JPH0714352B2 - ポリエステル共重合体の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、３−ヒドロキシブチレート単位（以下3HB成
分と記す）と４−ヒドロキシブチレート単位（以下4HB
成分と記す）を含有する共重合体の製造法に関し、更に
詳しくは、ポリエステルを蓄積できる微生物を用いて製
造される3HB成分、4HB成分からなる新規の共重合ポリエ
ステルの製造法に関する。

〔従来の技術〕

ポリ−３−ヒドロキシブチレート（PHB）は、エネルギ
ー貯蔵物質として数多くの微生物の菌体内に蓄積され、
優れた生物分解性と生体適合性を示す熱可塑性高分子で
あることから、環境を保全する“クリーン”プラスチッ
クとして注目され、手術糸や骨折固定用材などの医用材
料および医薬や農薬を徐々に放出する徐放性システムな
どの多方面への応用が長年にわたり期待されてきた。特
に近年、合成プラスチックが環境汚染や資源循環の観点
から深刻な社会問題となるに至り、PHBは石油に依存し
ないバイオポリマーとして注目されている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、PHBは耐衝撃性に劣るとゆう物性上の問
題とともに、生産コストが高いことから工業的生産が見
送られてきた。

近時、3HB成分および３−ヒドロキシバリレート単位
（以下3HV成分と記す）を含有する共重合体およびその
製造法について、研究、開発がなされ、たとえば、特開
昭57−150393号公報および特開昭59−220192号公報にそ
れぞれ記載されている。

しかしながら、共重合体の3HV成分が０から33モル％ま
で増大するとこの増大に伴って融解温度（Tm）が180℃
から85℃まで急激に低下することが知られており〔T.L.
Bluhm et al,Macromolecules,19,2871（1986）〕そのた
め、3HV成分含有率の高い共重合体は耐熱性に劣ってい
た。

一方、本発明者は、3HB成分および4HB成分を含有する共
重合体およびその製造法について研究、開発を行ない、
先に出願した（特願昭62−204538）。かかる共重合体は
4HB成分の共重合成分含有率が高い場合でも、高い融点
を有することから工業的な価値は高い。しかしながら、
この方法では炭素源として高価な試薬を使う必要があっ
たため、工業的に容易に入手できる汎用の炭素源を見い
出すことに対する極めて高い要請があった。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者は、以上の点を鑑み、3HB成分および4HB成分か
らなる共重合体を工業的に有利にかつ容易に製造すべく
鋭意検討した結果、後段の窒素もしくはリンを制限する
培養において1,4−ブタンジオールの存在下でPHB生産能
を有する微生物を培養するとこの菌体中に所望の共重合
体が生成・蓄積されるとの新知見を得て、本発明に到達
した。

すなわち本発明は、ポリ−３−ヒドロキシブチレート生
産能を有するアルカリゲネス属菌を前段で菌体を増殖さ
せ、後段で該菌体を窒素あるいはリンの制限下で培養し
て該菌体内にポリ−３−ヒドロキシブチレートを生成・
蓄積させるに際して、後段の培養を1,4−ブタンジオー
ルの存在下で行なうことを特徴とする３−ヒドロキシブ
チレート単位および４−ヒドロキシブチレート単位から
なるポリエステル共重合体の製造方法に存する。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明において、共重合体に含有される3HB成分および4
HB成分はそれぞれの次式であらわされる。

本発明で使用される微生物は、PHB生産能を有する微生
物であれば特に制限はないが、実用上は、たとえば、ア
ルカリゲネス フェカリス（Alcaligenes faecalis），
アルカリゲネス ルーランディィ（Alcaligenes ruhlan
dii），アルカリゲネス ラタス（Alcaligenes latu
s），アルカリゲネス アクアマリヌス（Alcaligenes a
quamarinus）およびアルカリゲネス ユウトロフス（Al
caligenes eutrophs）等のアルカリゲネス属などがあ
る。

これらの菌種に属する菌株の代表例として、アルカリゲ
ネス フェカリスATCC8750,アルカリゲネス ルーラン
デイイATCC15749,アルカリゲネス ラタスATCC29712,ア
ルカリゲネス アクアマリヌスATCC14400ならびにアル
カリゲネス ユウトロフスＨ−16ATCC17699およびこの
Ｈ−16株の突然変異株であるアルカリゲネス ユウトロ
フスNCIB11597,同NCIB11598,同NCIB11599,同NCIB11600
などを挙げることができる。これらのうち、実用上、ア
ルカリゲネス ユウトロフスＨ−16ATCC17699およびア
ルカリゲネス ユウトロフスNCIB11599が特に好まし
い。

アルカリゲネス属に属するこれらの微生物の菌学的性質
は、たとえば、“BERGEY′S MANUAL OF DETERMINATIVE
BACTERIOLOGY:Eighth Edition,The Williams ＆ Wilkin
s Company/Baltimore"に、また、アルカリゲネス ユウ
トロフスＨ−16の菌学的性質は、たとえば、“J.Gen.Mi
clobiol.,115,185〜192（1979）にそれぞれ記載されて
いる。

これらの微生物は、従来の方法と同様に、主として菌体
を増殖させる前段の培養と、窒素もしくはりんを制限し
て菌体内に共重合体を生成、蓄積させる後段の培養との
２段で培養される。

前段の培養は、微生物を増殖させる為の通常の培養法を
適用することができる。すなわち、使用する微生物が増
殖し得る培地および培養条件を採用すればよい。

培地成分は、使用する微生物が資化し得る物質であれば
特に制限はないが、実用上は、炭素源としては、たとえ
ば、メタノール、エタノールおよび酢酸などの合成炭素
源、二酸化炭素などの無機炭素源、酵母エキス、糖蜜、
ペプトンおよび肉エキスなどの天然物、アラビノース、
グルコース、マンノース、フラクトースおよびガラクト
ースなどの糖類ならびにソルビトール、マンニトールお
よびイノシトールなど、窒素源としては、たとえば、ア
ンモニア、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合
物および／または、たとえば、尿素、コーン・スティー
ブ・リカー、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、肉エキ
スなどの有機窒素含有物ならびに無機成分としては、た
とえば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、
ナトリウム塩、りん酸塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩、
銅塩、モリブデン塩、コバルト塩、ニッケル塩、クロム
塩、ほう素化合物およびよう素化合物などからそれぞれ
選択される。

また、必要に応じて、ビタミン類なども使用することが
できる。

培養条件としては、温度は、たとえば、20〜40℃程度、
好ましくは25〜35℃程度とされ、また、pHは、たとえ
ば、６〜10程度、好ましくは6.5〜9.5程度とされる。こ
のような条件で好気的に培養する。

これらの条件をはずして培養した場合には、微生物の増
殖は比較的悪くなるが、これらの条件をはずして培養す
ることを妨げない。

培養方式は、回分培養または連続培養のいずれでもよ
い。

前段の培養によって得られた菌体を、さらに窒素および
／またはりん制限条件下で培養する。

すなわち、前段の培養で得られた培養液から微生物の菌
体を、過および遠心分離のような通常の固液分離手段
により分離回収し、この菌体を後段の培養に付するか、
または、前段の培養において、窒素および／またはりん
を実質的に枯渇させて、菌体を分離回収することなく、
この培養液を後段の培養に移行させることによってもで
きる。

この後段の培養においては、培地または培養液に窒素お
よび／またはりんを実質的に含有させず、1,4−ブタン
ジオールを炭素源として含有させること以外は前段の培
養と異なるところはない。

尚、培養液に1,4−ブタンジオールを含有させる場合
は、培養の初期ないし後期のどの時点でもよいが、培養
の初期が好ましい。

本発明に用いられる1,4−ブタンジオールは、共重合体
を生成させることができ、かつ微生物の生育を阻害しな
いような量であればよく使用した微生物の菌株および所
望の共重合割合（モル比）などによって異なるが、一般
的には培地もしくは培養液１に３〜40g程度が適当で
ある。

この後段の培養においては1,4−ブタンジオールを唯一
の炭素源としてもよいが、使用した微生物が資化し得る
他の炭素源、たとえば、グルコース、フラクトース、メ
タノール、エタノール、酢酸、プロピオン酸、ｎ−酪
酸、乳酸および吉草酸などを共存させることもできる。
たとえば、グルコースを使用する場合には、多くても1.
5g/程度とされる。

このように培養して得られた培養液から、過および遠
心分離などの通常の固液分離手段によって菌体を分離回
収し、この菌体を洗浄、乾燥して乾燥菌体を得、この乾
燥菌体から、常法により、たとえば、クロロホルムのよ
うな有機溶剤で生成された共重合体を抽出し、この抽出
液に、たとえば、ヘキサンのような貧溶媒を加えて、共
重合体を沈澱させる。

本発明の製造法によれば、共重合体中の3HB成分、4HB成
分の割合は任意に調節することができる。

〔実施例〕

本発明を、実施例によりさらに具体的に説明する。な
お、本発明は、これらの実施例に限定されるものではな
い。

実施例１〜５及び比較例１〜３ アルカリゲネス ユウトロフスH16（ATCC17699）を使用
して共重合体を製造した。すなわち、 前段培養： つぎの組成を有する培地で前記の微生物を30℃で24時間
培養し、対数増殖期終期の培養液から遠心分離により菌
体を分離した。

前段培養用培地の組成 酵母エキス 10g ポリペプトン 10g 肉エキス 5g （NH₄）₂SO₄ 5g これらを脱イオン水１に溶解し、pH7.0に調整した。

後段培養： 前段培養で得られた菌体を、つぎの組成を有する培地
に、１あたり5gの割合で懸濁させ30℃で48時間培養
し、得られた培養液から遠心分離により菌体を分離し
て、菌体を得た。

後段培養用培地の組成 0.5M りん酸水素カリウム水溶液 39.0ml 0.5M りん酸水素二カリウム水溶液 53.6ml 20wt/V％ 硫酸マグネシウム水溶液 1.0ml 炭素源^＊ ミネラル溶液^＊＊ 1.0ml ＊ 炭素源として後記表１に記した様な種々の化合物を
用いた。（単位g/培地） ＊＊ ミネラル溶液 CoCl₂ 119.0mg FeCl₃ 9.7g CaCl₂ 7.8g NiCl₂ 118.0mg CrCl₂ 62.2mg CaSO₄ 156.4mg を0.1N−HCl1に溶解 これらを脱イオン水１に溶解し、pH7.0に調整した。

菌体の処理： 後段培養で得られた菌体を蒸溜水で洗浄し、引続きアセ
トンで洗浄し、これを減圧乾燥（20℃、0.1mmHg）して
乾燥菌体を得た。

共重合体の分離回収： このようにして得られた乾燥菌体から熱クロロホルムで
共重合体を抽出し、この抽出液にヘキサンを加えて共重
合体を沈澱させ、この沈澱を取、乾燥して共重合体を
得た。

共重合体の特性： このようにして得られた共重合体の組成、固有粘度、融
解温度および融解熱を、つぎのようにして測定した。す
なわち、 組成:¹H NMRスペクトルによる。

固有粘度〔η〕:30℃、クロロホルム中。

測定結果などを第１表に示す。

尚、実施例２で得られた共重合体の500MHz¹ H−NMRスペクトルを図１に、125MHz¹³ C−NMRスペクトルを図２に各々示した。

〔発明の効果〕 本発明によれば、3HB成分、4HB成分を含有する新規のポ
リエステル共重合体を容易に得ることができる。

さらに本発明で得られた共重合体は、優れた種々の特性
を有しているので、手術糸および骨折固定用材などの医
用材料の原料として極めて好適であり、また徐放性シス
テムへの利用などの多方面への応用が期待される。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例２で得られた共重合体の500MHz、¹H−NMR
スペクトルであり、図２は同じく実施例２で得られた共
重合体の125MHz、¹³C−NMRスペクトルである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ポリ−３−ヒドロキシブチレート生産能を
   有するアルカリゲネス属菌を前段で菌体を増殖させ、後
   段で該菌体を窒素あるいはリンの制限下で培養して該菌
   体内にポリ−３−ヒドロキシブチレートを生成・蓄積さ
   せるに際して後段の培養を1,4−ブタンジオールの存在
   下で行なうことを特徴とする３−ヒドロキシブチレート
   単位および４−ヒドロキシブチレート単位からなるポリ
   エステル共重合体の製造方法。