JPH0725795B2 - ＧｎＲＨ拮抗物質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒトを含む哺乳動物の下垂体からの生殖腺刺激
ホルモンの放出を抑制するペプチド類、ならびに排卵を
抑えかつ／またステロイド類の放出を抑える方法に関す
る。詳細には、本発明は生殖腺機能およびステロイドホ
ルモン（プロゲステロンおよびテストステロン）の放出
を抑制するペプチド類に関する。

発明の背景 下垂体は視床下部として知られる脳の基底部に細い茎で
もつてつながつている。この下垂体からは生殖腺刺激ホ
ルモンと呼ばれる卵胞刺激ホルモン（FSH）および黄体
形成ホルモン（LH）が分泌される。これらのホルモンは
協働して生殖腺の機能を調節し、精巣でテストステロン
をそして卵巣でプロゲステロンとエストロゲンを産生す
る。これらはまた配偶子（生殖細胞）の発生および成熟
を調節する。

一般に、下垂体前葉からのホルモンの放出は視床下部に
よつて産生される別の種類のホルモンが前もつて放出さ
れることを必要とする。これらの視床下部ホルモンのう
ちの１種は生殖腺刺激ホルモン（特にLH）の放出を誘発
させる因子として作用し、本明細書ではこのホルモンを
GnRHと呼ぶことにするが、これはまたLH-RHおよびLRHと
も呼ばれている。GnRHは単離されて、次の構造： p-Glu-His-Trp-Ser-Try-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ で表わされるデカペプチドとして性状決定がなされた。

ペプチドとは２個またはそれ以上のアミノ酸を含み、そ
して一方のアミノ酸のカルボキシル基が他方のアミノ酸
のアミノ基に結合している化合物のことである。先に示
したGnRHのための式は、アミノ末端が左にそしてカルボ
キシル末端が右に記載されるペプチドの慣用表示法に従
つている。アミノ酸残基の位置は左から右へアミノ酸残
基に番号を付すことにより確認される。GnRHの場合は、
グリシンのカルボキシル基のOH部分がアミノ基（NH₂）
によつて置換されている。上記の個々のアミノ酸残基の
ための略号は慣用的であつてアミノ酸の俗名に基づいて
おり、例えば、p-Gluはピログルタミン酸、Hisはヒスチ
ジン、Trpはトリプトフアン、Serはセリン、Tyrはチロ
シン、Glyはグリシン、Leuはロイシン、Ornはオルニチ
ン、Argはアルギニン、Proはプロリン、Sarはサルコシ
ン、PheはフエニルアラニンおよびAlaはアラニンをそれ
ぞれ表わす。これらのアミノ酸は一般にバリン、イソロ
イシン、トレオニン、リシン、アスパラギン酸、アスパ
ラギン、グルタミン、システイン、メチオニン、フエニ
ルアラニンおよびプロリンと共に自然界に存在するアミ
ノ酸、すなわち蛋白質から誘導される普通のアミノ酸で
あると考えられる。グリシンを除いて、本発明ペプチド
の各アミノ酸は特に指示がない限りＬ体である。

雌性哺乳動物における排卵を抑制したい理由が多々存在
し、そして排卵を抑制しまた遅らせるためにGnRHの正常
機能に対して拮抗的に作用するGnRH類似体が投与されて
きた。こうして理由のために、GnRHの拮抗物質であるGn
RH類似体は避妊薬としてのそれらの使用可能性について
又は妊娠期間を調節することについて研究されつつあ
る。またGnRH拮抗物質は早発思春期症および子宮内膜症
の治療に使用することができる。この種の拮抗物質は更
に雄性哺乳動物の生殖腺刺激ホルモンの分泌を調節する
のに有用であることが見出され、そして例えば雄性哺乳
動物の避妊薬として精子形成を阻止するために、および
前立腺肥大の治療のために使用される。内因性GnRHに対
して強力な拮抗作用を示し、かつLHの分泌ならびに哺乳
動物の生殖腺からのステロイド類の放出を抑制する改善
されたペプチド類を提供することが望まれる。

発明の要約 本発明はヒトを含む哺乳動物の生殖腺刺激ホルモンの放
出を抑制するペプチド類を提供し、また雄性および雌性
哺乳動物の生殖腺からのステロイド類の放出を抑制する
方法を提供する。改善されたGnRH類似体はGnRHに対する
強力な拮抗物質であつて、哺乳動物の生殖過程に阻害作
用を示す。これらの類似体は早発思春期症、ホルモン依
存性新生物（腫瘍）、月経困難症および子宮内膜症を含
む種々の情況下で生殖腺刺激ホルモンおよび性ホルモン
の産生を阻止すべく使用される。

一般に、本発明によれば、ヒトを含む哺乳動物の下垂体
からの生殖腺刺激ホルモンの分泌を強く抑制し、かつ／
また生殖腺からのステロイド類の放出を阻止するペプチ
ドが合成された。これらのペプチドは好適にはデヒドロ
‐Proまたはβ‐（1-または2-ナフチル）‐D-アラニン
（以後はβ‐D-1NALまたはβ‐D-2NALと記す）の形の１
位置換；修飾D-Pheの形の２位置換；好適には置換D-Tr
p、D-3PALまたはβ‐D-NALの形の３位置換;5個より少な
い炭素原子をもつジアミノ酸の４位における任意置換；
（ａ）ハロゲン化またはメチル化L-PheまたはL-Tyr、も
しくは（ｂ）Argの形の５位における任意置換;Nle、NM
L,Phe,Nva,Met,Tyr,Trp,Cys,PALおよび4F-D-Pheのよう
な６位置換および７位の任意置換；が存在するGnRH類似
体である。２位の修飾D-Phsはベンゼン環に特定の修飾
が存在する結果として増大された拮抗作用を与える。ベ
ンゼン環の水素原子に代わる単一置換はパラ位または４
位においてなされ、そしてその置換基はクロル、フルオ
ル、ブロムおよびニトロ基より選択され、クロル、フル
オルおよびニトロ基が好ましい。ジクロル置換はベンゼ
ン環の2,4位または3,4位においてなされる。α‐炭素原
子もメチル化されてよく、例えば（Ｃ^αMe/4Cl）Pheで
あり得る。未置換のD-Trpまたはβ‐D-NALが３位に存在
する場合に、R₇はTyr,PAL,Pheまたは4F-D-Pheであるの
が好ましい。またD-3PALが３位に存在する場合にR₅はAr
gである。１位置換基はそのα‐アミノ基がアシル基、
例えばホルミル基（For），アセチル基、アクリリル
基、ビニルアセチル基（Vac）またはベンゾイル基（B
z）を含むように修飾されてもよく、この場合アセチル
基（Ac）およびアクリリル基（Acr）が好適である。PAL
およびD-PALはピリジル‐アラニンのL-およびD-異性体
を表わし、Alaのβ‐炭素原子が好ましくはピリジン環
の３位に結合しているものである。β‐D-NALが１位に
存在しかつR₅がArgでない場合は、4-NH₂-D-Phe,4-グア
ニド‐D-Phe,D-His,D-Lys,D-Orn,D-Arg,D-Har（ホモア
ルギニン）またはD-PALのような親水性D-アミノ酸が６
位に存在する方がよい。デヒドロ‐Proが１位に存在す
る場合は、D-Trp,D-Phe,For-D-Trp,NO₂-D-Trp,D-Leu,D-
Ile,D-Nle,D-Tyr,D-Val,D-Ala,D-Ser（OtBu），β‐D-N
ALまたは（imBzl）D-Hisのような親油性アミノ基のD-異
性体が６位に存在するのが好ましいが、D-PALを用いて
もよい。Glyに代わるD-Alaの10位置換は以後に述べるそ
の他の置換と共に任意に行いうると考えられる。

これらのペプチドはLHの放出を阻止するという優れた効
力を有するので、それらはしばしばGnRH拮抗物質と呼ば
れる。これらのペプチドは、それらを発情前期に極めて
低い用量で投与する場合、雌性哺乳動物の排卵を阻止
し、また妊娠直後に投与する場合受精卵の再吸収を引き
おこすのに有効である。さらに、これらのペプチドは雄
性哺乳動物の避妊処置に対しても有効である。

好適な実施態様の記述 GnRH拮抗作用を有するペプチド類は次の式Ｉで表わされ
る。

X-RA-（Ｗ）D-Phe-R₃-R₄-R₅-R₆-R₇-Arg-Pro-R₁₀ 〔式中、Ｘは水素原子または７個以下の炭素原子をもつ
アシル基であり;R₁はデヒドロ‐Pro,D-PGlu,D-Phe,4Cl-
D-Phe,D-Trp,Proまたはβ‐D-NALであり;WはCl,F,NO₂,G
^αMe/4Cl,Cl₂またはBrであり;R₃はD-3PAL,β‐D-NALま
たは（Ｙ）D-Trp（ここでＹはH,NO₂,NH₂,OCH₃,F,Cl,Br,
CH₃,NⁱⁿForまたはＮⁱⁿAcである）であり;R₄はSer,Orn,A
AL又はaBuであり;R₅はTyr,Arg,（3F）Phe,（2F）Phe,
（3I）Tyr,（3CH₃）Phe,（2CH₃）Phe,（3Cl）Phe又は
（2Cl）Pheであり;R₆は親油性アミノ酸のD-異性体であ
るか、或いは4-NH₂-D-Phe,D-Lys,D-Orn,D-Har,D-His,4-
gua-D-Phe,D-PALまたはD-Argであり;R₇はNie,Leu,NML,P
he,Met,Nva,Tyr,Trp,Cys,PALまたは4F-D-Pheであり；そ
してR₁₀はGly-NH₂,D-Ala-NH₂またはNH-Y¹（ここでY¹は
低級アルキル基、シクロアルキル基、フルオル低級アル
キル基またはNHCONH-Qであり、ＱはＨまたは低級アルキ
ル基である）である；但しR₃がD-3PALであるときR₅はAr
gであり、そしてR₃がβ‐D-NALまたはD-TrpであるときR
₇はTyr,PAL,Pheまたは4F-D-Pheである〕 R₁がβ‐D-NALであつてR₅がArgでないとき、R₆は4-NH₂-
D-Phe,D-Lys,D-Orn,D-Har,D-His,4-gua-D-Phe,D-PALま
たはD-Argであるのが好ましい。

β‐D-NALとはβ‐炭素原子がナフチル基で置換されて
いるアラニンのD-異性体を意味し、3-D-NALとも呼ばれ
る。好適にはβ‐D-2NALが使用され、ナフタリンへはそ
の環構造の２位で結合される。しかしβ‐D-1NALを使用
してもよい。PALはβ‐炭素原子がピリジル基で置換さ
れているアラニンを表わし、その結合はピリジン環の３
位においてなされることが好ましい。３位のD-Trpの場
合、水素原子に代わる単一置換は５位または６位で行わ
れ、その置換基はクロル、フルオル、ブロム、メチル
基、アミノ基、メトキシ基およびニトロ基より選択され
るがクロル、フルオルおよびニトロ基が好適である。ま
た、インドール窒素はアシル化されてもよく、例えばホ
ルミル基（ＮⁱⁿFor-または1For）またはアセチル基でア
シル化され得る。ＮⁱⁿFor-D-Trpおよび6NO₂-D-Trpが好
適な置換トリプトフアン残基である。未置換D-Trpが３
位に使用される場合、特定のアミノ酸残基、すなわちPh
eまたは4F-D-Phe,好適にはTyrまたはPALが７位に導入さ
れる。NMLとはＮ^αCH₃-L-Leuを意味する。AALはβ‐ア
ミノ‐Alaであり、そしてaBuはα，γ‐ジアミノ酪酸で
あつて、これらのうち何れかまたはOrnが４位に存在し
得る。Serが４位に存在しない場合にはデヒドロ‐Proが
１位に存在するのがよい。4-gua-D-Pheはバラ位がグア
ニジンで置換されているD-Pheの残基を意味する。

本発明は、次式： Ac-β‐D-2NAL-（4Cl）D-Phe-D-3PAL-Scr-Arg-R₆-Lcu-A
rg-Pro-D-Ala-NH₂ ［式中、R₆はD-Trp、D-3PAL、β‐D-2NAL、（imBzl）D-
Hisまたは6NO₂-D-Trpである］ で表されるペプチドまたはその無毒性付加塩を提供す
る。

上記の式において、好ましくは、R₆はD-3PLA、6NO₂-D-T
rp、または（imBzl）D-Hisである。

本発明ペプチドは基本的溶液合成法もしくはクロルメチ
ル化樹脂、メチルベンズヒドリルアミン（MBHA）樹脂、
ベンズヒドリルアミン（BHA）樹脂または当技術分野で
知られた他の適当な樹脂を使う固相法により合成するこ
とができる。固相法は米国特許第4211693号に詳細に説
明される方法でペプチド鎖にアミノ酸を段階的に付加さ
せることにより実施される。当技術分野で周知の如く、
側鎖保護基がSer,TyrおよびArgにおよび置換基のある種
のものに付加されるのが好ましく、また場合によりTrp
に付加されてもよく、その後これらのアミノ酸は樹脂上
に形成されつつあるペプチド鎖にカップリングされる。
この方法は充分に保護されたペプチド‐樹脂中間体を与
える。

GnRH拮抗作用を有するペプチドの中間体は次式で表わさ
れる。

X¹-R₁-（Ｗ）D-Phe-R₃-（X₂）‐R₄（X³）‐R₅（X⁴また
はX⁵）‐R₆（X⁵）‐R₇（X⁶）‐Arg（X⁵）‐Pro-X⁷ 式中、X¹はポリペプチドの段階合成法の分野で有用であ
ることが知られた型のα‐アミノ保護基であり、目的と
するペプチドのＸが特定のアシル基である場合にその基
は保護基として使用できる。X¹によつて包含されるα‐
アミノ保護基の例としては（１）アシル型保護基、例え
ばホルミル（For），トリフルオルアセチル、フタリ
ル、p-トルエンスルホニル（Tos）、ベンゾイル（B
z）、ベンゼンスルホニル、o-ニトロフエニルスルフエ
ニル、（Nps）、トリチルスルフエニルo-ニトロフエノ
キシアセチル、アクリリル（Acr）、クロルアセチル、
アセチル（Ac）およびγ‐クロルブチリル；（２）芳香
族ウレタン型保護基、例えばベンジルオキシカルボニル
（Ｚ）および置換ベンジルオキシカルボニル（例えばp-
クロルベンジルオキシカルボニル（ClZ）、p-ニトロベ
ンジルオキシカルボニル、p-ブロムベンジルオキシカル
ボニルおよびp-メトキシベンジルオキシカルボニル）；
（３）脂肪族ウレタン型保護基、例えばt-ブチルオキシ
カルボニル（Boc）、ジイソプロピルメトキシカルボニ
ル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニ
ルおよびアリルオキシカルボニル；（４）シクロアルキ
ルウレタン型保護基、例えばシクロペンチルオキシカル
ボニル、アダマンチルオキシカルボニルおよびシクロヘ
キシルオキカルボニル；（５）チオウレタン型保護基、
例えばフエニルチオカルボニル；（６）アルキル型保護
基、例えばアリル（Aly）、トリフエニルメチル（トリ
チル）およびベンジル（Bzl）；（７）トリアルキルシ
ラン基、例えば、トリメチルシラン；がある。好適なα
‐アミノ保護基はＸは水素原子であるときBocである。

X²は水素原子またはTrpのインドール窒素のための保護
基例えばベンジルである。しかし、大抵の合成ではTrp
を保護する必要がない。

X³は水素原子またはSerのアルコール性ヒドロキシル基
のための保護基であり、その保護基はアウセチル、ベン
ゾイル、テトラヒドロピラニル、t-ブチル、トリチル、
ベンジルおよび2,6-ジクロルベンジルよりなる群から選
択されるものであり、ベンジルが好適である。また、Se
rに代わつて置換が行われる場合には、X³は側鎖アミノ
基のための保護基、例えばTos、ＺまたはClZでありう
る。

X⁴は水素原子またはTyrが存在するときにはTyrのフエノ
ール性ヒドロキシル基のための保護基であり、その保護
基はテトラヒドロピラニル、t-ブチル、トリチル、ベン
ジル、Ｚ、4-ブロムベンジルオキシカルボニルおよび2,
6-ジクロルベンジルよりなる群から選択される。2,6-ジ
クロルベンジル（DCB）が好適である。

X⁵はArg,LysまたはHisなどの側鎖グアニジノ基、アミノ
基またはイミダゾール基のための保護基、例えばニト
ロ、Tos、トリチル、ベンジルオキシカルボニル、アダ
マンチルオキシカルボニル、ＺおよびBocであるか、或
いはX⁴のようなTyrのための保護基もしくはX²のようなT
rpのための保護基である。また、X⁵は水素原子であつて
もよく、この場合は側鎖基原子上に保護が存在しないこ
とを意味する。一般的にはTosが好ましい。

X⁶は水素原子、X⁴のようなTyrのための保護基またはCys
のための保護基であり、そのCys用保護基は好ましくはp
-メトキシベンジル（MeOBzl）、p-メチルベンジル、ア
セトアミドメチル、トリチルおよびBzlよりなる群から
選択される。最適な保護基はp-メトキシベンジルであ
る。

X⁷はGly-O-CH₂-〔樹脂支持体〕、‐O-CH₂-〔樹脂支持
体〕、D-Ala-O-CH₂-〔樹脂支持体〕、Gly-NH-〔樹脂支
持体〕またはD-Ala-NH-〔樹脂支持体〕であるか、また
はGlyもしくはD-AlaのOH、エステル、アミドまたはヒド
ラジドであるか、あるいはProに直接結合したOH、エス
テル、アミドまたはヒドラジドである。

側鎖保護基X²〜X⁶を選択するときの規準は、その保護基
が合成の各段階でα‐アミノ保護基を除去する反応条件
下に試薬に対して安定であるということである。側鎖保
護基はカツプリング条件下に切断されず、目的とするア
ミノ酸配列の合成完了時点にペプチド鎖を変性させない
反応応条件下で除去できなければならない。

X⁷がGly-O-CH₂-〔樹脂支持体〕、D-Ala-C-CH₂-〔樹脂支
持体〕またはO-CH₂-〔樹脂支持体〕である場合、ポリス
チレン樹脂支持体の多数の官能基のうちの１つのエステ
ル部分が表わされている。X⁷がGly-NH-〔樹脂支持体〕
またはD-Ala-NH-〔樹脂支持体〕である場合、アミド結
合がGlyまたはD-AlaとBHA樹脂もしくはMBHA樹脂とをつ
ないでいる。

最終の式においてＸが例えばアセチルである場合、それ
はD-NALまたは１位で使用されるその他のアミノ酸のα
‐アミノ基のためのX¹保護基として使用することがで
き、それはこの最後のアミノ酸をペプチド鎖へカツプリ
ングする前に付加される。しかしながら、反応は側鎖基
を保護したままでα‐アミノ保護基を除去した後の樹脂
上のペプチドを用いて、例えばジシクロヘキシルカルボ
ジイミド（DCC）の存在下での酢酸と、好適には無水酢
酸と反応させることにより、または当技術分野で知られ
た他の適当な反応により実施するのが好ましい。

充分に保護されたペプチドは当分野で周知のアンモノリ
シスによつてクロルメチル化樹脂支持体から切り離され
て、充分に保護されたアミド中間体を生成する。ペプチ
ドの保護基の除去、ならびにそのペプチドのベンズヒド
リルアミン樹脂からの切り離しは弗化水素酸（HF）を用
いて０℃で行うことができる。好適には、HFでの処理に
先だつてアニソールがペプチドに加えられる。真空下で
HFを除去した後、樹脂から切り離されかつ保護基を除去
されたペプチドは都合よくエーテルで処理され、デカン
トされ、希酢酸に溶解され、そして凍結乾燥される。

ペプチドの精製はCMCカラムでのイオン交換クロマトグ
ラフイー、その後のセフアデツクスG-25を充填したカラ
ムでn-ブタノール:0.1N酢酸（容量比1:1）の溶出系を使
用する分配クロマトグラフイーにより、または当技術分
野で知られかつJ.RivierらのJ.Chromatograpuy,288,303
〜328（1984）に詳細に説明されるHPLCを使つて行われ
る。

本発明ペプチドは雌ラツトの排卵を抑制するのに、発情
前期の日の正午頃に投与する体重1Kg当たり100μｇ以下
の量で有効である。排卵の長期抑制のためには、体重1K
g当たり約0.1〜2.5mgの投与量を使用する必要があるか
もしれない。これらの拮抗物質は更に、雄哺乳動物に定
期的に投与する場合、精子形成を抑えるのに有効であつ
て避妊薬として使用することができる。これらの化合物
はテストステロンレベルを低下させうる（これは正常
の、性的に活動する雄にとつて望ましくない結果であ
る）ので、GnRH拮抗物質と共に置換量のテストステロン
を投与することが合理的であるだろう。また、これらの
拮抗物質は先に示したような他の目的のために生殖腺刺
激ホルモン及び性ステロイド類の産生を調節するのに用
いられる。

参考例 Ｉ 表Ｉに示した次式： Ac-R₁-（4F）D-Phe-R₃-Ser-Tyr-R₆-Leu-Arg-Pro-R₁₀ のペプチドは既述の固相法によつて製造される。

１つの例として、〔Ac-β‐D-2NAL¹,（4F）D-Phe²,（6N
O₂）D-Trp³,D-Arg⁶〕‐GnRHと呼ばれる上記のペプチドN
o.1の代表的固相合成法を以下に述べる。このペプチド
は次式： Ac-β‐D-2NAL-（4F）D-Phe-（6NO₂）D-Trp-Ser-Tyr-D-
Arg-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂で表わされる。その他のペプ
チドも同様に合成され、精製される。

BHA樹脂を使用し、そしてこの樹脂にBoc-保護GlyをCH₂C
l₂中２時間にわたって３倍過剰のBoc誘導体と活性化試
薬BCCを用いてカツプリングさせる。グリシン残基はBHA
樹脂にアミド結合で定着する。

各アミノ酸残基のカツプリング後、洗浄、保護基の除去
ならびに次のアミノ酸残基のカツプリングは自動合成機
を使用しまた約5gの樹脂から開始することにより以下の
スケジユールに従つて実施される。

段階13の後、アリコートを採取してニンヒドリン試験を
行い、もしこの試験が陰性であるときには次のアミノ酸
のカツプリングのために段階１へ戻り、もしこの試験が
陽性または僅かに陽性であるときには段階９〜13へ戻つ
て繰り返し行う。

上記のスケジユールは最初のアミノ酸が結合した後に本
発明ペプチドの各アミノ酸をカツプリングさせる際に使
用される。Ｎ^αBoc保護は合成全般にわたつて残存する
各アミノ酸に対して用いられる。Ｎ^αBoc-β‐D-2NALは
当技術分野で知られた方法、例えば米国特許第4234571
号（1980年11月18日付）に詳細に記載されるようにして
製造できる。Argの側鎖はTosで保護する。OBzlはSerの
ヒドロキシル基の側鎖保護基として用いる。（6NO₂）D-
Trpは保護しないでおく。Ｎ^αBoc-β‐D-2NALは最後の
アミノ酸として導入する。Boc-Arg（Tos）およびBoc-
（6NO₂）D-TrpはどちらもCH₂Cl₂での溶解性が低いのでD
MF:CH₂Cl₂混合溶媒を用いてカツプリングする。

N-末端のα‐アミノ基の保護基を除去した後、ジクロル
メタン中の大過剰の無水酢酸を用いてアセチル化を行
う。樹脂からのペプチドの切り離しならびに側鎖保護基
の完全な除去はHFを用いて０℃で簡単に行われる。HF処
理に先だつてスキヤベンジヤーとしてアニソールを加え
る。真空下にHFを除去した後樹脂を50％酢酸で抽出し、
洗液を凍結乾燥して粗ペプチド粉末を得る。

次に、CMCカラム（ワットマンCM32,50/50メタノール／
水中の0.05〜0.3M NH₄OAcの勾配を使用）でのイオン交
換クロマトグラフイー、その後のn-ブタノール:0.1N酢
酸（容量比1:1）の溶出系を用いるゲル過カラムでの
分配クロマトグラフイーによりペプチドの精製を行う。

ペプチドは薄層クロマトグラフイーと数種の異なる溶剤
系を用いて、ならびに逆相高圧液体クロマトグラフイー
と燐酸トリエチルアンモニウム水溶液プラスアセトリル
を用いて均質であるかどうか判定する。得られた精製ペ
プチドのアミノ酸分析は実質的にペプチド鎖中の各アミ
ノ酸のための整数値を示し、用意した構造式と一致す
る。施光度は光電偏光計で測定して▲〔α〕²² _D▼＝−3
1.8゜±１（ｃ＝1,50％酢酸）である。

このペプチドはインビボ検定を行い、またインビトロで
試験してもよい。インビトロ試験を行う場合には検定に
先立つて４日間培養したラツト下垂水の解離細胞が用い
られる。ペプチドの施用に応答して影響をうけるLHレベ
ルはラツトLHに対して特異的なラジオイムノアツセイで
検定する。細胞の対照皿は３ナノモルのGnRHのみを受け
取り、一方実験皿は３ナノモルのGnRHと、0.01〜10ナノ
モルの濃度範囲の比較目的用の標準拮抗物質すなわち
〔Ac-デヒドロPro¹,（4F）D-Phe²,D-Trp^3,6〕‐GnRHま
たは試験ペプチドの何れか一方とを受け取る。GnRHのみ
で処理したサンプルのLH分泌量はペプチドプラスGnRHで
処理したサンプルのLH分泌量と比較する。３ナノモルの
GnRHによつて放出されたLH量を低下させる試験ペプチド
の効力は標準ペプチドのそれと比較する。インビボ試験
は雌ラツトの排卵を抑制するその有効性について測定す
る。この試験では、Sprague-Dawley系の成熟雌ラツトの
一定数すなわち６匹（体重は各々225〜250gである）
に、発情前期の日の正午頃トウモロコシ油中のペプチド
を一定用量（μｇ）注射する。発情前期は排卵の日の午
後である。別の雌ラツト群はペプチドを投与しないで対
照として使用する。対照雌ラツトは各々発情前期の夜に
排卵し、そして処理ラツトのうち排卵するものの数を記
録する。各ペプチドは極めて低用量で雌ラツトの排卵抑
制に非常に有効であると考えられ、また各ペプチドは約
５μｇの用量で完全に有効であると考えられる。より低
い用量で追加の試験を行い、その結果を、試験に用いた
ペプチドの物理的性状とともに以下の表Ａに示す。

表Ｉに示したペプチドは全てある適当な濃度でインビト
ロでのGnRH-誘導LH分泌を阻止するのに有効であると思
われる。これらのペプチドの多くはインビボにおいて標
準ペプチドよりもさらに強い効力を有する。これらのペ
プチドは全て極めて低い用量で雌性哺乳動物の排卵を抑
制すると考えられ、そして若干の選ばれたペプチドは試
験された既知GnRH拮抗物質の少なくとも２倍の効力を有
すると思われる。

参考例 II 表IIに示した次式： Ac-β‐D-2NAL-（Ｗ）D-Phe-R₃-R₄-R₅-D-Arg-R₇-Arg-Pr
o-D-Ala-NH₂ のペプチドは既述の固相法によつて製造される。

表IIに示したペプチドのインビトロおよび／またはイン
ビボ試験は、これらのペプチドが適当な濃度でインビト
ロでのGnRH-誘導LH分泌を阻止するのに有効であること
を示す。これらのペプチドの多くはインビボにおいて標
準ペプチドよりも更に強い効力を有する。これらのペプ
チドは全て極めて低い用量で雌性哺乳動物の排卵を抑制
すると考えられる。

参考例 III 表IIIに示した次式： X-β‐D-2NAL-（4Cl）D-Phe-（6NO₂）D-Trp-Ser-R₅-R₆-
NML-Arg-Pro-R₁₀ のペプチドは既に述べた固相合成法により製造される。

表IIIに示したペプチドのインビトロおよび／またはイ
ンビボ試験は、これらのペプチドが適当な濃度でインビ
トロでのGnRH-誘導LH分泌を阻止するのに有効であるこ
とを示す。これらのペプチドの多くはインビボにおいて
標準ペプチドよりも更に強い効力を有する。ペプチドは
全て極めて低い用量で雌性哺乳動物の拝卵を抑制すると
考えられる。

参考例 IV 表IVに示した次式： Ac-R₁-4Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-R₆-R₇-Arg-Pro-R₁₀-NH
₂ のペプチドは既に述べた固相合成法によつて製造され
る。

〔Ac-β‐D-2NAL¹,4Cl-D-Phe²,D-Trp³,D-Arg⁶,Nle⁷,D-A
la¹⁰〕‐GnRHと呼ばれる上記のペプチドNo.45は次式： Ac-β‐D-2NAL-4Cl-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-D-Arg-Nle-Ar
g-Pro-D-Ala-NH₂ で表わされる。

合成ペプチド類の旋光度は50％酢（ｃ＝１）中で光電偏
光計を用いて測定され、その結果を後述の表Ｂに報告す
る。

表IVに示した全てのペプチドは適当な濃度でインビトロ
でのGnRH-誘導LH分泌を阻止するのに有効であると考え
られる。これらのペプチドの多くはインビボにおいて標
準ペプチドよりも更に強い効力を有する。ペプチドは全
て極めて低い用量で雌性哺乳動物の排卵を抑制すると思
われ、ある種の選ばれたペプチドは試験された既知GnRH
拮抗物質と少なくとも同程度の効力を有すると考えられ
る。

参考例 Ｖ 表Ｖに示した次式： Ac-R₁-（Ｗ）D-Phe-R₃-Ser-Tyr-R₆-R₇-Arg-Pro-D-Ala-N
H₂ のペプチドは既に述べた固相合成法によつて製造され
る。

表Ｖに示したペプチドのインビトロおよび／またはイン
ビボ試験は、これらのペプチドが適当な濃度でインビト
ロでのGnRH-誘導LH分泌を阻止するのに有効であること
を示す。これらのペプチドの多くはインビボにおいて標
準ペプチドよりも強い効力を有する。ペプチドは全て極
めて低い用量で雌性哺乳動物の排卵を抑制すると考えら
れる。

参考例 VI 表VIに示した次式： X-R₁-4F-D-Phe-D-Trp-Ser-Tyr-R₆-R₇-Arg-Pro-D-Ala-NH
₂ のペプチドは既に述べた固相合成法によつて製造され
る。

表VIに示したペプチドのインビトロおよび／またはイン
ビボ試験は、これらのペプチドが適当な濃度でインビト
ロでのGnRH-誘導LH分泌を阻止するのに有効であること
を示す。これらのペプチドの多くはインビボにおいて標
準ペプチドよりも強い効力を有する。これらのペプチド
は全て極めて低い用量で雌性哺乳動物の排卵を抑制する
と考えられる。

参考例 VII 表VIIに示した次式： Ac-R₁-（Ｗ）D-Phe-R₃-R₄-Tyr-R₆-Leu-Arg-Pro-D-Ala-N
H₂ のペプチドは既に述べた固相合成法によつて製造され
る。

表VIIに示したペプチドのインビトロおよび／またはイ
ンビボ試験は、これらのペプチドが適当な濃度でインビ
トロでのGnRH-誘導LH分泌を阻止するのに有効であるこ
とを示す。これらのペプチドの多くはインビボにおいて
標準ペプチドよりも強い効力を有する。これらのペプチ
ドは全て極めて低い用量で雌性哺乳動物の排卵を抑制す
ると考えられる。

各種のペプチドについてのインビボ試験がいろいろな用
量で行われ、その結果を表Ｂに示す。

実施例 Ｉ 表VIIIに示した次式： Ac-R₁-R₂-D-3PAL-Ser-Arg-R₆-R₇-Arg-Pro-R₁₀ のペプチドは既に述べた固相合成法によつて製造され
る。

表VIIIに示したペプチドは雌ラツトの排卵を抑制するそ
れらの有効性についてインビボで試験される。それらの
全ては極めて低い用量で雌ラツトの排卵を抑制し、約10
μｇの用量で完全に有効であると考えられる。多くのペ
プチドに対して更に低い用量でインビボ試験が実施され
た。また、インビトロヒスタミン放出試験は、ラット肥
満細胞を用い、フツク（W.A.Hook）らの、Fed.Proc.,Fe
d.Am.Soc,Exp,Biol.,1985,44,1323および、カールテン
（M.J.Karten）らの、In LHRH and Its Analogs,Vol.2,
Nestor,J.,Vickery,B.,Eds.,MTp:Lancaster,1987に記載
の周知の方法にしたがって実施された。その結果を以下
の表Ｃに示す。

本発明のペプチドは薬学的に許容される無毒性塩、例え
ば酸付加塩または亜鉛、バリウム、カルシウム、マグネ
シウム、アルミニウムなどの金属との錯体（本明細書で
はこれも付加塩として考える）の形で、あるいはこれら
２つの組合せの形でしばしば投与される。このような酸
付加塩の例としては塩酸塩、臭化水素塩、硫酸塩、燐酸
塩、硝酸塩、蓚酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、タン
ニン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香
酸塩、コハク酸塩、アルギン酸塩、リンゴ酸塩、アスコ
ルビン酸塩、酒石酸塩などがある。例えば、ペプチドの
水溶液を1N酢酸と繰り返し処理し、その後凍結乾燥する
ことにより酢酸塩が生成する。活性成分を錠剤の形で投
与する場合にその錠剤は結合剤（例えばトラガカント、
トウモロコシ殿粉またはゼラチン）、崩壊剤（例えばア
ルギン酸）および滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシ
ウム）などの薬学的に許容される希釈剤を含みうる。液
剤の形で投与する場合には甘味料および／または風味料
を薬学的に許容される希釈剤の一部として使用してもよ
く、また等張塩水や燐酸緩衝液での静脈内投与を行うこ
ともできる。

医薬組成物は通常ペプチドと共に薬学的に許容される慣
用の担体を含むだろう。一般に、投与量は静脈内投与の
場合、患者の体重1Kg当たりペプチド約１〜100μｇであ
り、経口投与量はこれよりも多くなるだろう。結局、こ
れらのペプチドでの患者の治療は他のGnRH拮抗物質を用
いる臨床治療と同じ方法で行われる。

これらのペプチドは生殖力の抑制および／または調節を
行うために、あるいは例えば早発思春期症の管理や放射
線療法もしくは化学療期間中のような生殖腺の活動を可
逆的に抑制する必要がある場合に、哺乳動物に対して静
脈内、皮下、筋肉内、経口的または経皮的（例えば鼻腔
内、腟内）に投与される。有効投与量は投与形体および
治療をうける個々の哺乳動物の種類により変化するだろ
う。１つの代表的な投与形体の例は静菌ペプチド水溶液
であつて、この溶液は約0.1〜2.5mg/Kg（体重）の用量
で投与される。ペプチドの経口投与は固体または液体の
形のいずれかで行われる。

本発明は好適な実施態様に関して述べてきたが、当技術
分野で通常の知識を有する者にとつて明らかな種々の変
更ならびに修飾が添付の特許請求の範囲に記載される本
発明の範囲から逸脱することなくなされうることは理解
されるだろう。例えばペプチドの有効性を有意に損うこ
とのない当技術分野で知られた他の置換を本発明ペプチ
ドにおいて使用することができる。D-Phe²残基のフエニ
ル環の置換が３位および2,4位に存在してもよく、これ
らは均等物と考えられる。同様に、D-2PALおよびD-4PAL
はD-3PALの均等物と考えられる。C-末端において、Pro⁹
は一般に均等物と考えられる次の部分:Gly-OCH₃,Gly-OC
H₂CH₃,Sar-NH₂またはNH-Y¹（ここでY¹は低級アルキル
基、特にエチル基、シクロアルキル基、フルオル低級ア
ルキル基またはNHCONHQであり、ＱはＨまたは低級アル
キル基である）のうちの１つへ結合される。Sarはサル
コシンを意味する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−126852（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−181047（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−162562（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−14568（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−46253（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−35550（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−186948（ＪＰ，Ａ) 米国特許4215038（ＵＳ，Ａ)

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次式： Ac-β‐D-2NAL-（4Cl）D-Phe-D-3PAL-Scr-Arg-R₆-Lcu-A
   rg-Pro-D-Ala-NH₂ ［式中、R₆はD-Trp、D-3PAL、β‐D-2NAL、（imBzl）D-
   Hisまたは6NO₂-D-Trpである］ で表されるペプチドまたはその無毒性付加塩。
2. 【請求項２】R₆がD-3PALである、特許請求の範囲第１項
   のペプチド。
3. 【請求項３】R₆が6NO₂-D-Trpである、特許請求の範囲第
   １項のペプチド。
4. 【請求項４】R₆が（imBzl）D-Hisである、特許請求の範
   囲第１項のペプチド。