JPH06509944A - 特定Ｆｃεレセプターのための免疫グロブリン変異体 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 特定Ｆｃεレセプターのための免疫グロブリン変異体発明の背景 この発明は、アミノ酸配列変異体抗１ｇＥ抗体およびＩｇＥ配列を含有するポリ ペプチドに関し、とりわけＩｇＥアンタゴニストおよびＦｃεＲ１およびＦｃε Ｒ１１に対して識別結合が可能なポリペプチドに関する。

ＩｇＥは、喘息、食物アレルギー、第１型通敏症および広範囲で患う家族性屡炎 症などのアレルギ一応答を媒介する免疫グロブリン群の一つである。ＩｇＥは、 Ｂ細胞により分泌され、Ｂ細胞の表面上に発現される。Ｂ細胞によって合成され たＩｇＥは、短い膜結合領域により成熟ＩｇＥ配列に結合した縁膜ドメインによ りＢ細胞膜内に固着される（ａｎｃｈｏｒｅｄ）。ＩｇＥはまた、そのＦｃ領域 を介してＢ細胞（および単核細胞、好酸球および血小板）の低親和性１ｇＥレセ プター（ＦｃεＲ１１、以下、ｒＦ　ＣＥ　ＬＪと称する）に結合する。哺乳動 物がアレルゲンに暴露されると、該アレルゲンに結合するＩｇＥを合成するＢ細 胞がクローン的に増幅される。このＩｇＥが、今度はＢ細胞によって循環血流中 に放出され、ＩｇＥはマスト細胞および好塩基球の表面上に認められるいわゆる 高親和性レセプター（ＦｃεＲ１、以下、ｒＦＣＥＨＪと称する）を介してマス ト細胞および好塩基球により結合される。かくして、そのようなマスト細胞およ び好塩基球はアレルゲンについて感作される。該アレルゲンに次に暴露されると 、これら細胞上のＦｃεＲ１と交差反応し、それゆえ臨床的過敏症およびアナフ ィラキシ−の原因であるヒスタミンおよび他の因子の放出が活性化される。

当該技術分野では、ＦＣＥＬ−結合１ｇＥには結合し得るがＦＣＥＨ上に位置す るＩｇＥには結合し得ない抗体が報告されている（たとえば、ＷＯ８９１００１ ３８および米国特許第４．９４０．７８２号参照）。これら抗体は、Ｂ細胞上に 認められるＩｇＥまたは体内を遊離して循環しているＩｇＥには結合するがＦＣ ＥＨには結合せず、それゆえマスト細胞または好塩基球を活性化しないであろう ので臨床的に有利であることが開示されている。加えて、免疫グロブリンの種々 のアミノ酸配列変異体、たとえば「キメラ」抗体および「ヒト化」抗体が知られ テイル（タトエば、米国特許第４．８１６，５６７号、ＷＯ９１１０９９６８： ＥＰ　４５２．５０８号、およびＷｏ　９１／１６９２７参照）。ヒト化抗体と は、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列を最小しか含まない免疫グロブリン、 免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（Ｆｖ、ＦａｂＳＦａｂ’、Ｆ（ａｂ ’）ｚまたは抗体の他の抗原結合配列など）である。大部分においてヒト化抗体 はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエンドの相補性決定 部位（ＣＤＲ，）からの残基が所望の特異性、親和性および能力を有するマウス 、ラットやウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置換され ているものである。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠組み残基が対応 する非ヒト残基により置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエンド抗 体にも移入されたＣＤＲもしくは枠組み配列のいずれにも認められない残基を含 有していてよい。これら修飾は、以下でさらに詳細に記載するように、抗体性能 をさらに洗練し最適化するために行う。−価抗体および二特異的（ｂｉｓｐｅｃ ｉｆｉｃ）抗体もまた本質的に知られている。

ＦＣＥＨもまたＦＣＥＬと同様、ＩｇＥの定常（Ｆｃ）　ドメイン中の認識部位 に結合することが一般に理解される。これら２つのレセプターに対するＩｇＥの 認、識部位については、これまでこの問題を解決するために向けられた相当の努 力にもかかわらず殆ど定められていない。

過去１０年間の間に、ＩｇＥ分子のどの部分がＦｃｅＲＩおよびＦＣＥＲＩＩへ の結合に関与するのかを決定するために幾つかの研究がなされている。本質的に ３つのアプローチが試みられている。まず、ＩｇＥ配列の特定部分に対応するペ プチドをＩｇＥ−レセプター結合の競合インヒビターとして（パート（Ｂ　ｕｒ ｔ）ら、Ｅｕｒ、Ｊ、ｆｍｕｎ、１７：４３７−４４０　［１９８７コ　；ヘル ム（Ｈｅ１ｍ）　ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３１１１８０〜１８３　［１９８８］　 ：ヘルムら、Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

−≦ヨエ、８６　：　９４６５−９４６９　［１９８９コ　、ベルセリ　（ｆｅ ｒｃｅｌｌｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３８１６４９−６５１　［１９８９］　； ニオ（Ｎｉｏ）ら、ＰｅｐｔｉｄｅＣｈｅＩＩｉｓｔｒＶ、２０３−２０８　［ １，９９０］　）　、またはＩｇＥ−レセプター相互反応をブロックする抗１ｇ Ｅ抗体を産生させるために（パートら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｉ■ｓｕｎ。

は、ＩｇＥ残基３２９〜４０９に対応するペプチドがインビボでヒトＩｇＥ抗体 によるヒト好塩基顆粒球の感作をブロックすることを見いだした。さらに研究を したところ、残基３９５〜４０９は該３２９〜４０９ペプチドのＦｃεＲ１への 列を有しているが、本明細書に用いる免疫グロブリン残基番号はカバット（Ｋａ ｂａｔ）ら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉ　ｍｍｕ ｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｔ　ｎｔｅｒｅｓｔ　（国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａ ｌ　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）　、ベセスダ、メリーラン ド州、１９８７））のものであることに注意すべきである。

ベルセリら（Ｎａｔｕｒｅ、３３８　：　６４９〜６５１　（１９８９））は、 ヒトＩｇＥのＢ細胞（ＦＣＥＲＩＩ）結合部位を調べるために組換えＩｇＥペプ チド並びに抗Ｆｃεモノクローナル抗体を用いた。彼らは、ＦｃεＲ１１結合部 位かに３９９−Ｖ２Ｏ３近くのＦｃε３内に存在すると結論した。

パートら（Ｅｕｒ、　Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎ、１７　：　４３７〜４４０　（１ ９８７））は、ラットマスト細胞への結合におけるラットＩｇＨに対する競合に ついて７つのペプチドを調べた。彼らの最も活性なペプチドであるｐ１２９はＩ ｇＥよりも１０００倍低い活性であった。ｐ１２９は、ループＥＦを含むヒト配 列４３９〜４５３に対応する。Ｆｃε３ドメイン中の残基３９６〜４１９に対応 する彼らの他のペプチドであるｐ１３０は活性を有しなかった。

幾つかの合成ペプチドにより誘発された配列特異的（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｉｒ ｅｃｔｅｄ）抗体によるＩｇＥ結合を評価した。彼らは、彼らのε−ペプチド− ４により定められる配列（残基４４６〜４６０に対応）はレセプター結合に有意 に関与していないが、彼らのε−ペプチド−３により定められる配列（残基３８ ７〜４０１に対応）はＩｇＥ−レセプター認識部位の近傍に存在しそうだと結論 した。

ニオら（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃｈｅ＋＋１ｓｔｒｙ、　２０３−２０８　（１９９ ０）　）は、インビトロでのヒト好塩基球によるヒスタミン放出を阻害する能力 に関して多くのペプチドを評価した。一つのペプチド（ペプチド２、表１）のみ が特異的な阻害を示した。このペプチドは残基３７６〜３８８を包含していた。

しかしながら、この配列を含む一層大きなペプチド（ペプチド３、表１）は阻害 活性を有しなかった。

第二に、ＩｇＨにおける変異が部分的に探求されている。ンユバルツバウム（Ｓ 　ｃｈｗａｒｚｂａｕｍ）ら（Ｅｕｒ、　Ｊ　、　Ｉ　ｍｍｕｎ、１＠：１０１ ５〜１０２３［１９８９］、上記）は、点突然変異体Ｐ４０４Ｈ（本明細書にお ける番号付けによればＰ４４２Ｈ）はラット好塩基白血病（ＲＢＬ）細胞上のＦ ｃεＲＩに対して２倍減少した親和性を有していることを発見したが、この知見 の解釈は議論の多いものである（ライ−トール（Ｗｅｅｔａｌｌ）　ら、Ｊ　、 　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌ、１４５　：３８４９−３８５４［１９９０１）。

第三に、キメラ分子が構築されている。ヒトＩｇＥはマウスレセプターに結合し ないが（クルツズツキ−（Ｋｕｌｃｚｙｃｋｉ　Ｊｒ、）ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅ ｄ、、　１３９　：　６００〜６１６　［１９７４］　）、醤歯頚のＩｇＥはヒ トレセプターに減少した親和性１：、Ｔ、　結合ｔ　ル（ｍｌ　ンラート（Ｃｏ ｎｒａｄ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３０　：　３２７〜３３３　［１９８３ ］　）；ヒトＩｇＧ１はＩｇＥレセプターに結合しない（ライ−トールら、Ｊ、 １ｍ１ｌＩｕｎｏｌ、１４５　：　３８４９〜３８５４　［１９９０１）、これ ら観察に基づき、幾つかの研究者グループがヒト−マウスキメラまたはヒ）Ｉｇ Ｅ−Ｔ　ｇＧ＋ｌ　ラヲｔ１４ｔｊ５シタ。ライ−トールら（Ｊ、１ｍ１ＩＩｕ ｎｏ１．１４５：３８４９〜３８５４　（１９９０）　）は、一連のヒトＩｇＧ １−マウスＩｇＥキメラを作製し、Ｆｃε２およびＦｃε３ドメインはマウスＦ ｃεＲ１への結合に関与するが、Ｆｃε４ドメインはマウスＦｃεＲ１への結合 に関与していそうになＬｌ（Ｌかし、ＦｃεＲＩＩへの結合には関与している可 能性がある）と結論した。しかしながら、これら結論は不確かなものである。と いうのは、彼らはキメラによる結合の不在に主として頼っており、５つのキメラ のうち３つは幾つかの鎖内ジスルフィド結合を欠いていたからである。

ニラシム（Ｎｉｓｓｉｍ）ら（ＥＭＢＯＪ、、１．０　＋　１０１〜１０７　（ １９９１））は、一連のヒトーマウスＩｇＥキメラを構築してＲＢＬ細胞への結 合を測定し、ＲＢＬ細胞上の特定Ｆｃεレセプターに高親和性で結合するＩｇＥ の部分がＦｃε３に帰することができると結論した。

これら著者（たとえば、ヘルムらおよびパートら）により報告されている結果は 首尾一貫していない。さらに、抗１ｇＥ抗体の場合には、立体障害による非特異 的なブロックの可能性を排除することは困難である（ンユバルツノくラムら、Ｅ ｕｒＪ、Ｉｍｍｕｎ、、１９　：　１０１５−１０’２３　［１９８９］　）、 ＩｇＥのＦＣＥＨへの結合に関与するＩｇＥのドメインまたはＦＣＥＨへのＴｇ Ｅ結合の原因であるＩｇＥコンフオメーソヨンの維持に関与するＩｇＨのドメイ ンに関して、当該技術分野で相当の混乱が存在することは明らかである。

この発明の目的は、ＦＣＥＬおよびＦ　ＣＥ　Ｈへの識別結合が可能なポリペプ チドを同定することである。

本明細書における目的は、ＦＣＥＨレセプター結合には係るがＦＣＥＬレセプタ ー結合には関与しない（またはその逆）ＩｇＥドメインを決定することである。

本明細書における他の目的は、ＦｃεのＦＣＥＨまたはＦＣＥＬレセプター結合 ドメインを中和するアンタゴニストを含む、アレルギ一応答を阻害し得るアンタ ゴニスト、ＦＣＥＬには結合するがＦ　ＣＥ　Ｈには結合しない免疫グロブリン 類似体もしくはＦＣＥＨには結合するがＦＣＥＬには結合しない免疫グロブリン 類似体、およびＦＣＥＬ結合１結合１トＥ合するがＦＣＥＨ結合１結合１碓Ｈ合 しないヒト化抗ｈｕ１ｇＥ抗体もしくはＩｇＥには結合するがヒスタミン放出も しくはマスト細胞の脱顆粒を誘発しないヒト化抗ｈｕ１ｇＥ抗体を同定すること １こある。

本発明者らは、ＩｇＥをそのＦＣＥＬおよびＦＣＥＨレセプターに結合させるう えで重要な役割を果たすＩｇＥのドメインおよび特定の残基を同定し、この情報 に基づき、本発明者らは、これら２つのレセプターのうちの一方のみに実質的に 結合することができるがこれらレセプターの他方には実質的に結合することので きないポリペプチドを設計した。これらポリペプチドは識別結合ポリペプチドと 称される。とりわけ、ＦＣＥＬに結合する識別結合ポリペプチドは、ループＥＦ またはβ鎖りドメイン中の１またはそれ以上の残基が変化したＩｇＥ配列からな り、またＦＣＥＨ−結合ポリペプチドは、ループＡＢおよび／またはβ鎖Ｂ配列 が変化したＩｇＥ配列からなる。逆に、本発明に含まれるのは、機能性のＩｇＥ ループＥＦおよびβＩＤドメインからなるがループＡＢおよび／またはβ鎖Ｂド メインは野性型に比べて機能性が減少したある種のポリペプチド（ＦＣＥＨζこ 識別的に結合する）、および機能性のループＡＢおよびβ鎖Ｂドメインからなる がβ鎖りおよび／またはループＥＦドメインは野性型に比べて機能性が減少した ポリペプチド（ＦＣＥＬに結合する）である。

この発明の識別結合ポリペプチドは、ＦＣＥＬまたはＦＣＥＨに対する結合能を 保持しているのでＩｇＥＨ鎖のアミノ酸配列と充分に相同性を有してＬするが、 天然のＩｇＨに比べてこれら２つのレセプターの一方に対して減少しこ結合能を 示す点で変異している。種々の態様において、この発明のポリペプチド（よさら （こ、細胞毒性ポリペプチド、検出可能な標識、フンフオメーンヨン制限基およ び／またはＩｇＥに異種のアミノ酸配列、たとえば以下にさらに記載するように レセプターまたは免疫グロブリンに由来する配列を含む。他の態様におＬ＼て、 識別結合ポリペプチドは、上記レセプター結合ドメインに加えて、たとえば前以 て決定された抗原を結合することのできる少なくとも一つの可変ドメインを含む 。他の態様において、識別結合ポリペプチドは、前以て決定された抗原に対して 一価の■ｇＥ変異体である。さらに別の態様において、識別結合ポリペプチド（ ま、不活性なＩｇＥ可変ドメイン、すなわちいかなる抗原とも結合することので きな（１ものまたは可変ドメインもしくは機能性のＣＤＲを欠いたものを含む。

この発明の識別結合ポリペプチドは、ＩｇＥレセプターのための診断手順まｔニ はアレルギーなどのＩｇＥに媒介された疾患の治療に有用である。該ポリペプチ ドはまた、レセプター結合に参画するＩｇＥの領域に結合することのできる抗体 を調製するのに有用である。

この発明の態様において、アレルギーおよび他のＩｇＥに媒介される疾患の診断 または治療または予防に有用な変異体抗１ｇＥ抗体が提供される。この発明の特 定の態様において、１または２以上のヒト（レシピエンド）Ｌ鎖残基４．１３． １９．２４．２９．３０．３３．５５．５７．５８．７８．９３．９４または１ ０４、またはＨ鎖残基２４．３７．４８．４９．５４．５７．６０．６１．６３ ．６５．６７．６９．７８．８２．９７または１００を、好ましくはドナー（一 般にマウス）抗体中の対応位置に認められる残基で置換することにより修飾した 抗ＩｇＥ変異体抗体が提供される。好ましい態様において、選択される残基は、 Ｌ蛸１３．１９．５８．７８または１０４、−またはＨ鎖残基４８．４９．６０ ．６１．６３．６７．６９．８２または８２ｃであり、最も好ましいのはＨ鎖残 基６０．６１またはＬ鎖残基７８である。

他の態様において、本発明者らは、ＦＣＥＬ結合１結合１トＥ合することができ るがＦＣＥＨ結合１結合１碓Ｅ質的に結合することができずマスト細胞または好 塩基球からのヒスタミンの放出を誘発するこのできない抗体を提供し、該抗体は 、マウス抗ｈｕ１ｇＥ抗体ＭＡＥＩＩ、ＭＡＥ１３、ＭＡＥ１５またはＭＡＥ１ ７のカバソトＣＤＲドメインからの位置的に類似の残基が置換されたヒトカッく ・ソトＣＤＲドメインを含む。二特異的抗体およびＩｇＥ−価抗体、およびＩｇ Ｈに対してＭＡＥＩＩの約０１〜１００倍の親和性を示すヒト化抗体もまた本発 明において提供される。

図面の簡単な記載 図１は、ヒトＩｇＥＦｃε２およびＦｃε３の配列を示す（ＳＥＱ、ＩＤ、１） 。

この特定の配列は、パドランら（Ｍｏｌｅｃ、Ｉｍｍｕｎ、２３　：１０６３〜 １０７５　（１９８６））からのものである。残基の番号付けはカバソト（上記 ）に従った。ノくトランＩｇＥ配列をカハソトの番号付は方式と整合するために ｒＸＪ残基を含めである。種々のＩｇＥ変異体を調製するに際して変化させた配 列には下線を引いである：下線の下の太い数字は、変異体の番号を示す。β鎮残 基には、上に線を引いである。ループ残基は、２つのβ鎖の間に介在するすべて の残基として定義される。

図２は、ＭＡＥＩＩ　（ＳＥＱ、ＩＤ、２および３）　、ＭＡＥｌ３　（ＳＥＱ 、ＩＤ４および５）およびＭＡＥｌ５　（ＳＥＱ、ＩＤ、６および７）のＬ鎖お よびＨ鎖配列を示す。

図３は、ＨｕＭａｅｌｌＶｌのＨ鎮およびＬ鎖配列（ＳＥＱ、　Ｉ　Ｄ、　８お よび９）を示す。

図４８および４ｂは、それぞれ、マウスモノクローナル抗体Ｍａｅｌｌ並びに３ つのヒト化変異体（１型、８型および９型）による、ＦＣＥＬレセプターおよび ＦＣＥＨレセプターへのＴｇＥ結合の阻害％を示す。

図５ａ〜５ｂは、種々のｈｕ１ｇＥ変異体へのＭＡＥＩＩ、ＭＡＥｌ５およびＭ ＡＥｌ、７抗体の結合を比較する。ＭＡＥＩは、Ｂ細胞結合１ｇＥおよびマスト 細胞結合１ｇＥの両方に結合するコントロールとして提供されている。各図面中 の四角の囲みの中に載せた変異体は表１１で同定される。

発明の詳細な記載 この発明のＩｇＥ類似ポリペプチドは、天然に存在するＩｇＥの配列と相同なア ミノ酸配列を含有しており、ＦＣＥＬまたはＦＣＥＨに特異的または識別的に結 合するが種々の程度に両方には結合しない能力を有する。そのようなポリペプチ ドの野性型ＩｇＥに対する相同性の程度は重要ではない。というのは、ＩｇＥが これら２つのレセプターの一方に識別的または特異的に結合するのを可能にする のに充分なＩｇＥ配列のみを保持する必要があるからである。一般に、この発明 のポリペプチドはＩｇＥＦｃ類似体であり、天然に存在するＩｇＥＨ鎖Ｆｃ頌域 のポリベブヂド配列とおよそ８０％〜９９％相同であろう。相同性は、すべての 置換（保存的であると非保存的であるとを問わず）を非相同であるとし、最大の 相同性を得るために配列を整合する従来法により決定する。

本明細書において言及するＩｇＥＦｃ残基の番号付けはカバノドのものであるこ とが理解されるであろう。この発明の残基に関する教示を他のＩｇＥ　Ｆｃドメ インに適用するに際しては、残基を整合し残基番号を相関させるために候補配列 の全体を図１の配列と比較する必要があるであろう。加えて、所定のカバノド部 位番号におけるある個々の残基の同定は、種間相違または対立遺伝子相違のため にＩｇＥ毎に変化するかもしれない。たとえば、残基Ｒ３８３（ヒトＩｇＥ）に 置換が導入されると言う場合には、このことはＩｇＥ内の同じ部位に置換が導入 されることを意味し、それはたとえこの同じ部位（ループＡＢ中）が異なる残基 番号に位置していたりカバノドによって記載されるものとは異なる残基によって 親のＩｇＥまたは最初のＩｇＥ中で表されていてもそうであることが理解される であろう。しかしながら、明瞭および単純にするため、本明細書ではカバノドの ヒトＩｇＥＨ鎮配列の残基番号および同定を用いるであろう。幾つかのカバノド 残基はバドラン配列中で欠けており、この場合にはｒＸＪと称するスペーサー残 基の挿入によりカバノドの番号付けを保存することに注意すべきである（図１参 照）。

同様に、変異体、たとえばヒト北枕１ｇＥ免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＥ。

ＩｇＡまたはＩｇＤなど）の調製に用いる免疫グロブリン残基を明示するにもカ バソト系を用いる。好ましい聾様において、レシピエンドのヒト免疫グロブリン 部位の番号付けはカバノドサブグループｍ　（ＶＨ）共通配列およびにサブグル ープＩ　（Ｖ、）共通配列に従って行う。どのドナー残基がこれら力バット共通 残基に対応するかを決定するため、必要ならギャップを導入し、可変ドメインの システィン残基を主要な道標として用いて配列を最大限に整合させる。ＣＤＲ５ は抗体毎に相当変化する（そして定義によってカバソト共通配列と相同性を示さ ないであろう）ことに注意すべきである。枠組み残基（とりわけシスティン）の 最大整合は、ドナー抗体のＦ、領域に使用すべく、番号付は系において「スペー サー」残基の挿入を必要とするであろう。たとえば、以下で言及される残基ｒ２ ９ａＪ。

これは、対応残基が該共通配列中に存在しないが共通配列とドナー配列との最大 の整合を得るために必要な、マウスドナー抗体■□、ＣＤＲ中に認められる余分 の残基を表す。実際には、このドナーからヒト化抗体（１型）を調製する場合に は、それは残基２９ａを有するＶｌｌｌを含有するであろう。

この発明の識別結合ポリペプチドは、一般にＴｇＥＨ鎖Ｆｃ領域に相同な約５〜 ２５０残基を含有するが、通常は約１０〜１００のそのような残基を含有するで あろう。通常、ＩｇＥ　Ｆｃ３およびＦｃ４領域が存在するであろうが、Ｆｃ３ ドメインはレセプター結合に直接関与する残基を提供し、Ｆｃ４はコンフォメー ションの完全性を保証するために存在する。

一般に、該１ｇＥはヒトＩｇＥであるが、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ネコま たはブタＩｇＨなどの動物１ｇＥも含まれる。上記で記載したように、図１の配 列と比較したときにこれらＩｇＥには残基の同定および番号付けにおいて変異が 存在するであろう。

ＦＣＥＨおよびＦＣＥＬは、それぞれ、マスト細胞または好塩基球上に認められ る高親和性１ｇＥレセプター（ＦＣεＲＩ、インザカ（１５１１ｉｚａｋａ）ら 、１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　７　：　６８７〜７０２　「１９７３］ 　）　、および単核球、好酸球および血小板などの炎症に関与する細胞並びにＢ 細胞上に認められる低親和性レセプター（ＦＣεＲＩＩ、またはＣＤ２３）（カ プロンら、Ｉ　ｍｍｕｎ、　Ｔｏｄａｙ、　７１５〜１８　［１，９８６］　） として定義される。ＦＣＥＨおよびＦＣＥＬには、ＩｇＥに結合する対立遺伝子 および前決定アミノ酸配列変異体が含まれる。ＦＣＥＨには幾つかのポリペプチ ド鎖が含まれるが、ＩｇＥに結合するＦＣＥＨの部分はσ鎮であるので、アッセ イする必要のあるのは候補ポリペプチドのそのα鎖への結合がすべてである。

識別結合とは、相同な大ｉ１ｇＥが結合する程度の少なくとも約７５％の範囲で ＦＣＥＬまたはＦＣＥＨの一方に結合するが、他方のレセプターには相同なＩｇ Ｅが該他方の１ノセブターに結合する程度の約２０％以上では結合しないことを 意味する。結合は実施例３のアッセイにより決定する。この発明に含まれるのは 、これら２つのレセプターの一方に天然のＩｇＥよりも大きな程度で結合するこ とのできるポリペプチドである。

ＦＣＥＬ特異的ポリペプチド これらポリペプチドは、低親和性レセプターに優先的に結合する。これらポリペ プチドは、一般に、β鎖ＤドメインまたはループＥＦ内の残基が置換または欠失 しているか、および／またはそのような残基の一つに隣接して他の残基が挿入さ れたＦｃε３配列を含む。本発明の目的において、β鎖ＤドメインはＮ４１８− Ｘ４３１の範囲であり（図１、ＸはＵ２６６　ＩｇＥがらは省かれているがカバ ノド配列には認められる残基を示す）、ループＥＦはＧ４４４−Ｔ４５３の範囲 である。好ましいＦＣＥＬ特異的態様は変異体６（表６）であり、ヒトＩｇＥＨ 鎖配列に４２３−Ｒ４２８内の４残基の置換が実質的にＦＣＥＨ結合を破壊して いる。ＥＦループ変異を含む他のＦＣＥＬ特異的態様は、変異体８５．８９、お よび４９．５１．５２．８３．８６および８７の組み合わせである。これら部位 （ＤおよびＥＦドメイン）は、ＩｇＥＬ：６ＦｃＥＬへの結合に関与する主要な 部位であると思われる。しかしながら、これらβｔｉＪＩＤおよびループＥＦド メインが主要な突然変異誘発の標的であることが理解されれば、当業者であれば 本実施例に示した方法を用いて最適のＦＣＥＬ特異的ポリペプチドをありきたり にスクリーニングすることができるであろう。

好ましいＦＣＥＬ特異的ポリペプチドは、β鎖ＤドメインまたはループＥＦまた は両者内で残基が置換または欠失したものである。たとえば、変異体６を生成す るために４つの残基が置換されたが、これら置換のうちの一つまたはそれ以上が ＦＣＥＬ結合を保持しながらＦＣＥＨ結合を失わせているのがもじれない。ルー プＥＦ　（ＦＣＥＬおよびＦＣＥＨ結合の両方に関与している）に関しては、Ｆ ＣＥＬ特異的特異的１異Ｅ変異択するために両方の活性をスクリーニングするの が望ましい。たとえば、変異体８５（９つのＩｇＥ残基が、類似して位置するＩ ｇＧ残基によって置換されている）はＦＣＥＨへの結合は検出できないがＦＣＥ Ｌには結合する（表１１参照）。他方、部位４４４をｃ＋ｙからＬｅｕに変換す るといずれのレセプターへの結合も破壊されるが、部位４４７および４５２は両 レセプターへの結合に関与している。というのは、これら位置で変化が起こると ＦＣＥＬへの結合が妨げられるがＦＣＥＨ結合は破壊されないからである。

ＦＣＥＬ特異性のためのβ鎖り変異体 一般に、Ｄドメインの置換は非保存的である、すなわち、置換された残基は一般 に相同な天然ＩｇＥ内に認められるものと電荷、疎水性または大きさくｂｕｌｋ ）において実質的に異なっている。一般に、１４のβ鎖Ｄドメイン残基のうち最 大４つを変化させる（通常、残基４２３．４２４．４２６および／または４２８ ）が、一般にこれら残基のいずれか１〜５が変化に適している。一般にわずかに ４つの残基を変化させる必要があるが、最適には一つだけを変化させるであろう 。

Ｒ４２３および／またはに４２６は、ＡｒｇＳＨｉｓ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ 。

Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌＳ　Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ 。

ＴｈｒＳＡｓｐ、Ｇｌｕ、ＧｉｎおよびＡｓｎよりなる群から選ばれた残基のい ずれか、好ましくはＧｌｙ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、ＧｉｎおよびＡｓｐよりなる群が ら選ばれた残基のいずれか、最も好ましく！；ｔＰｒｏまたはＧｉｎで置換され る。

Ｒ４２４および／またはＲ４２５は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇ１ｎ５Ｈｉｓ、Ｌｙｓ 。

Ａｒｇ、Ｃｙｓ、、Ｍｅ　ｔＳＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌ ａ。

Ｖａｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＳｅｒおよびＴｈｒよりなる群から選ばれた残基のい ずれか、好ましくはＡｒｇＳＬｙｓ、Ｐｒｏ、ＧａｙおよびＨｉｓよりなる群か ら選ばれた残基のいずれか、最も好ましくはＡｒｇで置換される。

Ｒ４２８および／またはＲ４２２は、Ｃｙｓ、Ｍｅ　ｔＳＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒ ｐ。

ＰｒｏＳＧａｙ、Ａｌ　ａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｃｅＳＳｅｒＳＴｈｒ、Ａｓｐ 。

Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、ＨｉｓおよびＬｙｓ、好ましくはＣｙｓＳＭｅｔＳＰ ｈｅ。

Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇａｙ、Ａｈａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉ　］　ｅＳＳｅ ｒ。

ＴｈｒＳＡｓｐ、ＧｌｕＳＡｓｎおよびＧｉｎ、最も好ましくはＴｙｒで置換さ れる。

Ｔ４２１は、Ｃｙｓ、ＭｅｔＳＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｈ ａ。

Ｖａｌ、ＬｅｎＳｌ　］　ｅ、５ｅｒＳＡｓｐＳＧｌｕ、Ａｓｎ、、Ｇｌｎ、Ｈ ｉｓおよびＬｙｓ、好ましくはＭｅ　ｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＰｒｏＳＧ ａｙＳＡｈａ。

Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ｌ１ｅＳＡｓｐ、ＧｌｕＳＡｓｎＳＧｌｎ、ＨｉｓおよびＬｙ ｓ。

最も好ましくはＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｎ、Ｌｅｎおよ びＩｌｅで置換される。

５４２０は、Ｍｅｔ、ＰｈｅＳＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｙ、ＧｌｙＳＡｌａ、Ｖａ 　ｌ、Ｌｅｕおよびｌｉｅ、好ましくはＰｒｏまたはＧＩｙで置換される。

Ｘ４２９は、天然に存在する他のいずれのアミノ酸残基でも置換される。

最適の識別およびＦＣＥＬ結合活性は、変異の組み合わせによって達成されるで あろうと思われる。好ましくは、ＦＣＥＨまたはＦＣＥＬ結合は天然の相同Ｉｇ Ｅの１０％未満であり、場合により検出不能から天然の相同１ｇＥの３％の範囲 であり、一方、他のレセプターへの結合は天然の相同ＩｇＥの少なくとも約７５ ％から９０％、好ましくは９５％から１００％以上、たとえば１２５％の範囲で あろう。変異は可能な限り保存的であるべきである、すなわち疎水性、電荷また は大きさの変化が可能な限り穏やかでありながら、なおこれら識別結合特性を示 すポリペプチドが得られるべきである。

β鎖Ｄドメイン残基のいずれか一つまたはそれ以上が欠失していてもよい。残基 の欠失は、ＩｇＥ類似体中に免疫原となる可能性のある部位を導入しないという 利点を有する。

β鎖Ｄドメイン置換または欠失変異体候補の例を下記表１に示す。各変異体の配 列を決定するには、各部位の下の各変異体番号について残基を同定されたい。

たとえば、化合物１９の配列はＣ３８８Ｒ３８９Ｒ３９０などからなる。

１類似体中に置換されたアミノ酸残基 ２欠失を意味する。

β鎖りドメイン内の残基に隣接して１または２以上の外来残基を挿入することも 本発明の範囲に包含される。一般に、わずかに一つの残基を挿入するが、該ドメ イン内のいずれか一つの部位に隣接して２〜４またはそれ以上の残基を挿入する こともできる。免疫原部位の導入を回避するため、挿入する残基の数は小さい方 が好ましいであろう。しかしながら、このことは単なる選択の問題にすぎない。

一般に、挿入は単一の部位で行うが、いずれかの２またはそれ以上のβ鎖Ｄドメ イン残基に隣接して挿入を行うこともできる。

挿入は一般に下記残基の間に行う、４２２と４２３．４２３と４２４．４２４と ４２５．４２５と４２６．４２６と４２７．４２７と４２８および／または４２ ８と４２９゜挿入した残基は、一般に、両側の残基とは異なる電荷、大きさまた は疎水性特性を示すであろう。たとえば、挿入候補は下記表２から選択すること ができる。

表２ ＦＣＥＬ特異的ポリペプチドは、実質的にＦＣＥＬ結合を達成するのに必要なだ けのＩｇＥＦｃεＡＢ−ＢおよびループＥＦドメイン配列を含有しておりさえす ればよい。このことは、ＡＢ−ＢおよびループＥＦドメインを含むポリペプチド を調製し、両側または通常介在される残基、たとえばβ１ＪＩＡ（Ｎ末端）また はループＢＣ，β鎖Ｃ１ループＣＤ、β鎖Ｄ１ループＤＥ、β鎖Ｅ１β鎖Ｆ１ル ープＥＦ、ループＦＧ、β鎖Ｇ１およびＦｃε４（Ｃ末端）の数を増加させてい （ことにより容易に決定することができる。一般に、Ｆｃε３〜Ｆｃε４の全Ｉ ｇＥ配列を用いるが、とりわけＡＢ−Ｂドメイン、ループＥＦおよび介在配列を 含有する場合にはＡＢ−Ｂドメインを含有するＦｃε３のフラグメントで満足で きるものであり、他はＦＣＥＩ、に対する特異性を達成するための本発明の教示 に従って変化させてよい。

ＦＣＥＬ特異的ポリペプチドは、直線状またはフンフオメーノヨンが制限された ポリペプチドとして提供される。コンフオメーノヨン的な制限は、好ましくは環 状構造を生成するようにＮ末端またはＣ末端でポリペプチドを架橋することによ り達成する。好ましい態様において、該環状の形態は下記構造を有する。

式Ｉ 上記式中、（β３−ａｌｌ）は結合または配列−Ｒ３７３−Ｆ３８１であり：ａ １２およびＲ１８は疎水性アミノ酸残基であり、β１３およびβ１４は塩基性ア ミノ酸残基であり；β１５、β１７およびＲ１９は親水性アミノ酸残基である： Ｒ１は （ｄ）Ｃ６Ｃ＋２アリールオキジ、 （ｅ）アシルアミノ−Ｃ，−Ｃｓ−アルコキシ、（Ｖ）ピバロイルオキシエトキ シ、 （ｇ）Ｃｓ　Ｃｌ２７！Ｊ　ｈ　Ｃｌ　Ｃｓ　アルコキシ（式中、アリール基は 非置換であるかまたはニトロ、ハロ、Ｃ−Ｃ′４−アルコキシおよびアミノ基の １または２以上て置換されている）。

（ｈ）ヒドロキシ置換Ｃ２Ｃｓｌ換アルコキシ、および（ｉ）ジヒドロキシ置換 Ｃ３−Ｃ１１アルコキンから選ばれる。

Ｒ２、Ｒ８、Ｒ５、Ｒ７、Ｒ８は同じかまたは異なり、（ａ）水素、 （ｂ）Ｃ６Ｃ１２アリール（式中、アリール基は非置換であるがまたはニトロ、 ヒドロキシ、ハロ、Ｃｌ−Ｃｓアルキル、”口Ｃ＋　Ｃ６０）Ｌｒキ）Ｌｒ、ｃ ＋　Ｃｓフルコキン、アミ人フェニル、アセトアミド、ベンズアミド、ジーｃＩ −ｃ、アルキルアミ人Ｃ，−Ｃ，２アロイル、Ｃ＝Ｃ，アルカノイル、およびヒ ドロキシ置換Ｃ＋　Ｃｍアルキル基の１または２以上で置換されている）、（Ｃ ）ＣＩ　ＣＩ２アルキルまたはアルケニル、Ｃ３−自。シクロアルキルまたはＣ ３Ｃ１２（ハｏ、Ｃｌ　Ｃ＠フルコキン、Ｃｓ　Ｃｌ２アリールオキシ、ヒドロ キシ、アミノ、アセトアミド、Ｃ＝Ｃ，アルキルアミ人カルボキシまたはカルボ キサミドのいずれかで置換されている）。

Ｒ忙Ｒｓ、Ｒ６とＲ６、またはＲ７とＲ８は、任意におよび独立に一緒になって ４〜７原子（ヘテロ原子はＯ，Ｓ、またはＮＲｌｏ　（式中、亀。は水素、Ｃｌ 　Ｃｍ−アルキル、Ｃ１−Ｃ，−アルケニル、Ｃｔ　ＣＩ！−アリール、Ｃ５− 口。シクロアルキル、Ｃａ　Ｃ１−アリール−Ｃ，−Ｃ，−アルキル、Ｃ，−Ｃ ，−アルカノイル、およびＣａ　Ｃ１ｌアロイルから選ばれる）から選ばれる） の炭素環またはへテロ環を形成する、 Ｒ４は、水素、Ｃｌ−ＣＳ−アルキル、Ｃ２−Ｃ，−アルケニル、Ｃ，−ＣＩ２ −アリール、（４−ＣＩＯンクロアルキル、Ｃ８Ｃｌ２−アリール−Ｃ，−Ｃ， −アルキル、Ｃ１〜Ｃε−アルカノイル、およびｃｓ　Ｃ１２アロイルから選ば れる。

Ｒ２またはＲ３は、任意にＲ４と一緒になってピペリジン、ビロリンンまたはチ アゾリジン環を形成する。

Ｘは、ＯまたはＳ原子、ＮＲｏ＜式中、Ｒｏは水素、Ｃ，−Ｃ，−アルキル、Ｃ ３−〇、−アルケニル、Ｃ３−Ｃ，。ノクロアルギル、ｃａ　Ｃ１１−アリール 、Ｃａ　ｃ＋ｚ〜アリール−Ｃ，−Ｃ８−アルキル、Ｃ，−Ｃ，−アルカノイル 、またはＣ，Ｃ，□アロイルから選ばれる）、Ｃ６Ｃ１２アリール、ＣｌＣａア ルカノイルおよび（ＣＨ２）　ｋ　（式中、ｋはθ〜５の整数）から選ばれる。

および薬理学的に許容し得るその塩。

本明細書において特に断らない限り、アルキルおよびアルケニルは、そねぞれ、 直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和炭化水素鎖を示し：Ｃｅ　Ｃｌ２アリール 基は、たとえばフェニルやナフチルなどの非置換の芳香族環または縮合した芳香 族環を示し、ハロは、Ｆ、ＣＩ、ＢｒまたはＩ原子を示し、アルコキシは指示さ れた部位にＯを介して結合したアルキル基を示す。Ｃｌ　ＣａアルキルまたはＣ ２−Ｃ６アルケニル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル 、ブチル、オーブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、ビニル、アリル、 ブテニルなどが挙げられる；Ｃ３Ｃｏｏ−シクロアルキル基の例としては、ンク ロプロピル、ノクロペンチル、ノクロヘキシルなどが挙げられる。ヘテロ環とし ては、ピリジル、チェニル、フリル、インドリル、ベンズチェニル、イミダゾリ ル、チアゾリル、キノリニルおよびイソキノリニルが含まれるがこれらに限られ るものではない。疎水性アミノ酸残基としては、疎水性側鎖を有する天然に存在 するまたは合成の残基、たとえばＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｃｅ、Ｖａｌ、Ｎｏｒｌｅ ｕなどが含まれる。親水性アミノ酸残基としては、荷電したまたは非荷電の親水 性側鎖を存する天然に存在するまたは合成の残基、たとえばオルニチン、Ｓｅｒ 、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＬｙｓおよびＡｒｇなどが含ま れる。好ましくはＣ１５、Ｃ１７およびＣ１９は変化させないかまたは直鎖、第 二級または第三級のモノもしくはンヒドロキシ置換アルキル側鎖を有する。塩基 性アミノ酸は、たいていの場合、グアニジノまたはアミノ置換側鎖を有する。

この発明のＡＢ−Ｂドメインおよび／またはループＥＦを含有するＦＣＥＬ特異 的なポリペプチドは、場合により他の物質と結合しているかまたは別のポリペプ チドと融合している。この発明のポリペプチドは一般にＩｇＥ相同な配列のみを 含有するが、診断に使用するために標識していてもよい（酵素、放射性同位元素 、ビオチンまたはアビジン、安定なフリー−ラジカル、および化学ルミネセンス もしくは蛍光残基を通常の方法で用いて〕。この発明のポリペプチドはまた、非 ＩｇＥポリペプチド（細胞毒性または免疫抑制ポリペプチドなど）、他のＩｇＥ ポリペプチド（たとえば、Ｆｖ領領域、または前以て決定したリガンドもしくは 抗原に結合することのできるポリペプチドと融合させてもよい。

細胞毒性ポリペプチドとしては、ＴｇＧＦｃエフェクター配列およびポリペプチ ド毒素（ジフテリア毒素またはりンンＡ鎖などく米国特許第４．７１４．７４９ 号および同第４．８６１．．５７９号））が挙げられる。好ましい融合は、ＦＣ ＥＬ特異的配列（変異体６のＦｃε３−ＦＣε４配列のものなど）がそのＮ末＃ Ａ（すなわち、およそＤ３６０）において免疫グロブリンのＣ末端に、またはＩ ｇＧＦｃγ２またはＩｇＧＦｃγ３のＣ末端で終わる免疫グロブリンフラグメン トに融合したものである。別聾様として、ＦＣＥＬ特異的ポリペプチドは、公知 の免疫吸着と類似の仕方でＩｇＧＦｖドメインの一方または両方の代わりにエフ ェクター１ｇＧ配列に融合する。

本発明のポリペプチドは、任意に、前以て決定した抗原またはリガンドと結合す ることのできるポリペプチドと融合させる。一般に、これら別のポリペプチドは ＩｇＥまたは他の免疫グロブリンＦｖドメインであろうが、任意にレセプター細 胞外ドメイン（たとえばＣＤ４で行われるように、免疫吸着の公知の仕方で生成 される）などの異種ポリペプチドであってよい。本発明のＦＣＥＬ特異的ポリペ プチドに融合する免疫グロブリン配列としては、ＦｃまたはＩｇＧ１．１ｇＧ２ ．１ｇＧ３、ｌ　ｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩ、ｇＡのＨ鎖の可変 配列が挙げられる。ＦＣＥＬ特異的Ｈｆ１Ｊ融合は、任意に、同じ特異性を有す るＨ鎖に（ホモポリマーの生成）、または異なるＨ鎖（異なる抗原に対する特異 性を有する異なるＨＭを含む）（ヘテロポリマーの生成）に通常の仕方でジスル フィド結合する。そのようなヘテロポリマー性Ｈ鎖にはＦＣＥＬ特異的でないＨ Ｍが含まれ、たとえば、これらＨ鎖はＦ　ＣＥ　ＬおよびＦＣＥＨに通常の仕方 で結合する天然ＩｇＥ配列を含むか、またはこれらＨ鎖は任意にＦ　ＣＥ　Ｉ− 特異的な少なくとも一つのＨＭとＦＣＥＨ特異的な少な（とも一つのＨ鎖を含む 。ヘテロポリマー性Ｈ鎖はまた、非１ｇＥ免疫グロブリン、たと−えばＴｇＧ、 ＩｇＤ、ＩｇＭなどのＨ鎖を含んでいてよい。加えて、Ｈ＠ヘテロまたはホモポ リマーはまた、前以て決定した抗原に通常の仕方で協力的に結合することができ るように、天然免疫グロブリンの仕方でＬ鎖に任意にジスルフィド結合してよい 。ヘテロポリマー性Ｈ鎖がｒｇＭＨ鎖を含むのでない限り、一般にヘテロダイマ ーであろう。

幾つかの態様において、ＦＣＥＬ特異的なポリペプチドを含む免疫グロブリンは また、免疫グロブリンの可変領域、好ましくは（いやしくも含有するなら）Ｉｇ Ｅ　Ｆｖドメインをも含有するであろう。可変領域の抗原特異性は、ハブテンに 結合するものや、ヒト、動物、植物、真菌、細菌または昆虫源からのポリペプチ ドやタンパク質に結合するものを含み、広範囲に変わってよい。特異性は知られ ていなくてよいし、または可変領域は前以て決定した抗原に結合する能力を有し ていてもよい。免疫グロブリンが機能性の可変ドメインを有すべき場合には（Ｆ 　ｃ　ｅ　３またはＦｃｅ４フラグメントの場合の欠失したＦｖとは異なり）、 抗原特異性が知られている方が好ましい。抗原特異性には、細胞毒性または免疫 応答に関与する抗原、とりわけＣＤ３やＣＤ８などのリンパ球抗原、インテグリ ン、Ｂ細胞表面抗原、ヘルパーまたはサプレッサー細胞表面抗原、またはＩｇＧ のエフェクターサブタイプの可変領域中に位置するニピトープなどに結合する能 力が含まれる。患者がアレルギーである特定のアレルゲンと結合することのでき るＦＣＥＬ特異的なＦｃドメインもまたＦｖドメインと組み合わせて用いること も有用である。これらは一般に、アレルゲンに対して向けられたヒトＩｇＥであ り、ＦＣＥＬ特異的なＦｃドメインを含有する。別の態様として、免疫グロブリ ン特異性をＩｇＧのエフェクターサブタイプのＦｃ領域に対して向けるが、この 場合には、ＦＣＥＬ特異的ポリペプチドは該１ｇＧの補体結合またはＡＤＣＣ機 能を抑制しないのが好ましい。

抗原またはりガント結合能を有するこの発明のポリペプチドは、該抗原またはリ ガンドに結合することのできる１またはそれ以上の部位を有する。たとえば、本 発明のポリペプチドは、１またはそれ以上のＩｇＥまたは他の免疫グロブリンの Ｆｖドメインを含み、−価または多価免疫グロブリンを生成する。たいていの場 合、そのようなポリペプチドは、抗原ζ三結合することができないように免疫グ ロブリンが欠失したまたは不活化したＦｖまたはＣＤＲを有するＨ−Ｌ鎖ペアを 含む場合のように、抗原またはりガントに対して一価であるであろう。別の態様 として、優勢な場合には該ポリペプチドは二価であり、単一特異的または二特異 的であろう。

他の態様において、ＦＣＥＬ特異的ポリペプチドは、細胞毒性因子に共有結合で 結合する。たとえば、リノヌス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｔａｍｕｎｉ ｓ）植物がら単離したポリペブチトリノンＤＩ！素を、化学的手段によるか、ま たは最も好ましくは標準組換えＤＮＡ法を用いて融合タンパク質を製造するかの いずれかにより、Ｆｃドメインのカルボキン末端に結合させる。このことにより 、細胞表面上にＦＣＥＬを発現している細胞にのみ毒素を選択的に送達する手段 が得られる。

ＦＣＥＬ特異的ポリペプチドは、ＦＣＥＬ結合を実質的に維持するのに要するだ けのＩｇＥＦｃε配列を含有しておればよい。このことは、生成物を合成または 発現させ、その活性を測定することにより容易に決定される。一般に、Ｆｃε２ −Ｆｃε４の範囲の全１ｇＥ配列を用いることができるが、Ｆｃε３およびＦｃ ε４のみを含有するフラグメントも一般に満足のいくものである。

一般に、免疫グロブリン配列およびＦＣＥＬ特異的配列は、ＩｇＥ類似体で処置 しようとする種と同じ種に由来するものであろう。好ましくは、免疫グロブリン 配列はヒトのものである。

この発明のＦＣＥＬ特異的ポリペプチドは（非１ｇＥ配列と融合することなくそ のままで用いる場合には）、ニオら（上記）により開示された直線状ポリペプチ ド配列、並びに天然のＩｇＥ　ＡＢ−ＢドメインまたはループＥＦを含有する他 の従来技術のポリペプチド（パートら、上記）を排除する。

これらポリペプチドは、ＡＢ−ＢまたはループＥＦドメインがちはやＦＣＥＬに 結合することができないようにＡＢ−ＢまたはループＥＦドメイン内の残基が欠 失、置換されまたは他の残基が挿入されており、高親和性レセプターに結合する に充分なβ鎖り配列および（任意に）ループＥＦ配列を含有する、ＩｇＥまたは そのフラグメントのアミノ酸配列変異体である。上記で開示したように、ＡＢ− ＢおよびループＥＦドメインはＦＣＥＬへの結合に関与していた。というのは、 これらドメインにおける変異はＩｇＥ変異体の低親和性レセプターへの結合に対 して重篤な影響を及ぼすからである。とりわけ、ループＥＦまたはＡＢループの Ｃ末端側半分における変異およびβ鎖ＢのＮ末端側半分における変異は、ＩｇＥ のＦＣＥＬ／ＦＣＥＨ特異性に逸脱を生じさ也この変異体は高親和性レセプター には結合し続けるが低親和性レセプターにはほとんど結合することができなシＡ ０加えて、本発明者らは、ＩｇＥのループＥＦおよびＨ鎖のβ鎮Ｄドメインが高 親和性レセプターへの結合に関与することを見いだした。それゆえ、ＦＣＥＨ特 異的な識別結合ポリペプチドは、少なくともβ鎖りのＦＣＥＨ結合性配列および 好ましくは実質的にＦＣＥＨにのみ結合する変異体のＡＢ−ＢまたはループＥＦ ドメイン配列を含有しているであろう。

好ましい態様において、ＡＢ−ＢまたはループＥＦドメインの低親和性レセプタ ー結合機能中にアミノ酸配列変異が導入される。好ましくは、残基■３８２、Ｒ ３８３、Ｎ３８４．５３８５、Ｉ３８７、ｌ３８８、Ｉ３８９、Ｃ３９０、Ｒ４ ４６、Ｒ４４７、Ｗ４４８、Ｉ４４９、Ｒ１５０、Ｇ１５１、Ｒ１５２またはＴ １５３の一つまたはそれ以上が変えられるが、ループＡＢＮ末端内Ｉこ指定した ループＡＢ残基に任意に修飾が導入される。Ｒ３８３、Ｎ３８４．５３８５、Ｉ ３８７、Ｔ−３８９、またはＲ４４６−Ｔ４５３のうち一つのみを変異させさえ すればよいが、各ドメインから１．２または３の残基を変えるのが好ましい。

いやしくも置換する場合は、一般にｌ３８２および／またはｌ３８８を独立にＡ ｓｎ、Ｇ１ｎ５ＬｅｕＳＶａ　ｌ５Ｈｉ　５ＳＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ 。

Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、ＡｌａＳＳｅｒ、ＴｈｒＳＡｓｐまたはＧｌ ｕ。

好ましくはＴｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕで置 換する。通常、これら２つの残基は修飾しない。

Ｒ３８３は、一般にＣｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ 。

ＡｌａＳＶａ　］、ＬｅｕＳ　Ｉ　Ｉｅ、５ｅｒＳＴｈｒＳＡｓｐＳＧｌｕＳＡ ｓｎ。

Ｇｉｎ、ＨｉｓまたはＬｙｓ、好ましくはＭｅｔ、ＰｈｅＳＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐ ｒｏ。

Ｇｌｙ、ＡｈａＳＶａ　ｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、５ｅｒＳＴｈｒ、ＡｓｐＳＧｌｕ 。

ＡｓｎまたはＧｌｎ、最も好ましくはＡｌａ、Ｇｌｕ、ＡｓｐまたはＳｅｒで置 換する。

Ｎ３８４は、一般にＡｒｇ、ＨｉｓＳＣｙｓ、ＭｅｔＳＰｈｅＳＴｙｒＳＴｒｐ 。

ＰｒｏＸＧａｙＳＡｌａ、Ｖａｌ、Ｉ　Ｉｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ 。

Ｇ　］　ｕＳＧ　Ｉ　ｎおよびＡｓｎ、好ましくはＡｈａ、Ｇａｙ、ＰｒｏＳＧ ｌｕ、ＧｉｎまたはＡｓｐ、最も好ましくはＡｌａ、ＧｌｕまたはＡｓｐで置換 する。

５３８５は、Ａｓｐ、Ａｓｎ５ＧｉｎＳＨｉ　ｓ、ＬｙｓＳＡｒｇＳＣｙｓ、Ｍ ｅｔ。

Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、、ＴｒｐＸＰｒｏ、ＧｌｙＳＡｈａＳＶａｌ、ＬｅｕＳ　ｌｉ ｅ。

ＧｌｕおよびＴｈｒ、好ましくはＡｈａＳＴｙｒ、Ｖａｎ、１ｉｅＳＬｅｕＳＰ ｈｅ。

ＡｒｇＳＬｙｓおよびＨｉｓ、最も好ましくはＡｌａＳＶａｌ、ｌｉｅ、Ｌｅｕ 。

ＰｈｅおよびＴｙｒで置換する。

置換する場合には、Ｒ３８６は通常、ＧａｙＳＡ、１ａＳＣｙｓ、Ｖａｎ、Ｌｅ ｕ。

Ｉｃｅ、５ｅｒＳＴｈｒ、ＡｓｐＳＧｌｕ、Ａｓｎ５Ｇｉｎ、ＨｉｓＳＬｙｓ。

Ａｒｇ、ＰｈｅＳＴｙｒ、またはＴｒｐ、好ましくはＧａｙＳＡｈａ、Ｓｅｒ。

Ｔｈｒ、Ａｓｎ５Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇ１ｎ５Ｈｉｓ、ＬｙｓＳＡｒｇまたはＴｒ ｐで置換する。通常、Ｒ３８６は修飾しない。

Ｉ３８７および／またはＩ３８９は、一般に独立にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌ ｅｕ、Ｉ　］　ｅ、Ｓｅｒ、ＡｓｐＳＰｒｏ、ＧｌｕＳＡｓｎＳＧｉｎＳＨｉ　 ｓ。

Ｌｙｓ、ＡｒｇＳＣｙｓ、ＰｈｅＳＴｙｒおよびＴｒｐ、好ましくはＧｌｙＳＡ ｌａ。

Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｃｅＳＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｉｎ、ＨｉｓＳＬｙｓ。

Ａｒｇ、、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ、最も好ましくはＡｌａで置換する。

Ｃ３９０は、通常、式Ｉに示すように環状化基の成員として用いる場合以外は置 換しない。

この発明の識別ＦＣＥＨ結合性ポリペプチドは、上記のように機能性のＦＣＥＨ 結合性β鎖りおよびループＥＦドメインの配列を含むであろう。一般に、これら 機能性ドメインはβ鎖りまたはループＥＦドメイン残基のすべてを含む必要はな い。しかしながら、いやしくも修飾を施すなら、ＦＣＥＨ結合を保存するために β鎮Ｄドメイン残基の修飾は保存性である必要があるであろう。ループＥＦはＦ ＣＥＬ結合およびＦＣＥＨ結合の両方に関与するので、実施例５に示すようにそ の活性を法定するためにこれら変異体をスクリーニングする必要があるであろう 。しかしながら、たとえば変異体５０および５２のように、ＦＣＥＨ結合を明ら かに妨害することなくＦＣＥＬ結合を実質的に破壊する幾つかのループＥＦ変異 体がすてに同定されている。それゆえ、ループＥＦ変異体はＦＣＥＬ特異的カテ ゴリーまたはＦＣＥＨ特異的カテゴリーのいずれかに属する、すなわち各レセプ ターへの結合に等しく影響を及ぼす。

ＦＣＥＨ特異的ポリペプチドの特に好ましい態様は、他のＣ末端配列とともにβ 鎖Ｄドメインを含有するものである。この態様の配列は、およそＩ４２１からお よそＩ４４０の範囲である。一般に、この態様のＮ末端は５４２０またはＩ４２ １であり、Ｃ末端はＩ４４０、Ｒ４４１またはＲ４４２である。加えて、この配 列とは外来の１または２以上の残基が該配列のＮ末端またはＣ末端に融合してい る。これら外来配列は、このポリペプチドのＮ末端とＣ末端との間で共有結合ま たは非共有結合を形成するうえで特に有用である。これらＮ末端および／または Ｃ末端は、残基の側鎖によりまたはポリペプチド主鎖により共有結合しているの が好ましい。たとえば、システィン残基がＮ末端またはＣ末端に融合し、酸化さ れてその末端を連結する末端ジスルフィド結合を有するポリペプチドが生成され 、そのため該ポリペプチドのコンフォーメーションが制限される。別の態様とし て、該ポリペプチドのαアミノ基（またはＮ末端側に位置する外来残基のαアミ ノ基）がＣ末端側に位置する外来システィン残基の硫黄原子に共有結合して、式 Ｉに示す環状化合物と類似のチオエーテル環状化合物が生成する。本明細書のい ずれかの箇所で記載するように、他の環状化合物も同様の仕方で調製される。

この態様の配列に対応する天然のＩｇＥＩｅ列のアミノ酸配列変異体も本発明の 範囲に包含される。β鎖り変異体はＦＣＥＨへの結合を高めるために選択される が、該β鎖Ｄドメインの外側の配列はＮ末端およびＣ末端を天然のＩｇＥ配列の 場合と実質的に同じ位置に適切に配置するのに充分なコンフォーメーション構造 を保持するのに必要なだけである。

本発明のＦＣＥＨ特異的ポリペプチドは、細胞毒性の官能基を含むＦＣＥＨ特異 的ポリペプチドは好ましくないことを除けばＦＣＥＬ特異的ポリペプチドについ て記載したのと全く同じように非１ｇＥポリペプチドを任意に含有する。加えて 、βｔｌＤドメインのＦＣＥＨ結合性配列を含有するコンフォーメーションが制 限された（一般に環状の）ポリペプチドも本発明の範囲に包含される。そのよう なポリペプチドは、（Ｇ３）−（Ｇ１９）残基がＦＣＥＨ結合性結合性β鎖イド メイン換わっているほかは上記式Ｉに示すものと同一である。置換残基の例とし ては、５４２０−Ｒ４２８、Ｉ４２１−Ｎ４３０．５４２０−Ｇ４３３およびＲ ４２１Ｒ４２８が挙げられる（カバット配列からの残基が省かれているＵ２Ｏ５ からのＩ４２１−Ｎ４３０などの配列は該部位に残基を含有するかまたは同位置 に欠失を有し、後者の場合、Ａｓｎ残基が部位４２９を占めることに注意せよ） 。

ＦＣＥＬ結合を実質的に減少させまたは失わせるためにＡＢ−Ｂドメイン残基の いずれの１またはそれ以上の残基も欠失させてよい。β鎖Ｄドメインに関しても 上記と同じ理由から残基の欠失が好ましい。

ＡＢ−Ｂドメインの置換または欠失変異体の候補の例を下記表３に示す。各変異 体の配列を決定するには、各部位の下の各変異体番号について残基を同定する。

たとえば、化合物９８の配列はＡ、３８３　Ａ３８４　Ａ３８５を含み、変異体 ７に属する変異のクラスを示す。

表３ ＡＢ−Ｂドメイン内の残基に隣接して１または２以上の外来残基を挿入すること もこの発明の範囲に包含されるが、置換または欠失が好ましい。一般に、わずか に一つだけの残基を挿入するが、ＡＢ−Ｂドメイン内のいずれか一つの部位に隣 接して２〜４またはそれ以上の残基を挿入することもできる。免疫原部位の導入 を回避するため、挿入する残基の数は少ない方が好ましいであろう。しかしなが ら、このことは単なる選択の問題にすぎない。一般に、挿入は単一の部位で行う が、いずれかの２またはそれ以上のＡＢ−Ｂドメイン残基に隣接して挿入を行う こともできる。

挿入は一般に下記残基の間で行う　５３８５とＰ２Ｓ５、Ｐ２Ｓ５とｌ３８７、 ｌ３８７と１３８８、およびｌ３８８とｌ３８９゜挿入された残基は、一般に両 側の残基とは異なる電荷、大きさまたは疎水性特性を示すであろう。たとえば、 ＡＢ−Ｂドメイン残基の１または２以上が置換もしくは欠失され、またはそのよ うな残基に隣接して別の残基が挿入される。一般に、わずかに４つの残基または 部位が変えられ、最適にはわずかに一つのみが変えられるであろう。本明細書に おける変化には、挿入、欠失または置換の組み合わせが含まれる。ニオらにより 開示されたＩｇＥポリペプチドフラグメント（またはそのようなフラグメントの 天然に存在する配列変異、たとえば対立遺伝子など）並びに従来技術により開示 される他のそのようなフラグメントはＦＣＥＨ特異的ポリペプチドから排除され る。

ループＥＦ変異体 ループＥＦは上記で定義した。実施例に記載していないループＥＦ変異体はＦＣ ＥＨアッセイおよびＦ　ＣＥ　Ｌアッセイの両方に対してスクリーニングする必 要がある。というのは、ループＥＦはＦＣＥ−Ｌ結合およびＦＣＥＨ結合の両方 に関与しているからである。しかしながら、このスクリーニングは本明細書の指 示および原則に従うならばお決まりの手順であり当業者には自明の範囲である。

一般に、ＦＣＥＨまたはＦＣＥＬ結合性の識別ポリペプチドは、残基４４６．４ ４７．４４８．４４９．４５０．４５２および４５３の１または２以上の置換ま たは欠失（またはそれに隣接した挿入）を含むであろう。４４６および４４７な どの部位もまた（ＦＣＥＬ結合の喪失となるＡｈａ置換の場合を示しであるが（ 実施例５））　、ＦＣＥＬに対して天然１ｇＥよりも大きな程度で結合する変異 体を選択するための部位として役立つことに注意すべきである。しかしながら、 たいていの場合には、目的がＦＣＥＬ結合である場合において部位４４６および ４４７は変異体を導入するには好ましくない。このため、残基４４８から４５３ の範囲の領域、好ましくは残基４５０．４５２および４５３に焦点を合わせるべ きである。

一般に、ループＥＦ変異体は、ループＡＢ−β鎖Ｂまたはβ鎖りまたは両方に導 入した変異とともに用いる。

Ｒ４４６は、一般に、Ｆ　ＣＥ　Ｈ特異性のため、Ｇｌｙ、ＡｌａＳＶａｌ、Ｌ ｅｕ。

ｌｉｅ、Ｓｅｒ、ＨｉｓＳＬｙｓ、Ｍｅｔ、ＴｈｒＳＡｓｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ。

Ａｓｎ、Ｇ１ｎ５ＣｙｓＳＰｈｅＳＴｙｒまたはＴｒｐ、好ましくはＡｌａで置 換する。

Ｒ４４７は、一般に、ＦＣＥＨ特異性のため、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ 。

ｌｉｅ、ＭｅｔＸＣｙｓ、Ｓｅｔ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、に　ｌ　ｕ　ｓ　Ａ　Ｓ　 ｎ　１Ｇ　１　ｎ　１Ｈｉ　ｓ、ＬｙｓＳＡｒｇ、ＰｈｅＳＴｙｒまたはＴｒｐ １好ましくはＡｌａで置換する。

Ｗ４４８もまた一般に置換しないが、置換する場合はＧｌｙ、ＡｌａＳＶａｌ。

Ｌｅｕ、Ｉ　］　ｅ、Ｍｅ　ｔ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、ＧｌｕＳＡ ｓｎ。

Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｈ４ｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＰｈｅまたはＴｙｒを用いる。

Ｉ４４９も同様に一般に置換しないが、置換する場合はＧｌｙ、ＡｌａＳＶａ　 Ｉ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｈｒＳＰｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓ ｐ。

Ｇ１ｎ５Ｈｉｓ、ＬｙｓＳＡｒｇＳＰｈｅＳＴｙｒまたはＴｒｐを用いる。

Ｒ４５０は、一般に、ＦＣＥＨ特異性のｈめ、引ｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ｌｉｅ。

Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＣｙｓＳＳｅｒＳＴｈｒ、ＰｒｏＳＧｉｎ、Ａｓｎ５Ａｓｐ。

ＨｉｓＳＬｙｓｌＡｒｇＳＰｈｅＳＴｙｒまたはＴｒｐ、好ましくはＡｌａで置 換する。

Ｇ１５１は一般に置換しないが、置換する場合にはＡｌａＳＶａｌＳＬｅｕ。

Ｍｅｔ、Ｃｙｓ、５ｅｒＳＴｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ。

Ｇｉｎ、Ｈ４ｓＳＬｙｓＳＡｒｇ、Ｐｈｅ、ＴｙｒまたはＴｒｐを用いる。

Ｒ４５２もまた一般に、Ａ　］　ａＳＶａ　］、Ｌｅｕ、Ｍｅ　ｔＳＣｙｓＳＳ ｅ　ｒ。

ＴｈｒＳＰｒｏ、ＧｌｙＸＡｓｎＳ　Ｉ　１ｅＳＡｓｐＳＧｉｎＳＨ４ｓＳＬｙ ｓ。

ＡｒｇＳＰｈｅＳＴｙｒまたはＴｒｐで置換する。

Ｉ４５３は、一般に、Ａｌａ、Ｖａ　Ｉ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＣｙｓＳＳｅｒ、Ｐ ｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ５ＧｌｕＳ　Ｉ　Ｉｅ、Ａｓｐ、ＧｉｎＳＨｉｓＳＬｙｓ ＳＡｒｇ。

Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、またはＴｒｐで置換する。

ＩｇＥ変異体の例を表５に示す。この表には、両レセプターに結合する変異体、 一方または他方のレセプターに識別的に結合する変異体、またはいずれのレセプ ターにも結合しない変異体が含まれることが理解されるであろう。

変異体抗ｈｕＴｇＥ抗体 まずＦＣＥＬには結合することができるがＦＣＥＨには結合することのできない 一層のマウスモノクローナル抗体を得ることにより、変異体抗ｈｕＩｇＥ抗体を 製造した。そのような８つのマウスモノクローナル抗体（ＭＡＲＩＯｌＭＡＥｌ ｌ、ＭＡＥ１２、ＭＡＥ１３、ＭＡＥ１４、ＭＡＥ１５、ＭＡＥ１６およびＭＡ Ｅ１７と称する）を、ヒトｒｇＥまたはｈｕｌｇＥの残基３１５−５４７からな るポリペプチドでマウスを免疫し抗１ｇＥ活性についてスクリーニングすること を含む通常の方法により得た。

ＭＡＥＩＩ／１５およびＭＡＥ１３は異なるエピトープを認識する。ＭＡＥＩ３ のエピトープはＩｇＥのＦＣＥＨ結合部位の重要な成員に３次元的に隣接して位 置するように思われる。というのは、高濃度のＭＡＥ１３でわずかな量のヒスタ ミン放出が起こり、ある種の制限されｈ抗体を介したＦＣＥＨの架橋がＭＡＥ１ ３で起こることを示唆しているからである。ＭＡＥＩＩおよびＭＡＥ１３が一層 大きなＩｇＥ親和性を示すという事実にもかかわらず、ＭＡＥ１７がＢ細胞のＩ ｇＥ合成を抑制するうえで最も有効である。このことは、それが補体固着を媒介 する能力を有することに帰することができる（それはＩｇＧ２ａ同位体（ｉｓｏ ｔｏｐｅ）を有し、それゆえエフェクター機能を顕現し得るＦｃを含有する）。

ＭＡＥＩＩとＭＡＥ１５とは同じＩｇＥエピトープを認識すると思われる。各抗 体は、そのアミノ酸配列においである種の異常な性質を共通に有していた。たと えば、各抗体のし鎖のＣＤＲＩには３つのアスパラギン酸残基が含まれていた。

ＭＡＥＩＩおよびＭＡＥ１５のＨ鎮のＣＤＲ３には３つのヒスチジン残基が含ま れていた（および、それぞれ２つのアルギニン残基が含まれていた）。

所望のＩｇＥ結合特性を有する上記のような抗体をさらに修飾することができる 。そのような修飾は、２つの一般的なりラスに分けられる。第一のクラスでは、 ＩｇＥに対して一価となるように抗体を修飾する。このことは、抗体の一方の「 アーム」のみが、すなわち抗体の一方のＬ−Ｈ鎖フォークのみがＩｇＨに結合し 得ることを意味する。抗体の残りのＦｖｒアーム」　（またはＩｇＭの場合は複 数のアーム）は第二の（非１ｇＭ）抗原に特異的であり、いかなる抗原にも結合 することができず、または完全に欠失している。それゆえ、ＩｇＥ−価なる語は 、ＩｇＥに対して一価である多価抗体をも包含する。最良の結果は第二の態様に より得ることができる。というのは、この態様は抗体の構造を最も忠実に保存す るものであり、最長の循環半減期を抗体に付与する傾向があるからである。ＦＣ ＥＬ結合ＩｇＨに特異的なＩｇＥ−一価抗体は、最適には補体結合およびＩｇＥ エフェクター機能を可能にするのに充分なＨ鎖のｆｃドメインを含むであろう。

ＩｇＥ−価抗体の一つの態様により認識される第二の抗原は、該抗体によってＦ ＣＥＬに間接的に架橋した場合にいかなる毒性または有害な応答をも行い、すな わち第二の抗原がＦＣＥＨでないものであり、一般には処置しようとする動物内 に認められないものである（体内の組織やタンパク質に抗体が望ましくない吸着 を起こさないように）。それゆえ、第二の抗原は通常、ＦＣＥＬではないであろ う（しかしＦＣＥＬであるかもしれな６）。しかしながら、ある状況下では、第 二の抗原は処置しようとする患者中に存在するタンパク質であろう（たとえば、 そのようなタンパク質が本発明における治療用抗体の担体または貯蔵物放出とし て働く場合）。

そのようなＩｇＥ−一価抗体は、それ自体公知の方法により製造される。たとえ ば、抗１ｇＥ　Ｆｖ　Ｈ＠およびＬ鎖をコードするＤＮＡをヒトレシピエンド抗 体のＦｃをコードするＤＮＡに連結させる。加えて、第二の抗原または未同定の 抗原に結合し得る抗体のＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡ、または非１ｇＥ抗 原結合がもはや起こりえないようにＣＤＲから充分な残基を欠失させたＨｔ！お よびＬ鎖をコードするＤＮＡが提供される。通常の組換え宿主を４つのすべての ＤＮＡで形質転換し、生成物を回収する。鎖のランダムな取り合わせを仮定して 、抗体生成物の亜集団は抗１ｇＥＨ鎖およびＬ鎖を有する一つのアームおよび第 二の抗原に対して特異性を有するまたはいずれの抗原に対しても特異性を有しな 　゛い少なくとも別のアームを有するであろう。ついで、得られた所望の亜集団 を通常の方法、たとえばイムノアフィニティー吸着または分子篩により精製する 。これら抗体はまた、これまでに−価抗体の調製に用いられてきたように（たと えば、グレニ−（Ｇｌｅｎｎｉｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２９５　：　７１２　［ １９８２］　）　、出発物質の抗体を還元し、ついで酸化的鎖組換えにより調製 することもできる。

Ｉ　ｇＥ−一価に加え、他の態様において、最大の比率のヒト配列を含有するよ うに（必要なまたは所望の活性の保持と同程度に）抗体を修飾する、すなわち、 キメラに変換すなわちヒト化する。両方の場合において、機能的な効果は、マウ スまたは他のドナー抗体の抗１ｇＥ結合能をヒト背景中に導入してできるだけ非 免疫原性にすることである。キメラの作製および抗体のヒト化のための一般的な 方法が知られている（上２のように）。最小量の非ヒト抗体配列をレシピエンド のヒト抗体中に置換する。一般に、非ヒト残基をレシピエンドのヒト抗体のＶ□ 、ＶＬ、Ｖ−ＶＬ境界またはフレームワーク中に置換する。一般に、ヒト化抗体 のカバットＣＤＲは非ヒトドナーのＣＤＲと約８０％、さらに一般的には約９０ ％相同である。一方、ヒト化抗体のＶｏ　ＶＬ境界およびフレームワーク残基は 、レシピエンドのヒト抗体と約８０％、通常σＯ％、好ましくは約９５％相同で ある。

相同性は同一残基を最大に整合させることにより決定する。得られた抗体は、（ ａ）マウス抗体に比べてヒトにおいて免疫原性が小さく、また（ｂ）ＦＣＥＬに 結合したｈｕｌｇＥには結合することができるがＦＣＥＨに結合したｈｕｌｇＥ には実質的に結合することができない。そのような抗体は、一般に、結合可能な 非ヒト抗１ｇＥ抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）　、ＶＬ−ＶＨ境界またはフレ ームワーク頭載からのアミノ酸残基によって置換されたヒト抗体である。非ヒト ＣＤＲのＬ］、Ｌ２、Ｌ３、Ｈｌ、Ｈ２またはＨ３のうちの−っまたは二つ、好 ましくはすべてをヒト抗体レソビエント中に置換する。

ＭＡＥＩＩ抗体が有する特性は治療用に使用するのに好ましかった。ＭＡＥｌｌ は可溶性１ｇＥに結合し、Ｍ１ｇｅ含有Ｂ含有に結合し、低親和性１ｇＥレセプ ターおよび高親和性１ｇＥレセプターへのＩｇＥの結合をブロックし、インビト ロでＩｇＥ産生を抑制し、ＩｇＥでコーティングされた好塩基球には結合するこ とができなかったので、これをヒト化のためのドナー抗体として選択した。レシ ピエント抗体はカバットヒトに（Ｌ）サブグループＩおよびヒトザブグループＩ ＩＩＨ鎖であったが、他のいずれのヒト抗体も好適に用いることができる。驚く べきことに、レシピエンドのヒト抗体中のＣＤＲをマウスＣＤＲで単に置換する ことによっては最適の結果は得られなかった（図３：以下の表８）。その代わり 、ドナー抗体と同様の程度のＩｇＥ結合の阻害を達成するためにＶＬＩ７８．４ ８．４９．６３．６７．６９　；　８２または８２ｃ１またはＶＬＩ３．１９． ５８．７８または１０４などのドナーフレームワークの疎水性残基を回復する必 要があった。

これら残基はＣＤＲのフンフォメーンヨンを確立するよう機能するが、これら残 基は一般に抗体の外部には暴露されず、それゆえマウス残基の使用は免疫原性に 対して有意の影響を与えるべきでない。結合に影響を与える他の非ＣＤＲ残基と しては、Ｖ、１６０．６１．３７．２４、およびＶＭ５０．５２．５８および９ ５（コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）による非ＣＤＲ）、およびＶＬ４、ＶＬ３３（コ チアによる非ＣＤＲ，）およびＶＬ５３　（コチアによる非ＣＤＲ）が挙げられ る。ヒトフレームワークの疎水性残基は、一般に、バリン、インロイシン、ロイ ノン、フェニルアラニンまたはメチオニンなどの他の疎水性残基（とりわけドナ ー抗体からのもの）で置換する。残りの非ＣＤＲ残基は他のいずれがのアミノ酸 残基で置換するが、この場合も、好ましくは類似位置に認められるマウス残基で 置換するのが好ましい。

一般に、抗１ｇＥ抗体の特性は、ＶＬ部位の２９ａ、２９ｃ、３０．３３．５５ ．５７．５８．７８．９３．９４または１０４および／またはＶＨ残基２４．３ ７．４８．４９．５４．５７．６０．６１．６３．６５．６７．６９．７８．８ ２．８２ｃ、９７．１００ａまたは１００ｃにてまたはそれに隣接して残基を置 換、欠失または挿入することにより改良される。

位置Ｖ、−７８は、フェニルアラニンで置換するのが最も好ましい。しかしなが ら、この位置はまた、ロイノン、バリン、イソロイ、ノン、メチオニン、アラニ ンまたは該抗体の特性が改良される他のいずれかの残基でも置換されるＣ以下参 照）。

位ｆｉＶ、−６０は、アスパラギンて置換するのが最も好ましいが、グルタミン 、ヒスチジン、すノン、アルギニノまたは該抗体の特性が改良される他のいずれ がの残基による置換もまたこの発明の範囲に包含される。

位置Ｖｌｌ−６１は、プロリンで置換するのが最も好ましいが、グリノン、アラ ニン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたは該抗体の特性が改良される他のい ずれかの残基もまた適している。

ＣＤＲ残基はＭａＥｌｌがら移入した。これらには、ＶｔＨ中の４つの挿入、３ ０ａ−３Ｑｄ、並びに９１　９４　（ＶＬＩ）　、Ｖｌｌ＋　２７　２９．２９ ａ、３１．３３および３４、ＶＭｔ５３５５、および７Ｍ３９７−１０１が含ま れていた。

ＶＬ　２９ａ、２９ｃｔたｆｉ３０．ｔ［Ｆ＋：Ｖｔ＋　９７．１００ａｔたは １ＯＯｃｌ；！、ＣＤＨにＩｇＥへの結合能を付与するうえで重要である。

ｈｕｍａｅｌｌ（ヒト化Ｍａ　ｅ　１１）中ではＶＨ位置の９７．１００ａおよ び１００ｃはすべてヒスチジンであり、ＭＡＥ１５では２つがアルギニンである 。

これら残基はＩｇＥへの結合において重要である。これらのうちの一つ、２つま たは３つを塩基性残基、とりわけリジンやアルギニンで置換して修飾するが、ア ラニン、グリノン、バリン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン 酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、メチオニン、フェニルアラニン 、チロノン、トリプトファンまたはプロリンでも置換できる。

ＶＬ位置の２９ａ、、２９ｃおよび３ｏもまたＩｇＥ結合にとって重要である。

ｂｕｍａｅｌｌでは、これら位置のそれぞれは酸性残基、アスパラギン酸で占め られている。これら位置は、他の態様においてはグルタミン酸により置換される が、アラニン、グリノン、バリン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパ ラギン、グルタミン、メチオニン、フェニルアラニン、チロノン、トリプトファ ンまたはプロリンでも置換することができる。位置Ｖｔ、　２９　ａ、　２９　 ｃおよび３０上の電荷をＶ、９７．１００ａおよび１００ｃ上の電荷で逆転させ ることを、たとえばこれら３つのＶ１１部位（ヒト化ＭａＥ１５の場合は２つの 部位）中のアスパラギン酸およびこれら３つのＶｌｓｌ中位中スチジンを用いる ことにより行うこともこの発明の範囲に包含される。

Ｖ＋＋位置の９７．１００ａ、］、　ＯＯｃ、６１または６１、または２９ａ、 ２９ｃ。

３０または７８の位置のｖＬ残基に隣接して残基を挿入することもできる。挿入 する残基は、一般に似た種類のものであり、たとえば酸性残基はｖＬ−２９ａ。

２９ｃまたは３０に隣接して挿入し、塩基性残基はＶＨ９７，１００または１０ ０Ｃに隣接して挿入する。これら部位の残基は欠失させてもよい。

ヒト化１　ｇＥ−一価抗体もまたこの発明の範囲に包含される。この場合には、 ヒト化は抗１ｇＥアームまで及び、必要なら残りのアームまで及ぶ。非１ｇＥ結 合アームはもちろんヒト抗体由来であってよく、その場合には非ヒトを必要とし ないであろう。

上記変異は、前駆体形態の抗体をコードするＤＮＡ中に変異を導入し、該ＤＮＡ を組換え細胞培養などで発現させることにより行う。このことは、部位特異的突 然変異誘発の常法により行う。ついで、所望の特性について変異体をそれ自体通 常のアッセイでスクリーニングする。抗ｈｕ１ｇＥの場合、所望の特性としては 、ｈｕｌｇＥに対する抗体親和性を増大させること、ＦＣＥＬ結合１結合１対Ｅ る収容力（ｃａｐａｃｉｔｙ）および特異性を増大させること、マスト細胞また は好塩基球からのヒスタミン放出を刺激するの辷必要な抗体の濃度を増大させる こと、ヒトにおける免疫原性を減少させること、および当業者に明らかな他の改 良が含まれる。これら特性を最適化することには、しばしば他の改良に対する一 方の改良のバランスが必要とされ、それゆえ判断の問題であり、抗体に対して意 図された使用により指示される性能パラメータに依存する。

ヒト化のためのレシピエンド免疫グロブリンとしてはヒトＩｇＧ１（または他の 補体結合抗体）を用いるのが好ましいが、ヒ）　Ｉ　ｇＧ２．１ｇＧ３、Ｉ　ｇ Ｇ４、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＡもまたレノピエントとして用いるこ とができる。レノビエントは補体結合１ｇＧ抗体であるかまたはＡＤＣＣに参画 し得るＩｇＧ抗体が好ましい。

治療、診断および製剤用途 本発明の抗１ｇＥ抗体は、ＦＣＥＬまたはＦＣＥＨ結合ドメインが修飾されたＩ ｇＥアミノ酸配列配列変異体定するのに有用である。ＦＣＥＬまたはＦＣＥＨ特 異的ポリペプチドの候補をこれら抗体とともにインキュベートし、さらに評価す るため、たとえばそれぞれＦＣＥＨおよびＦＣＥＬレセプター結合特性を決定す るため、これら抗体が結合することのできなかった類似体を選択する。抗体ＭＡ ＥＩＯ−ＭＡＥ１７　（とりわけＭＡＥＩＩ／１５、ＭＡＥ１３またはＭＡＥＩ ７）のいずれかのエピトープ特異性を有するいかなる抗体も、その採取源がマウ ス、ヒトまたは他の動物種であろうと、または上記ヒト化免疫グロブリンなどの その変異体であろうとも同様に採用できる。そのような抗体は、適当な動物起源 のＩｇＥで適当な動物を免疫しまたはインビトロＦｖ選択系（たとえば、ファー ジミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）　）を用い、ＩｇＨに対してＭＡＥ１１／１５．１ ３．１７または本明細書に記載した抗体と実質的に同じエピトープ部位をマツピ ングした他の抗体と競合する能力を有する動物または生成物をスクリーニングす ることにより容易に同定される。記載しこように、治療用に用いる場合はこれら 抗体はＦＣＥＬ−結合１ｇＥに対して一価であるのが望ましい。これら抗体は、 血漿、血清または組換え細胞培養液から精製するのに用いる場合には二価および ／または温特異的であってもよい。

ＦＣＥＨおよびＦＣＥＬ特異的な識別結合ポリペプチドは、診断および治療に有 用である。インビトロ診断アッセイにおいて、これらポリペプチドはそれぞれＦ ＣＥＨ１またはＦＣＥＨ１１に対するアッセイにおいて特異的結合試薬として用 いる。この発明のポリペプチドは、酵素、蛍光または化学ルミネセンス基、放射 性同位元素または検出可能な物質（酵素など）に結合した特異的結合残基などの 検出可能な物質で標識する。典型的な特異的結合物質は、検出可能な物質に結合 し得る免疫グロブリンの可変ドメインである。免疫グロブリン可変ドメインを含 有するＦＣＥＬおよびＦＣＥＨ特異的ポリペプチドは上記で一層詳細に記載する 。

この発明のＦＣＥＬまたはＦＣＥＨ特異的ポリペプチドを用いたアッセイ系は、 これまでイムノアッセイ分野で一般に用いられてきたサンドイッチタイプのシス テムに類似する。本発明においては、該特異的ポリペプチドは、抗原（ＦＣＥＬ またはＦＣＥＨレセプター）に対して向けられた標識抗体または試験試料からレ セプターを単離するためマトリックス上に不溶化した吸着剤と同様の仕方で用い る。通常のアッセイ系に用いるため、この発明のポリペプチドに酸化還元標識、 加水分解標識、エステル分解標識または他の通常の酵素標識を結合させる。

この発明の識別結合ポリペプチドはまた、治療または研究目的でＦＣＥＬまたは ＦＣＥＨを調製するうえで細胞培養からＦＣＥＬまたはＦＣＥＨを単離するのに も有用である。該ポリペプチドは、イオン交換樹脂、イムノアフィニティーカラ ム（ＦＣＥＨまたはＦＣＥＬ特異的ポリペプチドに融合したポリペプチドと結合 し得る抗体を含有する）、固定化抗原（この場合、ＦＣＥＨまたはＦＣＥＬ特異 的ポリペプチドは該抗原に結合し得る免疫グロブリンの可変領域を含有する）ま たは臭化ンアン活性化多糖などのマトリックスに共有結合されるかまたは非共有 結合的に吸着される。ついで、固定化されたＦ　ＣＥ　ＨまたはＦＣＥＬ特異的 ポリペプチドをレセプター調製物とレセプターがＦＣＥＨまたはＦＣＥＬ特異的 ポリペプチドと結合する条件下で接触させる。ついで、ｐＨまたはイオン条件を 変えレセプターからポリペプチド調製物を分離することによりレセプターを溶出 させる。

本発明の識別結合ポリペプチドは、ＩｇＥのＦＣＥＨまたはＦＣＥＬ−結合ドメ インに特異的な抗体を調製するうえで有用である。たとえば、ＩｇＥのＦＣＥＨ またはＦＣＥＬ−結合ドメインに特異的に結合し得る抗体を選択するには、まず 患者をＩｇＥで免疫する。ついで、天然ＩｇＥ結合についてモノクローナル抗体 を通常の仕方で選択し、ついで、モノクローナル抗体をスクリーニングしてこの 発明のＦＣＥＨまたはＦ　ＣＥ　Ｌ特異的ポリペプチドに結合するものを同定す る。

ＦＣＥＨまたはＦ　ＣＥ　Ｌ特異的ポリペプチドは、もちろんＦＣＥＨまたはＦ ＣＥＬ識別結合特異性を付与するのに必要な最小限の変異は別にして、免疫原と して用いたＩｇＥの対応配列と配列が同一であるのが好ましいであろう。たとえ ば、変異体６への結合能についてＩｇＥモノクローナル抗体を選択することがで きる。

もしも変異体６に結合することができないなら、それら抗体はＦＣＥＨ結合部位 に結合し、それゆえＦＣＥＨの結合したＩｇＨには結合できないがＦＣＥＬの結 合したＩｇＥには結合する抗体に依存する診断または治療手順に有用であると約 束されたと結論付けることができる。かくして選択した抗体が実際にＦＣＥＬに 結合したＩｇＥに結合することを決定することにより確証が得られる。選択した 抗体はレセプター結合に関与する重要な部位に対して高度に特異的であるので、 ついで抗体のサイズを小さくすることが可能である；ＩｇＥ−レセプター相互作 用の立体障害には抗体のかさばり（ｂｕｌｋ）は必要ではない。それゆえ、アレ ルギー治療に抗１ｇＥ−価抗体または他の抗１ｇＥフラグメント（Ｆａｂ、Ｆａ ｂ’など）を使用することが可能になる。

同様に、ＦＣＥＬまたはＦＣＥＨ特異的ポリペプチドは、ＦＣＥＨまたはＦＣＥ Ｌ特異的ポリペプチドを作製するうえセ変化させたドメインの外側のエピトープ 部位でのみ天然のＩｇＥと交差反応し得る抗体を生成させるための免疫原として 有用である。たとえば、変異体６および７は、場合に応じて変異させたＡＢ−Ｂ またはβ鎖Ｂドメイン以外のＩｇＥエピトープに特異的な抗体を生成させるの　 −に有用である。

ＦＣＥＨおよびＦＣＥＬ特異的ポリペプチドおよび抗１ｇＥ抗体（とりわけ、免 疫原性の減少したもの）はアレルギーの治療または予防のための療法に有用であ るが、細胞毒性官能基を有するＦＣＥＨ特異的ポリペプチドサブグループはマス ト細胞および好塩基球の脱顆粒を引き起こし得るので治療には適していないと考 えられる。そうでなければ、一般に、好ましくは急性のアレルギ一応答に先立つ て、アレルゲンに感作したことがわかっている患者に該ポリペプチドを投与する 。

投与量および投与経路は、該ポリペプチドに付随する付帯的な機能性（たとえば 、細胞毒性剤、免疫グロブリンエフェクター機能など）、患者の状態（Ｂ細胞ま たはマスト細胞および好塩基球の個体数を含む）、該ポリペプチドの半減期、該 ポリペプチドのそのレセプターへの親和性および臨床室に公知の他のパラメータ に依存するであろう。Ｆ　ＣＥ　Ｈ特異的ポリペプチドの場合の一般的な規準と して、患者中を循環している標的細胞の量を血液検査から決定し、ＦＣＥＨレセ ブターの個体数並びに半減期およびＦＣＥＨに対する該ポリペプチドの親和性を 考慮して内生１ｇＥと置換しあるいは有効に競合するポリペプチドの量を決定す ることができるであろう。ついで、妥当な治療期間の間に天然のＦＣＥＨ結合１ 結合１実Ｅ的に置き換えるのに必要な循環させるべき過剰のポリペプチドを投与 するであろう。抗１ｇＥ抗体またはＦＣＥＬポリペプチドの投与量を決定するた め同様の分析を用いる。

治療用ポリペプチドは、静脈内、肺内、腹腔内、皮下または他の適当な経路で投 与する。皮下または静脈内で該ポリペプチドを必要に応じて約１〜１４日の期間 かけて投与するのが好ましい。ＦＣＥＬ特異的ポリペプチドまたは抗ＦＣＥＬ− 結合１ｇＥの場合には、ＩｇＥを分泌するＢ細胞集団の実質部分を阻止、抑制ま たは殺すのに必要な量を決定する。Ｂ細胞集団の阻止または抑制には、ＩｇＥ分 泌の減少およびＩｇＥを分泌するＢ細胞の全数の減少のいずれかまたは両方が含 まれる。候補となる投与量は、インビトロ細胞培養または動物モデルを用いて容 易に決定される。

抗ＦＣＥＬ結合１ｇＥおよびＦＣＥＬまたはＦＣＥＨポリペプチドを用いたアレ ルギー疾患の治療は、任意にアレルギーのための他の公知の療法を用いて行う。

これらには、γインターフェロンの投与、アレルゲン脱感作、アレルゲンへの暴 露の減少、抗ヒスタミン剤を用いた治療などが含まれる。

ＦＣＥＨ特異的ポリペプチドおよびＦＣＥＬ特異的ポリペプチドの調製この発明 のＦＣＥＨ特異的ポリペプチドまたはＦＣＥＬ特異的ポリペプチドは通常の仕方 で作製する、すなわち、変異を有するプライマーを用いたＰＣＲ増幅などの一般 に利用できるＤＮＡ突然変異誘発により、またはＭ１３突然変異誘発によりアミ ノ酸配列の修飾を行い、ついで該変異したＤＮＡを組換え宿主細胞中で発現させ る。該ポリペプチドはまた、もし充分に小さいなら（一般に約１００残基以下） 、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）や他のインビトロ合成法により作製 することもできる。しかしながら、該ポリペプチドは組換え法により作製するの が好ましい。組換え宿主細胞、ベクター、培養条件および他のパラメータの選択 は重要ではないと思われる。一般に、免疫グロブリン（一般にＩｇＧ）の組換え 発現においてこれまで用いられてきた宿主、ベクターおよび方法もまた、この発 明のポリペプチド配列を調製するのに有用である。ミエローマ、ＣＨＯＳＣｏｓ 。

２９３ｓなどの哺乳動物細胞を宿主に用い、該ポリペプチドの分泌発現のために ベクターを構築するのが好ましい。組換え発現系によりＦＣＥＬ特異的配列また はＦＣＥＨ特異的配列を含有する機能性免疫グロブリン変異体の調製が容易にな る。というのは、ＦＣＥＬ特異的配列またはＦＣＥＨ特異的配列を含む一つのＨ 鎖および一つのＬ鎖（それぞれ第一の抗原に結合するための可変ドメインを含む ）をコードするＤＮＡで宿主細胞を形質転換し、抗原およびＦＣＥＬまたはＦＣ ＥＨに結合する免疫グロブリンを回収すればよいからである。同様に、ＦＣＥＬ 特異的ドメインまたはＦＣＥＨ特異的ドメインを含む他のト■鎖および他のＬ鎖 （それぞれ第二の抗原に結合するための可変ドメインを含む）をさらにフードす るＤＮＡを用いて同じ手順を行い、二価免疫ダ゛ロブリンを回収する。適当に組 み立てられた免疫グロブリン類似体を、これら２つの抗原を含むマトリックス上 のアフィニティークロマトグラフィーにより回収する。

この発明のポリペプチドを、溶解した組換え細胞培養液または（分泌される場合 ）培養上澄みから回収する。該ポリペプチドを含有する細胞不含抽出液を、固定 化したＦＣＥＬまたはＦＣＥＨレセプターアフィニティーマトリックス上に通す ことにより実質的な精製を達成する。ＩｇＥまたは池の適当な免疫グロブリンを 精製するのにこれまで用いられてきた他の方法もまた同様に本発明に適用でき、 それにはイムノアフィニティーおよび（適当な場合には）固定化抗原上の吸着が 含まれる。

短い配列を含有するこの発明のポリペプチドは、固相合成法、たとえばメリフィ ールド（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅ＋ｃ、Ｓｏｃ、、８５　：　２１４９　（１９６３） ）の方法を用いて調製するのが好ましい。しかしながら、当該技術分野で公知の 他の同等の化学的合成法も採用できる。ついで、組換えまたはインビトロ合成し たポリペプチドをマトリックスに架橋するか（診断または調製手順に用いるため ）またはフンフオメーノヨンが制限された構造とする。ＰＣＴ９０１０１．３３ １に記載されているものや、Ｌｙｓ／ＡＳ＋）についてＦｍｏｃ／９−フルオレ ニルメチル（Ｏｆｍ）側鎖保護して固相支持体上のＮα−Ｂｏｃ−アミノ酸を用 い、ついでピペリジン処理して環状にするＬｙｓ／Ａｓｐ環化などの公知の環化 法が有用である。残基の側鎖を介した架橋または環化に依存する方法では、適当 な環化または架橋部位を提供するためにＡＢ−ＢまたはβＩＤドメインのＣおよ び／またはＮ末端に外来残基を挿入する必要があるかもしれない。

ＧｌｕおよびＬｙｓ側鎖もまた環状ペプチドまたは二環状ペプチドを調製するに 際して架橋した・このペプチドをｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂上の固相 化学により合成し、該樹脂から開裂し脱保護する。環状ペプチドは希釈メチルホ ルムアミド中のジフェニルホスホリルアジドを用いて生成させる。別法としては 、ンラー（Ｓｃｈｉｌｉｅｒ）ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、 　２５　：１７１−７７　（１９８５）を参照。また米国特許第４，５４７．４ ８９号をも参照。

ジスルフィド架橋または環状化したペテチドは通常の方法により生成させる。

ペルトン（Ｐｅｌｔｏｎ）らの方法（Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、、　２９　：　２ ３７０−２３７５　（１９８６））が適している。チオメチレン架橋（Ｔｅｔｒ ａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２５　：　２０６７−２０６８　（１９８４ ））も有用である。コディ−（Ｃｏｄｙ）らのＪ、Ｍｅｄｐ展ｆｆ１．：　２８ 　：　５８３　（１９８５）をも参照。ＡＢ−ＢドメインのＣ末端配列中に認め られるＣ３９０残基は、このドメインを架橋または環状化するのに有用である。

一般に、環状化または架橋に関与する外来残基を、該方法に用いるポリペプチド 前駆体の合成の一部として、選択したＡＢ−Ｂまたはβ鎖り配列のＮ末端および Ｃ末端に挿入する。得られた所望の環状化または架橋ペプチドを、ゲル濾過、つ いで逆相高速液体クロマトグラフィーまたは他の通常の方法により精製する。

得られたペプチドを０２μｍ濾過により滅菌し、通常の薬理学的に許容し得るビ ヒクル中に調合する。

この発明で記載される化合物は、遊離の酸もしぐは塩基であってよく、または種 々の無機および有機酸および塩基の塩に変換してもよい。そのような塩の例とし ては、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムな どの金属塩、ジンクロヘキシルアミンＮ−メチル−Ｄ−グルカミンなどの有機塩 基との塩：およびアルギニンまたはリンノなどのアミノ酸との塩が挙げられる。

無機および有機酸との塩は、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフ ルオロ酢酸、メタンスルホン酸、マレイン酸、フマール酸などを用いて調製する ことができる。非毒性で生理学的に融和性の塩が特に有用であるが、他のあまり 望ましくない塩も単離や精製の過程に用いてもよい。

多くの方法が上記塩を調製するために有用であり、当業者に知られている。たと えば、遊離酸または遊離塩基の形態の式Ｉの化合物を１モル等量またはそれ以上 のモル等量の所望の酸または塩基と該塩が不溶な溶媒もしくは溶媒混合物中で反 応させるか、または水のような溶媒中で反応させた後、溶媒を蒸発、蒸留または 凍結乾燥により除去する。別法として、遊離酸または塩基の形態の生成物をイオ ン交換樹脂上に通過させて所望の塩を得るか、または同じ一般的方法を用いて一 つの塩の形態の生成物を他の塩の形態ば変換させてもよい。

この発明のポリペプチドの作用持続時間をコントロールするため、別の製薬法を 用いることもできる。制御放出製剤は、目的のポリペプチドと複合体を生成する かまたは目的のポリペプチドに吸着するポリマーを用いることにより得られる。

制御送達は、該ポリペプチドを適当な巨大分子物品（たとえば、ポリエステル、 ポリアミノ酸、ポリビニル、ポリピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチ ルセルロース、カルボキンメチルセルロース、またはポリアミンサルフェートか ら調製されるもの）に調合することにより達成される。

別法として、該ポリペプチドをポリマー性のマトリックス内に封じ込める代わり に、たとえばコアセルベーノヨン法によりまたは界面重合により調製したマイク ロカプセル中にこれら物質を封じ込めることが可能である。ヒドロキシメチルセ ルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート） マイクロカプセルが、それぞれコロイド状薬物送達システム（たとえば、リポソ ーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノ カプセル）において有用である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕ ｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（１９８０）参照。

実施例１ ＩｇＥに対するモノクローナル抗体の調製ＦＣＥＨへのＩｇＥの結合をブロック する能力を有する８つのモノクローナル抗体を用いた。これらモノクローナル抗 体（ＭＡＥＩＯ−ＭＡ、Ｂ１７）を下記のようにして調製した。精製ヒトＩｇＥ を、前辺て単離した抗１ｇＥ抗体（ジェネンテックＭＡＥＩ、他の抗ｈｕＩ　ｇ Ｅ抗体も同様に有用である）上のアフィニティークロマトグラフィーを用いてＵ ２６６Ｂ１細胞（ＡＴＣＣＴｌＢ１９６）の上澄み液から精製した。ＭＡＥｌ２ については、５匹のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（６通船）をリビのアジュバント中の 精製ＩｇＥ（１０μｇ）で足祉に免疫した。最初の免疫から１週問および３週間 後に引き続き同様にして注射を行った。最後の注射から３日後に、鼠蹟部および 膝窩部のリンパ節を除去してプールし、組織を金網に通すことにより単一細胞懸 濁液を調製した。ＭＡＥｌ４、ＭＡＥｌ５およびＭＡＥｌ、３については、同様 にして免祷を行ったが、ＭＡＥｌ３については注射当たり３０　ｕ　ｇのＴｇＥ を用い、前融合ブースターとしてはＩ　ｇＥ３１５−５４７を用い＋ＭＡＥ１４ およびＭＡＥｌ５については、各５０μｇの５つの注射を用い、ＭＡ、Ｂ１７の ためのＩｇＥ免疫原はＩｇＥ３１．５−５４７であった。ＭＡＲｌ、０およびＭ ＡＥＩＩについては、１００μｇの２回の投与量および５０１１ｇの最終ブース ターにて皮下に注射を行い、融合用には胛臓細胞を用いた。こ第１ら細胞をマウ スミエローマＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８０）ど４ １の比率にて、５０％Ｗ／Ｖポリエチレングリコール４０００をへ有する高グル コース（ＤＭＥＭ）中で融合した。

融合した細胞を９６ウ工ル組織培養プレート中にウェル当たり２Ｘ１０’の密度 にてブレ−ティングした。２４時間後、ｉ（Ａ　Ｔ選択培地（ヒポキサンチン／ アミノプテリン／チミジン、シグマ・ケミカル・カンパニー、＃ＨＯ２６２）を 加えた。ブレーティングした１４４０のウェルのうち、３６５のウェルにＨＡＴ 選択後の増殖細胞が含まれていた。

融合から１５日後、酵素結合抗体免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用い、ヒト１ｇ Ｅに特異的な抗体の存在について上澄み液を試験した。ＥＬＩＳＡは以下のよう にして行い、すべてのインキコベーンヨンは室温にて行った。試験プレート（ヌ ンクイムノブレート）をラット抗マウスＩｇＧ（ベーリンガーマンハイム、＃６ ０５−５００）で５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）中に１μｇ／ｍ ｌにて２時間コーティングし、ついでリン駿緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．５％ ウシ血清アルブミンで３０分間ブロックし、ついで０．０５％ツイーン２０を含 有するＰＢＳ　（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した。被験上澄み液を加え、震盪しなが ら２時間インキュベートし、ついでＰＢＳＴで４回洗浄した。ヒトＩｇＥ（上記 のようにしてＵ２６６細胞から精製）を１５μｇ／ｍｌにて加え、震盪しながら １時間インキュベートし、ついでＰＢＳＴ中で４回洗浄した。西洋ワサビペルオ キシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＥ（キルケガール＆ぺり−・ラブダ、＃１４−１ ０−０４．０．５ｍｇ／ｍｌ）を１：２５００希釈にて加えて１時間インキュベ ートし、ついでＰＢＳＴで４回洗浄した。０−フェニレンジアミンニ塩酸塩（１ ０ｍｇ）（シグマ・ケミカル・カンパニ二＃Ｐ８２８７）を含有する溶液（１０ ０μｍ／ウェル）およびリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）（２５ｍｌ）中の ３０％過酸化水素（１０μｌ）を加えて発色させた。２．５Ｍ硫酸（１００μＩ ／ウエル）を加えて反応を停止させた。４９０μｍの吸光度にて自動ＥＬ　Ｉ　 ＳＡプレートリーダー中でプレートを読み取ることによりデータを得た。ＭＡＥ ｌ２については、３６５の上澄み液を試験して１００の上澄み液がヒトＩｇＥに 特異的であった。他の抗体をスクリーニングした場合も同様のＩｇＥ特異性が得 られた。ＭＡＥｌ７がＩｇＧ２ｂであり、ＭＡＥｌ４がＩｇＧ２ａであった他は 、本明細書に記載したすべてのモノクローナル抗体がＩｇＧ１アイソタイプのも のであった。

ＦＣＥＨへのＩｇＨの結合を阻止しＦＣＥＨに結合したＩｇＥには結合すること ができないような仕方でＩｇＥに結合した抗体を選択するため、各１ｇＥ特異的 抗体をさらに細胞ベースのプレートアッセイで試験した。これらアッセイの結果 を下記表５および表５ａに示す。

１、マウス抗腎−１ノ」汚ス／Ｌ三ニナル抗化ρ至析のためのＦＡＣＳベーろｐ ｌ−２モノクローナル抗体結合のスクリーニングａ　試料当たり５Ｘ４０Ｓ細胞 のＣＨＯ３Ｄ１０細胞（ＦｃＥＲ，Ｉｃｒ鎖安定なトランスフエクンヨン体（ｔ ｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）　；ハキミ（Ｈａｋｉｗｉ）ら、Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ 、　Ｃｈｅｔ２６５　：　２２０７９）を１００μＩ　ＦＡＣ３緩衝液（ＰＢＳ 　（ｐＨ７，４）中の０．１％ＢＳＡ　１０ｍＮアジ化ナトリウム）中の１０　 ｔｔ　ｇ／ｍ　＋のＵ２６６ＩｇＥ標準（ロット番号１３０６８−４６）ととも に４℃にて３０分間インキュベートし、ついでＦＡＣ８ＡＣ８緩衝液洗浄する。

ＴｇＥ含有細胞のアリコートを５０μｇ／ｍｌのポリクローナルＦＩＴＣ結合ウ サギ抗ヒトＩｇＧ（アキコレート・ケム（Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｗ、　Ｃｏ 、）　ＡＸＬ−４７５Ｆ、ロット番号１６）とともに４℃にて３０分間インキュ ベートし、ついでＦＡＣ３緩衝液で３回洗浄することによりＩｇＥ結合の量を決 定する。

ｂ、ＴｇＥ含有細胞を１００μｌのマウス抗ヒｌ−１ｇＥ／＼イブリドーマ上澄 み液（マウスＩｇＧの濃度は１〜２０μｇ／ｍりとともに４℃にて３０分間イン キュベートし、ついでＦＡＣ３緩衝液で１回洗浄する。結合に対する陽性コント ロールとしてはジェネンテソクのモノクローナル抗ヒトＩｇＥ（ＭＡＥＩ）を１ ０１１ｇ／ｍｌで用いる。ＩｇＥを認識しないジエネンテックのモノクローナル 抗体（ＭＡＤ６Ｐ）を陰性コントロールとして１０μｇ／ｍｌで用いる。

ｃ、２０μｇ／＋ｎｌのＦＩＴＣ結合しアフィニティー精製したＦ（ａｂ）２ヤ ギ抗マウスＩｇＧ（オルカノン・テクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｃａ） カタログ番号１０７１１−００８１）とともに細胞を４℃にて３０分間インキュ ベートし、つＬｌでＦＡＣ３緩衝液で３回洗浄することにより、ＣＨ○細胞上の ヒトＩｇＥに対するモノクローナル抗体結合を決定する。２μｇ／ｍｌのプロピ ジウムヨーダイド（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　１ｏｄｉｄｅＸノグマ力タログ番号Ｐ ４１．７０）を含有する４００μ］の緩衝液に細胞を加えて死細胞を染色する。

ｄ、ベツクマンディッキンソンＰＡＣ８ＣＡＮフローサイトメーター上で細胞を 分析する。前方光散乱ゲートおよび９０°側方ゲートをセットして細胞の均一集 団を分析する。プロビジウムヨーダイドで染色された死細胞は分析から排除する 。Ｃ１−１０３Ｄ１０細胞上のＩｇＥに結合しないハイブリドーマ上澄み液が、 さらにスクリーニングするための候補と考えられた。

２、末梢血好塩基ｇた哀ｏｂｘタミン放出正常ドナーからヘパリン処理した血液 を得、変性タイロード（Ｔ　ｙｒｏｄｅｓ）緩衝液（２５ｍＭ）リス、１．５０ ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭＣａＣＩｔ、ＭｇＣ１！、０．３ｍｇ／ｍｌ　Ｈ３Ａ 、ｐＨ７，３５）中に１．４で希釈し、ついで１．ｎＭヒト１　ｇＥ　（ＮＤ） とともに４℃にて６０分間インキュベートした。ついで、マウスモノクローナル 抗１ｇＥ抗体（１０ｍｇ／ｍりかまたは陽性コントロールとしてポリクローナル 抗ヒト抗血清のいずれかを含有するタイロード緩衝液に細胞を加え、３７℃にて ３０分間インキュベートした。細胞をペレット化し、上澄み液中のヒスタミンを アセチル化し、ＲＩＡキット（ＡＭＡＣ，Ｉｎｃ、ウェスプルツク、メイン州） を用いてヒスタミン含量を決定した。凍結解凍を数回繰り返す操作に供した細胞 から全ヒスタミン量を測定した。ヒスタミン放出％は、上澄み液中のヒスタミン 含量（ｎＭ）マイナス自発的に放出されたヒスタミン（ｎＭ）を試料中の全ヒス タミン（ｎＭ）で除したものとして計算した。

３、ＦｃＥＲＩα鎮へのＦｉｔｃ結合１結合１結ＥのブロックＦｉｔｃ標識した ＩｇＥを種々のＭａｅ抗体とともに３７℃にて３０分間、ＰＢＳ（０，１％ＢＳ Ａおよび１．０ｍＭアジ化ナトリウムを含有、ｐＨ７，４）中でブレインキュベ ートし、ついで得られた複合体を５Ｘ］、Ｏ’の３Ｄ１０細胞とともに４℃にて ３０分間インキュベートすることにより、ＩｇＥ結合に対するこれら抗体の作用 を調べた。ついで、細胞を３回洗浄し、４７５ｎＭにおける平均チャネル蛍光を 測定した。ＦｃＥＲＩα鎖へのＩｇＥ結合をブロックしないマウス抗ヒトＩｇＥ モノクローナル抗体（Ｍａｅｌ）をコントロールとして用いた。

４　膜１ｇＥ陽性Ｂ細胞Ｕ２６６へのマウス抗ヒ目ｇＥ結合の分析２．１５％熱 不活化つ／胎仔血清（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）カタログ番号Ａ−１１１ １−Ｌ）　、ペニシリン、ストレプトマイシン（１００単位／ｍ１）およびＬ− グルタミン（２ｍＭ）を添加した基礎培地中でＵ２６６Ｂ１細胞（膜１ｇＥ＋） を培養する。

ｂ、９６ウエル丸底マイクロタイタープレート中、水上にて、マウス抗ヒト１ｇ Ｅモノクローナル抗体を１０．５．１．０５および０．１μｇ／ｍｌで含有する １００μｍのＦＡＣ９ＡＣ９緩衝液中（，５Ｘ１０’／アリコート）を３０分間 インキュベートし、ついでＦＡＣ３緩衝液で２回洗浄する。ジェネンテックのモ ノクローナル抗体ＭＡＥＩを陽性コントロールとして用いる。

ｃ、５０μｇ／ｍｌ　（１：２０ストツク）のＦＩＴＣ結合Ｆ（ａｂ）２アフイ ニテイ一精製ヤギ抗マウスＩｇＧ（オルガノン・テクニカカタログ番号１７１１ −００８４）を含有する１００μｍのＦＡＣ３緩衝液中、氷上で細胞を３０分間 インキュベートし、ついでＦＡＣ３緩衝液で３回洗浄する。２μｇ／ｍｌのプロ ビジウムヨーダイドを含有する４００μｍのＦＡＣ３緩衝液に細胞を加えて死細 胞を染色する。

ａ、ＦｃＥＲＩ　Ｉ　（ＣＤ２３）（＋）Ｂ細胞株ＩＭ９に対するＩｇＥ結合の ＦＡＣ３分析。１Ｍ９ヒトＢ細胞ミニロー？ＡＴＣＣＣＣＬ　１５９　（Ａｎｎ 、Ｎ、ＹＡｃａｄ、Ｓｃｊ、］　９０　：　２２１−２３４　［１９７２］　） をＧＩＦ基礎培地（］０％熱不活化ウノ胎つ血消、ペニシリン、ストレプトマイ ノン（１００単位／ｍ１）およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）を含有）中で維持し た。

ｂ、９６ウエルマイクロタイタープレート中、Ｕ２６６１ｇＥ標準を２μｇ／ｍ ｌで含有する１００μｍのＦＡＣＳ緩衝液中で細胞（５Ｘ１０’アリコート）を ４℃にてインキュベートし、ついでＦＡＣ８ＡＣ８緩衝液洗浄した。コントロー ルとして、緩衝液単独中または２μｇ／ｍｌのヒト１ｇＧ１（ベーリ、ング・ダ イアグノスティ、クスカタログ番号４００１１２、ロット番号８０１０２４）を 含有する緩衝液中で細胞をインキュベートした。

Ｃついで、細胞をマウス抗ヒトＩｇＥモノクローナル抗体（０１〜１０μｇ／ｍ ｌ）とともに氷上にて３０分間インキュベートした。陽性コントロールとしてジ エネンチックのモノクローナル抗体ＭＡＥＩを用いた。

ｄ、ＦＩＴＣ結合Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ（オルガノン・テクニカカ タログ＃１７１１−００８４）を５０　ｔｔ　ｇ／ｍ　］で含有する１００μｌ のＦＡＣ３緩衝液中、細胞を４℃にて３０分間インキュベートし、ついでＦＡＣ ８ＡＣ８緩衝液洗浄した。

ｅ、Ｑμｇ／ｍｌのプロピジウムヨーダイドを含有する４００μｌの緩衝液に細 胞を加えて死細胞を染色した。

ｆ　細胞をベクトンディッキンソンＦＡＣ８ＣＡＮフローサイトメーター上で分 析した。前方光散乱ゲートおよび９０°側方ゲートをセットして細胞の均一集団 を分析し、プロビジウムヨーダイドで染色された死細胞は分析から排除した。

ＦＩＴＣウサギ抗ヒトＴｇＥ単独で染色きれた細胞に関して、ＦＩＴＣ陽性細胞 （ＩｇＥ結合）を分析した。

ｇ、各実験における１Ｍ９細胞の表面上のＣＤ２３レベルを決定するための陽性 コントロールとして、細胞のアリコートをベクトンディッキンソンマウスモノク ローナル抗体Ｌｅｕ２０　（抗ＣＤ２３抗体）（１０μｇ／ｍｌ）　で４℃ニテ ３０分間染色し、ついで２回染色した。ついで細胞を、ＦＩＴＣ結合ｆ（ａｂ’ ）２アフイニテイ一精製ヤギ抗マウスＩｇＧ（５０μｇ／ｍｌ）とともにインキ ュベＢＩＪンパ芽球細胞ＩＭ−９上に発現された低親和性１ｇＥレセプター（Ｃ Ｄ２３）への４０ｎＭＦＩＴＣ標識１ｇＥの結合を、ＦＡＣ３ＣＡＮフローサイ トメーター上のフローサイトメトリーにより分析した。Ｆｉｔｃ　ＩｇＥ結合に 対する上記抗体の影響は、Ｆｉｔｃ　ＩｇＥをマウス抗ヒト抗体（０１〜１０μ ｇ／ｍｌキメラ）とともにＰＢＳ（０，１％ＢＳＡおよび１０ｍＭアノ化ナトリ ウムを含有、ｐＨ７，４）中、３７°Ｃにて３０分間ブレインキュベートし、つ いで得られた複合体を５Ｘ１０５細胞とともに４℃にて３０分間インキュベート することにより調べた。ついで、細胞を３回洗浄し、４７５ｎＭにおける平均チ ャネル蛍光を測定した。

１．１ｇＥインビトロアッセイプロトコールａ　末梢血単核細胞を正常ドナーか ら分離した。

ｂ　細胞をリン酸緩衝食塩水で充分に洗浄してできるだけ多数の血小板を除去し た。

Ｃ単核細胞をカウントし、培地中に１×１０＠細胞／ｍｌにて再懸濁した。

（培地＝ＤＭＥＭ＋ペニシリン／ストレプトマイシン＋１５％ウマ血清＋ＩＬ− ２（２５Ｕ／ｍｌ）　十ＴＬ、−４（２０ｎｇ／ｍ１））。

ｄ、抗体を適当な濃度にて０．５および８日目に加えた。

ｅ　培養液を２４ウ工ルフアルコン組織培養プレート中で１４４日間インキュペ リｇＥ濃度をアッセイした。

ａ、ＩｇＥ（ＮＤおよびＰＳアロタイプ）をクロラミンＴ法によりヨード化し、 ＲＩＡ緩衝液・ＰＢＳ、０．５％ラウン清アルブミン（シグマカタログ番号Ａ− ７８８８）　、０．０５％ツイーン２０（シグマカタログ番号Ｐ−１３７９）、 ００１％チメロサール（シグマカタログ番号Ｔ−５１２５）　、ｐＨ７，４中の ＰＤ１０セファデックスＧ２５カラム（ファルマンアカタログ番号１７−０８５ １−０１）で遊離の１２５■Ｎａから分離した。約７８〜９５％のポストカラム カウントが５０にトリクロロ酢酸で沈殿し、ヨード化ＩｇＥＩＡ製物の比活性は ７０％のカウント効率と仮定して１６〜１３μＣｉ／μｇの範囲であった。

ｂ、１２Ｘ７５ｍｍポリプロピレン試験管中で所定濃度の１４５１７ｇＥ（約５ Ｘ１０’Ｃｐｍ）を最終容量０．１ｍｌのＲＩＡ緩衝液中の種々の濃度の非標識 ］　ｇＥ　（１〜２００ｎＭ）に加えた。ついで、ＲＩＡ緩衝液（０，１ｍ１） 中のマウス抗ヒトＴｇＥモノクローナル抗体（２０ｎＭ最終濃度）を最終アッセ イ容量０．２ｍｌにて加えた。

Ｃ継続して撹拌しながら試料を２５℃にて１６〜１８時間インキュベートした。

ｄ、ＣＮ　Ｂｒ活性化セファ０−ス４Ｂ（カタログ番号１７−０４３０−０１） および担体プロ１インＡセフアロース（レプリゲン（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）カタロ グ番号ＩＰＡ３００）に結合させたアフィニティー精製ヤギ抗マウスＩｇＧ（ベ ーリンガーマンハイムカタログ番号６０５　２０８）のＲＩＡ緩衝液中の０．３ ｍｌ混合液を加え、２５℃にて継続して撹拌しながら１〜２時間インキュベート することにより、結合したＩｔｓＩ　ＩｇＧおよび遊離の１！５Ｉ　ＩｇＧを分 離した。ついで、ＲＩＡ緩衝液（１ｍｌ）を加え、試験管を４００Ｘｇにて５分 間遠心分離した。

試料をカウントして全カウントを測定した。細く引き出したパスツールピペット で上澄み液を吸引し、試料を再びカウントし、遊離カウントに対する結合カウン トを計算した。

ｅ、ＮｒＨのマンソン（Ｐ　、　Ｍｕｎｓｏｎ）により書かれたりガントプログ ラムに基づくフォルトランプログラム（スキャンプロット（ｓｃａｎｐｌｏｔ） 　）を利用してスキャノチャード分析を行った。スキャソトプロット（ｓｃａｔ ｐｌｏｔ）には、ロッドバード（Ｒｏｄｂａｒｄ）タイプの回帰分析を用い、結 合カウントを全カウントの関数として適用した質量作用式を用いる。

実施例２ 変異体１ｇＥの調製 パドラン＆デービーズ（Ｍｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、２３　：１０６３　（１９ ８６）　）によるＩｇＥ　Ｆｃモデル（ヒトＩｇＧＩ　Ｆｃの結晶構造（ダイセ ンホーファー（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ）　、ＢｉｏｃｈｅＩｌ、２０　：　２ ３６１　２３７０　［１９８１］　）に基づ（）に基づき、ヒト■ｇＥのそのレ セプターへの結合を試験するのに用いることのできる一連の変異体を設計した。

これら変異体はＥｍｕｔｌ−１３と称され、下記表６に挙げである。Ｆｃε３ド メインは７つのβ鎖からなり、これら鎖は全免疫グロブリンドメインを表すβン ート構造を形成する：これら７つのβ鎖を連結する６つのループが存在する。本 発明者らは、これらループをそれが連結する２つのβ鎖により表す、たとえばル ープＡＢはβ鎖ＡおよびＢを連結する。本発明者らは、Ｆｃε３ドメインループ のうち５つを対応ヒトＩｇＧ１で置換したヒト■ｇＥの変異体を構築した（表６ ．１−５）。６番目のループにはＩｇＥおよびＩｇＧの両方とも糖付加部位が含 まれるため、本発明においては変化させなかった。一つの変異体（表６．６）は 、ヒトＦｃε３β鎖りをヒトＩｇＧＩＦｃγ２対応物と交換することにより作製 した。７つの別の変異体（表６．７−１３）は、Ｆｃε３β鎖およびＦｃε２内 のループ中へのＡｌａ残基の置換からなっていた。

ヒト■ｇＥ遺伝子を、公的に利用できる細胞株であるＵ２６６からクローニング した。この遺伝子を、ヒトサイトメガロウィルスエンハンサ−およびプロモータ ー、５゛イントロンおよび５ｖ４０ポリアデニル化シグナルを含有するすでにム タージーン（Ｍｕｔａ−ｇｅｎｅ）ファージミドインビトロ突然変異誘発キット により提供される緩衝液および酵素並びに下記表６に示すヒトＩｇＧ１配列をコ ードす異誘発を行った。変異体１ｇＥＤＮＡの配列は、３５Ｓンデオキソンーク エンシングを用いて変異の部位のみを調べた。

上記１ｇＥ変異体をヒト牌臓２９３細胞（ゴーマンら、上記）中で一過的に発現 さ也マウス抗ヒトＩｇＥ抗体アフィニティーカラム上で精製し、試料を５ＤＳ− ＰＡＧＥを用いて処理して変異体タンパク質が適切な分子量のものであることを 確認した。

実施例３ 可溶性ＦＣＥＨ結合アッセイ このアッセイは、ＦＣＥＨに対する結合のみを測定する逐次阻止ＥＬＩＳＡであ る。このアッセイでは、ＦＣＥＨに対するモノクローナル抗体を５０ｍＭ炭酸ナ トリウム（ｐＨ９，６）中の１μｇ／ｍｌの濃度にてＥＬＩＳＡプレート上に室 温にて２時間コーティングし、０５％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（Ｐ ＢＳＡ）で２時間ブロックし、ついでＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の００５ ％ツイーン２０）で３回洗浄する。総換え手法により製造した可溶性ＦＣＥＨを ５０単位／ｍｌの濃度にて加えて１時間インキュベートし、ついでＥＬＩＳＡ洗 浄緩衝液中で５回洗浄する。ついで、変異体１ｇＥ試料をウェルに加え、１〜２ 時間インキュベートする。過剰の変異体１ｇＥを吸引により除去し、ついでビオ チン化１ｇＥを５０ｎｇ／ｍｌの濃度にて１５分間加え、ついでＥＬＩＳＡ洗浄 緩衝液で５回洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したストレプトアビ ノン（シグマ・ケミカル・カンパニー＃５５５１２）を１　＋　５０００希釈に て１５分間加え、ついでＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄した。テトラメチルベ ンジジンベルオキシダーゼ基質系（キルケガール＆ベリー・ラブズ＃５０−７６ −００、ロット番号ＮＡ１８）で２５℃にて７分間発色させた。ＬＭ　ＨＣｌを 加えて反応を停止させた。変異体１ｇＥがＦＣＥＨに結合する能力は、ビオチン 化ＩｇＥが結合を妨げられる程度により評価する。このアッセイは変異体１ｇＥ によるいかなるＦＣＥＨ結合についても試験すべく設計してあり、ＦＣＥＨに対 する変異体の親和性を天然１ｇＥと比較して決定することを意味するものではな い。

Ｕ２Ｏ５１ｇＥ変異体のためのＦＡＣＳベースの結合アッセイＵ２６６　ＩｇＥ 　ｃＤＮＡでトランスフエクシヨンした２９３ｓ細胞からの組織培養上澄み液を トランスフェクション後４８時間または９６時間のいずれかで回収した。組織培 養上澄み液をアミコンセントリブシブ３０フ遠心濃縮機（３０゜０００ＭＷカッ トオフ）で５×に濃縮した。濃縮した上澄み液をマウスモノクローナル抗Ｕ２６ ６　１ｇＥアフィニティーカラム（ＣｎＢｒ−セファロースに結合させたジェネ ンテックＭＡＥＩ）に通した。５０ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ７，８）中の３．０ Ｍシアン化カリを用いてＵ２Ｏ５ＩｇＥをカラムから溶出した。ＯＤ。

２８０ｎｍで測定したタンパク質を含有する溶出液画分をプールし、アミコンセ ントリコンゝ濃縮機中に入れた。複数の容量のＰＢＳを濃縮機に通すことにより 溶出緩衝液をＰＢＳと交換した。アフィニティー精製した上澄み液の最終容量は ０．５〜１ｍｌであった。組換えＩｇＥ変異体の構造的完全さを１〜１２％５Ｄ ＳＰＡＧＥゲル上で分析し、Ｕ２６６細胞株から得たＵ２Ｏ５１ｇＥ標準と比較 した。また、一連のモノクローナル抗ＩｋＥ抗体に結合する能力について変異体 を分析して、適切な畳み込み（ｆｏｌｄｉｎｇ）および天然１ｇＥとの構造的同 一性をさらに確認した。各１ｇＥ変異体についての免疫反応性１ｇＥの濃度は、 下記のようにしてヒトＩｇＥ捕捉ＥＬＩ　ＳＡにより決定した。ヌンクイムノプ レートマクシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）　”プレート（ヌンク＃４−３９４５ １）をコーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９，６）中の １μｇ／ｍｌにてジエネンテソクのマウスＩｇＧ１抗Ｕ２６６　１　ｇＥ　（Ｍ ＡＥＩ）で４℃にて一夜コーティングした。コーティング抗体をＥＬＩＳＡ洗浄 緩衝液（ＰＢＳ中の０゜０５％ツイーン２０（米国バイオケミカル・コーポレー ション＃２０６０５））で３回洗浄して除去した。非特異的部位をオービタルン エー力−（ｏｒｂｉｔａｌｓｈａｋｅｒ）上、ＥＩｊＳＡ希釈緩衝ｆ＆（０，５ ％ＢＳＡ　（シグマ・ケミカル・カンパニー＃Ａ−７８８８）、０．０５％ツイ ーン２０および２ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する５０ｍＭｈリス緩衝食塩水）で２５ °Ｃにて２時間ブロックした。ＥＤＴＡ洗浄緩衝液で３回洗浄して希釈緩＃液を 除去した。ＥＤＴＡ希釈緩衝液中のＩｇＥ変異体の２倍系列希釈をプレートに加 えた。Ｕ２Ｏ５１ｇＥ標準（ロット１３０６８−４６）を、１０００．５００． ２５０．１２５．６２５．３１．３および１５．６μｇ／ｍｌにて２つずつ標準 として加えた。試料および標準を２５℃にて２時間インキュベートし、ついでＥ ＤＴＡ洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＥＤＴＡ希釈緩衝液中に１　：　８０００の ＨＲＰ結合ヒツジ抗ヒトＩｇＥ　（ＩＣＮａＮ０６０−０５０−１）でＩｇＥを ２５℃にて９０分間検出し、ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で３回洗浄した。ＨＲＰ結合 体をテトラメチルベンジジンベルオキシダーゼ基質系（キルケガール＆ベリーラ ブズ、＃５０−７６−００、ロフト番号ＮＡｌ８）で２５℃にて７分間発色させ た。ＩＭＨＣ＋を加えて反応を停止させた。

５７０ｎｍでの吸光度を引いた４５０ｎｍでの二重波長分光光度計を用いて反応 性生成物を分析した。Ｕ２Ｏ５１ｇＥ標準を用いて標準曲線を作成し、試料のＩ ｇＥ濃度を非母数線形回帰分析により外挿した。

ＦｃＥＲＩα（＋）ＣＨＯ３Ｄ１０　Ｂ細胞（ＦＣＥ）（を発現する）およびＦ ｃＥＲＩＩ　（ＣＤ２３）（＋）１Ｍ９　Ｂ細胞（ＦＣＥＬを発現する）を用い て結合アッセイを行った。安定にトランスフエクシヨンしたＣＨＯ（ｄｕｋ−） 細胞クローン３Ｄ１０　（ＪＢＣ２６５，２２０７！Ｊ−２２０８１，１９９０ ）を、１０％熱不活化ウノつ仔血清、８０μｇ／ｍｌゲンタマイシン硫酸塩およ び５Ｘ１０゛７Ｍメトトレキセートを添加したイスコープの変性ダルベツコ培地 中に維持した。ＩＭ９ヒトＢｍ胞ミニロー？ＡＴＣＣＣＣＬ　１５９　（Ａｎｎ 、Ｎ、Ｙ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、１９０：２２１．−２３４．１９７２）は、１０％０％熱不 活化ラン血清、ベニ／リン、ストレプトマイシン（１００単位／ｍ１）およびＬ −グルタミン（２ｍＭ）を含有するＧＩＦ基礎培地中に維持した。各実験におい てＩＭ９細飽の表面上のＣＤ２３レベルを決定するための陽性コントロールとし て、細胞のアリコートをベクトンディッキンソンマウスモノクローナルＬｅｕ２ ０（抗ｃＤ２３）抗体（１０μｇ／ｍｌ）で４℃にて３０分間染色し、ついでＦ ＡＣ３緩衝液中で２回洗浄した。ついで、細胞をＦｒＴＣ結合Ｆ（ａｂ’）２ア フイニテイ一精製ヤギ抗マウスＩｇＧ（５μｇ／ｍｌ）とともにインキュベート した。ＰＢＳ中の１０ｍＭ　ＥＤＴＡとともに３７℃にて２分間インキュベート することにより、吸着したＣＨＯ３Ｄ１．０細胞を組織培養ディソノユから除去 した。細胞をカウントし、ついてＦＡＣ３緩衝液（ＰＢＳ中の０１％ＢＳＡ、１ ０ｍＭ　Ｎａアット、ｐＨ７，４）中に５Ｘ１０’／ｍｌの濃度にて再懸濁した 。ＣＨＯ３Ｄ１０細胞および１Ｍ９細胞（５Ｘ１０’／アリコート）を９６ウエ ルマイクロタイタープレート中、Ｕ２Ｏ５１ｇＥ標準またはＩｇＥ変異体（２μ ｇ／ｍｌ）を含有するＦＡＣＳ緩衝液（１００μｍ）中で４℃にて３０分間イン キュベートし、ついでＦＡＣ３緩衝液で２回洗浄した。コントロールとして、緩 衝液単独中または２μｇ／ｍｌヒトＩｇＧ１（ベーリング・ダイアグノスティッ クス＃４００１１２、ロット番号８０１０２４）を含有する緩衝液中で細胞をイ ンキュベートした。ついで、ＦＩＴＣを結合したウサギ抗ヒトＩｇＥ（アキュレ ート・ケム、＃ＡＸＬ　４７５Ｆ、０ット番号０４０Ａ）を２０　μｇ／ｍ　］ にて含有するＦＡＣ３緩衝液（１００１１１）中で細胞をインキュベートした。

プロピジウムヨーダイド（２μｇ／ｍｌ）を含有する緩衝液（４００μｍ）を細 胞懸濁液に加えて死細胞を染色した。ベクトンディッキンソンＦＡＣ３ＣＡＮフ ローサイトメーター上で細胞を分析した。前方光散乱ゲートおよび９０°側方散 乱ゲートをセントして細胞の均一な集団を分析し、プロビジウムヨーダイドで染 色された死細胞は分析から排除した。ＦｒＴＣウサギ抗ヒトＩｇＥ単独で染色さ れた細胞に関してＦＩＴＣ陽性細胞（ＩｇＥ結合）を分析した。

上記アッセイを用いて実施例２のＩｇＥ類似体がＦＣＥＨおよびＦＣＥＪ、に結 合する能力を決定した。その結果を表７に示す。

ＦＣＥＨおよびＦ　ＣＦ、　ＬへのＩｇＥおよびＩｇＥ類似体の結合３つの変異 体１ｇＥはＦＣＥＨレセプターに対する結合の完全な喪失を示した６変異体１． ４および６゜変異体６は、Ｆｃε２ドメインに近接したＦｃε３の末端にあるβ 鎖りが変わっていた。変異体１および４は、Ｆｃε４ドメインに隣接したおよび 近くにある２つのＦｅε３ループの変化を含んでいた。変異体７は、ループＡＢ の３つのＣ末端残基がアラニンに変わった変異体１の部分集合であることに注意 すべきである（表６．１ｖｓ７）。しかしながら、変異体７はＦＣＥＨへの結合 に影響を及ぼさない。本発明者らは、このことを１）ＦｃεＲ１がＩｇＥ残基３ ７７−３８１の少なくとも一つに結合するか、または２）ＩｇＥループＡＢ　（ ８残基）に対して置換されたＩｇＧ１ループＡ、Ｂ（９残基）中の特別の残基が ある種の隣接する結合決定基、おそらくループＥＦの変形に影響を及ぼしたかの いずれかを意味すると解釈した。変異体８および１０がＦｃεＲ１結合に対して 影響を及ぼさないのは、おそらく−、ループＡＢおよびβ鎖りにより結合された 空隙中にＦＣＥＨレセプターが突出しないことを意味する。

変異体４はＧＩｙ４４４を置換するＬｅｕを有していたが（表６）、これはルー プＥＦのコンフォメーノヨンには影響を及ぼさない。残基４４４は、このα−へ リックスのＮ末端の前にある。加えて、マウスＩｇＥは位Ｎ４４４にＶａｌを有 し、ラットＩｇＥはＡｓｐを有する。α−へリソクスの中央にある２つの埋没し た疎水性残基であるＷ４４８およびＩ４４９は、α−ヘリックスの末端にあるＧ ４５１がそうであるように、置換されたＩｇＧ１ループ（Ｗ４４８、Ｌ４４９） 中に保持される。それゆえ、ループＥＦのコンフオメーンヨンは、ＩｇＥおよび ｒｇＧｌで類似している。

変異体２および３は、ＦＣＥＨに対して減少した結合を示した。ループＢＣはβ 鎖りの近くに位置しループＣＤはループＥＦの近傍に位置するので、ループＢＣ およびＣＤ中の１または２の残基がＦ　ＣＥ　Ｈと接触していると考えられる。

５つの変異体１ｇＥはＦＣＥＬレセプターに対する結合を喪失した。変異体１． ３４．７および８゜変異体１および４については上記で議論した。変異体３には ループＣＤの変化が関与していた。ＦＣＥＨとは対照的に、ループＣＤは明らか にＦＣＥＬ結合において主要な役割を果たしている。変異体７は上記のように変 異体１の部分集合であるが、ループＡＢのＣ末端部分を含み、ループＥＦに近接 している。加えて、変異体８は２つのＴｈｒ残基（３８７，３８９）のＡｌａに よる置換からなっている；これら２つの残基は、β鎖Ｂ（ループＡＢとβ鎖りと により結合された上記空隙の底部にある）の一部である。変異体１０は、この空 隙中のβ鎖Ｅ（β鎖Ｂに隣接する）上の２つの異なる残基（４３８，４４０）を 含んでいた。変異体１０はＦＣＥＬ結合に影響を及ぼさなかったので、本発明者 らは、ＦＣＥＬレセプターは空隙中に最小限の侵入のみを有しているべきである が、高親和性レセプターは該空隙中に突出していないと結論した。

Ａｓｎ４３０にある糖付加部位（ｒｇＧ　Ｆｃ内の糖付加部位に対応する）に加 えて、ヒトＩｇＥはＡｓｎ４０３に他の糖付加部位を有する。変異体９では、Ａ ｓｎ４０３およびＴｈｒ４０５がアラニンに変換されていた（表６）。炭水化物 の喪失はいずれのレセプターに対する結合にも影響を及ぼさなかった。

変異体１〜１３で得られた情報に基づき、本発明者らは、ＦＣＥＨおよびＦＣＥ ＬがＩｇＥ　Ｆｃ上に異なるが重複する結合部位を有することを提唱する。低親 和性レセプターは、３つの隣接するループ　ＡＢＳＣＤおよびＥＦが関与するＩ ｇＥ　Ｆｃε３ドメインの比較的小部分と相互反応すると思われる。対照的に、 高親和性レセプターは、ＩｇＥＦｃε３の一層大きい部分と相互反応し、該部分 はループＥＦ、β鎖Ｄ１およびおそらくはループＡＢのＮ末端部分の範囲に及ぶ 。ループＥＦおよびβ鎖りの近傍のループＢＣおよびＣＤの一部もまたＦＣＥＨ と相互反応する。加えて、ＦＣＥＬはループＡＢとβ鎖りとにより結合された空 隙内に突出するが、ＦＣＥＨはそのように突出しない。本発明者らはＦｃε４に おいてはいかなる変異体をも評価せずＦｃε２については一つの変異体のみを評 価しただけであるので（変異体１３）、これら２つのドメインの一部がＩｇＥレ セプター結合において役割を果たしている可能性がある。

実施例４ ヒト化ＭａＥ１１の調製 ＭａＥｌｌから残基を選択し、ヒトＦａｂ抗体背景中に挿入または置換した（Ｖ □領域カバットサブグループ■およびＶＬ領領域サブグループり。第一の型、ｈ ｕｍａｅｌｌｖｌまたは１型を表８に記載する。

表８　ヒト化ＭａＥ１１１型のための■エサブグループ■およびｖＬサブグルー プｒ（カバット）共通配列における変化１型の親和性をアッセイしたところ、ド ナー抗体Ｍａ　ｅ　１１の親和性に比べて約１００倍低いことがわかった（図４ ａおよび４ｂ参照）。それゆえ、表９に示すように、１型の配列においてさらに 修飾を行った。これらさらなる修飾が標識ｈｕ　Ｉ　ｇＥのＦＣＥＨへの結合を 阻止する能力の決定を行った。

５０％阻止アッセイ（その結果を表９に示す）を以下のようにして行った：９６ ウエルアツセイプレート（タンク類）を、１１１ｇ／ｍ１コーティング緩衝液（ ５０ナノモル炭酸／重炭酸、ｐＨ９，６）中のＦｃεＲ１α鎖１ｇＧ］キメラレ セプター（０，０５ｍ１）でコーティングした。４〜８℃にて】、２時間アッセ イを行った。ウェルを吸引し、２５０μｌブロツク緩衝液（ＰＢＳ−−１％ＢＳ ＡｐＨ７，２）を加え、４℃にて１時間インキュベートした。別のアッセイプレ ートにて、アッセイ緩衝液（０５％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン２０、ＰＢＳ、 ｐＨ７，２）で１〜１０倍に希釈することにより試料および参照マウスＭａｅｌ ｌ抗体を２００μｇ／ｍＩから滴定し、等容量のＬｏｎｇ／ｍｌビオチン化１ｇ Ｅを１０ｎｇ／ｍｌにて加え、プレートを２５℃にて２〜３時間時間インベコベ ート。ＦｃεＲ１コーティングウェルをＰＢＳ−０，０５％ツイーン２０で３回 洗浄し、ついで試料ウェルからの５０μｌを移し、撹拌しながら２５８Ｃにて３ ０分間インキュベートした。アッセイ緩衝液中に１・５０００に希釈した５０μ ｍ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰを撹拌しながら１５分間インキュベー トし、ついで王妃と同様に洗浄した。５０μｍ／ウェルのマイクロウェルペルオ キシダーゼ基質（キルケガール＆ぺり−・ラボラトリーズ）を加え、３０分間発 色させた。等容量の１規定ＨＣＩを加えて反応を停止させ、４５０ｎｍにて吸光 度を測定した。各抗体についてＩＮＰＬＯＴを用い、非線形４因子曲線適合でブ ロックした抗体の濃度に対して阻止％をプロットすることにより５０％阻止の濃 度を計算しプこ。

表９ ヒト化ＭａＥ１１変異体 表９および図４ａおよび４ｂから明らかなように、変異体８（Ｌ鎖中の部位６０ および６１において変異体１のヒト残基がＭａｅ１１対応物で置換されている） が実質的に増大した親和性を示した。変異体８ａおよび８ｂ（１または２のマウ ス残基がヒト残基を置換している）において親和性のさらなる増大が認められる 。

他の増大が（少なくとも実質的にＭａｅｌ、１のレベルまで）、ｖ工およびｖｌ （１の内部に認められる疎水性ヒト残基をＭａＥ１１対応物で置換して変異体９ として示される変異体とすることによって得られる（表９および図４ａおよび４ ｂ参照）。

従って、この態様のヒト化抗体はＭＡＥ１’ｌの約０．１〜１００倍の範囲の親 和性を有するであろう。

表１０では、ヒト化ｍａＥ１１　１ｇＧ］変異体の種々の組み合わせがＦＣＥＨ 親和性に及ぼす影響を調べる。

表１０　ヒ（・化ＭａＥ１１　１ｇＧ１変異体実施例５ ＩｇＥ変異体の調製 ＩｇＥ変異体（表］−１）を調製し、抗１ｇＥ（とりわけＭａＥｌｌ）に対する 結合、およびＦ　ｃ　ｅ　Ｒ，ＩおよびＦｃεＲＩＩに対する結合に及ぼす影響 を評価した。幾つかの変異体は、特定のアミノ酸残基を類似のまたは非常に異な る電荷またはサイズを有する他の残基て置換するよう設計した。これら変化がレ セプター結合に及ぼす影響を下記表に示す。　−これらレセブターアンセイは実 質的に下記のようにして行う。

９６−ウエルアッセイプレート（ヌンク製）を１μｇ／ｍｌコーティング緩衝液 （５０ナノモル炭酸／重炭酸、ｐＨ９，６）中のＦｃεＲ１およびＲｌｒ　Ｉｇ Ｇ１キメラレセプター（０，０５ｍ１）でコーティングした。アッセイを４〜８ ℃にて１２時間行った。ウェルを吸引し、２５０μｍブロック緩衝液（ＰＢＳ− １％ＢＳＡ　ｐＨ７，２）を加え、４℃にて１時間インキュベートした。別のア ッセイプレートで、アッセイ緩衝液（０，５％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン２０ 、ＰＢＳ。

ｐＨ７，２）で１〜１０倍希釈することにより試料および参照マウスＭａＥ１１ 抗体を２００μｇ／ｍｌから滴定し、等容量の１．　Ｏｎ　ｇ／ｍ　］ビオチン 化１ｇＥを１．０μｇ／ｍｌにて加え、プレートを２５°Ｃにて２〜３時間イン キュベートした。ＦｃεＲ１コーティングウェルをＰＢＳ−０，０５％ツイーン ２０で３回洗浄し、ついで試料ウェルからの５０μｍを移し、撹拌しながら２５ ℃にて３０分間インキュベートした。アッセイ緩衝液中に１・５ｏｏｏに希釈し たストレプトアビノン−ＨＲＰ（５０μｌ／ウエル）を撹拌しながら１５分間イ ンキュベートし、ついでプレートを上記のようにした洗浄した。５０μｌ／ウエ ルのマイクロウエルペルオキシダーゼ基質（キルケガール＆べり−・ラボラトリ ーズ）を加え、３０分間発色させた。等容量の１規定ＨＣＩを加えることにより 反応を停止させ、４５０μｍにて吸光度を測定した。吸光度をブロック抗体Ｍａ Ｅ１１の濃度に対してプロットし、ＩＮＰＬＯＴを用いて阻止標準曲線を作成し た。

表１１　１ｇＥ変異体のアミノ酸配列 配列表 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　１配列の長さ一１１８アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー　直線状 配列： Ｘａａ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ＾ ｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｘａａ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　 Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　ＴｈｒＣｙｓ　Ｌｅｕ　ＶａＩＶａ ｌ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ 　Ａｓｎ　ＬｅｕＴｈｒ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｘａａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　 Ｘａａ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　ＨｉｓＳｅｒ　Ｔ ｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｘａａ　Ａ ｓｎ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＬｅｕ　丁ｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｓｅ ｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｒ ｐ　１ｉｅＧｌｕ　Ｇａｙ　Ｇｌｕ　丁ｈｒ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ 　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＡｌａ　Ｌｅｕ　 Ｘａａ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｙ　Ｐｒ。

１．１０　１．１５　１１８ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）　・２配列の長さ、１１１アミノ酸 配列の型・アミノ酸 トポロジー・直線状 配列。

Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ］、　５　１０　１５ Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ＾ ｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ＾５ｐＴｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ 　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ 　Ｐｒｏ　ＧｌｙＧｉｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　 Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　５ｅｒＧｌｕ　Ｉ ｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓ ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　ＰｈｅＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｈｉ ｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ＾ｌａ　Ｔｈｒ 　ＰｈｅＴｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　丁ｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　ＧｌｙＴｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌ ｅｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓｌｌ、０１１１ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　３配列の長さ、１３４アミノ酸 配列の型・アミノ酸 トポロジー　直線状 配列 Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇ１．ｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇ１．ｙ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　５ｅｒＧｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ 　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ 　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　ＴｈｒＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　 Ｔｒｐ　Ｉｌ、ｅ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　１ｌｅｔ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ 　Ａｓｐ　Ｇ］、ｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ＴｙｒＡｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ 　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ 　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　５ｅｒＧｉｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　 Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＡｓｐＴ ｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅ ｒ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　ＨｉｓＴｒｐ　Ｒｉｓ　Ｐｈｅ　Ａｌａ 　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ 　Ｖａｌ　５ｅｒ１１０　１．１５　１２０ Ｓｅｒ＾ｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ、　 Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ａｒｇ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　４ 配列の長さ　１２４アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー二直線状 配列 Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ、　ｋｌｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｃｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙ ｓ　Ｐｈｅ　１ｌｅｔ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌｌ　５　１０　１５ Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＡｒｇＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ＾ｌ ａ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　５ｅｒＳｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｎ、、Ａｌ ａ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｓｅ ｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ＾１ａ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ＾ｌａ　Ｓｅｒ　 Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇ１．ｙ　ｌ’ａｌ　Ｐｒｏ　ＡｓｐＡｒｇ 　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ 　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅＳｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇ１．ｎ 　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ 　Ｇｉｎ　Ｇ１ｎＴｙｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　 Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＧｌｕ　Ｉ ｌｅ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ＾ｌａ　Ａｓｐ＾１ａ＾ｌａ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　 Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｐｒ。

１．１０　１．１５　］２０ Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　丁ｈｒ　Ａｒｇ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：５ 配列の長さ　１３０アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー　直線状 配列 Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｉ−ｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｔｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ＋、　５　１．０　１５ Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　 Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　ＴｈｒＳｅｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ＾ｌ ａ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　１１．ｅ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｙ　Ａｓｎ　ＬｙｓＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｉｌ ｅ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ＾ｓｎ 　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ 　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　５ｅｒＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　 Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　 Ｇ１．ｕ　ＡｓｐＴｈｒ＾ｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔ ｒｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ＾ｌａ　Ｔｙｒ＾１．ａ　Ｍｅｔ　ＡｓｐＴｙｒ　Ｔｒｐ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ 　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒｌｌ、０　１１５　＋、２０ Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ａ ｒｇｌ、２５　１３０ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：５ 配列の長さ、１０６アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー　直線状 配列： Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　ＬｅＩＪＴｈｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕｌ　５　１０　１５ Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ＾ｌａ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ＾ｌ ａ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　ＡｓｐＴｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ 　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｔｒ（ｙ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｂ＋　Ｌｙ ｓ　Ｐｒｏ　Ｇ１．ＹＧｌｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　１１ ．ｅ　Ｔｙｒ＾１ａ＾ｌａ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　５ｅｒＧｌｙ　 Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇ１．ｙ 　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　ＰｈｅＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　 Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ａｌａ＾ｌａ　Ｔ ｈｒ　ＴｙｒＴｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｒ＋　Ｇｌｕ　Ａ ｓｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　丁ｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙｈｒ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：　７配列の長さ　１３７アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー二直線状 配列 Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｅｉｓ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ＾ ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　１．ｙｓ　Ｐｒｏ　５ｅｒ１、　５　１０　１５ Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　丁ｈｒ　Ｖａｌ　 丁ｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　ＴｈｒＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａ ｓｎ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｙ　Ａｓｎ　ＬｙｓＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｉｌ ｅ　Ｉ（ｉｓ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　丁ｙｒ５［ ）　５５　６（１ ＾ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　 Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　５ｅｒＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｐ ｈｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｔ ｈｒ　Ｇｌｕ　ＡｓｐＴｈｒ＾ｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ 　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　ＧｌｙＳｅｒ　 Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　丁ｙｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇ１ｙ’ Ａ１ａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌｌｌｏ　１１５　１２０ Ｔｈｒ　Ｉ’ａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ 　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｈｉｓ　ＴｒｐＰｒｏ　Ｇｌｙ 配列ｔｑ　（ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ）：　ｓ配列の長さ　４５３アミノ酸 配列の型・アミノ酸 トポロジー　直線状 配列 Ｇｌｕ　ｌ’ａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ 　Ｇｌｙ　Ｌ、ｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５ Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ＾ｌａ　Ｖａｌ　Ｓ ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　ＴｈｒＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｓｅ ｒ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　ｒｌｅ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌ ｙ　Ｌｙｓ　ＧｌｙＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ 　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ＾１ａ　 Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ｌ’ａｌ　Ｌｙｓ　ＩＩ；Ｉｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　ｒ ｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　５ｅｒＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈ ｅ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　ｌ１ｅｔ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａ ｌａ　Ｇｌｕ　ＡｓｐＴｈｒ＾ｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ 　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　ＨｉｓＴｒｐ　 Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　丁ｈｒ　 Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　ｖａｌ　５ｅｒＳｅｒ＾ｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙ ｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｌｅ ｕ　ＡｌａＰｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ 　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＣｙｓＬｅｕ　Ｖａｌ　 Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 Ｖａｌ、　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　ＡｓｎＳｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　）Ｉｉｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　ｖａｌ 　ＬｅｕＧｉｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　 Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ、　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｐｒ。

Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　 Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　ＨｉｓＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａ ｓｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　人ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇ］、ｕ　 Ｐｒｏ　Ｌｙｓ’　５ｅｒ２１．５　２２０　２２５ Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　１ｌｉｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ 　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　 Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　 Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　ＡｓｐＴｈｒ　Ｌｅｕ　１ｌｅｔ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　 Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　ｉ’ａｌ　Ｖａｌ　１ｌａ １Ａｓｐ　’／ａｌ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇ］、ｕ　Ｖ ａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｖａ１＾ｓｐ　Ｇａｙ　Ｖａ ｌ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ＾ｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ ＾ｒｇ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＧｉｎ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａ ｒｇ　ｌ’ａ１．　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ、　Ｌｅ ｕ３０５　３］０　３１５ Ｈ４ｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　 Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　５ｅｒ＾ｓｎ　Ｌｙｓ＾１．ａ　Ｌ ｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｉｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　１１．ｅ　 Ｓｅｒ　Ｌｙｓ＾１ａＬｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　５ｅｒ＾ｒｇ 　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　１ｉｅｔ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｖａｔ　Ｓｅ ｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａ１Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｐｂｅ　Ｔｙｒ 　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｇ１． ｕ　Ｓｅｒ　ＡｓｎＧｌｙ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ 　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＡｓｎＳｅｒ　 Ａｓｐ　Ｇａｙ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　 Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＬｙｓＳｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｇ ｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｍ ｅｔ　ＨｉｓＧｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ｔｌｉｓ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｔ ｈｒ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　５ｅｒＰｒｏ　Ｇｌ ｙ　Ｌｙｓ 配列番号（ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ）：　９配列の長さ　２１８アミノ酸 配列の型　アミノ酸 ｌ・ポロノー　直線状 配列 Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌｌ、　５　１０　１．５ Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　 Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ＾５ｐＴｙｒ　Ａｓｐ　Ｇａｙ　Ａｓ ｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙ ｓ　Ｐｒｏ　Ｇ１．ｙＬｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｃｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌ 、ｅ　Ｔｙｒ　Ａｌａλｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　５ｅｒＧｌｙ 　Ｖａｌ、　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌ ｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ丁ｈｒ　１．ｅｕ　丁ｈｒ　Ｉｌ ｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｈ ａ　Ｔｈｒ　ＴｙｒＴｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ 　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　ＧａｙＴｈｒ　 Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ＾ｌａ　Ａ ｈａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅｌｌｏ　１．１５　１２０ １１ｅ　Ｉ’ｈｅ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ 　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　５ｅｒＶａｌ　％’ａｌ　Ｃｙｓ 　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ ＾ｌａ　Ｌｙｓ　Ｖａ１Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ｖａ１人ｓｐ　Ａｓｎ＾ｌａ 　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ＋５５　 １６０　１６５ Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　 Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　５ｅｒＳｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔ ｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ＾ｌａ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｈｉ ｓ　Ｌｙｓ　ＶａｌＴｙｒ＾ｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　 Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ＴｈｒＬｙｓ　Ｓ ｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ配列番号（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　Ｎｏ）１０ 配列の長さ　８アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー　直線状 配列 Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　５ｅｒ配列番号（ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　１１配列の長さ、９アミノ酸 配列の型二アミノ酸 トポロジー　直線状 配列 Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒｌ 　５　９ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）　・１２配列の長さ・６アミノ酸 配列の型　アミノ酸　− トポロジー　直線状 配列 Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒｌ　５６ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：１３配列の長さ　６アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロノ一　直線状 配列 Ｓｅｒ　１ｌｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇ１ｎ配列番号（ＳＥＱ　ｒＤ　 Ｎｏ）：１４配列の長さ：１１アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー二直線状 配列。

Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇ１．ｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ＾ｓｎ　 Ｈｉｓ　５ｅｒ１　５　１．０　１１ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：１５配列の長さ　１１アミノ酸 配列の型・アミノ酸 トポロジー・直線状 配列・ Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｉｒ１ｓ　Ａｓｎ 　Ａｌａ　Ｌｙｓｌ　５　１０　１１ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）１６ 配列の長さ　１０アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー：直線状 配列・ Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　１１ｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　 Ｔｈｒ配列番号（ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ）　・２３（２）　ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯ Ｎ　ＦＯＲＳＥＱ　１０　ＮＯ：２３・配列の長さ　５アミノ酸 配列の型・アミノ酸 トポロジー　直線状 配列 Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ　人１ａ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）　２ ４配列の長さ・８アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー　直線状 配列 Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　ｔｌｉｓ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇｌ　５　 ８ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）＋　２５配列の長さ　８アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー　直線状 配列 Ａｌａ　Ａｌａ　＾］、ａ　Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａ１．ａ　Ａｌａ　Ａｌａｌ　５ 　８ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：２６配列の長さ：４アミノ酸 配列の型二アミノ酸 ｌ・ボロジー、直線状 配列・ Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：　２７配列の長さ　８アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー　直線状 配列。

Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｌ、ｙｓ　５ｅｒ配列番号 （ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：２８配列の長さ　９アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー　直線状 配列： Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒｌ 　５　９ 配列番号（ＳＥＱ　［Ｉ　Ｎｏ）＋３５配列の長さ、６アミノ酸 配列の型、アミノ酸 トポロジー：＠線状 配列゛ Ｓｅｒ　Ａｒｇ＾ｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓｌ　５６ 配列番号（ＳＥＱ　［）ＮＯ）３６ 配列の長さ　６アミノ酸 配列の型・アミノ酸 トポロジー・直線状 配列 ＾１ａ＾ｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａｌ　５６ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　３７配列の長さ　６アミノ酸 配列の型、アミノ酸 トポロジー　直線状 配列 Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｒｇｌ　５６ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　３８配列の長さ、６アミノ酸 配列の型二アミノ酸 トポロジー・直線状 配列 Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒｌ　５６ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）：　３９配列の長さ、６アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー　直線状 配列 Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇｌ　５６ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：４０配列の長さ・６アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロノー、直線状 配列 Ａｌａ　Ｇｌｕ＾ｌａ　Ｌｙｓ＾ｌａ　Ａｒｇｌ　５６ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）＋４７配列の長さ　４アミノ酸 配列の型・アミノ酸 トポロジー−直線状 配列 Ｇ］、ｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ 配列番号（ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ）：　４８配列の長さ　４アミノ酸 配列の型、アミノ酸 トポロジー　直線状 配列 Ａｌａ　Ｇｌｙ＾１ａ＾１ａ 配列番号（ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ）　・４９配列の長さ　９アミノ酸 配列の型　アミノ酸 ■・ポロン−直線状 配列・ Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｉｅ　Ｇｌｕ　Ｇａｙ　Ｇ１．ｕ　丁ｈｒ ＋　５　９ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　５０配列の長さ、９アミノ酸 配列の型二アミノ酸 トポロジー・直線状 配列： Ｂｉｓ　Ｇｉｎ　ＡＳＩ）Ｔｒｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕｌ 　５　９ 配列番号（ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ）　・５１配列の長さ　４アミノ酸 配列の型二アミノ酸 トポロン−・直線状 配列。

Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　５２配列の長さ　４アミノ酸 配列の型・アミノ酸 トポロジー・直線状 配列 Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ 配列ｉｎ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　５９配列の長さ：４アミノ酸 配列の型二アミノ酸 トポロジー・直線状 配列： Ｐｒｏ＾ｒｇ　Ａｌａ　Ａｌａ １ｊＪｆ１番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）　：　６０配列の長さ・４アミノ酸 配列の型　アミノ酸　− トポロジー　直線状 配列 Ｇ１．ｎ　Ｐｒｏ＾ｒｇ　Ｇ１．ｕ ！４ 配列番号（ＳＥＱＩＤＮ○）６１ 配列の長さ　６アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー　直線状 配列 Ａｈａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒｌ　５６ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　６２配列の長さ・５アミノ酸 配列の型６アミノ酸 トポロジー：＠線状 配列 Ｌｅｕ　Ｂｉｓ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　 ６３配列の長さ：５アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー　直線状 配列。

Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒｌ５ 配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：　６４配列の長さ　５アミノ酸 配列の型　アミノ酸 トポロジー、直線状 配列 Ａｌａ　Ｐｒｏ＾】ａ＾ｌａ　Ａｌａ 】 ＭｅｌＥ１１ＬＪＩ！１ ＳＥ工ＰＡＲＰＳＧＳＧ！９ＧＴＤＦＴＬＮ工ＨＰＶＥＥＥＤＡＡＴＦＹＣＱＱ ＳＨＥＤＰＹＴＦＧＡＧＴＫＬＥＸＫＶＳＳＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＲ ＰＰＳＴＲ ＫＴｒＰＰＳＶＹＰＬＡＲ Ｍａｅ１５　）［＋ ＩＧ２ ヒμ化ＭａＥ１１１’ｔ　（’ｉ２全１９Ｇ）Ｈ２Ｎ し諜 ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ａ φ ％Ｆ　ＩＴｃ十細胞 １ロロロロロロ ％　ＦＩＴＣ＋−月性 １０ロロロロ［Ｄ　％Ｆ１工。ヤ細、Ｖ国際謹審輔牛 １ｍｆｉ＠＋ｍｍＡｍｍｔｍｈ―　ρＣＴ／ＵＳ　、９２１０６８６Ｇ＋ｘ−Ｉ 　Ａ４＠ｂｅｓｔｋａ　Ｎ＠　ρＣＴ／ＵＳ　９２１０６８６０フロントページ の続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１５／１２　 ８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１５１０２　ＺＮＡ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、　Ａ Ｕ、　ＣＡ、ＪＰ、　ＵＳＩ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＦＣＥＬまたはＦＣＥＨの一方には結合し得るがＦＣＥＬまたはＦＣＥＨの 他方には実質的に結合し得ないポリペプチド。 ２．Ｆｃε３−Ｆｃε４配列に実質的に相同なアミノ酸配列からなる請求項１に 記載のポリペプチド。 ３．Ｆｃε３−Ｆｃε４配列と約８０％以上相同なアミノ酸配列からなり、少な くとも約５０残基を含む請求項２に記載のポリペプチド。 ４．免疫グロブリンである請求項１に記載のポリペプチド。 ５．ＦＣＥＬに結合し得るがＦＣＥＨには実質的に結合し得ない請求項４に記載 の免疫グロブリン。 ６．およそ残基４２０から４２８内に変異体アミノ酸配列を有するＩｇＥ類似体 である請求項５に記載の免疫グロブリン。 ７．およそ残基４４６から４５３内に変異体アミノ酸配列を有するＩｇＥ類似体 である請求項５に記載の免疫グロブリン。 ８．およそ３７３−３９０からのＩｇＥ残基をさらに含み、該変異体アミノ酸配 列が残基４２３−４２８の一つの残基の欠失である請求項６に記載の免疫グロブ リン。 ９．細胞毒性ポリペプチド、酵素、診断標識、または前以て決定した抗原に結合 し得る免疫グロブリン可変ドメインをさらに含む請求項４に記載の免疫グロブリ ン。 １０．およそ残基４２０−４２８内およびおよそ残基４４６から４５３内に変異 体アミノ酸配列を有するＩｇＥ類似体である請求項５に記載の免疫グロブリン。 １１．補体に結合し得る請求項１０に記載の免疫グロブリン。 １２．抗原がＣＤ８またはＣＤ３である請求項９に記載の免疫グロブリン。 １３．抗原がリンパ球表面抗原である請求項９に記載の免疫グロブリン。 １４．ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＭ配列を含む請求項９に記載の免疫グ ロブリン。 １５．アレルギー疾患の治療法であって、アレルギーに感受性の患者に治療学的 有効量のＦＣＥＬまたはＦＣＥＨ特異的ポリペプチドを投与することからなり、 該ＦＣＥＨ特異的ポリペプチドがＦＣＥＨと架橋することができずヒスタミン放 出を誘発することができないことを特徴とする方法。 １６．ＦＣＥＬに結合することができ、ＦＣＥＨに実質的に結合し得ないヒトＩ ｇＥβ鎖Ｄ配列を有する、約４０以下の残基を含むポリペプチド。 １７．約３０以下の残基を有する請求項１６に記載のポリペプチド。 １８．β鎖Ｄドメイン内の残基が欠失または置換されており、またはβ鎖Ｄドメ イン内に他の残基が挿入されている請求項１７に記載のポリペプチド。 １９．ＩｇＥのβ鎖Ｄ配列を含み、１９以下の残基を有する、ＦＣＥＨに結合可 能なポリペプチド。 ２０．ＦＣＥＨには結合し得るがＦＣＥＬには結合し得ず、およそ残基４２０か らおよそ残基４４２から選ばれたＩｇＥ配列を含む請求項１に記載のポリペプチ ド。 ２１．残基Ｋ４２３−Ｒ４２８のＩｇＥアミノ酸配列を含む請求項１９に記載の ポリペプチド。 ２２．約２０未満の残基からなり、コンフォメーションが制限されている請求項 １に記載のポリペプチド。 ２３．天然のＩｇＥの少なくとも約７５％の親和性でＦＣＥＬに結合し、天然の ＩｇＥの約１０％未満の親和性でＦＣＥＨに結合する請求項１に記載のポリペプ チド。 ２４．ＩｇＥの相補性決定領域を含む請求項４に記載の免疫グロブリン。 ２５．ＦＣＥＨには結合し得るがＦＣＥＬには実質的に結合し得ない請求項４に 記載の免疫グロブリン。 ２６，およそ残基３７３から３９０または残基４４６から４５３内に変異体アミ ノ酸配列を有するＩｇＥ類似体である請求項２５に記載の免疫グロブリン。 ２７．およそ残基３８２から３９０または残基４４６から４５３内に変異体アミ ノ酸配列を有するＩｇＥ類似体である請求項２５に記載の免疫グロブリン。 ２８．ＦＣＥＨ結合性のループＥＦおよびβ鎖Ｄドメインをさらに含む請求項２ ７に記載の免疫グロブリン。 ２９．前以て決定した抗原、酵素または診断標識に結合し得る免疫グロブリン可 変ドメインをさらに含む請求項２４に記載の免疫グロブリン。 ３０．抗原がＣＤ８またはＣＤ３である請求項２９に記載の免疫グロブリン。 ３１．抗原がリンパ球細胞表面抗原である請求項２９に記載の免疫グロブリン。 ３２．ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＭ配列を含む請求項２５に記載の免疫 グロブリン。 ３３．天然のＩｇＥの少なくとも約７５％の親和性でＦＣＥＨに結合し、天然の ＩｇＥの約１０％未満の効率でＦＣＥＬに結合する請求項２５に記載のポリペプ チド。 ３４．ＩｇＥのヒトループＡＢ−β鎖ＢのＦＣＥＬ結合性ドメインを含み、約２ ５以下の残基を有する、ＦＣＥＬに結合可能なポリペプチド。 ３５．ヒトのものである請求項３４に記載のポリペプチド。 ３６．約１０以下の残基を有する請求項３４に記載のポリペプチド。 ３７．Ａ３５８−Ｔ３８９またはＲ３８３−Ｉ３８８ではない請求項３４に記載 のポリペプチド。 ３８．β鎖Ｄが欠失している請求項３４に記載のポリペプチド。 ３９．アミノ酸配列がＩｇＥ配列Ｉ３８２−Ｔ３８９を含む請求項３７に記載の ポリペプチド。 ４０．ＦＣＥＬ−結合ＩｇＥには結合することができるがＦＣＥＨ−結合ＩｇＥ には実質的に結合することができない抗体であって、ＭＡＥ１１、ＭＡＥ１３、 ＭＡＥ１５、ＭＡＥ１７のカバットＣＤＲドメインからの類似残基が置換された ヒトカバットＣＤＲドメインを含むことを特徴とする抗体。 ４１．該残基がＭＡＥ１１、ＭＡＥ１３またはＭＡＥ１５カバットＶＨ１ＣＤＲ ドメインからのものである請求項４０に記載の抗体。 ４２．該置換されたアミノ酸配列が、ＭＡＥ１１、ＭＡＥ１３またはＭＡＥ１５ カバットＣＤＲドメインからの約１〜約７残基からなる請求項４０に記載の抗体 。 ４３．該置換された残基が、ＭＡＥ１１、ＭＡＥ１３またはＭＡＥ１５カバット ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３、ＶＬ１、ＶＬ２およびＶＬ３ドメインからのものであ る請求項４０に記載の抗体。 ４４．カバットヒト共通抗体からの非ＣＤＲ配列を含む請求項４０に記載の抗体 。 ４５．該共通抗体が、Ｈ鎖についてカバットサブグループＩＩＩおよびＬ鎖につ いてκサブグループＩである請求項４４に記載の抗体。 ４６．ＭＡＥ１１、ＭＡＥ１３、ＭＡＥ１５またはＭＡＥ１７フレームワークま たはＶＨ−ＶＬ境界ドメインからヒト抗体の類似残基中に置換された残基を含む 請求項４０に記載の抗体。 ４７．該残基がＨ鎖フレームワークからのものである請求項４０に記載の抗体。 ４８．該残基がＶＨ７８、ＶＨ６０まだはＶＨ６１である請求項４７に記載の抗 体。 ４９．ＦＣＥＬ−結合ＩｇＥには結合することができるがＦＣＥＨ−結合ＩｇＥ には実質的に結合することができない抗体であって、ｈｕｍａｅ１１　１型、２ 型、３型、４型、５型、６型、７型、７ａ型、８型、８ａ型、８ｂ型または９型 のＨ鎖およびＬ鎖配列を含むことを特徴とする抗体。 ５０．ｈｕｍａｅ１１　９型である請求項４８に記載の抗体。 ５１．ＦＣＥＬ−結合ＩｇＥには結合することができるがＦＣＥＨ−結合ＩｇＥ には実質的に結合することができない二特異的抗体。 ５２．（ａ）ＦＣＥＬ−結合ＩｇＥに対しては一価であるがＦＣＥＨ−結合Ｉｇ Ｅには実質的に結合することができず、（ｂ）免疫グロブリンエフェクター機能 が可能で少なくとも２つのＨ鎖を含有するＦｃドメインを含む抗体。 ５３．ＦＣＥＬ−結合ＩｇＥには結合することができるがＦＣＥＨ−結合ＩｇＥ には実質的に結合することができない抗体であって、ヒト共通Ｈ鎖およびＬ鎖配 列を含むことを特徴とする抗体。 ５４．該共通Ｈ鎖がカバットサブグループＩＩＩであり、該共通Ｌ鎖がカバット κサブグループＩである請求項５２に記載の抗体。 ５５．ＦＣＥＬ−結合ＩｇＥには結合することができるがＦＣＥＨ−結合ＩｇＥ には実質的に結合することができない抗体であって、ヒトＨ鎖およびＬ鎖配列を 含み、ＩｇＥに対するＭＡＥ１１の親和性と実質的に同じかまたはそれより大き いＩｇＥ親和性を有することを特徴とする抗体。 ５６．ＩｇＥに対する親和性がＩｇＥに対するＭＡＥ１１の親和性の約０．１〜 １００倍である請求項５４に記載の抗体。 ５７．該ヒトＨ鎖またはＬ鎖配列がＭＡＥ１１、ＭＡＥ１３またはＭＡＥ１５か ら置換された配列を含む請求項５４に記載の抗体。