JPH0699322B2 - 傷の治癒 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 この発明は傷の治癒に関係する。成長因子は標的細胞の
限定的集団を刺激するポリペプチドホルモンである。成
長因子の例は、血小板由来成長因子（PDGF）、インシュ
リン様成長因子（IGF−Ｉ）、トランスホーミング成長
因子β（TGF−β）、トランスホーミング成長因子α（T
GF−α）、上皮細胞成長因子（EGF）及び繊維芽細胞成
長因子（FGF）、そしてインターロイキン１（IL−１）
を含む。PDGFは、循環性血小板中の顆粒中に見出される
陽イオン性の熱安定性蛋白質であり、イン・ビトロでの
蛋白質合成及び繊維芽細胞によるコラーゲンの産生を刺
激することが知られている。それは又イン・ビトロで繊
維芽細胞及び平滑筋細胞に対する分裂促進剤及び走化性
物質としても作用することが知られている。

イン・ビボでの傷の治癒促進にPDGFを用いることは提案
されている。例えば、Grotendost（1984）J.Trauma 24
巻、549-52頁には、コラーゲンゲルをしみ込ませてラッ
トの背中に移植したHunt-Schillingワイヤーメッシュチ
ャンバーにPDGFを加えるとPDGFが新しいコラーゲンの合
成を増加させることを見出したと記載してある。しかし
ながら、Leitzelら（1985）J.Dermatol.Surg.Oncol.11
巻、617-22頁では、ハムスターでは、PDGFを単独で用い
ても又はFGF及びEGFと組み合わせても通常の傷の治癒を
加速出来なかった。

Michaeliら（1984）は、Soft and Hard Tissue Repair
（Hunt,T.K.ら編）、Praeger Publishers、New York、3
80-394頁で、血小板に富む血漿から得られたPDGFの部分
的精製標品の投与がウサギの角膜への移植に際して血管
形成を刺激することを報告している。PDGFは血管成長因
子ではないので、この研究者は、彼らの部分精製PDGF標
品中の未知の因子がこの血管形成効果の原因であると示
唆している。Lynchらは、傷の治癒における血小板由来
成長因子の役割：他の成長因子との共力効果、Proc.Not
l.Acad.Sci.U.S.A.、84巻、7696-7700頁及び傷の治癒に
おける成長因子（1989）、J.Clin.Invest.、84巻、640-
646頁で、組換えPDGFを含む精製したPDGF標品が傷の治
癒の研究において結合組織及び上皮層の再生に有意の効
果を生じさせないということを示した。対照的に、精製
したPDGFをIGF−１、IGF−II又はTGFのいずれかと組み
合わせた場合には、結合組織再生及び上皮再生の両方に
おいて劇的な共力効果が見られた。IGF−Ｉ又はII或はT
GF−α単独での投与は結合組織及び上皮層の再生におい
て何ら有意の効果を生じなかった。インターロイキン１
は、リンパ球及びマクロファージを含む幾つかの種類の
細胞により普通に産生される成長因子（又はサイトカイ
ン）である（Kaplanら、インターロイキン１と傷害への
応答、（1989）Immunol.Res.、８巻、118-129頁）。精
製した生物学的に活性なIL−１は約17.5Kdの分子量を有
する。それは同じ生物活性を有するがアミノ酸配列にお
いて有意に異なる二つの形態（α及びβ）で生じる。こ
こでは、“IL−1"という用語はIL−１α及びIL−１β並
びに両イソ型（isoform）の大きい前駆体型を含む。IL
−１は好中球及び単核細胞に特徴的であり、組織培養に
おいて繊維芽細胞及び角化細胞のイン・ビトロでの増殖
を刺激する（Kaplanら）。それは上皮細胞のイン・ビト
ロでの培養において化学誘因物質でもあり（Martinet
ら、上皮細胞の化学誘引物質の固定と特徴付け、J.Inve
st.Dermatol.、90巻、122-126頁、1988年）、細胞外の
グリコサミノグリカン組成の変化を誘導する（Bronson
ら、皮膚の瘢痕由来の培養繊維芽細胞におけるインター
ロイキン１に誘導されたグリコサミノグリカン組成の変
化、Collagen Res.、８巻、1988年、199-208頁）。

発明の要約 一般的に、この発明は哺乳類、例えばヒトの患者の外傷
の効果的な量の精製したPDGF及び精製したIL−１、又は
精製したIGF−１及び精製したIL−１の組み合わせを含
む配合物による治癒を記載する。IL−１は天然の源から
単離出来るが、或はより好ましくは組換え技術により生
産出来る。この発明の配合物は、上皮及び結合組織の成
長及び全蛋白質及びコラーゲンの合成を促進することに
より傷の治癒を少なくとも部分的に助成する。この発明
の配合物を用いる傷の治癒は、この処理をしない（即ち
外因性因子を投与しない）場合又は精製したPDGF単独、
精製したIGF−１単独又は精製したIL−１単独で処理し
た場合に達成されるものよりも効果的である。この発明
の好ましい配合物は、製薬上容認出来るキャリアー物
質、例えば市販の不活性のゲル又は膜又は液体中での、
精製したPDGF及びIL−１（両方とも市販されている）の
組み合わせにより調製される。傷の治癒を促進するため
の第二の配合物は精製したIGF−１及びIL−１の製薬上
容認出来るキャリアー中での組み合わせにより調製され
る。最も好ましくは精製したPDGF及びIL−１又はIGF−
１及びIL−１を重量比1:25〜25:1、好ましくは1:10〜1
0:1で組み合わせる。精製したPDGFはヒト血小板から或
は組換えDNA技術により得られる。従って、“PDGF"とい
う用語により、我々は血小板由来の及び哺乳類、好まし
くは霊長類起源の組換えによる物質の両方を意味し、霊
長類は好ましくはヒトであるがチンパンジーその他の霊
長類でも良い。組換えPDGFは組換えヘテロ２量体であっ
て良く、培養原核又は真核細胞に両サブユニットをコー
ドするDNA配列を挿入し、次いで翻訳されたサブユニッ
トに細胞によるプロセッシングを受けさせてヘテロ２量
体を形成することにより作られる。或は、一方のサブユ
ニットをコードするDNA（好ましくはβ又は“2"鎖）を
細胞に挿入することも出来、その場合は培養によりホモ
２量体PDGF（PDGF−１又はPDGF−２のホモ２量体）が作
られる。

ここでのPDGF、IGF−１又はIL−１についての“精製し
た”という用語は、他のものに混ぜる前において、90重
量％以上ということであり、即ち、それが天然において
結合している他の蛋白質、脂質及び炭水化物を実質的に
含まないということである。

精製した蛋白質標品は、一般に、各PDGF、IGF−１又はI
L−１成分について、ポリアクリルアミドゲル上に主要
な単一バンドを生じる。最も好ましくは、この発明の配
合物中で用いる精製したPDGF、IGF−１又はIL−１は、
アミノ末端のアミノ酸配列分析により純粋であることが
判定されたものが良い。

この発明の配合物は哺乳類の外傷、例えば床ずれ、裂傷
及び火傷の治癒のための早くて効果的な方法を与える。
この配合物は自然の（即ち、外因性因子を加えない）治
癒に比べて、或は精製したPDGF、IGF−１又はIL−１を
単独で加えた場合と比べて結合組織の形成を増進する。
精製したPDGF、IGF−１又はIL−１を単独で加えた場合
と異なり、PDGF/IL−１又はIGF−1/IL−１の配合物は新
しい結合組織及び上皮組織の両方で有意の増加を促進
し、得られる上皮層は自然治癒又はIL−１単独使用によ
り作られるものより厚く、かつ又それを新しい結合組織
に結合させ、よりしっかりと結合させて保護する、より
多くの上皮突起（epithelial projection）を含む。

この発明の他の特徴及び利点は下記の好ましい具体例の
説明及び請求の範囲から明らかとなろう。

好ましい具体例の説明 我々は今この発明の好ましい具体例を述べる。

外傷、例えば床ずれ及び火傷は、この発明により、精製
したPDGF及びIL−１又は精製したIGE−１及びIL−１を
組み合わせることにより調製されるPDGF/IL−１又はIGF
−1/IL−１混合物で処置する。天然の又は組換えIL−１
はＲ＆D System（Minneapolis、Minnesota）、Genzyme
（Boston、Massachusetts）及びCollaborative Researc
h（Waltham、Massachusetts）から市販されている。精
製した組換えPDGF及びヒト血小板由来の精製したPDGFは
PDGF Inc.（Boston、MA）、Collaborative Reseach（Wa
ltham、MA）、Genzyme（Boston、MA）及びAmgen（Thous
and Oaks、CA）から市販されている。精製したPDGFは又
下記のようにしても調製出来る。洗浄したヒト血小板ペ
レット500〜1000単位を1M NaClに懸濁（2ml/血小板単
位）し、100℃で15分間加熱する。次いで、その上清を
遠心分離し、沈殿を1M NaClで２回抽出する。

抽出物を合わせ、0.08M NaCl−0.01Mリン酸ナトリウム
緩衝液（pH7.4）に対して透析し、その緩衝液で平衡化
したCM−セファデックスＣ−50と４℃で一晩混合する。
次に、この混合物をカラム（５×100cm）に注ぎ、0.08M
NaCl−0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）で十分
洗い、1M NaClで溶出して10mlずつの画分を集める。

活性な画分をプールし、0.3M NaCl−0.01Mリン酸ナト
リウム緩衝液（pH7.4）に対して透析し、遠心分離し
て、0.3M NaCl−0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
4）で平衡化した４℃の2.5×25cmのブルーセファロース
（Pharmacia）のカラムに通す。次いで、そのカラムを
この緩衝液で洗い部分精製されたPDGFを1M NaClとエチ
レングリコールの1:1溶液で溶出する。

部分精製したPDGF画分を1M NaClで希釈（1:1）し、1M
酢酸に対して透析し、凍結乾燥する。凍結乾燥試料を
0.8M NaCl−0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）に
再懸濁し、この緩衝液で平衡化したCM−セファデックス
Ｃ−50の1.2×40cmカラムに通す。次いで、PDGFをNaCl
勾配（0.08〜1M）で溶出する。

活性な画分を合わせ、1M酢酸に対して透析し、凍結乾燥
し、そして少量の1M酢酸に溶かす。0.5mlを取り、1M酢
酸で平衡化したバイオゲルＰ−150（100〜200メッシ
ュ）の1.2×100cmカラムにかける。次いで、PDGFを1M酢
酸で溶出し、2mlずつの画分を集める。

100〜200mgの蛋白室を含む各活性画分を凍結乾燥し、10
0mlの0.4％トリフルオロ酢酸に溶かし、フェニルボンダ
パック（Bondapak）カラム（Waters）上での高性能液体
クロマトグラフィーにかける。線形アセトニトリル勾配
（０〜60％）での溶出は純粋PDGFを生じる。

組換えDNA技術により作られるPDGFは下記のようにして
調製出来る： ヒト血小板に由来する血小板由来成長因子（PDGF）は、
二つのポリペプチド配列を含む（PDGF−１及びPDGF−２
ポリペプチド、Antoniades,H.N.とHunkapiller,M（198
3）Science、220巻、963−965頁）。PDGF−１は第７染
色体上に局在する遺伝子によりコードされ（Betsholtz,
Cら、Nature、320巻、695-699頁）、PDGF−２は第22染
色体上に局在する（Dalla−Favera,R（1982）、Science
218巻、686-688頁）sisオンコジーンによりコードされ
る（Doolittle,Rら（1983）Science、221巻、275-277
頁）。sis遺伝子は、PDGF−２ポリペプチドに密接に関
係しているサル肉腫ウィルス（SSV）のトランスホーミ
ング蛋白質をコードしている。ヒトの細胞性ｃ−sisも
又PDGF−２鎖をコードしている（Rao,C.D.ら、（1986）
Proc.Natl.Acad.Sci.USA、83巻、2392-2396頁）。PDGF
の二つのポリペプチド鎖が離れた染色体上に局在化した
二つの異なる遺伝子によりコードされているので、ヒト
PDGFは、PDGF−１及びPDGF−２のジスルフィド結合され
たヘテロ２量体、又は二種のホモ２量体（PDGF−１の２
量体及びPDGF−２の２量体）或はヘテロ２量体と二種の
ホモ２量体との混合物からなる可能性がある。

PDGF−２鎖をコードする遺伝子を含むサル肉腫ウィルス
に感染した哺乳類の培養細胞は、PDGF−２ポリペプチド
を合成し、そのプロセッシングを行ってジスルフィド結
合されたホモ２量体を生じることが示された（Robbins,
K.ら、（1983）Nature、305巻、605-608頁）。更に、PD
GF−２ホモ２量体はヒトPDGFに対する抗血清と反応す
る。更に、分泌されたPDGF−２ホモ２量体の機能的特性
は、培養繊維芽細胞におけるDNA合成を刺激する点、185
kdの細胞膜蛋白質のチロシン残基のリン酸化を誘導する
点、及びヒト（¹²⁵I）7PDGFと特異的な細胞表面のPDGF
レセプターを競合出来る点で血小板由来PDGFの機能特性
と似ている（Owen,A.ら、（1984）Science、225巻、54-
56頁）。正常ヒト培養細胞（例えば、ヒト動脈内皮細
胞）に由来する、又はsis/PDGF−２遺伝子を発現してい
るヒト悪性細胞に由来するsis/PDGF−２遺伝子産物に類
似の特性が見られた（Antoniades,H.ら、（1985）Cance
r Cells、３巻、145-151頁）。

組換えPDGF−２ホモ２量体（ここでは、組換えPDGFとし
て参照する）はｃ−sis/PDGF−２遺伝子のcDNAクローン
を発現ベクターを用いてマウス細胞へ導入することによ
り得られる。発現用に用いるｃ−sis/PDGF−２クローン
は正常ヒト培養内皮細胞か得られた（Collins,T.ら、
（1985）Nature、216巻、748-750頁）。

傷の治癒 PDGF/IL−１及びIGF/1/IL−１混合物の傷の治癒の促進
効果を決定するために、下記の実験を行った。

若い白い体重10〜15kgとヨークシャー豚（Parson's Far
m,Hadley,MA）を手術の少なくとも６時間前に絶食さ
せ、それから麻酔をかけた。無菌条件下で、背中と胸部
の毛を刈り、剃り、そして温和な石けんと水で洗った。
傷をつける部位をそれから70％アルコールで消毒した。

1cm×1.5cmの傷を、改変Castroviejo電気槍状刀（elect
rokeratome）（Storz,St.Louis,MO、Brownells,Inc.に
より改変）を用いて深さ0.7mmにつけた。この傷により
上皮並びにその下の真皮の一部は完全に除去された（第
二度の火傷に匹敵）。個々の傷は少なくとも15mmの傷を
受けていない皮膚により離された。同じ処理を受ける傷
は一つのグループとして編成され他のグループから少な
くとも2cm離された。成長因子処理を受けない傷は、そ
の処理を受ける傷から少なくとも5cm離された。傷を直
に生体適合性のゲルに懸濁された下記の成長因子の単一
投与により処理した：（１）500ng−1.0μｇの純粋な組
換えPDGF（高性能液体クロマトグラフィーにより精
製）、（２）500ng−1.0μｇの組換えIL−１αと組み合
わせた500ng−1.0μｇの純粋な組換えPDGF、（３）500n
g−1.0μｇの組換えIL−１α単独、（４）500ng−1.0μ
ｇのIGF−１と組み合わせた500ng−1.0μｇのIL−１
α、（５）500ng−1.0μｇのIGF−１単独。

バイオプシー検体を傷を付けてから７日後に採取した。

組織学的評価 組織学的検体は標準パラフィン含浸・包埋技術を用いて
調製した。４μの切片を作り、過したハリスヘモトキ
シリン及びアルコール性エオシンで染色した。次いで、
それらを顕微鏡下で観察した。すべての検体を二人の研
究者が切片中に等しく分布した点を盲目的に記録した。
上皮及び結合組織層の広さを計数用パッドと作図用チュ
ーブ（drawing tube）を用いて記録した。

結果 組織学的評価からの結果は、精製した組換えPDGFと精製
した組換えIL−１を組み合わせて処理した傷は、処理さ
れない傷、ヒトIL−１単独で又は純粋なPDGF単独で処理
された傷よりも厚い結合組織及び上皮層及びこれらの層
を結合させるより広い上皮突起を有し、細胞性を増すと
いうことを示した。精製したIGF−１と精製したIL−１
を組み合わせて処理した傷は、IGF−１単独又はIL−１
単独で処理した傷より、厚い結合組織を有し、コラーゲ
ン繊維を増した。新しく合成された傷を付けた組織の全
体の厚さは、図１及び図２に示してある。棒の“空白”
部分により付加的効果が示されており、付加的効果を上
回る効果、即ち共力効果は棒の平行斜線を付けた部分で
示される。PDGF/IL−１又はIGF−1/IL−１のいずれかで
処理した傷における新しく合成された組織の全体の厚さ
及び細胞性の増加は、これらの処理がこれらの因子の個
々の効果から予想されるよりも大きな組織成長及び急速
な傷の治癒を促進するということを示す。

他の具体例は下記の請求の範囲に含まれる。

図面の簡単な説明 図１は、PDGFとIL−１との共力作用を示すグラフであ
る。

図２は、IGF−ＩとIL−１との共力作用を示すグラフで
ある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アントニアデス，ハリー エヌ. アメリカ合衆国 02158 マサチューセッ ツ，ニュートン，マグノリア ドライブ 21 (72)発明者 リンチ，サミュエル イー. アメリカ合衆国 02130 マサチューセッ ツ，ジャメイカ プレイン，ジャメイカ ウェイ 224，ナンバー ７

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】精製した血小板由来成長因子及び精製した
   インターロイキン１を含む、哺乳類の外傷を治癒させる
   ための配合物。
2. 【請求項２】精製したインシュリン様成長因子Ｉ及び精
   製したインターロイキン１を含む、哺乳類の外傷を治癒
   させるための配合物。
3. 【請求項３】精製した血小板由来成長因子及び精製した
   インターロイキン１を重量比1:25〜25:1で含む、請求の
   範囲第１項に記載の配合物。
4. 【請求項４】上記の比が1:10〜10:1である、請求の範囲
   第３項に記載の配合物。
5. 【請求項５】精製したインシュリン様成長因子Ｉ及び精
   製したインターロイキン１を重量比1:25〜25:1で含む請
   求の範囲第２項に記載の配合物。
6. 【請求項６】上記の比が1:10〜10:1である、請求の範囲
   第５項に記載の配合物。
7. 【請求項７】傷の治癒のための配合物の製造方法であっ
   て、精製した血小板由来成長因子及び精製したインター
   ロイキン１を重量比1:25〜25:1で混ぜることを含む製造
   方法。
8. 【請求項８】傷の治癒のための配合物の製造方法であっ
   て、精製したインシュリン様成長因子Ｉ又はII及び精製
   したインターロイキン１を重量比1:25〜25:1で混ぜるこ
   とを含む製造方法。