JPH03501623A

JPH03501623A - 蛋白誘導体及びその調製法

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Publication number: JPH03501623A
Application number: JP1509484A
Authority: JP
Inventors: オフォード，ロビン，ユーアト; ローズ，ケイス
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-08-26
Filing date: 1989-08-25
Publication date: 1991-04-11
Anticipated expiration: 2013-07-23
Also published as: DE68923746T2; AU637326B2; WO1990002136A1; JP2778775B2; ATE126236T1; GB8820378D0; EP0359428A1; DE68923746D1; AU4190689A; GR3017089T3; ES2077582T3; EP0359428B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、蛋白複合体、その調製法、及び医学の分野で有効である新規蛋白複合体の調製におけるその使用に関する。さらに詳しくは、本発明は蛋白のヒドラジド誘導体及びその調製法（特に酵素に触媒された逆蛋白分解による調製法）に関する。

発明の背景医学の分野において、治療又は診断のための蛋白複合体の使用に対して大きな興味が持たれている。この複合体は一般的には、エフェクターやレポーター基（例えば細胞毒性物質や放射能標識されることができる基）の結合した蛋白（例えば抗体）よりなる。

一般的にエフェクターやレポーター基の蛋白への結合は、基特異的反応により、領域特異的反応（例えばチロシン残基のヨード化、またはりジン残基のアシル化）ではない。従って１つの物質とだけ反応した物質でも一般的にそれ自身は不均一であり、修飾反応に関与するタイプのいくつかの残基のうちの１つに１つの基が結合した種の混合物である。

医学分野での使用が目的の蛋白複合体については、上記の非領域特異的方法により得られた生成物よりも、目的の基の部位特異的結合法による生成物の均一性により、多くの情報が得られる。即ちＩｇＧ型の抗体の部位特異的修飾の利点については、すでに報告されている（ムラヤマら（Ｍｕ＋ａｙａｍａ　ｅｊ　ａｌ、）　、イミュノケミストリー（１ｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉ　ｌ目ｙ）第１５巻、５２３−５２８頁（１９７８年）；ジエイ・ディー・ロッドウェルら（Ｒｏｄｗｃ　ｌ　ｌ。

１、Ｄ、ｅｔ　ａｌ、）　、プロシーディングズオブナショナルアカデミーオブサイエンシーズユーエスエ−（１’＋ｏ、Ｎａｔｌ。

Ａｃ１ｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳ＾）第８３巻、２６３２−２６３６頁（１９８６年）、及びヨーロッパ特許明細書第８８６９５号）。この場合、１２６分子の炭水化物を酸化した後に還元性アルキル化を行うことにより、領域特異性が達成された。このような方法がうま（いくかどうかは、適当なグリコジル化があるか否かに依存するため、他のクラスのポリペプチドには一般的には適用できない。また１２６分子はグリコジル化の部位が２つ以上あるため、この方法は必ずしも部位特異的とは限らない。

活性基をポリペプチドのＣ末端にのみ結合させるために、逆方向に働くプロテアーゼの特異性が利用されている（アール・イー・オフオードとケー・ローズ（Ｏｆｉｏ＋ｄ。

Ｒ，Ｅ、ａｎｄ　Ｒｏｓｅ、に、）　、ｒ生体液のプロタイド」（Ｐｒｏｔｉｄｅｓ　ｒｒｌ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ＦＩｕｉｄ＋）　、エイチφビーターズ（Ｈ，Ｐ６ｅｌｅ＋ｓ）編、パーガモン（Ｐｅ＋ｇｘｍｏｎ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、３５−３８頁（１９８６年）；アール・イー・オフオードら（ＯｆＩｏ＋ｄ、　Ｒ，Ｅ、ｅｌ　ａｌ、）「ペプチドＪ　１９８６年（ディー・チオドロボーロス（Ｄ、　Ｔｈｅｏｄｏ＋ｏｐｏｕｌｏｓ）編）、ダブりニー・デグルイタ−（Ｗ、　ｄｅ　Ｇ＋ｕｙｌｅ＋）、ベルリン、２７９ −２８１頁（１９８６年）；ケー・ローズら（Ｒｏｓｅ、Ｋ　ｅｌ　ａｌ、）　ｒペプチド」（同上）、２１９−２２２頁（１９８６年）；ケー・ローズら（Ｒｏｓｅ、Ｋ　ｅｔ　ａｌ、）　、バイオケミストリージャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１．　）、第２４９巻、８３−８８頁（１９８８年）；及びヨーロッパ特許明細書第２４３９２９号）。

この後の化学反応において、エフェクターやレポーター基は特異的に、修飾されたポリペプチドの活性基に向かう。（酵素の特異性という点と、酵素の結合反応を高収率にするために大量のアミノ成分が一般的に必要であるという点から、目的の基を直接ポリペプチド鎖に酵素的に結合させることは、普通可能ではないし、好ましくもない。）エフェクターやレポーター基と活性ポリペプチドの結合反応の特異性は、エフェクターやレポーター基とポリペプチド中の反応性基の化学的相補性により、またエフェクターやレポーター基自身がポリペプチド断片の場合は立体配置的に助けられて、達成される。

上記のタイプのプロテアーゼ反応に、芳香族アルデヒド、脂肪族アルデヒド又は芳香族アミンである活性基の使用が、記載されている。シッフ塩基の生成と還元（還元アルキル化）により結合し、低ｐ）Ｉにおける芳香族アミンと脂肪族アミンの相対的反応性により特異性が得られている。

蛋白のカルボキシル末端に特異的にヒドラジド基を結合させるのに、酵素に触媒された逆蛋白分解（酵素触媒逆蛋白分解）を使用できることを、われわれは見いだした。側鎖の保護は必要でなく、蛋白の変性が最小に抑えられる非常に穏和な条件下で及び水溶液中で結合反応が有効に実施できる。ヒドラジド基は通常蛋白中には存在せず、エフェクターやレポーター基が酵素的に蛋白に結合している場合は、適当に修飾したエフェクターやレポーター基を直接ヒドラジド基に向かわせることにより、部位特異的結合が可能である。得られる複合体はこれ以上の処理は不要であり、これはシッフ塩基で還元的安定化が必要であるという部位特異的結合の従来の報告とは異なる（ニー・ムラヤマら（Ｍｕ＋ａ７ｕｎａ、Ａ　ｅｌ　ａｌ、）　、ジエイ・ディー”Ｏラドウェルら（Ｒｏｄｗｅｌｌ、Ｊ、Ｄ、ｅｌ　ａｌ、）、アール・イー・オフオードとケー・ローズ（ＯＩＩｏ＋ｄ、　Ｒ，Ｅ。

ａｎｄ　Ｒｏｓｅ、に、）、アール−イー・オフオードら（Ｏｌｌｕｄ、Ｒ。

Ｅ、ｅｔａｌ、）、同上）。このような還元を使用すると好ましくない分子間及び分子内架橋の不可逆的生成の原因となりやすく、ヒドラジド形成による結合を使用することにより高度の特異性が得られる。

化学試薬を使用する場合、蛋白へのヒドラジド基の非特異的結合は報告されておらず、ヒドラジド形成による蛋白複合体が生成されている（ティー・ピー・キングら（Ｋｉｎｇ、Ｔ、Ｐ、！ｔ　ａｌ、）、バイオケミストリー（ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔＢ）第２５巻、５７７４−５７７９頁（１９８６年））。

Ａ−Ｃｏ−Ｎ　（Ｒ’）Ｎ　（Ｒ２）−Ｚ’−Ｃ−Ｚ２−Ｎ　（Ｒ３）ＮＨＲ’ す、それぞれ水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基であり；Ｚｌ、！：Ｚ２は同じか又は異なり、存在するか又は欠如しており、それぞれスペーサー（ｓｐａｃｅ’）基であり；Ｘは酸素又はイオウ原子である）。

式（１）の化合物において１．Ａ−ＣＯ−で示される蛋白又はペプチドＡＣ０２Ｈの残基は、任意の天然に存在する合成又は半合成蛋白又はペプチド（ハイブリドーマや組換えＤＮＡ法により産生されたものを含む）の残基でもよい。具体的な例としては、免疫グロブリン（例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及び組換え抗体やその断片）、フィブリノーゲン、アルブミン、トランスフェリンなどの血漿蛋白、ホルモン（例えばエストロゲンのようなステロイドホルモン、インスリン、エリスロボエチン、ソマトスタチン）、リンフ才力イン（例えばインターロイキン１又はインターロイキン２）、組織壊死因子（Ｔ　Ｎ　Ｆ）などのサイトカイン、そして治療上有効な酵素（例えば組織プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ））や酵素インヒビター（例えばメタロプロテイナーゼの組織インヒビター）などがある。

式（１）の化合物のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４がアルキル基の場合、それは例えばＣ，−６アルキル基（メチル又はエチル基）でもよい。Ｒ１，Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４で示されるアリール基の例はＣ６−１２アリール基（例えばフェニル基）がある。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、又はＲ４で示されるアラルキル基は、芳香族Ｃ１ −３アルキル（例えばベンジル又はフェネチルなどのフェニルＣ１−３アルキル）がある。

式（１）の化合物の２　又はＺ２がスペーサー基であする場合、それは例えば、−〇−又は−Ｓ−又は１つ又はそれ以上の−Ｎ−（Ｒ５）−（ここでＲ５は水素原子又はＣ１−６アルキル基である）、環状脂肪族又は芳香族基より選択された１つ又はそれ以上の異種原子が随時介在する、随時置換された脂肪族ハイドロカルビル鎖である。

即ち具体的にはＺｌ又はＺ２は、−〇−又は−８−又は１つ又はそれ以上の−Ｎ −（Ｒ５）（例えば−ＮＨ−又は−Ｎ　（ＣＨ３’）−）　、環状脂肪族（例えばシクロへキシレンのようなＣ３−８シクロアルキレン）又は芳香族（例えばフェニレンのようなＣ６−１２アリレン）基より選択される１つ又はそれ以上の異種原子が随時介在する、随時置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ１−１０アルキレン、Ｃアルケニレン、又はＣ２−１０アルキニレン鎖である。

Ｚ　又はＺ２の具体的例としては、−ＣＨ，、−１−（ＣＨ２）２−１−ＣＨ２０ＣＨ２−１−ＣＨＳＣＨ、−（ＣＨ）　−又は−（ＣＨ２）４がある。

式（１）の化合物の塩には、酸や塩基との塩（例えば塩酸塩やシュウ酸塩などの酸付加塩、又はナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩）がある。

一般的に式（１）の化合物のＡ、　−ＣＯ−基は、蛋白又はペプチドＡ−Ｃｏ　Ｈ（ここで−〇〇、、Ｈは蛋白又はペプチド中に存在する任意のカルボキシル基である）の残基である。しかし好ましくは式（１）の化合物のＡ−Ｃｏ−基は、　Ｃｏ２Ｈは蛋白又はペプチド中のＣ末端カルボキシル基である蛋白又はペプチドのＡ−Ｃｏ２Ｈの残基である。

式（１）の化合物の好適な基は、Ａ−Ｃｏ−が、フィブリノーゲンや免疫グロブリン又はそれらの断片などの血漿蛋白、インスリンなどのホルモン、組織壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカイン、又は治療上有効な酵素（例えば組織プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ））などの残基であるものである。

具体的にはＡ−Ｃｏ−は免疫グロブリン又はその断片の残基であることが好ましい。免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片は一般的には、免疫グロブリンクラスに属する。例えばそれは免疫グロブリンＭクラスに属する抗体、又は特に免疫グロブリンＧクラスに属する抗体である。抗体又はその断片の起源は、動物、例えば咄乳類（例えばマウス、ラット、又はヒＩ−）でもよい。またそれは天然の抗体又はその断片、又は必要な場合は、組換え抗体又は抗体断片（即ち組換えＤＮＡ法を使用して産生される抗体又は抗体断片）でもよい。

具体的な組換え抗体又は抗体断片には、（１）少なくとも一部は、異なる抗体由来の抗原決定基を有するもの、例えば１つの抗体の高度可変域又は相補性決定域が、第２の異なる抗体の可変フレームワーク領域に移植されているもの（ヨーロッパ特許明細書第２３９４００号に記載）；（２）非Ｆｖ配列が他の異なる抗体のＦｖ配列で置換されている組換え抗体又は断片（ヨーロッパ特許明細書第１７１４９６号、１７３４９４号、１９４２７６号に記載）；又は（３）実質的に天然の免疫グロブリンの構造を有しているが、ヒンジ部位のシスティン残基の数が天然の免疫グロブリン中の数と異なるもの、又は組換え抗体又は断片の表面ポケット（ｓｕ「ｆａｃｅ　ｐｏｃｋｅｔ）中の１つ以上のシスティン残基が天然の免疫グロブリン中に存在する他のアミノ酸の場所にあるもの（それぞれ国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ　８８１００７３０とＰ　ＣＴ／Ｇ　Ｒ８８１００７２９に記載）がある。

抗体又は抗体断片は、ポリクローナル、好ましくはモノクローナルであり、複数の抗原決定基に対して特異性を有していてもよいが、１つにのみ特異的であることが好ましい。抗原決定基は任意のハプテン、はヒトなどの動物（例えば正常動物の組織又は器官細胞に関連した抗原、腫瘍細胞関連抗原（例えば癌胎児性抗原又はアルファフェトプロティンなどの腫瘍胎児抗原、絨毛性ゴナドトロピンや胎盤性アルカリホスファターゼなどの胎盤性抗原、前立腺酸性ホスファターゼや前立腺特異抗原などの前立腺抗原）、及びフィブリン、血小板のどの体液に関連した抗原）、ウィルス、細菌そして菌類に関連した抗原決定基である。

抗体断片は例えば、全抗体の蛋白分解により得られた断片、例えばＦ　（ａ　ｂ ’　）　、Ｆ　ａ　ｂ’又はＦａｂ断片、又は組換えＤＮＡ法により得られる断片（例えばＦｖ断片）がある（国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ　８８１００７４７に記載）。

式（１）の化合物のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は好ましくは水素原子、又はアルキル（特にメチル）基である。

Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４がそれぞれ水素原子である式（１）の化合物が特に好ましい。

式（１）の化合物の一般的に好ましい群は、Ｚｌとｚ２が欠如しているか又は存在しており、同じであるものである。

式（１）の化合物の２１と２２が存在する時、それらは好ましくは１つ以上の一〇−又は−Ｓ−又は−Ｎ（Ｒ）−基が随時介在するＣｌ−１０アリキレン鎖である。

式（１）の化合物のＸは好ましくは酸素原子である。

本発明の化合物の特に有用な群は式（１ａ）を有する：Ａ−Ｃｏ−Ｎ（Ｒ”）Ｎ（Ｒ２）−Ｃ−Ｎ（Ｒ３）ＮＨＲ，’Ｉ（１ａ）（式中、Ａ−ＣＯ−１Ｒ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ’は式（１）■ の化合物及びその塩で定義されたものである）。

この型の特に有用な化合物は式（１ｂ）を有する：Ａ　−ＣＯ−Ｎ　ＨＮ　ＨＣＦ（Ｎ　ＨＮ　Ｈ２（１ｂ）（式中、Ａ−Ｃｏ−は式（１）の化合物及びその塩で定義されたものである）。

Ａ−Ｃｏ−は蛋白又はペプチドＡ、−Ｃｏ２Ｈ（ここでＣＯ２Ｈは蛋白又はペプチドのＣ末端カルボキシル基である）の残基である式（１ａ）と（１ｂ）の化合物は特に好ましい。Ａ−Ｃｏ−が免疫グロブリン又はその断片の残基である、この型の化合物は特に好ましい。

式（１）の化合物は以下の方法で調製される（ここで特に明記していない場合はＡ−ＣＯ−１ＲＩＳＲ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｚｌ、Ｚ２、Ｘは式（１）で定義（、たちのである）。

即ち本発明は、式（２）の化合物：八−ＣＯ２Ｈ（２）又はその活性化誘導体を、式（３）の化合物：ＲＮＨＮ　（Ｒ２）　−Ｚ’−Ｃ −Ｚｚ−Ｎ　（Ｒ３）　ＮＨＲ’と、溶媒（例えば水性溶媒）中で適当な温度（例えば大体周囲温度）で縮合することよりなる、式（１）の化合物の調製法を与える。

ｚｌと２２が同じでない式（１）の化合物を調製する場合は、反応の前に−Ｎ　（Ｒ）ＮＨＲ’基を保護することが必要かも知れない。この場合従来の保護方法が用いられ、式（１）の化合物の化合物が得られた後は、標準的脱保護法を使用して脱保護される。

本発明の上記の一般的方法の特に有用な点は、ペプチド結合の形成を触媒することができる酵素の存在下で式（２）の化合物を式（３）の化合物と縮合させることよりなる、式（１）の化合物（式中、Ａ−Ｃｏ−は蛋白又はペプチドＡ−Ｃｏ　Ｈの残基であり、−Ｃｏ２）１は蛋白又はペプチドのＣ末端カルボキシル基である）の調製法が与えられることである。

本発明のこの点での使用に適した酵素は、セリンプロテイナーゼ（例えばトリプシン、又はキモトリプシン）、又はリジルエンドペプチダーゼ、エクソペプチダーゼ（例えばカルボキシペプチダーゼＹのようなカルボキシペプチダーゼ）などのプロテアーゼがある。

一般的に、式（２）の化合物と式（３）の化合物の縮合を促進するのに選ばれる、有利な穏和な条件で反応が行われる。正確な条件は使用する酵素により異なる。即ち例えばトリプシンを酵素として使用する場合、反応は溶媒、特に水性溶媒（例えば水又は水性有機溶媒（例えば水溶性ジメチルスルホキサイド又は水溶性ブタン−１，４−ジオール）中で適当なｐＨ（例えばｐＨ４−８）、適当な温度（例えば大体周囲温度）で実施される。

同じ条件又は類似の条件を使用して他の酵素も使用される。その正確な条件は、縮合反応を実施する前に通常の方法により適当な小規模実験を行い、実験的に決定される。

式（１）の化合物の塩は、標準的方法（例えば水性溶媒中で式（１）の化合物を酸又は塩基と反応させる）で調製される。

式（２）の蛋白又はペプチドは、容易に入手できるか、又は標準的方法を用いて得られる。

式（３）の中間体は公知の物質であるか、又は該公知の物質の調製に使用される方法に類似の方法を使用して公知の出発物質より調製される。

式（１）の化合物は、蛋白が目的の別の分子（例えば他の蛋白又はペプチド、又はエフェクターやレポーター分子）に結合しており、結合は−Ｎ（Ｒ）Ｎ（Ｒ２）−Ｚ　Ｃ（＝Ｘ）Ｚｚ−Ｎ　（Ｒ３）Ｎ＝基である、蛋白複合体の調製に有用である。

即ち本発明のさらに別の点において、蛋白複合体の調製に使用できる式（１）の化合物を与える。

本発明のさらに別の点において、結合は−Ｎ　（Ｒ’　）Ｎ　ＣＲ）−Ｚ’　Ｃ（＝Ｘ）Ｚｚ−Ｎ　（Ｒ３）Ｎ−ＪＥであることを特徴とする、蛋白が他の蛋白又はペプチド、又はエフェクターやレポーター分子に結合している蛋白複合体を与える。

この型の複合体において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ｚｌ、Ｚｚ、Ｘは式（１）で定義されたものであり、式（１）に関連してこれらの基のある型について説明した種々の選択は、本発明の蛋白複合体にも適用されると理解するべきである。

本発明の具体的な蛋白複合体は、式（４）の化合物よりなる：Ａ−Ｃｏ−Ｎ　ＣＲ’）Ｎ　（Ｒ２）−Ｚ’−Ｃ−Ｚｚ−Ｎ　（Ｒ３）−Ｙ−Ｒ（式中、Ａ−ＣＯ−１Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｚｌ、Ｚｚ、Ｘは式（１）で定義したものであり、Ｒは蛋白又はペプチド又はエフェクターやレポーター基であり、Ｙは−ＮＨＲ’　（ここでＲ４は式（１）で定義したものである）をＲの反応性基と結合させることにより形成される結合基である）。

式（４）の具体例は式（５）の化合物を含む：Ａ−Ｃｏ−Ｎ　ＣＲ’）Ｎ　（Ｒ２）−Ｚ’−Ｃ−２２−Ｎ　（Ｒ３）Ｎ＝ＣＨ−ＲＩ（式中、Ａ−ＣＯ−１Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｚｌ、ｚ２、Ｘ、Ｒは上で定義したものである）。

式（４）と式（５）の化合物において、Ｒは例えばＡ−ＣＯ−１又はエフェクターやレポーター基について定義した蛋白又はペプチドである。エフェクター基は、例えば任意の生理的に活性な化合物、抗細菌、抗ウィルス、抗菌化合物である。具体的な生理的に活性な化合物としては、抗新生物物質（細胞毒性物質や細胞増殖抑制性物質など）、毒素、ホルモン、抗炎症化合物、及び心臓血管系（線溶系）物質や中枢神経系物質として活性な物質などがある。レポーター基は、例えば分析法によりインビトロ及び／又はインビボで検出される基（例えば放射能標識が可能な基、蛍光性の基、又はＮＭＲやＥＳＲ分光法で測定可能な基）がある。

式（４）と式（５）の化合物を生成させるために、出発物質Ｒは、式（１）の化合物のヒドラジド基と反応できる基を有していなければならないことは理解されるであろう。このような基は容易に同定可能であり、特にアルデヒド基がある。

適当な基は出発物質中に存在することもあり、必要な場合には、例えば本実施例中に君己載した従来法を使用して導入することができる。

図面の簡単な説明本発明は以下の非限定的実施例において、及び添付の図面を参照して説明される。図１は、リジルエンドペプチダーゼの存在下でデス（ａｌａＢ３０）インスリン（ＤＡＩ）と１．１−カルボニルジヒドラジドを反応させて得た試料のＨＰＬＣ分析の結果を示し、ＤＡＩ−Ｎ　ＨＮ　ＨＣＯＮ　ＨＮ　Ｈ２（本発明の化合物）とＤＡＩ出発物質との分離を示す。

具体的態様の説明以下の実施例により本発明を説明する：実施例１１．１−カルボニルジヒドラジドとデスＡｌａＢ３０インスの調製　１載された方法により調製した（モリハラら（Ｍｏ＋ｉｂａ＋ａ　ｅｌａｔ、）、ビオケム拳ビオフィシ・レス・コム（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｈ、　Ｃｏｍｍｏｎ、　）第９２巻、３９６−４０２頁（１９８０年））。１．１−カルボニルジヒドラジド（１８０ｍｇ−フル力（Ｆｌｕｋｘ、　ｐｕ＋１ｓｓ））に２　ｍｌの蒸留水を加えた後、２ｍｌのジメチルスルホキサイド（フル力（Ｆｌｕｋａ）　、ｐｕ＋１ｓｓ）と１２μｍの酢酸（フル力ｆＦｌｕｋａ）　）を加えた。標準液（メルク（Ｍｅ＋ｃｋ）社）で較正した後、ガラス電極（モデルＧＫ２４２１Ｃ，ラジオメーター（Ｒａｄｉｏｍｅｔｃ＋）、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｂａｌａｎ））で見かけのｐＨを測定したが、ｐｌ＋は調整しなかった。約１２．５μｍの９８−１００％の蟻酸（メルク（Ｍｅ＋ｃｋ）社）を加エテｐＨを５．５に下ケタ。ＤＡ、Ｉ（３０ｍｇ）を１．５ｍ１（７）上記溶液に溶かし、次に３０μｍの水中の０．５■のリジルエンドペプチダーゼ（アクロモバクタ−（＾ｃｈ＋ｏｍ。ｂｘｃｌｕｌより；ワコー（Ｗａｋｏ）社）を加えた。システム１で分析ＨＰＬＣ，続いて調製ＨＰＬＣを行った。

システムト　ベックマンゴールドシステム。カラムはマシェリーナゲルヌクレオジル（ＭａｃｈｅＢ　ＮａＩ！ｅｌＮｕｃｌｅｉｏｉｉｌ）　（３００Ａ％　５１１１１％　Ｃ８、内径２５　ｃｍ　Ｘ　４ｍ１Ｉ＋）を０．６ｍｌ／分で使用した。溶媒Ａは０．３Ｍ硫酸アンモニウムであり、溶媒Ｂは３５％アセトニトリル中の０．３Ｍ硫酸アンモニウムであった。この２つの溶媒は、濃硫酸を注意深く加えてｐＨを２（ガラス電極）に調整した３Ｍ硫酸アンモニウムを使用して調製した。分析実験では２１４　ｎｍで検出し、調製実験では２５４　＋＋ｍで検出した。

図１はシステム１でのイソクラティック（ｉｓｏｃ＋ａｔｉｃ）ＨＰＬＣの結果である。ＤＡＩは約９０％の収率できれいに、より親水性（速く溶出する）の化合物に変換されている（ＤＡ　Ｉ−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ，、として同定される、下記参照）。もともとのＤＡ１５ｍｇに相当するバッチで試料を注入し、画分を手で集めて調製分離を行った。水で希釈した後製造業者の指示に従いＣ１８セパツク（ＳｅｐＰａｋ）　（ウーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）社）で蛋白を回収した（メタノールで洗浄、０．１％トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）で平衡化、等量の水で希釈した試料を添加、０．１％ＴＦＡ／２０％アセトニトリルで洗浄、０．１％ＴＦＡ／４０％アセトニトリルで溶出）。真空遠心分離機中でヒーターのスイッチはきった状態で溶媒を除去した（スピードバックコンセントレータ−（ＳｐｅｅｄＶａｃＣｏｎｃｅｎｔｒａ＋ｏｒ）　、サバント（Ｓａｖａｎｔ））。

生成物ＤＡ　Ｉ−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ２を電気泳動、ペプチドマツピング、逆相ＨＰＬＣ，そして２．４−ジヒドロキシベンズアルデヒドへの特異的結合で性状解析した。ｐＨ８での酢酸セルロース電気泳動（ローズら（Ｒｏｕ　ｒｌ　ａｌ、）　、ジャーナルオブクロマトグラフィ−（Ｊ、　ＣｈｒｏｌＩｌａｔｏｇｒａｐｈｙ）第２１０巻、３０１−３０９頁（１９８１年）に記載のシステム）で、この生成物は、陰性荷電を１つ失ったインスリン誘導体としての挙動を示した（ローズら（Ｒｏ＋！ｅｌ　ａｌ、）　、バイオケム・ジェイヒドラジド基（ｐＨ８では荷電していない）になっているため、これは予想されたことである。

アルミラリアメ１ノア（Ａ＋ｍ１ｌｌａ＋ｉａ　ｍｅｌｌ！ａ）より単離されたプロテアーゼ（Ｌｙｓ残基のＮ末端で切断する）（例えばローズら（ＲｏＩｅ　ｅｔ　ａｌ、）　、「ペプチドＪ、１９８４年、ラグナーソン（Ｒａｇｎａ＋ｓ＋ｏｎ、　Ｕ、　）編、２３５−２３８頁、アルムクビストアンドゥィクセルインターナショナル（＾１ｍｑｖｉｓｌａｎｄ　Ｗｉｋｓｃｌｌ　Ｉｎｔｅｔｎａｔｉｏｎａｌ）、ストックホルム、１９８４年を参照）を用いて消化すると、Ｌｙｓ−Ａｌａ　−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ２で予想される性質（高圧濾紙電気泳動）を有する小断片とともに、デス（ＬｙｓＢ２９−ＡｌａＢ３０）インスリンが遊離された（標準物質と比較してＨＰＬＣと酢酸セルロース電気泳動で同定）。

システム１の逆相ＨＰＬＣでは、ＤＡＩ−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ，。

はＤＡＩや天然のインスリンよりも速く溶出しくＤＡＩと天然のインスリンはこのシステムで同じ位置に溶出した）、生成物が低ｐＨにおいて陽性荷電を１つ余分にもっていることに一致する。上記のデータ及び合成方法を考慮すると（ローズら（Ｒａｔｅ　ｅｌ　ｍｌ、）、バイオケム・ジエイ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１．　）第２１１巻、６７１−６７６頁（１９８３年）と比較）、この生成物の予想される構造はＤＡＩ−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ２で、Ｌｙｓ　のカルボキシル基を介してヒドラジド基が結合している。

亜鉛を含まないブタインスリン（対照）とＤＡＩ−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ２を１１００ｊの濃度で、５００ｊＭの２．４−ジヒドロキシベンズアルデヒド（フル力（Ｆｌｕｋ））の存在下で及び存在しないところで、ｐｔ１４．　６の０．１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液中で２２℃で、別々にインキュベートした。間隔をあけて１０μｍをＨＰＬＣで分析した。その結果は、インスリンはアルデヒドと反応セス、ＤＡ　Ｉ−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ２Ｇ；！フルデヒドの存在しないところで安定であり、アルデヒドは安定でありＤＡ　Ｉ−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ２＋；ｉ明らかに反応してより疎水性の単一の複合体を産生じていることを明瞭に示していた。同様の条件でＤＡＩ−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ２は４−カルボキシベンズアルデヒド（フル力（Ｆｌｕｋａ）　）と反応し、ＨＰＬＣでより疎水性の、そしてｐＨ８の電気泳動で（ＤＡ　Ｉ−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ２より）１つ余分の陰性荷電を有する生成物を生成し、修飾していないインスリンとは反応しなかった。

入乞ワ上μとりを上韮斗−ノヱ４４０．２ｍｌのｐ）１４．６．０．ＩＭの酢酸ナトリウム緩衝液中２２℃で、１００　ｊＭノＤ　Ａ　Ｉ　ＮＨＮ　ＨＣＯＮ　ＨＮ　Ｈ２を、５６０．ＭのＨＣＯ −ＣＯ−フェリオキサミン（市販のデフエロキサミンをＢｏｃ−Ｌ−３ｅ　ｒＯＮｓｕで７シル化し、脱保護し、次に１１２ナノモル当り約１１０６ｄｐの５５Ｆｅで標識し、次にエチレングリコール中の過ヨウ素酸塩を用いて酸化してＨＣＯ−Ｃｏ−型にした；調製物を希釈して必要な比活性にした）とインキュベートした。２４時間後に試料をセファデックスＧ５０フアインカラムでゲル濾過（０，１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液）シ、次に全ての画分の液体シンチレーション計測を行った。結果は、蛋白への放射能の予想される取り込み量に近いものを示していた（１４．３％の放射能が取り込まれた；過剰のフェリオキサミン試薬から考えると、理論的最大取り込み量は１７．８％であろう）。標識したＨＣＯ−ＣＯ−フェリオキサミンと修飾していないインスリンとの対照インキュベ−１・では、蛋白画分に放射能は取り込まれなかった。

実施例３キモトリプシンを用いる１、１−カルボニルジヒドラジドとデス（ペンタペプチドＢ２６−３０）インスリンとの結合実施例１と同様の条件（ただしスケールは５■であり反応時間は２４時間）でアルファーキモトリプシン（シグマ社（Ｓｉｇ＋ｎａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、））を用いて、１．１−カルボニルジヒドラジドをデス（ペンタペプチドＥ２６−３０）インスリン（ＤＰｌ、ブタインスリンの穏和なペプシン消化の後、尿素を含むトリス緩衝液でＤＥＡＥ　Ａ２５イオン交換クロマトグラフイーを行う公知の方法により調製した）と結合させた。

ＨＰＬＣによる分析の結果は、酢酸セルロースによる電気泳動と、共有結合したアルデヒド基を有するゲルに結合する能力（未修飾のインスリンはアルデヒドカラムに結合しなかった）から、予想されるＤＡ　Ｉ−ＮＨＮＨＣＯＮＨＮＨ２と同定される、速く溶出する生成物に明らかに変換されていることを示していた（約６２％の収率）。

０．２ｍｌのＩｇＧ溶液（リン酸緩衝化生理食塩水中１０■／ｍｌ）に０．８ｍｌの１．１−カルボニルジヒドラジド（２，５Ｍ５ｐＨ５，５：　２１０ｍｌの水に５０ｇのカルボニルジヒドラジドを溶解し、１．２ｍｌの氷酢酸、そして１．５ｍｌの蟻酸を加え、水で２２０ｍ１とした）を加えた。固体トリプシン（２ ■、ブタ）を加えて混合物を２０℃で放置した。少量の試料を標準の５ＤＳ−アクリルアミドゲルで電気泳動した結果、ＩｇＧの消化が進んでいた。消化２４時間と７２時間の間は、見かけの分子量がＦ　（ａ　ｂ’　）　２に相当する断片が優勢であった。７２時間後はＩｇＧはほとんど残っていなかった。スーパーローズ（Ｓｕｐｅ＋ｏｓｅ）　１２のカラム（２５Ｘ０．８ｃｍ）（１，ｐ、　１．　ｃ、　）でゲル濾過して、修飾断片をトリプシンから単離した。２．５Ｍのカルボニルジヒドラジド溶液を水で２Ｍに希釈してカラム緩衝液を得た。流速は０．５ｍ１Ｚ分であった。

Ｆ　（ａ　ｂ’　）　２に相当するピークをトリプシンのピークからほとんど完全に分離し、酵素を完全に除去するため同じ緩衝液中で同じカラムにもう一度かけた。次にカラムの緩衝液をＯ，ＬＭ　ＮＨ，ＨＣＯ３に変えて、大豆トリプシンインヒビターの２■／ｍｌ溶液１　ｍｌをシステムに通した。次にこのカラムでＦ　（ａ　ｂ’　）　２様物質からカルボニルジヒドラジドを除去した。

上記条件で２４時間消化の生成物を上記のように単離し、生成物はＩｇＧ　１モルにつき０．０６モルのヒドラジドを取り込んでいることが証明された。

実施例５Ｆａｂ様１ｇＧ−フェリオキサミン複合体の産生ＩｇＧ抗体の試料（０，５ｍＬ　リン酸緩衝化生理食塩水中２３．３■／ｎ＋１．）リプシン消化によりＦａｂ様断片を与えることが分かっている）に、５０ｊｌのトリプシン（ブタ、ＴＰＣＫ処理した１０’ＨＣ１中１５ｍｇ／ｍｌ）を加え、混合物を室温で８時間放置した。次にトリプシン溶液をさらに１００μｌ加え、さらに２１．５時間消化を続けた。この時点で白い沈澱物が現れた。消化物に固体１．１−カルボニルジヒドラジド（１５５■）を加え、１時間２０分後に、膵臓トリプシンインヒビター（ベイヤー（ＢａＨｒ）　、１３■／ｍ１）を加えて反応を停止させた。

適当に処理したアルデヒド性５５フエリオキサミン（実施例２に記載の方法で調製）に結合させると、Ｆａｂ様ＩｇＧ分子の約２０％が標識されていた。次のトリプシン消化で約９０％の放射能が除去可能であり、標識は実質的にＣ末端のトリプシン感受性部位で起きていることを示していた。

Ａ！持時間（分）　＝ＣｌＡｌεＮＨ２ＮＨＣＯＮＨＮＨ２乙０）祁合つイゝ／／７うｆｉ・ｖフ（１ｓｏｃｒａ士ｉ’の　ｆ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ分Ｍ（ウーボ゛ＬＳＦ“ラジ゛ト″）ＦＩＧＵＲＥ　１手続補正書く自発ン平成　２　年８７月８０日

Claims

【特許請求の範囲】１．式（１）の化合物及びそれらの塩：▲数式、化学式、表等があります▼（１）（式中、Ａ−ＣＯ−は蛋白又はペプチドＡ−ＣＯ２Ｈの残基であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は同じか又は異なり、それぞれ水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基であり；Ｚ１とＺ２は同じか又は異なり、存在するか又は欠如しており、それぞれスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）基であり；Ｘは酸素又はイオウ原子である）。２．式（１ａ）の化合物及びそれらの塩：▲数式、化学式、表等があります▼（１ａ）（式中、Ａ−ＣＯは蛋白又はペプチドＡ−ＣＯ２Ｈの残基であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は同じか又は異なり、それぞれ水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基であり；Ｘは酸素又はイオウ原子である）。３．Ａ−ＣＯは蛋白又はペプチドＡ−ＣＯ２Ｈ（ここで−ＣＯ２Ｈは該蛋白又はペプチドのＣ末端カルボキシル基である）の残基である、請求の範囲第１項又は第２項に記載の化合物。４．Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４がそれぞれ水素原子である、前記請求の範囲のうちいずれか１項に記載の化合物。５．Ｘは酸素原子である、前記請求の範囲のうちいずれか１項に記載の化合物。６．Ａ−ＣＯは免疫グロブリン又はその断片の残基である、前記請求の範囲のうちいずれか１項に記載の化合物。７．式（２）：Ａ−ＣＯ２Ｈ（２）の化合物又はその活性化誘導体を、式（３）▲数式、化学式、表等があります▼ （３）の化合物と縮合することよりなる、式（１）の化合物及びその塩の調製方法：▲数式、化学式、表等があります▼（１）（式中、Ａ−ＣＯ−は蛋白又はペプチドＡ−ＣＯ２Ｈの残基であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は同じか又は異なり、それぞれ水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基であり；Ｚ１とＺ２同じか又は異なり、存在するか又は欠如しており、それぞれスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）基であり；Ｘは酸素又はイオウ原子である）。８．式（１）（式中、Ａ−ＣＯは蛋白又はペプチドＡ−Ｃ０２Ｈの残基であり、 −ＣＯ２Ｈは該蛋白又はペプチドのＣ末端カルボキシル基である）の化合物の調製のための請求の範囲第７項に記載の方法において、ペプチド結合の形成を触媒することができる酵素の存在下で、式（２）の化合物を式（３）の化合物と縮合させることよりなる、上記方法。９．蛋白は他の蛋白又はペプチド、又はエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）やレポーター（ｒｅｐｏｒｌｅｒ）分子に結合している蛋白複合体において、結合は −Ｎ（Ｒ１）Ｎ（Ｒ２）−Ｚ１−Ｃ（＝Ｘ）Ｚ２−Ｎ（Ｒ３）Ｎ＝基よりなる上記蛋白。１０．式（４）の化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼（４）（式中、Ａ−ＣＯ−は蛋白又はペプチドＡ−ＣＯ２Ｈの残基であり；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は同じか異なり、それぞれ水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基であり；Ｚ１とＺ２は同じか又は異なり、存在するか又は欠如しており、それぞれスペーサ（ｓｐａｃｅｔ）基であり；Ｘは酸素又はイオウ原子であり；Ｒは蛋白又はペプチド又はエフェクター又はレポーター基であり；Ｙは、−ＮＨＲ４（ここでＲ４は水素原子、又はアルキル、アリール、又はアラルキル基である）をＲ基中の反応性の基と結合させることにより生成される結合基である）。