粒子を用いた他は、前記した手順に従
い、ジゴキシンで感作した微粒子試薬を調製した。１０
μｌのサンプル容量を使用し、ＬＰＩＡ−１００装置を
用いて３５の患者サンプルを評価した。使用した抗体緩
衝液の組成は次の通りとした。

【０１１８】・３．５％の塩化ナトリウム ・２５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５〜７．５） ・０．１６％のメチルセルロース ・０．１〜４％の脂肪酸非含有ヒト血清アルブミン ・２５０ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−尿素 ・０．０５％のアジ化ナトリウム ・１：６０，０００に希釈した抗ジゴキシンモノクロー
ナル抗体

【０１１９】結果を図２１〜２４に示す。尚、図２１は
１．２５ｍｇ／ｍＬのＦＡＦ−ＨＳＡを使用した対照標
準であり、図２２、図２３、図２４は、それぞれ１０、
２０、４０ｍｇ／ｍＬのＦＡＦ−ＨＳＡを使用したもの
である。

【０１２０】

【発明の効果】本発明のイムノアッセイ試薬およびそれ
を使用するイムノアッセイ法は、感度が高いために、感
度が高く特異的で安定かつ信頼性があり、例えば少量の
サンプルであっても正確性および信頼性を維持すること
ができるなど、従来の検定方法の欠点を克服することが
できる。よって、例えばグリコシド系強心薬、特にジゴ
キシンおよびジギトキシンの検出等のために有用であ
る。

【０１２１】また、本発明によれば、臨床化学の分野で
有用な現在の市販の自動分析装置に適用可能な、感度が
高く特異的なイムノアッセイおよびそれに用いられるキ
ットを提供することができる。

【０１２２】更に、本発明の方法によれば、サンプルの
予備処理なしに、患者の血清ジゴキシンレベルを、高い
信頼性をもって簡単かつ効率的に決定することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の実施例１における、ジゴキシン−ヒ
ト血清アルブミン（ＨＳＡ）接合体が結合されたラテッ
クス粒子を用いた本発明の微粒子試薬の検量曲線を示す
図である。

【図２】 本発明の実施例３において、ジゴキシン−ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）接合体により感作したラテ
ックス粒子を用いた微粒子試薬を用いて、異なる抗体ロ
ットについて、検定した結果のひとつを示す図である。

【図３】 本発明の実施例３において、ジゴキシン−ヒ
ト血清アルブミン（ＨＳＡ）接合体により感作したラテ
ックス粒子を用いた微粒子試薬を用いて、異なる抗体ロ
ットについて、検定した結果のひとつを示す図である。

【図４】 本発明の実施例３において、ジゴキシン−ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）接合体により感作したラテ
ックス粒子を用いた微粒子試薬を用いて、異なる抗体ロ
ットについて、検定した結果のひとつを示す図である。

【図５】 本発明の実施例３において、ジゴキシン−ヒ
ト血清アルブミン（ＨＳＡ）接合体により感作したラテ
ックス粒子を用いた微粒子試薬を用いて、異なる抗体ロ
ットについて、検定した結果のひとつを示す図である。

【図６】 本発明の実施例４において、グリシンの後処
理を伴わない場合について、ジゴキシン−ＨＳＡ接合体
を用いて感作した本発明の微粒子試薬による検定結果を
示す図である。

【図７】 本発明の実施例４において、グリシンの後処
理を伴う場合について、ジゴキシン−ＨＳＡ接合体を用
いて感作した本発明の微粒子試薬による検定結果を示す
図である。

【図８】 本発明の実施例５において、ＴＤｘ（商品
名）法を用いて得られた検定結果（Ｘ軸）の関数とし
て、本発明のジゴキシン感作微粒子試薬（装置：ＣＯＢ
ＡＳ・ＦＡＲＡ）を用いて得られた結果（Ｙ軸）を示す
図である。

【図９】 本発明の実施例５において、ＴＤｘ（商品
名）法を用いて得られた検定結果（Ｘ軸）の関数とし
て、本発明のジゴキシン感作微粒子試薬（装置：ＣＯＢ
ＡＳ・ＭＩＲＡ）を用いて得られた結果（Ｙ軸）を示す
図である。

【図１０】 本発明の実施例５において、ＴＤｘ（商品
名）法を用いて得られた検定結果（Ｘ軸）の関数とし
て、本発明のジゴキシン感作微粒子試薬（装置：ＨＩＴ
ＡＣＨＩ７０４）を用いて得られた結果（Ｙ軸）を示す
図である。

【図１１】 本発明の実施例５において、ＴＤｘ（商品
名）法を用いて得られた検定結果（Ｘ軸）の関数とし
て、本発明のジゴキシン感作微粒子試薬（装置：ＬＰＩ
Ａ−１００）を用いて得られた結果（Ｙ軸）を示す図で
ある。

【図１２】 本発明の実施例７において、ジゴキシン感
作微粒子試薬および抗体緩衝液試薬の長期間の安定性を
示す図である。

【図１３】 本発明の実施例８において、０．２９６μ
ｍの粒子を使用し、ＬＰＩＡ−１００装置を使用した場
合のジゴキシン検定の結果（反応速度）を示す図であ
る。

【図１４】 本発明の実施例８において、０．２９６μ
ｍの粒子を使用し、ＬＰＩＡ−１００装置を使用した場
合のジゴキシン検定の結果（ジゴキシン濃度）を示す図
である。

【図１５】 本発明の実施例８において、０．４３４μ
ｍの粒子を使用し、ＬＰＩＡ−１００装置を使用した場
合のジゴキシン検定の結果（反応速度データ）を示す図
である。

【図１６】 本発明の実施例８において、０．４３４μ
ｍの粒子を使用し、ＬＰＩＡ−１００装置を使用した場
合のジゴキシン検定の結果（ジゴキシン濃度）を示す図
である。

【図１７】 本発明の実施例９において、ジゴキシン検
定における本発明の緩衝液に対する塩化ナトリウムの濃
度の効果を示すために、０．９％濃度の塩化ナトリウム
を使用した場合の検定結果を示す図である。

【図１８】 本発明の実施例９において、ジゴキシン検
定における本発明の緩衝液に対する塩化ナトリウムの濃
度の効果を示すために、３．５％濃度の塩化ナトリウム
を使用した場合の検定結果を示す図である。

【図１９】 本発明の実施例９において、ジゴキシン検
定における本発明の緩衝液に対する塩化コリンの効果を
示すために、０％濃度の塩化コリンを使用した場合の検
定結果を示す図である。

【図２０】 本発明の実施例９において、ジゴキシン検
定における本発明の緩衝液に対する塩化コリンの効果を
示すために、４％濃度の塩化コリンを使用した場合の検
定結果を示す図である。

【図２１】 本発明の実施例１０において、ジゴキシン
検定における本発明の緩衝液に対する脂肪酸非含有ヒト
血清アルブミン（ＦＡＦ−ＨＳＡ）の効果を示すため、
１．２５ｍｇ／ｍＬのＦＡＦ−ＨＳＡ（対照標準）を使
用した場合の結果を示す図である。

【図２２】 本発明の実施例１０において、ジゴキシン
検定における本発明の緩衝液に対する脂肪酸非含有ヒト
血清アルブミン（ＦＡＦ−ＨＳＡ）の効果を示すため、
１０ｍｇ／ｍＬのＦＡＦ−ＨＳＡを使用した場合の結果
を示す図である。

【図２３】 本発明の実施例１０において、ジゴキシン
検定における本発明の緩衝液に対する脂肪酸非含有ヒト
血清アルブミン（ＦＡＦ−ＨＳＡ）の効果を示すため、
２０ｍｇ／ｍＬのＦＡＦ−ＨＳＡを使用した場合の結果
を示す図である。

【図２４】 本発明の実施例１０において、ジゴキシン
検定における本発明の緩衝液に対する脂肪酸非含有ヒト
血清アルブミン（ＦＡＦ−ＨＳＡ）の効果を示すため、
４０ｍｇ／ｍＬのＦＡＦ−ＨＳＡを使用した場合の結果
を示す図である。

【符号の説明】

１・・・粒子直径０．２９２μｍ、ＥＤＣ濃度８８ｍｇ
／ｍＬの場合の検量曲線 ２・・・粒子直径０．２９２μｍ、ＥＤＣ濃度１１ｍｇ
／ｍＬの場合の検量曲線 ３・・・粒子直径０．１８４μｍ、ＥＤＣ濃度８８ｍｇ
／ｍＬの場合の検量曲線

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】表面にカルボキシレート基を有するラテッ
   クス粒子と前記粒子に共有結合で結合した免疫反応体と
   を含む感作した微粒子であって、前記ラテックス粒子が
   ０．１〜０．６μｍの直径および８〜３５平方オングス
   トロームの表面カルボキシレート占有領域を有すること
   を特徴とする、感作した微粒子。
2. 【請求項２】前記ラテックス粒子が、０．１８〜０．５
   μｍの直径を有する請求項１記載の微粒子。
3. 【請求項３】前記ラテックス粒子が、１０〜３０平方オ
   ングストロームの表面カルボキシレート占有領域を有す
   る、請求項２記載の微粒子。
4. 【請求項４】前記免疫反応体が、ハプテン−蛋白質接合
   体である、請求項１記載の微粒子。
5. 【請求項５】前記免疫反応体が、ジゴキシン−蛋白質接
   合体である、請求項４記載の微粒子。
6. 【請求項６】前記免疫反応体が、ジゴキシン−ヒト血清
   アルブミン接合体である、請求項４記載の微粒子。
7. 【請求項７】前記免疫反応体が、カルボジイミドの存在
   下、縮合反応を行うことによって、前記ラテックス粒子
   と共有結合で結合して得られるものである、請求項１記
   載の微粒子。
8. 【請求項８】前記カルボジイミドが、１−エチル−３−
   （３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸
   塩である、請求項７記載の微粒子。
9. 【請求項９】前記縮合反応の停止が、エタノールアミ
   ン、エチレンジアミン、グルコースアミン、グリシンお
   よびリジンよりなる群から選択される化合物を用いて行
   われる、請求項７記載の微粒子。
10. 【請求項１０】前記縮合反応の停止が、グリシンを用い
    て行われる、請求項７記載の微粒子。
11. 【請求項１１】請求項１記載の感作した微粒子と相補的
    な免疫反応体とを接触させる工程を含む、微粒子を用い
    たイムノアッセイ法。
12. 【請求項１２】２つの成分ＡおよびＢを含むキットであ
    って、成分Ａは請求項１記載の微粒子を含み、成分Ｂは
    緩衝剤、塩化ナトリウム、塩化コリン、多糖類および脂
    肪酸非含有血清アルブミンを含有する緩衝液を含むこと
    を特徴とするキット。
13. 【請求項１３】前記緩衝液が、下記一般式で表される非
    特異的反応抑制剤またはその酸付加塩を更に含むことを
    特徴とする、請求項１２記載のキット。 【化１】 （式中、Ｘは−ＮＨ−（ＣＯ）−ＮＨ−、−ＮＨ−（Ｃ
    Ｓ）−ＮＨ−、−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−または次の式で表される
    残基である。 【化２】 Ｒ₁およびＲ₂は同一でも異なってもよいＣ₁〜Ｃ₅の直鎖
    状若しくは分岐状アルキル基を表すか、またはＲ₁およ
    びＲ₂は窒素と共に次式で表される残基若しくはそのメ
    ト−ｐ−トルエンスルホン酸塩を形成するものである。 【化３】 Ｙは同一でも異なってもよく、Ｈ、ＯＨおよびハロゲン
    のいずれかである。Ｒ₃は−ＮＲ₁Ｒ₂、−ＮＨ₂、−ＣＨ
    Ｙ、シクロヘキシル基またはＨである。また、ｍは０〜
    ５の整数であり、ｐは０〜５の整数であり、ｎは０また
    は１である。但し、ｎが１の場合は、ｍおよびｐの少な
    くとも１つは少なくとも１であり、ｍ＝ｎ＝ｐ＝０の場
    合はＲ₃はＨまたは−ＣＨ₂Ｙである。）
14. 【請求項１４】前記非特異的反応抑制剤が、１−エチル
    −３−（３−ジメチルアミノプロピル）−尿素である、
    請求項１３記載のキット。
15. 【請求項１５】前記緩衝液が、１．０〜５．０重量％の
    塩化ナトリウム、１〜１５重量％の塩化コリン、０．２
    〜０．３重量％のデキストラン硫酸ナトリウム若しくは
    ０．０５〜１．０重量％のメチルセルロース（前記重量
    ％は前記緩衝液の全重量を基準とする）、および前記緩
    衝液の全容量を基準として５〜１００ｍｇ／ｍＬの脂肪
    酸非含有血清アルブミンを含む、請求項１２記載のキッ
    ト。
16. 【請求項１６】前記緩衝液が、相補的な免疫反応体を更
    に含む、請求項１５記載のキット。
17. 【請求項１７】前記相補的な免疫反応体が、抗ジゴキシ
    ンモノクローナル抗体である、請求項１６記載のキッ
    ト。
18. 【請求項１８】検出すべき分析対象を含むサンプルと、
    緩衝剤、塩化ナトリウム、塩化コリン、多糖類、脂肪酸
    非含有血清アルブミン、および必要に応じて下記一般式
    で表される非特異的反応抑制剤またはその酸付加塩を含
    む緩衝液とを混合して緩衝液−サンプル混合物を生成す
    る工程と、前記緩衝液−サンプル混合物と請求項１記載
    の微粒子とを接触させる工程とを含むことを特徴とす
    る、イムノアッセイ法。 【化４】 （式中、Ｘは−ＮＨ−（ＣＯ）−ＮＨ−、−ＮＨ−（Ｃ
    Ｓ）−ＮＨ−、−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−または次の式で表される
    残基である。 【化５】 Ｒ₁およびＲ₂は同一でも異なってもよいＣ₁〜Ｃ₅の直鎖
    状若しくは分岐状アルキル基を表すか、またはＲ₁およ
    びＲ₂は窒素と共に次式で表される残基若しくはそのメ
    ト−ｐ−トルエンスルホン酸塩を形成するものである。 【化６】 Ｙは同一でも異なってもよく、Ｈ、ＯＨおよびハロゲン
    のいずれかである。Ｒ₃は−ＮＲ₁Ｒ₂、−ＮＨ₂、−ＣＨ
    Ｙ、シクロヘキシル基またはＨである。また、ｍは０〜
    ５の整数であり、ｐは０〜５の整数であり、ｎは０また
    は１である。但し、ｎが１の場合は、ｍおよびｐの少な
    くとも１つは少なくとも１であり、ｍ＝ｎ＝ｐ＝０の場
    合はＲ₃はＨまたは−ＣＨ₂Ｙである。）
19. 【請求項１９】前記緩衝液が、相補的な免疫反応体を更
    に含む請求項１８記載の方法。
20. 【請求項２０】前記緩衝液が、１．０〜５．０重量％の
    塩化ナトリウム、１〜１５重量％の塩化コリン、０．２
    〜３．０重量％のデキストラン硫酸ナトリウム若しくは
    ０．０５〜１．０重量％のメチルセルロース（前記重量
    ％は前記緩衝液の全重量を基準とする）、および前記緩
    衝液の全容量を基準として５〜１００ｍｇ／ｍＬの脂肪
    酸非含有血清アルブミンを含む、請求項１８記載の方
    法。
21. 【請求項２１】前記緩衝液が、１．５〜４．５重量％の
    塩化ナトリウム、２〜１２重量％の塩化コリン、０．６
    〜２．０重量％のデキストラン硫酸ナトリウムまたは
    ０．１〜０．４重量％のメチルセルロース（前記重量％
    は緩衝液の全重量を基準とする）、および６０〜７５ｍ
    ｇ／ｍＬの脂肪酸非含有血清アルブミンを含む請求項１
    ９記載の方法。