JPH06508639A - 新規な化合物と共役体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は新規なマレイイミド化合物とそれから製造される兵役体とに関する。

免疫化学における進歩は、分析方法と調製方法のために、無数のタンパク質−タ ンパク質又はタンパク質−ハブテン共役体の製造を必要としてきた。タンパク質 変性の概観に関しては、Ｍｅａｎｓ、　Ｇ、　Ｅ、とＦｅｅｎｅｙ、　Ｒ，Ｅ、 のＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ、、　（１９９０）　、上、２−１２及 びＭ、Ｂｒ１ｎｋｌｅｙ　のＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ、、（＋　９ 　９　２）　、　３゜２−１３を参照のこと。腫瘍局在モノクローナル抗体（イ ムノトキシン）への細胞障害性薬物の付着は、急速に受容されつつある化学療法 へのアプローチである。

Ｋｏｐｐｅｌ、Ｇ、Ａ、のＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ、、（１９９０ ）　。

１．１３−２３を参照のこと。このような共役体の調製のための多くの試薬が開 示され、広範囲に研究されている。にｉ　ｔａｇａｗａ等のＣｈｅｍ、　Ｐｈａ ｒｍ、　Ｂｕｌｌ、、２９　（４）　、＋１３０−１１３５　（＋９８１）とこ れに引用されている参考文献を参照のこと。開発されている、いわゆる架橋試薬 は典型的に、各反応物質に含まれる官能基に対して特異的反応性を有するように 設計されている。ホモ三官能性試薬とへテロ三官能性試薬の両方が公知であり、 後者が最も望ましい。ヘテロ三官能性架橋剤は２つの選択的反応基を有し、これ らの基をタンパク質又は他の部分（ｍｏｉｅｔｙ）の段階的かつ特異的な方法で の結合に用いることができるので、例えばホモタンパク質ポリマーの形成のよう な好ましくない副反応の発生が好ましく避けられる。

通常の種類のへテロ三官能性架橋剤はスペーサー基によって結合したアミン反応 基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）とスルフヒドリル反応基 （例えば、マレイイミド、ハロアセチル官能基及び反応性ジスルフィド）とを含 む。しかし、ハブテン及び／又はペプチドが例えばε−アミノ酸−リソン残基の ような通常の官能基の１つを含まず、このような物質のタンパク質への結合がい っそう困難になる場合がある。慣習的な架橋剤はこの目的のために不適切である 。１つのアプローチは物質を化学的に改質することであるか、この方法は化合物 の好ましい生物学的又は化学的挙動をしばしば変化させるので、あらゆる場合に 満足できる方法であるとは限らない。問題の化合物は結合可能なアミノ基を有さ ないが、ヒドロキシル基を含むことができる。このような化合物に対しては公知 の架橋性物質を用いることができるか、生ずるエステル結合誘導体は典型的に、 エステル部分に固存の安定性制限という欠点を有する。例えばトとアルコール基 とからのウレタン結合の形成におけるように、より安定なヒドロキシル結合を典 型的に形成する架橋化学が常に好ましい。例えばＬｙｎｎ、に、Ｒ１等のＬＰｈ ｙｓ、　Ｃｈｅｍ、、　１９７２．　６２．　６８７及びＡｄａｍｓ、　Ｒ９等 のＣｈｅｍ、　Ｒｅｖ、、ｌ　９６５．　６５．　５６７を参照のこと。

従って、最新技術の状況として、これらの機能を果たす新規な物質が相変わらず 要求されている。

それ故、新規なヘテロ三官能性化合物を提供することが、本発明の目的である。

アルコール基又はアミン基を存する化合物を、チオール基を有する化合物と結合 させることができるヘテロ三官能性化合物を提供することが、本発明のもう一つ の目的である。

他の目的は、末端イソシアネート基と末端マレイイミト基とを有するヘテロ三官 能性化合物を提供することである。

発明の概要 上記その他の目的と利点は、本発明によって、イソシアネート基とマレイイミト 基との両方を含む新規な化合物を提供することによって達せられる。これらの化 合物は式： ［式中、Ｘはスペーサー基である］ によって表される。イソシアネート基は、アミンと反応して尿素を形成し、アル コールと反応してウレタン（カルバメート）を形成する、高度に反応性の、立体 障害を有さない官能基である。マレイイミド基はチオール（スルフヒドリル、Ｒ −Ｓ　Ｈ）基に対して反応性である。従って、これらの化合物を用いて、チオー ル基を含む化合物、例えば酵素をアルコール基及び／又はアミン基を含む化合物 と結合させることができる。

スペーサー基、Ｘ、は幾つかの機能を果たす。スペーサー基の１つの重要な機能 は立体障害に対するその効果である。最小の立体的相互作用を有するタンパク質 部分及び／又はハブテン部分の間の線状架橋は所望の免疫反応性を維持するため の必要条件でありうる。スペーサー基、Ｘ、は好ましくは炭素数１〜６のアルキ ル、例えばノクロヘキシルのような飽和炭素環式部分又は例えばフェニルもしく はナフチルのような芳香族炭素環式部分であることかできる。飽和炭素環式部分 と芳香族炭素環式部分とは炭素数１〜６のアルキル基１個又は２個によって置換 されることができ、この基を通してイソシアネート及び／又はマレイイミドへの 付着がなされる。Ｘが飽和炭素環式部分である場合には、１個のメチル基を含み 、このメチル置換基を介してマレイイミド基を取り付けることが好ましい。

この場合に、飽和炭素環式部分と芳香族炭素環式部分との環を例えばジメチルア ミノ、メトキシ、エトキシ、メチル、エチル、スルホンアミド、スルホン酸等の ような置換基によって置換することかできることに留意すべきである。

本発明によって提供される共役体は式：［式中、Ｒはアルコール基及び／又はア ミン基を含む化合物の残基てあり：ＲＩはスルフヒドリル基を含む化合物の残基 てあり；Ｘは以前に定義した通りである］によって表される。Ｒによって表され る部分を酸素又（よ窒素原子を介してカルボニル基に結合することができ、Ｒ１ によって表される部分を硫黄原子を介してマレイイミド基に結合することかでき ることは、当業者（こ明ら力為であろう。

一般に、Ｒ部分は抗原（］）ブブチを含む）、合成もしくは組換え体ペプチド配 列、ステロイド等の残基であることかできる。Ｒ１は例えば抗体、酵素等のよう なチオール基含有化合物の残基であることができる。以下で詳述するような、好 ましい実施態様では、免疫検定法に用いるための、例えば酵素標識抗原（７Ｎブ テンを含む）、酵素標識ペプチドもしくはポリペプチド等のような酵素標識部分 と、固体サポート物質に結合する抗体とか形成図面は本発明によるヘテロ三官能 性中間体のマレイイミド誘導体の相対的安定性を、ｐＩ（の関数として、幾つか の公知の化合物に比較するグラフ式図である。

好ましい実施態様の説明 本発明のへテロ三官能性化合物の製造法は、ここに提供する一般的な開示と特定 の実施例によると共に合成調製方法についての当業者の一般的知識から当業者に 明らかてあろう。一般に、これらのへテロ三官能性架橋化合物の製造は対応アシ ルアジドのＣｕｒｔｉｕｓ転位を含む。出発マレイイミド酸化合物は文献に述べ られた方法によって製造することができる。芳香族マレイイミドカルポン酸の製 造に関しては、Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ等のＥｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

ｌｏｔ　（１９７９）、３９５−３９９を参照のこと；脂肪族マレイイミトカル ポン酸の製造に関しては、Ｋｅｌｌｅｒ等のＪ、　Ｈｅ１ｖ、　Ｃｈｅｍ、　Ａ ｃｔａ、　５８　（１９７５）　５３１を参照のこと。このようにして製造した マレイイミＦカルボン酸化合物を１当量のトリエチルアミン（ＴＥＡ）によって 処理し、次にトルエン中の１当量のジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）に よって処理する。還流加熱は関与するアシルアジドの転位を開始させ、次式に従 ってイソシアネートを生ずる： 酸をイソシアネート基に転化させる他の方法は文献に公知である。Ｂａｎｔｈｒ ｏｐｅによるＰａｔａｉにおける“アジド基の化学３９７−４０５頁、Ｉｎｔｅ ｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂ、、ニューヨーク＋９７１と；　Ｓｍ１ｔｈによる。

　Ｏｒｇ、　Ｒｅａｃｔ、３３３７−４４９頁（１９７９）参照のこと。

前述したように、本発明による共役体（式■）は広範囲な物質を含む。−Ｒ部分 はアルコール基及び／又はアミノ基を含む化合物の残基である。本来存在するア ルコール基又はアミン基を含む化合物を用いることが好ましい場合には、化合物 を１個以上のこのような基を含むように誘導体化することができる。化合物中に アルコール基又はアミン基を導入する方法は技術上周知である。

”Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａ旧ｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”第２版、Ｊ、　Ｍａ ｒｃｈ　（１９７７）　、　ＭｃＧｒａｗ　Ｈｉｌｌ、Ｉｎｃ、、ニューヨーク を参照のこと。

本発明のへテロ三官能性化合物におけるイソシアネール基又はアミン基を含む化 合物は、この共役体に配合することができる。このような化合物を下記に挙げる ：例えば、ＨＩＶ−１ウイルスのトランスメンブラン糖タンパク質（ＧＰ４１） から誘導される合成ペプチド又はＨＩＶ−２ウイルスの糖タンパク質４２から誘 導されるペプチドのような、セリン基を含む天然、組換え体もしくは合成のペプ チドもしくはポリペプチド；例えば葉酸、ビタミンＢａｔ、ジゴキシン、ジギタ リスグリコシド、例えばバンコマイシンのような抗生物質、例えばアミカシンの ようなアミノグリコシド、メトトレキセート、カルバマゼピン等のような、種々 な天然もしくは合成の生物学的に活性な物質、又は例えばセオフイリン、フェニ トイン、フエノバルビタール等のような治療薬： 例えば３，５．５’　−トリョードチロニン（Ｔ３）、３．５．３°、５°−テ トラヨードチロニン（Ｔ４）、コルチゾール、エストラジオール等のようなホル モン：及び 例えばコレステロールのようなステロイド。

チオール基含有化合物は、本発明のへテロ三官能性化合物におけるマレイイミド 基と反応して安定な共有二重結合を形成するいずれの化合物でもよい。このよう な化合物を下記に挙げる： チオール基を含む、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼのような酵素、又はチオー ル基を導入することができる、例えばペルオキシダーゼ、グルコースオキシダー ゼ及びアルカリホスファターゼのような酵素。酵素へのチオール基の導入は、” Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉ ｃｓ“、９６巻、６０５−６１２頁（１９６２）に述べられているように実施す ることができる：公知方法によってチオール基に還元することがてきるジスルフ ィド結合を含む、Ｆ（ａｂ”）２フラグメントを含めた、例えば抗生物質のよう な化合物。例えば、Ｃ１ｅｌａｎｄ、　Ｗ、　Ｗ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ、１９６４．　３．　４８０−４８２を参照のこと。この化合物群は例えばあ らゆる免疫グロブリンのようなタンパク質、例えばインシュリンもしくはヒトの コリオゴナドトロピン（ＨＣＧ）のようなポリペプチド並びに内部ジスリフイド 結合を含む合成ペプチドをも含む。

さらに、チオール基を生物学的活性物質に導入するための周知の方法が存在する 。例えばＢｌａｔｔｅｒ、　Ｗ、　Ａ、等のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９ ８５．２４．１５１７−１５２４を参照のこと。

ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、その触媒効果を考えて、イソノアネート 反応のために好ましい溶媒であると判明している。一般に、アルコール基及び／ 又はアミン基含有化合物をＤＭＳＯ中の１当量のへテロ三官能性化合物と一緒に し、乾燥窒素下、室温において、薄晋クロマトグラフィー分析によって生成物の 転化が確認されるまで、撹拌する。不純物として水が存在する場合には又は水和 試薬として存在する場合には、残留水を最初に消耗するために過剰な試薬を加え て、所望の生成物への転化を完成させることがてきる。最終生成物は一般に、逆 相又は正常相シリカ上でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。マ レイイミド部分と反応する溶媒、すなわち水酸化アンモニウム又は他のアミン含 有溶媒の使用は避けるへきである。実施例で詳述するような、モデル化合物によ って実施した試験は、生ずるマレイイミト部分の安定性かｐ　Ｈ＞　７では低下 することを示した。しかし、マレイイミドは弱酸性から中性の条件（ｐＨ６，５ −７，５）下では容易にスルフヒドリル基と特異的に反応する。誘導体化物質は 使用直前に適当な緩衝液中に、存意な分解を示すことなく、溶解することかでき る。水溶性が一つの要素である場合には、この誘導体化物質を例えばジメチルホ ルムアミドのような溶剤の少量に導入することかできる。

本発明の好ましい実施態様では、抗原に結合した酵素の共役体を提供する。この ような共役体は例えば血液、血漿又は血清のような流体中の分析物又は代謝産物 を測定するための周知の酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）に有用である。これ らの方法には競合ＥＬＩＳＡ方法とサンドイッチＥＬＩＳＡ方法との両方がある 。これらの免疫検定方法は米国特許第３，６５４，０９０号と第３゜８５０．７ ５２号とに述へられている。このような共役体中の酵素対抗原又は酵素の割合は 特定の酵素、抗原又は抗体に依存して、特に一方の反応物質中のアルコール基又 はアミン基の数と他方の反応物質中のチオール基の数とに依存して、変化しうる 。好ましくは、このような酵素結合抗体もしくは抗原共役体は酵素１モルにつき 抗原もしくは抗体３〜７モルを含む。

もう一つの好ましい実施態様では、アルコール基又はアミン基を含む固体サポー ト物質に結合した、例えば抗体又は酵素のような、タンパク質の共役体を提供す る。

このような固体サポートはへテロ三官能性化合物のイソシアネート基と結合して 安定な共有結合を形成することができるものであれば如何なるものでもよい。或 いは、タンパク質がイソシアネート基を介して結合し、生じた中間体かチオール 化固体サポート物質と反応する。この固相物質は例えばデキストラン、糖等のよ うな大きい分子、ミクロ粒子、ヒース、ソート、球体、例えば化学的に改質した ガラス繊維のような繊維状物質、フィルター等の形状であることかてきる。この 固相物質はポリスチレンアミン化粒子、アミノシリカゲル、部分的加水分解ナイ ロン、部分的還元ボリアリールアミド、部分的還元シアノアクリレート等であり うる。

もう一つの好ましい実施態様では、本発明のへテロ三官能性化合物を用いてビオ チニル化共役体を製造することができる。これは例えばビタミンＢ１２のような 化合物を、本発明によって、ＰＭＢ　Ｉと最初に反応させ、続いてこの生成物を アミノエタンチオールと反応させて、末端アミン基を存する共役体を形成するこ とができる。次に、兵役体を商業的に入手可能なビオチン−ＮＨ３誘導体と反応 させて、ビオチニル化誘導体を形成することが次に、本発明を実施例によって特 に好ましい実施態様に関連してさらに説明するが、これらの実施例は説明のみを 意図するものであり、本発明がこれらの実施例中に述べる物質、方法等に限定さ れないことは理解されよう。

実施例Ｉ Ｌユｙレイイミドベンゼンイソシアネート（ＰＭＢ　Ｉ）の製造 ４−アミノ安息香酸（４，２６ｇ／３１ｍｍｏｌ）をアセトン３０ｍ１中に懸濁 させ、メタノール５ｍｌの添加によって可溶化させる。アセトン１０ｍ１中の無 水マレイン酸（３、６６ｇ／　３７ｍｍｏｌ）の溶液を滴加し、生ずる沈殿を２ ０分間撹拌し、次に吸引濾過し、アセトンで洗浄し、真空乾燥させて、黄色粉末 ６．３６ｇを得た。この粉末を無水酢酸（１３ｍｌ）中に溶解し、酢酸ナトリウ ム（１゜０８ｇ）によって処理し、次に撹拌しながら、５０℃に２時間加熱した 。揮発性物質を真空下で除去し、残渣を水１５０ｍ１中に入れ、７０°Ｃに２． ５時間加熱した。生じた白色沈殿を吸引濾過し、水で洗浄し、真空下で一晩乾燥 させて、４−マレイイミド安息香酸４．７ｇ（７０９６収率）を得た。ＵＶ吸収 とヨウ素蒸気染色とによって可視化したシリカＴＬＣ（塩化メチレン９１０％メ タノール）による分析は、ＲｆＯ，８に１スポツトを示した。

構造はＮＭＲスペクトロスコピーによって確認された。

トルエン１５０ｍ１中の前記生成物（４，３ｇ／２０ｍｍｏ　Ｉ　）の撹拌懸濁 液をトリエチルアミン（３，０４ｍ１／２２ｍｍｏｌ）によって処理し、その直 後にジフェニルホスホリルアジド（４、７ｍｌ／　２２　ｍｍｏｌ）によって処 理した。

室温において２日間撹拌した後に、揮発性物質を真空下て除去し、生ずる残渣を 溶離剤として塩化メチレンを用いてシリカゲル上でクロマトグラフィー処理した 。生成物の４−マレイイミトアジドは淡黄色結晶質体（３，９ｇ　；　９１Ｃ１ ６収率）として溶離された。塩化メチレンから再結晶されたサンプルは融点測定 装置において下記挙動を示した：１１５〜１２０℃では、サンプルは“ポンとは しける（ｐｏｐ）”ように見え；Ｉ２５〜＋３０°Ｃては、サンプルは激しくガ スを発生して分解した。この化合物の構造はＮＭＲとＩＲスペクトロスコピーに よって確認された。

乾燥トルエン１５０ｍ１中のアジド（３，４ｇ／１４ｍｍｏ　ｌ　）の溶液を窒 素下で８０分間還流させ、真空下で蒸発させた。これによって、式： で示されるｐ−マレイイミドベンゼンイソシアネート（ＰＭＢＩ）３ｇが黄色ミ クロ針状結晶として得られた。

この生成物の構造はＮＭＲと１Ｒスペクトロスコピーによって確認された。ｍ、 ｐ、＝１２１〜１２３℃（Ｃ）Ｉｔ　Ｃ１，）。

／１けンブル（３８ｍｇ）を塩化メチレン１ｍｌ中に溶解し、過剰なメタノール （０，１５ｍ１）によって処理した。１時間後に、揮発性物質を真空下で除去し 、メチルＮ−（ｐ−マレイイミドフェニル）カルノくメート、化合物２を得た。

生成物の構造はＮＭＲ，ＭＳ及びＴＪＶ／Ｖ　Ｉ　Ｓスペクトロスコピーによっ て確認された。

ＤＭＳ　Ｏ（４ｍｌ）中のＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、からのＮ−Ｃ ＢＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−３ｅｒ　（２１８＋ｎｇ１０．６２ｍｍｏｌ）の溶液を ＰＭＢ　Ｔ　（２６４ｍｇ／　１．　２３ｍｍｏｌ）　４ニーよって処理し、生 じた黄色溶液を室温において２とｌ／４時間撹拌した。反応混合物を水１４ｍ１ によって反応停止させ（水浴で冷却）、０〜５°Ｃにおいて１０分間撹拌し、吸 引濾過し、過剰な水によって洗浄し、真空下で乾燥させた。生ずる残渣を酢酸− メタノールー塩化メチレン（１：１０：８９）を用いてシリカ上でクロマトグラ フィー処理して、式： によって表される純粋な生成物を得た。

化合物の構造はＮＭＲとＭＳスペクトロスコピーによって確認された。

実施例■て製造した活性化ペプチド（化合物３）のマレイイミド部分の安定性を 調べたところ、３種類の同様によって開示された、０−ｌｍ−及びｐ−マレイイ ミド安息香酸−ＮＨＳエステル（それぞれ、０ＭＢ５．ＭＭＢＳ及びＰＭＢＳ） の安定性に匹敵することが判明した。

この試験では、活性化ペプチド（２）の１０ｍＭ溶液の２０μｍアリコートを０ ．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６゜７又は８）又は０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐ Ｈ５）Ｏ。

５ｍｌ中で３０°Ｃにおいて３０分間インキュベートした（２通りに）。続いて 、０．０５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ６）中の１ｍＭメルカプトエタノール２００ μｌを加え、１〜２分間充分に混合してがら、０，０２ＭＥＤＴＡ−Ｎａ４を含 む０．２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，２）１．１ｍｌによって処理し 、次にメタノールジニトロ安息香酸０．２ｍｌを加えた。１ｏ分間後に、各試験 サンプル、すなわち（Ａ）零ブランク；（Ｂ）インキュベートせず；及び（ｃ） サンプルブランク［サンプル溶液の代わりにＤＭＦ２０１１１中、３０”Ｃにお いて３０分間インキュベート］の４１２ｎｍにおける吸光度値を得た。マレイイ ミド残渣の分解％を［（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）］　ｘｌｏＯとして算出した。結 果は表１と図に示す。図１ｔＯＭＢＳ、ＭＭＢＳ及びＰＭＢＳ（それぞれ、０− ｌｍ−及びｐ−マレイイミド安息香酸ＮＨＳエステル）の比較データをも含む。

ＤＭＳＯ０，５ｍｌ中のジアノコバラミン（５４ｍｇｌｏ　、０４　ｍｍｏｌ） の溶液をＰＭＢ　Ｉ　（９７，３ｍｇ１０．４５ｍｍｏｌ）によって処理し、生 ずる赤色溶液をアルゴン下、室温において、遮光して、−晩撹拌した。混合物を エーテル１０ｍ１で処理し、激しく撹拌して、ＤＭＳＯを抽出した。赤色油状物 から液体をデカントし、再びエーテル（１０ｍｌ）と共に撹拌した。液体をデカ ントした後に、残留赤色油状物に塩化メチレンを加えて磨砕して、赤色粉末を得 、これを吸引濾過し、過剰な塩化メチレンで洗浄し、真空下で乾燥させた。この 生成物を溶離剤としてメタノール−水混合物（２：　３）を用いて、Ｃ−１８シ リカ上でのフラッソユクロマトグラフィーによって精製した。赤色帯として溶離 した生成物を真空下で溶媒を蒸発させて単離させ、活性化ビタミンＢ＋２誘導体 （４１ｍｇ：６６％収率）を得た。生成物の構造はＮＭＲ，ＭＳ及びＵＶ／Ｖ　 Ｉ　Ｓスペクトロスコピーによって確認された。

アルカリホスファターゼ（１ｍｇ／　７　、　１　ｍｍｏｌ）をトリス生理食塩 水マグネシウム亜鉛（ＴＳＭＺ）緩衝液（ｐＨ７，３）１ｍｌ中てＴＳＥ／Ｎａ ＯＨ溶液（トリエタノールアミン、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウムの各１０ ０ｍＭとエチレンジアミン四酢酸１ｍＭとを含む溶液５０μＩ）中の２−イミノ チオラン・ＨＣＩによって処理し、室温において２０分間インキュベートするこ とによってチオール化した。ＩＭグリシン１０μｍによる処理後に、ＰＤ−１０ カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５Ｍ）を用い、ＴＳＭＺ緩衝液（ｐＨ７， ３）によって溶離して、過剰な試薬を除去した。誘導体化アルカリホスファター ゼを含むフラクション（Ｔ’ＮＢＳ試薬を用いた遊離チオール基の分析はアルカ リホスファターゼ１分子につき４〜７個のチオール基を示した）をプールしく２ ８０ｎｍにおいて吸光度読取り値）、次に直ちに誘導体化ビタミンＢ、　（２１ ３ｎｍｏｌ）によって処理した。この溶液を室温において１時間保存し、次に１ ０″Ｃにおいて一晩貯蔵した。溶離剤としてＴＳＭＺ緩衝液（ｐＨ７，３）を用 いるＰＤ−１０カラムでのゲル濾過は過剰な誘導体化ビタミン８１２試薬からア ルカリホスファターゼ−ビタミンＢ１２共役体を分離した。生ずる共役体の５５ ０．５２０．３６１及び２８０ｎｍにおける吸光度に関するスペクトル分析は約 ９１の算出Ｂ１２タンパク質比を生じた。

１０９６水／９０％メタノール０．５ｍｌ中のマレイイミド活性化ビタミンＢ＋ ｚ　（３，８８ｍｇ／　０．　００２４７ｍｍｏ　Ｉ　）の撹拌溶液に、水中２ −アミノエタンチオール塩酸塩（０，００２７２Ｈｏｌ）のＩｍｇ／ｍｌ溶液０ ．３１ｍ１を加えた。生した混合物を室温において３・０分間撹拌した。この時 点において、逆相ＴＬＣはＲｆ−０，１（溶離剤として１０９６水／　９０９６ メタノールを用いるＣ−１８シリカ）に１種の新規な生成物の形成を示した。

Ｂ、Ｌ、Ｃ，ビオチン−ビタミンＢ　Ｉ２誘導体の製造上記で得られた、この撹 拌反応生成物に、ＮＨ３−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏ、から）３ｍｇとｐＨ８ホウ酸塩緩衝液０．５ｍｌとを加えた。撹拌を一晩続 けた後に、粗反応混合物を予め６０％水／４０％メタノールと平衡させたＣ−１ ８カラムに加えることによって逆相シリカ上で精製した。このカラムを溶出させ て、２つの淡赤色帯を除去して、生成物を４０％水／６０％メタノールによって 取り出した（この溶離剤によりＣ−１８ＴＬＣカラム上てＲｆ〜０．３）。プー ルした生成物フラクションの蒸発は赤色固体としての精製ビタミンＢａｔ−Ｌ、 Ｃ，−ビオチン化合物を生じた（３８％収率）。

水中でのＵＶ／Ｖｉｓスペクトルは３６１ｎｍ、　５１６ｎｍ及び５４９ｎｍに おける３主要帯を生した。

ＤＭＳＯ０，５ｍｌに溶解したＨＩＶ−２特異的ペプチド０．５ｍｇの溶液に、 ３５倍モル過剰な固体ＰＭＢ　Ｉを加えた。この混合物を室温において１時間イ ンキュベートし、次に脱イオン水０．５ｍｌを加えることによって反応を停止さ せた。活性化ペプチドを１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ５０と平衡させた１、５ｘｌＳｃｍ カラムＢｉｏＧｅｌ　Ｐ　２上てのゲル濾過クロマトグラフィーによって精製し た。

ペプチド含有フラクションをプールし、４℃において貯蔵した。

チオール化アルカリホスファターゼは、この酵素１ｍｇを１００ｍＭの２−イミ ノチオラン−ＨＣｌの１／２０希釈物と共に室温において２０分間インキュベー トすることによって製造した。活性化酵素をＴＳＭＺ　ｐＨ７゜３緩衝液と平衡 したＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ　Ｄ　−１０カラム上でのクロマトグラフィーによ って過剰な試薬から分離した。

活性化酵素を７倍過剰なペプチドとｐＨ７，０において反応させた。混合物のｐ Ｈをトリエタノールアミンの１０９６溶液によって調節した。１８時間後に反応 をマレイイミドによって停止させ、ＴＳＭＺ　ｐＨ７，３緩衝液と平衡した５ｅ ｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−７５の１．５Ｘ１５ｃ［１１カラム上で精製した。

実施例■ 患者の血清サンプル中のＨＩＶ抗体の分析を、実施例■に述へた酵素共役ペプチ ドを用いて、下記方法によって実施した。

プロティンＡとプロティンＧ（プロティンＡ／ＧはＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅ＋ｎ１ ｃａｌ　Ｃｏ、から入手可能）の結合ドメインを組み込む融合タンパク質をその 上に固定した約１　ｃｍ”、０．４２ｍｍ厚さ孔質ガラス繊維メツシュパッド（ Ｗｈａｔ＋ｎａｎ　Ｇ　Ｆ　／　Ｆ　）を含む分析モジュールを調製した。

全体で１０μＩのサンプルを本発明の酵素共役ペプチド１９０μｌの溶液に加え 、５０ｍＭトリス［ヒドロキシメチル］−アミノメタン、（ＴＲＩＳ）Ｐｈ７． ６．１５０ｍＭ　ＮａＣｌ５１ｍＭ　ＭｇＣＩｚ、０．１ｍＭＺｎＣＬ　、０． 　１９６Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ　ｌ　００．１％ゼラチン及び＋　９６　Ｂ　Ｓ　Ａ から成る緩衝液中で所望の濃度に希釈した。反Ｌζ混合物を３７°Ｃにおいて６ 分間インキュベートした。

続いて、サンプル／標識共役体温合物１５μｍを繊維状パッドに加え、このモジ ュールを３７°Ｃにおいて６分間インキュベートし、その後に１ｍＭメチルウン ベリフェリルホスフェートとＩ　Ｍジェタノールアミンとから成り、０、Ｉ　９ ６　Ｔｒｉｔｏｎ　ｘ　ｌ　００を含む基質／洗浄溶液７５μＩをモジュールの 洗浄ボートを通して繊維状パッドの１端部に加えた。基質／洗浄溶液を繊維状パ ッドに侵入させ、毛管作用によってパッド全体に伝播させ、それによってサンプ ル領域を洗浄した。次にモジュールを３７°Ｃにおいて４分間インキュベートし た。

３分間にわたって一定の間隔を置いて、正面蛍光計を用いて３６０ｎｍ光線（ｒ ａｄｉａｔｉｏｎ　）を反応帯の下方の分析モノニールの開口に通し、反射した ４５００ｍ光線を回収することによって反応帯の読取り値を得た。サンプル中の ペプチド特異的抗体が結合した酵素標識共役体量の関数である蛍光の増加を算出 した。得られた結果を一定の陰性及び陽性のギヤリプレーターによって得られた 結果と比較し、所定カットオフ値を基準にして、陽性であるか陰性であるかを決 定した。

アルカリホスファターゼ標識ペプチドは、試験した全ての６種のＨＩＶ２陽性血 清と全ての３０種のＨＩＶ陰性血清を確認した。

ＤＭＳＯ（２ｍｌ）中の１１α−ヒドロキシプロゲステロン（９４ｍｇ１０．　 ２８ｍｍｏｌ）の溶液をＰＭＢＩ（９４ｍｇ／　０　、　４３　ｍｍｏｌ）によ って処理し、生ずる混合物を室温において一晩撹拌した。冷却しながら、水１０ ｍ１を加えて、生成物を沈殿させた後に、吸引濾過し、−晩風乾させた。溶離剤 として塩化メチレン中２％メタノールを用いて、シリカゲル上でのクロマトグラ フィーによって生成物を精製した。主要な最高Ｒｆ物質を単離し、ＩＩα−マレ イイミド誘導体化プロゲステロン９０ｍｇ（５８９６収率）を得た。

誘導体化プロゲステロンを実施例■に述べた方法に従ってチオール化アルカリホ スファターゼと反応させて、プロゲステロン−アルカリホスファターゼ共役体を 形成した。

Ｃ，プロゲステロン分析のための標準曲線の作成既知プロゲステロン濃度を有す る標準溶液を用いて実施する競合プロゲステロン分析に、プロゲステロン−アル カリホスファターゼ共役体を用いた。この分析は実施例■に述べた種類の分析モ ジュールを用いて実施した。

繊維状固体キャリヤーに固定させたプロゲステロンモノクローナル抗体（２５ｍ ｇ／ｍｌ溶液３５μｍ）を捕捉物質として用いた。最初に、この標準溶液を繊維 状固体キャリヤーに塗布してから、インキュベーション期間を実施した。次に、 兵役体溶液を反応帯に塗布し、インキュベーション期間後に、繊維状固体マトリ ックスの末端部分に基質洗浄溶液を塗布した。問題の濃度範囲に好ましい急激な 勾配を有する標準曲線が得られた。

ＤＭＳＯ１ｍｌ中のβ−エストラジオール（３５ｍｇｌｏ、Ｉ　３ｍｍｏｌ）の 溶液をＰＭＢ　Ｉ　（２８ｍｇ／　０．　１３ｍｍｏ　ｌ　）と一度に反応させ た。生じた黄色溶液を、遮光しながら、アルゴン下、室温において一晩撹拌した 。過剰な水を加えて、粗生成物を沈殿させ、吸引濾過し、水で洗浄し、真空下で 乾燥させた。残渣を溶離剤として塩化メチレン中１９３メタノールを用いて、シ リカ上でクロマトグラフィー処理し、１７βマレイイミド活性化β−エストラジ オール生成物２１ｍｇ（３３％Ｓ収率）を得た。

誘導体化エストラジオールを実施例■に述べた反応機構に従ってアルカリホスフ ァターゼと反応させた。

ＤＭＳｏ　２ｍｌ中のし一チロキシン、ナトリウム塩６水和物（１９６，４ｍｇ １０．　２２１ｍｍｏりの溶液を室温においてＰＭＢ　Ｉ　（４７，３ｍｇ／　 ０．　２２１ｍｍｏｌ）によって一度に反応させた。生じた黄色溶液をアルゴン 下、室温において、遮光しながら、−晩撹拌した。次に、この溶液を過剰なエー テル中に注入して、黄色油状物を形成し、これを沈降させた後に、エーテルをデ カントした。

新しいエーテルと共に１０分間撹拌した後に、エーテルを再びデカントし、油状 物を無水メタノール２０ｍ１中に溶解した。ＩＮ　ＨＣＩを滴加して、沈殿を生 じさせ、これを吸引濾過し、過剰なＩＮ　ＨＣＩによって洗浄し、真空乾燥させ た。塩化メチレンを加えて磨砕して、淡黄色粉末としてＮ−マレイイミド活性化 Ｌ−チロキシン２１０ｍｇ（９６％収率）を得た。

誘導体化し一チロキシンを実施例■に述べた反応機構に従ってアルカリホスファ ターゼと反応させた。

ＤＭＳＯ１ｍｌ中のジゴキシゲニン（５３ｍｇ１０．　１３６ｍｍｏｌ）の溶液 をＰＭＢ　Ｉ　（２９ｍｇ１０．　Ｉ　３６ｍｍｏｌ）によって処理し、生じた 黄色溶液をアルゴン下、室温において、遮光しながら、４時間撹拌した。水（６ ｍｌ）を滴加して、沈殿を生じさせ、これを吸引濾過し、過剰な水によって洗浄 し、真空乾燥させた。粗残渣を溶離剤として塩化メチレン９３％メタノールを用 いて、シリカ上でクロマトグラフィー処理した。３β−マレイイミド活性化ジゴ キシゲニン生成物が２不純物帯後に淡黄色帯として溶出した。

誘導体化ジゴキシゲニンを実施例■に述べた反応機構に従ってアルカリホスファ ターゼと反応させた。

Ｃ，ジゴキソン分析のための標準曲線の作成既知ジゴキシン濃度を有する標準溶 液を用いて実施する競合ジゴキシン分析に、ジゴキシゲニシーアルカリホスファ ターゼ共役体を用いた。この分析は実施例■に述べた種類の分析モジュールを用 いて実施した。繊維状固体キャリヤーに固定させたマウス抗ジゴキシンモノクロ ーナル抗体を捕捉物質として用いた。用いた分析方法は実施例■に述べた方法と 同じであった。治療濃度範囲に好ましい急激な勾配を有する標準曲線が得られた 。

ＤＭＦ　（５ｍｌ）中のＮ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−グルタミン酸α−ベンジルエステ ル（０，５１ｇ／　１．　５０ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０，２３ｍｌ／ 　１．　６５ｍｍｏｌ）との溶液をアルゴン下で一４０℃に冷却し、次にジフェ ニルホスホリルアジド（０，３６ｍｌ／　１．　６５ｍｍｏｌ）によって一度に 処理した。浴を２０分間にわたって一５°Ｃに徐々に温度上昇させた。−４０℃ に再冷却した後に、３−アミノ−１−プロパツール（０、１３ｍｌ／１．６５　 ｍｍｏｌ）を一度に加え、浴を徐々に室温に一晩で温度上昇させた。

揮発物を真空下で除去し、粗残渣を溶離剤として塩化メチレン中１０９６メタノ ールを用いて、シリカ上でクロマトグラフィー処理した。生成物は痕跡量の出発 グルタミン酸の直後に溶出し、適当なフラクションを蒸発させると、Ｎ−ｔ−Ｂ ＯＣ−Ｌ−グルタミン酸α−ベンジルエステルのヒドロキシプロピルアミドが透 明なシロップとして得られた（０．５ｇ／８５％収率）。

上記で得られたヒドロキシプロピルアミド（０，４４ｇ／　１　、　１３　ｍｍ ｏｌ）を水冷塩化メチレン（５ｍｌ）中に溶解し、アニソール（０，１２ｍｌ／ 　１．　１３ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（０，５７ｍｌ／７．　４ｍｍｏｌ ）とによって処理した。浴を徐々に室温に温度上昇させ、４時間撹拌した。揮発 性物質を真空下で除去し、残渣を溶離剤としてメタノール−濃水酸化アンモニウ ム−塩化メチレン（ｌＯｗｌ：８９）を用いてシリカ上でクロマトグラフィー処 理した。生成物は主要帯として溶出し、適当なフラクションを蒸発させると、Ｌ −グルタミン酸誘導体のトリフルオロ酢酸塩（０゜２１７ｇ／６５％収率）か無 色油状物（フリーザー中で結晶化）として得られた。

ＤＭＦ（１ｍｌ）中のＮ”−（）リフルオロアセチル）ブチロイン酸（４４ｍｇ ／　Ｏ，Ｉ　Ｏｍｍｏｌ）の懸濁液をアルゴン下で一１Ｏ°Ｃに冷却した。これ に、チェニルアミン（０，０１６ｍｌ／　０．　Ｉ　１２ｍｍｏｌ）と上記で得 られたトリフルオロ酢酸塩（３０ｍｇ／　０　、　１　Ｏｍｍｏｌ）とを加えた 。

５分間後に、混合物をさらに一３５°Ｃに冷却し、ジフェニルホスホリルアジド （０、０２４１１１１１０，１１２ｍｍｏｌ）を一度に加えた。浴を徐々に室温 に温度上昇させ、−晩撹拌した。揮発性物質を真空下で除去して、コハク色油状 物を得、これに過剰なアセトニトリルを加えて５〜ｌＯ分間磨砕し、吸引濾過し 、洗浄し、乾燥させて、黄褐色粉末：５９ｍｇ（８５９６収率）を得た。この物 質はさらに精製せずに用いた。

前記生成物（５４ｍｇ１０．　０８　Ｏｍｍｏｌ）を５０１５０工タノール／水 溶液４ｍｌ中に懸濁させ、アルゴン下で数分間パージした。この撹拌混合物に、 アルゴン下、室温においてＩＮ　Ｎａ０Ｈ（０，２４ｍ１１０．２４ｍｍｏｌ） を加え、生じた黄色溶液を、遮光しながら、３時間撹拌した。この溶液をＯ，Ｉ Ｎ　ＨＣＩ　（２，４ｍ１）の滴加によって処理し、黄色ゼラチン状を得、これ を遠心分離によって単離した。水洗浄／遠心分離の１回サイクル後に、残渣をメ タノール中に入れ、蒸発乾固させた。粗残渣をイソプロパノ−ルー濃水酸化アン モニウム−水（７：１：２）約１ｍｌ中に溶解し、溶離剤として塩化メチレン− メタノール−濃水酸化アンモニウム（６５：３５：１０）を用いてシリカ上でク ロマトグラフィー処理した。

痕跡量の不純物帯後に生成物が黄色帯として溶出した。

生成物を含むフラクションをプールし、真空下で蒸発させて、黄色残渣を得た。

この残渣をＩＮ　ＨＣＩ４ｍｌ中に溶解し、蒸発乾固させて、黄褐色固体として 塩酸塩３４ｍｇを得た。

Ｂ、ヒドロキシル含有葉酸誘導体の活性化この塩酸塩（３４ｍｇ：数モルの水を 含む可能性あり）をＤＭＳＯ（２ｍｌ）中に溶解し、薄層クロマトグラフィーが 残留未反応出発物質を殆ど又は全く示さなくなるまで［シリカＴＬＣ１溶離剤と してｎ−ブタノール：酢酸エチル・酢酸：水（１：１：１：ｌ）を使用］、室温 において数日間にわたってＰＭＢＩ（約２０当量）によって処理した。エーテル による反復処理と好ましくない有機物質の抽出とによって生成物を混合物から単 離して、黄色ガム状残渣を得た。この残渣に塩化メチレンを加えて磨砕し、次に 熱アセトニトリルを加えて磨砕した（数上記で得られた葉酸誘導体（ＤＭＦ中１ ｍｇ／ｍｌ溶液７２μｍ）をｐＨ３ＴＭＳＺ中の０．５ｍｇ／ｍｌチオール化ア ルカリホスファターゼ１．Ｏｍｌに加えた。冷蔵庫で一晩貯蔵した後に、共役体 をＰＤ−１０カラム上で脱塩した。得られたタンパク質フラクションは目的の共 役体を含有した。λ、、、　＝　３５５ｎｍにおけるＵＶ吸収は大体の比３．１ での葉酸の結合を実証した。

本発明を種々な好ましい実施態様に関して説明したが、これに本発明を限定する ことは意図されず、本発明の要旨内及び請求の範囲内に含まれる変更及び変化が なされうろことは当業者に理解されるであろう。例えば、芳香族環と飽和炭素環 部分は例えば開示した置換基によってさらに適当に置換されることかできる。従 って、本発明の架橋化合物と共役体との有利な特徴を有する類似体は、特許請求 の範囲の目的のために、本発明の化合物と共役体の同等物とみなされる。

誇ＪｒＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ、＋ａ　＝　ＰＣＴ／ ＵＳ　９３１０３３４６

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．式 ▲数式、化学式、表等があります▼、 ［式中、Ｘはアルキル、芳香族炭素環部分又は飽和炭素環部分であり； −Ｒはアルコール基及び／又はアミン基を有する化合物の残基であり； Ｒ１はチオール基を有する化合物の残基である］によって表される共役体。
2. ２．−Ｒが抗原又は抗体の残基であり、−Ｒ１が酵素の残基である請求項１記載 の共役体。
3. ３．−Ｒがタンパク質の残基であり、−Ｒ１が固体サポート物質の残基である請 求項１記載の共役体。
4. ４．−Ｒが固体サポート物質の残基であり、Ｒ１がタンパク質の残基である請求 項１記載の共役体。
5. ５．Ｘがフェニル、ナフチル、又は炭素数１〜６のアルキル基１個もしくは２個 によって置換したフェニルもしくはナフチルである請求項１記載の共役体。
6. ６．Ｘが炭素数１〜６のアルキルである請求項１記載の共役体。
7. ７．Ｘが炭素数１〜６のアルキル基１個もしくは２個によって置換した飽和炭素 環部分である請求項１記載の共役体。