JPH06510206A

JPH06510206A - 新規ヘテロダイマー核レセプタータンパク質、それをコードする遺伝子、およびその使用

Info

Publication number: JPH06510206A
Application number: JP5513364A
Authority: JP
Inventors: レイド、マーク; カストネール、フィリップ; シャンボン、ピエール
Original assignee: アンスティテュー・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル; サントル・ナシオナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シアンティフィク; ユニベルシテ・ルイ・パストゥール・ストラスブール・アン; イー・アール・スクイブ・アンド・サンズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1992-01-24
Filing date: 1993-01-25
Publication date: 1994-11-17
Also published as: WO1993015216A1; US6635429B1; EP0577814A1; CA2106382A1; EP0577814A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規へテロダイマー核レセプタータンパク質、それをコードする遺伝子、およびその使用この出願は、１９９２年１月２４日に出願された継続中の米国特許出願第０７／８２５．６６７号の一部継続出願である。

発明の技術分野本発明は、核レセプターの分野に関する。詳しくは、本発明は、ＲＸレセプターをコードするＤＮＡの単離に一部基づいており、２つの異なるタイプの核レセプターであるレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）および甲状腺レセプター（ＴＲ）がＲＸレセプター（ＲＸＲ）とダイマーを形成してヘテロダイマーを生成するという新規観察に基づいている。このヘテロダイマーは、生理学的条件下でレチノイン酸応答要素（ｒｅｔｉｎｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ）　（ＲＡＲＥ）　、甲状腺レセプター応答要素（ｔｈｙｒｏｉｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ）　（ＴＨＥ）　、またはＲＸ応答要素（ＲＸ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ）　（ＲＸＲＥ）と結合することができる。

この観察に基づき、本発明は、開示されたヘテロダイマーと結合することのできる因子を同定する方法、並びに該ヘテロダイマーによって結合可能なりＮＡ配列を同定する方法を提供する。加えて、本発明は、ＲＡ代謝に関与する哺乳動物特異的酵素を同定する方法、ＲＸＲの新規へテロパートナ−およびレチノイン酸レセプターの活性化機能に関与する補助因子を記載する。

発明の背景レチノイド（ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ）は、を推動物の発達期間中における重要なシグナル分子（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）であって幾つかの成人組織の分化状態を制御するためのものと考えられるビタミンＡ（レチノール）の代謝産物である（概観するため、ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）　、Ｎｅｕｒｏｎ　２　＋１２８５〜１２９４　（１９８９）およびブロックス、Ｎａｔｕｒｅ　３４５　：　７６６〜７６８　（１９９０）；ンヤーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ、Ｍ、　１．）　、レチノイドおよび細胞分化、ジャーマン（編）、ＣＲＣプレス（１９８６）：サマーペル（５ｕｍｍｅｒｂｅｌｌ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ。

１３　：１４２〜１４７　（１９９０）参照）。核レチノイドレセプターの２つのファミリーは、特徴付けられたレチノイン酸レセプターであり、これにはＲＡＲ−α、Ｒ，ＡＲ−βおよびＲＡＲ−γが含まれ（概観のため、ルバー）　（Ｒｕｂｅｒｔｅ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１１１　：　４５〜６０　（１９９１ｂ）およびシャンボン（（：　１１ａｍｂｏｎ）ら、Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　ｉｎ　Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、２　＋１５３〜１５９　（１９９１ａ）参照）、全トランスレチノイン酸（ＲＡ）に対して高い親和性を有し、甲状腺ホルモン（ＴＲ８）、ビタミンＤ３　（ＶＤＲ）およびエクジソン（ＥｃＲ）レセプターなどの核レセプターと同じクラスに属する（ケレ（Ｋｏｅｌｌｅ）ら、Ｃｅ１ｌ　６７　：　５９〜７７（１，９９１）参照）。ＲＸＲファミリーの成員であるＲＸＲ− α（マンゲルスドルフ（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ）ら、Ｃｅ１ｌ　６６：５５５〜５６１　（１９９０）、参照のため本明細書中に引用する）、ＲＸＲ−β（ハマダ（）ｌ　ａｍａｄａ）ら、Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６　：　８２８９−８２９３　（１９８９）　、参照のため本明細書中に引用する）およびＲＸＲ−γは、はるかに高濃度のＲＡに応答し、ＲＸＲの天然のりガントはＲＡの新規な立体異性体であると思われる。ＲＸＲは、ドロソフィリア・ウルトラスビラクレ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ　ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）　（ｕｓｐ）遺伝子産物を含む核レセプターの異なるクラスに属する（オロ（Ｏｒｏ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３４７・２９８〜３０１　（１９９０）　）。

合成および天然のＤＮＡ応答要素（ＲＥｓ）は、ＴＲｓについて（グラス（Ｇ］、ａｓｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３２９　：　７３８〜７４１　（１９８７）：ウメソノ（Ｕｍｅｓｏｎｏ）ら、Ｃｅ１ｌ　６５　：　１２５５〜］　２６６　（１９９１）およびその参照文献）、ＲＡＲｓについて（バシオス（Ｖａｓｉｏｓ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８６１９０９９〜９１０３　（１９８９）およびバシオスら、ＥＭＢＯＪ、１０　：１１４９〜１１５８　（１９９１）；ド・テ（ｄｅ　Ｔｈｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４３　：　１７７−１８０　（１９９０）；レロイ（Ｌｅｒｏｙ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾８８　：１０１３８〜１０１４２　（１９９１ａ）およびその参照文献）、およびＲＸＲｓについて（マンゲルスドルフら、Ｎａｔｕｒｅ　３４５　：２２４〜２２９　（１９９０）およびマンゲルスドルフら、Ｃｅ１ｌ　６６：５５５〜５６１　（１９９１））特徴付けされている。これらＲＥｓはすべて、コアモチーフ、ＰｕＧ＊ＴＣＡ　（Ｐｕ＝プリン）（または関連配列）の繰り返しが方向（直行繰り返しまたは逆行繰り返し）および２つのモチーフのスペースの両方において異なる立体配置をとったものからなる。所定のレセプターによるＲＥｓの認識は、実際の配列、方向および繰り返しモチーフのスペースに依存すると思われる。直行繰り返しモチーフ間のスペースの影響に関する系統的な研究によると、ＲＡＲｓは５ｂｐのスペースを有するモチーフと関係があり（ウメソノら、Ｃｅ１ｌ　６５　：１２５５〜１２６６（１９９１））、一方、ＴＲｓおよびＲＸＲｓは、それぞれ４ｂｐ　（ウメ’／／ら、Ｃｅ１ｌ　６５　：　１２５５〜１２６６　（１９９１））および１ｂｐ（マンゲルスドルフら、Ｃｅ１ｌ　６６　：５５５〜５６１　（１９９１））のスペースを有するモチーフを優先的に認識することが示された。これらＲＥｓに繰り返しモチーフが存在すること、およびグルココルチコイドおよびエストローゲンレセブターが、同様のモチーフからなるパリンドローム状ＲＥｓにダイマーとして結合するという証拠（シュバーベ（Ｓ　ｃｈｗａｂｅ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ、　１１６　：　２９１−２９６　（１９９１）：ルイ ’、ｉ　（Ｌｕｉｓｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３５２　：　４９７〜５０５　（１９９１）；およびその参照文献）は、ＲＡＲｓ、ＴＲｓおよびＲＸＲｓもまたＲＥｓにダイマーとして結合することを示唆している。この可能性は、ＴＲｓおよびＲＡＲｓの場合におけるインビトロでの結合の証拠（グラスら、Ｃｅ１ｌ　５９　：６９７〜７０８　（１９８９）；グラスら、Ｃｅ１ｌ　６３　：　７２９〜７３８　（１９９０）、ラザー（Ｌａｚａｒ：ｉら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１１　＋　５００５〜５０１５　（１９９］）＋７ｔ−？ン（Ｆ　ｏｒｍａｎ）ら、Ｇｅｎｅ　１０５　：　９〜１５　（１９９１））により直接支持されている。しかしながら、ＲＡＲ（グラスら、Ｃｅ１ｌ　６３　：　７２９〜７３８　（１９９０））およびＴＲ（ｖレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら、Ｍｏｌ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、３　：　１４３４〜１４４２　（１９８９）；バーンサイド（Ｂ　ｕｒｎｓｉｄｅ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５　：　２５００−２５０４　（１９９０））のＲＥＳへのインビトロ結合が、種々の細胞の核抽出物中に存在する現在のところまだ特徴付けられていない因子の添加によって大きく刺激されることも報告されている（他の文献については検討の項目を参照）。さらに、これら因子がＲＡＲ（グラスら、Ｃｅ１ｌ　６３　ニア２９〜７３８　（１９９０））およびＴＲ（ラザーら、Ｍｏ１ｅｃ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、１１　：５００５〜５０１５　（１９９１）；ナール（Ｎａａｒ）ら、Ｃｅ１ｌ　６５　：　１２６７〜１２７９　（１９９１））とヘテロダイマーを生成することを示す証拠も提出されており、これら（ＲＡＲおよびＴＲ）は単離されたレセプターよりも高い親和性にてＲＥｓに結合する。

種々の宿主−ベクター系において過剰発現されたＲＡＲｓの精製過程において、これらレセプターはＲＡＲ−β２プロモーター（β−ＲＡＲＥ）のＲＡ応答要素（ＲＡＲＥ）へ結合する能力を失い（ド・テら、Ｎａｔｕｒｅ　３４３　：１７７〜１８０　（１９９０）ニスコブ（Ｓ　ｕｃｏｖ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ８７　：　５３９２〜５３９８　（１９９０）；メンデルゾーン（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１１３　：　７２３〜７３４　（１９９１））　、この能力は、過剰発現されたＲＡＲｓの採取源のいかんに拘わらずヒーラ細胞の核抽出物を添加することにより回復することができた。

レチノイドは、口部の老化皮膚（エリス（Ｅｌｌｉｓ）ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　５ｋｉｎ、　３：２４９〜２５３　（１９８９）　）、種々のタイプの皮膚病（ゴルニック（Ｇｏｌｌｎｉｃｋ）　、Ｄｅｒｆｆｉａｔｏｌｏｇｉｃａｌ　１７５　（１）　：　１８２〜１９５　（１９８７）　）、角質化の疾患（ハラプル（Ｈａｐｐｌｅ）ら、Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ　１７５　（１）　＋　１０７〜１２４　（１９８７）’）　、慢性関節リュウマチ（プリンケルホフ（Ｂ　ｒｉｎｃｋｅｒｈｏｆｆ）ら、１９８５　レチノイド、分化および疾患、ピットマン、ロンドン（チバファウンデーションシンポジウム１１３）１９１〜２１１頁）、基底細胞癌腫（ベック（Ｐｅｃｋ）　、ＤｅｒＩＩｌａｔｏｌｏｇｉｃａｌ　１７５　（１）　：１３８〜１４４（１９８７））、および全身性硬化症（モーリス（Ｍａｕｒｉｃｅ）ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。

５ｋｉｎ、３　：　２３５〜２３９　（１９８９））の治療に用いられている。

加えて、レチノイドは、免疫刺激作用を有しくデナート（Ｄｅｎｎｅｒｔ）　、１９８５　レチノイド、分化および疾患、ピットマン、ロンドン（チバファウンデーションシンポジウム１１３）１１７〜１３１頁）、表皮末端分化を抑制しくリヒティ（Ｌｉｃｈｔｉ）ら、１９８５　レチノイド、分化および疾患、ピットマン、ロンドン（チバファウンデーションシンポジウム１１３）７７〜８９頁）、膀胱における発癌を調節しくヒックス（Ｈ１ｃｋｓ）ら、１９８５　レチノイド、分化および疾患、ピットマン、ロンドン（チバファウンデーションシンポジウム１１３）１６８〜１９０頁）、肝癌腫細胞の分化を制御しくジャーマンら、１９８５　レチノイド、分化および疾患、ピットマン、ロンドン（チバファウンデーションシンポジウム１１３）４２〜６０頁）、気管上皮細胞の分化を制御しくジェッテン（Ｊ　ｅｔｔｅｎ）ら、１９８５　レチノイド、分化および疾患、ピットマン、ロンドン（チバファウンデーションシンポジウム１１３）６１〜７６頁）、新生物トランスフォーメーションを抑制しくバートラム（Ｂ　ｅｒｔｒａｍ）ら、１９８５　レチノイド、分化および疾患、ピットマン、ロンドン（チバファウンデーションシンポジウム１１３）２９〜４１頁）、抗炎症作用を有しくネイ（Ｎｅいら、Ｄｅｒ＋ａａｔｏｌｏｇｉｃａｌ　１７５　（１）：　９３〜９９　（１９８７））　、黒色腫増殖を調節する（アモス（Ａ　ｗａｓ）ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、５ｋｉｎ、３　：　２９〜３６　（１９８９）　）ことが示されており、コレステロール代謝において重要な役割を有するかもしれない（ロットマン（Ｒｏｔｔｍａｎ）ら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、１１　：　３８１４〜３８２０　（１９９１））。

レチノイドが制御することのできる種々の作用がどのような分子的基盤に基づいているのかはわかっていない。ひとつの可能性としては、レチノイドによって制御される種々の作用は組織特異的ＲＡＲレセプターとのレチノイドリガンドの相互作用によって引き起こされるということが挙げられる。別の考え方として、これら種々のレセプターは異なるＲＥモチーフに異なる親和性で結合するのかもしれない。

本発明において開示される観察を用い、特定のＲＡＲ／ＲＸＲ，およびＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマーの組み合わせとのレチノイド、またはその誘導体の相互作用を調べることがいまや可能である。加えて、これらへテロダイマーの組み合わせのそれぞれについて、異なるＲＡＲＥ、ＴＲＥまたはＲＸＲＥ配列との親和性を調べることができる。そのような系により、レチノイドによって刺激される生物学的作用の一層の理解が得られ、次世代のレチノイドの同定が可能となるであろう。

発明の要約本発明は、３つのタイプの核レセプターであるＲＡＲ，ＲＸＲおよびＴＲ（ＤＮＡ応答要素にホモダイマーとして結合すると思われていた）が生理学的条件においてへテロダイマーを実際に生成し、これがそれぞれの各ホモダイマーに比べて高い親和性を種々のＲＥモチーフに対して有するという新規な観察に一部は基づいている。

この観察に基づき、本発明は、２つのサブユニット（これらサブユニットの一方はＲＡＲまたはＴＲであり、他方のサブユニットはＲＸＲである）からなるヘテロダイマータンパク質を提供する。

本発明はさらに、ＲＸＲの高度精製サブタイプおよびイソ形を提供する。このＲＸＲの高度精製形は、約１４６１〜７，７５０，０００ｃｐｍ／μｇの比活性を有する。本発明の種々のＲＸＲのアミノ酸配列の例は、配列番号２（ｍＲＸＲ− β）、配列番号４　（ｈＲＸＲ−β１）、配列番号６　（ｈＲＸＲ−β２）　、配列番号９　（ｍＲＸＲ−α）、および配列番号１１（ｍＲＸＲ−γ）に示しである。

本発明はさらに、ＲＸＲのサブタイプおよびイソ形を精製する方法を提供する。

詳しくは、ＲＸＲは、（ａ）約５０ｍＭからのＫＣＩを含有する緩衝液の存在下、ＲＸＲタンパク質を含有する試料をＤＥＡＥクロマトグラフィーカラムと接触させ；（ｂ）カラムからのフラクションによる流れ中のＲＸＲを回収し；（Ｃ）フラクション（ｂ）による該流れをＨＥＰ−ＵＧカラムと接触させ：（ｄ）約２９０ｍＭからのＫＣＩを用い、カラムからＲＸＲを溶出し。

（ｅ）該ＫＣＩ溶出したＲＸＲ（ｄ）をフェニル−５ＰＷカラムと接触させ。

（ｆ）約２５０ｍＭからの硫酸アンモニウムを用い、カラムからＲＸＲを溶出しくｇ）該硫酸アンモニウム溶出ＲＸＲ（ｆ）をＨＥＰ−ＴＳＫカラムと接触させ（ｈ）約２５０ｍＭからのＫＣＩを用い、カラムからＲＸＲを溶出し；（ｉ）該ＫＣＩ溶出ＲＸＲ（ｈ）をＨＡＰ−ＴＳＫカラムと接触させ二ついで（ｊ）約１５０ｍＭからのリン酸カリウムを用い、カラムがらＲＸＲを溶出することにより精製することができる。

本発明はさらに、上記へテロダイマーのいずれかと結合することのできるＤＮＡ配列を提供する。

本発明はさらに、上記へテロダイマーのいずれがと結合することのできる抗体を提供する。

本発明はさらに、本発明のヘテロダイマーと結合することのできる因子の同定方法であって、（１）因子を本発明のへテロダイマーの一つとともにインキュベートし；つぃで（２）該因子が該ヘテロダイマーに結合したか否かを決定する工程からなることを特徴とする方法を提供する。

本発明はさらに、ＲＡＲＥＳＴＲＥ、またはＲＸＲＥに機能的に連結した配列の転写を誘発することのできる因子の同定方法を提供する。これら方法は、（１）細胞、生物、またはその抽出物（本明細書に記載する１または２以上のへテロダイマーを発現するよう変えである）を因子とともにインキュベートし、その際、該細胞または生物はＲＡＲＥに機能的に連結したレポーター配列を含有する：ついで（２）該レポーター配列の発現についてアッセイする工程からなる。

本発明はまた、まず上記アッセイにおいて転写を誘発することのできるヘテロダイマー／ＲＥ／因子の組み合わせを同定し、ついでヘテロダイマーを発現しＤＮＡ配列（ＲＥに機能的に連結）を含有するように細胞または生物を変えることにより、特異的因子に応答したＤＮＡ配列の発現を指令する方法をも提供する。

本発明はさらに、レセプターのＲＸＲファミリーの成員をコードするＤＮＡ配列を提供する。詳しくは、ｍＲＸＲ−βの１つのイソ形をコードする配列（配列番号ｌ）　、ｈＲＸＲ−βの３つのイソ形をコードする配列（配列番号３．５および７）　、ｍＲＸＲ−αの１つのイソ形をコードする配列（配列番号８）、およびｍＲＸＲ−γの１つのイソ形をコードする配列（配列番号１０）を記載しである。

依存性：ヒーラ細胞ＲＢＦの精製ＡおよびＢ、粗製の（レーン１〜４）または精製した（レーン５〜８）ｒＶＶ− 発現ｈＲＡＲ−γ、粗製の（レーン９〜１２）または精製した（レーン１３〜１６）ｒＢＶ−発現ｈ　Ｒ，Ａ　Ｒ−γインビトロ翻訳レセプター（レーン２０〜２３）および細菌発現ｈＲＡＲ−γ（レーン２４〜２７）を含有するインキュベーションに増加量のヒーラＮＥ　（０，１，５，３および６ｍｇのタンパク質）を加えたゲル遅滞（ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）アッセイ。矢印はヒーラおよび５ｆ９−細胞特異的複合体の位置を示す。ｈＲＡＲ−γ不在下でのヒーラ核抽出物の２つの独立した調製物の結合をレーン１７〜１９および２８〜３０に示す。

Ｃ表示のように、ヒーラ（３μｇのタンパク質）、５ｆ９（５μｇ）およびドロソフィリア５２（５μｇ）細胞から調製した抽出物とともに細菌発現ｈＲＡＲ− γ（１０フィコモル）をインキュベートしたゲル遅滞アッセイ。レーン５〜７はｈＲＡＲ−γの不在下でのこれら抽出物の結合を示す。

Ｄ、　ヒーラ細胞ＲＢＦ精製の各工程を表す銀染色ケル。各レーンに負荷したタンパク質の量（ｌ１ｇにて）は　ＷＣＥ、１．５　；　ＤＥＡＥ　ＦＴ、１．１　；ＨＥＰ−ＵＧ、２　：フェニル−５ルｗ、５　：ＨＥＰ−ＴＳＫ、１．３およびＨＡＰ−ＴＳＫ、０．０５　（推定）。分子量櫟準（バイオラド）の移動を示す。

Ｅ　ヒーラ細胞ＲＢＦ精製の各工程を表すゲル遅滞アッセイ。ヒーラＮＥ（４μ ｇのタンパク質）を陽性コントロールとして含めた（レーン２）。各レーンに用いたヒーラ細胞タンパク質の量（μｇにて）は＋ＷＣＥ、１０：ＤＥＡＥＦＴ、０．５　；　ＨＥＰ−ＵＧ、　０．１８　；フェニル−５ＰＷ、０．１２；１４ＥＰ−ＴＳＫ、、０．０３およびＨＡＰ−ＴＳＫ　Ｏ，００１（推定）。レーンには、各精製工程からの記載した量のタンパク質、および図示しである場合には１０フィコモルの細菌−発現ｈＲＡＲ−γが含まれる。

茎２　ｍＲＸＲ−α、−βおよび−γとのｈＲＸＲ−βのアミノ酸整列アミノ酸の同一性を星印（すべてのＲＸＲｓの間の同一性について）および／または点（ヒトおよびマウスのＲＸＲ−βの同一性について）で示す。他の核レセプターとの相同性に基づき、ＤＮＡ　（領域Ｃ）およびリガンド結合（領域Ｅ）ドメインを示す。精製ヒーラ細胞ＲＢＦのトリプシン消化により得られた７つのアミノ酸配列を斜線を入れた囲みにより示す。ｐ２４およびｐ２７上の白三角の矢印は、ＰＣＲプライマーを導き出したアミノ酸を示す（本文参照）。ｐ２５およびｐ２８は、得られたペプチドの中でＲＸＲファミリーの成員間を識別し得る唯一のペプチドであることに注意すべきである。ｍＲＸＲ−α、−βおよび−γおよびｈＲＸＲ−βのヌクレオチド配列についてのＥＭＢＬデータバンクのアクセス番号は、それぞれ・・・聾１　クローニングＲＸＲｓはβ−ＲＡＲＥへのｈＲＡＲｓの結合を刺激するＡ、約１０フイコモルの細菌−発現ｈＲＡＲ−γを、図示しであるように、等モル量のインヒドロ翻訳したｍ　ＲＸ　ＲＳの不在下（レーン１）または存在下でβ −ＲＡＲＥとともにインキュベートした。コントロールとしてｍＲＸＲｓ　（２ μｌ）を含有するものに対応するウサギ網状赤血球（ＲＲＬ）の所定容量もｈＲＡＲ−γと混合した（レーン５）。ｈＲＡＲ−γの不在下でのＲＸＲｓおよびＲＰＬのβ−ＲＡＲＥへの結合をレーン６〜９に示ス。

Ｂ、　ＲＡＲｓ　（〜１０フィコモルの各レセプター）をインビトロ翻訳により調製し、ヒーラ核抽出物（３μｇのタンパク質）かまたはｍＲＸＲ−α（〜１０フィコモル、インビトロ翻訳）の不在下または存在下でβ−ＲＡＲＥとともにインキュベートした。コントロールレーン１０〜１２は、ＲＡＲｓの不在下での、それぞれヒーラＮＥＳｍＲＸＲ−αおよびＲＲＬをβ−ＲＡＲＥとともにインキュベートしたものに対応する。

ニワトリＴＲα１の結合Ａ、　β−ＲＡＲＥおよびＴＲＥｐａｌプローブへの単離ＲＡＲおよびＲＸＲの結合。レーン１〜９および１０〜１８（β−ＲＡＲＥ結合）は同じゲルに由来する。しかしながら、後者のレーンは弱い複合体を可視化するために一層長Ｌ１期間暴露しである。同様に、レーン１９〜２６および２７〜３４（ＴＲＥｐａｌ結合）は、後者のレーンを同様の目的で一層長（暴露した他は同一である。図示しであるように、部分精製した（ＤＥＡＥ　ＦＴ、２μｇ）または精製した（ＨＡＰ−ＴＳＫ、ｌｎｇ）ヒーラ細胞ＲＢＦＳｍＲＸＲ−ａ　（〜１０フィコモルインビトロ翻訳）　、ｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）（〜１０フィコモルインビトロ翻訳）および細菌−発現ｈＲＡＲ−γ（〜１０フィコモル）をβ−ＲＡＲＥ　（このプローブの上部鎮の配列を示す）とともにインキュベートした。特異的抗体の存在下ではｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）（レーン６および１５）およびｈＲ，ＡＲ−７（レーン９および１８）のスーパーシフトした（ｓｕｐｅｒｓｈｉｆｔｅｄ）複合体が観察されたが、一方、非特異的な抗体（ＡＢ４γ、レーン５および１４）を用いた場合はｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）複合体はスーパーソフトしなかった。レーン１９〜３４は試料の内容物に関してレーン１〜］８と正確に対応するが、前者のレーンはＴＲＥｐａｌ　（このプローブの上部鎖の配列を示す）への結合に対応する。矢印は特異的複合体を示す。

Ｂ、　ＲＸＲとＲＡＲかまたはＣ−ｅｒｂＡとのβ−ＲＡＲＥおよびＴＲＥｐａｌプローブへの協力的結合。これらゲルの暴露時間は上記Ａにおけるレーン１〜９および１９〜２６のものと同一であることに注意すべきである。レーン１〜９は、図示するように、β−ＲＡＲＥ単独（レーン１）またはヒーラ細胞ＲＯＦのＤＥＡＥ　ＦＴまたはＨＡＰ−ＴＳＫ調製物、（−ｅｒｂＡ（インビトロ翻訳した〜１０フィコモル）、ｍＲＸＲ−ａ、ｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）またはＲＲＬの存在下での細菌−発現ｈＲＡＲ−γ（〜１０フィコモル）結合を示す。ｈＲＡＲ− γ／ｍＲＸＲαＥＲ（Ｆ）／β−ＲＡＲＥ複合体（レーン６）は、Ａｂ４７（レーン７）およびＡｂＦ３　（レーン８）の両方によりスーツく一ンフトした。レーン１０〜１７は、図示するように、β−ＲＡＲＥ単独（レーン１０）またはヒーラ細胞ＲＢＦのＤＥＡＥ　ＦＴ＊た１ｔＨＡＰ−ＴＳＫｔｌｌ製物、ｈＲＡＲ −ｒ、！ｎＲＸＲ−ａ、ｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）またはＲＲＬの存在下でのｃ−ｅｒｂＡ（〜１０フィコモル、インビトロ翻訳）結合を示す。ｃ−ｅｒｂＡ／ｍＲＸＲαＥＲ（Ｆ）／β−ＲＡＲＥスーパーシフト複合体は、ＡｂＦ３の添加で観察された（レーン１６）。レーン１８〜３４はレーン１〜１７に正確に対応するが、前者のレーンはＴＲＥｐａｌへの協力的結合相互作用を表す。量またはレセプターは上記Ａに示したものと同じであった。

９５　ＲＡＲおよびＲＸＲの化学的架橋および同時免疫沈降Ａ、　図示するように、［”Ｓ］　ｈＲＡＲ−γ（〜５０フィコモル）を等モル量の非標識ｈＲＡＲ −γまたはｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）とともにインキュベートした。インキュベーションは、図示するように、５００フィコモルのβ−ＲＡＲＥｗｔおよびＤＳＳ　（最終濃度１ｍＭ）の不在下または存在下で行った。上の矢印はレーン３．５．７および９で観察された架橋生成物を示し、下の矢印は［３５Ｓ］　ｈＲＡＲ− γモノマーに対応する。レーン１は［”Ｓ］　ｈＲＡＲ−γの移動についての参照レーンである。

Ｂ　工程Ｂは、標識レセプターが［”Ｓ］　ｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）である他は工程Ａと同じである。架橋複合体および［”Ｓ］　ｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）モノマーをそれぞれ上および下の矢印で示す。非標識レセプター、β−ＲＡＲＥ、ＤＳＳおよび沈降抗体は示すとおりである。レーン１は［”Ｓ］　ｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）の移動についての参照レーンである。

図６　各タンパク質の欠失および変異分析によるＲＡＲ／ＲＸＲ相互作用の特徴付けＡ　β−ＲＡＲＥへのｈＲＡＲ−γ変異体のＤＮＡ結合。ｈＲＡＲ−γ変異体をインビトロで翻訳しくＲＲＬを使用）、翻訳されたタンパク質の量を記載するようにして（実験手順を参照）標準化した（〜１０フィコモル／アッセイ）。

図示するように、等モル量のｍＲＸＲ−αの存在下または不在下でゲル遅滞アッセイを行った。オートラジオグラフィーの後、特異的複合体を切り出し、シンチレーションカウンターでカウントして各変異体による複合体生成の程度を定量した。図示しであるのは、これら変異体の模式図およびｈＲＡＲ−７ｗｔとの比較における対応活性である。

Ｂ、　β−ＲＡＲＥへのｍＲＸＲ−α変異体の結合を同様にしてアッセイした。

ｍＲＸＲ−α変異体をインビトロ翻訳し、等モル量（〜１０フィコモル）の細菌 −発現ｈＲＡＲ−７の存在下または不在下でゲル遅滞アッセイを行った。この実験を工程Ａの記載と同様にして定量化した。一つの変異体であるｍＲＸＲ−αΔ ４４９−４６６のＤＮＡ結合特性はゲル中に示していないが、この変異体およびｈＲＡＲ−γの存在下で生成した複合体はｍＲＸＲ−αまたはｍＲＸＲαΔ４５５−４６６のものと識別できなかったことに注意すべきである。

図７　異なる繰り返し間スペースの直行繰り返し上でのＲＡＲ／ＲＸＲ複合体生成の比較１０フィコモルの細菌−発現ｈＲＡＲ−γ、インビトロ翻訳ｈＲＡＲγ−ΔＣ４、ｍＲＸＲ−αｗｔまたはｍＲＸＲ−ａΔＣ４を、図示するように、β−ＲＡＲＥ（レーン１〜８）またはβ−ＲＡＲＥＩ　（レーン９〜１６）プローブとともに種々の組み合わせでインキュベートした（それぞれの繰り返しモチーフを示す）。

右側のパネルは、暴露を少なくしたレーン１〜３を示す。他の存在するバンドは、非特異的な大腸菌またはＲＲＬタンパク質によるものである（データは示していｍＲＸＲ−（ｘ　（レーン５〜１２）または親発現ベクター（ｐＳＧ５、レーン１〜４）でトランスフェクションした細胞から調製したＣＯＳ細胞ＷＣＨのアリコート（１０μｇのタンパク質）を、図示するように、抗〜ＲＡＲモノクローナル抗体Ａｂ９α、Ａｂ７βおよびＡｂ４γの存在下または不在下でβ−ＲＡＲＥとともにインキュベートしたゲル遅滞アッセイ。上および下の矢印は、それぞれスーパーシフトしたおよびスーパーシフトしていない複合体の位置を示す。

阻　選択された核レセプターのダイマー生成能で示されるサブドメインのアミノ酸配列整列（ホモ）ダイマー生成に不可欠のマウスニストロジエンレセプター（ＭＥＲ）の領域（ファウエル（Ｆ　ａｗｅｌｌ）ら、Ｃｅ１ｌ　６０　：　９５３〜９６２、星印は変異したときにレセプターのホモダイマー生成能を破壊する残基を示す）。斜線の囲みに囲まれた残基は、フォーマン（Ｆ　ｏｒｍａｎ）ら、Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　４　：　１２９３〜１３０１　（１９９０）により提唱されるヘブタド繰り返し９　（ｈｅｐｔａｄｒｅｐｅａｔ　９）に対応する。ｍＲＸＲ−ａ、ｕｓｐおよびＥ７５Ａの場合には、他のヘブタド（下線を引いである）繰り返しが可能である。プロリン残基（この領域に柔軟性を付与すると思われる）も示しである。図示しである配列は、下記文献からのものである：ｍＥＲ（ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら、Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　１　＋７３５〜７４４　（１９８７））（ファウエルら、Ｃｅ１ｌ　６０　：　９５３ −９６２　（１９９０）も参！Ｑ）；ＲＡＲ−７、クルスト（Ｋｒｕｓｔ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳ＾８６　：　５３１０〜５３１４　（１９８９）；　ｃＴＲ−ａｌ、サップ（Ｓａｐ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４　：　６３５〜６４０　（１９８８）；　ｈＶＤＲ，ベーク−（Ｂ　ａｋｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ８５　：　３２９４〜３２９８　（１９８８）；　ＥｃＲ，ケレ（Ｋｏｅｌｌｅ）ら、Ｃｅ１ｌ　６７：５９〜７７　（１９９１）；ｍＲＸＲ−α、時車レポート：ｕｓｐ、オＯ（Ｏｒｏ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４７：２９８〜３０１　（１９９０）；Ｅ７５Ａ、セグレープ（Ｓ　ｅｇｒａｖｅ）ら、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖ、　４　：　２０４〜２１９（１９９０）：ｓｖｐ、ムロドジク（Ｍｌｏｄｚｉｋ）ら、Ｃｅ１ｌ　６０　：　２１１〜２２４　（１９９０）；　ｒＮＧＦｌ−Ｂ、ミルプラント（Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ）　、Ｎｅｕｒｏｎ　１　＋１８３〜１８８　（１９８８）：ｈｅａｒ−１、ミャジｖ　（Ｍｉｙａｊｉｍａ）ら、Ｃｅ１１５７：３１〜３９　（１９８９）。

るａ、キメラＲＡＲａ１−ＥＲ，ＣＡＳおよびＲＸＲａ−ＥＲ（Ｃ）レセプターおよびその末端欠失誘導体の模式図。数字はアミノ酸の位置を示す。これらキメラレセプターはヒトＥＲのＤＢＤ　（斜線の囲み）を含み、２μ−由来酵母マルチコピープラスミドＹＥｐｌＯおよびＹＥｐ９０　（ビニラット（Ｐｉｅｒｒａｔ、　Ｂ、）ら、Ｇｅｎｅ　１１９　：　２３７〜２４５　（１９９２））中、構成酵母ＰＧＫ　（ホスホグリセレートキナーゼ）遺伝子プロモーターから発現させた。ｂ、全トランスレチノイン酸（Ｔ−ＲＡ）および９−シスレチノイン酸（９Ｃ−ＲＡ）に対するＲＡＲα１−ＥＲ，ＣＡＳおよびＲＸＲａ−ＥＲ（Ｃ）の用量応答。キメラレセプターＲＡＲα１−ＥＲ，ＣＡＳおよびＲＸＲａ−ＥＲ（Ｃ）をレポーター株（ＰＬ３）（染色体中に組み込まれた３ＥＲＥ−ＵＲＡ３レポーター遺伝子を含有（ビニラットら、Ｇｅｎｅ　１１９：２３７〜２４５　（１９９２）））中、図示した濃度のＴ−ＲＡまたは９Ｃ−ＲＡの存在下で発現させた。レポーター遺伝子の転写はＵＲＡ３遺伝子遺伝子産物０カＰデカーゼチジン−５°−モノホスフエートデカルボキシラーゼ）の比活性を測定することにより決定し、リガンド不在下で観察されるＯＭＰデカーゼ活性レベルに対する倍誘発（ｆｏｌｄ　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ）として示す。Ｃ１レチノイン酸誘導体は、ＲＡＲα１−ＥＲ，ＣＡＳおよびＲＸＲａ−ＥＲ（Ｃ）によるトランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）を差別的に誘発する。下記リガンドの存在下でのＲＡＲα１−ＥＲ，ＣＡＳまたはＲＸＲａ−ＥＲ（Ｃ）を発現する酵母株ＰＬ３中でのレポーター活性の誘発、ＴＲＡ、９Ｃ−ＲＡ、Ｔ−ｄｄＲＡ　（全トランス３，４−ジデヒドロレチノイン酸）、９Ｃ−ｄｄＲＡ　（９−シス３．４ −ジデヒドロレチノイン酸）。リガンドの最終濃度は１０”’Ｍであった。レポーター遺伝子のトランス活性化レベルは、ＯＭＰデカーゼ活性の単位（トランスフオームした基質のナノモル／分／ｍｇタン／（り質）として示しである。

里１１　ＲＡＲαおよびＲＸＲａは協力して酵母中のＲＡＲＥレポーター遺伝子を活性化するａ、　トランス活性化実験に用いたＤＲ５−ＵＲＡ３レポーターのプロモーター領域の模式図。基本転写および活性化転写の両方に必要なＵＲＡ３プロモーター配列を欠失させ、ＲＡＲＥ配列で置換した。この要素は、５つの塩基対で分離されたモチーフ５°−ＡＧＧＴＣＡ−３°の直行繰り返しくＤＲ５；その配列を示しである）よりなる。ＡＴＧ開始コドン（＋１）との関係におけるＤＲ５およびＴＡＴＡボックスの位置も示してあり、曲がった矢印はＵＲＡ３ｍＲＮＡの転写の開始のおよその部位を示す。レポーター遺伝子は、酵母株ＹＰＨ２５０中、動原体（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ）プラスミド上で維持された。ｂ、　ＲＸＲａはＤＲ５要素上、酵母中でＲＡＲα活性を促進する。ＤＲ５−ＵＲＡ３レポータープラスミドおよびＲＡＲα、ＲＡＲαｄｎΔＡＢＳＲＸＲａ、ＲＸＲαｄｎΔＡＢを図示した組み合わせで発現するマルチコピープラスミド（図１０参照）、または親ベクター（コントロール）、を含有するトランスフォーマントの抽出物中、リガンド（Ｔ−ＲＡまたは９Ｃ−ＲＡ＋最終濃度５Ｘ１０−’Ｍ）の存在下または不在下で測定したＯＭＰデカーゼ活性。ＲＡＲαｄｎΔＡＢおよびＲＸＲα ｄｎΔＡＢにおいて、Ａ／Ｂ領域およびＲＡＲαおよびＲＸＲａのＣ−末端の一部をそれぞれ欠失させたところ、転写的に不活性な変異誘導体が得られた（データは示していない）。示した平均値および標準偏差は、各クローンについて３つの別々のトランスフォーマントを用いた少なくとも２つの実験によるものである。Ｃ９９Ｃ−ＲＡはＤＲ５−レポーター遺伝子上、酵母中でＲＸＲα活性を誘発する。

ＤＲ５−ＵＲＡ３レポータープラスミドを含有し、図示するようにＲＡＲαとＲＸＲａまたはＲＸＲａｄｎを共発現するトランスフォーマントにおけるＴ−ＲＡおよび９Ｃ−ＲＡへの用量応答。ＲＸＲａｄｎは哺乳動物細胞において優性な陰性レセプターであり、Ｃ−末端欠失を含む（デュランド（Ｄ　ｕｒａｎｄ、　Ｂ　、　）ら、Ｃｅ１ｌ　７１　：　７３〜８５　（１９９２））。トランス活性化は、リガンドの不在下で得られる値に対するレポーター活性の倍誘発で示す。

図１２　酵母中で産生されるＲＡＲαおよびＲＸＲαはインビトロでのＲＡＲＥへのＤＮＡ結合について協力する標識ＤＲ５プローブ（その配列を図の下に示す）およびレセプターなしくレーン１）、ｍＲＸＲａ　（７ウスＲＸＲａレセプター）（レーン３）　、ｈＲＡＲａ（ヒトＲＡＲαルセブター）（レーン５）　、ｈＲＡＲａおよびｍＲＸＲａ（レーン７）　、ｈＲＡＲａおよびｍＲＸＲａｄｎ　（ｖウスＲＸＲαｄｎレセプター）（レーン９）を発現する酵母トランスフォーマントから調製した細胞遊離抽出物を用いてゲル遅滞アッセイを行った。結合の特異性は、ＲＡＲα−特異的モツクローナル抗体Ａｂ９α（レイド（Ｌｅｉｄ、Ｍ、）ら、Ｃｅ１ｌ　６８　：　３７７〜３９５　（１９９２））を用いてスーパーシフトした遅滞複合体により確認された。レーン２．４．６．８および１０にはそれぞれレーン１．３．５．７および８と同一の試料が含まれるが、電気泳動をする直前に抗体とともに試料をインキュベートした。

矢印は特異的なスーパーシフトした複合体を示す。

発明の詳細な記載本発明は、ＲＸＲレセプターファミリーの成員をコードするＤＮＡ配列の単離に一部基づいている。

本発明は、さらに、３つのタイプの核レセプターであるＲＡＲ，ＲＸＲおよびＴＲ（ＤＮＡ応答要素にホモダイマーとして結合すると思われていた）が生理学的条件において実際にヘテロダイマーを生成するという新規観察に基づいている。

かくして生成されたヘテロダイマーは、それぞれのホモダイマーに比べてはるかに高い効率てＲＥに結合することができる。

これら観察に基づき、本発明は、これまで未知であったＤＮＡ配列並びにヘテロダイマータンパク質を提供する。

本発明は、ｍＲＸＲ−βの１つのイソ形（配列番号１）　、ｈＲＸＲ−βの３つのイソ形（配列番号３．５および７）　、ｍＲＸＲ−αの１つのイソ形（配列番号８）、およびｍＲＸＲ−γの１つのイソ形（配列番号１０）をコードするＤＮＡ配列を開示する。当該技術分野で公知の手順、たとえばアンカー（ａｎｃｈｏｒｅｄ）　ＰＣＲやサザーンブロッティングなどとともにこれら配列またはその断片をプローブとして用い、相同なＲＸＲレセプターをコードするＤＮＡ配列を他の生物から単離すること、並びに他のサブタイプのＲＸＲ，およびＲＸＲの種々のサブタイプの他のイソタイプを単離することがいまや可能である。

本明細書においてＲＸＲの「サブタイプ」は、該レセプターのＡ、Ｂおよび／またはＤ領域内に存在するサブタイプ特異的配列により同定する。特定のＲＸＲファミリーの所定の生物からのすべてのイソタイプ、たとえばヒトＲＸＲ−βのすべてのイソタイプは、これら領域内のサブタイプを定める保存された配列を有する。

本明細書においてＲＸＲレセプターの特定のサブタイプの「イソ形」は、ＲＸＲレセプターのＡ領域中に存在する配列不均一により同定する。所定の生物からのＲＸＲレセプターの種々のイソ形は異なるＡ領域配列を有するであろう。

たとえば、当業者であれば、配列番号１０（ＲＸＲのマウスＲＸＲ−γ特異的領域をコードする）のＡ、Ｂおよび／またはＤ領域を用いてサルＲＸＲ−γ配列を単離し、またはこの配列のＢおよび／またはＤ領域を用いてマウス（または他のいかなる生物）ＲＸＲ−γの他のイソ形を単離することができる。

本発明はさらに、上記配列でトランスフオームした細胞または生物を包含する。

当業者であれば、上記配列で原核生物（大腸菌およびバシラス・サチリスなど）並びに真核生物（ヒト細胞、昆虫細胞および酵母など）を容易にトランスフオームすることができる。

本発明はさらに、２つの同一でないサブユニットからなるヘテロダイマータンパク質を開示する。これらサブユニットの一つはＲＡＲまたはＴＲであり、他方のサブユニットはＲＸＲである。

本発明のへテロダイマータンパク質の例示としては、第一のサブユニットがＲＡＲ−α、ＲＡＲ−β、ＲＡＲ−γ、ＴＲ−αまたはＴＲ−βレセプターファミリーのイソタイプよりなる群から選ばれたＲＡＲであり、第二のサブユニットがＲＸＲ−α、ＲＸＲ−β、またはＲＸＲ−７レセブターフアミリーのイソタイプよりなる群から選ばれたＲＸＲであるタンパク質が挙げられるが、これらに限られるものではない。

本発明のへテロダイマーの例示としては、ＲＡＲ−α１、ＲＡＲ−α２、ＲＡＲ −α３、ＲＡＲ−α４、ＲＡＲ−α５、ＲＡＲ−α６、ＲＡＲ−α７、ＲＡＲ− β１、ＲＡＲ−β２、Ｒ，ＡＲ−β３、ＲＡＲ−β４、ＲＡＲ−γ１、ＲＡＲ− γ２、ＲＡＲ−γ３、ＲＡＲ−γ４、ＲＡＲ−γ５、ＲＡＲ−γ６、ＲＡＲ−γ ７、ＴＲ−α１、ＴＲ−α２、ＴＲ−β１、ＴＲ−β２よりなる群から選ばれた一つのサブユニット、およびｍＲＸＲ−α（配列番号９）　、ｈＲＸＲ−β１（配列番号４）　、ｈＲＸＲ−β２（配列番号６）　、ｈＲＸＲ−β３、ｍＲＸＲ −β（配列番号２）、またはｍＲＸＲ−γ（配列番号１１）よりなる群から選ばれた他のサブユニットからなるタンパク質が挙げられるが、これらに限られるものではない。

本発明はさらに、ＲＸＲの高度精製サブタイプおよびイソ形を提供する。本明細書において、あるタンパク質が該タンパク質を含む全細胞抽出物（ＷＣＥ）中で認められる比活性に比べて大きな比活性を有する場合に該タンパク質は高度精製されているという。たとえば、ヒーラ細胞のＷＣＥで一般に観察される比活性は１．５６ｃｐｍ／μｇである（たとえば、アッセイ条件のための実施例を参照）。

ＲＸＲの高度精製形は、約１４６１〜７，７５０．ＯＯＯｃｐｍ／μｇの比活性を有する。本発明の種々の高度精ＩＲＸＲのアミノ酸配列の例を配列番号２（ｍＲＸＲ−β）、配列番号４　（ｈＲＸＲ−β１）、配列番号６　（ｈＲＸＲ−β ２）、配列番号９　（ｍＲＸＲ−α）、および配列番号１１（ｍＲＸＲ−γ）に示す。

いかなる真核生物も、該採取源生物が天然にそのようなサブユニットを含有している限り、ヘテロダイマーサブユニット、またはそれをコードする遺伝子の採取源として用いることができる。本明細書において、「採取源生物」とは、該生物中で該サブユニットが発現されているかどうかまたは最終的に該生物から該サブユニ、トが単離されるかどうかとは無関係に、該サブユニットのアミノ酸またはＤＮＡ配列が由来する元の生物をいう。たとえば、そのアミノ酸配列がヒトＲＸＲ−α１のアミノ酸である限り、酵母中で発現したＲＸＲ−α１の「採取源生物」はヒトであるということができる。最も好ましい採取源生物は、ヒト、マウス、およびニワトリである。

本発明のヘテロダイマータンパク質のサブユニットを得るために、当該技術分野で公知の種々の方法を利用することができる。一つの態様において、所定のサブユニットを産生ずる組織または細胞からサブユニットを精製する。当業者であれば、所望のサブユニットを得るためにタンパク質を単離するための公知の方法に容易に従うことができる。これらの例としては、イムノクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ，サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限られるものではない。

詳しくは、ＲＸＲは、（ａ）約５０ｍＭからのＫＣＩを含有する緩衝液の存在下、ＲＸＲタンパク賃を含有する試料をＤＥＡＥクロマトグラフィーカラムと接触させ；（ｂ）カラムからのフラクションによる流れ中のＲＸＲを回収し：（Ｃ）フラクション（ｂ）による該流れをＨＥＰ−ＵＧカラムと接触させ：（ｄ）約２９０ｍＭからのＫＣＩを用い、カラムからＲＸＲを溶出し；（ｅ）該ＫＣＩ溶出したＲＸＲ（ｄ）をフェニル−５ＰＷカラムと接触させ。

（ｆ）約２５０ｍＭからの硫酸アンモニウムを用い、カラムからＲＸＲを溶出しくｇ）該硫酸アンモニウム溶出ＲＸＲ（ｆ）をＨＥＰ−ＴＳＫカラムと接触させ（ｈ）約２５０ｍＭからのＫＣＩを用い、カラムからＲＸＲを溶出し。

（１）該ＫＣＩ溶出ＲＸＲ（ｈ）をＨＡＰ−ＴＳＫカラムと接触させ：ついで（Ｄ約１５０ｍＭからのリン酸カリウムを用い、カラムからＲＸＲを溶出することにより精製する。

当業者であれば、上記精製手順を採用して、容易に幾つかの精製工程を省きまたは他の精製工程を組み込むことができる。

他の態様において、所望のサブユニットを発現するように変えた細胞からサブユニットを精製する。

本明細書において、遺伝子工学により、ある細胞が通常は産生じないかまたは通常は低レベルでしか産生しないタンパク質を産生ずるようにした場合に、該細胞は「所望のサブユニットを発現するように変えた」といわれる。当業者であれば、所望のサブユニットを産生ずる細胞を生成するために、真核または原核のいずれかの細胞中にゲノムまたはｃＤＮＡ配列のいずれかを導入または発現させるための手順を容易に採用することができる。

ルバート（Ｒｕｂｅｒｔｅ）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１１１　：　４５〜６０　（１９９１）、ンヤンボン（Ｃｈａｍｂｏｎ）ら、５ｅｓｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｄｅｖ、Ｂｉｏｌ、　２　：１５３〜１５９　（１９９１）、ケレら、Ｃｅ１ｌ　６７　：　５９〜７７　（１９９１）　、マンゲルスドルフら、Ｃｅ１ｌ　６６：５５５〜５６１　（１９９０）、ハマダら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８６　：　８２８９〜８２９３　（１９８９）　、オロら、Ｎａｔｕｒｅ　３４７　：　２９８〜３０１　（１９９０）に記載されている配列などのようなりＮＡ配列が同定されているサブユニットを含む、所望のサブユニットをコードするＤＮＡのための種々の採取源生物が存在する。

別法として、ＲＡＲ，ＲＸＲｌおよびＴＲの種々の識別されるサブタイプおよびイソ形にハイブリダイズすることのできるプローブを入手できるので、日常的なハイブリダイゼーションおよびこれらレセプターを有する宿主からの選択により、所望のサブユニットをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。

ＤＮＡなどの核酸分子は、それが転写および翻訳制御情報を含むヌクレオチド配列を含み、そのような配列がポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「機能的に連結されているｊ場合に該ポリペプチドを「発現することができる」といわれる。機能的連結とは、これら制御ＤＮＡ配列および発現しようとするＤＮＡ配列とが遺伝子配列発現を可能とするような仕方で結合された連結をいう。遺伝子配列発現に必要とされる制御領域の正確な特性は生物によって異なるが、一般に、プロモーター領域を含み、該領域には原核生物においてプロモーター（ＲＮＡ転写の開始を指令する）並びにＲＮＡに転写される場合にＲＸＲ合成の開始をシグナルするであろうＤＮＡ配列が含まれる。そのような領域には、通常、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などのような、転写および翻訳の開始に関与する５゛−非コード配列が含まれるであろう。

所望なら、ＲＸＲをコードする遺伝子配列の３′非コード領域を上記方法により得ることができる。この領域は、終止およびポリアデニル化などのような、その転写終止制御配列のために保持してよい。それゆえ、ＲＸＲをコードするＤＮＡ配列に天然に隣接する３°−領域を保持することにより、転写終止シグナルを得ることができる。転写終止シグナルが発現宿生細胞において充分に機能的でない場合には、該宿主細胞において機能的な３゛領域を置換することができる。

２つのＤＮＡ配列（プロモーター領域配列とＲＸＲコード配列など）は、これら２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が（１）フレームシフト変異を誘発しない、（２）プロモーター領域がＲＸＲ遺伝子配列の転写を指令する能力を妨害しない、または（３）ＲＸＲ遺伝子配列がプロモーター領域配列により転写される能力を妨害しない場合に、機能的に連結されているといわれる。それゆえ、あるプロモーターがあるＤＮＡ配列の転写を起こすことができる場合に、該プロモーター領域は該ＤＮＡ配列に機能的に連結されているであろう。

それゆえ、ＲＸＲを発現するには、適当な宿主によって認識される転写および翻訳シグナルが必要である。

本発明は、原核または真核細胞のいずれかにおけるＲＸＲタンパク質（またはその機能的誘導体）の発現を包含する。好ましい原核宿主としては、大腸菌、バシラス、ストレプトマイセス、ンユードモナス、サルモネラ、セラチアなどの細　 ”菌が挙げられる。最も好ましい原核宿主は大腸菌である。特定の興味における細菌宿主としては、大腸菌に１２株２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６）　、大腸菌Ｘ１７７６　（ＡＴＣＣ３１５３７）　、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、ラムグー、原栄養性（ＡＴＣＣ２７３２５）　）、およびサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）やサルモネラ−？ルセツセンス（Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａ■ａｒｃｅｓｃｅｎｓ）　、および種々のシュニドモナス種などの他の腸内細菌力く挙ζｆられる。

そのような条件下ではＲＸＲは糖付加されないであろう。原核宿主は、発現プラスミド中のレプリコンおよびコントロール配列と両立するものでなけれ：ｆならない。

原核細胞（たとえば、大腸菌、バシラス・サチリス、シュードモナス、ストレプトマイセスなど）中でＲＸＲ（またはその機能的誘導体）を発現す引こ（よ、ＲＸＲコード配列を機能的な原核プロモーターに機能的に連結する必要がある。そのようなプロモーターは、構成的であるか、または一層好ましくは制御的である（すなわち、誘発し得るまたは抑制し得る）かいずれであってもよＬｌ。構成的プロモーターの例としては、バクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子配列のｂｌａプロモーター、およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列のＣＡＴ７ ’ロモーターなどが挙げられる。誘発し得る原核プロモーターの例として１ま、ｌくクテリオファージλの主要右および左プロモーター（ＰＬおよびＰＲ）、大腸菌のｔ「ｐ、ｒｅｃＡＳ　１ａｃＺ、ＩａｃＬおよびｇａｌプロモーター、および／くシラス・サチリスのα−アミラーゼ（ウルマネン（Ｕ　１ｍａｎｅｎ、　Ｉ　、　）ら、ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ、１６２　：　１７６〜１８２　（１９８５））およびＣ−２８−特異臼タプロモーター（ギル７　ン（Ｇｉｌｍａｎ、　Ｍ、　Ｚ、　）ら、Ｇｅｎｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　３２：１１〜２０（１９８４））、バシラスのバクテリオファージのプロモーター（グＩＪクザン（Ｇｌｙｃｚａｎ、　Ｔ、　Ｊ　、　）、「バシラスの分子生物学」、アカデミ・ツクブレス、二ニーヨーク（１９８２））、ストレプトマイセスプロモーター（ウオード（Ｗａｒｄ、　Ｊ　、　Ｍ、　）　ら、Ｍｏｌ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、２０３　：　４６８〜４７８　（１９８６））が挙げられる。

原核プロモーターについては、グリツク（Ｃ１ｉｃｋ、　Ｂ、　Ｒ，）　（Ｊ　、　Ｉ　ｎｄ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１　：　２７７〜２８２　（１９８７）　）　；セナチェンポ（Ｃｅｎａｔｉｅｎｐｏ。

Ｙ、）　（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　６８　：　５０５〜５１６　（１９８６）　）　；およびゴッテスマン（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、　Ｓ、）　（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、　１８　：　４１５〜４４２　（１９８４）　）に概観されている。

原核細胞中での適切な発現にはまた、遺伝子配列−コード配列の上流にリポソーム結合部位の存在が必要である。そのようなリポソーム結合部位は、たとえば、ゴールド（Ｇｏｌｄ、　Ｌ、　）ら（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３５　：　３６５〜４０４　（１８８１））により開示されている。

好ましい真核宿主としては、インビボかまたは組織培養のいずれかにおける酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞が挙げられる。宿主として有用な哺乳動物細胞としては、ヒーラ細胞、線維芽由来の細胞（ＶＥＲＯまたはＣＨＯ−Ｋｌなど）、またはリンパ球由来の細胞（ハイブリドーマ５Ｐ２１０−ＡＧ１４＊たハミエローマＰ３ｘ６３Ｓｇ８など）、およびその誘導体が挙げられる。好ましい哺乳動物宿主細胞としては、Ｓ　Ｐ　２１０およびＪ５５８Ｌ、並びに神経芽腫細胞株（１ＭＲ３３２など）（正しい翻訳後プロセシングのための一層良好な能力を与える）が挙げられる。

哺乳動物宿主については、ＲＸＲの発現のために幾つかの可能なベクター系を利用することができる。宿主の性質に応じて、広範囲の転写および翻訳制御配列を用いることができる。転写および翻訳制御シグナルは、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス、シミアンウィルスなどのウィルス源に由来するものであってよく、その場合、これら制御シグナルは高レベルの発現を有する特定の遺伝子配列と関連している。別法として、アクチン、コラーゲン、ミオシンなどの哺乳動物発現産物からのプロモーターを用いることができる。転写開始制御シグナルは、遺伝子配列の発現を調節することができるように、抑制または活性化できるものを選択することができる。温度を変化させることにより発現を抑制または開始できるように温度感受性の制御シグナル、または化学（代謝産物など）制御に付される制御シグナルが興味がもたれる。

酵母は、翻訳後のペプチド修飾をも行うことができるという点で実質的に有利である。酵母中での所望のタンパク質の産生に利用することのできる強プロモーター配列および高コピー数のプラスミドを利用した多くの組換えＤＮＡ法が存在する。酵母は、クローニングした哺乳動物遺伝子配列産物上のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチド（すなわち、プレーペプチド）を分泌する。

グルコースに富む培地中で酵母を増殖させた場合に大量に産生される解糖酵素をコードする活性に発現された遺伝子配列からプロモーターおよび終止要素を組み込んだ一連の酵母遺伝子配列発現系を利用することができる。公知の解糖遺伝子配列はまた、非常に効率的な転写制御シグナルをも提供することができる。たとえば、ホスホグリセレートキナーゼ遺伝子配列のプロモーターおよびターミネータ−シグナルを利用することができる。酵母細胞はＲＡレセプターを含有しないので、酵母がとりわけ好ましい宿主である。

他の好ましい宿主は昆虫細胞、たとえば、ドロソフィラ・ラーベ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｌａｒｖａｅ）である。昆虫細胞を宿主として用い、ドロソフィラアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターを用いることができる。ルピン（Ｒｕｂｉｎ、　Ｇ、　Ｍ、　）、５ｃｉｅｎｃｅ　２４０　：　１４５３〜１４５９　（１９８８）、別の態様として、昆虫細胞中で大量のＲＸＲを発現するようにバクロウィルスベクターを変えることができる（ンヤスニ−（Ｊ　ａｓｎｙ、　Ｂ、　Ｒ，）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３８　：１６５３　（１９８７）：ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｄ、Ｗ、　）ら、遺伝子工学（１９８６）、セットロウ（Ｓ　ｅｔｌ、ｏｖ。

Ｊ、に、）ら編、Ｐｌｅｎｔ＋ｍ、　ＶＯｌ、　８．２７７〜２９７頁）。

上記のように、真核生物宿主中でのＲＸＲの発現には真核制御領域が必要である。そのような領域には、一般に、ＲＮＡ合成の開始を指令するに充分なプロモーター領域が含まれるであろう。好ましい真核プロモーターとしては、マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（ハフ　−（）ｌａｍｅｒ、　Ｄ、　）ら、Ｊ　、　Ｍｏ１．。

Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ、１　：　２７３〜２８８　（１９８２））：ヘルペスウイルスのＴＫブコモーター（マツフナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、Ｓ、）　、Ｃｅ１ｌ　３１　：　３５５〜３６５　Ｃ１９８２））：ＳＶ４０初期プロモーター（ベノイスト（Ｂｅｎｏｉｓｔ、　Ｃ，）ら、Ｎａｔｕｒｅ　（ロンドン）２９０＋３０４〜３１０　（１９８１））；酵母ｇａ１４遺伝子配列プロモーター（ジョンストン（Ｊ　ｏｈｎｓｔｏｎ、　Ｓ　、　Ａ、　）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）７９：６９７１〜６９７５　（１９８５）；シルバー（Ｓｉｌｖｅｒ、　Ｐ、　−４゜）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８１　：　５９５１〜５９５５　（１９８４））が挙げられる。

広く知られているように、真核ｍＲＮＡの翻訳は最初のメチオニンをコードするコドンで開始される。この理由のため、真核プロモーターとＲＸＲ（またはその機能的誘導体）をコードするＤＮＡ配列との間の連結は、メチオニンをコードし得るいかなる介在コドン（すなわち、ＡＵＧ）も含まないことを確認するのが好ましい。そのようなコドンの存在により、融合タンパク質の生成（もし該ＡＵＧコドンがＲＸＲコード配列と同じ読み取り枠にあるなら）またはフレームシフト変異（もし該ＡＵＧコドンがＲＸＲコード配列と同じ読み取り枠にないなら）のいずれかとなる。

ＲＸＲコード配列および機能的に連結したプロモーターは、受容される原核または真核細胞中に、非複製ＤＮＡ　（またはＲＮＡ）分子として（直線分子か、または一層好ましくは閉じた共有結合環状分子のいずれかであってよい）導入される。そのような分子は自律的に複製することができないので、ＲＸＲの発現は導入配列の一時的発現により起こる。別法として、導入配列を宿主染色体中に組み込むことにより、永久的な発現を起こすことができる。

一つの態様において、所望の遺伝子配列を宿主細胞の染色体中に組み込むことのできるベクターを用いる。導入ＤＮＡを自分の染色体中に安定に組み込んだ細胞は、発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能とする１または２以上のマーカーをも導入していることにより選択することができる。マーカーは、独立栄養宿主に対する原栄養、殺生物剤耐性、たとえば抗生物質または重金属（銅など）などを付与する。選択マーカー遺伝子配列は、発現しようとするＤＮＡ遺伝子配列に直接連結させるか、またはコトランスフエクションにより同細胞中に導入することかできる。−末鎖結合タンパク質ｍＲＮＡの最適合成のためには別の要素も必要である。これら要素としては、スプライスシグナル、並びに転写プロモーター、エンハンサ−１および終止シグナルが挙げられる。そのような要素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベクターとしては、オカヤ７　（Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，）　、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、３　：　２８０　（１９８３）に記載されているものが挙げられる。

好ましい態様において、上記導入配列は、受容した細胞で自律的複製のできるプラスミドまたはウィルスベクター中に導入されるであろう。この目的のために、広範囲のベクターのいずれをも用いることができる。特定のプラスミドまたはウィルスベクターを選択するに際して重要な因子としては　該ベクターを含有する受容細胞を認識することができ、該ベクターを含有しない受容細胞から選択できる容易さ：特定宿主で望まれるベクターのコピー数、および異なる種の宿主細胞間でベクターを「シャトル」できることが望まれるか否かが挙げられる。好ましい原核ベクターとしては、大腸菌中で複製できるものなどのプラスミド（たとえば、ｐＢＲ３２２、Ｃｏ　］　Ｅｌ、ｐＳ　Ｃ１，０１、ｐＡｃＹｃ１８４、π ｖＸなど）が挙げられる。そのようなプラスミドは、たとえば、マニアチスら（モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル、コールドスプリングハーバ−プレス、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク（１９８２））により開示されている。バシラスブラスミドとしては、ｐｃ１９４、ｐｃ２２１、ｐＴ１２７などが挙げられる。そのようなプラスミドは、グリクザン（バシラスの分子生物学、アカデミツクプレス、ニューヨーク（１９８２）　、ｐｐ３０７〜３２９）により開示されている。適当なストレプトマイセスプラスミドとしては、ｐＩＪｌｏｌ　（ケンダル（Ｋｅｎｃｔａｌｌ、　Ｋ、　Ｊ　、　）ら、Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９　：　４１．７７〜４１８３　（１，９８７））　、およびφＣ３１（チャタ−（Ｃｈａｔｅｒ、　Ｋ、　Ｆ　、　）ら、アクチノミセタリスの生物学に関する第６回国際シンポンウム、アカデミアイカイト（Ａｋａｄｅｍｉａｉ　Ｋａｉｄｏ）　、ブダペスト、ハンガリー（１９８６）　、ｐｐ４５〜５４）などのストレプトマイセスバクテリオファージが挙げられる。シュードモナスプラスミドは、ジョン（Ｊｏｈｎ、　Ｊ、　Ｆ、）ら（Ｒｅｖ、　Ｉ　ｎｆｅｃｔ、　Ｉ］ｓ、　８　：　６９３〜７０４（１９８６））、およびイザキ（Ｉｚａｋｉ、に、）　（Ｊｐｎ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

３３・７２９〜７４２　（１９７８））により概観されている。

好ましい真核プラスミドとしては、ＢＰＶ、ワクシニア、ＳＶ４０，２−ミクロンサークル（２−ｍｉｃｒｏｎ　ｃｉｒｃｌｅ）など、またはその誘導体が挙げられる。そのようなプラスミドは当該技術分野でよく知られている（ホトスタイン（Ｂｏｔｓｔｅｊｎ、　Ｄ、　）　ら、ＭｉａｍｉＷｎｔｒ、Ｓｙｍｐ、１９　：２６５〜２７４　（１９８２）；ブローチ（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ　、　Ｒ，）　、酵母サツカロミセスの分子生物学：生活環および遺伝、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリングハーバ−、ニューヨーク、ｐ４４５〜４７０　（１９８１）；ブローチ、Ｃｅ１ｌ　２８　＋　２０３〜２０４　（１９８２）：ボロン（Ｂｏｌｌｏｎ、　Ｄ、　Ｐ、）ら、Ｊ　、　Ｃ１１ｎ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　０ｎｔｏ１゜１０：３９〜４８　（１９８０）；７ニアチス、細胞生物学：包括的論文、Ｖｏ１３、遺伝子配列発現、アカデミツクプレス、ニューヨーク、ｐｐ５６３〜６０８（１９８０））。

構築物を含有するベクターまたはＤＮＡ配列が発現のために調製されたら、種々の適当な手段　トランスフォーメーション、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降法、直接マイクロインジェクションなどのいずれによっても該ＤＮＡ構築物を適当な宿主細胞中に導入することができる。ベクターの導入後、受容細胞を選択培地（ベクター含有細胞を増殖させる）中で増殖させる。クローニング遺伝子配列が発現されると、ＲＸＲまたはその断片が産生される。このことはトランスフオームした細胞でそのまま行うことができるし、またはこれら細胞を誘発させて分化させた後に行うこともできる（たとえば、神経芽腫細胞にブロモデオキシウラシルを投与するなどにより）。

ヘテロダイマーの単一のサブユニットを発現するようにまたは該ヘテロダイマーの両サブユニットを発現するように細胞を変えることができる。単一のサブユニットを発現するように細胞を変える場合には、本発明のへテロダイマーは２つの異なるトランスフオームした宿主がら単離した個々のサブユニットを混合することにより生成する。

本発明のヘテロダイマーを生成するため、種々のインキュベーション条件を用いることができる。最も好ましい条件は、生理的条件を模したものである。下記に示す実施例においては、ヘテロダイマーを１５０ｍＭＫＣｌ中で生成させた。

両サブユニットを発現するように細胞を変える場合には、ヘテロダイマーは単一の宿主から精製することができる。

本発明のへテロダイマータンパク質は、抗体の産生のため、医薬組成物の同定における使用のため、およびＤＮＡ／タンパク質相互作用の研究のためなどの種々の手順および方法に用いることができる。

一つの態様において、該ヘテロダイマーに結合することのできる抗体を産生ずるための免疫原として該ヘテロダイマーを用いることができる。この態様の他の側面において、該抗体はさらに該ヘテロダイマーに結合するが個々のサブユニットには結合することができない。

本発明のへテロダイマーのいずれも、抗体またはハイブリドーマを産生ずるために用いることができる。当業者であれば、抗体がｈＲＡＲ−α／ｈＲＸＲ−αに結合することが望まれる場合には、そのようなヘテロダイマーを上記のようにして生成し免疫原として用いることができることを認識することができるであろう。ついで、得られた抗体を該ヘテロダイマーへ結合する能力についてスクリーニングする。加えで、該抗体を個々のサブユニットへ結合する能力についてスクリーニングすることができる。

本発明の抗体には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、並びにこれら抗体の断片、およびヒト化した形態が含まれる。本発明の抗体のヒト化した形態は、キメラ化やＣＤＲ移植などの当該技術分野で公知の方法の一つを用いて生成させることができる。

本発明はまた、上記抗体を生成することのできる／％イブリドーマをも提供する。

ハイブリドーマは、特定のモノクローナル抗体を分泌することのできる不死化した細胞株である。

一般に、抗体およびハイブリドーマを産生させる技術は当該技術分野でよく知られている（キャンプベル（ＣａＩｌｐｂｅｌｌ、　Ａ、Ｍ、）、「モノクローナル抗体法：生化学および分子生物学における実験室技術」、エルセビエ・サイエンス・パブリッシャーズ、アムステルダム、オランダ（１９８４）；セント・グロス（Ｓ　ｔ、　Ｇ　ｒｏｔｈ）ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　３５　：１〜２１　（１９８０）　）。

抗体を産生ずることが知られているいかなる動物（マウス、ウサギなど）をも選択したポリペプチドで免疫することができる。免疫法は当該技術分野でよく知られている。そのような方法としては、ポリペプチドの皮下または腹腔内注射が挙げられる。当業者であれば、免疫に使用するポリペプチドの量を免疫する動物、該ポリペプチドの抗原性および注射の部位に基づいて変わるであろうことを理解するであろう。

ポリペプチドは、ペプチドの抗原性を増大させるために修飾しまたはアジュバント中で投与することができる。ポリペプチドの抗原性を増大させる方法は当該技術分野でよく知られている。そのような方法としては、該抗原に異種タンパク質（グロブリンやβ−ガラクトシダーゼなど）をカップリングすることまたは一免疫を行う間にアジュバントを含有させることが挙げられる。

モノクローナル抗体のためには、免疫した動物から膵臓細胞を取り出し、ＳＰ２１０−Ａｇ１４ミエローマ細胞などのミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞とする。

所望の特性を有する抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞を同定するため、当該技術分野でよく知られた多くの方法のいずれをも用いることができる。これらにはＥＬＩＳＡアッセイ、ウェスタンプロット分析、またはラジオイムノアッセイを用いてハイブリドーマをスクリーニングすることが挙げられる（ルック（Ｌ　ｕｔｚ）ら、Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、１７５　：　１０９〜１２４　（１９８８））。

所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、当該技術分野で公知の方法を用いてクラスおよびサブクラスを決定する（キャンプベル、モノクローナル抗体法・生化学および分子生物学における実験室技術、エルセビエ・サイエンス・パブリッシャーズ、アムステルダム、オランダ（１９８４））。

ポリクローナル抗体のためには、抗体含有抗血清を免疫した動物から単離し、上記方法の一つを用いて所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングする。

本発明の他の態様において、上記抗体を検出可能なように上記抗体を標識する。

抗体は、放射性同位元素、アフィニティー標識（ビオチン、アビジンなど）、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（ＦＩＴＣやローダミンなど）、常磁性原子などを用いて検出可能なように標識することができる。そのような標識を行う手順は当該技術分野でよく知られており、たとえば、スターンバーガー（Ｓ　ｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ、　Ｌ、　Ａ、　）ら、Ｊ　、　Ｈ１ｓｔｏｃｈｅ＋ａ。

Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、１８：３１５　（１９７０）；ベイヤー（Ｂａｙｅｒ、　Ｅ、　Ａ、）　ら、Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍ、６２：３０８　（１９７９）；エングバル（Ｅｎｇｖａｌ、　Ｅ、）ら、Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ。

１０９　：１２９　（１９７２）：ゴーデイング（Ｇｏｄｉｎｇ、　Ｊ　、Ｗ、　）　、Ｊ　、　Ｉ　＋＋＋＋５ｕｎｏｌ。

Ｍｅｔｈ、１３　：２１５　（１９７６）を参照。本発明の標識抗体は、特定のヘテロダイマーを発現する細胞または組織を同定するため、インビトロ、インビボ、およびインソチュアッセイに用いることができる。

本発明の他の態様においては、上記抗体を固相支持体上に固定化する。そのような固相支持体の例としては、ポリカーボネートなどのプラスチック、アガロースおよびセファロースなどの複合カーボネート、アクリル酸樹脂およびポリアクリルアミドおよびラテックスビーズなどが挙げられる。そのような固相支持体に抗体をカップリングする技術は当該技術分野でよく知られている（ウェア（Ｗｅｉｒ。

Ｄ、Ｍ、）ら、「実験免疫学ハンドブック」、第４版、ブラックウエルサイエンティフィックパブリッンヤーズ、オックスフォード、イングランド、１０章（１９８６）；ジ＋：ｌビー（Ｊ　ａｃｏｂｙ、　Ｗ、　Ｄ、　）ら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、　３４アカデミ、ツクブレス、ニューヨーク（１９７４））。本発明の固定化抗体は、インビトロ、インビボ、およびインンチュアッセイ並びにイムノクロマトグラフィーに用いることができる。

本発明の他の態様において、試験試料中の特定へテロダイマーの発現を決定する方法が提供される。

詳しくは、該方法は、試験試料を本発明の抗体の１種または２種以上とインキュベートし、該抗体が試験試料と結合するかどうかを決定することからなる。

抗体を試験試料とともにインキュベートする条件は変わる。インキュベーション条件は、アッセイに使用したフォーマット、使用した検出法、およびアッセイに使用した抗体のタイプおよび性質に依存する。当業者であれば、本発明の抗体を用いるために、一般に利用できる免疫アッセイフォーマット（ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、オフタロニー拡散法、またはロケット免疫蛍光アッセイなど）のいずれをも容易に採用することができることが理解されるであろう。そのようなアッセイの例は、チャード（Ｃｈａｒｄ、　Ｔ、）　、ｒラジオイムノアッセイおよび関連技術入門」、エルセビエサイエンスパブリッシャーズ、アムステルダム、オランダ（１９８６）ニブロック（Ｂｕｌｌｏｃｋ、Ｇ、Ｒ，）ら、「免疫組織化学における技術」、アカデミツクプレス、オーランド、Ｆ　Ｌ　Ｖｏｌ、　１　（１９８２）　、Ｖｏｌ、２　（１９８３）　、Ｖｏｌ、３　（１９８５）；ティシュセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ。

Ｐ、）、［エンザイムイムノアッセイの実際および理論・生化学および分子生物学における実験室技術」、エルセビエサイエンスバブリッンヤーズ、アムステルダム、オランダ（１９８５）に認めることができる。

本発明の試験試料には、細胞、細胞のタンパク質または膜抽出物、または血液、血清、血漿、もしくは尿などの生物学的流体が含まれる。上記方法に使用する試験試料は、アッセイフォーマット、検出方法の特性、およびアッセイしようとする試料として用いる組織、細胞または抽出物により変わるであろう。細胞のタンパク質抽出物または膜抽出物を調製する方法は当該技術分野でよく知られており、使用したシステムに適合する試料を得ることができるよう容易に採用することができる。

本発明の他の態様において、本発明のへテロダイマータンパク質の一つに結合することができる因子を同定する方法が提供される。

詳しくは、該方法は、（ａ）本発明のへテロダイマータンパク質の１種または２種以上に因子を接触させ、ついで（ｂ）該因子が該ヘテロダイマーに結合するかどうかを決定することからなる。

そのようなアッセイを行うに際して、当業者であれば、特定の核レセプターのいかなるイソタイプまたはサブタイプに因子が結合するのか、それゆえ該化合物によりいかなる特定のレセプターが利用されるのかを決定することができるであろう。

上記アッセイにおいてスクリーニングされる因子としては、ペプチド、炭水化物、およびビタミン誘導体が挙げられるが、これらに限られるものではない。該因子は、ランダムに選択およびスクリーニングし、合理的に選択し、またはタンパク質モデル技術を用いて合理的に設計することができる。

ランダムスクリーニングのためには、ペプチド、炭水化物、またはＲＡの誘導体などの因子をランダムに選択し、直接または間接法を用いて本発明のヘテロダイマーの一つに結合する能力についてアッセイする。

別法として、因子を合理的に選択することもできる。本明細書において、因子がヘテロダイマーの公知のりガントの物理構造に基づいて選択される場合に該因子は「合理的に選択される」という。たとえば、レチノール様構造を有する化合物をアッセイすることは、レチノール様化合物が種々のヘテロダイマーに結合するてあろうから合理的選択と考えられる。

いまや高度に精製されたヘテロダイマーを利用することができるので、ヘテロダイマー上に存在するリガント結合部位の構造を同定するためにＸ線結晶解析法およびＮＭＲ造影技術を用いることができる。そのような情報を利用してコンピューターモデルシステムをいまや利用することができ、それにより所望の構造に結合することのできる因子を「合理的に設計する」ことができる（ホジソン（Ｈｏｄｇｓｏｎ）　、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８　：１２４５−１２４７　（１９９０）　、ホジソン、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９　：　６０９〜６１３　（１９９１）　）。

本明細書において、因子がヘテロダイマーのリガンド結合部位のコンピューターモデルに基づいて選択される場合に該因子は「合理的に設計される」といわれる。

上記結合アッセイの一つの態様において、ＲＥとして同定されたＤＮＡのセグメントの存在下で該アッセイを行う。この様式において、ヘテロダイマーのＲＥへの結合を刺激または抑制することのできる因子を同定することができる。そのようなアッセイにおいては、該ＤＮＡが少なくとも一つのＲＥを含有している限り、いかなる長さのＤＮＡをも用いることができる。

池の態様においては、上記アッセイをＲＥの不在下で行う。この様式において、ＤＮＡ結合とは独立にヘテロダイマーに結合する因子を同定することができる。

さらに、上記アッセイは、ＲＥによって制御されるＤＮＡ配列の転写を活性化する因子を同定することができるように修飾することができる。

詳しくは、本発明のＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーの１種または２種以上を発現するように細胞または生物（酵母細胞など）を日常的方法を用いて変える。

一つの応用において、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアシルトランスフェラーゼまたは選択マーカー（ＵＲＡ３など）などのレポーター配列に機能的に連結したＲＥ（ＤＲＩなど）を含むように細胞をさらに変える。ついで因子を該細胞または生物とともにインキュベートし、ついでレポーター配列または選択マーカー活性をアッセイする。上記手順を用いることにより、ＲＡＲ／ＲＸＲ／ＲＥ依存転写を刺激することのできるまたはリガンド誘発転写を抑制することのできる因子を同定することができる。

本発明はさらに、ＲＡ　Ｒ／ＲＸ　Ｒヘテロダイマーが、酵母細胞中で発現された場合に、ＲＡＲＥに機能的に連結された配列の転写をトランス活性化することができることを開示する。実施例２に記載するように、酵母細胞は天然においてはＲＡＲおよびＲＸＲレセプターを含有していない。さらに、はとんどの他の真核細胞生物と異なり、酵母は一般に、異なるクラスのレチノイドを相互変換する酵素を含有していない。たとえば、哺乳動物細胞は全トランスレチノイン酸を９ −シスレチノイン酸に変換する酵素（ＲＡイソメラーゼ活性）を含有するが、酵素は含有しない。とりわけ、キメラＲＸＲ（ＲＸＲ−ＥＲ，ＣＡ）を含有する酵母は９ンスーＲＡの存在下では転写を活性化するが全トランスＲＡの存在下では活性化せず（ヒアリー（Ｈｅｅｒｙ）ら）、哺乳動物細胞由来のＲＮＡから作製したＣＤＮＡ発現ライブラリーとの相補性（ｃｏｍｐｌｅｒＤｅｎｔａｔｉｏｎ）により哺乳動物の全トランス９ンスイソメラーゼをクローニングするのに用いることができる。ＲＡ代謝に関与する他の酵素についても同様に、ポジティブおよびネガティブ選択法を用い、相補性によりクローニングすることができる。それゆえ、ＲＡＲおよびＲＸＲレセプタータンパク質を発現するため、およびＲＡＲ／ＲＸＲ／ＲＡＲ，Ｅ依存転写を調節する因子をさらに研究および同定するためにそのような発現系を用いるために、サツカロミセス・セレヒノエなどの酵母細胞は特に好ましいものである。

一般に、酵母細胞がＲＡＲおよびＲＸＲレセプターのサブタイプまたはイソ形の１種または２種以上を含有または発現し得るように日常的な遺伝子操作を用いて酵母細胞を修飾することにより、トランス活性化の研究に用いる修飾酵母細胞を調製する。たとえば、ＲＡＲα１およびＲＸＲα１を発現するように細胞を修飾する（実施例２参照）。ついで、選択マーカー活性をコードする遺伝子（たとえば原酵母宿主がＵＲＡ３−であるならＵＲＡ３）　、またはアッセイ可能なマーカー活性をコードする遺伝子（たとえば、β−カラクトシダーゼ）をＲＡＲＥ　（たとえば、ＤＲ５配列）の制御下に置く。

ついて、そのような修飾酵母細胞を用い、特定のＲＡＲ／ＲＸＲ／ＲＡＲＥの組み合わせをトランス活性化することのできる因子を同定する。詳しくは、上記修飾酵母細胞をＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーと結合することのできる因子とともにインキュベートし、該ダイマーが結合してＲＡＲＥに連結した配列の転写を活性化する能力を刺激した場合に（トランス活性化）、該細胞はウラシルを含有しない培地中で増殖することができるであろうし、またはマーカー活性を発現として同定することができる。それぞれ異なるＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーを発現しそれぞれ種々のＲＡＲＥに連結した１または２以上の選択マーカーを含有する種々の修飾酵母細胞を生成することにより、ヘテロダイマーイソ形およびサブタイプ特異的並びにＲＡＲＥ特異的な活性化因子を同定することができる。

他の応用において、本明細書に記載する酵母系を、さらに（１）ＲＡＲＥ配列を同定するため、（２）ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーにより制御される転写のアシタゴニストおよびアゴニストを同定するため、（３）レチノイドを相互変換することのできる酵素（すなわち、ＲＡイソメラーゼ活性を有する酵素）をコードする遺伝子を同定およびクローニングするため、および（４）哺乳動物ＲＮＡ由来酵母発現ベクターを用いた相補性によりＲＸＲｓの新規なヘテロダイマーパートナ−をコードする遺伝子を同定およびクローニングするために利用することができる。

詳細には、ＲＡＲＥとして機能するＤＮＡ配列、たとえばＤＲＩ、ＤＲ２およびＤＲ５などの配列を同定するため、１または２以上のＲＡＲ／Ｒ，ＸＲヘテロダイマーを発現するように酵母細胞を修飾する。この細胞を、試験すべきＤＮＡ配列を含有するようにさらに修飾する。ＲＡＲＥ活性のために試験すべき配列を、選択マーカー活性をコードする遺伝子（たとえば、ＵＲ，Ａ−宿主細胞におけるＵＲＡ３）またはアッセイ可能なマーカー活性をコードする遺伝子の５゛側に置く。

ついて、この細胞を、ＲＡＲ／ＲＸＲ依存トランス活性化を活性化することがわかっている因子の存在下でインキュベートする。選択マーカーの上流に置いたＤＮＡ配列がＲＡＲＥ活性を有する細胞は、ウラノルを欠失した選択培地中で増殖することができるであろうし、または該マーカー遺伝子によってコードされたアツセイ可能な活性を発現するであろう。そのような手順は、ランダムにクローニングしたＤＮＡ配列のスクリーニング、ショットガンタイプの方法に利用することができ、または知られたＲＡＲＥの配列に基づいて合理的に設計したＤＮＡ配列を試験するのに用いることができる。

特定のＲＡ　Ｒ／ＲＸ　Ｒヘテロダイマーのアンタゴニストを同定するため、１または２以上のＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーを発現するように酵母細胞を修飾する。この細胞を、致死マーカー（そのようなマーカーの発現は細胞を死に至らしめる）の５゛側にＲＡＲＥを含有するようにさらに修飾する。ついで、この修飾酵母細胞を２つの因子（第一の因子は、酵母細胞中に含まれる特定のＲＡＲ／ＲＸ　Ｒ／ＲＡ　ＲＥの組み合わせをトランス活性化することが知られている化合物、第二の因子は、アンタゴニスト活性について試験されている化合物）の存在下でインキュベートする。アンタゴニストとして機能する因子は、致死遺伝子を発現させないであろう。

種々のレチノイドを相互変換することのできる酵素（たとえば、哺乳動物において全トランスレチノイン酸を９ンスーレチノイン酸に変換する酵素）をコードするＤＮＡ配列を同定するため、１または２以上のＲＡ　Ｒ／ＲＸ　Ｒヘテロダイマーを発現するように酵母細胞を修飾する。この細胞を、選択マーカー活性をコードする遺伝子（たとえば、ＵＲＡ−宿主細胞におけるＵＲＡ３）　、またはアッセイ可能なマーカー活性をコードする遺伝子の５゛側にＲＡＲＥを含有するようにさらに修飾する。ついで、この細胞を、特定のクラスのレチノイドを相互変換することができることが知られているまたは相互変換すると思われる哺乳動物から単離したｃＤＮＡ’ｓ、たとえばヒト皮膚ｃＤＮＡライブラリーを発現するための宿主として用いる。

該ｃＤＮＡライブラリーでトランスフォーメションした後、ついで酵母細胞を、最初に活性形に変換されない限り細胞内に含まれる特定のＲＡＲ／ＲＸＲ／ＲＡＲＥの組み合わせをトランス活性化しない因子とともにインキュベートする。選択培地中で増殖することのできる細胞、またはアッセイ可能なマーカーを発現する細胞は、レチノイドを活性形に相互変換する酵素をコードする遺伝子配列を含有している。別法として、細胞内に含まれるＲＡＲ／ＲＸＲ／ＲＡＲＥの組み合わせををトランス活性化することができるが、いったん該因子力坏活化形態に変換されたらトランス活性化することのできないレチノイドとともに細胞をインキュベートすることができる。

上記手順を修飾して、完全な細胞を用いる代わりに、ヘテロダイマーを含有する変化した細胞からの核および／またはサイトツル抽出物を用いることができる。

そのような応用においては、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーを発現する細胞の抽出物を、レポーター配列に機能的に連結したＲＡＲＥを含有する発現モデュールと混合する。ついで、この抽出物／発現モデュールを因子とともにインキュベートし、レポーター配列の発現をアッセイする。

本発明の他の態様において、上記アッセイを行うのに必要な試薬を含有するキットが提供される。

詳しくは、１または２以上のコンテナーを密接した領域内に収容する区画化キットを提供し、該コンテナーは（ａ）本発明の抗体の一つ、１または２以上の本発明のヘテロダイマー、または１または２以上の本発明の修飾細胞を含む第一のコンテナー、および（ｂ）１または２以上の他のコンテナーであって下記の１または２以上を含むもの：洗浄試薬、結合した抗体または第一のコンテナーからのへ子ロダイマーの存在を検出することのできる試薬、ＲＥ配列、またはアゴニストＲＡＲ／ＲＸＲ／ＲＡＲＥｌ−ランス活性化に対するアンタゴニスト；からなる。

詳細には、区画化キットには試薬が別々のコンテナーに含まれているあらゆるキットが包含される。そのようなコンテナーとしては、小さなガラスコンテナー、プラスチックコンテナーまたはプラスチックまたは紙のストリップが挙げられる。

そのようなコンテナーにより、試料および試薬が互いに汚染し合わないように、試薬を一つの区画から他の区画へ有効に移動させることができ、また各コンテナーの因子または溶液を一つの区画から他の区画へ定量的に加えることができる。

そのようなコンテナーには、試験試料を受容するコンテナー、アッセイに使用する抗体を入れたコンテナー、洗浄試薬（リン酸緩衝食塩水、トリス緩衝液など）を入れたコンテナー、結合した抗体を検出するのに用いる試薬を入れたコンテナーが含まれるであろう。

検出試薬のタイプとしては、標識した第二の抗体、または第一の抗体を標識しである場合には、該標識抗体と反応し得る難染性試薬、酵素試薬または抗体結合試薬が挙げられる。当業者であれば、本発明により開示される抗体を当該技術分野でよく知られている確立されたキットフォーマットの一つに容易に組み込むことができることが容易に理解されるであろう。

本発明はさらに、本発明のへテロダイマーに結合するＤＮＡ配列を同定および単離する方法を提供する。詳しくは、本発明のへテロダイマーを用い、該ヘテロダイマーにより結合される能力またはＲＡＲＥとして働くことについて所定の配列を単離またはスクリーニングすることができる。

タンパク質により結合される配列を単離するために当該技術分野において知られた種々の方法が存在する。そのような一つの方法において、ヘテロダイマーを固相支持体に固定化し、アフィニティーマトリックスとして用いてそれに結合した配列を単離する（アーカンジオリ（Ａｒｃａｎｇｉｏｌｉ）ら、Ｅｕｒ、　Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７９：３４５９〜３６４　（１９８９）　）。

たとえば、ｈＲＡＲ−α１／ｈＲＸＲ−β１ヘテロダイマーをセファロース上に固定化し、剪断したヒトＤＮＡ　（最も好ましくは長さが２０ｂｐ〜２ｋｂ）を該カラム上で洗浄する。該ヘテロダイマーに結合した配列はカラムに付着するであろうに対して、結合しなかった配列は洗浄液中に除かれるであろう。加えて、結合した配列はクローニングする前にＰＣＲを用いて増幅することができる。

別法として、ニトロセルロースなどの固相支持体上にＤＮＡを固定化したゲノムライブラリーをスクリーニングするのにヘテロダイマータンパク質を用いることができる（シャープ（Ｓ　ｈａｒｐ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ　１０４８　：　３０６〜３０９　（１９９０）：ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　１８　：１１５９〜１１６６　（１９９０））。

本発明はさらに、細胞中の遺伝子の発現を制御する方法を提供する。

詳細には、ＲＥに機能的に連結したＤＮＡ配列を含有するように細胞を変えることができる。加えて、該細胞を、本発明のヘテロダイマータンパク質を生成する種々のサブユニットを発現するように変えることができる。適当なサブユニット／ＲＥの組み合わせを選択することにより、当業者であれば特定の因子に応答して所定の配列を発現する細胞を生成することができる。

いまや本発明を一般的に記載したので、因子およびそれを得るための方法は下記実施例を参照することにより一層容易に理解されるであろう。これら実施例は説明のために提供されるものであって、特に断らない限り本発明を制限することを意図するものではない。

実施例１インビトロでＲＡＲ／ＲＡＲＥ複合体の有効な生成のために必要な因子のヒーラ細胞および昆虫細胞における存在有効なＲＡＲ／ＲＡＲＥ生成のための細胞結合因子（ＲＡＲ結合因子またはＲＢＦｓ）の必要性を、幾つかの過剰発現系を用いて得られたｈＲＡＲ−γを用いて最初に調べた（同様の結果は、ｈＲＡＲ−αおよびβを用いても得られた、データは示しておらず下記参照）。まず、該レセプターのｃＤＮＡコード配列を有する組換えワクシニアウィルス（ｒＶＶ）でヒーラ細胞を感染させることによりｈＲＡＲ−７を過剰発現させたにコルソン（Ｎ　１ｃｈｏｌｓｏｎ）ら、ＥＭＢＯＪ、９４４４３〜４４５４　（１９９０））。これら細胞の核抽出物（ＮＥ）中に存在するｈＲＡＲ−７のＲＡＲ−βＲＡＲＥ　（β−ＲＡＲＥ、ド・テら、Ｎａｔｕｒｅ３４３　：１７７〜１８０　（１９９０）　、図４参照）への結合をゲルシフトにより評価しく図ＩＡ、レーン１、矢印）、その特異性をスーパーシフト実験において抗ＲＡＲ−γ抗体を用いることによりにコルソンら、ＥＭＢＯＪ、９：４４４３〜４４５４　（１９９０）；スミス（Ｓ百１ｔｈ）　ら、ＥＭＢＯＪ、１０：２２２３〜２２３０　（１９９１））、並びに野生型および変異 β−ＲＡＲＥｓを用いた競合実験により（スミスら、ＥＭＢＯＪ、１０：２２２３〜２２３０　（１９９１））確認した（データは示していない）。さらに、野生型ＶＶ感染細胞の抽出物を用いると複合体は生成しなかった（データは示していない）。増大量の非感染ヒーラ細胞ＮＥを添加すると複合体の生成が刺激され（図ＩＡ、レーン２〜４）、ＲＡＲ結合を促進する限定因子の存在が示唆された。

興味深いことに、同一の結合条件下において、使用したレセプタータンパク質の量（ウェスタンブロッティングにより決定、データは示していない）は粗製の抽出物を用いたアッセイにおけるもの（レーン１）と同じであっても、精製ｒＶ■ 発現レセプターを用いると複合体は観察されなかった（図ＩＡ、レーン５）。

しかしながら、ヒーラ細胞ＮＥの添加によりｈＲＡＲ−γ結合は完全に回復しく図ＩＡ、レーン６〜８；レーン２〜４と比較せよ）、レセプターの精製の間にｈＲＡＲ−γの内生ＤＮＡ結合能は失われなかったことを示していた。特定複合体の生成は精製ｈＲＡＲ−γの存在に完全に依存することに注意すべきである（図ＩＡル−ン１７〜１９および１０、レーン２８〜３０）。大腸菌中に発現されるｈＲＡＲ−γの粗製の調製物（図１Ｂル−ン２４〜２７）は、酵母中のユビキチン融合タンパク質（データは示していない）、またはインビ）・口でウサギ網状赤血球溶解液中て翻訳されるｈＲ，ＡＲ−γ（レーン２０〜２３）のように、特定複合体の生成がヒーラ細胞ＮＥの添加に依存するという点で同様の挙動を示す。

いずれの場合も、複合体タンパク質（たとえば、血清アルブミン）の生成、ニストロツエンレセプターＤＮＡ結合刺激因子（マツケルジー（Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１８　：　５７］　３−５７１６　（１９９０））　、または５０ｍＭまでのＤＴＴ濃度（アベイｌ−（Ａｂａｔｅ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４９　：　１１５７〜１１６１（］、９９０））はｈＲＡＲ−γ結合を促進しなかった（データは示していない）。

同様の結果はレセプター源がバクロウィルス（ｒＢＶ）発現系である場合にも得られたく図ＩＡ、レーン９〜１２）。しかしながら、電気泳動移動度の大きい（ｒＶＶ感染ヒーラ細胞から調製した核抽出物で認められるものと比較して）複合体は、ｒＢＶ感染したスポドブテラ・フルシベルダ（Ｓ　ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞の粗製抽出物を用いた場合に観察された（図ＩＡ、レーン１および９を比較せよ）。この複合体には抗体のスーパーソフトにより示されるようにｈＲＡＲ−γが含まれていた（データは示していない）。これら細胞の抽出物から精製したｈＲＡＲ−γを用いた場合にはＳｆ９細胞特異的複合体は観察されなかった（図ＩＡ、レーン１３）。しかしながら、電気泳動移動度の小さいレセプター／ＤＮＡ複合体は、ヒーラ細胞ＮＥを添加することにより生成することができた（図ＩＡ、レーン１４〜１６）。同様に、ｒＶＶまたはｒＢＶ抽出物から精製したｈＲＡＲ−γにＳｆ９細胞抽出物を添加すると、電気泳動移動度の大きいＳｆ９特異的複合体が再構成された（データは示していない）。対照的に、ドロソフィラ・ンユナイダー（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ）　５２細胞には、Ｓｒ１かまたはヒーラ細胞ＲＢＦｓのいずれかで生成したものよりも再生可能なほどに遅く移動するＲＡＲ／β−ＲＡＲＥ複合体の生成を刺激するＲＢＦが含まれていた（図ＩＣ。

レーン２〜４を比較せよ）。ｈＲＡＲ−γの不在下では、ＳＦ９またはＳ２細胞タンパク質は（いやしくも結合するとして）β−ＲＡＲＥに弱く結合することに注意すべきである（図ＩＣ，レーン６および７、データは示していない）。

本発明者らは、上記データから、ｈＲＡＲ−γは過剰発現したレセプターの採取源のいかんにかかわらずぞれ自身てはβ−ＲＡＲＥに有効に結合しないと結論する。β−ＲＡＲＥへのｈＲＡＲ−γの有効な結合のためには、ヒーラ細胞かまたは昆虫細胞のいずれかには存在するが酵母または大腸菌には存在しない因子（ＲＢＦｓ）の存在が必要であるように思われる。さらに、本発明者らのデータは、ヒーラ細胞および昆虫細胞ＲＢＦｓが互いに区別され、ｈＲＡＲ−γとともにβ −ＲＡＲＥに結合することを示唆している。というのは、ヒーラ、ＳＦ９およびＳ２細胞抽出物の存在下で生成する複合体は異なる電気泳動移動度を有するからである（図ＩＡおよびＩＣ参照）。最後に、これらＲＢＦｓ活性は、加熱（６５ ℃にて１０分間）により、またはトリプシン処理により不活化され（データは示していない）、それゆえＲＢＦｓはタンパク質からできていることが示された。

有効なＲＡＲ／ＲＡＲＥ複合体生成に必要なヒトＲＢＦを精製およびクローニングする試みにおいて、ヘム（Ｈｅｍ）全細胞抽出物（ＷＣＥ）の分画を行った。

ＤＥＡＥ−ＢｉｏＧｅｌＡ、　ヘパリンーウルトロゲル、フェニル−８ＰＷ１ヘパリン−ＴＳＫおよびヒドロキシルアパタイト−ＴＳＫＳシカラム上連続クロマトグラフィーにより、〜６４ｋＤａのみかけ上均−なポリペプチドが得られ（図ＩＤ）、このものはＲ，Ａ　Ｒ−γによるβ−ＲＡＲＥ結合を強く刺激した（図ＩＥ）。ヒドロキシルアパタイト力ラム精製ＲＢＦ　（図ＩＤ、レーン６）の比活性は、ヒーラＷＣＥのものに比べて約４９．０００倍大きかった（表１）。６４ｋＤａのポリペプチドと該ＲＢＦ活性とは最後の３つのクロマトグラフィ一工程において正確に一緒に溶出しくデータは示していない）、このポリペプチドがヒーラ細胞ＲＢＦ活性に対応していることを示していた。さらに、この精製ＲＢＦはグリセリン勾配において〜６０　ｋ、　Ｄ　ａ種として沈降した（データは示していない）。

上記ヒーラ細１１ｉＪ６４ｋＤａタンパク質のトリプノン消化から得られる７つのペプチドの配列を決定し、データベースと比較した。７つのペプチドはすベテ（図２において斜線を施しである）、ヒトレチノイドＸレセプター−−α（ｈＲＡＲ−α、マンケルストルフら、Ｎａｔｕｒｅ　３４５　：　２２４−２２９　（１９９０））のＣＤ　！’、ｌ　Ａから誘導される配列に非苓に類似していた。本発明者らはマウスＲＸＲファミリーの３つの成員、すなわちｍ　ＲＸ　Ｒ− α、ｍ　ＲＸ　Ｒ−βおよびｍＲＸＲ−γヲコートするｃＩ）ＮＡをクローニングしであるので（図２、および本発明者らの未刊（テの結果）、本発明者らは、とのＲＸＲサブタイプがヒーラ細胞ＲＢＦに対応するかを同定するためにＲＸＲｓファミリーの間の配列の類似性を調べた。ただ一つのベブチｔ”（ｐ２８、図２参照）のみが、これらＲＸＲファミリーの成員の間で完全に区別することができ、このペプチドの配列はヒーラ細胞ＲＢＦがヒトＲＸＲ−β（以下、ｈＲＸＲ −βと称する）または該ファミリーの密接に関連した成員であることを示唆していた（加えて、ｐ２５により部分的な区別をすることができた、図２参照）。この示唆は、ペプチドｐ２４とｐ２７との間に位置する推定ｈＲＸＲ−β　ｃＤＮＡの部分をＰＣＲの助けを借りてクローニングおよびシークエンソングすることによりさらに支持された（図２）。４つのクローンの誘導されたアミノ酸配列は、ｍＲＸＲ−βのものとほとんど同一であることが確かめられ（図２参照）、ｈＲＸＲ−βが主要なヒーラ細胞ＲＸＲサブタイプであるかもしれないことを示していた。それゆえ、このレセプターのヒト類似体をクローニングするため、ｍＲＸＲ−βを用いてヒーラｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。スクリーニングした〜１０５のコロニーのうち、７つの重複するクローンが得られ、ついでこれらをサブクローニングしシークエンソングした（図２はｈＲＸＲ−βの誘導したアミノ酸配列を示す）。最も長い読み取り枠は５２６アミノ酸長のポリペプチドに対応しており、このものはｍＲＸＲ−βに非常に類似しており、５５．８２１ダルトンの予想ＭＷを有している（図２および下記参照）。

ｈＲＸＲ−ａの配列（マンゲルスドルフら、Ｎａｔｕｒｅ　３４５　：　２２４〜２２９（１，９９０））は、その全体において、４６６アミノ酸長のｍＲＸＲ −αに対して本明細書において与えられるもの（図２、データは示していない）と驚くほど類似している（９８％同一）。本発明のｍＲＸＲ−７４６３アミノ酸長配列は、ロウ”　（Ｒｏｗｅ）ら、ＤｅｖｅｌｏｐＩＩｌｅｎｔｌ　１１　：　７７１−７７８　（１９９１）により報告されているニワトリのＲＸＲと非常に類似している（８３．５％）。これら３つのＲＸＲｓは、とりわけＡ／ＢおよびＤ領域において互いに明らかに異なっている。しかしながら、ＤＮＡ結合ドメイン（領域Ｃ）および推定リガンド結合ドメイン（領域Ｅ）ｉｊ、３つのＲＸＲサブタイプのすべてにおいて非常に保存されている（それぞれについて〜９０％）。ｍＲＸＲ−βのアミノ酸配列は以前に報告されており、Ｈ−２ＲＩＩＢＰとして言及されている（ハマダら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ｔｌｓＡ８６　：　８２８９〜８２９３　（１９８９））　。本発明の配列は３８アミノ酸残基だけ長い（図２）。というのは、本発明者らの一層長いｃＤＮＡ配列にはインフレームのＣＴＧロイノン開始コドン（有利なコザクモチーフ内に位置する）が含まれており、そこから翻訳をインビトロで容易に開始することができるからである（本発明者の未刊行の結果）。興味深いことに、ｈＲＸＲ−βおよびｍＲＸＲ−βのアミノ酸配列はｍＲＸＲ−βのＣ末端からＮ末端まで非常に保存されているが、ｈＲＸＲ−βは余分の６８アミノ酸長のＮ末端領域を有しているように思われる（図２）。このことは、すてにＲＸＲ−α（レロイら、ＥＭＢＯＪ、１０：５９〜６９　（１９９１ｂ））、ＲＸＲ−β（ゼレント（Ｚｅｌｅｎｔ）ら、ＥＭＢＯＪ、１０ニア１〜８１　（１９９１））およびＲＸＲ−γ（カスドナー　（Ｋａｓｔｎｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　［ＩＳ＾８７　：　２７００〜２７０４　（１９９０））イソ形について報告されているように、別のスプライシングおよび／または異なるプロモーターの使用によって生じる末端配列において異なるＲＸＲイソ形の存在を反映している（本発明者らの未刊行の結果）。同様に、ｍＲＸＲ−βと比較した場合に（図２）　、ｈＲＸＲ−βのアミノ末端領域中に存在する１０アミノ酸長のインフレームの挿入がｈＲＸＲ−β中の付加ミニエクソンにおそらく対応する。

上記３つのＲＸＲタイプについて観察されるように（ゼレントら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９　：　７１４〜７１７　（，１９８９））　、所定の棟内におけるこれら３つのタイプについて認められるもの（たとえば、ヒトおよびマウスにおけるＲＸＲ−αまたはＲＸＲ−β、およびマウスおよびニワトリにおけるＲＸＲ−γ ）に比べて種間での所定のＲＸＲタイプについて認められるアミノ酸配列保存の度合が大きく、これら３つのＲＸＲｓが特定の機能を行うことを示唆している。

ＲＡＲｓの場合のように、所定の棟内で３つのＲＸＲｓ間でそれほど保存されていない中央のＤ領域が、種間ての所定のＲＸＲタイプ（α、βまたはγ）について高度に保存されていることは特に驚くべきことである（図２、データは示していない）。

３つのすべてのクローニングしたＲＸＲｓは、３つのすべてのＲＡＲｓのＤＮＡ結合の促進において精製ヒーラ細胞ＲＢＦと置換するマウスＲＸＲｓをウサギ網状赤血球溶解液（ＲＲＬ）を用いてインビトロで翻訳し、ＲＡＲ／ＲＡＲＥ結合アッセイにおいてクローニングＲＸＲｓが精製ヒーラ細胞ＲＢＦと置換するかどうかを調べるのに用いた。細菌により発現したｈＲＡＲ−γのβ−ＲＡＲＥへの特異的結合がｍＲＸＲ−α、βまたはγのいずれかの添加により観察されたのに対して（図３Ａ、レーン２〜４）　、ＲＸＲｓの不在下では結合は観察されなかった（図３Ａにおけるレーン１および５）。しかしながら、ＲＸＲｓはｈＲＡＲ −γの不在下ではβ−ＲＡＲＥプローブと特異的な複合体を生成しなかった（図３Ａ、レーン６〜８）。インビトロで翻訳された３つのすべてのｍＲＸＲｓ並びにｈＲＸＲ−βは、β−ＲＡＲＥへの３つのインビトロ翻訳されたＲＡＲｓのいずれの結合を促進するうえにおいてもヒーラ細胞ＲＢＦと有効に置換することができた（図３Ｂ；レーン２および３．５および６．８および９を比較せよ、データは示していない）。同様の結果は、大腸菌で発現させたｍＲＸＲ−ａを用いても得られた（本発明者らの未刊行の結果）。ｍＲＸＲ５の不在下でｈＲＡＲ−ａ、βまたはγを用いても結合はほとんど認められなかった（図３Ｂにおけるレーン１．４および７）。ｍＲＸＲ−αを下記に記載するほとんどの実験において用いたが、ｍＲＸＲ−βおよび一γ、またはｈＲＸＲ−βと同様の結果は得られなかった（データは示していない）。

図１および図３に示された結果は、ＲＡＲおよびＲＸＲがインビトロでβ−ＲＡＲＥに協力的に結合することを示唆している。この可能性を調べるため、β−ＲＡＲＥを用いて生成した複合体中にＲＡＲおよびＲＸＲの両方が存在するかどうかを決定するように実験を設計した。ついで、本発明者らは、かかる協力的な結合が溶液中でのＲＡＲおよびＲＸＲのヘテロダイマー会合を反映しているのかどうかを調べた。本発明者らはまた、単離したＲＡＲまたはＲＸＲがＲＡＲＥｓに結合することができるかどうかをさらに調べた。

図４において用いたｈＲＡＲ−γの濃度においては（アッセイ当たり〜１０フィコモルのレセプター）、ヒーラ細胞ＲＢＦまたはｍＲＸＲ−αの不在下ではβ− ＲＡＲＥプローブを用いて検出可能な複合体は生成しなかった（図４Ｂ、レーン１；図４Ａ、レーン８および１７をも参照のこと）。しかしながら、部分的に精製した（図４Ｂ、レーン２）または精製した（レーン３）ヒーラ細胞ＲＢＦおよびインビトロで翻訳したｍＲＸＲ−α（レーン５）は複合体生成を強く促進した。

ｈＲＡＲ−γの不在下では、ヒーラ細胞ＲＢＦ　（図４Ａ、レーン１および２）もｍＲＸＲ−α（図４Ａ、レーン３および１２）もβ−ＲＡＲＥプローブに有効に結合することはできなかった。ＲＸＲが遅滞（ｒｅｔａｒｄｅｄ）複合体の成員であることを示すため、本発明者らは、ｍＲＸＲ−αのカルボキシル末端アミノ酸に融合したヒトニストロジエンレセプター（ＥＲ）のＦ領域（クルストら、Ｅ￥ＢＯＪ、５：８９１〜８９７　（１９８６）　）を含有する、抗原を付着した融合タンノ々り質、ｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）を構築した。この融合タンパク質は、抗ＥＲ（Ｆ）抗体（Ａ　ｂ　Ｆ　３、メツツガ−（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら、準備中の原稿）のエピトープを含有しており、該抗体を用いたスーパーシフトアッセイに用いることができる。ｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）はｍＲＸＲ−ａと同じくらいβ −ＲＡＲＥへのＲＸＲ−７の結合の促進において有効であるが（図４Ｂのレーン５および６を比較）、それ自身ではこの要素に有効に結合しなかった（図４Ａ、レーン４および１３）。ＲＡＲ−７およびｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）の存在下で生成した複合体は、抗ＲＡＲ−γ（Ａｂ４γ、図４Ｂ、レーン７）または抗ＥＲ（Ｆ）（ＡｂＦ３、レーン８）抗体のいずれかでスーパーシフトすることができた。

このことは、両方のタン、（り質がヘテロマー複合体中に存在することを示している。対照的に、単離したｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）（図４Ａ、Ｌｉ　：ｚ６ｔ−ｉよび１５）ｔたはｈＲＡＲ−７（図４Ａ、レーン９および１８）および共役抗体とともにβ−ＲＡＲＥをインキュベートした場合には、スーパーシフトした複合体ははるかにかすかにしか認められなかった。これらすべてのデータは、ＲＡＲおよびＲＸＲがβ−ＲＡＲＥに協力的に、おそらくヘテロダイマーとして結合することを明らかに示している。加えて、β−ＲＡＲＥとＲＡＲまたはＲＸＲのいずれかとの間にホモマー複合体を低い有効性で生成することができると思われる。しかしながら、現在のアッセイ条件下では、これら「低い親和性」の視覚化にはレセプター抗体の「安定化」効果（最もおそらく、これら抗体の２価特性による）が必要である。

上記結果は、ＲＡＲおよびＲＸＲが溶液中で相互作用してヘテロダイマーを生成するのかどうか、あるいはＤＮＡ結合において観察される協力性はこれらタンパク質がＤＮＡに一旦結合してから起こる相互反応を反映しているのかどうかに関して疑問を起こさせる。これら可能性を調べるため、両タンパク質の一方に対する抗体を使用した両タンパク質の交差および同時免疫沈降を用いた。抗ＲＡＲ− γまたは抗ｍＲＸＲαＥＲ（Ｆ）抗体のいずれかを用いた化学的交差または免疫沈降を行う前にβ−ＲＡＲＥの不在下（図５Ａ、レーン３および７）または存在下（レーン５および９）で［３ｓＳ］　ｈＲＡＲ−７および非標識ｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）をインキュベートした場合に、〜１３０ｋＤａの交差生成物が観察された。

この交差生成物（上の矢印）はＡｂ４γ（図５Ａ、レーン３および５）またはＡｂＦ３　（レーン７および９）のいずれかにより免疫沈降し、複合体中に両方のレセプタータンパク質が存在することを示唆していた。β−ＲＡＲＥを含有させるとこの複合体の生成はわずかに増加したが（図５Ａ、レーン３をレーン５と、レーン７をレーン９と比較）、一方、図５Ａの非交差［３ｓＳ］　ｈＲＡＲ−γ および非標識の同時免疫沈降；　［３ＳＳｌ　ｈＲＡＲ−γモノマーは下の矢印で示す）。交差または免疫沈降の前にβ−ＲＡＲＥの不在下（図５Ａ、レーン１１）または存在下（レーン１３）で［”Ｓ］　Ｍｅ　ｔ−標識および非標識ｈＲＡＲ−γをインキュベートした場合には交差生成物は観察されなかった。この所見は、ゲルシフトアッセイを用い（図４８）または通常の同時免疫沈降によって（データは示していない）ｈＲＡＲ−γホモダイマーを示すことができなかったことと一致している。

［３５５１ｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）および非標識ｈＲＡＲ−７をインビトロで交差させた場合にも、β−ＲＡＲＥの不在下で交差複合体が明らかであり（図５８、し−ン３および７）Ａ、ｂ４ｙまたはＡｂＦ３のいずれによっても免疫沈降しなかった（それぞれ１ノーン３，５および７，９；交差複合体の移動は上の矢印により示す）点で定量的にも同様の結果が得られた。さらに、［”Ｓｌ　ｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）は前以て交差を行うことなくＡｂ４ＹによってｈＲＡＲ−γで有効に同時免疫沈降したが、β−ＲＡＲＥの存在下においてのみであった（図５０のレーン６および８を比較）。交差および免疫沈降を行う前に［”Ｓｌ　Ｍｅｔ− 標識および非標識ｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）をβ−ＲＡＲＥの存在下でインキュベートした場合にかすかな交差複合体が観察された（図５８、レーン１３、上の矢印のわずかに上部の弱い複合体を参照）。この所見は、インビトロ翻訳したＲＸＲがおそらくホモダイマーとしてβ−ＲＡＲＥに弱く結合することを示すゲルシフト実験（図４Ａ、レーン］２および１３）と一致する。まとめると、これら結果は、ＲＸＲまたはＲＡＲのいずれも本発明の条件下ては溶液中またはβ−ＲＡＲＥプローブ上で有効にホモダイマーを生成しないことを示している。対照的に、ＲＡＲおよびＲＸＲは溶液中でヘテロダイマーを生成し、この相互反応はβ−ＲＡＲＥの存在によって安定化される。

協力的ＲＡＲ／ＲＸＲ結合はＲＡＲ−β応答要素に限られないＲＡＲ／ＲＸＲ結合の協力性が合成ＴＲＥｐａｌ（グラス（Ｇ　１ａｓｓ）ら、Ｃｅ１１５９　：　６９７〜７０８　（１９８９））（β−ＲＡＲＥの直行繰り返しモチーフの代わりに２つの逆行モチーフを含有する（図４Ａ参照））などの他のＲＡＲ応答要素に一般化することができるかどうかという問題と取り組むため、細菌により発現したｈＲＡＲ−γおよびインヒドロ闘訳したｍＲＸＲ−αを用いた。ｈＲＡＲ −γは、ヒーラ細胞ＲＢＦまたはｍＲＸＲ−αのいずれかの不在下でＴＲＥｐａｌに結合しなかった（図４Ｂ、レーン１８、図４Ａ、レーン２５および３３をも参照）。しかしながら、ＲＡＲ−γは、部分精製（図４Ｂ、レーン１９）または精製（レーン２０）ヒーラ細胞ＲＢＦ、、ｍＲＸＲ−ａ　（レーン２２）またはｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）（レーン２３）の存在下でこの要素と強く結合した。期待されるように、後者の複合体は抗ｈＲＡＲ−γ（レーン２４）および抗ＥＲ（Ｆ）（レーン２５）抗体の両方によってシフトし、遅滞複合体中に両レセプタータンパク質が存在することが確認された。興味深いことに、ｍＲＸＲ−αおよびｍＲＸＲａＥＲ（Ｆ）は両方とも、ＲＡＲ−γの不在下においてβ−ＲＡＲＥプローブよりもパリンドロームＴＲＥに一層強く結合した（図４Ａ、レーン１２および１３をレーン２９および３０と比較せよ）。対照的に、単離ｈＲＡＲ−γはＡｂ４γ抗体の存在下においてさえもＴＲＥｐａｌとかすかな複合体しか生成しなかった（レーン２６および３４）。これらの結果は、不安定なＲＸＲホモダイマー（その可能なＲＡＲ対応物ではなく）は、直行繰り返しモチーフへの結合よりもパリンドロームへの結合によって一層良好に安定化されることを示唆している。

マンゲルスドルフら、Ｃｅ１ｌ　６６　：５５５〜５６１　（１９９１）の最近の結果および本発明者らの未刊行のデータ（Ｓ、Ｍ、ら、準備中）は、単離ＲＸＲが、１ｂｐＨｌｌ！れた直行繰り返しモチーフに結合し、トランス活性化されることを示している。それゆえ、本発明者らは、５ｂｐではなくｌｂｐ離れた直行繰り返しモチーフからなる要素上でＲＸ　Ｒ／ＲＡ　Ｒホモおよびヘテロ複合体が一層有効に生成されるかどうかを調べた（β−ＲＡＲＥの場合がそうであるように）。ｌｂｐ離れた要素（β−ＲＡＲＥＩ、図７参照）を用い、本発明のアッセイ条件下ではｍＲＸＲ−αまたはｈＲＡＲ−γのいずれかでは非常にわずかしか複合体は生成されず、有効な複合体の生成には両方のレセプターの存在が必要であった（図７、レーン９〜１０）。しかしながら、ヘテロダイマー複合体生成の効率はβ−ＲＡＲＥの場合よりもβ−ＲＡＲＥＩの方が低かった（図７におけるレーン２および１０を比較せよ）。

各タンパク質の欠失変異を用い、ＲＸＲ／ＲＡＲ協力的結合にはリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ、領域Ｅ）の完全さが必要であるかどうかを調べた。ダイマー生成界面は以前にはニストロジエンおよびプロジエヌテロンレセブターのこの領域内に位置するとされていたが（参照のため検討を参照）、同様の界面の可能な存在がＲＡＲｓの場合にも提唱されている（フォーマン（Ｆ　ｏｒｍａｎ）ら、Ｍｏｌ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、４　：　１２９：３−１３０１　（１９９０））　。ｈＲＡＲ−７領域Ｆの欠失は、β−ＲＡＲＥプローブへのＲＡＲ／ＲＸＲ結合に同等影響を及ぼさなかったが、一方、領域Ｅの断片（ｈＲＡＲ−γΔ２７０−４５４、レーン５および６）または領域Ｅの全部（ｈＲＡＲ−γΔＥＦおよびｈＲＡＲ−γΔ１８８−４５４、レーン７〜１０）の欠失はβ−ＲＡ、　ＲＥ結合の劇的な減少となった。ｍＲＸＲｓの配列を核レセプタースーパーファミリーの他の成員の配列と比較した場合に（図２、データは示していない）　、ｍＲＸＲｓについて明らかなＣ末端Ｆ領域を定めることができなかった。ｍＲＸＲ−α領域Ｅの１２　（ｍＲＸＲ−αΔ４５５−４６６、図６Ｂ、レーン１〜４）または１８　（ｍＲＸＲαΔ４４９−４６６、データは示していない）の最もカルボキシル末端のアミノ酸の欠失は、β−ＲＡ　Ｒ，ＥへのＲＡＲ／′ＲＸＲ結合に影響を及ぼさなかった。しかしながら、さらに推定ＲＸＲＬＢＤの方へ３２アミノ酸を欠失すると（ｍＲＸ、Ｒ−ａΔ４２１４６６）、β−Ｒ，Ａ　Ｒ，Ｅ結合は完全になくなった（図６Ｂ、レーン５および６）。それゆえ、ＲＡＲおよびＲＸＲの両方のＬ　Ｂ　Ｉ）内に位置するアミノ酸配列がβ−ＲＡＲＥへの協力的結合に明らかに必要である。

このようなＲＡ　ＲおよびＲＸＲＤＮＡ結合ドメインの可能な必要性を、各レセプターの第一の「認、識」シンクフィンガー（概観のためソユワーベ（Ｓ　ｃｈｗａｂｅ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｃｉ、１１６　：　２９１〜２９６　（１９９１）を参照）の第四番目のノステインをアラニンに変えた変異体を用いて調べた。ｈＲＡＲ−γの場合は（ｈ　ＲＡ　Ｒ−γへＣ４、図６Ａ、レーン１３および１４１図７、レーン５をも参昭）、この変異の結果、有意のβ −ＲＡＲＥ結合は認められなかったが、一方、ｍＲＸＲ−ａの場合は（ｍＲＸＲ −ａΔＣ４、図６０、レーン７および８゜図７、レーア３をも参照）、対応変異はＲＡＲＥ結合を減少させたがなくなることはなかった。このことは、Ｃｙｓ− ４Ａ　Ｉ　ａ変異がｍＲＸＲ−αのＤＮＡ結合よりもｈＲＡＲ−γのＤＮＡ結合において一層有害であることを示唆している。対照的に、２つの結合モチーフがＩｂｐ離れて存在するβ−ＲΔＲＥＩへの結合、およびパリンドローム要素ＴＲＥｐａｌへの結合（データは示していない）は、ｍＲ，ＸＲ−ａΔＣ４（図７のレーン１０および１１を比較）およびｈＲＡＲ−７ΔＣ４（レーン１０および１３を比較）の両方の場合に完全に失われた。それゆえ、スペーサーの長さの異なる直行繰り返しモチーフまたは逆行繰り返しモチーフからなる応答要素へ結合する場合に、ＲＡＲおよびＲＸＲは異なる相互反応の仕方をする。最後に、ｈＲＡＲ−γＮ末端Ａ／Ｂ領域の欠失はβ−ＲＡＲＥ結合を有意に変えなかった（ｈＲＡＲ−γΔＡＢ、図６Ａ、１ノーン１１および１２）。

ＲＸＲ−βはまたヒーラ細胞ＴＲＡＰである甲状腺ホルモンレセプターαおよび β（ＴＲ−αおよびβ）のＴＲＥｓへの結合は、種々の細胞および組織抽出物中に存在するＴＲ結合タンパク質（ＴＲ補助タンパク質、ＴＲＡＰとも称される）により刺激されることが報告されている（マ（ノイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら、Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、３　：　１４３４〜１４４２　（１９８９）　；バーンサイド（Ｂ　ｕｒｎｓｉｄｅ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５　：　２５００〜２５０４　（１９９０）：レイザー（Ｌ　ａｚａｒ）ら、Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　４　：１６２７〜１６３５（１９９０）；スバンヤール（Ｓ　ｐａｎ　ｊａａｒｄ）　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾８８：８５８７〜８５９１　（１９９１）：およびその中に引用された文献）。これらＴＲ，ＡＰｓのみかけのＭＷは、サイズ排除クロマトグラフィー（バーンサイドら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５　：　２５００−２５０４　（１９９０））およびＴＲへの化学架橋（オドネル（０’　Ｄｏｎｎｅｌｌ）ら、Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　５　：　９４〜９９　（１９９１）、レイザーら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　１１　：　５００５〜５０１５　（１９９１）、ナール（Ｎａａｒ）ら、Ｃｅ１ｌ　６５　：１２６７〜１２７９　（１９９１））による決定によると４２〜６６ｋＤａの範囲である。精製ヒーラ細胞ＲＢＦは５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で〜５４ｋＤａポリペプチドとして移動したので、本発明者らは、このタンパク質がゲル遅滞アッセイにおいてＴＲＡＰとして挙動するかどうかを決定するための実験を行った。インビトロ翻訳ｃ− ｅｒｂＡにワトリＴＲ−α１またはｃＴＲ−α１）は、部分精製（図４Ｂ、レーン１１）または精製（レーン１２）ヒーラ細胞ＲＢＦと、並びにインビトロ翻訳ｍＲＸＲ−α（レーン１４）またはｍＲＸＲαＥＲ（Ｆ）（レーン１５）とβ− ＲＡＲＥ上で強い複合体を生成した。後者の複合体はＡｂＦ３　（レーン１６）によってスーパーソフトし、複合体中にＲＸＲａＥＲ（Ｆ）が存在することを示していた。β−ＲＡＲＥプローブ上よりもＴＲＥｐａｌ上で一層強いｃ−ｅｒｂＡ／ＲＸＲ複合体が生成したが（図４Ｂ、レーン１１〜１６およびレーン２８〜３３）　、ＲＡＲ／ＲＸＲ複合体の場合は逆であった（図４８、レーン２〜８および１９〜２５を比較せよ）。ＲＡＲｓおよびＲＸＲｓとは対照的に、ｃ−ｅｒｂＡはモノマーとしてＴＲＥｐａｌに結合するように思われたが（図４８、レーン２７）、β−ＲＡＲＥには結合しなかった（レーン１０）。さらに、この推定ｃ−ｅｒｂＡモノマー複合体は、部分精製（図４Ｂ、レーン２８）または精製（レーン２９）ヒーラ細胞ＲＢＦ、インビトロ翻訳ｍＲＸＲ−ａ（レーン３１）またはＲＸＲａＥＲ（Ｆ）（レーン３２）の添加により、おそらくヘテロダイマー複合体に完全にシフトした。後者の複合体はＡｂＦ３　（レーン３３）によりスーパーシフトし、複合体中にｍＲＸＲαＥＲ（Ｆ）が存在することが確認された。まとめると、これら結果は、ｈＲＸＲ−βがヒーラ細胞ＴＲＡＰであることを強く示唆している。ｈＲＸＲ−βが確かにヒーラ細胞中に存在する主要なＴＲＡＰであるかどうかを決定するため、本発明者らはヒーラ細胞抽出物の精製を行い、同時にゲルシフトアッセイを用いてＲＢＦおよびＴＲＡＰ活性をモニターした。これら２つの活性は各クロマトグラフィ一工程の間に一緒に溶出され、本発明者らはヒーラ細胞中に別の有意のＴＲＡＰ活性の存在を示唆する証拠を認めることができなかった（データは示していない）。それゆえ、ヒーラ細胞のＴＲＡＰおよびＲＢＦ活性は同じもの、すなわち生としてｈＲＸＲ−βに対応すると思われる。

クラスら、Ｃｅ１ｌ　５９　：　６９７〜７０８　（１９８９）は、ｈＲＡＲ− ａおよびｈＴＲ−βがインビトロおよびインビボでヘテロダイマーを生成することを報告しこ。それゆえ、本発明者らは、βＲＡＲＥへのｈＲＡＲ−γとの協力的結合においてｃ−ｅｒｂＡがＲＸＲに置換し得るかもしれないと推定した。驚くべきことに、ｃ−ｅｒｂＡは、β−ＲＡＲＥ　（図４Ｂ、レーン４および１３）またはＴＲＥｐａｌ（レーン２１および３０）プローブのいずれにもｈＲＡＲ −γと協力的に結合しなかった。それゆえ、ｃ−ｅｒｂＡとＲＡＲ−γとがヘテロダイマーを生成するならば、この相互反応はあまりにも弱いので本発明のゲルシフトアッセイ条件を用いては認めることができないものである。対照的に、同一の条件下において、ＲＸＲはβ−ＲＡＲＥおよびＴＲＥｐａｌの両プローブ上でｃ−ｅｒｂＡまたはＲＡＲのいずれかと強くヘテロダイマーを生成した（図４Ｂ）。

培養中の細胞中で過剰発現されたｍＲＸＲは内生ＲＡＲｓの結合を促進するインビボ発現したＲＸＲが内生ＲＡＲｓと協力的に結合することを示すため、本発明者らは、β−ＲＡＲＥプローブ、およびｍＲＸＲ−α発現ベクターでトランスフェクションしたＣｏｓ細胞から調製した抽出物を用いてスーパーシフトゲル遅滞実験を行った。コントロールとして、親発現ベクターｐＳＧ５　（グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、　１６　：　３６９　（１９８８）　）でトランスフェクションした細胞から調製した抽出物も用いた。ｐＳＧ５トランスフェクション細胞から調製した抽出物を用いた場合は、ｈＲＡＲ−αに特異的な抗体（Ａｂ９α、レーン２）またはｈＲＡＲ−βに特異的な抗体（Ａｂ７β、レーン３）またはｈＲＡＲ−γに特異的な抗体（Ａｂ４γ、レーン４）の不在下（図８、レーン１）または存在下のいずれにおいてもβ−ＲＡＲＥ特異的な複合体を観察することはできなかった。しかしながら、ｍＲＸＲ−αトランスフェクション細胞から調製した抽出物を同じアッセイに用いた場合には、特異的な遅滞複合体が観察された（図８、レーン５、下の矢印）。興味深いことに、この複合体はＡｂ９α（レーン６）およびＡｂ４γ（レーン８）抗体（上の矢印）により部分的にスーパーソフトしたが、抗体Ａｂ７β（レーン７）によってはスーパーソフトしなかった。

Ａｂ９αおよびＡｂ４γを同時に添加（レーン１０）、または３つの抗体すべてを同時に添加すると（レーン１２）、複合体の完全なスーパーシフトが得られた。

同様の結果は、ｍＲＸＲ−βまたはｍＲＸＲ−γ発現ベクターをＣｏｓ細胞中にトランスフェクションすることによっても得られた（データは示していない）。

これら所見は、ＲＡＲ−αおよび−γ（ＲＡＲ−βはそうではない）、レチノイン酸の不在下で増殖させたＣｏｓ細胞中のｍＲＮＡ５の存在を示すノーザンプロットデータと一致する。それゆえ、過剰発現したＲＸＲｓはインビトロでβ−ＲＡＲＥへの内生Ｃｏｓ細胞ＲＡＲ−αおよび−γの協力的結合を促進する。さらに、これら結果は、トランスフェクションしたＲＸＲ１７）ＤＮＡ結合活性における内生ＲＡＲ−αおよび−７を直接意味しており、本発明の条件下において、ＲＡＲ−αおよびＲＡＲ−γがＲＸＲと安定なヘテロダイマーを生成し得る唯一のＣｏｓ細胞タンパク質であったことを示している。同様の観察は、ｍＲＸＲ− α発現ベクターでトランスフェクションしたヒーラおよびＣＶＩ細胞の抽出物を用いても認められた。

本発明の精製およびｃＤＮＡクローニングは、ＲＡＲｓおよびＴＲｓの応答要素（ＲＥｓ）への結合を促進するヒーラ細胞タンパク質が主としてｈＲＸＲ−βであることを示している。ｈＲＸＲ−αおよびγもヒーラ細胞中に存在するかもしれない。というのは、低レベルの対応転写物を検出することができ（データは示していない）、事実、３つのすべてのＲＸＲｓはＲＡＲまたはＴＲ結合を促進することができる。さらに、本発明者らの結果は、３つのＲＸＲタイプの促進活性が種々の発現系で過剰産生されたまたはインビトロで翻訳されたＲＡＲｓに限られないことを明らかに示している。というのは、Ｃｏｓ、ヒーラおよびＣＶＩ細胞で産生されたＲＸＲｓはこれら細胞中に存在するＲＡＲｓ　（αおよびγ）の結合を有効に刺激するからである。本発明者らのデータはまた、これら内生ＲＡＲｓが、過剰発現されたＲＸＲとともにβ−ＲＡＲＥ上で安定なヘテロダイマー複合体を生成し得る唯一のタンパク質であることを示している（図８、データは示していない）。このことは、ＲＸＲｓが、ビタミンＤ３レセプター（ＶＤＲ）のその標的配列への有効な結合に必要な因子にも対応するというありそうな可能性を規定するものではない（リアオ（Ｌ　１ａｏ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８７：９７５１〜９７５５　（１９９０）；ダーリング（Ｄａｒｌｉｎｇ）ら、Ｍｏｌ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　５　：　７３−８４　（１９９１）　）。

交差実験は、別の少数の５５ｋＤａ　ＲＢＦ種がヒーラ細胞中に存在する可能性（これはＲＸＲ−αまたは一層などの他のＲＸＲに対応するかもしれない、上記参照）および４５ｋＤａのみかけのＭＷを有する多数のＲＢＦ種力用Ｌ６０核抽出物中に存在する可能性（グラスら、Ｃｅ１ｌ　６３　：　７２９〜７３８　（１９９０））を示した。レイザーら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１１　：　５００５〜５０１５　（１９９１）はまた、ＴＲＤＮＡ結合を促進する４２ｋＤａ肝臓タンパク質を記載している。このタンパク質および上［１ｅ４５ｋＤａ　ＨＬ６０細胞タンパク質がＲＸＲｓに対応することはありそうもないように思われる。というのは、記載されたすべてのＲＸＲｓは〜４８〜５６ｋＤａの範囲であり、すべてタンパク質ゲル上ではさらに大きなみかけのＭＷで移動するからである（本発明者らの未刊行の結果）。これら小さなタンパク質がＲＡＲ／ＴＲ結合タンパク質の別のクラスに属するのか、あるいはＲＡＲｓに起こるもの（カスドナーら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

１］５Ａ８７：２７００〜２７０４　（１９９０）；レロイら、ＥＭＢＯＪ、１０　：　５９〜６９　（１９９１ｂ）：ゼレントら、ＥＭＢＯＪ、１０ニア１〜８１（１９９１））と類似した別のスプライシング事象または人工的なタンパク質分解から得られる末端欠失ＲＸＲ形に対応するのかどうかを決定するため、ＲＸＲｓに対する抗体を用いることが必要であろう。

警（べきことに、本発明者らは、スボドブテラ・フルジペルダＳｆ９およびドロソフィラ・ンユナイダ−８２の両細胞の抽出物中に強いＲＢＦ活性を認めた（図ＩＣ）。これら抽出物は、昆虫からヒトにいたるまで保存され同様に促進した。

ヤング（Ｙａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳ＾８８　：　３５５９〜３５６３　（１９９１）もまたＳ２細胞抽出物のＲＢＦ活性を言及している。ドロソフィラのウルトラスビラクレ（ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ）　（ｕ　ｓ　ｐ　）タンパク質（オロら、Ｎａｔｕｒｅ　３４７　：　２９８〜３０１　（１９９０））はＲＸＲと関係している（ＤＮＡおよびリガンド結合ドメインにおいて、それぞれ８６％および４９％の配列類似性）。Ｓ２およびＳｆ９細胞ＲＢＦおよびＴＲ結合活性がｕｓｐタンパク質およびそのＳｆ９類似体に対応するのかどうかについては、いまだ確立されていない。しかしながら、本発明者らの結果は、核レセプタースーパーファミリー（たとえば、エクジソンレセプター、ＥｃＲ，文献としてはケレ（Ｋｏｅｌｌｅ）ら、Ｃｅ１１６７５９〜７７　（１９９１）；セグラベス（Ｓｅｇｒａｖｅｓ）　、Ｃｅ１ｌ　６７　：　２２５〜２２８（１，９９１）参照）のドロソフィラ成員が５２−細胞ＲＢＦのパートナ−であり得る可能性を提示している。それゆえ、核レセプターファミリーの成員間の相互反応が昆虫およびを推動物の分岐に先立つ可能性がある。ＲＡＲ／ＲＸＲおよびＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマーは、対応するホモダイマーよりもＲＡＲＥおよびＴＲＥに一層強く結合する。本発明のゲルシフトアッセイ条件（１５０ｍＭＫＣｌ、室温、レセプターの制御８ａ度）下では、本発明者らは、「安定化」抗体の存在下においてさえも単１ｔｆＲＡＲまたはＲＸＲのＤＮＡ結合は極めてわずかしか観察されず、すべての場合において、ＲＡＲ／ＲＸＲおよびＴＲ／ＲＸＲの組み合わせは個々のレセプターよりもＲＡＲＥおよびＴＲＥｐａｌにはるかに有効に結合した。交差および同時免疫沈降実験は、ＲＡＲおよびＲＸＲがへテロダイマーとして結合することを示した（図５）。ＲＡＲ／ＲＸＲ−ＲＥ複合体およびＴＲ／ＲＸＲ−ＲＥ複合体はゲルシフトアッセイにおいて同様に移動するので、本発明者らはＴＲおよびＲＸＲもまたへテロダイマーとして結合したと推論する。

本発明者らの結果は、インビトロにおけるＲＡＲ−ＲＡＲＥ複合体の生成を報告した幾つかのグループの結果と明らかに矛盾する（グラスら、Ｃｅ１ｌ　５９　：　６９７〜７０８　（１９８９）；グラスら、Ｃｅ１ｌ　６３ニア２９〜７３８（１９９０）；ダーリングら、Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、５　：　７３〜８４　（１９９１）　）。ニー０）不一致は、少な（とも一部は、これらグループがアビジン−ビオチン複合体ＤＮＡ結合（ＡＢＣＤ）アッセイを採用していることに帰することができる。このアッセイは、ゲルシフトアッセイに比べて、弱いタンパク質ＤＮＡ相互反応を確かに検出することができる。というのは、前者のアッセイにおいては遊離および複合体のＤＮＡの分離条件がはるかに劇的でないがらである。加えて、ＡＢＣＤアッセイは、通常、本発明の研究に用いた１５０ｍＭＫＣｌのような一層生理学的な条件でなく５０ｍＭＮａＣｌで行われる。実際、一層高い濃度のレセプターを用い、結合反応中のイオン強度を低くすればゲルシフトアッセイによってもβ−ＲＡＲＥまたはＴＲＥｐａｌプローブ上のＲＡＲおよびＲＸＲポモダイマー複合体の生成を検出することができる（Ｓ、Ｍ、ら、準備中の原稿、ＲＡＲ結合に関してはマンゲルスドルフら、Ｃｅ１ｌ　６６　：　５５５〜５６１　（１９９１）およびヤングら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾８８　：　３５５９〜３５６３　（１９９１）　、およびＴＲ結合に関してはビーブ（Ｂ　ｅｅｂｅ）ら、Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　５　；　８５〜９３　（１９９１）をも参照）。にもかかわらず、ゲルシフトおよびＡＢＣＤアッセイは定性的には同様の結果が得られる。というのは、５０ｍＭＮａＣｌでＡＢＣＤアッセイを用いると、単離ＲＡＲのアフィニティーはＴＲＥｐａｌに対するよりもβ−ＲＡＲＥに対する方がはるかに高いことが認められたが、このことは図４Ａに示す本発明者らのゲルシフトアッセイと一致するからである（レーン１８および３４を比較せよ）。さらに、これら著者らは、ヒーラ細胞核抽出物の添加はβ−ＲＡＲＥへのＲＡＲの相対的アフィニティーを〜１５倍増加させるが、一方、本発明者らはＲＸＲの存在下でゲルソフトアッセイを用いてアフィニティーの〜４０〜５０倍の増加を認めた（データは示していない）。

溶液中でダイマーとして存在する（リンスチット（Ｌ　１ｎｓｔｅｄｔ）ら、Ｊ　、　Ｓ　ｉｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ、２４　：６７７〜６８６（１９８６）；スヵフ７　（Ｓｋａｆａｒ）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ３０：６１４８〜６１５４　（１９９１））ステロイドホルモンレセプター（とりわけニストロジエンレセプター（ＥＲ））とは対照的に、ＲＡＲ，ＴＲおよびＲＸＲは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは速度遠心分離のいずれかを用い、溶液中でモノマーとして存在することが示された（バールマン（Ｐｅｒｌｍａｎ）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５７＋９３０−９３８　（１９８２）：ネルビ（Ｎｅｒｖｉ）ら、ＰｒｏｃＮａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８６　：　５８５４〜５８５８　（１９８９）　；および本発明者らの現在のおよび未刊行の結果）。それゆえ、観察されるＲＡＲまたはＴＲのいずＪｌかとのＲＸＲの協力的結合は２つの区別される機構により起こる。モノマーはＲ，Ｅの各モチーフに独立に結合しくＴＲが明らかに結合するように、レイザーら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、１１　：　５００５〜５０１５　（１９９１）；フォーマンら、Ｇｅｎｅ　１０５　：　９〜］　５　（１９９１）；および図４Ｂ参照）、この結合は、ホモダイマー相互反応よりも一層安定なヘテロダイマー相互反応により安定化される。

または、不安定なヘテロダイマー（ホモダイマーではなく）が溶液中に生成し、この相互反応がＤＮＡ結合によりさらに安定化されるかもしれない。後者の可能性は、有意の交差ホモダイマーが検出されない条件下でＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーが溶液中で交差され得るという本発明者らの観察により支持される（図５）。

さらに、ＲＥが存在すると交差へテロダイマーはわずかに増加したが、交差ホモダイマーはそれてもほとんど生成されなかった。それゆえ、不安定なＲＸＲ／ＲＡＲダ・イマ−（おそら＜ＲＸＲ／ＴＲダイマーも）が溶液中に存在し、ＲＥに結合することによりヘテロダイマー相互反応がさらに安定化される。この観点において、レイザーら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．Ｂｊｏｌ、　１１　：　５００５〜５０１５　（１９９１）は、ＴＲホモダイマーを観察することのできない条件下でＴＲが４２ｋＤａ肝臓タンパク質とへテロダイマーを生成するかもしれないことを報告している。同様に、グラスら、Ｃｅ１ｌ　６３　：　７２９−７３８　（１９９０）は、ＲＡＲホモダイマーを検出することができない条件下でＲＡＲが５５ｋＤａヒーラ細胞タンノ＜り質とヘテロダイマーを生成するかもしれないことを示している。

ダイマー生成界面および異なる応答要素へのホモダイマーおよびヘテロダイマーの結合効率ダイマー生成ドメインはニストロジエン（クマール（Ｋ　ｕｍａｒ）ら、Ｃｅ１ｌ　５５　：１４５〜１５６　（１９８８）　）およびプロジェステロン（ギオチョンーマンテル（Ｇｕｉｏｃｈｏｎ−Ｍａｎｔｅｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６　：　６９５〜６９８　（１９８８））レセプターのりガント結合ドメイン（ＬＢＤ、領域Ｅ）と関係していることがわかっている。ダイマー生成に重要なアミノ酸は、ＥＲＬＢＤのＣ末端領域中に同定されている（ファウエルら、Ｃｅ１ｌ　６０　：　９５３〜９６２　（１９９０）；図９参照）。７オー？ンら、Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、４　：　１２９３〜１３０１　（１９９０）は、ＴＲ５ＲＡＲおよびＶＤＲのＬＢＤが９つの７アミノ酸繰り返しからなるダイマー生成ドメインを含有しており、その際、疎水性アミノ酸が該繰り返しの１位および８位に存在し、疎水性アミノ酸または疎水性側鎖を有する荷電アミノ酸（ＡｒｇＳＧｌｕ）が第５位に存在し、それゆえα−へリックスの一方の側でダイマー生成界面を生成していることを提唱している。ＲＸＲヘブタド９の欠失（フォーマンら、Ｍｏ１．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、４　：　１２９３〜１３０１　（１９９０）　）により、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーは生成されなくなった（図６ＢのｍＲＸＲ−αΔ４２３−４６６　；配列については図２および図９参照）。ヘブタド９をも欠失させる大きな末端欠失（図６ＡのｈＲＡＲ−γΔ２７０− ４５４）　、並びにこのヘプタドにおける点変異（Ｍ、　Ｓ、、未刊行の結果）によっても、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーが同様に生成されなくなった。対応ＥＲヘブタド中の点変異によってもまた、ＥＲダイマー生成がなくなった（ファウエルら、Ｃｅ１ｌ　６０　：　９５３〜９６２　（１９９０）’　：図９参照）。ヘブタド１〜８もまたＲＡＲ／ＲＸＲダイマー生成に貢献するのかどうかは今後に残された課題である。

明らかに、ＲＡＲ，ＴＲおよびＲＸＲのへプタド繰り返しが関係しているとしても、これらレセプターのダイマー生成界面に相違があるに違いなく、その結果、ＲＡＲ，ＴＲおよびＲＸＲホモダイマーまたはＲＡＲ／ＴＲヘテロダイマーに比べて一層強いＲＡＲ／ＲＸＲおよびＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマーとなる。ＲＡＲｌＴＲおよびＥｃＲにおけるスレオニンの代わりに、ＲＸＲｓの推定ヘブタド繰り返し９にはプロリン残基が存在することに注意すべきである（図９）。それゆえ、ＲＸＲヘブタド繰り返し９はＲＸＲ−αの４２０〜４２７位および／または４３５〜４４２位に位置する残基に対応するのが一層ありそうなことである（図９）。

この観点において、ＲＸＲｓは多（の哺乳動物およびドロソフィラ・オーファンレセプターと類似している（図９）。興味深いことに、ｃＴＲ−α１ヘブタド９に先行するＰｒｏ残基に影響を及ぼす変異により、このレセプターがインビトロでダイマー生成する能力は失われる（セルミ（Ｓ　ｅｌｍｉ）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　２６６・１１５８９〜１１５９３　（１９９１）　）。上記類似性は、一つのクラスの成員は同じクラス間に比べて他のクラスの成員と一層有効にヘテロダイマーを生成するような、核レセプターの別々のクラスが存在する可能性を提示している。

ステロイドホルモンレセプターのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）には別の弱いダイマー生成ドメインが含まれ（クマールら、Ｃｅ１ｌ　５５　：１４５〜１５６　（１９８８）ＬこれはＮＭＲおよびＸ線結晶解析研究により第二のＤＮＡ結合ジンクフィンガー中に位置付けられている（シュワーべら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｃｉ。

１１６　：　２９１〜２９６　（１９９１）；ルイジ（Ｌｕｉｓｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　３５２　：４９７〜５０５　（１９９１）；およびその中に引用されている文献）。類似のドメインはＲＡＲの場合にも存在するかもしれない。というのは、大腸菌で発現されたＲＡＲＤＢＤは低イオン強度において野生型のβ−ＲＡＲＥにダイマーとして結合し、また；、はるかに低い親和性ではあるが、直行繰り返しモチーフの一つ変異を起こしたβ−ＲＡＲＥにもモノマーとして結合するからである（Ｓ、　Ｍら、準備中）。しかしながら、得られたＤＢＤダイマー複合体の安定性は、完全長のＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーの安定性に比べるとはるかに低い。ＲＸＲＤＢＤ中にも弱いダイマー生成ドメインが存在するかどうか、およびＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーの生成にＲＡＲおよびＲＸＲの第二のジンクフィンガー間の相互反応が関与しているかどうかは、まだわかっていない。

本発明者らの観察のいくつかは、ＲＡＲ，ＴＲおよびＲＸＲホモおよびヘテロダイマー結合の効率が、ＲＥを構成している繰り返しモチーフの正確な配置（方向およびスペースノに依存することを示している。このことは、第一のジンクフィンガーに変異を起こしたＲＡＲおよびＲＸＲの場合において劇的に説明される（図６および７）。このＲＸＲフィンガーの完全さは、ＴＲＥｐａｌへのＲＡＲ／ＲＸＲ協力的結合およびモチーフがｌｂｐ離れている要素（β−ＲＡＲＥＩ）への結合には必要であったが、５ｂｐ離れているβ−ＲＡＲＥへの結合には必要ではなかった。極めて対照的に、第一のＲＡＲフィンガーにおける変異によって３つのすべての要素への結合はなくなった。それゆえ、第一のフィンガー中の同じ変異により、ＲＡＲ（ＲＸＲでない）がＤＮＡへ結合する能力は完全に失われた。

残るＲＸＲＤＮＡ結合は、ＲＡＲ／ＲＸＲダイマー相互反応と一緒になって、β −ＲＡＲＥとのＲＡＲ／ＲＸＲ複合体の視覚化を可能とするのに充分であるが、２つのモチーフがｌｂｐ離れているかまたは逆行している（ＴＲＥｐａ　Ｉ）ＲＥＳとではそうではなかった。その理由は、おそらく、これら後者のモチーフの配置はＲＡＲおよびＲＸＲのダイマー生成界面間の相互反応を減少させるからである。この解釈と一致して、本発明者らは、野性型のＲＡＲ／ＲＸＲダイマーが β−ＲＡＲＥに比べてβ−ＲＡＲＥＩ　（図７）およびＴＲＥｐａｌ　（図４Ｂ）の両方に対して低い有効性で協力的に結合することに注目する。異なる仕方で配置されたモチーフ上でのＲＸＲ／ＲＡＲダイマー生成においてもＬＢＤの同じヘブタド繰り返しくおよび、それゆえ同じダイマー生成界面）が関与しているがどうかを調べること、および各場合において、おそら＜ＤＢＤ相互反応の結果として生じるダイマー生成界面の可能な貢献度を決定することは興味あることであろう。

同様の研究はまた、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーとは対照的に、ＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマーが何故β−ＲＡＲＥよりもＴＲＥｐａｌに一層良好に結合するのかをも明らかにするかもしれない（図４Ｂ）。

ＲＡＲＳＲＸＲおよびＴＲホモダイマーの一層弱い特異的ＤＮＡ結合はまた、ＲＥｓの性質により調節される（図４および７参照）。これら特異なホモダイマー結合にＤＢＤおよびＬＢＤダイマー生成ドメインが関与するのかどうか、およびいかに関与するのか、また、いまだ特徴付けられていない幾つかの標的配列において、ＲＡＲおよびＲＸＲホモダイマーの結合有効性がＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーで現在達成されているレベルに達することができるのかどうかは、将来の研究により確立されるであろう。核レセプターシグナル経路の収束（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ）による高度に多面的な効果の生成についての含意。

ＲＡＲ（ルバート（Ｒｕｂｅｒｔｅ）ら、Ｓｅｍ１ｎａｒｓ　ｉｎ　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　２　：　１５３〜１５９　（１９９１ａ）およびその中に引用されている文献）およびＴＲ（ヤオイタ（Ｙａｏｉｔａ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８７　：　７０９０〜７０９４　（１９９０））の両方のファミリーが複数の成員（タイプ）からなり、それぞれが別々の遺伝子（その主要な転写物が特異にスプライシングして複数の進化的に保存されたイソ形を生成する）によってコードされるという所見は、対応リガンド（とりわけＲＡ）の高度の多面的効果が、少なくとも一部、複数のレセプタータイプおよびそのイソ形の機能的特異性により説明することができるという推測に導いた。さらに、転写因子間でのへテロダイマーの生成が、限られた数の制御タンノ々り質との転写制御の増大する多様性の生成にとって重要であることがますます明らかになっている（概観のため、ラム（Ｌａｍｂ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｎ、　Ｓｅｔ、　１６　：４１７〜４２２　（１９９１）参照）。たとえば、トランス−レギュレーターのロイシンジッパ−クラスにおいて、Ｊｕｎ／ＦｏｓおよびＡＴＦ／ＣＲＥＢファミリーの複数の成員がホモダイマーおよびヘテロダイマーを生成することができ、生成したホモダイマーおよびヘテロダイマーは異なる転写活性を示すかもしれない（アバテ（Ａ　ｂａｔｅ）ら、５ｅＩＩｌｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｌ、　１　：１９〜２６　（１９９０）、ナカベップ（Ｎ　ａｋａｂｅｐｐｕ）ら、Ｃｅ１ｌ　６４　：　７５１〜７５９　（１９９１）；ハイ（Ｈａｉ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８８　：　３７２０〜３７２４　（１９９１）、およびその中に引用されている文献）。トランス−レギュレーターの多様性の生成にヘテロダイマー生成が重要であることは塩基性へ１ルックス−ルーブーへり。

クス（ｂＨＬＨ）タンパク質の場合（最も著しくは筋原ＨＬＨ因子の場合口こも顕著に説明される（ワイントララブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ　２５１　：　７６１〜７６６　（１９９１）：ラサー（Ｌａｓｓａｒ）ら、Ｃｅ１ｌ　６６　：　３０５〜３１５（１９９１）；サン（Ｓ　ｕｎ）ら、Ｃｅ１ｌ　６４　：　４５９〜４７０（１９９１）；ベネズラ（Ｂ　ｅｎｅｚｒａ）ら、Ｃｅ１ｌ　６１　：　４９〜５９　（１９９０）；サンら、Ｍｏ１ｅｃ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、１１　：　５６０３〜５６１１　（１９９１）およびその中に引用されている文献）。ＲＡＲ／ＲＸＲおよびＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマーの生成も同様に、ＲＡおよび甲状腺ホルモンへの転写応答における増大する多様性の生成の原因であるのであろうか？。簡単のため、またＴＲはＲＡＲまたはＲＸＲのいずれよりもモノマーとしてはるかに効率的に結合することができるように思われるので、以下の論議は主としてＲＡＲ／ＲＸＲの組に限ることにする。

ＲＡＲ−α、βおよびγの各イソ形とＲＸＲイソ形のいずれかとの可能な組み合わせは、明らかに多数のへテロダイマーを生成し、これらヘテロダイマーは種々のレベルの転写活性化プロセスにおいて特定の機能を発揮している可能性がある。ＤＮＡ結合のレベルにおいては、本発明のアッセイ条件下において本発明者らは種々のセットのＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーの種々の標的配列への結合についていかなる優勢な結合も観察しなかったが、特定のプロモーターに結合した他のタンパク質に関しては特定のＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーが特定の標的配列に対して高い親和性を有しているかもしれない。この観点において、ＲＡ応答要素が繰り返しモチーフの実際の配列、方向およびスペースにおいて多様性を増大していると思われること（バノオス（Ｖａｓｉｏｓ）ら、ＥＭＢＯＪ、１０：１１４９〜１１５８　（１９９１）およびレロイら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ８８　：１０１３８〜１０１４２　（１９９１ａ））　、および複数のＲＡＲおよびＲＸＲタイプおよびイソ形が種間において高度に保存されていることは注目すべきである。

転写活性化プロセスのレベルにおいては、ヘテロダイマーにおけるＲＡＲおよびＲＸＲ転写活性化機能（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）　（ＴＡＦｓ）の組み合わせは、特定のプロモーターからＲＮＡ合成の開始を引き起こす複数のタンパク質の相互反応における一層の多様性を生じさせるかもしれない。リガンド依存ＴＡＦｓは、ＲＡＲｓおよびＲＸＲｓの両方のＬＢＤｓ　（Ｅ領域）中に位置することが示されている（Ｍ、Ｓ、およびＰＣｌ、未刊行の結果）。加えて、ＲＡＲｓのＮ末端Ａ／Ｂ領域（イソ形特異的である）は、幾つかのＲＡ応答性プロモーターからの有効な転写活性化に必要な調節機能を有していると思われる（ナグバル（Ｎａｇｐａｌ）ら、Ｃｅ１ｌ　７０　：１００７〜１０１９　（１９９２）：ＲＸＲＡ／Ｂ領域の可能な役割に関してはいまだデータが得られていない）。それゆえ、複数のＲＡＲおよびＲＸＲタイプおよびイソ形が概念的には多数の特定のへテロダイマーの生成を可能にし、これら特定のヘテロダイマーのそれぞれが特定の転写特性を有しているかもしれない。興味深いことに、ＲＸＲＴＡＦｓを活性化する天然のりガント（ＲＸ）は、ＲＡの新規な立体異性体であると思われる（グリツボ（ＪＦ　、　Ｇ　ｒｉｐｐｏ）およびレビン（Ａ、　Ａ、　Ｌｅｖｉｎ）　、個人的な情報）。それゆえ、所定の細胞内での特定の応答プロモーターからの転写の活性化へのＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーの貢献は、転写機構へのＲＡＲおよびＲＸＲＴＡＦｓのカップリングの原因である、ＲＡＲ，ＲＸＲ，ＲＡおよびＲＸ、および細胞特異的な転写仲介因子の実際の濃度に依存するかもしれない（タセット（Ｔａｓｓｅｔ）ら、Ｃｅ１１６２：１１７７〜１１８７　（１９９０）　、およびその中に引用されている文献）。

これら分子の幾つかの濃度の小さな変化の組み合わせにより、転写活性の有意な差異が生じ、この差異が発達過程におけるパターン生成に特に重要であるかもしれない。Ｆｏｓ／Ｊｕｎホモおよびヘテロダイマーの場合について最近観察されたこと（ケルポラ（Ｋｅｒｐｐｏｌａ）ら、Ｃｅ１ｌ　６６　：　３１７−３２６（１９９１ａ）；ケルポラら、Ｃｅ１ｌ　６６　：　３１７−３２６　（１９９１ｂ））の類推により、特定の標的配列に結合した所定のＲＡＲ／ＲＸ、ＲヘテロダイマーはＤＮＡを特定に方向に曲げ、ＤＮＡループ形成により起こる（概観のため、ブタシュン（Ｐ　ｔａｓｈｎｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３４６　：　３２９〜３３１　（１９９０）を参照）ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーと対応プロモーターに結合した因子との間での相互反応を命すると考えたくなる。そのような可能性は、種々の応答要素において観察されている反対の転写効果（活性化および抑制）を説明するかもしれない（ナールら、Ｃｅ１ｌ　６５　：１２６７〜１２７９（１，９９１）およびその中に引用されている文献）。リガンド結合ドメイン、トランス活性化ドメインおよびダイマー生成ドメインが同じ領域中に重複していることはまた、何故、応答要素に依存して、同じレセプターで転写のりガント依存的活性化またはりガント独立的抑制を逆説的に観察することができるのかを説明するかもしれない（ナールら、Ｃｅ１ｌ　６５　：１２６７〜１２７９　（１９９１））。実際、ヘブタド繰り返しダイマー生成界面、それゆえＤＮＡの曲がりおよびトランス活性化ドメインのフンホメーション両方は、異なる標的配列で異なるかもしれない。

発達の種々の段階におけるマウス胚および成体組織中におけるＲＸＲｓの低レベルでの広い分布（マンゲルスドルフら、Ｎａｔｕｒｅ　３４５　：　２２４〜２２９　（１９９０）および本発明者らの未刊行の結果）、および３つのＲＡＲｓの発現の一層制限されたパターン（ルベルトら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｌｌｌ　：４５〜６０　（１９９１ｂ））は、ＲＸＲｓがｂＨＬＨ因子の場合におけるＥ４７およびＥ１２タンパク質の役割と類似の役割を担っているという興味深い可能性を提示する。ワイントラウプおよび彼の共同研究者であるラサーら（ラサーら、Ｃｅ１１６６・３０５〜３１５　（１９９１））により提唱されているように、そのようなヘテロダイマーの協力、および限られた共通に必要なｒ３ＮＡ結合パートナ−に対する競合は、発達過程における相互排他的「決定」をなすための機構および胚発生の初期段階において特に重要な限界転写応答を生成するための機能の両方を提供する。この観点において、限られたＲＸＲに対するＲＡＲｓ、ＴＲｓおよびおそらく核レセプターの同じサブクラスの他の成員（ＶＤＲまたはベルオキシソームブロリファレーター活性化レセプター（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）　（イッセマン（Ｉ　ｓｓｅｍａｎｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３４７：６４５〜６５０　（１９９０））など）間の競合は、最も広（分布していないレセプターの機能を妨害し、特定のリガンドに対する細胞応答性を調節するかもしれない。実際、高レベルのＴＲ発現がＲＡＲ活性を抑制し得ること（グラウブナー（Ｇ　ｒａｕｐｎｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３４０　：　６５３〜６５６　（１９８９）：ハドソン（Ｈｕｄｓｏｎ）ら、Ｃｅ１１６２　：１１６５〜１１．７５　（１９９０））はＲＸＲに対する競合に対応するかもしれない。同様に、本発明者らは、ＲＸＲｓがＴＲＥｐａｌへのｖ−ｅｒｂＡの結合を促進し得ることを観察したが（未刊行の結果）、このことは、少なくとも部分的に、転写活性に対するｖ−ｅｒｂＡの陰性のトランスドミナント効果（ダム（Ｄａｍｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３３９　：５９３〜５９７　（１９８９）；サブ（Ｓ　ａｐ）ら、Ｎａｔｕｒｅ４０　：２４２−２４４　（１９８９）；ディゼラ（ｐｉｓｅｌａ）　ら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　５　：　２Ｑ３３〜２０４７　（１９９１））を説明しており、また、ＲＸＲｓを封鎖することにより、ｖ−ｅｒｂＡがＲＡＲ機能に対して同様の陰性効果を奏する可能性を示唆している（ジャリフら、Ｃｅ１１６６　：　８８５＋−８９３（１９９１）およびドウボア（Ｄｅｓｂｏｉｓ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６　：　２１２９〜２１３５　（１９９１，））　。同様に、ｔ（１５；１７）転座の結果起こるキメラ融合ＭｙｌＲＡＲタンパク質の蓄積を特徴とする急性前骨髄球性白血病（Ａ　Ｐ　Ｌ）において起こる前骨髄球分化における抑制（カキズカ（Ｋａｋｉｚｕｋａ）ら、Ｃｅ１ｌ　６６　：　６６８〜６７４　（１９９１）、カスドナーら、ＥＭＢＯＪ、（１９９２、出版中）：バンドルフイ（Ｐａｎｄｏｉｆｉ）　ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６　：１２８５〜１２９２　（１，９９１）；　ド・テら、Ｃｅ１ｌ　６６：６７５〜６８４　（１９９１））が、ＭｙｌＲＡＲｌ：よるＲＸＲ（７）封鎖と関係があるかもしれない。また、ＥｃＲと同じレセプターサブクラスに属する初期エクジソン応答遺伝子Ｅ７５（ケルら、Ｃｅ１ｌ　６７：５９−７７　（１９９１）１セグレープ、Ｃｅ１ｌ　６７：２２５〜２２８　（１９９１））は、ＥｃＲと同じパートナ−とダイマーを生成し、それによって同時に後期応答を引き起こしながら最初のエクジソン応答を不活化すると考えたくなる。

本発明者らが本発明のインビトロ研究で観察したヘテロダイマー相互反応が、インビボにおける標的遺伝子のプロモーター上での２つのレチノイドシグナル経路の組み合わせ収束（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ）にどの程度対応するかを調べるため、培養細胞およびマウスにおける複数のＲＡＲおよびＲＸＲ遺伝子の発現をさせなくする（たとえば、ＥＳ細胞における相同組換えにより）遺伝子研究が必要であろう。同様の研究はまた、レチノイドおよび甲状腺ホルモンシグナル経路がインビボにおいてどの程度収束しているのか、もっと一般的には、各レセプターサブファミリーの他の成員（多くのみなしごレセプターを含む）間の同様のへテロダイマー相互反応が、核レセプターシグナル経路による遺伝子発現の制御に関与しているのかどうかも明らかにするであろう。

組換えワクシニアウィルス発現ベクターの構築、これらベクターによるヒーラ細胞の感染、これら細胞からの核抽出物の調製は、すでに記載されているにコルソンら、ＥＭＢＯＪ、９　：　４４４３〜４４５４　（１９９０））。

ｒＢＶ発現ベクターの構築およびｒＢＶ感染ＳＦ９細胞からのＷＣＥの調製はどこかに記載されつつある（チェノ（Ｃｈｅｎ）ら、準備中の原稿）。

ｈＲＡＲ−７のＢａｍＨＩ断片にコルソンら、ＥＭＢＯＪ、９　：　４４４３− ４４５４　（１９９０）　）をｐＥｔ３ａ　（スタブイア（Ｓ　ｔｕｄｉｅｒ）より贈与（スタブイアら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１８５　：　６０〜８９　（１９９１）　）　）のＢａｍＨ１部位に挿入してｐ　Ｅ　ｔ　ＲＡＲγを調製した。このＩＰＴＧ誘発性原核発現ベクターは、完全長のｈＲＡＲ−γのアミノ末端アミノ酸に融合した親ベクターからの１４アミノ酸からなる融合タンパク質をコードしている。細菌発現ｈＲＡＲ−７を製造するため、１０μｇのｐＥｔＲＡＲ７を用いて大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓｓ株をトランスフオームし、トランスフォーマントを０．１μｇ／ｍ＋アンピシリンおよび３３μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する培地中、３７℃にて一夜増殖させた。ついで、培養液を１０倍に希釈し、０．６〜１゜０のＯＤ　ｓ　ｅ　ｏまで増殖させ、この時点でＩＰＴＧを０．４ｍＭの最終濃度で加え、細胞をさらに２時間増殖させた。ついで、細胞を遠心分離により回収し、溶解緩衝液（５０ｍＭトリフ、−ＨＣｌ　ｐＨ７，８，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ。

１０μＭＺｎｃ１ｚ、４００ｍＭＫＣｌおよび１０％グリセリン）中の最初の培養容量の１％中に再懸濁し、２回の凍結−解凍サイクルにより溶解し、ついで超音波の短いパルスによりＤＮＡを切断した。細菌ホモジネートをベックマンウルトラ遠心分離（ＳＷ６００−ター、５５．０００ｐｍ　２℃で１時間）で遠心分離し、上澄み液を回収し、アリコートし、液体窒素中で凍結し、−８０℃で貯蔵した。

インビトロで翻訳されたタンパク質を産生ずるため、完全長のＲＡＲ（ブランド（Ｂ　ｒａｎｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３３２　：　８５０〜８５３　（１９８８）：クルストら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８６　：　５３１０〜５３１４　（１９８９）　）　、ＲＸＲ（下記参照）およびｃ−ｅｒｂＡ（ペンストレーム（ＶｅｎｎｓｔｒＱａ＋）　（サブら、Ｎａｔｕｒｅ３４・６３５〜６４０　（１９８６））より贈与）発現ベクターを適当な制限酵素で終止コドンの３′側で直線状にした。ついで、製造業者（プロメガ）の指示に従い、ウサギ網状赤血球溶解液を用い、直線状にしたｃＤＮＡｓを転写および翻訳した。

ＲＡＲおよびＲＸＲ変異体の構築ＲＡＲおよびＲＸＲのすべての３°欠失変異体を未成熟終止コドンのＰＣＲ導入により構築した。しかしながら、２つのＲＡＲ欠失変異体であるｈＲＡＲ−γΔ ２７０−４５４およびｈＲＡＲ−γΔ１８８−４５４は、それぞれＥｃｏＲＶおよび５ａｃ１部位で直線状にしたｈＲＡＲ−γ発現ベクターのインビトロ転写および翻訳により産生じた。ｈＲＡＲ−γΔＡＢの構築は、ｈＲＡＲ−γドメインＣ−Ｆに対応する断片であって、ＢａｍＨ１部位、好ましい翻訳開始配列および該断片の５″末端にＡＴＧ　（ＧＧＡＴＣＣＡＣＣΔ工旦ＴＧＣ・・・）を含有する断片のＰＣＲ増幅により行った。ついで、この断片をｐＳＧ５　（グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１６　：　３６９　（１９８８）　）のＢａｍＨ１部位にサブクローニングした。

一本ｌＤＮＡの生成および標準手順によりｈＲＡＲ−γおよびｍＲＸＲ−α中にシスティン点変異を生成させた。ｈＲＡＲ−γΔＣ４およびｍＲＸＲ−αΔＣ４において、第一のジンクフィンガーの第四番目のシスティンをコードするＴＧＣコドンをアラニンのＧＣＣに変えた。すべての場合において、ＲＡＲおよびＲＸＲ変異の真正さが配列分析、ウェスタンブロッティング（ＲＡＲ変異）　、［” ＳＦメチオニンの存在下でのインビトロ翻訳により、および幾つかのＰＣＲ変異体の場合は複数のクローンの単離および試験により確認された。

ゲル遅滞実験ゲル遅滞実験（抗体スーパーシフトアッセイを含む）は、すでに記載されたのと同様であったにコルソンら、ＥＭＢＯＪ、９　：　４４４３〜４４５４　（１９９０）：およびスミスら、ＥＭＢＯＪ、１０　：　２２２３〜２２３０　（１９９１））。

抗ｈＲＡＲ−γ抗体（Ａｂ４γ）は、すでに記載されている（ロシエットーエグリー（Ｒｏｃｈｅｔｔｅ　−Ｅｇｌｙ）　ら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１１５　：　５３５〜５４５　（１９９１））、抗ｈＲＡＲ−ａ　（Ａｂ９ａ）および抗ｈＲＡＲ−β（Ａｂ７β）抗体は、どこかに記載されるであろう（ガウブ（Ｇ　ａｕｂ）ら、準備中の原稿）。抗ｈＥＲ（Ｆ）抗体（ＡｂＦ３）の記載もまた、どこかに刊行されるであろう（メツガー（Ｍｅｔｚｇｅｒ）ら、準備中の原稿）。異なる採取源から得たＲＡＲγを用いた（すなわち、インビトロ翻訳における、ｒ　Ｖ　Ｖ　Ｓｒ　Ｂ　Ｖ　ｓ大腸菌）実験のためには、ウェスタンプロットによりレセプターレベルをｒＶＶのものに標準化したつこのＲＡＲγの量は、これら実験およびこのレポートに記載する他のすべての実験において、アッセイ当たり約１０フイコモルのレセプターに対応する（　［３Ｈ］レチノイン酸結合により決定）。ＲＡＲおよびＲＸＲサブタイプおよび欠失変異体を比較するゲル遅滞実験のためには、［３！　Ｓ］メチオニンの存在下でインビトロ翻訳することによりすべてのタンパク質を産生させた。放射標識タンノ々り質は５ＤＳ− ＰＡＧＥにより分析し、これらデータを用い、ゲル遅滞アッセイに用いた各非標識レセプター（平行して翻訳した）の量を標準化した。同様の方法を用い、ゲル遅滞実験に使用したｃ−ｅｒｂＡの量は約５〜１０フイコモルであった。

タンパク質精製ｒＶＶ発現ｈＲＡＲ−γおよびｒＢＶ発現ｈＲＡＲ−γの精製は、どこかに記載されつつある（チェノら、準備中の原稿）。ヒーラ細胞ＲＢＦの精製のため、ヒーラＷＣＥをすでに記載されたようにして調製した（モンコリン（Ｍｏｎｃｏｌｌｉｎ）ら、ＥＭＢＯＪ、５　：　２５７７〜２５８４　（１９８６））。すべての工程を４℃で行い、ＲＢＦ活性を上記のように細菌発現ｈＲＡＲ−γを用いた相補的ゲル遅滞アッセイによりすべての精製工程においてモニターした。ヒーラＷＣＥ（懸濁液中に増殖させた細胞９０リツトルから、９Ｘ１０’細胞に対応）を５０ｍＭＫＣｌを含有する緩衝液Ａ（５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　ｐＨ７，８，０，１ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭ　ＤＴＴおよび１０％グリセリン）に対して一夜透析し、同緩衝液中に平衡化した３５０ｍ１のＤＥＡＥ−バイオゲルＡカラム（バイオラド）上に負荷した（１００ｍｌ／時）。溶出液のＡＺａ。がベースラインに戻るまで、カラムを平衡緩衝液で洗浄した。フロースルーフラクション（ＤＥＡＥＦＴ、１３５０ｍｌ、タンパク質１１２ｍｇ）をＫＣＩ中に１５０ｍＭとし、１５０ｍＭＫＣｌを含有する緩衝液Ａ中に平衡化した８０ｍ１のヘパリンーウルトロゲル力ラム（ＩＢＦ）上に負荷した（８０ｍｌ／時）。カラムを平衡緩衝液で洗浄して未結合のタンパク質を除き、緩衝液Ａ中の１５０〜４５０ｍＭＫＣｌの一次勾配液（３２０ｍｌ）で溶出した。ＲＢＦは、２９０ｍＭＫＣｌにおいて集中する鋭いピークとしてこのカラムから溶出した。ＲＢＦ活性を含有するフラクションをプールしく６５ｍ１、タンパク質１．９５ｍｇ）、硫酸アンモニウム中の０゜９Ｍとし、０．９Ｍ硫酸アンモニウムおよび５０ｍＭＫＣｌを含有する緩衝液Ａ中で平衡化したフェニル−５ＰＷカラム（ベックマン、０．７５Ｘ７．５ｃｍ。

０．４ｍｌ／分）上に負荷した。溶出液のＡ、。がベースラインに戻るまでカラムを平衡緩衝液、ついで０．４５Ｍ硫酸アンモニウムおよび５ＱｍＭＫＣ１を含有する緩衝液Ａの４カラム容量で洗浄した。ついで、５０ｍＭＫＣｌを含有する緩衝液Ａ中の硫酸アンモニウムの０．４５〜ＯＭの一次勾配液１８ｍ１でカラムを溶出した。ＲＢＦ活性を含有するフラクション（２５０ｍＭの硫酸アンモニウムにてこのカラムから溶出した）をプールしく５ｍＬ　１２０μｇタンパク質）、５ＱｍＭＫＣ１を含有する緩衝液Ａに対して透析し、同緩衝液中で平衡化したＴ　Ｓ　Ｋ−ヘパリンＳＰＷカラム（トソーハース（Ｔｏｓｏ　−Ｈａａｓ）、０．７５Ｘ７．５ｃｍ、０．３ｍｌ／分）に負荷した。このカラムを平衡緩衝液で、ついで１５０ｍＭＫｃ］を含有する緩衝液Ａの６カラム容量で洗浄し、ついで緩衝液Ａ中の１５０〜４００ｍＭ　ＫＣＩの一次勾配液（２０ｍｌ）で洗浄した。ＲＢＦ含有フラクションをプールしく７．５ｍｌ、　１９μｇのタンパク質、〜２５０ｍＭＫＣｌにおいてピーク）、緩衝液Ｂ（１０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７，５，０，０１ｍＭｃａｃ］、、０．５ｍＭ　ＤＴＴおよび１０％グリセリン）に対して透析し、緩衝液Ｂで平衡化したＴＳＫ−ＨＡ１００Ｏヒドロキシルアパタイトカラム（トソーハース、領７５Ｘ７．５ｃｍ、０．３ｍ　ｌ　／分）上に負荷した。カラムを緩衝液Ｂおよび３カラム容量の緩衝液Ｂ（７５ｍＭリン酸カリウムを含有）で洗浄した後、カラムを緩衝液Ｂ中の７５〜２５０ｍＭリン酸カリウムの一次勾配液（１８ｍｌ）で溶出した。ＲＢＦ活性のピークは約１５０ｍＭリン酸カリウムにおいてこのカラムから溶出し、みかけ上物質に精製されたＲＢＦ　（約０．２μｇ）を含有していると推定された。

ＲＢＦのペプチドシークエンシング精製ＲＢＦの複数の調製物をプールしく５〜６μｇのＲＢＦを含有すると推定された）、緩衝液Ｃ（０，５ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，８，１μＭＥＤＴＡ。

５μＭ　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　ＮａＣ＋、０．０５％５ＤＳ）に対して透析し、スピード真空（ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ、　）中で凍結乾燥した。凍結乾燥した材料を水中に再懸濁し、７．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（ミリポア）にプロットした。ＲＢＦバンドを切り出し、標準手順を用いてンークエンシンググレードのトリプシン（ベーリンガー・マンハイム）で消化した。

トリプシン処理したペプチドを逆相ＨＰＬＣにより分離し、アブライドバイオシステムズシークエンサー上の自動エドマン分解によりンークエンシングした。

ｍＲＸＲｓおよびｈ　Ｒ，Ｘ　Ｒ−βのクローニングマウスＲＸＲ−αをクローニングするため、本発明者らは、まずｈＲＸＲ−α配列（マンゲルスドルフら、Ｎａｔｕｒｅ３４５　：　２２４〜２２９　（１９９０））から導いた縮重ＰＣＲプライマーを用い、アミノ酸１４〜３６０をコードする領域に対応する断片をマウス肝臓ｃＤＮＡから増幅した。完全に適合するプライマーが該断片の配列から導かれ、肝臓ｃＤＮＡ上でのアンカーＰＣＲ（５°末端）およびマウス１１．５ｄ胚λｇｔｌＯｃＤＮＡライブラリーからの全ＤＮＡ上でのＰＣＲ（３’末端）を行うことにより、ｍＲＸＲ−αの５゛および３゛配列をクローニングした。

１８８３ヌクレオチド長の配列をＥＭＢＬデータバンクにおいてアクセス番号　にてアクセスすることができる。９８位に存在する最初のＡＴＧは、翻訳開始に有利な配列で取り囲まれており、インフレームの終止コドン（ヌクレオチド６〜９）により先行されている。

マウスＲＸＲ−βは、以前にＨ−２ＲＩＩＢＰと称されていた配列である（ハマダら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８６　：　８２８９〜８２９３　（１，９８９））。本発明者らは、アンカーＰＣＲ（１４，５ｄ胚ｃＤＮＡにおいて行った）によりさらに５゛配列を得た（ＥＭＢＬアクセス番号　）。最初のＡＵＧは１９０位にあり［ハマダら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾８６　：　８２８９〜８２９３　（１９８９）においては１０９）、インフレームの終止コドン（ヌクレオチド６４）により先行されている。このＡｔＪＧを取り囲む配列は、翻訳の有効な開始に必要な共通配列と適合しない。ｍＲＸＲ−βの全クローニング５°配列を含有するインビｉ・口合成ｍＲＸＲ−βＲＮＡをウサギ網状赤血球溶解液とともに翻訳する場合（産生されたＲＸＲ−βタンパク質の〜１０％二本発明者らの未刊行の結果）には、上流ＣＵＧコドン（ヌクレオチド７６〜７８）を翻訳開始のために部分的に用い、また、インビボで用いてもよい。というのは、導かれたアミノ酸配列はマウスとヒトとの間で第一のメチオニンの上流で保存されているからである。

ｍＲＸＲ−γの部分配列は、ＲＸＲ−αとＲＸＲ−βとの間で保存されているＣ領域中のアミノ酸配列に対応する縮重オリゴヌクレオチドブライマー（５′および３゛プライマーとしては、それぞれＣＡＩＣＧＤおよびＹＱＫＣＬ）を用いたマウス心臓ｃＤＮＡ（７）ＰＣＲ増幅により得た。ついで、このｃＤＮＡ断片を用い、ランダムブライミングしたマウス心臓ｃＤＮＡライブラリー（λＺＡＰ− ＩＩにおいて確立）をスクリーニングし、２つの重複クローンを得た。得られたクローニングｍＲＸＲ−γｃＤＮＡは、１５１７ヌクレオチドの長さである（ＥＭＢＬアクセス番号□番号量初のＡＵＧ　（ヌクレオチド３５）は、翻訳開始に有利な配列によって取り囲まれており、インフレームの終止コドン（ヌクレオチド１８）により先行されている。

ｈＲＸＲ−βをクローニングするため、完全長の［”Ｐ］　ＣＴＰ標識ｍＲＸＲ −βプローブを用いてλＺＡＰ−ＩＩヒーラｃＤＮＡライブラリー（キシアオ（Ｘｉａｏ）ら、Ｃｅ１１６５　：　５５１〜５６８　（１９９１））をスクリーニングした。

この１７３８ヌクレオチド長の配列は、ＥＭＢＬデータバンクにおいてアクセス番号□にてアクセスできる。最初のＡＴＧは１１８〜１２０位に位置し、インフレームの終止コドン（ヌクレオチド５２〜５４）により先行されている。

マウスＲＸＲ発現ベクターの構築マウスＲＸＲ−α発現ベクターを２つの断片：ＥｃｏＲＩ−ＮａｒＩ　（ヌクレオチド７９〜１１３７間の配列を含有し、マウス肝臓ｃＤＮＡからＰＣＲにより得た）およびＮａ　ｒ　Ｉ−ＢａｍＨＩ　（コード配列の末端（ヌクレオチド１１３８から）および３゛非非翻訳列の〜６００ｂｐを含有する１１５ｄλｇｔｌＯライブラリークローンに由来する）の融合からｐＳＧ５ベクター中において構築した。

このベクター中にはＢ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋポリリンカーに由来するＥｃｏＲｒ、ＰｓｔｒおよびＳｍａ　１部位がＢａｍ８１部位の上流に存在することに注意。ｍＲＸＲαＥＲ，（Ｆ）はｐＳＧ５のＥｃｏＲＩ部位とＢａｍ８１部位間でクローニングされ、ヒトニストロジエンレセプターのＦ領域をコードする配列（ヌクレオチド１８６９〜２０２０）に融合したｍＲＸＲ−αコード配列（ヌクレオチド７９〜１４９６）を含有しくグリーンら、Ｎａｔｕｒｅ　３２０　：　１３４〜１３９　（１９８６））、連結部にＸｂａ１部位が生成している。

Ｒ，Ｘ　Ｒ−Ｅ　Ｒ連結部におけるヌクレオチド配列は、人工ＰＳＲ工旦をコードするＧＣＣＡＣＣＣＣＴＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＣである。プロリン残基が導入されてＲＸＲ−α配列とＥＲ配列との間で柔軟性が得られることに注意。

ｍＲＸＲ−β発現ベクターは、ｐＴＬｌ　（ルフキン（Ｔ、　Ｌｕｆｋｉｎ）から贈与、ｐＴＬｌはクローニング部位としてＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩ［［／Ｘｈｏ　Ｉ／Ｎｏ　ｔ　Ｉ／Ｓｍａ　Ｉ／Ｐｓ　ｔ　Ｉ／Ｓａｃ　Ｉ／Ｋｐｎ　Ｉ／Ｂｇｍポリリンカーを有する他はｐＳＧ５と同じである）のＥｃｏＲ１部位とＨｉｎｄ１１１部位との間に挿入されたｍＲＸＲ−βコード配列を含有する。開始ＣＴＧはＡＴＧにトランスフオームされており、「完全」コザク開始配列の下流に位置している。それゆえ、ｍＲＸＲ−β発現ベクター中の５゛配列は、ＧＡＡＴＴＣＣＡ、ＣＣΔ工ｐＧＧＡＣＣＧＧＡＴ・・・である。

ｍＲＸＲ−７発現ベクターは、ｐＳＧ５のＥｃｏＲ１部位に挿入されたｍＲＸＲ −γヌクレオチド３５〜１５１７を含有する。「完全」コザク配列は、開始ＡＴＧの上流に生成されている（配列ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣΔＴＧ）。

交差および同時免疫沈降実験インビトロ翻訳ＲＡＲおよびＲＸＲを化学的に交差するため、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ、ピアス）を用いた。交差および同時免疫沈降実験は、大スケールで行う池はケル遅滞アッセイと同様にして行った。たとえば、〜５０フィコモルの非標識レセプター（細菌発現またはインビトロ翻訳レニもの）を等モル量の［３５Ｓ］　メチオニン樟識レセプター（インビトロ翻訳したもの）とともにインキュベートした。インキュベーションは、トリス−ＭＣＩの代わりに１５ＱｍＭＫＣ］およびへペスーＮａＯＨ（１０ｍＭＳｐＨ７，５）を含有するゲル遅滞緩衝液にコルソンら、ＥＭＢＯＪ、９・４４４３〜４４５４　（１９９０））（５０μｌ）中で行った。指示されている場合には、５００フィコモルの非標識β−ＲＡＲＥをもインキュベーション中に含有させた（ゲル遅滞アツセイは一般に〜１０フィコモルの熱プローブを用いて行ったことに注意）。２０分間の室温でのインキュベーションの後、ＤＳＳ　（ＤＭＳＯ中に溶解）を１ｍＭおよび２％ＤＭＳＯの最終濃度で加えた。コントロールの管にはＤＭＳＯのみを入れた。交差反応は２２℃で１５分間行い、ついでリジン（最終濃度２５ｍＭ）を加えて反応停止させた。各反応液の容量をゲル遅滞緩衝液で５００μｌに増加させた後、すでに記載されているようにして試料を免疫沈降させた（ロシエットーエグリーら、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、１１５　：　５３５〜５４５　（１９９１））、免疫沈降したタンパク質をＳＤＳゲル上で処理し、ＰＰＯをゲル中に導入してｐｉＳ］　シグナルを高めた後にオートラジオグラフィーにより［３５Ｓ］標識タンパク質を視覚化した。

ＣＯ８Ｏ８細胞トランスフェクションび抽出物の調製ＣＯ５−１細胞（６０％コンフルエント、７５ｍｍプレート上で増殖）をプレート当たり１０μｇのｍＲＸＲ−α発現ベクターおよび１０μｇの担体ＤＮＡ　（ＢＳＭ）でトランスフェクションし、５％脱脂ウつ飴仔血清を含有するダルベツコ培地中でさらに４８時間増殖させた。細胞を洗浄し、冷ＰＢＳ中で回収し、遠心分離後、プレート当たり１００μｍの溶解緩衝液中に再懸濁した（ＺｎＣＩ！を含有しない上記大腸菌溶解緩衝液と同一）。細胞を３回の凍結−解凍（氷上で解凍）サイクルにより溶解し、不溶性物質を遠心分離により除いた。上澄み液（ＣｏｓＷＣＥ）をアリコートし、液体窒素中で凍結し、−８０℃で貯蔵した。

酵母におけるＲＡＲによる有効なトランス活性化にはＲＸＲが必要である全トランスレチノイン酸および９−シスレチノイン酸は、核レチノイン酸（ＲＡＲ）およびレチノイドＸ　（ＲＸＲ）レセプターへの結合の結果として遺伝子発現を調節するビタミンＡの天然誘導体である（シャンボンら、Ｒｅｔｉｎｏｉｄｓ：　１０Ｙｅａｒｓ　Ｏｎ、ツーラット（Ｊ　、　Ｈ，５ａｕｒａｔ）編、バーゼル：カーガー（Ｋａｒｇｅｒ）（１９９１）ニレイド（Ｌｅｉｄ、　Ｍ、　）ら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７　：　４２７〜４３３　（１９９２）；ヘイマン（Ｈｅｙｍａｎ、　Ｒ，Ａ、　）ら、Ｃｅ１１６８　：　３９７〜４０６（１９９２）；レビン（Ｌｅｖｉｎ、　Ａ、　Ａ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ３５５　：　３５９〜３６１　（１９９２）：およびその中に引用された他の文献）。ＲＸＲｓはインビトロでＲＡＲｓとへテロダイマーを生成し、そのような複合体は、同族のＤＮＡ応答要素に対して高められた結合親和性を示す（ユ（Ｙｕ、　Ｖ、　Ｃ，）ら、Ｃｅ１１６７　：　１２５１〜１２６６　（１９９１）；レイドら、Ｃｅ１１６８：３７７〜３９５　（１９９２）：ザング（Ｚｈａｎｇ、　Ｘ、　Ｋ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ３５５：４４１〜４４６　（１９９２）：クリーツー（Ｋｌｉｅｗｅｒ、　Ｓ、　Ａ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ３５５：４４６〜４４９　（１９９２））。

核レセプターは内生ＲＡＲｓおよびＲＸＲｓを欠いた酵母細胞中で機能するので（メツガーら、Ｎａｔｕｒｅ３３４　：　３１〜３６　（１９８８）：シエナ（Ｓ　ｃｈｅｎａ）およびヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）　、５ｃｉｅｎｃｅ２４１　：　９６５〜９６７　（１９８８）　；マッグ（Ｍａｋ、Ｐ、）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｅ１１６８　：　２１６１３〜２１６１８　（１９８９）：バービ７．　（Ｐｕｒｖｉｓ、　１．　Ｊ、）ら、Ｇｅｎｅ１０６　：　３５〜４２　（１９９１）：ビニラット（Ｐ　１ｅｒｒａｔ、　Ｂ、　）ら、Ｇｅｎｅｌ１９　：２３’７”２４５　（１９９２））、本発明者らはこの生物を用いてインビボにおけるトランス活性化にＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーが必要かどうかを調べた。ドメイン交換法（グリーンおよびシャンボン、Ｎａｔｕｒｅ３２４　＋　６１５〜６１７　（１９８６））を用い、本発明者らは、ニストロジエンレセプターのＤＮＡ結合ドメインを含有するキメラＲＡＲα１およびＲＸＲαレセプターが酵母中の同族レポーター遺伝子を互いに独立に活性化することを示す。これら活性は、ＲＡＲａ１およびＲＸＲａのリガンド結合ドメインにおける誘発し得る転写活性化機能（ＡＦ−２）　、およびＲＡＲａ１のＡ／Ｂ領域中の構成的活性化機能（ＡＦ−１）によるものである、ＲＸＲａのＡＦ−２は、レチノイン酸（ＲＡ）の９−シス誘導体によって専ら誘発された。レチノイン酸応答要素（ＲＡＲＥ）を含有するレポーター遺伝子の天然ＲＡＲαによるトランス活性化は、リガンドの不在下においてさえも、ＲＸＲａの同時発現により著しく増大した。最適の誘発は、両方のレセプターの活性を刺激する９−シスレチノイン酸により達成された。この研究は、内生ＲＡＲｓＳＲＸＲｓおよび観察し得るリカンド異性化の不在下でのレチノイドによるシグナル形質導入を調べるうえでの酵母の有用性を示す。

ヒトＲＡＲα１およびマウスＲＸＲαレセプター（以下、ＲＡＲａおよびＲＸＲａと称する）が転写を活性化する内生能を有しているかどうかを調べるため、天然のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤｓ）をヒトニストロジエンレセプター（ＥＲ）のＤＢＤで置換したキメラレセプターを構築した。

キメラレセプターは以下のようにして構築した。ＰＣＲおよび部位特異的突然変異誘発を用い、ヒトＲＡＲα１（レロイら、ＥＭＢＯＪ、１０　：　５９〜６９（１９９１）：ペトコビッチ（Ｐ　ｅｔｋｏｖｉｃｈ、　Ｍ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ３３０　：　４４４〜４５０　（１９８７）：ギゲレ（Ｇｉｇｕｅｒｅ、　Ｖ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ３３０　：　６２４〜６２９（１９８７））（ＲＡＲ（Ｚ）およびマウスＲＸＲａ　（レイドら、Ｃｅ１１６８　：　３７７−３９５　（１９９２））（ＲＸＲａ）ｃＤＮＡｓ　（すべての非コードフランキング配列を除いである）を含有するＥｃｏＲＩ断片を生成した。各構築物の５°プライムフランク（ｐｒｉｍｅ　ｆｌａｎｋ）は、ＥｃｏＲＩと１訳開始コドン（５’ −ＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧ−３’）との間に挟まれた哺乳動物コザック配列を含んでいる。これら断片をプラスミドｐＳＧ５　（グリーンら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１６　：　３６９　（１９８８）　）のＥｃｏＲ１部位にクローニングし、オリゴヌクレオチド５°−ＧＧＧＣＡＣＣＴＣＡＡＴＧＧＡＴＡＣＣ−ＣＧＧＴＧＣＣＴＣＣＣ−３′を用いた部位特異的突然変異誘発によりサイレント変異を導入することによって、ＲＡＲａ　ｃＤＮＡ中の内部Ｋｐｎ１部位を破壊した。ＲＡＲａ（アミノ酸８８〜１５３）およびＲＸＲ（２（７ミ／酸１４０〜２０４）（７）ＤＢＤｓをコードする配列を欠失させ、ＨＥ２８について記載されているのと同じ仕方にて（グリーンおよびシャンボン、Ｎａｔｕｒｅ３２４：６１５〜６１７　（１９８６））唯一のＫｐｎｌおよびＸｈｏ１部位で置換し、それゆえＥＲ，ＣＡＳまたはＥＲ（Ｃ）断片を同じ位相で挿入した。これらは、ヒトニストロジエンレセプター（ＥＲ）遺伝子のＤＮＡ結合ドメインをコードするＫｐｎＩ −Ｘｈｏｌ断片であり、ＨＥ２８　（アミノ酸１８５〜２５０　；　ｒＥＲ−ＣＡＳＪと称する；文献１４）かまたはＨＥ８１　（アミノ酸１７６〜２８２　；　ｒＥＲ，（Ｃ）Ｊと称する：メーダー（Ｓ、　Ｍａｄｅｒ）およびＰ、Ｃ未刊行）のいずれかに由来していた。ＰＣＲおよび部位特異的突然変異誘発を用い、ａに示すように、ＲＡＲａ　（ＤＥＦ）　−ＥＲ。

ＣＡＳ、ＲＡＲａｌ　（ＡＢ）　−ＥＲ（Ｃ）　、ＲＸＲａ　（ＤＥ）−ＥＲ，ＣＡＳおよびＲＸＲａ（ＡＢ）−ＥＲ（Ｃ）を生成した。ＰＣＲまたは部位特異的突然変異誘発により生成した配列はすべて、シーフェンシングにより確認した。これらキメラレセプターを、それぞれＴＲＰＩおよびＨＩＳ３選択マーカーを含有する２μ−由来酵母マルチコピープラスミドＹＥｐｌＯおよびＹＥｐ９０　（ビニラットら、Ｇｅｎｅｌ１９　：　２３７〜２４５　（１９９２））中のＰＧＫプロモーター／ターミネータ−カセットのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、方向をシーフェンシングにより確認した。プラスミドをエレクトロポレーションにより酵母レポーター株ＰＬ３　（ＭＡＴ（Ｚ、ｕｒａ３−Δ１、ｈｉｓ３−Δ２００、ｌ　Ｃｕ２−Δ１、ｔ　ｒｐｌ：：３ＥＲＥ−ＵＲＡ３）　（ビニラットら、Ｇｅｎｅｌ１９：２３７〜２４５　（１９９２））中にトランスフオームし、レセプターの発現をウェスタン分析により確認した（本発明者らの未刊行の結果）。トランス活性化実験のため、散乱光の条件にて、リガンドの存在下または不在下、ウラシルを含有する選択培地中てトランスフォーマントを約５世代、指数関数的に増殖させた。酵母細胞遊離抽出物の調製（ロイマン（Ｌｏｉｓｏｎ、　Ｇ、　）ら、Ｃｕｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、　２　：　３９〜４４　（１９８０）　）、およびＯＭＰデカーゼアッセイはすてに記載されたものと同じであった（ウオルコット（Ｗｏｌｃｏｔｔ）およびロス（Ｒｏｓｓ）　、ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　１２２　：　５３２〜５３４　（１９６６）　）。

これらキメラレポーター（ＲＡＲａ１−ＥＲ，ＣＡＳおよびＲＸＲａ−ＥＲ（Ｃ）と称する）を、３つのニストロジエン応答要素（ＥＲＥｓ）により制御される染色体に組み込まれたＵＲＡ３レポーター遺伝子を含有するレポーター株中で発現させた（ビニラットら、Ｇｅｎｅ１１９：２３７〜２４５　（１９９２））。

レポーターの誘発は、ＵＲＡ３遺伝子遺伝子産物０カＰデカ上記参照）の比活性を測定することにより決定した。リガンド用量応答実験（図１０ｂ）は、ＲＡＲａ１−ＥＲ，’ＣＡＳおよびＲＸＲａ−ＥＲ（Ｃ）の両方とも酵母においてリガンド誘発性および容量依存的な仕方で転写を活性化することを示した。ＲＡＲα １−ＥＲ，ＣＡＳによるトランス活性化は、全トランスレチノイン酸（Ｔ−ＲＡ）、９−シスレチノイン酸（９Ｃ−ＲＡ）（図１０ｂ）またはＲＡの幾つかの他の誘導体（図１０ｃ）により同等に刺激されたが、ＲＸＲａ−ＥＲ（Ｃ）による活性化は使用した濃度における９Ｃ−ＲＡまたは９−シス−３，４−ジデヒドロレチノイン酸（９Ｃ−ｄｄＲＡ）によってのみ誘発された（図１０ｂおよびＣ）。

このことは、ＲＡ誘導体に対するＲＡＲｓおよびＲＸＲｓの結合親和性に関する最近のデータ（ヘイマンら、Ｃｅ１１６８　：３９７〜４０６　（１９９２）：アレンビー（Ａｌｌｅｎｂｙ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（出版中））と一致し、ＲＡの９−シス誘導体に対するＲＸＲａの特異性を示している。加えて、本発明者らの結果は、Ｔ−ＲＡまたはＴ−ｄｄＲＡが酵母中で９−シス立体異性体に有意に変換されないことを示している。対照的に、高濃度のＴ−ＲＡによるＲＸＲ活性の刺激を示した哺乳動物およびドロソフィラ細胞における研究（ヘイマン、Ｃｅ１ｌ　６８　：３９７〜４０６　（１９９２）；レビンら、Ｎａｔｕｒｅ３５５　：　３５９〜３６１（１９９２）；マンゲルスドルフら、Ｃｅ１１６６　：　５５５〜５６１　（１９９１）；マンゲルスドルフら、Ｇｅｎｅ　Ｄｅｖ、６　：３２９〜３４４　（１９９２））は、酵母には明らかに存在しないＲＡイソメラーゼ活性が高等真核生物において存在することを示唆している。

ＲＡＲａおよびＲＸＲａにおける転写活性化機能（ＡＦｓ）を同定するため、本発明者らはＤＢＤまたはＥＲに連結したＡ／Ｂまたはホルモン結合ドメインを発現するキメラレセプターを構築した。ＲＡＲａ（ＤＥＦ）−ＥＲ，ＣＡＳ　（図１０ａ）は、９　Ｃ−ＲＡまたはＴ−ＲＡの存在下でＯＭＰデカーゼ活性を１０倍増大させ（表２）、核レセプターについて認められているように（ビニラットら、Ｇｅｎｅｌ１９　：　２３７〜２４５　（１９９２）ニライト（Ｗｒｉｇｈｔ、　Ａ、　Ｐ、　Ｈ，）ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６５　：１４７６３〜１４７６９　（１，９９０）：メイヤーら、Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６７：１０８８２〜１０８８７　（１９９２））　、ＲＡＲａが酵ｅ中て機能的なりカント結合ドメイン中に誘発性ＡＦ　（ＡＦ−２）を有することを示している。

ＲＡＲ（２１（ＡＢ）−ＥＲ（Ｃ）（図１０８）は、リガンド独立的な仕方でレポーターの活性を（バックグラウンドに比べて約１５０倍）増大させた（表２）。それゆえ、本発明者らは、哺乳動物細胞におけるＲＡＲｓおよびＲＸＲｓのトランス活性化特性がプロモーター環境に依存してＡ／Ｂドメインにより調節されているという本発明者らの研究室における最近の結果と符号して、ヒトＲＸＲα １のＡ／Ｂ領域が自律的ＡＦ　（ＡＦ−１と称する）を含有すると結論する（ナグパル（Ｎａｇｐａｌ、　Ｓ、　）ら、Ｃｅ１ｌ　７０　：１００７〜１０１９　（１９９２））。興味深いことに、同じレポーター株で発現されたＥＲレポーターと対照的に（ビニラントら、Ｇｅｎｅ　１コ９　：　２３７〜２４５　（１９９２））、ＲＡＲａ１．−ＥＲ，ＣＡＳが幾つがのりガント独立的な活性化を示しく表２）、このことはキメラＲＡＲαがＥＲＥｓに結合するのにリガンドを必要としないことを示唆している。ＲＸＲａ（ＤＥ）−ＥＲ，ＣＡＳは９Ｃ−ＲＡの存在下でレポーター活性を５倍刺激するので（表２）　、ＲＸＲａもまたそのリガンド結合ドメイン中に誘発性ＡＦ−２を含有することがゎがった。対応ＲＡＲαレポーターとは対ｆｆｌ的１．−１Ｒ，ＸＲａ、ＥＲ（Ｃ）　およびＲＸＲａ（ＤＥ）　−ＥＲ，ＣＡＳは９Ｃ−ＲＡへの応答において同程度の誘発（５倍）を示したが、このことは、ＲＸＲａのＡ／Ｂドメインがこのレポーターの転写活性化に有意の貢献をしないことを示唆している。実際、本発明者らは、酵母中のＲＸＲａ（ＡＢ）−ＥＲ（Ｃ）によるいかなるＵＲＡ３−レポーター活性化をも観察しなかった（表２）。しかしながら、この構築物が他のプロモーターからの転写を活性化するがもしれないという可能性を排除するこはできない。これらの実験において、何故、ＲＸＲａ−ＥＲ（ＤＥ）　−ＥＲ，ＣＡＳの構成および誘発活性がＲＸＲａ−ＥＲ（Ｃ）について観察されるものよりも１０倍も高いのかは明らかではない。しがしながら、Ｒ，ＸＲａ−ＥＲ（Ｃ）　はＲＸＲａ　（ＤＥ）−ＥＲ，ＣＡＳに比ヘテハルかニ低しヘルで発現されたが（イムノプロットにより決定されるように）、ＲＡ、Ｒａ１−ＥＲＣＡＳおよびＲＡＲａ（ＤＥＦ）−ＥＲ８ｃＡｓは同レベルで発現された（データは示していない）。上記結果は、酵母細胞で自律的に転写を活性化することのできる、ＲＡＲａ　（ＡＦ −１およびＡＦ−２）およびＲＸＲａ（ＡＦ−２）Ｉ：おける活性化機能の存在を示している。

これら機能がインビボでの天然レポーターを用いたＲＡにより高められた転写を達成するのに充分かどうかを調べるため、本発明者らは合成ＲＡＲＥ要素を含有するＵＲＡ３レポーター遺伝子を構築した１図１１ａ）。

このレポーター遺伝子を構築するため、単一のニストロジエン応答要素（ＥＲＥ）およびＵＲＡ３プロモーターの一部を含有するプラスミドｐＦＬ３９−ＩＥＲＥ−ＵＲＡ３　（ビニラットら、Ｇｅｎｅ　１１９：２３７〜２４５　（１９９２））からのＨｉｎｄｌＵ−Ｐｓｔｌ断片をｐＢＬＵＥｓｃＲＩＰＴ　ＳＫ−（ストラタンーン）中にクローニングした。部位特異的突然変異誘発により、ＥＲＥ配列（翻訳開始部位に関して位置−１３９）を除き、ＢｇｌＩ［およびＮｈｅｌの制限部位を生成した。これら部位を用い、ａに示すようにＤＲ５配列を含有するオリゴヌクレオチドを挿入した。Ｈｉｎｄｍ−Ｐｓｔｌ　ＤＲ５−ＵＲＡ３プロモーター断片を親ベクター中に再クローニングしてｐＦＬ３９−ＤＲ５−ＵＲＡ３を生成した。完全なＵＲＡ３コード配列をそのＤＲ５−ＵＲＡ３プロモーターとともにＸｍａｌ消化により切り出し、動源体（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ）プラスミドｐＲ８３１５を含有するＬ　Ｅ　Ｕ２のＸｍａ１部位に再クローニングした（ンコルスキー（Ｓ　１ｋｏｒｓｋｉ）およびヒーター（Ｈｉｅｔｅｒ）　、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１２２　：１９〜２７　（１９８９））。ヒトＲＡＲα １　（レロイら、ＥＭＢＯＪ、１０：５９〜６９（］−９９１）、ペトコビソチら、Ｎａｔｕｒｅ　３３０：４４４〜４５０　（１９８７）：ギゲールら、Ｎａｔｕｒｅ　３３０　：　６２４〜６２９　（１，９８７））　（アミノ酸１〜４６２）、マウスＲＸＲａ　（レイドら、Ｃｅ１ｌ　６８：３７７〜３９５　（１９９２））　（アミノ酸１〜４６７）、マウスＲＸＲαｄｎ　（デュランドら、Ｃｅ１ｌ　７１　：　７３〜８５　（１９９２））　（アミノｌＩｌ！！１〜４４８）、ヒトＲＡＲαｄｎΔＡＢ（アミノ酸８８〜３９６．ナグパルから贈与）およびマウスＲＸＲαｄｎΔＡＢ（アミノ酸１４０〜４４８．ナグバルから贈与）ｃＤＮＡを標準手順に従って酵母発現ベクター’１’ＥＴ）１０および）’　Ｅ　ｐ　９０のＥｃｏＲ１部位に挿入した。トランス活性化アッセイは上記と同じてあった。連続したトランスフォーメーションによりプラスミドを酵母株ＹＰＨ２５０（ＭＡＴａ、ｕｒａ３−５２、Ｉｙｓ２−８０１、ａｄｅ２−１０１、ｔｒｐｌ−Δ１、ｈｉｓ３−Δ２００．］ｅｕ２−Δ１）（シコルスキーおよびヒーター、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２　：　１９〜２７　（１９８７））中に導入した。ウェスタン分析によると（データは示していない）、２つの異なるレポーターの同時発現は、酵母細胞遊離抽出物中で検出し得るタンパク質レベルにおいていかなる観察し得る効果もなかった。レポーター活性を上記のようにして測定し、表示のように、比活性（ｂ）または基本活性に対する倍誘発（Ｃ）として示しである。

この応答要素は５塩基対のスペーサー（ＤＲ５）によって離されたモチーフ５° −ＡＧＧＴＣＡ−３°の直行繰り返しであり、哺乳動物においてＲＡ誘発性エンハンサ−として機能することが以前に示されたＲＡＲβ２遺伝子のＲＡＲＥに由来する（マンケルスドルフら、Ｃｅ１ｌ　６６　：　５５５〜５６１　（１９９１）；ド・テら、Ｎａｔｕｒｅ３４３　：１７７〜１８０　（１９９０）；メイグー（Ｍａｄ６ｒ、　Ｓ　、　）ら、Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（出版中））。レポーターを、単一コピーベクター上にＤＲ５−ＵＲＡ３レポーター遺伝子を有する適当な酵母株中で発現させた。いずれかのレポーターを単独で発現するトランスフォーマントにおいては、リガンドの不在下でレポーター基本活性（すなわち、レポーターなしのコントロール）において増加が観察されなかった（ＯＭＰデカーゼ活性として測定、図１１ｂ）ｃＲＡＲａのみを発現するクローンにおいては、Ｔ−ＲＡまたは９Ｃ−ＲＡ　（５Ｘ１０−’Ｍ）はともにＯＭＰデカーゼ活性を約５倍誘発し、ＲＡＲａがＲＸＲの不在下においてリカンド独立の仕方で、弱くではあるがインビボでＤＲ５の転写を活性化し得ることが示された。ＲＸＲａのみを発現するクローンは、９Ｃ−ＲＡ　（Ｔ−ＲＡではなく）に応答してレポーター活性の一層弱い（２倍）増加を示した。

しかしながら、顕著なことに、ＲＡＲａとＲＸＲａとの同時発現はレポーター遺伝子活性の構成および誘発レベルの両方を強（増加させた。構成活性はコントロールの１８倍であったが、Ｔ−ＲＡおよび９Ｃ−ＲＡにより誘発された活性はそれぞれコントロールの約３０倍および６０倍に増加した（図１１ｂ）。それゆえ、両レポーターを発現するトランスフォーマントにおけるＴ−ＲＡおよび９Ｃ− ＲＡにより誘発された活性は、ＲＡＲａのみを発現するトランスフォーマントにおける場合に比べてそれぞれ６倍および１２倍高かった。これらの結果は、ＲＡＲａおよびＲＸＲａが、リガンドの不在下においてさえも酵母中でＤＲ５要素を協力してトランス活性化させることを示している。ＲＡＲａおよびＲＸＲａの両方を発現するトランスフォーマントにおけるＴ−ＲＡおよび９Ｃ−ＲＡに対する用量一応答により、この系において９Ｃ−ＲＡが一層強力なインデューサーであることが確認された（図１１ｃ）。

従前の結果は、溶液中でのへテロダイマーの生成がインビトロでのＲＡＲｓおよびＲＸＲｓによる協力的なりＮＡ結合をもたらすことを示している（ユら、Ｃｅ１ｌ　６７　：　１２５１〜１２６６　（１９９１）；レイドら、Ｃｅ１１６８：３７７〜３９５　（１９９２）；ザングら、Ｎａｔｕｒｅ３５５：４４１〜４４６　（１９９２）；クリーワ−（Ｋｌｉｅｗｅｒ、　Ｓ、　Ａ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ３５５　：４４６〜４４９　（１９９２））。ゲル遅滞実験により、両方のレポーターを発現する酵母からの抽出物のみが合成りＲ５プローブの移動度を有効に遅らせ得ることが確認された（図１２、レーン７）。

レポーターを上記のようにして酵母株ＹＰＨ２５０中で発現させた。選択培地中で増殖させたトランスフォーマントの後期対数期の培養液から以下のようにして細胞遊離抽出物を調製した：細胞を選択培地（２０ｍ　ｌ　）中で一夜増殖させ、１回洗浄し、ガラスピーズ破砕法を用いて０．１５ｍ１の高塩緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ５ｐＨ７，５，０，４Ｍ　ＫＣＩ、２ｍＭ　ＤＴＴ、２０％グリセリン：プロテアーゼインヒビターを含有）中で溶解した。ｉｏ、ｏｏｏｘｇで１５分間清澄化した後、２０μｇ（約２５μｍ）の上澄み液を７μｌの低塩緩衝液（０，０５ＭＫＣｌを含有する他は上記と同じ）、１μｌ　ポリ（ｄｉ−ｄＣ）で希釈した。ポリ（ｄｌ−ｄＣ）を１０ｍｇ／ｍｌにて加え、混合物を４℃ にて１５分間インキュベートした。ゲル遅滞（５０，０００ｃｐｍの標識プローブを使用）および抗体スーパーシフトをすでに記載したようにして行ったにコルソンら、ＥＭＢＯＪ、９　：　４４４３〜４４５４　（１９９０））。

遅滞複合体中の両レセプターの存在を、抗ＲＡＲα（図１２、レーン８）または抗ＲＸＲα（データは示していない）モノクローナル抗体で該複合体をスーパーシフトすることにより確認した。それゆえ、酵母中で産生したＲＡＲｓおよびＲＸＲｓは、他の系で産生じたレセプターについて観察されたように、インビトロでヘテロダイマーを生成する。

この結果は、協力的なりＮＡ結合がインビボにおいてＲＡＲＥにより制御されたレポーターの活性化のための重要な要件であるという考えを支持しているが、トランス活性化実験において観察された９Ｃ−ＲＡおよびＴ−ＲＡへの差異的応答を説明していない（図１１ｃ）。それゆえ、ヘテロダイマーを介した転写に対するＲＡＲａおよびＲＸＲａの個々の貢献を調べるため、本発明者らは優性な陰性レセプター変異体（ＲＸＲａｄｎ）（デュランドら、Ｃｅ１ｌ　７１　：　７３〜８５（１９９２））を用いた。この変異体はリガンド誘発性の活性を失っていたが、インビトロでＲＡＲａのＤＮＡ結合を促進する活性は保持していた（図１２、レーン９および１０）。トランス活性化実験は、ＲＡＲａおよびＲＸＲａｄｎの同時発現によりＴ−ＲＡおよび９Ｃ−ＲＡに対する差異応答が失われることを示した（図１１０）。このことは、ＲＸＲａは、ＤＲ５へのＲＡＲａの結合を促進するのみならず、少なくとも部分的に、ＤＲ５レポーターの９Ｃ−ＲＡ刺激をも媒介することを示している。ヘテロダイマーのリガンド独立な活性の起源を調べるため、本発明者らは、Ｃ末端の末端欠失に加えて全Ａ／Ｂ領域を欠失したＲＡＲａ　ＣＲＡＲａｄｎΔＡＢ）およびＲＸＲａ　ＣＲＸＲａｄｎΔＡＢ）の転写的折衷変異体を構築した。Ａ／Ｂ領域の欠失は、これらレセプターがインビトロでＤＮＡに協力的に結合する能力に影響を及ぼさないことに注意（本発明者らの研究室からの未刊行の結果）。ＲＡＲａｄｎΔＡＢおよびＲＸＲａの同時発現は、構成的活性を強く減少させ、完全長のレセプターを用いて観察されるＴ− ＲＡへの応答を失わせたが、幾つかの誘発は９Ｃ−ＲＡの存在下で起こった（図１１ｂ）。

対照的に、ＲＡＲａとＲＸＲαｄｎΔＡＢとを同時発現させた場合には構成的活性における減少は観察されず、ＲＡＲａがリガンド独立活性化に大きく関与していることを示していた。このことは、上記で示したように、ＲＡＲａに強い構成的活性化機能（ＡＦ−１）が存在するがＲＸＲａには存在しないことと一致している。さらに、ＲＡＲα／ＲＸＲαｄｎについて観察されたように（図１１０）、ＲＡＲａおよびＲＸＲαｄｎΔＡＢを同時発現させた場合にはＴ−ＲＡおよび９Ｃ−ＲＡへの差異応答は失われた。要約すると、本発明者らの結果は、ＲＸＲ／ＲＡＲヘテロダイマーがインビボで構成的活性を有することを示している。しかしながら、標的遺伝子発現はＴ−Ｒ，Ａ　（ＲＡＲａにより）および９Ｃ−ＲＡ　（ＲＡＲａおよびＲＸＲａにより）によってさらに誘発される。

結論として、この研究は、インビボでＤＲ５により制御されるレポーターの有効な活性化にはＲＡＲａおよびＲＸＲａのへテロダイマーが必要であるという必然的な証拠を提供する。さらに、この研究は、ＲＡＲｓおよびＲＸＲｓのへテロダイマーがＲＡＲＥに結合し、リガンドの不在下で遺伝子転写を刺激することを示している。このことは、活性がリガンドに全面的に依存している核レセプターからＲＡＲ，ｓおよびＲＸＲｓを区別する。哺乳動物系に対する実験的利点、すなわち内生ＲＡＲｓＳＲＸＲｓおよびＲＡイソメラーゼ活性の不在は、酵母を、レチノイドングナル形質導入の背景をなしている分子機構を調べるための優れたモデルとしている。

ＲＡＲａおよびＲＸＲａにおける自律的活性化機能（ＡＦｓ）の特徴付１九図１０ａに示すキメラレセプターを、表示するようにＴ−ＲＡおよび９Ｃ−ＲＡの存在下または不在下、酵母株ＰＬ３において３ＥＲＥ−ＵＲＡ３レポーター遺伝子を活性化する能力について試験した。挿入物なしのベクターはコントロール（「なし」）として用いた。トランス活性化のデータはＯＭＰデカ、−ゼ活性として表しである１表に示す平均値は、各クローンについて３つの個々のトランスフォーマントを用いて２回アッセイを行って決定した。括弧内の数字は、リガンドの不在下で各レセプターについて観察した活性に対する倍誘発を示す。

配列表配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　１ｙ列の長さ：　２２８５塩基対配列の型：核酸鎖の数二両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ特徴を表す記号・ＣＤＳ存在位置＋７５．、．１４２０配列：ＣＣＴ　ＧＯＯＧＣＣＡＣＣＧＧＧ　ＧＯＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＡ　ＡＡＴ　ＧＡｃＣＣＡ　（ＦＴＯＡσ　ｇ３ＸＰｒｏ　Ｇｌｙ　入１ａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｃｌｙ　Ｇｌｙ　Ｂａｒ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　’Ｖａｌ　丁ｈ■ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：２ｙ列の長さ：４４８アミノ酸配列の型；アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列：Ｌ＠ｕ　Ｇｕｙ　Ｐｒｏ　Ａｍｐ　８ｅｒ　Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　８ｅｒ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ入−ｎ　Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕＩ　Ｓ　１０　１５５ｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　１１ｓ　）Ｌｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｉ）ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ　Ｐ秩B Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｓ＠ｒ　Ｃ１ｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　２１＠　Ａｓｎ　ｇ＠ｒ　ＴｈｒＶａｌ　Ｓ＠ｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

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ａｃ　１７ｓ］配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：４配列の長さ＝５３３アミノ酸配列の型二アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種＊：タンパク質配列：Ｈａｔ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　＾１１１　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｈ＠　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ　λ１ａ＾１龜Ｓ　１０　１５Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｃｙ＠Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ＾ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｈａｔ　Ｈｌｍ　ＣＹ＠　ＧＩＹ　Ｖｌｌ１２０　２Ｓ　３０人１畠ＳｅｒＡｒｇＴｒｐ＾ｒ９＾ｒｇＡｒｇＡｒｇＰｒｏＴｒｐＬ＠ｕＡｇｐＰｒｏＡｌａ＾１１λユ暑人１ａ　λ１龜　入１ａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　（ｉｌ■ ｓｏ　ｓｓ　ｇ。

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１）Ｓ　１２０　１２５Ｇｌｙ　Ｐｈ＠ｔｉ＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ＶａＩＳｅｒ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ｌｉｅ　）ｌｓｎ　ｌ＠ｘ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓ＠ｒＬ＠ｕＰｒｏＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＰｒｏＰｒｏＧｌｕＡｓｐＶａｌＬｙｓＰｒｏＰｒｏＶａ１１４５　１５０　１５５１ＧＯＬｅｕ　（ｉｌｙ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌ、＠ｕ　）Ｉｉｓ　Ｃｙｍ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　fｌソ１６５　１フ０　１７５！（ｉｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ’Ｔｙｒ　Ｓ＠ｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙａ　Ｌｙｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠Ｐｈ＊　Ｌｙ−＾ｒｇＴｈｒ　１１会　Ａｒｇ　Ｌｙｅ　Ａｓｐ　Ｌ、＠ｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ　Ｃｙｍ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａａｎ　Ｌｙｇ　Ａｓｐ　Ｃｙ■ Ｔｈｒ　Ｍａｌ　λ＃Ｐ　Ｌｙ−Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａａｎ　Ａｒｇ　Ｃｙｍ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　λｒ９　丁ｙｒ　Ｇ１ｎ２２５　２３０　２３Ｇ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）＋　７配列の長さ：１５２５塩基対配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ配列：Ｇ丁ＣＧＴＧＣ丁丁Ｃ？ＣＡＣＡＣＴＧＧ＾　ＧＧＡＧＣＩＳ２Ｓ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）＋　８配列の長さ：　１８８３塩基対配列の型：核酸鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状配列の種類−ＤＮＡ特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置［６，、，１８８３配列：配列１号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　９配列の長さ：４６７アミノ酸配列の型；アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列：ＭｅｔＡｓｐＴｈｒＬｙｓＨ１＠Ｐｈ＊Ｌ豐ｕＰｒｏＬ＠ｕＡｓｐＰｈｅＳ＠ｒＴｈｒＧｉｎＶａｌ入ｓｎ１　！ｌ　ｌｏ　１ｓ５ｅｒ　Ｈｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌ＠ｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　５ｅｒ　Ｈａｔ＾１ｍ　Ｖｍｌ　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　Ｌ＠ｕ　）Ｉｉｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌ＊ｕ　Ｇａｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｉｌ＠Ｇｌｙ　６ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｙ　Ｓ＠ｒＪｌｓｐ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　ｌ１ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌηｒ　ｇｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ１４５　１５０　Ａ５Ｓ　＞Ｇ。

ｌｉ＠　Ｃｙｍ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｌｍ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　丁ｈｒ　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　丁１’ｐ　＾１■ ２７５２・０　２１１５Ｌｙｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　）Ｉｉｓ　Ｐｈｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌ＠ｕ　Ｐｒｏ　Ｌ億ｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　１１■ Ｌ＠ｕ　Ｌ＠ｕ　Ａｒｇ　Ａｌｅ　Ｇｌｙ　丁ｒｐ　Ａｓｎ　ＧＩＬＩ　Ｌａｕ　Ｌ＠Ｌｌ　ｌｉｅ　＾１ｓ　Ｓｉｒ　ｔｈｅ　Ｓｉｒ　）撃奄■ Ａｒｇ　Ｓ＠ｒ　ＩＩｓ　入１ｍ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　ｌｉ＠　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ａｌｍ　丁ｈｒ　Ｇｌｙ　Ｉ、ｍｕ　Ｈ１■ ’３２５　３３０　）コ５ＶｓｌＨ１ｓＮｒｇｋｅｎｇ＠ｒλ１ａ阻５Ｓｉｒ＾１ａＧｌｙＶａｎＧｌｙＡｌａＩＩ峨Ｐｈ＊Ａｓｐ３４０　３４５　３ＳＯＡｒｇＶａｎＬｅｕ丁ｈｒＧｌｕＬａｕνａｌＳａｒＬｙｓＭｅｔＡｒｇ＾ｓｐ＋４ｅｔＧｉｎＭｅｔＡｓｐ：ｉＳＳ　３６０Ｖａ１丁）−【＾１ｍｇ＠ｒＬａｕＧｌｕＡｌａＴｙｒＣｙｓＬｙｓｌ（ｉｓＬｙｓＴｙｒＰｒｏＧ１ｕＧｉｎ４０５　４１０　ＧＳＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈ＠　λ１畠　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｌ＠ｕ　Ｌ＠ｕ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　＄’ｒｏ　Ａｌｍ　Ｌ龜ｕ　λτ９６敬τ！ｌｅ　Ｇｕｙ　Ｌａｕ　ＬＦ　Ｃｙｓ　Ｌ＋ａｕ　Ｇｌｕ　Ｈｌｍ　Ｌａｕ　Ｐｈａ　Ｐｈ＠ｔｈｅ　Ｌｙｅ　Ｌｅｕ　ＩＩｓ　Ｇｌｙ４３！ｌ　４４０　４４５配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：　１０配列の長さ：１４８８塩基対配列の型：核酸鎖の数二両形態トポロジー二直鎖状配列の種類：ＤＮＡ特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：３６．、．１４８７配列Ｃ入ＣＴＴＣＡＴＣ入ＡＧ　丁ｎ　ＣＣＣＡｃｅ　ＧＧＣｍ　ＧＧＴ　ＧＧＣ丁ＣＣＣＣＣＣＣｉＴ　Ｃ＾ＣＡＣＴ　１０１Ｊ（ｉｓ　Ｐｈａ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈ＠Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒｌｏ　ｉｓ　２０ＧＧＣＴＣＧ　ＡＣＣＴＣＣＡＴＧ　ＡＧＣＣＣＴ　ＴＣ＾ＧＴ＾ＧＣＣＴＴＧ　ＣＣＣＡｃＧ　ＧＧＧ　ＭＧ　ＧＣＡ　１４９Ｇｌｙ　５＠ｒ　丁ｈｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｌｍ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙａ　Ｐｒ。

２５　３０　３％為丁ＧＧ＾ＣＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＧＣＴＡＣＡＣＡＧ＾ＣＡＣＣｃｃ＾ＣＴＧ＾ＧＴＧＣＣＣＣ’ＴＣＧＧ１９７Ｍ！ｔ　Ａｓｐ　Ｓ＠ｒ　）Ｉｉｓ　Ｐｒｏ　Ｂ＠ｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　５＊ｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｒ■ ４０　４５　Ｓ。

ＡＣＧ　Ｃ’ｒＧ　ＡＧＴ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＧＧＡ　ＡＣＣＣＣＣＣＴＣＡＡ丁ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＧＧＣＴＣＴ　ＣＣＯＴＡ丁　２４５丁ｈｒ　１４１１　Ｓｅｒ　Ａｌｍ　Ｖｍｌ　Ｃ１ｙ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ａｌｍ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙ■ ５５　Ｇｏ　６５　７０ＡＧＡ　ＣＴＣＡＴＣＡＣＴ　丁ＣＴ　ＧＣＣ＾ＴＧ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＣＣＣ丁ＣＡ　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＣＴＣＧＣＡ　Ｃσ　２９３λｒｇ　Ｖａｌ　ＩＩｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｌｍ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｉ’ｒｏ　Ｂａｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ａｌｍ　為ｌ■ フｓ　ｓｏ　ａｓＧ　１４１１１１配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：１１配列の長さ：４８４アミノ酸配列の型二アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列：Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　）ｌｉｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　丁ｙｒ　ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇ１．ｙ　Ｃｙｓ　Ｌ凾■ Ｇｌｙ　Ｐｈ＠　Ｐｈｅ　Ｌｙｇ　Ａｒｇ　丁ｈｒ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇｌ、６Ｓ　ニア０　１フ５Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）　・１２Ａｉｍ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　（ｉｌｎ　Ｌ＠ｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　ＰｒB ２７５　２８０　２１１％）＋１ｓ　Ｐｈ＠Ｓ＠ｒ＾ｓｐ　Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｕ　Ａ＠ｐ　Ｇｌｎ　Ｖｌｌｌ　Ｉｌｅ　Ｌａｕ　ｔａｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ２９０　２９ｓ　３００Ｇｌｙ　丁ｒｐ　Ａｓｎ　Ｃ１ｕ　Ｌａｕ　Ｌ＠ｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｓ＠ｒ　Ｐｈ＠　Ｓｉｒ　Ｈｌｓ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　ｇｅｒ丁ｈｒ　Ｓ＠ｒ　Ｓｅｒ　Ａｉｍ　Ａｌｍ　Ａｌａ　ｇｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｌｓｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　λ”１４ＧＳ　４７０　４フ５　４ａＯＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｍｒｃ　Ｐｒｏ　Ｖａｎ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　１１拳ＬＩＩＬＩ　Ｇｌｕ＾ｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｓｕλ１ｍ　Ｖｍｌ　Ｇｌｕ配列の長さ＝４６１アミノ酸配列の型二アミノ酸トポロジー：直鎖状配列のｗｌ妬：タンパク質Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　（ｉｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｕｙ　ｋｒＧｌｙ　Ｓ＠ｒ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｘ１＠　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　入１ａ　Ａｓｐ２６０　２ＧＳ　２７０配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：１３配列の長さ＝４７５アミノ酸配列の型二アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質Ｍ＠ｔ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　５＠ｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｂａｒ　１ｌｒｏ　入−ｐ　Ｂａｒ　Ｓｅｔ　ｆａｒ　ＰｒB ｘ　ｓ　ｘｏ　１ｓＡｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｇ１＋ｖ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｉｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ＰｒB ２０　２６　３ＧＰｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＭｅｔＰｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　ｋｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈ＠Ｐｒｏ　ＶａｌＩｌｓｓｏ　ｓｓ　ｇ。

Ｓａｒ　ｇｅｒ　Ｂａｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　５ｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌ４ｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＰｈ＠ｇｅｒ　Ｇｌｙ　＄ｌｒｏ　Ｖａｌ　Ｂａｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｂａｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓａｒし昨１＋　９０　９５Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｇｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ＾ −ｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｇ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｖａｎ　Ｌｓｕｌｏｏ　１０５　１１０Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　丁ｙｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｌｙｅ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　丁ｈｒユ４５　１５０　１５５　１６０１１ａ　Ａｒｇ　Ｌｙｅ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｉ；ｓｒ　Ｃｙｍ　Ａｒｇ　入ｓｐ　Ａａｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｃｙ−丁ｈｒ１６５　１フＯニア５ＶａＩ　Ａｓｐ　Ｌｙｍ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ａａｎ　Ａｒｇ　Ｃｙｍ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｌａｙ■ １８０　１ｌｌｓ　１９０Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ａｌａ　丁ｈｒ’　Ｇｌｙ　Ｍａｃ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｈａ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇ１■ Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｉｍ　Ｐｒ。

Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｈａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ＾１ｍ　Ｖｍｌ　ＧｌｕＧｉｎ　Ｌｙｅ　Ｓ＠ｒ　Ｒａｐ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　５ｓｒＧａｙ　Ｓ＠ｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｇｎ　Ｚｌｅ　Ｃ７０Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｓｐ２ｇ０　２６Ｓ　２７０Ｌｙｅ　Ｇｌｎ　ｔ、ｅｕ　Ｐｈｅ　丁ｈｒ　Ｌ句ｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｌｙｅ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　阻−Ｐｈ５２７５　２ａ０　２１１５１’ｒｏ　Ｂａｒ　Ｃ１ｕ　Ｖａｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｅａｒ　１ｉｅｕ　Ｇ撃■ ３ａ５　３９０　３９５　４０ＧＴｈｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　ｊｌｌａ　Ｌｙ■ ４１）Ｓ　４１０　４１５Ｌｍｕ　Ｌｅｕ　Ｌ會ｕ　Ａｒｇ　Ｌｌ）ｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ｂａｒ　Ｘｉｓ　Ｏｌｙ　Ｌｅｕ　ＬＹ＠　Ｃｙｍ　Ｌａ■ ４２０　、　４２５　Ｄ。

Ｇｌｕ　）Ｉｉｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈ＠Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｌｙｅ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ＾−ｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｘ’ｌ＠Ａｓｐ　Ｔｈｒ４３５　４４０　４４ｓ八ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　丁ｙｒ　Ｍａｔ　ＰｈＩＩ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｍ＠ｅ　Ｌ＠ｕ　Ｍａｅ　Ｌｙｓ　ＩＩｓ　Ｔｈ■ ｌ　５）Ｏ、Ｉｓ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　２０配列の長さ・３６アミノ酸配列の型・アミノ酸トポロジー−＠鎖状配列の種類、ペプチド配列・配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）＋　２１配列の長さ　３６アミノ酸配列の型・アミノ酸トポロン−１直艙状配列の種類　ペプチド配列ｒπ言１小Ｗ★　、つζ７２　ノ幻配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：２２配列の長さ：３６アミノ酸配列の型二アミノ酸トポロジー　＋１［錦秋配列の種類：ペプチド配列Ａｓｐ　Ｓ＠ｒ　Ｍｅｔ、Ｓａｒ　Ｌ＠ｕ　Ｖａｌ　Ｐｈ＠　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｌｙｍ　Ｌｓｕ　Ｌａｕ　Ｓａｔ　ｌｉｅ　Ｌｅｕ　丁ｈｒｌ　Ｓ　１０　ｌ５Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　丁ｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　八ｌａ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｃｙａ　Ｐｈｅ　Ｓａｒ　ＬｓｕＬｙｉ　Ｌｓｕ　Ｌｙｅ　Ａｓｎ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　２３配列の長さ　３６アミノ酸配列の型　アミノ酸トポロン−直鎖状１列の種類・ペプチド配列・配列の種類；ペプチド配列の＆Ｅ：６：ａｙミノ顕配列の型二アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列：配列番号（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ）：　２５配列の長さ、３６アミノ酸配列の型・アミノ酸トポロジー二直鎮状配列の種類・ペプチド配列Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇ１．ｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｚｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　ＰｒB Ｓ　、　１０　１５Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　Ｈｉｓ　丁ｈｒ　Ｇｌｕ　ＬｙＢ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ２０　２Ｓ３０Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　）ｉｉｓ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）　・２６配列の長さ　３６アミノ酸配列の型、アミノ酸トポロジー　直鎖状配列：Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｐｈ＠Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ｔａｕ　Ｌａｕ　１１＊　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

ＩＳ　ｉｏ　１５配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　２７配列の長さ：３６アミノ酸配列の型　アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列・Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｓｅｒ　Ｃｙ＋＋　Ｌａｕ　ｇｅｒ＾ｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

Ｓ　ｎｏ　１５Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　にｌｒ＋　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　ｒｌｅ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｌａ■ ２０　２５　３ＧＬｙｌｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　入呼Ｓ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　２８配列の長さ＝３６アミノ酸配列の型　アミノ酸トポロジー・直鎖状配列の種類、ペプチド配列入ｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓ＠ｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｅ　Ｌ＠ｕ　Ｌａｕ　！Ｒｅ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｐｒ。

ＩＳ　１０　１ｓＡｓｐ　Ｌ４ｕ＾巧τｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　）Ｉｉ＠Ｓａｒ　Ｇ１１ｌ　ＬＹ＠　Ｌａｕ　Ｌ４ｕ　５ｅｒ番１ｈ１２ＸＲ−βＩ　Ｍ！！ＩＡＭ’ＰＰＦＬＰ［ＧＳＷＩＪｌν［ＣＩＶｆｉＸＡＴＡＬＡ準５ＧＧｉｉｉ＊１ｉｉｒ璽Ｉ夏夏ＩＩＦＩＧ、２ＡＦＩＧ、　４ＡＦＩＧ、　４ＢＦＩＧ、　５ＡＦＩＧ、　５ＢＦＩＧ、　６Ａ複合体の生成ＦＩＧ、　６ＢｍＲＸＲ−αＭ　−＋−−今一＋−−十一−十−＋−−十−ｍＲＸＲ−ＱＡＣ４ −−＋−−＋−＋−＋＋ｗ＋＋＋＋　＋＋４ｈ日Ａ日−γΔＣ４−−−＋＋＋− −−−−＋＋＋−−１２３４５６７８９１（Ｎ１１２１３１４１５１６　１２３Ａｂ４γ　〜−−＋　−−−＋−＋＋＋−−−山（寸０■■　■円旧ト〜「 −　〇の口（ト）寸■ω−寸一い　寸曽寸ψ　寸？ＬＩ”）わ０ψ ｘ　Ｃｆ５Ｌｎ（”’Ｉ寸　會■口〜さのＣ）　ｔ＋０Ｌｎｌ”ｙｅ＋　−寸り ■ロトＵ”ｚ　（”＋　Ｍ　（”）　ｆｉ　？　？　Ｌ／”）　？　Ｌｎ　ｌ／ ’）倍誘発倍誘発ＯＭＰアカーゼ活性　（ＩＪ）ＯＭＰデカーゼ活性（ｕ）ＦＩＧ、１１Ｂ倍誘発ＦＩＧ、１１ＣＩＦＩＧ、１１Ｃ２フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｑ　１／６８　Ｚ　７８２３−４８ＧＯＩＮ　３０１０２　Ｂ　８３１０−２Ｊ３０／８８　Ｅ　８３１０−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃｌ　２　Ｒ１：６４５）（７１）出願人　ユニベルシテ・ルイ・バストウール・ストラスプール・アシフランス国６７０７０ストラスプール・セデックス、リュ・ブレーズ・パスカル４番　ボワット・ポスタル　１０３２／エフ（７１）出願人　イー・アール・スクイブ・アンド・サンズ・インコーホレイテッドアメリカ合衆国０８５４３−４０００ニユーシヤーシー州プリンストン、ローレンスビル−プリンストンロード（番地の表示なし）Ｉ（７２）発明者　レイド、マークフランス国６７０００ストラスプール、リュ・ドベルネ　２２番（７２）発明者　カストネール、フィリップフランス国６７００ストラスプール、ケ・ムーラネム　２８番（７２）発明者　シャンボン、ビニールフランス国６７１１３ブレセン、リュ・デュ・ドクトゥール・アルベール・シュヴエゼール４番

Claims

【特許請求の範囲】１．２つのサブユニットからなる実質的に純粋なヘテロダイマータンパク質であって、該サブユニットの一方はレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）または甲状線レセプター（ＴＲ）であり、該サブユニットの他方はレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）であるヘテロタイマータンパク質。２．該ＲＡＲがＲＡＲ−α、ＲＡＲ−β、またはＲＡＲ−γよりなる群から選ばれたものである請求項１に記載のヘテロダイマー。３．該ＲＸＲがＲＸＲ−α、ＲＸＲ−β、またはＲＸＲ−γよりなる群から選ばれたものである請求項１に記載のヘテロダイマー。４．該ＲＸＲがｍＲＸＲ−β１（配列番号２）、ｈＲＸＲ−β１（配列番号４）、ｈＲＸＲ−β２（配列番号６）、ｈＲＸＲ−β３、ｍＲＸＲ−α（配列番号９）、またはｍＲＸＲ−γ（配列番号１１）よりなる群から選ばれたものである請求項３に記載のヘテロダイマー。５．該ＴＲがＴＲ−αまたはＴＲ−βよりなる群から選はれたものである請求項１に記載のヘテロダイマー。６．該ＲＸＲがｍＲＸＲ−β１（配列番号２）、ｈＲＸＲ−β１（配列番号４）、ｈＲＸＲ−β２（配列番号４）、ｍＲＸＲ−α（配列番号９）、またはｍＲＸＲ−γ（配列番号１１）よりなる群から選ばれたものである請求項１に記載のヘテロダイマー。７．請求項１に記載のヘテロダイマーのいずれか一つに結合することのできるＤＮＡ配列。８．請求項１に記載のヘテロダイマーのいずれか一つに結合することのできる抗体。９．ヘテロダイマータンパク質に結合することのできる因子を同定する方法であって、該ヘテロダイマーのサブユニットの一つがＲＡＲまたはＴＲからなり、該ヘテロダイマーの他方のサブユニットがＲＸＲであり、因子をＲＡＲ／ＲＸＲまたはＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマーとともにインキュベートし；ついで該因子が該ヘテロダイマーに結合したかどうかを決定する工程からなることを特徴とする方法。１０．該インキュベーションが、該ヘテロダイマーによって結合され得るＤＮＡ配列をさらに含む請求項９に記載の方法。１１．ＲＥに機能的に連結した配列をトランス活性化することのできる因子を同定する方法であって、ＲＥに機能的に連結したレポーター配列を含む細胞、生物またはその抽出物を該因子とともにインキュベートし；ついで該レポーター配列の発現についてアッセイする工程からなり、該細胞または生物が１または２以上のＲＡＲ／ＲＸＲまたはＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマーを発現するように変えてあることを特徴とする方法。１２．レチノイン酸、およびその誘導体を代謝することのできる酵素をコードするＤＮＡ配列の同定方法であって、（１）試験しようとするＤＮＡ配列が発現されるように該ＤＮＡ配列で細胞または生物をトランスフェクションし；（２）該細胞、該生物、またはその抽出物を該レチノイド、または該誘導体とともにインキュベートし；ついで（３）レポーター配列の発現についてアッセイする工程からなり、該細胞または該生物は、ＲＡＲＥに機能的に連結したレポーター配列を含有するように変えてあり、さらに１または２以上のＲＡＲ／ＲＸＲまたはＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマーを発現するように変えてあることを特徴とする方法。１３．ＲＸＲまたはＴＲとヘテロダイマーを生成するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法であって、（１）試験しようとするＤＮＡ配列が発現されるように該ＤＮＡ配列で細胞または生物をトランスフェクションし；（２）該細胞、該生物、またはその抽出物をレチノイン酸またはその誘導体とともにインキュベートし；ついで（３）レポーター配列の発現についてアッセイする工程からなり、該細胞または該生物は、ＲＡＲＥに機能的に連結したレポーター配列を含有するように変えてあり、さらにＲＡＲＥに機能的に連結したレポーター配列を含有するように変えてあり、さらに１または２以上のＲＸＲまたはＴＲサブユニットを発現するように変えてあることを特徴とする方法。１４．該レセプターの活性化に必要なタンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定する方法であって、（１）試験しようとするＤＮＡ配列が発現されるように該ＤＮＡ配列で細胞または生物をトランスフェクションし；（２）該細胞または該生物、またはその抽出物を因子とともにインキュベートし；っい、で（３）レポーター配列の発現についてアッセイする工程からなり、該細胞または該生物は、該応答要素に機能的に連結したレポーター配列を含有するように変えてあり、さらに１または２以上の該レセプターを発現するように変えてあることを特徴とする方法。１５．該該レセプターがＲＡＲまたはＴＲのいずれかであり、該該応答要素がＲＡＲＥまたはＴＲＥのいずれかであり、該因子がレチノイン酸またはその誘導体である請求項２４に記載の方法。１６．該細胞または該生物が真該細胞である請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法。１７．該真該細胞が酵母である請求項１６に記載の方法。１８．因子に応答してＤＮＡ配列の発現を指令する方法であって、該ＤＮＡ配列にＲＥを機能的に連結させる工程からなり、該ＲＥは該因子がＲＡＲ／ＲＸＲまたはＴＲ／ＲＸＲヘテロダイマーに結合した場合に転写的に活性化されることを特徴とする方法。１９．該細胞が酵母細胞である請求項１８に記載の方法。２０．ＲＸＲ−γのイソ形をコードするＤＮＡ配列。２１．該ＤＮＡ配列が配列番号１０に示す配列である請求項２０に記載のＤＮＡ配列。２２．ＲＸＲ−βのイソ形をコードするＤＮＡ配列。２３．該配列が配列番号３、５または７よりなる群から選ばれた配列である請求項２２に記載のＤＮＡ配列。２４．マウスＲＸＲ−αのイソ形をコードするＤＮＡ配列。２５．該配列が配列番号８に示す配列である請求項２４に記載のＤＮＡ配列。２６．配列番号１、３、５、７、８または１０のいずれか一つとハイブリダイズすることのできるヒトから単離したＤＮＡ配列。２７．実質的に純粋なＲＸＲ。２８．ＲＸＲ−α、ＲＸＲ−β、またはＲＸＲ−γよりなる群から選はれたものである請求項２７に記載のＲＸＲ。２９．配列番号２、４、６、９、１１、１２、または１３よりなる群から選ばれたものである請求項２８に記載のＲＸＲ。３０．約１４６１〜７，７５０，０００ｃｐｍ／μｇの比活性を有する請求項２７のいずれか一つに記載のＲＸＲ。３１．約２２，０００〜７，７５０，０００ｃｐｍ／μｇの比活性を有する請求項２７に記載のＲＸＲ。３２．約７８，３３３〜７，７５０，０００ｃｐｍ／μｇの比活性を有する請求項２７に記載のＲＸＲ。３３．約３１５，７８９〜７，７５０，０００ｃｐｍ／μｇの比活性を有する請求項２７に記載のＲＸＲ。３４．ＲＸＲの精製方法であって、（ａ）約５０ｍＭからのＫＣｌを含有する緩衝液の存在下、該ＲＸＲを含有する試料をＤＥＡＥクロマトグラフィーカラムと接触させ；ついで（ｂ）該カラムからフラクションによる流れ中の該ＲＸＲを回収する工程からなることを特徴とする方法。３５．さらに（ａ）該フラクションによる流れをＨＥＰ−ＵＧカラムと接触させ；ついで；（ｂ）約２９０ｍＭからのＫＣｌを用いて該カラムから該ＲＸＲを溶出する工程を含む請求項３４に記載の方法。３６．さらに（ａ）該ＫＣｌ溶出ＲＸＲをフェニル−５ＰＷカラムと接触させ；ついで（ｂ）約２５０ｍＭからの硫酸アンモニウムを用いて該カラムから該ＲＸＲを溶出する工程を含む請求項３５に記載の方法。３７．さらに（ａ）該硫酸アンモニウム溶出ＲＸＲをＨＥＰ−ＴＳＫカラムと接触させ；ついで（ｂ）約２５０ｍＭからのＫＣｌを用いて該カラムから該ＲＸＲを溶出する工程を含む請求項３６に記載の方法。３８．さらに（ａ）該ＫＣｌ溶出ＲＸＲをＨＡＰ−ＴＳＫカラムと接触させ；ついで（ｂ）約１５０ｍＭからのリン酸カリウムを用いて該カラムから該ＲＸＲを溶出する工程を含む請求項３７に記載の方法。