JPH0655137B2 - Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法 - Google Patents
Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法Info
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- JPH0655137B2 JPH0655137B2 JP61172832A JP17283286A JPH0655137B2 JP H0655137 B2 JPH0655137 B2 JP H0655137B2 JP 61172832 A JP61172832 A JP 61172832A JP 17283286 A JP17283286 A JP 17283286A JP H0655137 B2 JPH0655137 B2 JP H0655137B2
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【発明の詳細な説明】 〔従来の技術〕 本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素に類似する作
用を有すＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及びこ
の酵素を利用するＬ−α−アミノカルボン酸の製造方法
が特開昭59-198972に記載されている。しかしながらこ
の公開された明細書に記載されているＬ−フェニルアラ
ニンデヒドロゲナーゼはブレビバクテリウム(Brevibact
erium)属細菌により生産されたものであり、この明細書
には、バシルス(Bacillus)属細菌が同様の酵素を生産す
ることは全く示唆されていない。またこのＬ−フェニル
アラニンデヒドロゲナーゼは130,000±10,000の分子量
を有し、分子量6,600±5,000のサブユニットから成る
点、及びフェニルピルビン酸のみならずｐ−ヒドロキシ
フェニルピルビン酸、インドールピルビン酸等広範囲の
基質に対して高い特異性を有する点等において、本発明
のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素とは全く異なる。
用を有すＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及びこ
の酵素を利用するＬ−α−アミノカルボン酸の製造方法
が特開昭59-198972に記載されている。しかしながらこ
の公開された明細書に記載されているＬ−フェニルアラ
ニンデヒドロゲナーゼはブレビバクテリウム(Brevibact
erium)属細菌により生産されたものであり、この明細書
には、バシルス(Bacillus)属細菌が同様の酵素を生産す
ることは全く示唆されていない。またこのＬ−フェニル
アラニンデヒドロゲナーゼは130,000±10,000の分子量
を有し、分子量6,600±5,000のサブユニットから成る
点、及びフェニルピルビン酸のみならずｐ−ヒドロキシ
フェニルピルビン酸、インドールピルビン酸等広範囲の
基質に対して高い特異性を有する点等において、本発明
のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素とは全く異なる。
特開昭61-146183にはロドコッカス(Rhodococcus)属細菌
の生産するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及び
この酵素を利用するＬ−α−アミノカルボン酸の製造方
法が記載されている。この明細書には、バシルス(Bacil
lus)属細菌が同様の酵素を生産することは全く示唆され
ていない。ロドコッカス属細菌の生産する酵素はＬ−フ
ェニルアラニンに対して著しく高い基質特異性を有する
ことが記載されているが、酵素の分子量については全く
記載されていない。
の生産するＬ−フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ及び
この酵素を利用するＬ−α−アミノカルボン酸の製造方
法が記載されている。この明細書には、バシルス(Bacil
lus)属細菌が同様の酵素を生産することは全く示唆され
ていない。ロドコッカス属細菌の生産する酵素はＬ−フ
ェニルアラニンに対して著しく高い基質特異性を有する
ことが記載されているが、酵素の分子量については全く
記載されていない。
本発明者等の発明に係る特願昭60-080293号及び特願昭6
0-127118号明細書にはバシルス属微生物又はスポロサル
シナ(Sporosarcina)属微生物が生産するＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素及びその製造方法、並びに該酵素を使
用するＬ−フェニルアラニンの製造方法が記載されてい
る。しかし、これらの微生物に由来するフェニルアラニ
ン脱水素酵素はいずれも高速液体クロマトグラフィー(T
SK 3000 SW)により測定される約290,000の分子量を有す
る点などにおいて、360,000〜370,000の分子量を有する
本発明のフェニルアラニン脱水素酵素と異る。
0-127118号明細書にはバシルス属微生物又はスポロサル
シナ(Sporosarcina)属微生物が生産するＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素及びその製造方法、並びに該酵素を使
用するＬ−フェニルアラニンの製造方法が記載されてい
る。しかし、これらの微生物に由来するフェニルアラニ
ン脱水素酵素はいずれも高速液体クロマトグラフィー(T
SK 3000 SW)により測定される約290,000の分子量を有す
る点などにおいて、360,000〜370,000の分子量を有する
本発明のフェニルアラニン脱水素酵素と異る。
従って本発明は、今まで知られているＬ−フェニルアラ
ニン脱水素酵素とは異る新規なＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素、及びその製造方法を提供しようとするもので
ある。
ニン脱水素酵素とは異る新規なＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素、及びその製造方法を提供しようとするもので
ある。
本発明者等は、該酵素を生産する新規な微生物及び該酵
素の新規な製造方法を開発するために、Ｌ−フェニルア
ラニン脱水素酵素活性を有する菌株を広範囲にスクリー
ニングしたところ、バシルス属微生物が高活性で新規な
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を生産することを見い
出した。
素の新規な製造方法を開発するために、Ｌ−フェニルア
ラニン脱水素酵素活性を有する菌株を広範囲にスクリー
ニングしたところ、バシルス属微生物が高活性で新規な
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素を生産することを見い
出した。
前記の目的は、次の性質：(1)１モルのＬ−フェニルア
ラニン、１モルのNAD+及び１モルの水から１モルのフェ
ニルピルビン酸、１モルのアンモニウムイオン及び１モ
ルのNADHを生成する反応、並びにこの逆反応を触媒す
る；(2)高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法におい
て約360,000〜370,000の分子量を示し、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドディスク電気泳動法において約38,000〜3
9,000の分子量を有するサブユニットを示す；及び(3)Ｌ
−フェニルアラニンに特異的に作用し、Ｌ−チロシン、
Ｌ−トリプトファンン及びＬ−メチオニンに対する特異
性が非常に低い；を有することを特徴とするＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素：並びにバシルス属微生物を培養
し、この培養物から前記酵素を採取することを特徴とす
る前記酵素の製造方法を提供することにより解決され
る。
ラニン、１モルのNAD+及び１モルの水から１モルのフェ
ニルピルビン酸、１モルのアンモニウムイオン及び１モ
ルのNADHを生成する反応、並びにこの逆反応を触媒す
る；(2)高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法におい
て約360,000〜370,000の分子量を示し、ＳＤＳ−ポリア
クリルアミドディスク電気泳動法において約38,000〜3
9,000の分子量を有するサブユニットを示す；及び(3)Ｌ
−フェニルアラニンに特異的に作用し、Ｌ−チロシン、
Ｌ−トリプトファンン及びＬ−メチオニンに対する特異
性が非常に低い；を有することを特徴とするＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素：並びにバシルス属微生物を培養
し、この培養物から前記酵素を採取することを特徴とす
る前記酵素の製造方法を提供することにより解決され
る。
(1)微生物 本発明において使用する微生物として、例えばバシルス
・バディウスIAM 11059(ATCC 14574)微工研菌寄第2757
号(FERM BP-2757)を挙げることができる。本菌はATCCカ
タログやJFCCカタログに記載されており、容易に入手す
ることができる。
・バディウスIAM 11059(ATCC 14574)微工研菌寄第2757
号(FERM BP-2757)を挙げることができる。本菌はATCCカ
タログやJFCCカタログに記載されており、容易に入手す
ることができる。
なお、本菌に変異を商事させて一層生産性の高い菌株を
得ることもできる。さらに、これらの菌株の細胞中に存
在するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の生産を関与す
る遺伝子を切り出し、これを適切なベクター例えばプラ
スミドに挿入し、このベクターを用いて適当な宿主、例
えばエッシェリッヒア・コリ(Eshcherichia coli)や酵
母のごとき異種宿主を形質転換することにより、Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素生産株を人為的に創成するこ
ともできる。
得ることもできる。さらに、これらの菌株の細胞中に存
在するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の生産を関与す
る遺伝子を切り出し、これを適切なベクター例えばプラ
スミドに挿入し、このベクターを用いて適当な宿主、例
えばエッシェリッヒア・コリ(Eshcherichia coli)や酵
母のごとき異種宿主を形質転換することにより、Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素生産株を人為的に創成するこ
ともできる。
(2)酵素の製造方法 前記の微生物を培養して本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えること
が好ましい。
脱水素酵素を製造しようとする場合、基礎栄養培地とし
て、この発明の微生物が増殖し得るものであればいずれ
を使用してもよい。この培地は、窒素源として例えば酵
母エキス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類
を含有する。また、この培地には必要に応じて炭素源と
してグルコース、澱粉、グリセリン等を加えることがで
きる。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えること
が好ましい。
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造に当っては前記
基礎培地に、誘導物質として少量のＬ−フェニルアラニ
ンを添加するのが好ましい。このＬ−フェニルアラニン
の添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株の性質等に
より異なるがおよそ0.01〜１ｗ／ｖ％である。
基礎培地に、誘導物質として少量のＬ−フェニルアラニ
ンを添加するのが好ましい。このＬ−フェニルアラニン
の添加量は、基礎培地の組成、培養する菌株の性質等に
より異なるがおよそ0.01〜１ｗ／ｖ％である。
培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いてもよい
が、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用い、
振盪培養、通気、攪拌培養等により好気的条件下で培養
を行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素が生産される温度範囲内であ
ればいずれの温度でも良いが、好ましくは25〜45゜Cであ
る。pHは６〜11、好ましくは７〜10の範囲である。培養
時間は酵素活性が発現される時間を選べば良いが好まし
くは６〜48時間である。
が、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用い、
振盪培養、通気、攪拌培養等により好気的条件下で培養
を行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素が生産される温度範囲内であ
ればいずれの温度でも良いが、好ましくは25〜45゜Cであ
る。pHは６〜11、好ましくは７〜10の範囲である。培養
時間は酵素活性が発現される時間を選べば良いが好まし
くは６〜48時間である。
次に得られた培養物から本発明のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素が採取さるが、精製法として通常の酵素精製
法を用いることが出来る。遠心分離等によって、粗酵素
を得、さらにこれに硫酸プロタミン又は硫酸ストレプト
マイシンを加えて処理を行ない、塩析、有機溶媒沈澱、
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行ない、さらに硫
酸アンモニウム等の塩やポリエチレングリコール等の添
加による結晶化等の公知の方法によって均一の結晶酵素
標品を単離することが出来る。なお、本発明の酵素の製
造方法の具体的な一例を実施例に記載する。
脱水素酵素が採取さるが、精製法として通常の酵素精製
法を用いることが出来る。遠心分離等によって、粗酵素
を得、さらにこれに硫酸プロタミン又は硫酸ストレプト
マイシンを加えて処理を行ない、塩析、有機溶媒沈澱、
吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行ない、さらに硫
酸アンモニウム等の塩やポリエチレングリコール等の添
加による結晶化等の公知の方法によって均一の結晶酵素
標品を単離することが出来る。なお、本発明の酵素の製
造方法の具体的な一例を実施例に記載する。
(3)力価の測定法 本発明においては次の方法により力価を測定した。酸化
的脱アミノ化反応：グリシン-KCl-KOH緩衝液(pH10.5)10
0μmol、NAD+2.5μmol、Ｌ−フェニルアラニン１０μmo
l、及び適当量のサンプルを１mlになるように混合して
反応せしめ、２５゜CにおけるNADHの増加を340ｎｍの吸
光度の増加として計測し、１分間当り１μmolのNADHを
増加せしめる酵素量を１単位とする。
的脱アミノ化反応：グリシン-KCl-KOH緩衝液(pH10.5)10
0μmol、NAD+2.5μmol、Ｌ−フェニルアラニン１０μmo
l、及び適当量のサンプルを１mlになるように混合して
反応せしめ、２５゜CにおけるNADHの増加を340ｎｍの吸
光度の増加として計測し、１分間当り１μmolのNADHを
増加せしめる酵素量を１単位とする。
還元的アミノ化反応：グリシン-KCl緩衝液（pH9.5)100
μmol、NADH0.1μmol、NH4Cl 1200μmol、フェニルピル
ビン酸ナトリウム１０μmol及び適当量のサンプルを１m
lになるように混合して反応せしめ、２５゜CにおけるNAD
Hの減少を340ｎｍの吸光度の減少として計測し、１分間
当り１μmolのNADHを減少せしめる酵素量を１単位とす
る。なお本文中の酵素活性の単位は酸化的脱アミノ化反
応における活性の値を用いている。
μmol、NADH0.1μmol、NH4Cl 1200μmol、フェニルピル
ビン酸ナトリウム１０μmol及び適当量のサンプルを１m
lになるように混合して反応せしめ、２５゜CにおけるNAD
Hの減少を340ｎｍの吸光度の減少として計測し、１分間
当り１μmolのNADHを減少せしめる酵素量を１単位とす
る。なお本文中の酵素活性の単位は酸化的脱アミノ化反
応における活性の値を用いている。
(4)酵素の性質 本発明のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素は次の性質を
有する。
有する。
(1)作用：次式に示す反応を触媒する。
Ｌ−フェニルアラニン＋NAD+＋H2Oフェニルピルビン
酸＋NADH＋NH4 + (2)基質特異性：本酵素は酸化的脱アミノ化反応では、
Ｌ−フェニルアラニン以外のＬ−アミノ酸には極めてわ
ずかにしか反応しないか又は全く反応しない。
酸＋NADH＋NH4 + (2)基質特異性：本酵素は酸化的脱アミノ化反応では、
Ｌ−フェニルアラニン以外のＬ−アミノ酸には極めてわ
ずかにしか反応しないか又は全く反応しない。
補酵素としては、NAD+が必要であり、NADP+はNAD+に対
して約1.8％の活性を示すにすぎない。
して約1.8％の活性を示すにすぎない。
(3)至適pH：酸化的脱アミノ化反応では、pH10.5付近が
至適であり、還元的アミノ化反応では、pH9.4付近が至
適である。
至適であり、還元的アミノ化反応では、pH9.4付近が至
適である。
(4)pH安定性：各pHの衝撃液(0.05M)中３０゜Cにて１時間
保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化反応について
測定した場合、pH8.0付近が安定である。
保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化反応について
測定した場合、pH8.0付近が安定である。
(5)至適温度：６５゜C付近における活性が最大である。
(6)温度安定性：0.1Ｍリン酸緩衝液（pH8.0）中、各温
度において１０分間処理した後の残存活性を酸化的脱ア
ミノ化反応について測定する場合、５５゜Cで活性が半減
する。
度において１０分間処理した後の残存活性を酸化的脱ア
ミノ化反応について測定する場合、５５゜Cで活性が半減
する。
(7)吸収スペクトル：278ｎｍに極大吸収を有する。
(8)金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金属イオ
ン及びPCMBによって活性が阻害される。
ン及びPCMBによって活性が阻害される。
(9)等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動により
測定した場合3.5である。
測定した場合3.5である。
(10)分子量：高速液体クロマトグラフィー(TSK3000 SW)
により約360,000〜370,000と算出される。
により約360,000〜370,000と算出される。
(11)サブユニットの分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により約38,000〜39,000と算出される。
ドゲル電気泳動により約38,000〜39,000と算出される。
(12)均一性：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（7.5
％，pH8.4）により第１図Ａに示す如く単一のバンドを
与える。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（10.0％，pH7.2）により第１図Ｂに示す如く単一の
バンドを与える。
％，pH8.4）により第１図Ａに示す如く単一のバンドを
与える。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（10.0％，pH7.2）により第１図Ｂに示す如く単一の
バンドを与える。
次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。
実施例１．バシルス・バディウス(IAM11059;FERM BP-27
57)からのＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の精製 Ｌ−フェニルアラニン0.2％、酵母エキス0.5％、ペプト
ン1.0％、K2HPO40.2％NaCl 0.1％及びMgSO4・7H2O 0.02
％を含有し、pH7.0に調整した培地３０リッターを120゜
C、１５分間加熱殺菌した後、バシルス・バディウスIAM
11059（微工研条寄第2757号）を接種し湿重量約280ｇ
の菌体を得た。菌体を生理的食塩水で洗浄した後、0.1
ｍＭEDTA及びｍＭ２−メルカプトエタノールを含むリン
酸緩衝液（pH7.0）１リッターに懸濁し、９KHzにおける
超音波処理を約１０時間行ない菌体を破砕した。破砕菌
体は14,000×ｇ、２０分間の遠心分離で除去し、Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この
無細胞抽出液を５０゜C、１０分間の熱処理の後、固形硫
酸アンモニウムを加え３０％硫酸アンモニウム飽和とし
た。３０分攪拌の後、生成した沈澱を14,000×ｇで２０
分間遠心分離することにより除去した。この上清に固形
硫酸アンモニウムを加え６０％硫酸アンモニウム飽和と
した。遠心分離にり得られる、酵素活性を有する沈澱を
少量の0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、さらに
0.1ｍＭのEDTA及び５ｍＭの２−メルカプトエタノール
を含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で透析した。この
酵素液をあらかじめ0.1ｍＭのEDTA及び５ｍＭの２−メ
ルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.
0）で平衡化したEDAE−トヨパール650Ｍのカラムに通過
させ、さらに0.1ｍＭのEDTA及び５ｍＭの２−メルカプ
トエタノール及び0.1ＭのNaClを含む0.1Ｍリン酸緩衝液
（pH7.0）で溶出した。
57)からのＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の精製 Ｌ−フェニルアラニン0.2％、酵母エキス0.5％、ペプト
ン1.0％、K2HPO40.2％NaCl 0.1％及びMgSO4・7H2O 0.02
％を含有し、pH7.0に調整した培地３０リッターを120゜
C、１５分間加熱殺菌した後、バシルス・バディウスIAM
11059（微工研条寄第2757号）を接種し湿重量約280ｇ
の菌体を得た。菌体を生理的食塩水で洗浄した後、0.1
ｍＭEDTA及びｍＭ２−メルカプトエタノールを含むリン
酸緩衝液（pH7.0）１リッターに懸濁し、９KHzにおける
超音波処理を約１０時間行ない菌体を破砕した。破砕菌
体は14,000×ｇ、２０分間の遠心分離で除去し、Ｌ−フ
ェニルアラニン脱水素酵素を含む粗抽出液を得た。この
無細胞抽出液を５０゜C、１０分間の熱処理の後、固形硫
酸アンモニウムを加え３０％硫酸アンモニウム飽和とし
た。３０分攪拌の後、生成した沈澱を14,000×ｇで２０
分間遠心分離することにより除去した。この上清に固形
硫酸アンモニウムを加え６０％硫酸アンモニウム飽和と
した。遠心分離にり得られる、酵素活性を有する沈澱を
少量の0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解し、さらに
0.1ｍＭのEDTA及び５ｍＭの２−メルカプトエタノール
を含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）で透析した。この
酵素液をあらかじめ0.1ｍＭのEDTA及び５ｍＭの２−メ
ルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.
0）で平衡化したEDAE−トヨパール650Ｍのカラムに通過
させ、さらに0.1ｍＭのEDTA及び５ｍＭの２−メルカプ
トエタノール及び0.1ＭのNaClを含む0.1Ｍリン酸緩衝液
（pH7.0）で溶出した。
活性区分を集め、0.1ｍＭのEDTA及び５ｍＭの２−メル
カプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）
で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したDEAE−ト
ヨパール650Ｍのカラムに通過させ、前工程と同様にし
て酵素を溶出させた。この活性区分を集め、固体硫酸ア
ンモニウムの添加により４０％の硫酸アンモニウム飽和
とした。生成する沈澱を遠心分離により除去し、上清を
さらに５０％硫酸アンモニウム飽和とした。酵素活性を
有する沈澱を遠心分離により得、少量の0.01Ｍリン酸緩
衝液（pH7.0）に溶解し、0.1ｍＭのEDTA及び５ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH
7.0）で透析した。この酵素液を再び３０％硫酸アンモ
ニウム飽和とし、あらかじめ0.1ｍＭEDTA及び５ｍＭの
２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン３緩衝液
（pH7.0）の３０％硫酸アンモニウム飽和液で平衡化し
たオキチル−セファロースのカラムに通過させ３０％か
ら０％の硫酸アンモニウム飽和の同リン酸緩衝液の直線
的な濃度勾配で酵素を溶出させた。この活性区分を集
め、0.1ｍＭのEDTA及び５ｍＭの２−メルカプトエタノ
ール及び0.1ＭNaClを含む0.05Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）
で平衡化したセファデックスＧ−200によるゲル濾過ク
ロマトグラフィーを行なった。こうして、Ｌ−フェニル
アラニン脱水素酵素を約7.2％の収率で約190倍に精製し
た。この精製過程における比活性及び回収率を第１表に
示す。この酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳動（7.
5％ゲル、pH8.4）及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（10.0％ゲル、pH7.2）において均一であるこ
とが証明された。
カプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）
で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したDEAE−ト
ヨパール650Ｍのカラムに通過させ、前工程と同様にし
て酵素を溶出させた。この活性区分を集め、固体硫酸ア
ンモニウムの添加により４０％の硫酸アンモニウム飽和
とした。生成する沈澱を遠心分離により除去し、上清を
さらに５０％硫酸アンモニウム飽和とした。酵素活性を
有する沈澱を遠心分離により得、少量の0.01Ｍリン酸緩
衝液（pH7.0）に溶解し、0.1ｍＭのEDTA及び５ｍＭの２
−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン酸緩衝液（pH
7.0）で透析した。この酵素液を再び３０％硫酸アンモ
ニウム飽和とし、あらかじめ0.1ｍＭEDTA及び５ｍＭの
２−メルカプトエタノールを含む0.01Ｍリン３緩衝液
（pH7.0）の３０％硫酸アンモニウム飽和液で平衡化し
たオキチル−セファロースのカラムに通過させ３０％か
ら０％の硫酸アンモニウム飽和の同リン酸緩衝液の直線
的な濃度勾配で酵素を溶出させた。この活性区分を集
め、0.1ｍＭのEDTA及び５ｍＭの２−メルカプトエタノ
ール及び0.1ＭNaClを含む0.05Ｍリン酸緩衝液（pH7.0）
で平衡化したセファデックスＧ−200によるゲル濾過ク
ロマトグラフィーを行なった。こうして、Ｌ−フェニル
アラニン脱水素酵素を約7.2％の収率で約190倍に精製し
た。この精製過程における比活性及び回収率を第１表に
示す。この酵素はポリアクリルアミドゲル電気泳動（7.
5％ゲル、pH8.4）及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（10.0％ゲル、pH7.2）において均一であるこ
とが証明された。
参考例１．Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の使用例 フェニルピルビン酸ナトリウム20.4mg(100μmol）、蟻
酸アンモニウム５０mg(800μmol）、NAD+3.6mg（５μmo
l）、トリス−塩酸緩衝液（pH8.5)250μmol、バシルス
・バディウスIAM11059のＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素0.5単位（均一精製酵素）、および粗蟻酸脱水素酸素
0.5単位（(pH8.5)、カンジダ・ボイディニNo.2201より
部分精製）を含む５mlの反応液を３０゜Cにおいて２４時
間保温した。微生物定量法により定量したところ16.2mg
（98μmol；９８％の転換率）のＬ−フェニルアラニン
が生成していた。
酸アンモニウム５０mg(800μmol）、NAD+3.6mg（５μmo
l）、トリス−塩酸緩衝液（pH8.5)250μmol、バシルス
・バディウスIAM11059のＬ−フェニルアラニン脱水素酵
素0.5単位（均一精製酵素）、および粗蟻酸脱水素酸素
0.5単位（(pH8.5)、カンジダ・ボイディニNo.2201より
部分精製）を含む５mlの反応液を３０゜Cにおいて２４時
間保温した。微生物定量法により定量したところ16.2mg
（98μmol；９８％の転換率）のＬ−フェニルアラニン
が生成していた。
参考例２．Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の使用例 バシルス・バディウスIAM 11059により生産されるＬ−
フェニルアラニン脱水素酵素の基質特異性を酸化的脱ア
ミノ化について測定した場合、Ｌ−フェニルアラニン以
外のＬ−アミノ酸にきわめてわずかしか反応しないが、
還元的アミノ化反応においては相当に広い基質特異性を
有する。この知見に基き、バシルス・バディウスIAM 11
059の菌体あるいはＬ−フェニルアラニン脱水素酵素を
用いて第２表に記載する各種のα−ケト酸からそれぞれ
対応するＬ−アミノ酸の合成を行なった。なお、表中で
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の状態で「粗酵素」と
は無細胞抽出液を硫安分画した酵素を意味し、「部分精
製酵素」とは、さらにDEAE−トヨパールカラムを通過さ
せた酵素を意味する。NAD+又はNADHの濃度は１ないし２
０ｍＭの濃度となるようにした。アンモニウムイオンは
塩化アンモニウム、蟻酸アンモニウム又はNH4OH-NH4Cl
緩衝液（pH9.0）として供給し、その濃度は0.05ないし
0.5Ｍの濃度となるようにした。蟻酸は蟻酸ナトリウム
又は蟻酸アンモニウムとして供給し、その量はα−ケト
カルボン酸の１〜30当量とした。反応液のpHは8.5ない
し９であり、トリス−HCl緩衝液（pH8.5）又はNH4OH-NH
4Cl緩衝液（pH9.0）を0.05ないし0.5Ｍの濃度となるよ
うにして用いた。反応は３０゜Cで行なった。反応液中に
生成したＬ−アミノ酸の定量はロイコノストック・メセ
ンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)ATCC 8042を
用いるバイオアッセイにより行なった。
フェニルアラニン脱水素酵素の基質特異性を酸化的脱ア
ミノ化について測定した場合、Ｌ−フェニルアラニン以
外のＬ−アミノ酸にきわめてわずかしか反応しないが、
還元的アミノ化反応においては相当に広い基質特異性を
有する。この知見に基き、バシルス・バディウスIAM 11
059の菌体あるいはＬ−フェニルアラニン脱水素酵素を
用いて第２表に記載する各種のα−ケト酸からそれぞれ
対応するＬ−アミノ酸の合成を行なった。なお、表中で
Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素の状態で「粗酵素」と
は無細胞抽出液を硫安分画した酵素を意味し、「部分精
製酵素」とは、さらにDEAE−トヨパールカラムを通過さ
せた酵素を意味する。NAD+又はNADHの濃度は１ないし２
０ｍＭの濃度となるようにした。アンモニウムイオンは
塩化アンモニウム、蟻酸アンモニウム又はNH4OH-NH4Cl
緩衝液（pH9.0）として供給し、その濃度は0.05ないし
0.5Ｍの濃度となるようにした。蟻酸は蟻酸ナトリウム
又は蟻酸アンモニウムとして供給し、その量はα−ケト
カルボン酸の１〜30当量とした。反応液のpHは8.5ない
し９であり、トリス−HCl緩衝液（pH8.5）又はNH4OH-NH
4Cl緩衝液（pH9.0）を0.05ないし0.5Ｍの濃度となるよ
うにして用いた。反応は３０゜Cで行なった。反応液中に
生成したＬ−アミノ酸の定量はロイコノストック・メセ
ンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)ATCC 8042を
用いるバイオアッセイにより行なった。
なお、具体的には次の様にして反応を行ない、後記の結
果を得た。
果を得た。
反応番号１ フェニルピルビン酸ナトリウム74.3mg(364μmol）、グ
リセロール２８mg(300μmol）、バシルス・バディウスI
AM 11059の菌体（５mlの培養液から菌体を遠心分離で集
菌し、生理的食塩水で１回洗浄した菌体）を含む５mlの
反応液を３０゜Cで２４時間静置した。反応液中のＬ−フ
ェニルアラニンの量を微生物定量法により測定したとこ
ろ２５mg(153μmol：４２％の転換率）のＬ−フェニル
アラニンが生成していた。
リセロール２８mg(300μmol）、バシルス・バディウスI
AM 11059の菌体（５mlの培養液から菌体を遠心分離で集
菌し、生理的食塩水で１回洗浄した菌体）を含む５mlの
反応液を３０゜Cで２４時間静置した。反応液中のＬ−フ
ェニルアラニンの量を微生物定量法により測定したとこ
ろ２５mg(153μmol：４２％の転換率）のＬ−フェニル
アラニンが生成していた。
反応番号２はこの例と同様に実験を行なった。
反応番号３ フェニルピルビン３ナトリウム20.4mg(100μmol）、NAD
H76.3mg(100μmol）、トリス−塩酸緩衝液（pH8.5)250
μmol、塩化アンモニウム107mg（２ｍmol）、バシルス
・バディウスIAM 11059のＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素0.5単位（硫安分画における30〜60％飽和画分）を
含む５mlの反応液を３０゜Cにおいて２４時間保温した。
H76.3mg(100μmol）、トリス−塩酸緩衝液（pH8.5)250
μmol、塩化アンモニウム107mg（２ｍmol）、バシルス
・バディウスIAM 11059のＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素0.5単位（硫安分画における30〜60％飽和画分）を
含む５mlの反応液を３０゜Cにおいて２４時間保温した。
反応液中のＬ−フェニルアラニン量を微生物定量法によ
り測定したところ、15.7mg（９５μmol；９５％の転換
率）のＬ−フェニルアラニンが生成していた。反応番号
５はこの例と同様に実験を行なった。
り測定したところ、15.7mg（９５μmol；９５％の転換
率）のＬ−フェニルアラニンが生成していた。反応番号
５はこの例と同様に実験を行なった。
反応番号４ フェニルピルビン酸ナトリウム20.4mg(100μmol）、蟻
酸アンモニウム５０mg(800μmol）、NAD+3.6mg（５μmo
l）、トリス−塩酸緩衝液（pH8.4)250μmol、バシルス
・バディウスIAM 11059のＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素0.5単位（硫安分画における30〜60％飽和画分）、
および粗蟻酸脱水素酵素0.5単位（pH8.5、カンジダ・ボ
イディニNo.2201より部分精製）を含む５mlの反応液を
３０゜Cにおいて２４時間保温した。微生物定量法により
定量したところ15.7mg（９５μmol；９８％の転換率）
のＬ−フェニルアラニンが生成していた。反応番号６，
７，８は、この例と同様に実験を行なった。
酸アンモニウム５０mg(800μmol）、NAD+3.6mg（５μmo
l）、トリス−塩酸緩衝液（pH8.4)250μmol、バシルス
・バディウスIAM 11059のＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素0.5単位（硫安分画における30〜60％飽和画分）、
および粗蟻酸脱水素酵素0.5単位（pH8.5、カンジダ・ボ
イディニNo.2201より部分精製）を含む５mlの反応液を
３０゜Cにおいて２４時間保温した。微生物定量法により
定量したところ15.7mg（９５μmol；９８％の転換率）
のＬ−フェニルアラニンが生成していた。反応番号６，
７，８は、この例と同様に実験を行なった。
これらの結果を次の第２表に要約する。
第１図は、本発明のフェニルアラニン脱水素酵素のポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（Ａ）及びＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（Ｂ）の泳動図のスケッチで
ある。
アクリルアミドゲル電気泳動（Ａ）及びＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（Ｂ）の泳動図のスケッチで
ある。
Claims (4)
- 【請求項１】次の性質： （１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのNAD+及
び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１モル
のアンモニウムイオン及び１モルのＮＡＤＨを生成する
反応、並びにこの逆反応を触媒する； （２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約360,000〜370,000の分子量を示し、SDS−ポリアクリ
ルアミドディスク電気泳動法において約38,000〜39,000
の分子量を有するサブユニットを示す； （３）Ｌ−フェニルアラニンに特異的に作用し、そして
Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニン
に対する特異性が非常に低い； （４）至適pH：酸化的脱アミノ化反応では、pH10.5付近
が至適であり、還元的アミノ化反応では、pH9.4付近が
至適である； （５）pH安定性：各pHの緩衝液（0.05M）中30℃にて１
時間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化反応につ
いて測定した場合、pH8.0付近が安定である； 並びに （６）至適温度：65℃付近における活性が最大である； を有することを特徴とするＬ−フェニルアラニン脱水素
酵素。 - 【請求項２】バシルス・バディウス(Bacillus badius)
(FERM BP-2757)により生産される特許請求の範囲第１項
記載の酵素。 - 【請求項３】次の性質： （１）１モルのＬ−フェニルアラニン、１モルのNAD+及
び１モルの水から１モルのフェニルピルビン酸、１モル
のアンモニウムイオン及び１モルのNADHを生成する反
応、並びにこの逆反応を触媒する； （２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約360,000〜370,000の分子量を示し、SDS−ポリアクリ
ルアミドディスク電気泳動法において約38,000〜39,000
の分子量を有するサブユニットを示す； （３）Ｌ−フェニルアラニンに特異的に作用し、そして
Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−メチオニン
に対する特異性が非常に低い； （４）至適pH：酸化的脱アミノ化反応では、pH0.5付近
が至適であり、還元的アミノ化反応では、pH9.4付近が
至適である； （５）pH安定性：各pHの緩衝液(0.05M)中30℃にて１時
間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化反応につい
て測定した場合、pH8.0付近が安定である； 並びに （６）至適温度：65℃付近における活性が最大である； を有するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の製造方法に
おいて、該酵素を生産することができるバシルス(Bacil
lus)属微生物を培養し、この培養物から該酵素を採取す
ることを特徴とする方法。 - 【請求項４】前記バシルス属微生物がバシルス・バディ
ウス(Bacillus badius)(FERMBP-2757)である特許請求の
範囲第３項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61172832A JPH0655137B2 (ja) | 1986-07-24 | 1986-07-24 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61172832A JPH0655137B2 (ja) | 1986-07-24 | 1986-07-24 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6332482A JPS6332482A (ja) | 1988-02-12 |
| JPH0655137B2 true JPH0655137B2 (ja) | 1994-07-27 |
Family
ID=15949177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61172832A Expired - Lifetime JPH0655137B2 (ja) | 1986-07-24 | 1986-07-24 | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0655137B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9267116B2 (en) | 2008-12-09 | 2016-02-23 | Kaneka Corporation | Amino acid dehydrogenase, and process for producing L-amino acid, 2-oxo acid or D-amino acid |
| JPWO2021070943A1 (ja) * | 2019-10-11 | 2021-04-15 |
-
1986
- 1986-07-24 JP JP61172832A patent/JPH0655137B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6332482A (ja) | 1988-02-12 |
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