JPH0657156B2 - 新糖蛋白質の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規な主としてヒト顆粒球系細胞のコロニー形
成をさせるために必要な、特異的な刺激因子、すなわち
コロニー刺激因子（以下「ＣＳＦ」と略記する）活性を
有する糖蛋白質、及びその製造方法に関する。

〔従来の技術〕

２層軟寒天培養法で、上層に標的細胞として骨髄細胞
を、下層に腎細胞や胎児細胞を入れて培養すると、上層
の細胞の一部が増殖分化し、好中球系顆粒球（以下「顆
粒球（granulocyte）」と称す）や単球マクロファージ
からなるコロニーが形成されることから、生体内にコロ
ニー形成を促進する因子が存在することが知られていた
（PluznikとSach；Ｊ．Cell．Comp．Physiol，66巻319
頁(1965)，BradleyとMetcalf：Aust．Ｊ．Exp．Biol．M
ed．Sci．44巻287頁(1966)）。

ＣＳＦと総称されるこの因子は、正常に広く生体内分布
する細胞、たとえば、Ｔ細胞、単球マクロファージ、繊
維芽細胞、内皮細胞などより産生されることが知られて
いる。ＣＳＦには顆粒球・単球マクロファージの幹細胞
に作用して、その増殖を刺激し分化を誘導して、軟寒天
中で顆粒球や単球マクロファージから成るコロニーを形
成させる作用をもつ顆粒球−単球マクロファージＣＳＦ
（ＧＭ−ＣＳＦと略記する）、主として単球マクロファ
ージのコロニーを形成させる作用をもつ単球マクロファ
ージＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦと略記する）より未分化な多能
性幹細胞に作用する多能性ＣＳＦ（ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ
と略記する）、あるいは本発明の如き、主として顆粒球
系コロニーを形成させる作用をもつ顆粒球ＣＳＦ（Ｇ−
ＣＳＦと略記する）などのサブクラスが存在し、それぞ
れのサブクラスによって標的細胞の分化段階も異なるこ
とが考えられる様になってきた［Asano：代謝−Metabol
ism and Disease，22巻249頁(1985)，Yunis等；“Growt
h and Maturation Factors”edited by Guroff，John W
iley＆Sons，NY，１巻，209頁(1983)］。従って個々の
サブクラスを精製し、その化学的性状や生物学的性状を
より詳細に調べることは造血機構や種々の血液学的疾患
の病態の解析にきわめて重要なことである。

中でもＧ−ＣＳＦの生物学的作用として、骨髄性白血病
細胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢進が注目されてお
り、特に白血病の治療と予防へのＧ−ＣＳＦの臨床的有
用性が大いに期待されてきた。

〔発明が解決しようとする問題点〕

Ｇ−ＣＳＦの単離精製のために従来行われてきた試み
は、細胞培養法を用いてその培養上清からＧ−ＣＳＦを
単離する方法であるが、Ｇ−ＣＳＦが低濃度しか産生さ
れないこと、大量の培養液から微量のＧ−ＣＳＦを得る
には複雑な精製過程を必要とするなどの難点をかかえ未
だ大量の均一なＧ−ＣＳＦを得るには至っていなかっ
た。従って、組換えＤＮＡ技術を用いてＧ−ＣＳＦを大
量に製造することが渇望されていた。

〔問題点を解決するための手段〕

かかる状況において、本発明者らはヒトＧ−ＣＳＦ活性
を有するポリペプチドをコードする遺伝子を単離し、当
該遺伝子を宿主細胞内で発現することに成功した。

本発明は請求項１記載の糖蛋白質の製造方法、即ち、ヒ
ト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する特定のアミノ酸
配列をコードする塩基配列を含有するヒト染色体由来の
遺伝子を得、次にこれを組み込んだ組換えベクターを調
製した後、該ベクターを用いて宿主哺乳動物細胞を形質
転換し、次いで得られた形質転換株を培養し、その培養
物から目的糖蛋白質を採取することを特徴とする上記の
ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する糖蛋白質の製
造方法を提供するものである。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明で用いられるヒトＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペ
プチドをコードする遺伝子としては、ショ糖密度勾配遠
心法により15〜17S画分として得られる、ヒトＧ−ＣＳ
Ｆ活性を有するポリペプチドをコードするメッセンジャ
ーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が
ある。

本出願人は２系列のこのようなｃＤＮＡを得た。そのう
ちの１つの系列のｃＤＮＡは図３(B)のポリペプチドＩ
又はIIをコードする遺伝子或いはその一部を有するもの
であり、更に詳細には図３(A)の塩基配列の５′−末端
から32〜34ヌクレオチド位のＡＴＧから650〜652ヌクレ
オチド位のＣＣＣまでの配列、122〜124位のＡＣＣから
650〜652位のＣＣＣまでの配列又は図３(A)に記載され
た配列或いはその一部を有するものである。

この系列のｃＤＮＡをｃＤＮＡ（＋ＶＳＥ）と称する。

他の系列のｃＤＮＡは図４(B)のポリペプチドＩ又はII
をコードする遺伝子あるいはその一部を有するものであ
り、さらに詳細には図４(A)の塩基配列の５′−末端か
ら31〜33ヌクレオチド位のＡＴＧから640〜642ヌクレオ
チド位のＣＣＣまでの配列、121〜123位のＡＣＣから64
0〜642位のＣＣＣまでの配列または図４(A)に記載され
た配列あるいはその一部を有するものである。

この系列のｃＤＮＡをｃＤＮＡ（−ＶＳＥ）と称する。

上記の遺伝子は、例えばＧ−ＣＳＦ活性を有するポリペ
プチドを産生する能力を有する哺乳動物細胞等からＧ−
ＣＳＦをコードするｍＲＮＡを調製した後、既知の方法
により２本鎖ｃＤＮＡに変換し、このＤＮＡを含む組換
体の集合（以下ｃＤＮＡライブラリーと称する）から既
知の方法によりスクリーニングすることによって得られ
る。

又、本発明で用いられる遺伝子はヒトＧ−ＣＳＦ活性を
有するポリペプチドをコードするヒト染色体由来の遺伝
子であってもよい。この遺伝子は転写調節に関与する塩
基配列を含んでいるものであり、詳しくは図５に示され
る塩基配列または、その一部を有するものである。

該染色体由来の遺伝子は、例えばヒト細胞からヒト染色
体遺伝子を含む組換え体の集合（以下、ヒト染色体遺伝
子ライブラリーと称する）を調製した後、既知の方法に
よりスクリーニングすることによって得ることができ
る。

この場合ヒト染色体遺伝子の供給源としては、ヒト細胞
であれば全て実施することができ、肝，腎等の摘出細胞
や腫瘍細胞等の培養細胞等を用いることができる。

また、ヒト細胞からヒト染色体遺伝子ライブラリーを調
製するには、既知の方法［Maniatis等；Cell 15巻687頁
(1978)およびManiatis等；Molecular cloning,Cold Spr
ing Harbor Laboratory 269頁(1982)等を参照］に従っ
て行えばよく、例えばヒト胎児肝等からヒト染色体ＤＮ
Ａをフェノール等にて抽出し、得られたＤＮＡを制限酵
素で部分的に、若しくは完全に消化させて、適当な長さ
に断片化されたＤＮＡを得、この断片化されたＤＮＡを
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等を用いて、さらには必要に応じて
ＥｃｏＲＩ等の切断部位を含むリンカーを付加して、λ
ファージベクターＤＮＡ断片に挿入する。次いでインビ
トロパッケージング法によりλファージ粒子を得、それ
により大腸菌などの宿主細胞を形質転換させることによ
って作成することができる。

上記ベクターとして用いたλファージは、例えばＣｈａ
ｒｏｎ４ＡやＥＭＢＬ−３，４などが挙げられる。

一方、前記ｍＲＮＡの供給源となる哺乳動物細胞は本発
明においては、ヒト口腔底癌由来の細胞株ＣＨＵ−２
（Collection Nationale De Cultures De Microorganis
mes（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ）寄託番号Ｉ−４８３）である
が、腫瘍細胞株にかぎらず、哺乳動物から分離できる細
胞、あるいは樹立した他の細胞株でもよい。

又、ｍＲＮＡの調製はすでに他のいくつかの生理活性タ
ンパクの遺伝子をクローン化する際、用いられた方法、
例えば、バナジウム複合体等を用いてリボヌクレアーゼ
インヒビター存在下に界面活性剤処理、フェノール処理
を行う（BergerとBirkenmeier；Biochemistry18巻5143
頁(1979)を参照）か、グアニジンチオシアナート処理
後、ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行う（Chirgwin等；Bioche
mistry18巻5294頁(1979)を参照）ことによって、全ＲＮ
Ａを得た後、オリゴ（ｄＴ）−セルロースやセファロー
ス２Ｂを担体とするポリＵ−セファロース等を用いたア
フィニティーカラム法あるいはバッチ法によりポリ（Ａ
^＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得ることができる。またショ
糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ^＋）ＲＮＡを更に分
画することもできる。

上記の如くして得られたｍＲＮＡが、Ｃ−ＣＳＦ活性を
もつポリペプチドをコードするものであることを確認す
るためには、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳させ、生理活
性を調べるか、抗Ｇ−ＣＳＦ抗体を用いてそのタンパク
を同定する等の方法を行えばよい。例えば、アフリカツ
メガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞にｍＲＮＡを注
入して翻訳させたり（Gurdon等；Nature，233巻177頁(1
972)を参照）、あるいはウサギ網状赤血球（Reticulocy
te）系や小麦胚芽（Wheat germ）系を利用した翻訳反応
が行われている（SchleifとWensink；“Practical Meth
ods in Molecular Biology”，Springer−Verlag，NY，
(1981)）。

Ｇ−ＣＳＦ活性の検定は骨髄細胞を用いた軟寒天培養法
を適用して実施できる。それらの手法については総説が
ある（Metcalf；“Hemopoietic Colonies”，Springer
−Verlag，Berlin，Heideiberg，ＮＹ(1977)）。

前述の如き方法で得たｍＲＮＡを鋳型にして１本鎖ｃＤ
ＮＡを合成した後、この１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤ
ＮＡを合成し、適当なベクターＤＮＡとの組換えプラス
ミドを作成する。これで大腸菌（Escherichia coli）な
どを形質転換して、形質転換株のＤＮＡ群（ｃＤＮＡラ
イブラリー）を得る。

ｍＲＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを得るには、例えばｍＲＮ
Ａの３′−末端にあるポリＡ−鎖に相補的なオリゴ（ｄ
Ｔ）をプライマーとして逆転写酵素で処理するか、また
はＧ−ＣＳＦタンパクのアミノ酸配列の一部に相応する
オリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして
逆転写酵素で処理してｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを合
成する。２本鎖ｃＤＮＡは、アルカリ処理でｍＲＮＡを
分解・除去した後、得られた１本鎖ｃＤＮＡを逆転写酵
素又はＤＮＡポリメラーゼＩ（例えばKlenow断片等）処
理後Ｓｌヌクレアーゼ等で処理して得るか、あるいは、
直接ＲＮａｓｅ ＨおよびＤＮＡポリメラーゼ（例え
ば、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩ等）等で処理するこ
とによっても得ることができる（例えば、Maniatis等；
Molecularcloning，Cold Spring HarborLaboratory(198
2)およびGublerとHoffman；Gene25巻263頁(1983)を参
照）。

このようにして得られた２本鎖ｃＤＮＡを適当なベクタ
ー、例えば、ｐＳＣ101，ｐＤＦ41，ＣｏｌＥ１，ｐＭ
Ｂ９，ｐＢＲ322，ｐＢＲ327，ｐＡＣＹＣ１などに代表
されるＥＫ型プラスミドベクターや、λgt，λｃ，λgt
10，λｇｔＷＥＳなどに代表されるファージベクターな
どに組み込んだ後、大腸菌（Ｘ1776；ＨＢ 101；ＤＨ
１，Ｃ600株など）等を形質転換してｃＤＮＡライブラ
リーを得ることができる（例えば、前出“Molecular cl
oning”を参照）。

２本鎖ｃＤＮＡをベクターと連結させるには、ＤＮＡ末
端に連結可能な末端をつけるべく、適当な化学合成ＤＮ
Ａ断片を付加し、予め制限酵素を用いて開裂させたベク
ターＤＮＡとＡＴＰ存在下にＴ４ファージＤＮＡリガー
ゼで処理することにより行うことができる。あるいは、
予め制限酵素を用いて開裂させたベクターＤＮＡと２本
鎖ｃＤＮＡのそれぞれにｄＧ，ｄｃ−鎖（あるいはｄ
Ａ，ｄＴ−鎖）を付加した後、例えば両ＤＮＡを含む溶
液を徐冷することによっても行うことができる（前記Mo
lecular cloningを参照）。

こうして得られた組換えＤＮＡ体による宿主細胞の形質
転換は、例えば宿主細胞が大腸菌の場合Hanahanが詳細
に記述している如き方法（Ｊ．Mol．Biol；166巻577頁
(1983)）、すなわち、ＣａＣｌ_２やＭｇＣｌ_２又はＲｂ
Ｃｌを共存させて調製したコンピテント細胞に該組換え
ＤＮＡ株を加えることにより実施することができる。

目的とする遺伝子を保有する細胞を検索するには、イン
ターフェロンｃＤＮＡのクローン化で用いられたプラス
−マイナス法（Taniguchi等；Proc．Jpn．Acad，55巻Se
r．Ｂ．464頁(1979)）や、ハイブリダイゼーション−ト
ランスレーションアッセイ法（Nagata等；Nature284巻3
16頁(1980)）など、又は該タンパク質のアミノ酸配列を
もとにして化学合成したオリゴヌクレオチドプローブを
用いたコロニーあるいはプラークハイブリダイゼーショ
ン法（Wallace等；Nucleic Acids Res．９巻879頁(198
1)およびBentonとDavise：Science 196巻180頁(1977)）
などを用いればよい。

このようにしてクローン化されたヒトＧ−ＣＳＦ活性を
有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む断片は適
当なベクターＤＮＡに再び組み込むことにより、他の原
核生物または真核生物の宿主細胞を形質転換させること
ができる。更にこれらのベクターに適当なプロモーター
及び形質発現に係る配列を導入することにより、それぞ
れの宿主細胞に於いて遺伝子を発現させることが可能で
ある。

哺乳動物由来の宿主細胞としては、ＣＯＳ細胞、チャイ
ニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ−１２７細
胞、ＨｅＬａ細胞などがあげられ、これ等の細胞を形質
転換させるベクターとしては、ｐＳＶ２−ｇｐｔ（Mull
iganとBerg；Proc．Natl．Acad．Sci．USA；78巻2072頁
（(1981)を参照）等がある。これ等のベクターは複製起
源、選択マーカー、発現させようとする遺伝子の前に位
置するプロモーター、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデ
ニル化シグナルなどを含んでいる。

哺乳動物細胞における遺伝子発現のプロモーターとして
はレトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィル
ス、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）などのプロモー
ターを用いればよい。例えばＳＶ４０のプロモーターを
使用する場合は、Mulliganなどの方法（Nature277巻108
頁(1979)）に従えば容易に実施することができる。

複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウィルス、ア
デノウィルス、牛パピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由
来のものを用いることができ、選択マーカーとしては、
ホスホトランスフェラーゼＡＰＨ（３′）IIあるいはＩ
（ｎｅｏ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、
大腸菌キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフ
ェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵
素（ＤＨＦＲ）遺伝子等を用いることができる。

以上の如き宿主−ベクター系を用いてヒトＧ−ＣＳＦ活
性を有するポリペプチドを得るには、上記ベクターの適
当な部位に該遺伝子を組み込んだ組換えＤＮＡ体により
宿主細胞を形質転換させた後、得られた形質転換体を培
養すればよい。さらに細胞内または培養液から該ポリペ
プチドを分離・精製するには、公知の手段を用いて行う
ことができる。

一般に真核生物の遺伝子はヒトインターフェロン遺伝子
等で知られているように、多形現象（polymorphysm）を
示すと考えられ（例えばNishi等；Ｊ．Biochem．97巻15
3頁(1985)を参照）、この多形現象によって１個または
それ以上のアミノ酸が置換される場合もあれば、塩基配
列の変化はあってもアミノ酸は全く変わらない場合もあ
る。

また例えば図３(B)あるいは図４(B)のアミノ酸配列の中
の１個またはそれ以上のアミノ酸を欠くか又は付加され
たポリペプチド、あるいは１個またはそれ以上のアミノ
酸が１個またはそれ以上のアミノ酸で置換されたポリペ
プチドでもＧ−ＣＳＦ活性を有することがある。例え
ば、ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子のシス
テインに相当する塩基配列をセリンに相当する塩基配列
に変換して得られたポリペプチドがインターロイキン２
活性を保持することもすでに公知となっている（Wang
等；Science，244巻1431頁(1984)）。それゆえ、それ等
天然に存在するかあるいは人工合成されたポリペプチド
がヒトＧ−ＣＳＦ活性を有する限りそれ等のポリペプチ
ドをコードする遺伝子を含む組換ベクターによって形質
転換された動物細胞（形質転換体）を培養して得られた
糖蛋白質は全て本発明に含まれる。

本発明のヒトＧ−ＣＳＦ活性を有する糖蛋白質を得るた
めに必要な遺伝子、該遺伝子を有する組換えベクター及
びこれを含有する形質転換体、並びにこの形質転換体を
培養し、取得した目的の糖蛋白質、夫々についてその製
法の概要を説明すると以下の通りである。

(1)プローブの調製 腫瘍細胞株ＣＨＵ−２の培養上清から精製して得られた
均一ヒトＣＳＦタンパクについてＮ末端よりアミノ酸配
列を決定し、さらにブロムシアン分解、トリプシン処理
などにより断片化した後その断片についてもアミノ酸配
列を決定した［実施例３(i)，(ii)，(iii)］。

そのアミノ酸配列中から図１に示される配列に対応する
３種類のヌクレオチドプローブ(A)，プローブ（ＬＣ）
およびプローブ（ＩＷＱ）を合成した（実施例４）。

プローブ(A)は連続した14個のヌクレオチドからなる混
合型プローブである。プローブ（IWQ）は、ヒトコレシ
ストキニン遺伝子のクローン化で用いられた如き（Taka
hashi等；Proc．Natl．Acad．Sci．，USA，82巻1931頁
(1985)）デオキシイノシンを使用した30個の連続したヌ
クレオチドである。プローブ（ＬＣ）は実施例３(i)に
示したアミノ酸配列のＮ末端から32〜39番に相当する部
分を、図３に示した塩基配列を基にして合成した24個の
ヌクレオチドからなるプローブである。

ヌクレオチドの化学合成は改良型ホスホトリエステル法
を固相法に適用して行うことができ、Narangの総説に記
述されている（Tetrahedron39巻３−22頁(1983)）。

使用するプローブは、本発明で用いたプローブ以外の位
置のアミノ酸配列に基づくものであってもよい。

(2)ｃＤＮＡライブイリーの構築 ＣＨＵ−２細胞にグアニジンチオシアナート溶液を加え
てホモジナイズし、ＣｓＣｌ密度勾配遠心法により全Ｒ
ＮＡを得る。

この全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムによ
りポリ（Ａ^＋）ＲＮＡを選別した後、逆転写酵素により
１本鎖ｃＤＮＡを合成し、ＲＮａｓｅ ＨおよびＥ．ｃ
ｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩを用いて、２本鎖ｃＤＮＡ
を得た。得られた２本鎖のｃＤＮＡにｄＣ鎖を付加し、
ＰｓｔＩ切断部位にｄＧ鎖を付加したｐＢＲ322ベクタ
ーとつなぎ合せて、大腸菌Ｘ1776株を形質転換させ、ｐ
ＢＲ322系ｃＤＮＡライブラリーを構築した（実施例
５，６）。

同様にＥｃｏＲＩリンカーを用いて、２本鎖ｃＤＮＡを
λｇｔ10ベクターと連結し、λファージ系ｃＤＮＡライ
ブラリーを構築した（実施例７）。

(3)スクリーニング ｐＢＲ322系ｃＤＮＡライブラリー由来の組換え体をワ
ットマン541濾紙に固定し、^３２Ｐで放射標識したプロ
ーブ（ＩＷＱ）を用いて、コロニーハイブリダイゼーシ
ョンを行った結果、１個のクローンが選別できた。この
クローンを、サザンブロッティング法（Southern；Ｊ．
Mol．Biol，98巻503頁(1975)）を用いて更に詳細に検討
したところ、プローブ(A)ともハイブリダイズした。

このクローンの塩基配列をジデオキシ法（Sanger；Scie
nce214巻1205頁(1981)）によって決定した。

得られたｃＤＮＡインサートの塩基配列を図２に示す。
図２に示される如く、このｃＤＮＡインサートはプロー
ブ（ＩＷＱ）およびプローブ(A)を含む308塩基対からな
り、実施例３(iii)に示したアミノ酸配列を含む83個の
アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームを
有していることがわかった。

この308塩基対を含むｐＢＲ322由来のプラスミドを以下
ｐＨＣＳ−１と略記する（実施例８）。

ｐＨＣＳ−１から得られる308塩基対を含むＤＮＡ断片
をニックトランスレーション法（前出、Molecular Clon
ingを参照）にて放射標識し、これをプローブとしてλ
ｇｔ10由来のｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリ
ダイゼーション（BentonとDavis；Science196巻180頁(1
977)によりスクリーニングして５個のクローンを得、ｃ
ＤＮＡを含むと思われるクローンについてその塩基配列
を前述と同様の方法で決定した（図３（Ａ））。

図３（Ａ）に示される如く、このｃＤＮＡインサートは
一つの大きなオープンリーディングフレームを有する。

このｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列は図３
（Ａ）に示された如く演えきできる。

実施例３（ｉ）に示されているＧ−ＣＳＦタンパクのＮ
末端アミノ酸配列との比較により、本ｃＤＮＡは５′−
末端から32〜３４ヌクレオチド位のＡＴＧ配列から始ま
り、119〜121位のＧＣＣ配列で終わる90塩基対によって
コードされるシグナルペプチドおよび122〜124位のＡＣ
Ｃ配列から始まり650〜652位のＣＣＣ配列で終わる531
塩基対によってコードされる成熟Ｇ−ＣＳＦポリペプチ
ドに相当する塩基配列を含んでいることがわかった。従
って図３（Ｂ）に示されたアミノ酸配列Ｉのポリペプチ
ドは207個のアミノ酸からなり、その分子量は22292.67
ダルトンと計算された。同様にアミノ酸配列IIのポリペ
プチドは177個のアミノ酸からなり、その分子量は1898
6.74ダルトンであった（実施例９）。

但しタンパク質の開始部位に関しては、32〜34位あるい
は68〜70位のＡＴＧも同様に考え得る。ＥｃｏＲ１切断
部位にこのｃＤＮＡ（＋ＶＳＥ）を挿入したｐＢＲ322
を保持するエシエリヒア・コリ（Ｅ．coli）Ｘ1776株
は、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている
（ＦＥＲＭ ＢＰ−９５４）。

図６には、得られた遺伝子の制限酵素切断部位を示し
た。

また、このｃＤＮＡをｐＢＲ327［Soberon等；Gene９巻
287頁(1980)］とＥｃｏＲＩ部位で結合したプラスミド
をｐＢＲＧ４と称する。

このようにして得られたｐＢＲＧ４を、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで処理して得られる約1500塩基対のｃＤＮＡを含む
ＤＮＡ断片をニックトランスレーション法（前出のMole
cular cloningを参照）にて放射標識し、これをプロー
ブとして、再びλgt10由来のｃＤＮＡライプラリーをプ
ラークハイブリダイゼーション（前出BentonとDavisの
文献参照）によりスクリーニングした。この際、同時に
λファージＤＮＡを固定したニトロセルロース濾紙を２
枚作成しておき、先に述べたプローブ（ＬＣ）にて同様
のプラークハイブリダイゼーションを行い、両プローブ
でポジティブとなるファージを選別した。完全長と思わ
れるクローンを選別し、ジデオキシ法を用いてｃＤＮＡ
インサートの塩基配列を決定したところ図４(A)に示さ
れる如くであった。

このｃＤＮＡは一つの大きなオープンリーディングフレ
ームを有し、コードされるアミノ酸配列は図４(A)に示
された如く演えきできる。

実施例３(i)に示されているＧ−ＣＳＦタンパクのＮ末
端アミノ酸配列との比較により、本ｃＤＮＡは５′−末
端から31〜33ヌクレオチド位のＡＴＧ配列から始まり、
118〜120位のＧＣＣ配列で終わる90塩基対によってコー
ドされるシグナルペプチドおよび121〜123位のＡＣＣ配
列から始まり640〜642位のＣＣＣ配列で終る522塩基対
によってコードされる成熟Ｇ−ＣＳＦポリペプチドに相
当する塩基配列を含んでいることがわかった。従って図
４(B)に示されたアミノ酸配列Ｉのポリペプチドは204個
のアミノ酸からなり、その分子量は21977.35ダルトンと
計算された。同様にアミノ酸配列IIのポリペプチドは17
4個のアミノ酸からなり、その分子量は18671.42ダルト
ンであった（実施例10）。

但しタンパク質の開始部位に関しては、31〜33位以外に
58〜60位あるいは67〜69位のＡＴＧも同様に考え得る。

ＥｃｏＲＩ切断部位に本ｃＤＮＡ（−ＶＳＥ）を挿入し
たｐＢＲ327を保持するエシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）Ｘ1776株は工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている（ＦＥＲＭＢＰ−９５５）。

図６には、得られた遺伝子の制限酵素切断部位を示し
た。

また、このｃＤＮＡをｐＢＲ327とＥｃｏＲＩ部位で結
合したプラスミドをｐＢＲＶ２と称する。

(4)ヒト染色体遺伝子ライブラリーのスクリーニング Maniatis等の記載した方法（前出Molecular cloningを
参照）に従って調製されたヒト染色体遺伝子ライブラリ
ーを前述のｐＨＣＳ−１を用いてスクリーニングした。

スクリーニングに用いるプローブとしては、ｐＨＣＳ−
１由来の308塩基対のＤＮＡ断片の他、ｐＢＲＧ４由来
の約1500塩基対のＤＮＡ断片やｐＢＲＶ２由来の約1500
塩基対のＤＮＡ断片、あるいはこれ等のＤＮＡ断片の一
部を含む適当な長さのＤＮＡ断片、さらには前述のオリ
ゴヌクレオチドプローブ［（ＩＷＱ）、（Ａ）、（Ｌ
Ｃ）］をもちいても実施することができる。

ｐＨＣＳ−１由来のＤＮＡ断片をニックトランスレーシ
ョン法［Roop等；Cell 15巻431頁(1978)を参照］に従っ
て［^３２Ｐ］で放射標識し、これをプローブとしてヒト
染色体由来遺伝子ライブラリーをプラークハイブリダイ
ゼーション（前出のBentonとDavisの文献参照）により
スクリーニングし、十数個のクローンを得た。

得られたクローンからＤＮＡを回収した後、公知の方法
［Fritsch等；Cell 19巻959頁(1980)］に従って制限酵
素地図を作成した。

次いで上記のＤＮＡプローブを用いてサザンブロッティ
ング（前出Southernの文献参照）を行い、ＥｃｏＲＩお
よびＸｈｏＩで切り出される約４キロ塩基対ＤＮＡ断片
に、ヒトＧ−ＣＳＦポリペプチドをコードする領域が存
在している可能性があることがわかった。そこで約４キ
ロ塩基対のＤＮＡ断片をｐＢＲ３２７のＥｃｏＲＩ部位
にＥｃｏＲＩリンカーを用いて挿入し、ｐＢＲＣＥ３β
を得た。このプラスミドを塩基配列を決定するためのＤ
ＮＡとし、ジデオキシ法を用いて約３キロ塩基対の塩基
配列を決定したところヒトＧ−ＣＳＦポリペプチドをコ
ードする遺伝子であることが判明した（図５）。

この約４キロ塩基対のＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ部位に挿
入したプラスミドｐＢＲ３２７（ｐＢＲＣＥ３β）を保
持するＥ．ｃｏｌｉＸ１７７６株は、工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。（ＦＥＲＭ ＢＰ−
９５６）。

図３，図４に示されるｐＢＲＧ４ｃＤＮＡインサートお
よびｐＢＲＶ２ｃＤＮＡインサートとの比較によりこの
ＤＮＡ断片は、５個のエクソン部分を含むものでもので
あり、ｐＢＲＧ４およびｐＢＲＶ２から演えきされるア
ミノ酸配列をコードするものであることがわかった。

また、このＤＮＡ断片は、ヒトＧ−ＣＳＦｍＲＮＡに転
写されるべき前領域すなわち、ヒトＧ−ＣＳＦの染色体
内遺伝子を含むものであり、さらには転写調節に関与す
る塩基配列を有している［BenoistとChambon；Nature29
0巻304頁(1981)およびBreathnackとChambon；Ann．Re
v．Biochem．50巻349頁(1981)］。

(5)動物細胞用組換えベクターの構築 宿主細胞としてＣ１２７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用
する場合の組換えベクター（ＢＰＶ由来）及びＣＨＯ細
胞を使用する場合の組換えベクター（ＤＨＦＲを含む）
の構築を＋ＶＳＥ系、−ＶＳＥ系ｃＤＮＡおよび染色体
由来遺伝子について各々行った。又、ＣＯＳ細胞につい
ても同様の組換えベクターの構築を行った。ここでは代
表的な例について述べるが詳しくは実施例を参照された
い。

(A)＋ＶＳＥ系組換えベクターの構築 前記(3)で得られたｃＤＮＡ（＋ＶＳＥ）断片をベクタ
ーｐｄＫＣＲに組み込みｐＨＧＡ４１０プラスミドとし
た後（実施例12）（図８）これをＥｃｏＲＩで部分消化
し、末端をブラントエンド（blunt end）にする。この
ＤＮＡにＨｉｎｄIIIリンカーを付加し、次いでＨｉｎ
ｄIII処理をしＴ４ＤＮＡリガーゼ処理した後これで塩
化ルビジウム法（前出Molecular Cloning参照）を用
い、Ｅ．coli ＤＨＩ株を形質転換した。得られたプラ
スミドをｐＨＧＡ４１０（Ｈ）と命名する（図９）。

ｐＨＧＡ４１０（Ｈ）をＳａｌＩで処理し、次いで末端
をブラントエンド化した後再びＨｉｎｄIII処理しＨｉ
ｎｄIII−ＳａｌＩ断片を回収する。

一方、ウシ乳頭腫ウィルスの形質転換断片を有するｐｄ
ＢＰＶ−１プラスミドをＨｉｎｄIII、ＰｖｕIIで処理
し大きいほうのＤＮＡ断片を分離し、これと先のＨｉｎ
ｄIII−ＳａｌＩ断片を結合する。これを用いてＥ．col
i ＤＨＩ株を形質転換しｐＨＧＧ４由来のＣＳＦ−ｃ
ＤＮＡを有するプラスミド、ｐＴＮ−Ｇ４を得る（図
９）（実施例13）。

一方、ｐＨＧＡ４１０プラスミドかｐＨＧＡ４１０
（Ｈ）プラスミドとｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡプラスミドを
用いてＣＨＯ細胞用組換えベクター（＋ＶＳＥ）である
ｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒを構築した（図10ａ及びｂ）（実
施例15）。

更にｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡからＤＨＦＲ遺伝子を含む約
２ＫｂのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ処理
により回収し、ｐＨＧＡ４１０（Ｈ）のＨｉｎｄIII部
位に挿入してｐＧ４ＤＲ１とｐＧ４ＤＲ２を構築した
（図10ｃ）（実施例15）。

(B)−ＶＳＥ系組換えベクターの構築 前記(3)で得られたｃＤＮＡ（−ＶＳＥ）断片をベクタ
ーｐｄＫＣＲに組み込みｐＨＧＶ２プラスミドとした後
（実施例18）これをＥｃｏＲＩで部分消化し、末端をブ
ラントエンド（blunt end）にする。このＤＮＡにＨｉ
ｎｄIIIリンカーを付加し、次いでＨｉｎｄIII処理をし
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ処理した後、これで塩化ルビジウム
法（前出Molecular Cloning参照）を用い、Ｅ．coli
ＤＨＩ株を形質転換した。得られたプラスミドをｐＨＧ
Ｖ２（Ｈ）と命名する（図12）。

ｐＨＧＶ２（Ｈ）をＳａｌＩで処理し、次いで末端をブ
ラントエンド化した後再びＨｉｎｄIII処理しＨｉｎｄI
II−ＳａｌＩ断片を回収する一方、ウシ乳頭腫ウィルス
の形質転換断片を有するｐｄＢＰＶ−１プラスミドをＨ
ｉｎｄIII、ＰｖｕIIで処理し大きい方のＤＮＡ断片を
分離し、これと先のＨｉｎｄIII−ＳａｌＩ断片を結合
する。これを用いてＥ．ｃｏｌｉＤＨＩ株を形質転換し
ｐＨＧＶ２由来のＣＳＦ−ｃＤＮＡを有するプラスミ
ド、ｐＴＮ−Ｖ２を得る（図12）（実施例19）。

＋ＶＳＥと同様にｐＨＧＶ２プラスミドかｐＨＧＶ２
（Ｈ）プラスミドとｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡプラスミドを
用いてＣＨＯ細胞用組換えベクター（−ＶＳＥ）である
ｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒを構築した（図13ａ及びｂ）（実
施例21）。

更にｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡからＤＨＦＲ遺伝子を含む約
２ＫｂのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ処理
により回収し、ｐＨＧＶ２（Ｈ）のＨｉｎｄIII部位に
挿入してｐＶ２ＤＲ１とｐＶ２ＤＲ２を構築した（図13
ｃ）（実施例21）。

(c)染色体由来遺伝子を含む組換えベクターの構築 前記(4)で得られた図５で示される染色体遺伝子を含む
プラスミドｐＢＲＣＥ３βをＥｃｏＲＩで処理した。

一方Banerji等の文献（Cell 27巻299頁(1981)）に記載
されれているｐＳＶＨ^＋Ｋ^＋プラスミドをＫｐｎＩで処
理してグロビリン遺伝子を除き、さらにＨｉｎｄIIIで
部分消化してＳＶ４０の後期遺伝子の一部を除いた後、
再結合させて発現用ベクターｐＭＬ−Ｅ^＋を調製した。

このベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した後、ア
ルカリホスファターゼ（宝酒造社製）で脱リン酸して得
られたベクターＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社
製）を加えて上記染色体ＤＮＡ断片と結合させ、ＣＯＳ
細胞用組換えベクターｐＭＬＣＥ３αを得た（実施例2
4）。図14に示される如くこのプラスミドは、ＳＶ４０
遺伝子のエンハンサー、ＳＶ４０の複製開始領域、ｐＢ
Ｒ３２２の複製開始領域およびｐＢＲ３２２由来のβ−
ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ^ｒ）を含むプラスミドで、
ＳＶ４０遺伝子のエンハンサー下流にヒトＧ−ＣＳＦ染
色体遺伝子が接続されている。Ｃ１２７細胞用の発現ベ
クターの構築は以下の如くして行った。

即ち、ＣＯＳ細胞での発現ベクターｐＭＬＣＥ３αより
染色体由来のＣＳＦ遺伝子を含むＤＮＡ断片を制限酵素
で切り出し、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）の複製起源
を含むＤＮＡ断片およびＳＶ４０初期プロモーターを有
するＤＮＡ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。得られたｐＴＮＣＥ３αはＳＶ４０初期プロモータ
ーの下流に染色体由来のＣＳＦ遺伝子が連結され、ＢＰ
Ｖの65％部分を含む発現ベクターである。

一方、ＣＨＯ細胞用発現ベクターは、上記と同様の染色
体由来ＣＳＦ遺伝子とＳＶ４０初期プロモーター部分を
含むＤＮＡ断片及びｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ由来のＤＨＦ
Ｒ遺伝子を含むＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより
連結したものである。得られたｐＴ２６ＳＶＣＥ３αは
ＳＶ４０プロモーター下流に染色体由来ＣＳＦ遺伝子、
アデノウイルス主後期プロモーター下流にＤＨＦＲ遺伝
子を有する発現ベクターである。

(6)動物細胞による形質発現 ここでは代表的な例について述べるが、その他の場合に
ついては各実施例を見られたい。

（Ａ）マウスＣ１２７細胞による形質発現 ｐＴＮ−Ｇ４プラスミドまたはｐＴＮ−Ｖ２プラスミド
をＢａｍＨＩで処理しておき、これを用いて培養増殖さ
せておいたＣ１２７細胞をリン酸−カルシウム法で形質
転換する。得られた形質転換細胞を培養しＣＳＦ生産能
の高いクローンを選別する。

形質発現したＧ−ＣＳＦはこれらの形質転換細胞の培養
液から回収精製され、ヒト−Ｇ−ＣＳＦ活性を示すこと
が確認された。又試料のアミノ酸分析及び糖含有量分析
により目的糖蛋白質の確認もなされた。

尚、糖含有分析に関しては、アミノ酸分析に用いたＣＳ
Ｆ試料をエルソン−モルガン法によるアミノ糖定量、オ
ルシノール硫酸法による中性糖の定量またチオバルビツ
ール法によるシアル酸の定量にてそれぞれ実施した。

定量方法は生化学実験講座第４巻「糖質の化学（下
巻）」（東京化学同人）の13章に記載されている。各定
量値から重量％を換算した結果、発現ベクター及び培養
条件等の違いにより、得られたＧ−ＣＳＦの糖含量は１
〜20（重量％）の範囲に分布していた。

（Ｂ）ＣＯＳ細胞による形質発現 前記（５）−（Ｃ）で得たヒト染色体由来のＧ−ＣＳＦ
遺伝子を含むベクターｐＭＬＣＥ３αは、サルのＣＶ−
１細胞由来でＳＶ４０の複製起源（ｏｒｉｇｉｎ）欠損
変異株で形質転換されＳＶ４０の大型Ｔ抗原を表現して
いるＣＯＳ細胞（Gluzman等；Cell 32巻175頁(1981)を
参照）を宿主細胞として、形質発現をさせてみたとこ
ろ、ヒトＧ−ＣＳＦ活性を示すことがわかった（実施例
25）。

さらにＣＯＳ細胞を回収し、ｍＲＮＡを分析したところ
図３（Ａ）および図４（Ａ）に示されるアミノ酸配列そ
れぞれに対応するｍＲＮＡが存在していた。

〔実施例〕

以下実施例をあげて本発明を詳細に説明するが、その前
にＣＳＦ活性の測定法について参考例で説明しておく。

＜参考例＞ＣＳＦ活性の測定方法 本発明において用いられたＣＳＦ活性（以下ＣＳＡと略
す）の測定方法は次のとおりである。

「ＣＳＡの測定方法」 (a)ヒト骨髄細胞を用いる場合： Bradley Ｔ．Ｒ．，Metcalf Ｄ．等の方法（Aust．
Ｊ．Exp．Biol．Med．Sci，44巻287〜300頁，1966年）
に準じて単層軟寒天培養法により行った。すなわちウシ
胎児血清0.2ml，被検検体0.1ml，ヒト骨髄非付着性細胞
浮遊液0.1ml（１〜２×10⁵有核細胞），改変McCoy′ｓ
５Ａ培養液0.2ml，寒天を0.75％含む改変McCoy′ｓ５Ａ
培養液0.4mlを混合して直径35mmの組織培養プラスティ
ックディッシュに入れて固まらせたのち、37℃，５％炭
酸ガス／95％空気，100％湿度の条件で培養を行い、10
日後に形成されたコロニー数（50個以上の細胞からなる
集落を１コロニーとする）を数え、１個のコロニーを形
成する活性を１単位（Ｕｎｉｔ）としてＣＳＡを求め
た。

(b)マウス骨髄細胞を用いる場合： ウマ血清0.4ml，被検検体0.1ml，Ｃ３Ｈ／He（メス）マ
ウスの骨髄細胞浮遊液0.1ml（0.5〜１×10⁵有核細
胞），寒天を0.75％含む改変McCoy′ｓ５Ａ培養液0.4ml
を混合し直径35mmの組織培養用プラスティックディッシ
ュに入れて固まらせたのち、37℃，５％炭酸ガス／95％
空気、100％湿度の条件下にて５日間培養し、形成され
たコロニー数（50個以上の細胞からなる集落を１コロニ
ーとする）を数え、１個のコロニーを形成する活性を１
単位（Ｕｎｉｔ）としてＣＳＡを求めた。

尚、上記(a)，(b)の方法において用いた「改変McCoy′
ｓ５Ａ培養液および(a)で用いたヒト骨髄非付着性細胞
浮遊液は次の如くして作成した。

「改変McCoy′ｓ５Ａ培養液（２倍濃度）」 McCoy′ｓ５Ａ培養液（ＧＩＢＣＯ社製）12ｇ，ＭＥＭ
アミノ酸ビタミン培地（日水製薬社製）2.55ｇ、重炭酸
ナトリウム2.18ｇ，ペニシリンＧカリウム50000単位を
２回蒸溜水500mlに溶解後、0.22μｍのミリポアフィル
ターにて濾過滅菌を行った。

「ヒト骨髄非付着性細胞浮遊液」 健常人胸骨せん刺により得た骨髄液をＲＰＭＩ1640培養
液にて５倍に希釈し、Ficol−Paque液（ファルマシア社
製）に重層し、400×ｇ，30分，25℃にて遠心を行い、
界面の細胞層（比重＜1.077）を回収する。この細胞を
洗浄後、20％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ1640培養液に
て５×10⁶Cell／mlの濃度に調整し、25cm²の組織培養用
プラスチックフラスコに入れ、炭酸ガス培養器にて30分
間インキュベートしたのち、上清の非付着性細胞を回収
し、再度25cm²プラスチックフラスコに入れ、２時間30
分インキュベートしたのち、上清の非付着性細胞を集め
て用いた。

実施例１「ＣＨＵ−２」の樹立 著明な好中球の増多が認められた口腔底癌患者の腫瘍を
ｎｕ／ｎｕマウスに移植した。この腫瘍は移植約10日後
に著明な腫瘍の増大と好中球の増多が認められた。この
腫瘍を移植12日後に無菌的に摘出し、１〜２mm³角に細
切し、これを以下の如く培養した。

上記細切した腫瘍塊10〜15片を50mlのプラスチック遠心
管に入れ、５mlのトリプシン溶液（トリプシン0.25％，
ＥＤＴＡ0.02％含む）を加え、37℃の温浴中で10分間振
とうしたのち上清を捨て、再度、同トリプシン溶液５ml
を加え、37℃で15分間攪拌しながらトリプシン消化を行
った。

上清の細胞浮遊液を回収し、ウシ胎児血清を１ml加えて
トリプシンの作用を止めたのち氷中に保存した。

以上の操作を再度行い細胞浮遊液を回収し、前回の分と
合わせて1,500r.p.m.10分間の遠心により細胞ペレット
を得た。

この細胞ペレットをウシ胎児血清を10％含むＦ−10にて
２回洗浄したのち、25cm²のプラスチック培養フラスコ
に細胞濃度５×10⁶個／フラスコになるようにして植え
込んだ。ウシ胎児血清を10％含有するＦ−10培養液を用
い、炭酸ガスインキュベーター（炭酸ガス濃度５％，湿
度100％）中にて一晩インキュベートしたのち、上清を
非付着細胞と共に除去し、新しい培養液を加えて培養を
継続した。培養開始後６日目に細胞がいっぱいに増殖し
たので、この時点で培養液を新しいものに替えた。翌
日、この培養液を捨て、ＲＰＭＩ1640で５倍希釈した抗
マウス赤血球抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）２mlと同じくＲ
ＰＭＩ1640で2.5倍希釈したモルモット補体（極東製薬
社製）２mlを加え37℃，20分間インキュベートした。イ
ンキュベーション終了後ウシ胎児血清を10％含むＦ−10
にて２回洗浄しｎｕ／ｎｕマウス由来のフィブロブラス
トを除去し引き続きウシ胎児血清を10％含むＦ−10培養
液を加えて、さらに２日間培養を行った後細胞の一部を
取り出し限界希釈法によりクローニングを行った。得ら
れた11個のクローンについてＣＳＦ活性を調べたとこ
ろ、他のものよりも約10倍高い活性を示すクローン（Ｃ
ＨＵ−２）が得られた。

実施例２ ＣＳＦの単離 上述の如くして樹立された細胞が完全に密に増殖した15
0cm²の培養フラスコ２本より細胞を回収し、これをウシ
胎児血清を10％含有するＦ−10培養液500mlに浮遊させ
たのち、1580cm²のガラス製ローラーボルト（Ｂｅｌｃ
ｏ社製）に移し、0.5 r.p.m.の速度で回転培養を行っ
た。細胞がローラーボトルの内壁に完全に密に増殖した
時点で培養液を血清を含まないＲＰＭＩ1640に交換し、
４日間培養したのち培養上清を回収し、ウシ胎児血清を
10％含有するＦ−10を加えて培養を続行する。３日間培
養したのち再び血清を含まないＲＰＭＩ1640に液替を行
い、４日後に培養上清を回収した。以下同様の操作をく
り返すことにより、毎週１ボルトより500mlずつの血清
を含まない培養上清が得られ、しかもこの方法によりか
なり長期間にわたって細胞を維持し、培養上清を回収す
ることが可能であった。得られた培養上清５を１バッ
チとし、これに0.01％ツィーン20を添加後Hollow Fiber
ＤＣ−４およびAmicon ＰＭ−10（アミコン社製）を
用いた限外濾過法により約1000倍に濃縮したのち、これ
を以下の順序で精製した。

(i)直径4.6cm，長さ90cmのUltrogel AcA54カラム（ＬＫ
Ｂ社製）を用い、0.15Ｍ ＮａＣｌ及び0.01％ツィーン
20（半井化学社製）を含む0.01Ｍトリス塩酸緩衝液（pH
7.4）を用いて前記濃縮した培養上清５mlを流速約50ml
／時間でゲル濾過した。尚カラムはあらかじめウシ血清
アルブミン（分子量67,000），オボアルブミン（分子量
45,000），チトクロームＣ（分子量12,400）にてキャリ
ブレーションを行った。ゲル濾過終了後各フラクション
より0.1mlずつを採取し、10倍に希釈した後、前述した
「ＣＳＡの測定方法(b)」により活性を示す画分を調べ
た。この結果、先ずＶｅ＝400〜700mlの画分がマクロフ
ァージ優位のＣＳＡを示し、Ｖｅ＝800〜1200mlの画分
が顆粒球優位のＣＳＡを示すことがわかったので、後者
の画分を集めＰＭ−10（アミコン社製）を用いる限外濾
過器によって約５mlに濃縮した。

(ii)上記濃縮画分にｎ−プロパノール（東京化成社製，
アミノ酸配列決定用）を30％含む0.1％トリフルオロ酢
酸水溶液を添加し、氷中に15分程度放置したのち、15,0
00r.p.m.10分の遠心により沈澱を除去した。次いで先の
ｎ−プロパノールおよびトリフルオロ酢酸を含む水溶液
で平衡化したμ Bondapak Ｃ18カラム（Ｗａｔｅｒｓ
社製、セミ分取用，８mm×30cm）に吸着後、30〜60％の
直線濃度勾配のｎ−プロパノールを含む0.1％トリフル
オロ酢酸水溶液で順次溶出した。高速液体クロマト装置
は日立685−50型を、検出は日立638−41型検出器（いず
れも日立製作所製）を用い、220nmと280nmの吸収を同時
に測定した。溶出後、各画分より10μを分取100倍希
釈したのち、前述の「CSAの測定法(b)」により活性を示
す画分を調べた。この結果、ｎ−プロパノール40％にて
溶出されるピークに活性が認められたので、このピーク
を集め再度同じ条件で再クロマトを行い上記と同様にし
てＣＳＡを調べたところ、やはりｎ−プロパノール40％
の位置のピークに活性が認められたので、このピークを
集め（４フラクション＝４ml）凍結乾燥した。

(iii)上記凍結乾燥粉末をｎ−プロパノールを40％含む
0.1％トリフルオロ酢酸水溶液200μに溶解し、ＴＳＫ
−Ｇ3000ＳＷカラム（東洋曹達社製，7.5mm×60cm）を
用いた高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）にかけ
た。溶出は同水溶液により0.4ml／分の流速で行い、フ
ラクションコレクターＦＲＡＣ−100（ファルマシア社
製）により0.4mlずつ分取した。分取した各画分につい
てＣＳＡを前記と同様にして調べた結果、保持時間が37
〜38分の画分（分子量約２万に相当）に活性が認められ
たので、この画分を回収し、更に分析用μ Bondapak
Ｃ18カラム（4.6mm×30cm）による精製を施したのち、
メインピークを回収し凍結乾燥した。得られた標品につ
いて前述の「ＣＳＡの測定方法(a)」によって検定した
ところヒトＧ−ＣＳＦ活性を有することを認めた。

実施例３ アミノ酸配列の決定 (i)Ｎ末端アミノ酸配列の決定 試料を気相式シークエンサー（アプライドバイオシステ
ム社製）を用いてエドマン（Ｅｄｍａｎ）分解し、得ら
れたＰＴＨアミノ酸を高速液体クロマトグラフィー装置
（ベックマン・インストルメンツ社製）およびUltrasph
ere−ＯＤＳカラム（ベックマン・インストルメンツ社
製）を用いて常法により分析した。カラム（５μｍ，直
径4.6mm，長さ250mm）を開始緩衝液（15ｍＭ酢酸ナトリ
ウム緩衝液pH4.5，40％アセトニトリルを含む水溶液）
にて平衡化したのち、検体（20μの開始緩衝液にて溶
解）を注入して開始緩衝液によるイソクラティック溶出
により分離を行った。流速は1.4ml／分、カラム温度は4
0℃に保持した。ＰＴＨアミノ酸の検出は269nmと320nm
の紫外部吸収を利用した。あらかじめ標準ＰＴＨアミノ
酸（シグマ社製）各２ｎ molを同一の系で分離して保
持時間を決定し、被検検体の保持時間から同定を行っ
た。

この結果、Ｎ末端から40残基目までのアミノ酸配列は次
の如く決定された。

Ｈ_２Ｎ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａ
ｌａ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｓｅ
ｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌ
ｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌ
ａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ− (ii)ブロムシアン分解 試料を70％ギ酸に溶かし、昇華精製したブロムシアン20
0当量を加えて、37℃で一夜反応させた。次に反応物を
凍結乾燥後、ＴＳＫ Ｇ3000ＳＷカラム（東洋曹達社
製）を用いたＨＰＬＣで分画し４つのピークを得た。ピ
ークを分子量の大きい順にＣＮ−１，ＣＮ−２，ＣＮ−
３，ＣＮ−４と命名し、収率のよいＣＮ−１，ＣＮ−２
についてアミノ酸配列を自動気相式シークエンサー（ア
プライドバイオシステム社製）を用いて(i)と同様の条
件で分析した。

その結果、ＣＮ−１はＧ−ＣＳＦタンパクのＮ末端から
のペプチドであることがわかった。さらにＣＮ−２は以
下のアミノ酸配列を有していた。

Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐ
ｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ− (iii)トリプシン分解 試料を８Ｍ尿素を含む0.1Ｍトリス塩酸緩衝液（pH7.4）
に溶かし、0.1％２−メルカプトエタノールを含む0.1Ｍ
トリス塩酸緩衝液（pH7.4）を加えて最終的に２Ｍの尿
素となるように調整した。次いで試料と酵素が50：１と
なるようにＴＰＣＫ処理トリプシン（シグマ社製商品
名）を加え、25℃で４時間反応させた後、さらに同量の
ＴＰＣＫ処理トリプシンを加えて、再度25℃で16時間反
応させた。反応後、反応物をＣ８カラム（山村化学社
製）を用いた高速逆相カラムクロマトグラフィーに付し
た。溶出は0.1％ＴＦＡを含むｎ−プロパノールを用
い、ｎ−プロパノール濃度を５％〜60％に直線的に上げ
て行った。280nmの紫外部吸収を測定して得られたピー
クのうち、メインピークについて(i)と同条件下に自動
気相式シークエンサー（アプライドバイオシステム社
製）を用いてアミノ酸配列を分析した。その結果、メイ
ンピークは(ii)のＣＮ−２断片の一部を含む以下の配列
を有するペプチドであることがわかった。

Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐ
ｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌ
ｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ
−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−
Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−Ｐ
ｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ− 実施例４ ＤＮＡプローブの作成 (i)プローブ（ＩＷＱ）の合成 実施例３．(iii)で得られたアミノ酸配列の中からＩｌ
ｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ
−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔで示される10個のアミノ酸の
配列に基づいて、30個の連続するヌクレオチドを得た
（図１）。図１の配列に於いて、例えば５′−末端から
９位のヌクレオチドはｄＡおよびｄＧを等量含む混合物
であることを示す。原料のヌクレオチドは主にダイマー
を使用し、必要に応じて随時モノヌクレオチドも使用し
た。グラスフィルター付きカラムに出発原料のヌクレオ
チド樹脂Ａｐ−ｄ（Ｇ）（ヤマサ醤油社製）20mgを入れ
塩化メチレンにて洗浄を繰り返した後、３％トリクロロ
酢酸を含む塩化メチレン溶液にて、４，４′−ジメトキ
シトリチル基を脱離せしめ、次いで１mlの塩化メチレン
でカラムを数回洗浄した。無水ピリジンで洗浄して溶媒
を置換したのちヌクレオチドダイマー（ＤＭＴｒ）Ａｐ
Ｔｐ（ＮＨＲ_３）（日本ゼオン社製；ＮＨＲ_３はトリエ
チルアンモニウム，ＤＭＴｒはジメトキシトリチルを示
す）20mgと0.2mlのピリジンを加えて真空ポンプにてカ
ラム内を真空乾燥した。次いで、２，４，６−トリメチ
ルベンゼンスルホニル−３−ニトロトリアゾリド（ＭＳ
ＮＴ，和光純薬社製）20mgと無水ピリジン0.2mlを加え
た後、カラム内を窒素ガスで置換して、室温下に45分間
時々振とうさせることによってヌクレオチド樹脂とダイ
マーを縮合させた。反応終了後、ピリジンにてカラムを
洗浄し、次いで未反応のＯＨ基を過剰の無水酢酸と４−
ジメチルアミノピリジンを含むピリジン溶液にてアセチ
ル化した後、再びカラムをピリジンで洗浄した。以下同
様に、(DMTr)Ip(NHR₃)，(DMTr)GpGp(NHR₃)，(DMTr)Ip(N
HR₃)，(DMTr)CpTp(NHR₃)と(DMTr)TpTp(NHR₃)の等量混合
物，(DMTr)ApAp(NHR₃)と(DMTr)ApGp(NHR₃)の等量混合
物，(DMTr)ApGp(NHR₃)と(DMTr)GpGp(NHR₃)の等量混合
物，(DMTr)GpAp(NHR₃)，(DMTr)TpGp(NHR₃)，(DMTr)ApAp
(NHR₃)と(DMTr)GpAp(NHR₃)の等量混合物，(DMTr)CpAp(N
HR₃)，(DMTr)ApAp(NHR₃)と(DMTr)ApGp(NHR₃)との等量混
合物，(DMTr)GpCp(NHR₃)，(DMTr)TpGp(NHR₃)，(DMTr)Ip
(NHR₃，(DMTr)ApTp(NHR₃) ［(DMTr)Ip(NHR₃)はヤマサ醤油社製，その他は全て日本
ゼオン社製］の順で、前述の操作を繰り返すことによっ
て縮合させた。最終段階の反応終了後、アセチル化する
ことなしに、ピリジン，塩化メチレン，エーテルの順で
樹脂を洗浄した後、乾燥させた。乾燥させた樹脂を１Ｍ
テトラメチルグアニジンおよび１Ｍα−ピコリンアルド
キシムを含むジオキサン１ml，ピリジン0.5ml，水0.2ml
の混合液1.7mlに懸濁した後、一夜室温にて放置した
後、100〜200μまで減圧濃縮した。この濃縮液に少量
（２〜３滴）のピリジンを加えた後、濃アンモニア水２
〜３mlを加え55℃で６時間加温した。次いで酢酸エチル
を加えて抽出分離し、得られた水層を減圧濃縮した後、
50ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸溶液（pH7.0）に溶
解せしめてＣ−18カラム（1.0×15cm，Ｗａｔｅｒｓ社
製）を用いたカラムクロマトグラフィーに付した。溶出
は、50ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸溶液（pH7.0）
中10％〜30％の直線濃度勾配のアセトニトリルで行い、
アセトニトリル濃度が25％付近の位置で溶出されるピー
ク画分を減圧濃縮した。

この濃縮液に80％酢酸を加えて室温下に30分間放置した
後、酢酸エチルを加えて抽出・分離し得られた水層を減
圧下に濃縮した。得られた濃縮液は、Ｃ18カラム（セン
シュー科学社製，ＳＳＣ−ＯＤＳ−272，６φ×200mm）
を用いた高速液体クロマトグラフィーに付して、さらに
精製した。溶出は50ｍＭトリエチルアンモニウム酢酸溶
液（pH7.0）中の10％〜20％の直線濃度勾配のアセトニ
トリルを用いて行い、１０Ａ_２６０units以上の収量で
合成ＤＮＡが得られた。

(ii)プローブ(A)の合成 実施例３．(iii)で得られたアミノ酸配列の中からＭｅ
ｔ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｌａで示される５個の
アミノ酸の配列に基づいて14個の連続するヌクレオチド
を得た（図１）。

合成は、プローブ（ＩＷＱ）と同様な方法で行いヌクレ
オチド樹脂ＡＰ−ｄ（Ｔ）（ヤマサ醤油社製）に(DMTr)
CpAp(NHR₃)；(DMTr)GpGp(NHR₃)；(DMTr)CpAp(NHR₃)，(D
MTr)CpTp(NHR₃)，(DMTr)CpGp(NHR₃)および(DMTr)CpCp(N
HR₃)の等量混合物；(DMTr)ApGp(NHR₃)，(DMTr)TpGp(NHR
₃)，(DMTr)GpGp(NHR₃)および(DMTr)CpGp(NHR₃)の等量混
合物；(DMTr)ApAp(NHR₃)；(DMTr)CpAp(NHR₃)と(DMTr)Cp
Gp(NHR₃)の等量混合物；(DMTr)Gp(NHR₃)（いずれも日本
ゼオン社製）の順に縮合させて約１０Ａ_２６０unitsの
合成ＤＮＡを得た。

得られたオリゴヌクレオチドの塩基配列をMaxam−Gilbe
rt法により調べたところ図１に示された塩基配列を有し
ていることが確認された。

(iii)プローブ（ＬＣ）の合成 アプライドバイオシステム社のＤＮＡ合成機380Ａによ
り、自動合成を行った。この方法はCaruthers等の記載
した原理（Ｊ．Ａｍ．Chem．Soc，103巻3185頁(1981)）
に基づいており、ホスホアミダイト法と称されている。

５′のジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）を脱保護した
ｄＧ−Ｓ（Ｓは支持体）にテトラゾールで予め活性化し
た（ＤＭＴｒ）−ｄＴのホスホアミダイト体を縮合させ
た後、未反応の水酸基をアセチル化し、次いで水存在下
でヨウ素酸化を行ってリン酸体に導いた。ＤＭＴｒ基を
脱保護し、以後同様に縮合を繰り返して図１に示される
如き配列の24個のヌクレオチドを合成した。得られたヌ
クレオチドを支持体から開裂せしめ脱保護した後、Ｃ18
カラム（センシュー科学社製ＳＳＣ−ＯＤＳ−272）を
用いた逆相系高速液体クロマトグラフィーにて精製し
た。

実施例５ ＣＨＵ−２細胞の培養とｍＲＮＡの精製 １）ＣＨＵ−２細胞の培養と細胞の回収 樹立されたＣＨＵ−２細胞を150cm²の培養フラスコ２本
に完全に密に増殖させた後、これをウシ胎児血清を10％
含有するＲＰＭＩ1640培養液500mlに浮遊させたのち、1
580cm²のガラス製ローラーボトル（Ｂｅｌｃｏ社製）に
移し、0.5r.p.m.の速度で４日間回転培養を行った。細
胞がローラーボトルの内壁に完全に密に増殖した時点
で、ローラーボトルから培養液を除き、あらかじめ37℃
に加温したＥＤＴＡを0.02％含む生理食塩水100mlを加
え、37℃で２分間加温後、ピペット操作にて細胞をはく
離せしめた。得られた細胞懸濁液を1500r.p.m.10分間の
遠心にて細胞ペレットを得る。細胞をＥＤＴＡを含まな
い生理食塩水５mlに再び懸濁し、1500r.p.m.10分間遠心
にて細胞ペレットを得た（湿重量約0.8ｇ）、このよう
にして得られた細胞はＲＮＡ抽出操作を行うまで−80℃
にて凍結保存する。

２）ｍＲＮＡの精製 上記の如くして得られたＣＨＵ−２細胞からのｍＲＮＡ
の単離は本質的に“Molecular cloning”［Maniatis
等，Cold Spring Harbor，196頁 (1982)］に記載され
ているようにして実施した。凍結保存されていたＣＨＵ
−２細胞（湿重量3.8ｇ）に20mlの６Ｍグアニジン溶液
（６Ｍグアニジンチオシアナート，５ｍＭクエン酸ナト
リウム（pH7.0），0.1Ｍ βメルカプトエタノール，0.
5％ザルコシル硫酸ナトリウム）に懸濁し、Vortexミキ
サーにて２〜３分よく混合した後、18Ｇの注射針を装て
んした20ml容の注射器を用いて10回吸入排出を繰り返し
た。ベックマン社製ＳＷ40Ｔｉローターに合うポリアロ
マー製の遠心チューブに６mlの5.7Ｍ ＣｓＣｌ−0.1Ｍ
ＥＤＴＡ，（pH7.5）を先に加えておき、チューブが
満たされるように上述の細胞が壊れて粘稠になったグア
ニジン溶液約６mlを重層した。このようにして調製され
た遠心チューブ４本を30,000r.p.m.、20℃で15時間遠心
した後、得られたペレットを少量の70％エタノールを用
いて３回洗浄した。

各々のチューブから得られたペレットを合して550μ
の水に溶解せしめＮａＣｌ濃度が0.2Ｍとなるように調
整したのち、フェノールクロロホルム（１：１）処理、
クロロホルム処理後、2.5倍容量のエタノールを加えて
エタノール沈澱を行い全ＲＮＡを得た（湿細胞3.8ｇよ
り全ＲＮＡ約10.1mgを得た）。

全ＲＮＡからポリ（Ａ^＋）−ＲＮＡの精製は以下の如く
行った。この方法はｍＲＮＡが３′末端にポリＡ鎖を付
加していることを利用したアフィニティークロマトグラ
フィーである。オリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｐ−Ｌ
Biochemicals社製Type７）を用い、吸着は全ＲＮＡを吸
着緩衝液（10ｍＭトリス−塩酸（pH7.5），0.5Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，0.1％ＳＤＳ溶液を含む）に
溶解し、65℃で５分間加熱した後、同溶液にて充てんさ
れたオリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムに通過させて行
い、溶出はＴＥ溶液（10ｍＭトリス−塩酸（pH7.5）、
１ｍＭ ＥＤＴＡを含む）で行った。未吸着通過液は再
び同カラムに通して同様に溶出操作を行い、１回目の溶
出液と混合した。このような操作を用いて、ポリ
（Ａ^＋）−ＲＮＡ400μｇを得た。

このようにして調製したｍＲＮＡをSchleifとWensinkの
実験技術書（Practical Methods in Molecular Biolog
y，Springer−Verlag，New York，Heiderberg，Berli
n，(1981)）中に記載されている方法と同様の操作で、
ショ糖密度勾配遠心法によりサイズ分画した。

すなわち、ＳＷ40Ｔｉローター（Beckman社製）用チュ
ーブに５％〜25％のショ糖密度勾配を作る。ショ糖溶液
は0.1Ｍ ＮａＣｌ，10ｍＭトリス−塩酸（pH7.5），１
ｍＭ ＥＤＴＡ，0.5％ＳＤＳの溶液にそれぞれ５％、2
5％の割合いでＲＮａｓｅフリーのショ糖（Schwarz／Ma
nn社製）を含んでいる。

上記で述べた如き方法で調製したｍＲＮＡ（ポリ
（Ａ^＋）−ＲＮＡ）800μｇを200μ〜500μのＴＥ
溶液に溶解せしめ、65℃で５分間加熱後急冷した後、シ
ョ糖密度勾配液の上にのせる。30000r.p.m.にて20時間
遠心後0.5mlずつの分画を集め260nmの吸光度を測り、同
様に行った標準ＲＮＡ（28Ｓ，18Ｓ，５Ｓのリボソーム
ＲＮＡ）の位置に基づいて、分画されたＲＮＡのサイズ
を決めると同時に各分画のＧ−ＣＳＦ活性をアフリカツ
メガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞系を用いて調べ
た。すなわち各分画のｍＲＮＡを１μｇ／μの濃度の
水溶液に調製し、ツメガエル（生後約１年）から取り出
した卵母細胞１個に50ngのｍＲＮＡの割合いで注入した
後、96穴のマイクロタイタープレートの１穴に卵母細胞
を10個ずつ入れ、それぞれ100μのバース培地（88mM
ＮａＣｌ，１mMＫＣｌ，2.4mM ＮａＨＣＯ_３，0.82mM
ＭｇＳＯ_４，0.33mMＣａ（ＮＯ_３）_２，0.41mMＣａＣｌ
_２，7.5mMトリス−塩酸（pH7.6），ペニシリン10mg／
，ストレプトマイシン硫酸10mg／）中で48時間室温
で培養した後上清を回収し、濃縮・精製してＧ−ＣＳＦ
活性を測定する。

この結果、15〜17Ｓ画分にＧ−ＣＳＦ活性が認められ
た。

実施例６ ｃＤＮＡの合成（ｐＢＲ系ｃＤＮＡライブラ
リーの構築） 前述の方法で得られたポリ（Ａ^＋）−ＲＮＡからＬａｎ
ｄ等の方法［Nucleic Acids Res．，９巻2251頁(198
1)］に基づき、GublerとHoffmanの方法［Ｇｅｎｅ，25
巻263頁(1983)］を加味してｃＤＮＡを合成した。

１）１本鎖ｃＤＮＡの合成 エッペンドルフ社製1.5ml容チューブに以下の如くの順
序で試薬を入れる。80μの反応緩衝液（500ｍＭ Ｋ
Ｃｌ，50ｍＭ ＭｇＣｌ_２，250ｍＭトリス−塩酸，pH
8.3），20μの200mMジチオスレイトール，32μの1
2.5mM ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄ
ＴＴＰを各々12.5ｍＭ含む），10μのα−^３２Ｐ−ｄ
ＣＴＰ（アマシャム製，ＰＢ10205），32μのオリゴ
（ｄＴ）_{１２−１８}（Ｐ−Ｌ Biochemicals社製，500
μｇ／ml），20μのポリ（Ａ^＋）−ＲＮＡ（2.1μｇ
／μ），蒸溜水206μの計400μの反応液を65℃で
５分間加熱後、42℃で５分間加温する。この反応液に逆
転写酵素（宝酒造製）120単位を加え、さらに42℃、２
時間反応させた後、ＲＮａｓｅインヒビター（Bethesda
Research Laboratories社製）２μ、20μのＴＥ溶
液、16μの100ｍＭピロリン酸ナトリウム、48単位
（４μ）の逆転写酵素を追加して、今度は46℃２時間
反応せしめた。0.5Ｍ ＥＤＴＡ ８μ，10％ＳＤＳ
８μを加えて反応を停止させた後、フェノール−ク
ロロホルム処理、エタノール沈澱（２回）を行い一本鎖
ｃＤＮＡを得た。

２）１本鎖ｃＤＮＡへのｄＣ−鎖付加 上記で得られた一本鎖ｃＤＮＡを60μの蒸溜水に溶解
後、60μのｄＣ−鎖付加緩衝液（400ｍＭカコジル酸
カリウム；50ｍＭトリス−塩酸（pH6.9）；４ｍＭジチ
オスレイトール；１mMＣｏＣｌ_２；１ｍＭ ｄＣＴＰ）
に加え、37℃で５分間加温した。この反応液にターミナ
ルトランスフェラーゼ（27unit／μ，P-L Biochemica
ls社製）３μを加えて37℃で2.5分間反応した後、フ
ェノール−クロロホルム処理（１回）、およびエタノー
ル沈澱（２回）を行い、100ｍＭ ＮａＣｌを含むＴＥ
溶液40μに溶解せしめた。

３）２本鎖ｃＤＮＡの合成 上記40μのＤＮＡ溶液に４μのオリゴ（ｄＧ）
_{１２−１８}（200μｇ／ml，P-L Biochemicals社製）を
加え65℃５分間、続いて42℃で30分間加温した後、反応
液を０℃に保った。この反応液に緩衝液80μ（100ｍ
Ｍトリス−塩酸、pH7.5，20ｍＭＭｇＣｌ_２，50ｍＭ
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，500ｍＭ ＫＣｌ），４μの４
ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧｔｐ，ｄＴ
ＴＰを各々４ｍＭ含む）、60μの１ｍＭ β−ＮＡＤ
及び210μの蒸溜水、20μのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（宝酒造社製）、15μのＥ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）、15μのＥ．ｃｏｌ
ｉ ＲＮａｓｅ Ｈ（宝酒造社製）を加え12℃にて１時
間反応させた後、さらに４μの４ｍＭｄＮＴＰを追加
し、25℃で１時間反応して、フェノール−クロロホルム
処理、エタノール沈澱（１回）を行って、約８μｇの２
本鎖ｃＤＮＡを得た。この２本鎖ｃＤＮＡをＴＥ溶液に
溶解せしめ、1.2％アガロースゲル電気泳動を行い、約5
60塩基対（ｂｐ）〜２キロ塩基対（Ｋｂｐ）の大きさに
相当する部分をワットマンＤＥ８１（ワットマン社製）
に吸着させ溶出回収したところ、約0.2μｇが回収され
た。

４）２本鎖ｃＤＮＡへのｄＣ−鎖付加 上記の如く得られた２本鎖ｃＤＮＡを40μのＴＥ溶液
に溶解し、２）の項で述べたｄＣ−鎖付加緩衝液８μ
を加え37℃で２分間加温した後、１μのターミナルト
ランスフェラーゼ（27unit／μ）を加えて37℃で３分
間反応せしめた。反応液を直ちに０℃に冷却し0.5Ｍ
ＥＤＴＡ１μを加えて反応を停止した後、フェノール
−クロロホルム処理、エタノール沈澱を行い、得られた
沈澱をＴＥ溶液10μに懸濁した。

５）ｐＢＲ系ｃＤＮＡライブラリーの構築 市販のオリゴ（ｄＧ）鎖付加ｐＢＲ322ベクター（ベセ
スダリサーチラボラトリーズ社製、10ng／μ）４μ
と上記ｄＣ−鎖付加２本鎖ｃＤＮＡ２μを75μの0.
1Ｍ ＮａＣｌを含むＴＥ溶液の中でアニールさせた。
アニールは65℃、５分加温した後40℃にて２時間加温、
その後、室温になるまで放置して行った。

一方、Maniatisらの実験書［Molecular cloning，Cold
Spring Harbor，249頁(1982)］に記載されている方法等
を用いて大腸菌Ｘ1776株からコンピテント細胞を調製
し、上記アニールされたプラスミドにより形質転換を行
い、トランスフォーマント（形質転換体）が得られた。

実施例７ ｃＤＮＡ合成（λファージ系ライブラリーの
構築） １）１本鎖ｃＤＮＡの合成 実施例５で述べた方法に従って3.8ｇの凍結保存ＣＨＵ
−２細胞から２回オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムによ
る精製を経て400μｇのポリ（Ａ^＋）−ＲＮＡを得た。

このポリ（Ａ^＋）−ＲＮＡ12μｇを溶解したＴＥ溶液10
μを10μｇのアクチノマイシンＤ（シグマ社製）を含
む反応チューブに入れた後、以下の順序で試薬類を加え
た；20μの逆転写緩衝液（250ｍＭトリス−塩酸（pH
8.3），40ｍＭ ＭｇＣｌ_２，250ｍＭ ＫＣｌ），20μ
の５ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＴＴＰを各々５ｍＭ含む）、20μｌのオリゴ（ｄ
Ｔ）_{１２−１８}（0.2μｇ／ml P-L Biochemicals社
製），１μの１Ｍジチオスレイトール，２μの30un
it／μのＲＮａｓｉｎ（プロメガバイオテク社），10
μの逆転写酵素（10unit／μ生化学工業社製），１
μのα−［^３２ｐ］dATP（10μＣｉアマシャム社
製），16μの水で計100μの液量の反応液になる。
反応液を42℃で２時間保った後、５μの0.5Ｍ ＥＤ
ＴＡ及び１μの20％ＳＤＳを加えて反応を停止した。
フェノール−クロロホルム（100μ）処理、エタノー
ル沈澱（２回）を行って約４μｇの１本鎖ｃＤＮＡを得
た。

２）２本鎖ｃＤＮＡの合成 上記の如く得られたｃＤＮＡを29μのＴＥ溶液に溶解
し以下の順序で試薬類を加えて反応液とした；25μの
ポリメラーゼ緩衝液（400ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（pH7.6）；
16ｍＭ ＭｇＣｌ_２；63mMのβ−メルカプトエタノー
ル；270ｍＭ ＫＣｌ）；10μの５ｍＭ ｄＮＴＰ；
1.0μの15ｍＭ β−ＮＡＤ；1.0μのα−
［^３２ｐ］ｄＡＴＰ（10μＣｉ／μ）；0.2μＥ．
ｃｏｌｉＤＮＡリガーゼ（60unit／μ宝酒造社製）；
5.0μのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩ（New E
ngland Biolabs社，10unit／μ）；0.1μのＲＮａ
ｓｅ Ｈ（60unit／μ宝酒造社製）；28.7μの蒸溜
水。

反応液を14℃で１時間インキュベートした後、室温にも
どして、さらに１時間インキューベートした。次いで５
μの0.5Ｍ ＥＤＴＡと１μの20％ＳＤＳを加えて
反応を停止させ、フェノール−クロロホルム処理、エタ
ノール沈澱を行った。得られたＤＮＡを0.5mM ＥＤＴ
Ａ20μに溶解せしめ、３μのＫｌｅｎｏｗ緩衝液
（500ｍＭトリス−塩酸（pH8.0），50mM ＭｇＣ
ｌ_２），３μの５ｍＭ ｄＮＴＰ，及び水４μを加
えて反応液を調製した後、１μのＤＮＡポリメラーゼ
（Ｋｌｅｎｏｗ断片）（宝酒造社製）を加えて30℃15分
インキュベートした。

この反応液に70μのＴＥ溶液を加えて希釈し、さらに
５μの0.5Ｍ ＥＤＴＡ，１μの20％ＳＤＳを加え
て反応を停止した。反応液をフェノール−クロロホルム
処理し、エタノール沈澱を行って約８μｇの２本鎖ｃＤ
ＮＡを得た。

３）２本鎖ｃＤＮＡのメチル化 ２）の項で合成した２本鎖ｃＤＮＡの水溶液30μ、メ
チル化緩衝液（500ｍＭトリス−塩酸（pH8.0），50ｍＭ
ＥＤＴＡ）40μ，ＳＡＭ溶液（800μＭ Ｓ−アデ
ノシル−Ｌ−メチルメチオニン（ＳＡＭ），50ｍＭ β
−メルカプトエタノール）20μ，水100μを加えた
混合液にＥｃｏＲＩメチラーゼ（New England Biolabs
社，20unit／μ）15μを加えて全反応液を200μ
とし、37℃２時間インキュベートした。フェノール処
理、エーテル処理を行った後、エタノール沈澱を行って
ＤＮＡを回収した。

４）ＥｃｏＲＩリンカーの付加 上記メチル化された２本鎖ＤＮＡ約1.2μｇにリガーゼ
緩衝液（250ｍＭトリス−塩酸 （pH7.5），100ｍＭ
ＭｇＣｌ_２）1.5μ，あらかじめリン酸化されたＥｃ
ｏＲＩリンカー0.5μ（10mer，宝酒造社製），1.5μ
の10ｍＭＡＴＰ，100ｍＭジチオスレイトール1.5μ
，２μのＨ_２Ｏを加え、反応液を15μとしてＴ４
ＤＮＡリガーゼ（3.4ｕ／μ，宝酒造社製）0.7μを
加えて４℃で一晩反応させた後、65℃にて10分間加熱し
リガーゼを失活させた。この反応液をさらに100ｍＭト
リス−塩酸（pH7.5），５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，50ｍＭ
ＮａＣｌ，100μｇ／mlのゼラチンの濃度で全液量が50
μになるように調製した後、ＥｃｏＲＩ（10unit／μ
）3.5μ加え、37℃、２時間反応させた。次いで0.5
ＭのＥＤＴＡ2.5μ、20％ＳＤＳ0.5μを加えた後フ
ェノール−クロロホルム処理を行いエタノール沈澱によ
りＤＮＡを回収した。この後Ultrogel AcA34（ＬＫＢ社
製）のゲル濾過法あるいはアガロースゲル電気泳動法に
て未反応のＥｃｏＲＩリンカーを除去し、リンカー付加
２本鎖ｃＤＮＡ約0.5〜0.7μｇを回収した。

５）２本鎖ｃＤＮＡとλｇｔ10ベクターの結合 上記のリンカー付加２本鎖ｃＤＮＡを、2.4μｇの予じ
めＥｃｏＲＩ処理したλｇｔ10ベクター（ベクタークロ
ーニングシステム社），リガーゼ緩衝液（250ｍＭトリ
ス塩酸，100ｍＭ ＭｇＣｌ_２）1.4μ，蒸溜水6.5μ
を加えて、42℃、15分間処理した後、10ｍＭ ＡＴＰ
１μ，0.1Ｍジチオスレイトール１μ，Ｔ_４ＤＮＡ
リガーゼ0.5μを加え全量を15μとした後、12℃で
一晩反応させた。

６）インビトロパッケージング 上記５）で得られた組換え体ＤＮＡの約1/3をインビト
ロパッケージングキット（プロメガ バイオテク社）を
用いてパッケージングし、ファージプラークを得た。

実施例８ プローブ（ＩＷＱ）によりｐＢＲ系ライブラ
リーのスクリーニング コロニーの成育した寒天培地上にワットマン541濾紙を
のせ37℃で２時間放置した。以下、TaubとThompsonの方
法［Anal，Biochem．126巻 222頁(1982)］に準じて濾
紙を処理した。

すなわち、541濾紙にコロニーを移した後、クロラムフ
ェニコール（250μｇ／μ）を含んだ寒天培地に移
し、さらに37℃で一晩放置した。

541濾紙を取り出した後、室温下で0.5Ｎ ＮａＯＨ溶液
を浸した濾紙上に３分間放置し、これを２回くり返し
た。以下同様な操作を0.5Ｍトリス−塩酸（pH８）溶液
を用いて３分間、２回行ない、更に４℃下に0.05Ｍトリ
ス−塩酸（pH８）溶液で３分、1.5mg／mlのリゾチーム
液（0.05Ｍトリス−塩酸（pH８），25％ショ糖を含む）
で10分間、次いで37℃下に１×ＳＳＣ（0.15Ｍ ＮａＣ
ｌ及び0.015Ｍクエン酸ナトリウム）溶液で２分間、200
μｇ／mlプロテアーゼＫを含む１×ＳＳＣ溶液で30分
間、再び室温下に１×ＳＳＣ溶液で２分間、95％エタノ
ール溶液で２分間、２回行った後、541濾紙を乾燥させ
た。得られた乾燥541濾紙を室温下にフェノール：クロ
ロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１，100ｍ
Ｍトリス−塩酸（pH8.5），100ｍＭ ＮａＣｌ，10ｍＭ
ＥＤＴＡで平衡化したもの）溶液に30分間浸した。以
下同様の操作を５×ＳＳＣ溶液で３分間、３回、次いで
95％エタノール溶液で３分間、２回行った後、濾紙を乾
燥させた。

プローブ（ＩＷＱ）を常法（Molecular cloningを参
照）に従って^３２Ｐを用いて放射標識した後、Wallace
等の方法（Nucleic Acids Res，９巻 879頁(1981)）に
従ってコロニーハイブリダイゼーションを行った。６×
ＮＥＴ［0.9Ｍ ＮａＣｌ，0.09Ｍトリス−塩酸（pH7.
5），６ｍＭ ＥＤＴＡ］，５×Denhardt溶液，0.1％Ｓ
ＤＳ，0.1mg／ml変性ＤＮＡ（仔牛胸腺ＤＮＡ）を含む
ハイブリダイゼーション緩衝液中で65℃、４時間、プレ
ハイブリダイゼーションを行った後、放射標識化したプ
ローブ（ＩＷＱ）１×10⁶cpm／mlを含む前記ハイブリダ
イゼーション緩衝液を用いて56℃で一夜ハイブリダイゼ
ーションを行った。反応終了後541濾紙を室温下に0.1％
ＳＤＳを含む６×ＳＳＣ溶液で30分、２回および56℃、
1.5分間洗滌した後、オートラジオグラフィーを行っ
た。

シグナルの出たクローンよりプラスミドを分離した後、
プローブ（ＩＷＱ）を用いてサザンプロッティングを行
った。ハイブリダイゼーションおよびオートラジオグラ
フィーは前述と同一の条件で行なった。

同様にプローブ（Ａ）を用いてサザンブロッティングを
行った。ハイブリダイゼーションは前述のハイブリダイ
ゼーション緩衝液を用い、49℃で１時間行い、39℃まで
徐冷後さらに39℃で１時間行なった。反応終了後、ニト
ロセルロースフィルターを0.1％ＳＤＳを含む６×ＳＳ
Ｃで室温下に30分で２回洗滌し、次いで39℃で３分間洗
浄滌した後、オートラジオグラフィーを行なった。

この結果、１個のクローンがポジティブなものとして得
られ、ジデオキシ法により塩基配列を決定したところ図
２に示した如く、プローブ（ＩＷＱ）及びプローブ
（Ａ）部分を含む308塩基対よりなるＤＮＡであること
が判明し、このインサートを含むｐＢＲ322由来プラス
ミドをｐＨＣＳ−１と命名した。

実施例９ ｐＨＣＳ−１由来ＤＮＡプローブによるλフ
ァージ系ライブラリーのスクリーニング BentonとDavisの方法［Science 196巻，180頁，(197
7)］に準じてプラークハイブリダイゼーションを行っ
た。実施例８で得られたｐＨＣＳ−１をＳａｕ３Ａおよ
びＥｃｏＲＩで処理して約600塩基対のＤＮＡ断片を
得、このＤＮＡ断片を常法に従いニックトランスレーシ
ョンにより放射標識した。ファージプラークの生じた寒
天培地上にニトロセルロース濾紙（Ｓ＆Ｓ社）をのせて
ファージを移し、0.5Ｍ ＮａＯＨにてＤＮＡを変性さ
せ、以下の順序で濾紙を処理した。0.1Ｍ ＮａＯＨ，
1.5Ｍ ＮａＣｌで20秒続いて0.5Ｍトリス−塩酸（pH7.
5），1.5Ｍ ＮａＣｌで20秒２回，最後に120ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，15ｍＭ クエン酸ソーダ，13ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ
_４，１ｍＭ ＥＤＴＡ，pH7.2で20秒処理した。

次いで濾紙を乾燥し、80℃で２時間加熱してＤＮＡを固
定した。５×ＳＳＣ，５×Denhardt溶液，50ｍＭリン酸
緩衝液，50％ホルムアミド，0.25mg／mlの変性ＤＮＡ
（鮭精巣ＤＮＡ），及び0.1％ＳＤＳを含むハイブリダ
イゼーション緩衝液中で42℃にて一晩プレハイブリダイ
ゼーションを行い、ニックトランスレーションにより放
射標識化したｐＨＣＳ−１プローブ４×10⁵cpm／mlを含
むハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ，５×De
nhardt溶液，20ｍＭリン酸緩衝液（pH6.0），50％ホル
ムアミド，0.1％ＳＤＳ，10％デキストラン硫酸，0.1mg
／mlの変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ）の混合液）で42℃に
て20時間ハイブリダイゼーションを行った。

ニトロセルロース濾紙を室温下に0.1％ＳＤＳを含む２
×ＳＳＣで20分間洗滌し、次いで44℃で、0.1％ＳＤＳ
を含む0.1×ＳＳＣで30分間、さらに室温下で0.1×ＳＳ
Ｃで10分間洗滌した後、オートラジオグラフィーで検出
した。

その結果、５個のポジティブなクローン（Ｇ１〜５）が
得られた。そこで、得られたクローンのうち完全長ｃＤ
ＮＡを含むと思われるクローンのＤＮＡ塩基配列をジデ
オキシ法にて調べたところ図３(A)に示される如き塩基
配列が得られた。そこでこのｃＤＮＡをλｇ10ベクター
より切りだし、ｐＢＲ327［Soberon等；Gene9巻 287頁
(1980)］とＥｃｏＲＩ部位で結合させ、プラスミドとし
て大量調製した。このプラスミドをｐＢＲＧ４と称す
る。

実施例10．ｐＢＲＧ４由来ＤＮＡプローブおよびプロー
ブ（ＬＣ）によるλファージ系ライブラリーのスクリー
ニング 実施例９で用いたBentonとDavisの方法（前出の文献を
参照）に準じてプラークハイブリダイゼーションを行っ
た。ファージプラークの生じた寒天培地上にニトロセル
ロース濾紙（Ｓ＆Ｓ社製）をのせてファージを移し、0.
5Ｍ ＮａＯＨにてＤＮＡを変性させ、以下の順序で濾
紙を処理した。0.1Ｍ ＮａＯＨ、1.5Ｍ ＮａＣｌで20
秒、続いて0.5Ｍトリス−塩酸（pH7.5）、1.5Ｍ Ｎａ
Ｃｌで20秒２回、最後に120ｍＭ ＮａＣｌ、15ｍＭク
エン酸ソーダ、13ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、（pH7.2）で20秒処理した。次いで濾紙を乾燥し、8
0℃で２時間加熱してＤＮＡを固定した。このようにし
て同一の濾紙を２枚作製し、ｐＢＲＧ４由来ＤＮＡプロ
ーブとプローブ（ＬＣ）によるスクリーニングにそれぞ
れ供した。ｐＢＲＧ４由来ＤＮＡプローブによる場合
は、ｐＢＲＧ４をＥｃｏＲＩで処理して約1500塩基対の
ＤＮＡ断片を得、このＤＮＡ断片を常法に従ってニック
トランスレーションにより放射標識した。上記濾紙を５
×ＳＳＣ、５×Denhardt溶液、50mMリン酸緩衝液、50％
ホルムアミド、0.25mg／mlの変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮ
Ａ）、及び0.1％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション
緩衝液中で42℃にて一晩、プレハイブリダイゼーション
を行い、上記の放射標識した約1500塩基対のＤＮＡプロ
ーブ（約１×10⁶cpm／ml）を含むプレハイブリダイゼー
ション緩衝液［５×ＳＳＣ、５×Denhardt溶液、20ｍＭ
リン酸緩衝液（pH6.0）、50％ホルムアミド、0.1％ＳＤ
Ｓ、10％デキストラン硫酸、0.1mg／mlの変性ＤＮＡ
（鮭精巣ＤＮＡ）の混合液］で42℃にて20時間ハイブリ
ダイゼーションを行った。ニトロセルロース濾紙を室温
下に、0.1％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣで20分間洗滌し、
次いで44℃で、0.1％ＳＤＳを含む0.1×ＳＳＣで30分
間、さらに室温下で0.1％ＳＳＣで10分間洗滌した後、
オートラジオグラフィーで検出した。

プローブ（ＬＣ）の場合は、濾紙を0.1％ＳＤＳを含む
３×ＳＳＣで、65℃にて２時間前処理した後、６×ＮＥ
Ｔ、１×Denhardt溶液、100μｇ／mlの変性ＤＮＡ（鮭
精巣ＤＮＡ）を含む溶液中、65℃で２時間、プレハイブ
イダイゼーションを行った。

放射標識したプローブ（ＬＣ）（２×10⁶cpm／ml）を含
むハイブリダイゼーション緩衝液［６×ＮＥＴ、１×De
nhardt溶液、100μｇ／ml変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮ
Ａ）］で63℃にて一晩ハイブリダイゼーションを行った
後、ニトロセルロース濾紙を室温下に、0.1％ＳＤＳを
含む６×ＳＳＣで20分間洗滌し、この洗滌を３回行った
後、0.1％ＳＤＳを含む６×ＳＳＣにて、63℃で２分間
洗滌した。

濾紙を乾燥した後オートラジオグラフィーで検出した。

このようにして行ったスクリーニングに於いて、２つの
プローブの両方にポジティブなクローンを選別し、その
うち完全長のｃＤＮＡを含むと思われるクローンの塩基
配列をジデオキシ法にて調べたところ、図４(A)に示さ
れる如き塩基配列が得られれた。そこでこのｃＤＮＡを
λｇｔ10ベクターより切りだし、ｐＢＲ327とＥｃｏＲ
Ｉ部位で結合させ、プラスミドｐＢＲＶ２を得た。

実施例11 ヒト染色体遺伝子ライブラリーのスクリーニ
ング １）ヒト染色体遺伝子ライブラリーの構築 ヒト染色体遺伝子ライブラリーはManiatis（Harvard Un
iversity）から供与を受けたが、これは次ぎのようにし
て作られたものである。

ヒト胎児肝臓から染色体全ＤＮＡをフェノールなどで抽
出し、制限酵素ＨａｅIIIとＡｌｕＩで部分消化する。
こうして得られたＤＮＡ断片の中から鎖長が18〜25Ｋｂ
程度のフラグメントをショ糖密度勾配遠心法により濃縮
し、次に制限酵素ＥｃｏＲＩの断片箇所を持つ短鎖合成
ヌクレオチドを介して大腸菌ファージλＣｈａｒｏｎ４
ＡのアームＤＮＡに接続し、感染性のあるファージＤＮ
Ａ組換え体を作成する。次に、さらに感染性を高める目
的でパッケージング法により完全なファージλ粒子にし
てある。このようにして作られたヒト遺伝子ライブラリ
ーは原理的にはほとんど全てのヒト遺伝子を含む鎖長が
18〜25ＫｂのヒトＤＮＡを含んだ組換え体の集合である
と考えられる。

２）ｐＨＣＳ−１由来ＤＮＡプローブによるヒト染色体
遺伝子ライブラリーのスクリーニング BentonとDavisの方法［Science 196巻 180頁(1977)］
に準じてプラークハイブリダイゼイションを行った。実
施例８で得られたｐＨＣＳ−１をＳａｕ３ＡおよびＥｃ
ｏＲＩで処理して約600塩基対のＤＮＡ断片を得、この
ＤＮＡ断片を常法に従いニックトランスレーションによ
り放射標識した。ファージプラークの生じた寒天培地上
にニトロセルロースろ紙（Ｓ＆Ｓ社）をのせてファージ
を移し、0.5Ｍ ＮａＯＨにてＤＮＡを変性させ、以下
の順序でろ紙を処理した。0.1Ｍ ＮａＯＨ，1.5Ｍ Ｎ
ａＣｌで20秒，続いて0.5Ｍ トリス塩酸（pH7.5），1.
5Ｍ ＮａＣｌで20秒２回，最後に120ｍＭ ＮａＣｌ，
15ｍＭクエン酸ソーダ，13ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４，１ｍＭ
ＥＤＴＡ，（pH7.2）で20秒処理した。

次いでろ紙を乾燥し、80℃で２時間加熱してＤＮＡを固
定した。５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、50ｍ
Ｍリン酸緩衝液、50％ホルムアミド、0.25mg／mlの変性
ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ），及び0.1％ＳＤＳを含むハイ
ブリダイゼーション緩衝液中で42℃にて一晩ハイブリダ
イゼーションを行いニックトランスレーションにより放
射標識したｐＨＣＳ−１プローブ４×１０^５ｃｐｍ／ml
を含むハイブリダイゼーション緩衝液［５×ＳＳＣ、５
×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、20ｍＭリン酸緩衝液（pH6.
0）、50％ホルムアミド、0.1％ＳＤＳ、10％デキストラ
ン硫酸、0.1mg／mlの変性ＤＮＡ（鮭精巣ＤＮＡ）の混
合液］で42℃にて20時間ハイブリダイゼーションを行っ
た。

ニトロセルロースろ紙を室温下に0.1％ＳＤＳを含む２
×ＳＳＣで20分間洗浄し、次いで44℃で0.1％ＳＤＳを
含む0.1×ＳＳＣで30分間、さらに室温下で0.1×ＳＳＣ
で10分間洗浄した後、オートラジオグラフィーで検出し
た。

その結果、十数個のポジティブなクローンが得られた。

これらのクローンから組換え体ＤＮＡをManiatisの方法
で（Cell 15巻687頁(1978)）により調製した。

得られたＤＮＡはＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＢｇｌII等
の各制限酵素にて処理した後、アガロースゲル電気泳動
で分析し、Fritsch等の方法（前出文献を参照）に従っ
て制限酵素地図を作成した。

上記スクリーニングに用いた放射標識されたｐＨＣＳ−
１由来のＤＮＡ断片のプローブを用いてサザンハイブリ
ダイゼーションを行い、その結果、プローブとハイブリ
ダイズした中からＥｃｏＲＩにより切断された約８キロ
塩基対のＤＮＡ断片を選び、ｐＢＲ３２７のＥｃｏＲＩ
部位にサブクローニングした。

さらに、このサブクローニングされたＤＮＡについて上
記の如き制限酵素による処理を行い、サザンハイブリダ
イゼーションを繰り返し行うことにより、ＥｃｏＲＩ及
びＸｈｏＩで切り出される約４キロ塩基対のＤＮＡ断片
にヒトＧ−ＣＳＦポリペプチドをコードする遺伝子が存
在することが判明した。

そこでデオキシ法を用いてこのＤＮＡ断片の約３キロ塩
基対の配列を調べたところ図５に示される塩基配列が得
られた。

また、このＤＮＡ断片の制限酵素切断部位は図７に示さ
れる如くであった。

ヒト染色体遺伝子のスクリーニングに用いるプローブと
して上述の他、ｐＢＲＧ４由来のＤＮＡ及びｐＢＲＶ２
由来のＤＮＡで行った。

両ＤＮＡとも、ＥｃｏＲＩで処理した1500塩基対のＤＮ
Ａ断片を直接上記の如くニックトランスレーション法に
て放射標識するか、ＥｃｏＲＩで処理した後ＤｒａＩ処
理して得られる約700塩基対のＤＮＡ断片を同様に放射
標識したものを、前述と同条件にてプラークハイブリダ
イゼーションすることによりクローンを選別した後、サ
ザンハイブリダイゼーションによる分析を行って図５に
示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を得ることができ
た。得られたプラスミドをｐＢＲＣＥ３βと命名した。

実施例12．ｐＨＧＡ−410ベクターの調製（動物細胞
用、＋ＶＳＥ系） 実施例９で得られた図３（Ａ）で示されるｃＤＮＡのＥ
ｃｏＲＩ断片を制限酵素ＤｒａＩにて３７℃で２時間処
理した後、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片
（宝酒造社製）で処理し、末端を平滑末端とした。１μ
ｇのＢｇｌIIリンカー（８ｍｅｒ；宝酒造社製）をＡＴ
Ｐを用いてリン酸化した後、上記で得られた約１μｇの
ＤＮＡ断片混合物と結合させた。次いで制限酵素Ｂｇｌ
IIで処理してアガロースゲル電気泳動を行い、最も大き
いＤＮＡ断片だけを回収した。

このＤＮＡ断片は図６に示すようにヒトＧ−ＣＳＦポリ
ペプチドをコードする部分を含む約710塩基対に相当し
ていた。ベクターｐｄＫＣＲ（Fukunaga等；Proc.Natl.
Acad.Sci.USA；81巻5086頁(1984)）を制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで処理した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造社
製）で脱リン酸して得られたベクターＤＮＡをＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造社製）を加えてｃＤＮＡ断片と結合
させｐＨＧＡ４１０を得た（図８）。図８に示されるご
とくこのプラスミドは、ＳＶ４０初期遺伝子のプロモー
ター、ＳＶ４０の複製開始領域、ウサギβ−グロビン遺
伝子の一部、ｐＢＲ３２２の複製開始領域およびｐＢＲ
３２２由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ^ｒ）をふ
くみ、ＳＶ４０初期遺伝子のプロモーター下流にヒトＧ
−ＣＳＦ遺伝子が接続されている。

実施例13．Ｃ１２７細胞用組換えベクターの構築（＋Ｖ
ＳＥ） １）．ｐＨＧＡ410（Ｈ）の構築 実施例12で得られたｐＨＧＡ４１０プラスミド（図８）
20μｇを50mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、７mMＭｇＣ
ｌ_２、100mMＮａＣｌ、７mM２−メルカプトエタノー
ル、0.01％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の反応液に溶
解し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製、10〜15単位）
を加えて約30分37℃にて反応させ、ＥｃｏＲＩによる部
分消化を行った。次いでフェノール−クロロホルム
（１：１）処理を２回行いエーテル処理、エタノール沈
澱を行ってＤＮＡ断片を処理した。

このＤＮＡ断片を50mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５mMＭｇＣｌ
_２、10mMＤＴＴ、１mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ｄＴＴＰからなる50μｌの液に溶解しＥ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼ−Ｋｌｅｎｏｗ断片（宝酒造社製）
５μを加えて14℃２時間インキュベートしブラントエ
ンド（blunt end）にした。

これから0.8％アガロースゲル電気泳動により約5.8Ｋｂ
の断片６μｇを回収した。

回収したＤＮＡ断片５μｇを再び50mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH7.6）、10mMＭｇＣｌ_２、10mM ＤＴＴ、１mMＡＴ
Ｐからなる反応液50μ中に溶解し、ＨｉｎｄIIIリン
カー（宝酒造社製）２μｇ、及びＴ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）100単位を加えて、４℃にて一晩反応し
た。次いで、フェノール処理、エーテル処理、エタノー
ル沈澱後、10mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、７mMＭｇ
Ｃｌ_２、60mMＮａＣｌの溶液30μに溶解し、制限酵素
ＨｉｎｄIII10単位存在下３時間37℃でインキュベート
した。再びＴ４ＤＮＡリガーゼにより処理した後、この
ＤＮＡを塩化ルビジウム法（前記の「Molecular Clonin
g」参照）によりＥ．ｃｏｌｉ ＤＨＩ株に形質転換
し、アンピシリン耐性（Ａｍｐ^ｒ）のコロニーを得てｐ
ＨＧＡ４１０プラスミドのＥｃｏＲＩ部位がＨｉｎｄII
Iに置きかわったプラスミドを保持する菌を選択した。
このようにして得られたプラスミドをｐＨＧＡ４１０
（Ｈ）と命名する（図９）。

２）．発現用組換えベクターｐＴＮ−Ｇ４の構築 上記１）で得られたｐＨＧＡ４１０（Ｈ）（20μｇ）を
10mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、７mMＭｇＣｌ_２、175
mMＮａＣｌ、0.2mMＥＤＴＡ、７mM２−メルカプトエタ
ノール、0.01％ウシ血清アルブミンからなる反応液50μ
に溶解し、制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社製）20単位を
加え、37℃にて５時間インキュベートした。次いでフェ
ノール処理、エタノール沈澱後、ＤＮＡポリメラーゼＫ
ｌｅｎｏｗ断片（宝酒造社製）にて前出の反応と同様に
14℃約２時間インキュベートし、ブラントエンドにし
た。これを、アガロース電気泳動で回収することなくエ
タノール沈澱したＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIに
て処理して、約２．７kbのＨｉｎｄIII−ＳａｌＩ断片
を１％アガロースゲル電気泳動にて５μｇ回収した。

一方、ウシ乳頭腫ウイルス［bovine papilloma virus
（ＢＰＶ）］を有するプラスミドｐｄＢＰＶ−１（Sarv
er，Ｎ．，Sbyrne，Ｊ．Ｃ＆Howley，Ｐ．Ｍ．(1982)Pr
oc．Natl．Acad．Sci．USA79巻7147−7151；Dr．Howley
より入手）をNagataらの方法の如く（Fukunaga，Sokaw
a，＆Nagata，(1984)Proc，Natl．Acad．Sci．USA81巻5
086−5090）ＨｉｎｄIII及びＰｖｕIIで処理して８．４
ｋｂのＤＮＡ断片を得ておく。

この８．４ｋｂのＤＮＡ断片と上記の約２．７ｋｂのＨ
ｉｎｄIII−ＳａｌＩＤＮＡ断片を常法に従ってＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼにより処理し、前出の「Molecular Clonin
g」に記載された塩化ルビジウム法によりＥ．coliＤＨ
Ｉ株に形質転換し、ｐＨＧＡ４１０由来Ｇ−ＣＳＦのｃ
ＤＮＡを有するプラスミドを保持するＥ．ｃｏｌｉコロ
ニーを選別した。このプラスミドをｐＴＮ−Ｇ４と命名
する（図９）。

一方、アデノウイルスＴｙｐｅII〔蛋白質核酸酵素27巻
12月号（1982年），共立出版発行〕よりＶＡＩ及びＶＡ
IIを含む約1700ｂｐのＳａｌＩ−ＨｉｎｄIII断片を含
むプラスミド△ｐＶＡよりＶＡＩおよびＶＡIIを含む断
片を回収した。この断片を先に述べたｐＴＮＧ４のＨｉ
ｎｄIII部位に挿入してｐＴＮＧ４ＶＡαおよびｐＴＮ
Ｇ４ＶＡβを得た（図９）。このプラスミドはアデノの
ＶＡ遺伝子によりＳＶ４０の初期プロモーターからの転
写産物の発現効率を高めるようにしたものである。

実施例14 Ｃ１２７細胞の形質転換及びその発現（＋Ｖ
ＳＥ） 実施例13で得たｐＴＮ−Ｇ４をマウスＣ１２７細胞に形
質転換する前に制限酵素ＢａｍＨＩで処理する。即ちｐ
ＴＮ−Ｇ４プラスミド20μｇを10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（pH8.0），７mM ＭｇＣｌ_２，100mM ＮａＣｌ，２
mM２−メルカプトエタノール，0.01％ＢＳＡの混合液10
0μに溶解せしめＢａｍＨＩ（宝酒造社製）20単位で
処理し、フェノール処理、エーテル処理、エタノール沈
澱を行った。

マウスＣ１２７Ｉ細胞は10％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ社
製）を含むDulbecoo′ｓ minimal essential培地中で
増殖させる。径５cmのプレートに増殖したＣ１２７Ｉ細
胞に、プレート当たり上記調製ＤＮＡを10μｇの割り合
いでリン酸−カルシウム法（Haynes，Ｊ＆Weissmann，C
(1983)Nucleic Acid Res．11巻687−706参照）にて形質
転換を行い、グリセロール処理の後、12時間37℃でイン
キュベートした。

次に、この細胞を３枚の新しい径５cmプレートに移し、
１週間２回の割り合いで培地交換をした。16日目にＦｏ
ｃｉ（集塊）を形成した部分をそれぞれ新しいプレート
に移し、上述の培地で継代培養し、Ｇ−ＣＳＦ生産能の
高いクローンを選別した。その結果〜１mg／のレベル
Ｇ−ＣＳＦ生産がみられた。更にクローニングを続けた
結果、10mg／以上のレベルのＧ−ＣＳＦ産生を確認し
た。

尚、宿主細胞には上記のＣ１２７Ｉ細胞のほかＮＩＨ３
Ｔ３細胞も用いることができる。

実施例15 ＣＨＯ細胞によるＧ−ＣＳＦの発現（＋ＶＳ
Ｅ） １）．ｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒの構築 実施例12で得たｐＨＧＡ４１０プラスミド20μｇを10mM
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、７mMＭｇＣｌ_２、175mM
ＮａＣｌ、0.2mM ＥＤＴＡ、0.7mM ２−メルカプトエ
タノール、0.01％ＢＳＡを含む溶液100μに溶解し、
制限酵素ＳａｌＩ（宝酒造社製）20単位を加え37℃一晩
反応した後、フェノール処理、エーテル洗浄、エタノー
ル沈澱を行った。

次ぎに、得られたＤＮＡ沈澱を50mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ、
５mMＭｇＣｌ_２、10mM ＤＴＴ、１mMのｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰからなる反応液100μに溶解
し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ−Ｋｌｅｎｏｗ
断片（宝酒造社製10μ）を加えて14℃２時間反応さ
せ、フェノール処理、エーテル洗浄、エタノール沈澱を
行った。

このＤＮＡにＥｃｏＲＩリンカーを付加する。即ち上記
ＤＮＡを50μの５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.4）、1
0mMＤＴＴ、0.5mMスペルミジン、２mMＡＴＰ、2.5mMヘ
キサミン塩化コバルト、20μｇ／mlＢＳＡからなる反応
液に溶解し、ＥｃｏＲＩリンカー（宝酒造社製）を加
え、200単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加
え４℃、１２〜１６時間反応した。フエーノル処理、エ
ーテル洗浄、エタノール沈澱を常法に従って行った後、
該ＤＮＡをＥｃｏＲＩで部分消化し、１％アガロースゲ
ル電気泳動で約2.7ｋｂのフラグメントを３μｇ回収し
た。

一方、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡプラスミド（Kaufman，
Ｒ．Ｇ．＆Sharp，Ｐ．A(1982)Mol．Cell Biol，２巻13
04〜1319）をＥｃｏＲＩにて処理し、バクテリアアルカ
リフォスファターゼ（ＢＡＰ）処理して脱リン酸を行
う。即ち、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ20μｇとＥｃｏＲＩ20
単位を反応液５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、７mM
ＭｇＣｌ_２、100mM ＮａＣｌ、７mM２−メルカプトエ
タノール、0.01％ＢＳＡの混合液100μに加え、37℃1
0時間反応させ、続いて上記反応液にＢＡＰ５単位を加
え、68℃にて30分間反応した。

その後フェノール処理をし、電気泳動にてｐＡｄＤ２６
ＳＶｐＡのＥｃｏＲＩ断片を回収した（〜５μｇ）。

上記した約2.7ｋｂの断片とｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡの断
片のそれぞれ0.5μｇずつをアニールした。このプラス
ミドをＥ．coli ＤＨＩ株に塩化ルビジウム法により形
質転換してｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒのプラスミドを保持す
るコロニーを選択する。得られたプラスミドをｐＨＧＧ
４−ｄｈｆｒと命名した（図10ａ）。

なお、上記の別法として、ｐＨＧＧ４プラスミドをＳａ
ｌＩ処理し、ＥｃｏＲＩリンカーを付加することなしに
ＥｃｏＲＩで部分消化し約2.7ｋｂの断片を回収し、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ−ｋｌｅｎｏｗ断片
で該ＤＮＡ断片を処理し末端をブラントエンド化する。

一方前述と同じ方法でｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡのブラント
エンド化したＥｃｏＲＩ断片を調製し、両者をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ処理してｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒを調製するこ
ともできる。

また実施例13の１）で得られたｐＨＧＡ４１０（Ｈ）を
実施例13の２）記載した如く、制限酵素ＨｉｎｄIIIお
よびＳａｌＩにて処理し、ＨｉｎｄIII−ＳａｌＩ断片
を上記ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡのブラントエンド化したＥ
ｃｏＲＩに連結してもｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒを得ること
ができる（図10ｂ）。

２）．ｐＧ４ＤＲ１およびｐＧ４ＤＲ２の構築 １）の項で述べたｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ10μｇを50ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣ（ＰＨ7.5）、７ｍＭ ＭｇＣｌ_２、1
00ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、0.01％ＢＳＡを含む反応液50mlに溶解し、制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩそれぞれ10単位を加え、37
℃10時間反応させた。常法に従いフェーノル処理、エー
テル洗浄を行った。１％低融点アガロース電気泳動に
て、約２ＫｂのＤＮＡ断片を回収した後、ＤＮＡポリメ
ラーゼ−Ｋｌｅｎｏｗ断片にて、常法に従いブラントエ
ンド化して、フェノール処理、エーテル洗浄、エタノー
ル沈澱を行った。

一方、実施例13の１）で得られたｐＨＧＡ４１０（Ｈ）
10μｇを10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ7.5）、７ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ_２、60ｍＭ ＮａＣｌを含む反応液50μ
に溶解し、ＨｉｎｄIII１０単位を加えて37℃、６時間
反応させた。常法に従い１％低融点アガロース電気泳動
にてＤＮＡ断片を回収し、更にＢＡＰ処理をした後、Ｋ
ｌｅｎｏｗ断片にてブラントエンド化した。フェノール
処理、エーテル洗浄を行った後、先に述べた約２Ｋｂの
ＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてブラントエン
ド結合させた。即ちそれぞれのＤＮＡ断片１μｇを66ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、6.6ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰを含む反応液30
μｇに溶解せしめ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ50単位を加え、
６℃、12時間反応せしめた後、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨＩ株に
形質転換した。このようにして、図10ｃに示すｐＧ４Ｄ
Ｒ１およびｐＧ４ＤＲ２を得た。

３）形質転換と発現 ＣＨＯ細胞（dhfr^-株、コロンビア大学Dr．Ｌ．Chasin
より入手）を９cm径のプレート（Nunc社製）中１０％仔
牛血清を含むα最小必須培地（α−ＭＥＭ、アデノシ
ン、デオキシアデノシン、チミジン添加）で培養増殖
し、これをリン酸−カルシウム法（Wigler等、Cell14巻
725頁(1978)）によって形質転換した。

即ち１）で調製したｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒプラスミド１
μｇにキヤリアーＤＮＡ（子牛胸線ＤＮＡ）を適量加え
て、ＴＥ溶液375μに溶解し１Ｍ ＣａＣｌ_２ 125μ
を加える。３〜５分氷上で冷やし、500μの２×Ｈ
ＢＳ（50mM Ｈｅｐｅｓ、280mM ＮａＣｌ、1.5mMリン
酸緩衝液）を加え再び氷冷後、上記のＣＨＯ細胞培養液
１mlと混合し、プレートに滴下した後、ＣＯ_２インキュ
ベーター中で９時間培養した。プレートから培地を除去
し、ＴＢＳ（Tris−Buffered Saline）にて洗浄後、20
％グリセロール含有ＴＢＳ添加、再び洗浄した後、非選
択培地（前出α−ＭＥＭ培地、ヌクレオチド添加）を添
加して２日間インキュベートし選択培地（ヌクレオチド
無添加）で１：10に細胞を分割した。次いで２日毎に選
択培地にて培地交換を行いながら培養を続行し生じたコ
ロニーを選別して新しいプレートに移した。

新しいプレートでは0.02μＭメトトレキセート（ＭＴ
Ｘ）存在下で増殖し、0.05μＭ、更に0.1μＭ ＭＴＸ
存在下で増殖させてクローニングを行った。なおＣＨＯ
細胞の形質転換はＣＨＯ細胞に対しｐＨＧＧ４とｐＡｄ
Ｄ２６ＳＶｐＡを同時形質転換（Co transformation）
することによっても行うことができる（Scahill等．Pro
c．Natl．Acad．Sci．USA80巻4654−4658(1983)参
照）。

また、以下に述べる方法にによってもＣＨＯ細胞の形質
転換を行った。即ち、上記２）の項で調製したｐＧ４Ｄ
Ｒ１あるいはｐＧ４ＤＲ２をあらかじめそれぞれＳａｌ
ＩおよびＫｐｎＩで処理してＤＮＡ断片を得て、そのう
ちの10μｇを上記と同様にＣＨＯ細胞に形質転換させ
た。このようにして形質転換された細胞を選択培地にて
上記の如く培養を続けると約７日目で明らかなコロニー
が１プレートにつき100個以上出現した。コロニーを一
つ一つ選別することなしに、再び新しいプレートに移し
かえた後、0.01μＭ ＭＴＸ存在下に選択培地で培養を
続けると、十数個のコロニーが出現した。更にこのよう
な手法によりＭＴＸの濃度を0.02μＭ、0.05μＭ、0.1
μＭと上昇させ、生き残ってきたコロニーを選別した。
また、得られた十数個のコロニーをそれぞれ選別した
後、ＭＴＸ濃度を上昇させても同様のコロニーの選別を
行うことができた。

又いわゆるポリシストロニック遺伝子を有する組換えベ
クターを構築し、これを用いてＣＨＯ細胞を形質転換す
ることができた。即ち、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡをＰｓｔ
Ｉ処理し、２つの断片を回収しこれらとｐＢＲＧ４由来
のＣＳＦｃＤＮＡ断片を結合することにより、アデノウ
イルスプロモーター、ＣＳＦｃＤＮＡ、ＤＨＦＲ、ＳＶ
４０のポリＡ部位の順序に配列した組換えベクターを構
築しＣＨＯ細胞にいれて実施した。

実施例16 発現物質のＧ−ＣＳＦ活性検定（＋ＶＳＥ） 実施例14及び実施例15で得られたＣ１２７細胞及びＣＨ
Ｏ細胞の培養上清を夫々１Ｎ酢酸によりpH４に調整し、
等容量のｎ−プロパノールを加えた後、生じた沈澱を遠
心除去し、Ｃ８逆相系担体（山村化学社製）を充填した
オープンカラム（１φ×２cm）に通し、50％ｎ−プロパ
ノールで溶出させた。溶出液を水で２倍に希釈した後、
ＹＭＣ−Ｃ８カラム（山村化学社製）を用いた逆相高速
液体クロマトグラフィーにて0.1％ＴＦＡを含む30〜60
％の直線濃度勾配のｎ−プロパノールにて溶出を行っ
た。ｎ−プロパノール濃度が40％付近の位置で溶出され
る画分を分取した後、凍結乾燥し、0.1Ｍグリシン緩衝
液（pH９）に溶解せしめた。このような過程を経ること
によって、ヒトＧ−ＣＳＦはＣ１２７及びＣＨＯ細胞上
清から約20倍に濃縮された。

コントロールとして、前述の方法に従ってヒトＧ−ＣＳ
ＦｃＤＮＡを含まないプラスミドで細胞を形質転換した
後その培養上清を濃縮した。得られた標品について参考
例に記載された「ヒトＧ−ＣＳＡの測定方法（ａ）」に
基づいた方法にてヒトＧ−ＣＳＦ活性を検定した。尚、
発現効率が十分に高い場合には培養上清を直接検定に供
してもよい。ここでは濃縮した例について結果を示し
た。その結果は表−１の通りであった。

実施例17 アミノ酸分析および糖分析（＋VSE） １）アミノ酸組成の分析 実施例16で得た粗ＣＳＦ試料を更に実施例２の(iii)の
方法にしたがって精製した。この精製ＣＳＦ試料を常法
により加水分解し、そのタンパク部分のアミノ酸組成を
日立835アミノ酸自動分析装置（日立製作所社製）を用
いて特殊アミノ酸分析法により分析した。この結果を表
−２に示した。尚、加水分解条件は次の如くである。

６Ｎ ＨＣｌ，110℃，24時間，真空中 ４Ｎ メタンスルホン酸＋0.2％３−（２−アミノエ
チル）インドール，110℃，24時間，48時間，72時間，
真空中 試料は、40％ｎ−プロパノールと0.1％トリフルオロ酢
酸を含む溶液（1.5ml）に溶かした後、各々0.1mlをと
り、乾燥窒素ガスにより乾燥させた後、又はの試薬
を加えて真空封管し、加水分解に供した。

表中、実測値はの24時間値との24，48，72時間値の
合計４回の平均値である。但し、Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，１／
２Ｃｙｓ，Ｍｅｔ，Ｖａｌ，ＩｌｅおよびＴｒｐは以下
の方法で算出した。（生化学実験講座、タンパク質化学
II（東京化学同人出版）を参照） ・Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，１／２Ｃｙｓ，Ｍｅｔはの24，4
8，72時間値の経時変化をとり、零時間に補外。

・Ｖａｌ，Ｉｌｅはの72時間値。

・Ｔｒｐはの24，48，72時間値の平均値 ２）糖組成分析 上記アミノ酸組成分析で用いた精製ＣＳＦ試料200ｎｇ
に内部標準としてイノシトール25ｎｍｏｌを加えた後、
1.5Ｎ ＨＣｌを含むメタノール溶液（500μ）を加え
て窒素ガス置換した封管中、90℃で４時間反応させた。
開管後炭酸銀（Ａｇ_２ＣＯ_３）を加えて中和した後、無
水酢酸50μを加え振とう後、室温にて暗所に一晩放置
した。上層をサンプルチューブにとり、窒素ガスにて乾
燥した。沈澱にメタノールを加え洗浄後軽く遠沈し、上
層を同じサンプルチューブに加え乾燥した。これに50μ
のＴＭＳ化試薬（ピリジン：ヘキサメチルジシラザ
ン：トリメチルクロロシラン＝５：１：１に混合したも
の）を加え40℃で20分反応させた後、Deep Freezerに保
存した。尚、スタンダードとしてガラクトース（Ｇａ
ｌ）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、
シアル酸などを各50ｎｍｏｌ及びイノシトール25ｎｍｏ
ｌを合わせ同様の操作を行った。

このサンプルについて以下に示す条件でガスクロマト分
析を行った。

（分析条件） カラム：２％ＯＶ−１７VINport ＨＰ60〜80メッシ
ュ，３ｍ，ガラス 温度：110℃〜250℃まで４℃／分の昇温 キャリヤーガス：最初は1.2〜1.6Kg／cm² （窒素圧） 終了時は２〜2.5Kg／cm² 感度：１０^３ＭΩレンジ0.1〜0.4Ｖ 圧：水素ガス0.8Kg／cm² 空気 0.8Kg／cm² サンプル量：2.5〜3.0μ 分析の結果、本発明のＣＳＦからガラクトース、Ｎ−ア
セチルガラクトサミンおよびシアル酸が確認された。

実施例18．ｐＨＧＶ２ベクターの調製（動物細胞用、−
ＶＳＥ系） 実施例10で得られた図４（Ａ）で示されるｃＤＮＡのＥ
ｃｏＲＩ断片を制限酵素ＤｒａＩにて37℃で２時間で処
理した後、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片
（宝酒造社製）で処理し、末端を平滑末端とした。１μ
ｇのＢｇｌIIリンカー（８ｍｅｒ；宝酒造社製）をＡＴ
Ｐを用いてリン酸化した後、上記で得られた約１μｇの
ＤＮＡ断片混合物と結合させた。次いで制限酵素Ｂｇｌ
IIで処理してアガロースゲル電気泳動を行い、最も大き
いＤＮＡ断片だけを回収した。

このＤＮＡ断片は図６に示すようにヒトＧ−ＣＳＦポリ
ペプチドをコードする部分を含む約700塩基対に相当し
ていた。ベクターｐｄＫＣＲ（Fukunaga等；Proc．Nat
l．Acad．Sci．USA；81巻5086頁(1984)）を制限酵素Ｂ
ａｍＨＩで処理した後、アルカリフォスファターゼ（宝
酒造社製）で脱リン酸して得られたベクターＤＮＡをＴ
４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を加えてｃＤＮＡ断片
と結合させｐＨＧＶ２を得た（図11）。図11に示される
ごとくこのプラスミドは、ＳＶ４０初期遺伝子のプロモ
ーター、ＳＶ４０の複製開始領域、ウサギβ−グロビン
遺伝子の一部、ｐＢＲ３２２の複製開始領域およびｐＢ
Ｒ３２２由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ^ｒ）を
含み、ＳＶ４０初期遺伝子のプロモーター下流にヒトＧ
−ＣＳＦ遺伝子が接続されている。

実施例19 Ｃ１２７細胞用組換えベクターの構築（−Ｖ
ＳＥ） １）ｐＨＧＶ２（Ｈ）の構築 実施例18で得られたｐＨＧＶ２プラスミド（図11）20μ
ｇを用いて、実施例13の１）に記載した方法と同様にし
てｐＨＧＶ２（Ｈ）と命名するプラスミドを得た（図1
2）。

２）発現用組換えベクターｐＴＮ−Ｖ２ならびにｐＴＮ
ＶＡαおよびｐＴＮＶＡβの構築 上記１）で得られたｐＨＧＶ２（Ｈ）20μｇを用いて、
実施例13の２）に記載した方法と同様にしてｐＨＧＶ２
由来Ｇ−ＣＳＦのｃＤＮＡを有するプラスミドを保持す
るＥ．ｃｏｌｉコロニーを選別した。得られたプラスミ
ドをｐＴＮ−Ｖ２と命名する（図12）。

一方アデノウイルスＴｙｐｅII〔蛋白質核酸酵素27巻12
月号（1982年）、共立出版発行〕よりＶＡＩおよびＶＡ
IIを含む約1700ｂｐのＳａｌＩ−ＨｉｎｄIII断片を含
むプラスミド△ｐＶＡよりＶＡＩおよびＶＡIIを含む断
片を回収した。この断片を先に述べたｐＴＮ−Ｖ２のＨ
ｉｎｄIII部位に挿入してｐＴＮＶＡαおよびｐＴＮＶ
Ａβを得た（図12）。このプラスミドはアデノのＶＡ遺
伝子によりＳＶ４０の初期プロモーターからの転写産物
の発現効率を高めるようにしたものである。

実施例20 Ｃ１２７細胞の形質転換およびその発現（−
ＶＳＥ） 実施例19で得たｐＴＮ−Ｖ２をマウスＣ１２７細胞に形
質転換する前に制限酵素ＢａｍＨＩで処理する。

次いでマウスＣ１２７Ｉ細胞を上記調製ＤＮＡで形質転
換して発現させ（実施例14参照）Ｇ−ＣＳＦ生産能の高
いクローンを選別した。その結果〜１mg／のレベルの
Ｇ−ＣＳＦ生産がみられた。

更にクローニングを続けていくことにより、10mg／レ
ベルのＧ−ＣＳＦ生産能を有するクローンが選別でき
た。同様にして実施例19で得たｐＴＮＶＡαおよびｐＴ
ＮＶＡβでＣ１２７細胞をそれぞれ形質転換し、Ｇ−Ｃ
ＳＦ生産能の高いクローンを選別した結果、ｐＴＮＶＡ
αについては20mg／以上の高生産クローンを得ること
ができた。またｐＴＮＶＡβからは数mg／の生産能を
有するクローンを得ることができた。

尚、宿主細胞には上記のＣ１２７Ｉ細胞のほかにＮＩＨ
３Ｔ３細胞も用いることができる。

実施例21 ＣＨＯ細胞によるＧ−ＣＳＦの発現（−ＶＳ
Ｅ） １）ｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒの構築 実施例18で得たｐＨＧＶ２プラスミド20μｇから実施例
15の１）に記載した方法によって得られる約2.7ｋｂの
断片とｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡの断片のそれぞれ0.5μｇ
ずつをアニールした。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ
ＤＨＩ株に塩化ルビジウム法により形質転換してｐＨＧ
Ｖ２−ｄｈｆｒのプラスミドを保持するコロニーを選択
した。得られたプラスミドをｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒと命
名した（図13ａ）。

尚、上記の別法として、ｐＨＶ２プラスミドをＳａｌＩ
処理し、ＥｃｏＲＩリンカーを付加することなしにＥｃ
ｏＲＩで部分消化し、約2.7ｋｂの断片を回収し、Ｅ．
ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ−Ｋｌｅｎｏｗ断片で該
ＤＮＡ断片を処理し末端をブラントエンド化した。

一方前述と同じ方法でｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡのブラント
エンド化したＥｃｏＲＩ断片を調製し、両者をＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ処理してｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒを調製するこ
ともできた。

また実施例19の１）で得られたｐＨＧＶ２（Ｈ）を実施
例13の２）で記載した如く制限酵素、ＨｉｎｄIIIおよ
びＳａｌＩにて処理し、ＨｉｎｄIII−ＳａｌＩ断片を
上記ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡのブラントエンド化したＥｃ
ｏＲＩ断片に連結してもｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒを得るこ
とができた（図13ｂ）。

２）．ｐＶ２ＤＲ１およびｐＶ２ＤＲ２の構築 １）の項で述べたｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡ10ｇを50ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ7.5）、７ｍＭ ＭｇＣｌ_２、1
00ｍＭ ＮａＣｌ、７ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、0.01％ＢＳＡを含む反応液50mlに溶解し、制限酵素
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩそれぞれ10単位を加え、37
℃10時間反応させた。常法に従いフェーノル処理、エー
テル洗浄を行った。１％低融点アガロース電気泳動に
て、約２ＫｂのＤＮＡ断片を回収した後、ＤＮＡポリメ
ラーゼ−Ｋｌｅｎｏｗ断片にて、常法に従いブラントエ
ンド化して、フェノール処理、エーテル洗浄、エタノー
ル沈澱を行った。

一方、実施例19の１）で得られたｐＨＧＶ２（Ｈ）10μ
ｇを10ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ7.5）、７ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、60ｍＭ ＮａＣｌを含む反応液50μに溶
解し、ＨｉｎｄIII１０単位を加えて37℃、６時間反応
させた。常法に従い１％低融点アガロース電気泳動にて
ＤＮＡ断片を回収し、更に、ＢＡＰ処理をした後、Ｋｌ
ｅｎｏｗ断片にてブラントエンド化した。フェノール処
理、エーテル洗浄を行った後、先に述べた約２ＫｂのＤ
ＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いてブラントエンド
結合させた。即ち、それぞれのＤＮＡ断片１μｇを66ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.5）、6.6ｍＭ ＭｇＣ
ｌ_２、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰを含む反応液30
μに溶解せしめ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ50単位を加え、
６℃、12時間反応せしめた後、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨＩ株に
形質転換した。このようにして、図13ｃに示すｐＶ２Ｄ
Ｒ１およびｐＶ２ＤＲ２を得た。

３）形質転換と発現 上記１）で調製したｐＨＧＶ２−ｄｈｆｒプラスミドを
用いて、実施例15の３）に記載の方法と同様にしてＣＨ
Ｏ細胞株を形質転換して発現させた。

なお、ＣＨＯ細胞の形質転換はＣＨＯ細胞に対してｐＨ
ＧＶ２とｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡを同時形質転換（Co tra
nsformation）することによっても行うことができる。

また、以下に述べる方法にによってもＣＨＯ細胞の形質
転換を行った。即ち、上記２）の項で調製したｐＶ２Ｄ
Ｒ１あるいはｐＶ２ＤＲ２をあらかじめそれぞれＳａｌ
ＩおよびＫｐｎＩで処理してＤＮＡ断片を得て、そのう
ちの10μｇを上記と同様にＣＨＯ細胞に形質転換させ
た。このようにして形質転換された細胞を選択培地にて
上記の如く培養を続けると約７日目で明らかなコロニー
が１プレートにつき100個以上出現した。コロニーを一
つ一つ選別することなしに、再び新しいプレートに移し
かえた後、0.01μＭ ＭＴＸ存在下に選別培地で培養を
続けると、十数個のコロニーが出現した。更にこのよう
な手法によりＭＴＸの濃度を0.02μＭ、0.05μＭ、0.1
μＭと上昇させ、生き残ってきたコロニーを選別した。
また、得られた十数個のコロニーをそれぞれ選別した
後、ＭＴＸ濃度を上昇させても同様のコロニーの選別を
行うことができた。

又、いわゆるポリシストロニック遺伝子を有する組換え
ベクターを構築し、これを用いてＣＨＯ細胞を形質転換
することができた。即ち、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡをＰｓ
ｔＩ処理し、２つの断片を回収しこれらとｐＢＲＶ２由
来のＣＳＦ ｃＤＮＡ断片を結合することにより、アデ
ノウィルスプロモーター、ＣＳＦ、ｃＤＮＡ、ＤＨＦ
Ｒ、ＳＶ４０のポリＡ部位の順序に配列した組換えベク
ターを構築しＣＨＯ細胞にいれて実施した。

実施例22 発現物質のＧ−ＣＳＦ活性検定（−ＶＳＥ） 実施例20および実施例21で得られたＣ１２７細胞及びＣ
ＨＯ細胞の培養上清から、実施例16に記載の方法と同様
にしてヒトＧ−ＣＳＦを得、そのヒトＧ−ＣＳＦ活性を
検定した。その結果は表−３の通りであった。

実施例23 アミノ酸分析および糖分析（−ＶＳＥ） １）アミノ酸組成の分析 実施例22で得た粗ＣＳＦ試料を更に実施例２の(iii)の
方法にしたがって精製した。この精製ＣＳＦ試料を実施
例17の１）に記載の方法によってアミノ酸組成分析に付
した。この結果を表−４に示す。

２）糖組成分析 上記アミノ酸組成分析で用いた精製ＣＳＦ試料をもちい
て、実施例17の２）に記載したのと同じ方法及び同じ分
析条件によって糖組成を分析した。分析の結果、本発明
のＣＳＦからガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン及びシアル酸が確認された。

実施例24 ＣＯＳ細胞用染色体由来遺伝子含有組換えベ
クターの構築 実施例11で得られた図５で示される染色体遺伝子を含む
プラスミドｐＢＲＣＥ３βをＥｃｏＲＩで処理した。一
方Banerji等の文献（Cell 27巻299頁(1981)）に記載さ
れているｐＳＶＨ^＋Ｋ^＋プラスミドをＫｐｎＩで処理し
てグロビン遺伝子を除き、さらにＨｉｎｄIIIで部分消
化してＳＶ４０の後期遺伝子の一部を除いた後、再結合
させて発現用ベクターｐＭＬ−Ｅ^＋を調製した。

このベクターを、制限酵素ＥｃｏＲＩで処理した後、ア
ルカリホスファターゼ（宝酒造社製）で脱リン酸して得
られたベクターＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社
製）を加えて上記染色体ＤＮＡ断片と結合させ、ｐＭＬ
ＣＥ３αを得た。図14に示される如くこのプラスミド
は、ＳＶ４０遺伝子のエンハンサー、ＳＶ４０の複製開
始領域、ｐＢＲ３２２の複製開始領域およびｐＢＲ３２
２由来のβ−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ^ｒ）を含むプ
ラスミドで、ＳＶ４０遺伝子のエンハンサー下流にヒト
Ｇ−ＣＳＦ染色体遺伝子が接続されている。

実施例25 ＣＯＳ細胞でのヒトＧ−ＣＳＦ染色体遺伝子
の発現 仔牛血清10％を含むＤＭＥＭ（日水製薬社製，ダルベッ
コ変法イーグル培地「ニッスイ」）培地（10ml）を用い
て、直径９cmのペトリ皿（Nunc社製）中で約70％密にま
で増殖させたＣＯＳ−１細胞（米国，Cold Spring Harb
or研究所Dr．Gluzmanより譲受）をリン酸−カルシウム
法（Wigler等；Cell 14巻 725頁(1978)）およびＤＥＡ
Ｅ−デキストラン：クロロキン法（例えば、Gordon等；
Science 288巻 810頁(1985)を参照）によって形質転換
した。

リン酸−カルシウム法の場合は以下の如く実施した。

実施例24で調製したプラスミドｐＭＬＣＥ３α160μｇ
をＴＥ溶液320μに溶解せしめ、3.2mlの蒸溜水を加え
た後さらに５０４μの２ＭＣａＣｌ_２を加えた。

この溶液に４mlの２×ＨＢＳ［50ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，28
0ｍＭ ＮａＣｌ，1.5ｍＭリン酸緩衝液，（pH7.12）］
を加えて20〜30分間氷冷した後、ＣＯＳ−１細胞の増殖
したペトリ皿１枚につき１mlずつ滴下した。37℃のＣＯ
_２インキュベーターにて４時間培養させた後、無血清の
ＤＭＥＭ培地で細胞を洗浄し、次いで20％のグリセロー
ルを含むＤＭＥＭ培地５mlを加えて室温で約３分間放置
し、再び無血清のＤＭＥＭ培地で洗浄した。無血清のＤ
ＭＥＭ培地を除いた後、仔牛血清10％を含むＤＭＥＭ培
地10mlを加えて一夜ＣＯ_２インキュベーター中で培養
し、再び同培地にて培地交換を行ってさらに３日間培養
した。

ＤＥＡＥ−デキストラン：クロロキン法を用いた場合は
以下の如くである。

リン酸カルシウム法と同様にＣＯＳ−１細胞を70％密に
まで培養し、無血清のＤＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄し
た。これに250μｇ／mlのＤＥＡＥ−デキストランおよ
び実施例24で調製した２μｇ／mlのプラスミドｐＭＬＣ
Ｅ３αを含む無血清ＤＭＥＭ培地を加え、37℃，12時間
培養した。次いで、細胞を無血清ＤＭＥＭ培地で２回洗
浄し、10％仔牛血清と１ｍＭクロロキンを含むＤＭＥＭ
培地にて、37℃，２時間培養を続けた。その後細胞を無
血清ＤＭＥＭ培地で２回洗浄した後、10％仔牛血清を含
むＤＭＥＭ培地を添加し、37℃にて３日間培養した。

このようにして得られたＣＯＳ−１細胞の培養上清を１
Ｎ酢酸によりpH４に調整し、等容量のｎ−プロパノール
を加えた後、生じた沈澱を遠心除去し、Ｃ８逆相系担体
（山村化学社製）を充填したオープンカラム（１φ×２
cm）に通し、50％ｎ−プロパノールで溶出させた。溶出
液を水で２倍に希釈した後、ＹＭＣ−Ｃ８カラム（山村
化学社製）を用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー
にて0.1％ＴＦＡを含む30〜60％の直線濃度勾配のｎ−
プロパノールで溶出させた。ｎ−プロパノール濃度が40
％付近の位置で溶出される画分を分取した後、凍結乾燥
し、0.1Ｍグリシジン緩衝液（pH９）に溶解せしめた。
このような経過を経ることによって、ヒトＧ−ＣＳＦは
ＣＯＳ−１細胞上清から約20倍に濃縮された。

コントロールとして、前述の方法に従ってヒトＧ−ＣＳ
Ｆ染色体遺伝子を含まないｐＭＬ−Ｅ^＋でＣＯＳ−１細
胞を形質転換した後、その培養上清を濃縮した。

得られた標品について参考例に記載された「ヒトＧ−Ｃ
ＳＡの測定方法（ａ）」に基づいた方法にてヒトＧ−Ｃ
ＳＦ活性を検定した。結果は表−５の通りであった。

実施例26 Ｃ１２７細胞によるヒトＧ−ＣＳＦ染色体遺
伝子の発現 実施例24で得られたｐＭＬＣＥ３αプラスミドをＥｃｏ
ＲＩで処理し、前出のMolecular Cloningに記載された
方法によって、約４Ｋｂの断片を回収して染色体由来の
Ｇ−ＣＳＦ遺伝子の源とする。

これをＤＮＡポリメラーゼＩ−Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理
し、ブラントエンドにしておく（Ａ）。

一方、実施例12で調製したｐＨＧＡ４１０プラスミドか
ら、上記と同様Molecular Cloningの方法によりＳＶ４
０プロモーター部分（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩの約0.4
Ｋｂ断片）を切り出し、ＤＮＡポリメラーゼＩ−Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片で処理する（Ｂ）。

更に、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）を有するプラスミ
ドｐｄＢＰＶ−１（Sarver，Ｎ．，Sbyrne，Ｊ．Ｃ＆Ho
wley，Ｐ．Ｍ．(1982)Proc．Natl．Acad．Sci．，USA 7
9巻7147〜7151；Dr Howleyより入手）をＨｉｎｄIIIお
よびＰｖｕIIで処理し約8.4ＫｂのＤＮＡ断片を得、こ
れをＤＮＡポリメラーゼＩ−Ｋｌｅｎｏｗ断片処理後、
バクテリヤアルカリフォスファターゼにて脱リン酸して
おく（Ｃ）。

以上の（Ａ），（Ｂ）及び（Ｃ）のＤＮＡを各々0.1μ
ｇずつ20μの反応液（50ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH
7.6），10ｍＭ ＭｇＣｌ_２，10ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ
ＡＴＰ）に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ180単位を加
えて、４℃にて一晩反応した。

この反応液を用い、前出のMolecular Cloningに記載さ
れた塩化ルビジウム法によりｐＴＮＣＥ３αプラスミド
を得た。

なお、染色体由来のＧ−ＣＳＦ遺伝子の源としては、上
記（Ａ）のかわりに、ｐＭＬＣＥ３α20μｇを10ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH8.0），７ｍＭ ＭｇＣｌ_２，100
ｍＭ ＮａＣｌ，７ｍＭ２−メルカプトエタノール，0.
01％ＢＳＡの混合液100μに溶解し、ＳｔｕＩ20単位
を加え、37℃，５時間インキュベートした後、1.2％ア
ガロースゲル電気電気泳動にて約1.78ＫｂのＤＮＡ断片
を得て、この断片を用いてもよい。

このようにして得たｐＴＮＣＥ３αプラスミドで実施例
14と同様にしてマウスＣ１２７Ｉ細胞を形質転換し、発
現させ、Ｇ−ＣＳＦ生産能の高いクローンを選別した。

実施例27 ＣＨＯ細胞によるヒトＧ−ＣＳＦ染色体遺伝
子の発現 実施例26のＣ１２７細胞の場合と同様にｐＭＬＣＥ３α
プラスミドをＳｔｕＩで処理して約1.78ＫｂのＤＮＡ断
片を回収するか、或いはＥｃｏＲＩ処理して約４Ｋｂの
ＥｃｏＲＩ断片を回収して染色体由来のＧ−ＣＳＦ遺伝
子の源とする。

これをＤＮＡポリメラーゼＩ−Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理
しておく（ａ）。

また、実施例26と同じく、ｐＨＧＡ４１０からＳＶ４０
プロモーター部分（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片）を切
り出して、約0.4Ｋｂの断片を得て、同様にＤＮＡポリ
メラーゼＩ−Ｋｌｅｎｏｗ断片処理をしておく（ｂ）。

一方、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡプラスミド（Kaufman，
Ｒ．Ｇ＆Sharp，Ｐ．Ａ(1982)Mol．Cell．Biol，２巻13
04〜1319）をＥｃｏＲＩで処理した後、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ−Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理し、続いてバクテリア
アルカリフォスファターゼ処理して脱リン酸する
（ｃ）。

上記の（ａ），（ｂ）および（ｃ）を各々0.1μｇずつ2
0μの反応液（50ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH7.6），
10ｍＭＭｇＣｌ_２，10ｍＭ ＤＴＴ，１ｍＭ ＡＴＰ）
に溶解し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ180単位を加え、４℃に
て一晩反応せしめた。

次いで、その反応液を前出のMolecular Cloningに記載
された塩化ルビジウム法により、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨＩ株
に形質転換しＴｅｔ^ｒのコロニーを得て、プラスミドｐ
Ｄ２６ＳＶＣＥ３αを含む菌を選択した。

プラスミドｐＤ２６ＳＶＣＥ３αは図15に示す通りＳＶ
４０の初期遺伝子にＣＳＦ遺伝子を連結し、更にアデノ
ウイルス主後期プロモーターの下流にＤＨＦＲ遺伝子を
連結した形となっている。

一方、ｐＡｄＤ２６ＳＶｐＡを実施例15の２）で述べた
如くＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで処理して得られた約
２ＫｂのＤＨＦＲ遺伝子を含むＤＮＡ断片と上述の
（ａ）およびｐＨＧＡ４１０（Ｈ）のＥｃｏＲＩ−Ｓａ
ｌＩ断片と連結させることによりＡｍｐ^ｒの発現ベクタ
ーｐＤＲＣＥ３α（図15）を構築した。

このｐＤ２６ＳＶＣＥ３αプラスミドおよびｐＤＲＣＥ
３αプラスミドを実施例15と同様にしてＣＨＯ細胞に形
質転換しＭＴＸ選択を繰り返してＧ−ＣＳＦ生産株を得
た。

実施例28 発現物質のＧ−ＣＳＦ活性検定（ヒト染色体
由来遺伝子） 実施例26および実施例27で得られたＣ１２７細胞および
ＣＨＯ細胞の培養上清から、実施例25に記載の方法と同
様にしてヒトＧ−ＣＳＦを得、そのヒトＧ−ＣＳＦ活性
を検定した。その結果は表−６の通りであった。

実施例29 ヒトＧ−ＣＳＦの感染防御効果 ＜試験方法＞ １．シュードモナス アエルギノーザ（Pseudomonas ae
ruginosa）感染に対する防御効果 ８〜９週令（体重３５．３±１．３８ｇ）のＩＩＣＲ系
マウス（雄）にエンドキサン（シオノギ社社製、商品
名）200mg／Kgを腹腔内投与した後３群に分け、その２
群にヒトＧ−ＣＳＦ（25000ｕ／マウス又は50000ｕ／マ
ウス）を含む溶媒（生理食塩水中１％プロパノール、0.
5％（（ｗ／ｖ）マウス血清アルブミン）を、そして別
の１群には溶媒のみを、それぞれ24時間毎に0.1mlずつ
４回皮下投与した。４回目の投与後３時間して各々の群
にシュードモナス アエルギノーザ（Pseudomonas aeru
ginosa）ＧＮＢ−139（3.9×10⁵ＣＦＵ／マウス）を皮
下投与して感染させた。感染後21時間して、さらにもう
一度ヒトＧ−ＣＳＦ（25000ｕ／マウス又は50000ｕ／マ
ウス）を含む溶媒又は溶媒のみをそれぞれ対応する群に
皮下投与した。

感染後10日目までの生存マウス数により感染防御効果を
調べた。

（菌液の調製） ハートインフュージョン液体培地（Ｄｉｆｃｏ社製、商
品名）を用いて37℃で一夜シュードモナス アエルギノ
ーザＧＮＢ−139を振とう培養する。培養液を生理食塩
水に懸濁させて調製した。

〈結果〉 実施例17のアミノ酸組成分析に用いたのと同じＣＨＯ
細胞由来の精製ヒトＧ−ＣＳＦ試料（＋ＶＳＥ）につい
て上記試験を行った。

その結果を表−７に示す。

同様にして前記実施例17のアミノ酸組成分析に用いたの
と同じＣ１２７細胞由来の精製ヒトＧ−ＣＳＦ試料を用
いて上記試験の感染防禦効果を調べたところ、ほぼ同様
の結果が得られた。

実施例23のアミノ酸組成分析に用いたのと同じＣＨＯ
細胞由来の精製ヒトＧ−ＣＳＦ試料（−ＶＳＥ）につい
て上記試験を行った。

その結果を表−８に示す。

同様にして前記実施例23のアミノ酸組成分析に用いたの
と同じＣ１２７細胞由来の精製ヒトＧ−ＣＳＦ試料を用
いて上記試験の感染防禦効果を調べたところ、ほぼ同様
の結果が得られた。

〔発明の効果〕

本発明のヒトＧ−ＣＳＦ活性を有する糖蛋白質は、白血
球減少症治療剤、骨髄性白血病治療剤、造血機能回復促
進剤或いは感染防禦剤等の有効成分として極めて有用な
ものである。

又、待望されていたこれら医薬品を具現化せしめた遺伝
子組換えによるヒトＧ−ＣＳＦの製法確立も、本発明の
大きな成果ということができよう。

〔実施の態様〕

１ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子を得、次にこれを組み込んだ組換
えベクターを調製した後、該ベクターを用いて宿主細胞
を形質転換し、次いで得られた形質転換株を培養し、そ
の培養物から目的糖蛋白質を採取することを特徴とする
下記のアミノ酸配列またはその一部で表わされるポリペ
プチドと糖鎖部分を有しヒト顆粒球コロニー刺激因子活
性を有する糖蛋白質の製造方法。

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Ph
e Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln
Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu(Val Ser Gl
u)_m Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Le
u Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala
Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Al
a Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu
Try Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pr
o Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp
Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Gl
u Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln
Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Ar
g Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Al
a Gln Pro（ただしｍは０又は１を表わす） ２ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子が、ショ糖密度勾配遠心法により
15〜17Ｓ画分として得られる、ヒト顆粒球コロニー刺激
因子活性を有するポリペプチドをコードするメッセンジ
ャーＲＮＡに相補的なＤＮＡであることを特徴とする実
施の態様第１項記載の糖蛋白質の製造方法。

３ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子が以下に示されるポリペプチド配
列またはその一部をコードするものである実施の態様第
１項に記載の糖蛋白質の製造方法。

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Ph
e Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln
Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu(Val Ser Gl
u)_m Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Le
u Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala
Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Al
a Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu
Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pr
o Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp
Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Gl
u Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln
Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Ar
g Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser
Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Al
a Gln Pro（ただしｍは０または１を表わす） ４ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有するポリペプチ
ドをコードする遺伝子が以下に示される塩基配列または
その一部を有するものである実施の態様第１項に記載の
糖蛋白質の製造方法。

ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG AGC TT
C CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG
GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GAG AAG CTG(GTG AGT GA
G)_m TGT GCC ACC TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG GAG CT
G GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT
CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG CTG GC
A GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC
TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CC
C GAG TTG GGT CCC ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC
GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG GA
A GAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG
GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CG
G GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTG CAG AGC
TTC CTG GAG GTG TCG TAC CGC GTT CTA CGC CAC CTT GC
C CAG CCC（ただしｍは０または１を表わす）

【図面の簡単な説明】

図１はプローブ（ＩＷＱ）、プローブ（Ａ）およびプロ
ーブ（ＬＣ）の配列を示す。 図２はｐＨＣＳ−１インサートの塩基配列を示す。 図３（Ａ）はｐＢＲＧ４のｃＤＮＡインサートの塩基配
列を示す。 図３（Ｂ）（Ｉ）はｐＢＲＧ４ ｃＤＮＡから演えきし
たヒトＧ−ＣＳＦ前駆体のアミノ酸配列を示す。 図３（Ｂ）（II）はｐＢＲＧ４ ｃＤＮＡから演えきし
たヒト成熟Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列を示す。 図４（Ａ）はｐＢＲＶ２のｃＤＮＡインサートの塩基配
列を示す。 図４（Ｂ）（Ｉ）はｐＢＲＶ２ ｃＤＮＡから演えきし
たヒトＧ−ＣＳＦ前駆体のアミノ酸配列を示す。 図４（Ｂ）（II）はｐＢＲＶ２ ｃＤＮＡから演えきし
たヒト成熟Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列を示す。 図５はヒトＧ−ＣＳＦをコードするヒト染色体遺伝子の
塩基配列を示す。 図６はｐＢＲＧ４またはｐＢＲＶ２由来ヒトＧ−ＣＳＦ
ｃＤＮＡの制限酵素切断部位を示す。 図７はヒトＧ−ＣＳＦをコードするヒト染色体遺伝子制
限酵素切断部位を示す。 図８はｐＨＧＡ４１０の概略構造を示す。 図９は発現用組換えベクターｐＴＮ−Ｇ４，ｐＴＮ−Ｇ
４ＶＡαおよびｐＴＮ−Ｇ４ＶＡβの構築プロセスを示
す。 図10ａおよび図10ｂはｐＨＧＧ４−ｄｈｆｒの構築プロ
セスを示す。 図10ｃはｐＧ４ＤＲ１およびｐＧ４ＤＲ２の構築プロセ
スを示す。 図11はｐＨＧＶ２の概略構造を示す。 図12は発現用組換えベクターｐＴＮ−Ｖ２，ｐＴＮ−Ｖ
ＡαおよびｐＴＮ−ＶＡβの構築プロセスを示す。 図13ａおよび図13ｂは発現用組換えベクターｐＨＧＶ２
−ｄｈｆｒの構築プロセスを示す。 図13ｃはｐＶ２ＤＲ１およびｐＶ２ＤＲ２の構築プロセ
スを示す。 図14はｐＭＬＣＥ３αの概略構造を示す。 図15はｐＤ２６ＳＶＣＥ３αとｐＤＲＣＥ３αの概略構
造を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 特願昭60−270839 (32)優先日 昭60(1985)12月３日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−９５４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−９５５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−９５６

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列
   を含有するヒト染色体由来の遺伝子を含む組換えベクタ
   ーで形質転換された哺乳動物細胞を培養し、次いで産生
   されたヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する糖蛋白
   質を分離することを特徴とするヒト顆粒球コロニー刺激
   因子活性を有する糖蛋白質の製造方法。 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Ph
   e Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln
   Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys Leu Cys Ala Th
   r Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu
   Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Se
   r Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu
   Ser Gln Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Le
   u Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly
   Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Ph
   e Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly
   Met Ala Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pr
   o Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly
   Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu Va
   l Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro
2. 【請求項２】ヒト染色体由来の遺伝子が下記の塩基配列
   を含む遺伝子である特許請求の範囲第１項記載のヒト顆
   粒球コロニー刺激因子活性を有する糖蛋白質の製造方
   法。 ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG AGC TT
   C CTG CTC AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG
   GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GAG AAG CTG TGT GCC AC
   C TAC AAG CTG TGC CAC CCC GAG GAG CTG GTG CTG CTC
   GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AG
   C TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG
   AGC CAA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CT
   C CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TTG GGT
   CCC ACC TTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TT
   T GCC ACC ACC ATC TGG CAG CAG ATG GAA GAA CTG GGA
   ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CC
   G GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG
   GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GT
   G TCG TAC CGC GTT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC