JPH06504064A - 血管形成ペプチド - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 血管形成ペプチド １、序章 本発明は、血管形成作用を示す血小板第４因子に関連するペプチド及びペプチド 誘導体、このペプチドを含有する薬剤組成物、及び本発明のペプチドを使用する 血管形成促進方法に関する。

２、本発明の背景 新血管形成による血管形成の生物学的プロセス、即ち新しい血管の形成は通常の 発達のために必要であり、また、損傷の修復及び炎症のような病的な状態及び固 体腫瘍成長の重要な局面でもあるＣＬｅｉｂｏｖｉｃｈら、　１９８８．　“成 長因子及び傷治癒の他の局面”Ｂａｒｂｕｌら編、　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、 　ＮＹ第１３２頁）。血管形成カスケードには、内皮細胞移動、プロテアーゼ形 成及び内皮細胞増殖か含まれる（Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈら１．上掲）。多数の良く 知られた、かっ、種々の同定された自己分泌及びバラ分泌成長因子が血管形成カ スケードに関与している。あまり特性決定が行われていない因子の一つに、血小 板由来の血管形成因子がある（ＰＤＡＦ　：　Ｂａｎｄａら、　１９８２゜Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、７９ニア７７３−７７７７）。

２．１．　血管形成ペプチド 血管形成を引き起こす幾つかのタンパク質成長因子か同定されている。、Ｒもよ く同定された血管形成因子の１つは、ヘパリン結合性ポリペプチド分裂促進因子 の塩基性繊維芽細胞増殖因子である。塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）タ ンパク質は、より大きい分子量のものも確認されているか、約１８ｋＤａの分子 量を有しており、これは１５５個のアミノ酸から成る予想されたｃ　ＤＮＡ翻訳 生成物に合致する（Ｓｏｍｍｅｒら、、１９８９．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、１６０：１２６７−１２７４：　Ａｂｒａｈａｍ　ら、１９８６ ．　ＥＭＢＯＪ、５：２５２３−２５２８）。

他の多くの因子が血管形成活性を示すことが報告されており、これには、セルロ ブラスミン（Ｃｈｕ及び０１ｄｅｎ、　１９８５．　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１２６：１５−２４）；単球由 来のモノサイトアンジオトロピン（Ｗｉｓｓｌｅｒら、、　１９８３．　Ｆｅｄ 、　Ｐｒｏｃ、　４２．アブストラクト６８４）　；胎盤血管形成因子（Ｂｕｒ ｇａｓ、　１９８６．　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃ１１ｍ、　Ｉｎ−ｖｅｓｔ、　１６ ：４８６−４９３）：グリオーム由来内皮細胞成長因子（Ｌｉｂｅｒｍａｎｎら 、　＋９８７．　ＥＭＢＯＪ、　６：１６２７−１６３２）：及びｂＦＧＦに免 疫的に関連する腎臓の腺癌からのヘパリン−結合性成長因子が含まれる。炎症及 び血管形成の簡単な総説はフォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）らの“免疫学の進歩 （Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＞”　１９８９、第１巻、メ ルチア−（Ｍｅｌｃｈｅｒ）ＩＩ、スブリンガーベルラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ −Ｖｅｒｌａｇ）社、Ｎ、　Ｙ、　、第７６１−７６４頁に見い出される。

２．２．　血小板第４因子 ７０個のアミノ酸をもつヘパリン結合性タンパク質である、血小板第４因子（Ｐ Ｆ４）は、活性化された血小板のアルファ顆粒がら放出される。ＰＦ４は化学走 性、凝結、炎症及び細胞成長に関連する多重遺伝子ファミリーの一員であるが、 ＰＦ４の正確な生物学的機能は知られていない（Ｅｉｓｍａｎら、　１９９０． 　Ｂｌｏｏｄ　７６：３３６−３４４）。ＰＦ４遺伝子のゲノム配列及び高度に 相同の遺伝子のＰＦ４　ａｌｔが最近報告された（Ｅｉｓｍａｎら、上掲）。Ｐ Ｆ４の報告されている生物学的活性には、マウスにおけるコンカナバリンＡによ り誘導される免疫抑制の軽減（Ｚｕｃｋｅｒら、　１９８９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８６：７５７１−７５７４）；内皮細胞への 結合及び侵入能力（Ｒｙｂａｋら、　１９８９．　Ｂｌｏｏｄ　７３：　１５３ ４−１５３９）；好中球化学走性の誘導、リソソーム酵素の放出及び増大した接 着性（Ｂｅｂａｗｙら、　１９８６．　Ｊ、　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｂｉｏｌ、 　３９：　４２３−４２４）：　血管周囲細胞の移動の刺激及び平滑筋細胞及び 内皮細胞の非刺激（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、　１９８２．　Ｊ、　Ｃｅ１１、　 Ｓｃｉ、　（５６）＋　７ｌ−８２）；及び潜在的な抗血栓作用（Ｗｅｅｒａｓ ｉｎｇｈｅら、　１９８４．　Ｔｈｏｒｍｂ、　Ｒｅｓ、３３　：　６２５−６ ３２）、が含まれる。ＰＦ４の増大したレベルは糖尿病患者（Ｇｕａｓｔａｍａ ｃｃｈｉａら、　１９８５．　Ｂｏｌｌ、　Ｓ。

ｃ、Ｉｔａｌ、Ｂｉｏｌ、５ｐｅｒ、６１：４９９−５０２：　Ｃｏｒｔｅｌｌ ａｔｏ　ら、１９９０．　Ｔｈｒ。

ｍｂ、Ｒｅｓ、５８：５７１−５７６＋　Ｃｅ１ｌａら、１９８６．　Ｆｏｌｉ ａ　Ｈａｅｍａｔｏｌ、１１３：６４６−６５４’）及びベーチェット病患者（ Ｓｃｈｍｉ　ｔｚ−Ｈｕｅｂｎｅｒ及びＫｎａｐ、　１９８４、　Ｔｈｒｏｍｂ 、　Ｒｅｓ、　３４：２７７−２８６）において確認されている。

３、本発明の概要 本発明は、血管形成活性を示す血小板第４因子に関連するペプチド及びペプチド 誘導体、このペプチドを含有する薬剤組成物、及びこのペプチドを使用する血管 形成促進のための方法に関する。

これは、一部、ウサギ角膜移植試験における新血管新生の測定により、及び毛細 管内皮細胞の化学誘引（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔ　１ｏｎ）の測定により、血 小板第４因子に由来するオクタペプチド及びそれに構造的に関連する７種のペプ チド（第１図に示す）がインビボにおいて血管形成応答を引き起こすことができ たという知見に基く。

これらの８種のペプチドは本発明の非限定的な特定の態様を表わす。本発明の血 管形成ペプチドは、特に、切開口の治療、骨修復、やけど治療及び心筋又は中枢 神経系の損傷における梗塞形成後の修復を含む傷の治療の促進；及び移植組織の 同化、特に、糖尿病患者のように血管不全を被っている患者において特に有用で ある。

４、図面の説明 第１図。血管形成ペプチドＷｏｈｌｌからＷｏｈｌ８のアミノ酸配列。

第２図。ＰＦ４のアミノ酸配列。

第３図。ネガティブ及びポジティブ（血小板由来の血管形成因子）のコントロー ルに比較したときのＷｏｈｌ　１−８ペプチド（ＰＩ−Ｐ８に相応）の血管形成 活性を示す棒グラフ。

第４図。ペレット移植に向かう毛細管の成長を示すダイアグラム。

第５　（Ａ−Ｂ）図。７日目（５Ａ）及び１４４日目５Ｂ）におけるＰ−１（Ｏ μｇ／ｍｌ、　１０μｇ／ｍｌ及び３０μｇ／ｍｌ）の損傷治療作用を示す棒グ ラフ。

第６図。１４４日目おけるＰ−１（０μｇ／ｍｌ、　ＩＯμｇ／ｍｌ、　３０μ ｇ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌ）の損傷治療活性を示す棒グラフ。

５、発明の詳細な説明 限定するのではなく、発明の明確化のために、以下のサブセクションにおいて発 明の詳細な説明がなされる：（ｉ）血小板第４因子の製造； （ｉｉ）本発明のペプチド及びその製造：（ｉｉ）血管形成ペプチドの同定；及 び（ｉｖ　）本発明の有用性 ５．１．　血小板第４因子の製造 血小板第４因子（ＰＦ４）は、当該分野で既知のいずれかの方法を使用して、精 製しうる。本発明の好適な態様において、ＰＦ４はメディチイ　（Ｍｅｄｉｃｉ ）らにより記載された方法を改善したものにより、トロンビン活性化血小板抽出 物より精製しうる（１９８９゜Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、　Ｒｅｓ、　５４：２７７− ２８７）。ＰＦ４は、１．７　Ｍ　ＮａＣ１で因子を溶出するヘパリンセファロ ースアフィニティークロマトグラフィーにより、次いで約１５％のアセトニトリ ルの存在下におけるＮａＣ１で溶出されたポリスルホエチルーアスパルタミドカ ラム上での強陰イオン交換クロマトグラフィーにより、及び最後に約Ｏ９１％の トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）水溶液中のアセトニトリルの線形勾配により溶 出されたＶｙｄａｃ　ＲＰＣａ逆相ＨＰＬＣ分析カラム上における分離により単 離しうる。

５．２．　本発明のペプチド及びその製造本発明のペプチドは、（ｉ）第２図に 示したアミノ酸配列のＰＦ４の少なくとも４アミノ酸部分、又は機能的に同等な 配列、又は（ｉｉ）第２図に示したＰＦ４配列の一部に少なくとも６６％相同で ある少なくとも６アミノ酸配列、又は機能的に同等な配列のいずれかを含むペプ チドを含有する。相同であることは、本明細書では、個々のペプチドにより共有 されるアミノ酸残基間の同一性を表すものとして理解されるへきである；例えば 、ＰＦ４の６アミノ酸断片に６６％相同である６アミノ酸残基のペプチドは、必 ずしも互いに連結しない４個のアミノ酸残基をＰＦ４断片と共存する。

本発明の好適な態様において、ペプチド又はペプチド誘導体は、Ｔｈｒ−３ｅｒ −Ｇｉｎ及び／又はＶａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ　、及びより好適には、Ｔｈｒ−Ｔ ｈｒ−３ｅｒ−Ｇｌｎ及び／又はＶａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇの配列を含む 。

本発明のペプチドは、ＰＦ４にほとんど又は全く相同ではない部分を含んでいて もよい。更に、これらのペプチドは、限定されるものではないか、炭水化物、脂 質、リン酸、澱粉、抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂｚ、酵素、アミノ酸、ペプチド又は成 長因子化合物を含む、他の化合物に結合させることにより、誘導体とすることか できる。

第２図に示されたＰＦ４のアミノ酸配列又は機能的に同等な配列は、ＰＦ４配列 か（ｉ）第２図に示した配列又は（ｉｉ）第２図に示した配列であるが、成る残 基がサイレント変化を生ずる機能的に同等のアミノ酸により置換さねたもののい ずれかでありうることを意味するものと解釈されるべきである。例えば、配列内 の１又は複数のアミノ酸残基は、機能的に同等に作用する類似の極性をもつ他の アミノ酸により置換させ、サイレント変化を生じさせることかできる。配列内の アミノ酸の置換は、そのアミノ酸か属するクラスの他のメンバーから選択しうる 。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン 、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含ま れる。極性の中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システィン、チ ロシン、°アスパラギン及びグルタミンを含む。正に荷電された（塩基性）アミ ノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれる。負に荷電された（酸 性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸か含まれる。

すへての場合において、本発明のペプチドは以下の第５゜３節で定義される血管 形成作用を示す。

本発明のペプチドは、当該分野で既知のいずれかの方法により製造しうる。例え ば、限定されるものではないが、ペプチドは（ｉ）ＰＦ４　（これに限定されな い）のような大きなペプチドからの開裂により；　（ｎ）組み換えＤＮＡ発現方 法により；及び（ｉｉ）バラ＝　（Ｂａｒａｎｙ）及びメリーフィールド（Ｍｅ ｒｒｉｆｉｅｌｄ）により記載された固相法（１９８０年、　“ペプチド”第２ 巻、　Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｉｅｎ−ｈｏｆｅｒ編、アカデミツクプレス、Ｎ、Ｙ 、）を含む化学合成により合成し得る。

本発明の好適な特定の態様において、ＰＦ４ペプチド断片を製造するために、Ｐ Ｆ４のトリプシン消化を行うことができる。例えば、第５．１節で述べたように して製造された、凍結乾燥したＰＦ４は、微量遠心分離管内でｐＨ＝９にて０． ４ＭのＮａ、ＣＯ，／　８　Ｍ尿素の５０μｍ中に溶解させることができる。次 いで、このタンパク質は、５０°Ｃにて、約１５分間、ｐＨ＝８で、緩衝液中の 約４５ｍＭジチオトレイトールを添加することにより、還元しうる。このタンパ ク質は、次いて、０．５　Ｎ　ＮａＯＨ中のヨード酢酸５μｌを添加し、室温で 暗所にて約１５分間インキュベートすることによりカルボキシメチル化され得る 。約１４０μｌの脱イオン水及び配列決定用グレードのトリプシン（２００ｕ　 ｇ／ｍｌ）の１　ｍＭ　ＨＣＩ溶液５μｌを添加し、試料を３７°Ｃて約２４時 間インキュベートし得る。得られたトリプシン消化物は、次いで、相応の逆相ク ロマトグラフィーカラム、例えば、２．７％アセトニトリル１０．１％Ｔ　Ｆ　 ＡｌＢ１２て平衡させたＶｙｄａｃ　ＣＩ８カラム内に注入し、相応の流速、例 えば０．５ｍｌ／分でクロマトグラフを行い、１．０分画分を集めることができ る。溶出プログラムは、例えば、緩衝液Ａ（０，１％ＴＦＡの水溶液）中の２． ７％緩衝液Ｂ（９５％アセトニトリル）を約１０分間、及び約２７〜９５％緩衝 液Ｂ勾配を１２３分とすることかできる。ペプチドの溶出は、２１０ｎｍの波長 において分光光度計によりモニターしうる。好適には、ベックマンシステムゴー ルドＨＰＬＣシステムを、タンパク質及び消化物の両方のクロマトグラフィーの ために使用しうる。

上記の例として記載したクロマトグラフィーのプロトコールを使用すると、Ｗｏ ｈｌｌがペプチド番号４として溶出することが期待される（下記第６節参照）。

本発明に従って、ＰＦ４のペプチド断片は適宜化学的に修飾でき、次節に記載さ れるように血管形成作用について試験される。

５．３．　血管形成ペプチドの同定 上記したペプチドは、血管形成活性について因子を評価するだめの、当該分野で 既知のインビトロ又はインビボのアッセイシステムを使用することにより、血管 形成活性を有することを決定し得る。血管形成活性という語は、（ｉ）新しい血 管の形成を引き起こす及び／又は（ｉｉ）内皮細胞を引き寄せる（ａｔｔｒａｃ ｔ）能力に言及するものと、本明細書においては解釈されるべきである。

特定の態様において、ペプチドは例えば下記第６節に記載するように、内皮細胞 化学定性アッセイを使用して、血管形成活性を試験し得る。かかる方法によれば 、特定のペプチドに応答する内皮細胞の移動は、多孔膜への内皮細胞の移動を検 出することにより測定しつる。

例えば、内皮細胞の移動は、パンダ（Ｂａｎｄａ）らに記載されたような方法（ １９８２，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７９．７７７３− ７７７７、参考までに本明細書中に取り入れる）でアッセイしうる。この方法に よれば、試験されるペプチド溶液はウサギ血小板の乏しい１０％のプラズマ血清 を補充したダルベツコ修飾イーグル培地中で約ｌ：１０に希釈し、ボイデン（Ｂ ｏｙｄｅｎ）ブラインド−ウェルチャンバーの底部に置かれる。次に、ゼラチン で被覆した１０μｍの孔径を有するポリカルボネートフィルター（ヌクレオボア ー社から購入可能なもの）を試験溶液の上に置き、血小板に乏しい１０％血清を 加えｔ−ダルベツコ修飾イーグル培地に懸濁させた内皮細胞を上部コンパートメ ントに加え、このチャンバーを３７℃で約７時間インギュベートさせる。インキ ュベーションの終了後に、フィルターの頂部をきれいにふき、フィルターを固定 、染色し、そして、フィルターの底部側面に移動した細胞の数を計算することに より評価する。

他の態様において、ペプチドはインブラント中に含まれる本発明のペプチドに応 答するインビボの血管形成を試験するインビボアッセイを使用して、血管形成活 性を試験しうる。特定の態様によれば、ウサギの角膜インブラントアッセイ（Ｒ Ｃ［Ａ）方法が使用できる　（Ｇｉｍｂｒｏｎｅら、１９７４．　Ｊ、　Ｎａｔ ｌ、　Ｃａｎｃｅｒ、Ｉｎ５ｔｉｔ、　５２：４１３゜これは参考として全部分 が本明細書にとり入れられる）。ＲＣＩＡにおいて、試験すべきペプチドは、ヒ ドロン、メタクリレートポリマーのような不活性の媒体と混合し、次いて乾燥さ せる。得られたペレットは、次に、上縁部から２〜３ミリのウサギの角膜中に移 植させる。もし試験したペプチドが血管形成性であれば、毛管の成長は上縁部か ら開始され、移植体に向けて成長することが期待し得る。ＲＣＩＡ法の記載は、 下記第７節でなされる。

５．４．　本発明の有用性 本発明は、血管形成を促進させるために使用し得るＰＦ４に関係するペプチド及 びペプチド誘導体、及び、増大した血管形成より利益が得られる患者を治療する ための方法を提供する。本発明は、血管形成活性を示すＰＦ４に関連するペプチ ド又はペプチド誘導体の有効量を組織にさらすことから成る、組織の血管形成を 引き起こす方法を提供する。治療方法は、かかる治療が必要な患者に本発明のペ プチドの有効量を投与することを含む。ペプチドの投与量は、全身又は局所的に なし得る。投与方法は、限定されるものではないが、静注、筋肉内、皮下、鼻内 、口腔内又は他の適当な態様を含む。本発明のペプチドは、いずれかの適当な薬 剤担体とともに投与しうる。成る状態においては、ペプチドの持続的な放出が達 成されるように移植体に含まれた本発明のペプチドを投与することが望ましいか もしれない。

増大した血管形成から恩恵を受ける患者は、全身的又は局所的部位のいずれかの 動脈並びに静脈の血管不全を被っている患者を含む。具体的には、糖尿病又はア テローム性動脈硬化症又は微少循環系の異常を被っている患者が含まれる。血管 形成ペプチドによる治療で恩恵を受ける顕著な部位は、限定するものではないが 、四肢、心臓及び脳血管系である。本発明の血管形成ペプチドは、殊に、糖尿病 における偏部の治療の促進のために有効であろう。

本発明の血管形成ペプチドは、また、血管の弱体化を被っている又は被っていな い患者において傷の治療を促進するために使用しうる。例えば、傷の治療は一般 に、外科手術患者、外傷の患者、やけどの患者又は、心筋梗塞を含む心血管系へ の損傷、又は外傷又は梗塞のような中枢神経系の傷害又は末梢神経系の損傷を含 む神経系に対する傷を有している患者において促進させることができる。本発明 のペプチドは、例えば、を髄の傷害の治療において使用しうる。ペプチドは、又 、例えば痩痕の再生におけるように、傷の治療から生ずる化粧的外観を改善する ために使用しつる。本発明のペプチドは、急性並びに慢性的な治療において使用 しうる。

かかる血管形成ペプチドは、改善された血管の潅流を組織に与えることにより、 移植された組織片のとり込みを促進する際にも使用しうる。それゆえ、本発明は 移植組織を有効量の血管形成ペプチドにさらすことによる、移植組織の同化を促 進するための方法も提供する。

本発明の血管形成ペプチドは、ヒト並びに動物の治療のために使用しうる。

本発明は、また、血管形成を阻止する、本発明の血管形成ペプチドに構造的に関 連するペプチドの開発を企図するものである。

かかる抗血管形成ペプチドは、増大した血管形成の異常を治療する際に、又は、 悪性腫瘍、血管腫及び内皮血管腫、リウマチ性関節炎及び乾癖のように、血液供 給又は血管形成を限定することが望ましい治療において有用であろう。

ＰＦ４は、メディチらにより記載された方法の改良法により、トロンビン−活性 化血小板抽出物から精製された（１９８９．　Ｔｈｒｏｍｂｏｓ、Ｒｅｓ、　５ ４：２７７−２８７）。Ｐ　Ｆ　４は、ヘパリンセフ７０−スアフィニティクロ マトグラフィーにより、１．７ＭのＮａＣ１でその因子を溶出し、次いて強力チ オン性交換クロマトグラフィーにより、ポリスルホエチルーアスパルタミドカラ ム上で１５％のアセトニトリルの存在下にてＮａ、ＣＩで溶出し、最後にＶｙｄ ａｃ　ＲＰＣ４逆相ＨＰＬＣ分析用カラム上、０、＋９６ＴＦＡ水溶液中の線形 アセトニトリル勾配で溶出して単離された。

６．１．２．　ＰＦ４のトリプシン消化トリプシン消化は、微量遠心分離管にお いて凍結乾燥されたＰＦ４を５０μｌの０．４　Ｍ　Ｎａ＊ＣＯａ／　８　Ｍ尿 素（ｐＨ９，０）に溶解させて実施した。次に、タンパク質は、５０℃で１５分 かけてｐＨ９，０の緩衝液中の５μｌの４５ｎ＋μＤＴＴを添加することにより 還元した。タンパク質は、０．５　Ｎ　ＮａＯＨ中の５μｌヨード酢酸を添加し てカルボキシメチル化し、室温で暗所にて１５分間インキュベートした。最後に 、脱イオン水１４０μｌ及び配列決定用の等級のトリプシンの１ｄＨＣ１溶液（ ２００、ｌ／ｍ））　５　、ｃｚｌを添加し、試料を３７℃で２４時間インキュ ベートした。

トリプシン消化物は、２．７％アセトニトリル１０．１％ＴＦＡ／Ｈ，０で平衡 化したＶｙｄａｃ　Ｃｐｓカラムに注入し、０．５　ｍｌ／分の流速でクロマト グラフを行い、１．０分毎の両分を集めた。溶出パターンは次のとおりであった ：緩衝液Ａ（０，１％ＴＦＡの水溶液）中の２．７％緩衝液Ｂ（９５％アセトド ニトリル）を１０分間、２．７％〜９５％Ｂを１２３分（第１図を参照）。ペプ チド溶出は２１０ｎｍでモニターした。ベックマンシステムゴールドＨＰＬＣシ ステムをタンパク質及び消化物のクロマトグラフィーのために使用した。

ウサギの傷ついた毛細管内皮細胞（ＲＷＣＥ）を３−４ブリマリア（Ｐｒｉｍａ ｒｉａ、　Ｆａｌｃｏｎ　１３８２４）　７５ａ＋ｆフラスコ上で６０〜８５％ の集密度になる迄増殖させた。アッセイの約２０〜２４時間前に、媒質を除去し 、フラスコをＣａ／Ｍｇを含まないハンクスの平衡塩類溶液で２回ブミン１２〜 １５ｍ１を各フラスコに加え、培養物を１晩維持した。翌日、ラクトアルブミン ／媒質をフラスコから除去し、細胞を６〜１０ｍ１の１（ＢＳＳで洗った。次に 、ＨＢＳＳ　（Ｃａ／Ｍｇ不含）ｉＩ！当たり２×１０’ＫＵ　ＤＮＡａｓｅ　 （約１００ｍｇ）及びＩ　Ｘ　ＩＯ’Ｕのコラゲナーゼ（約３３５ｍｇ）から成 る酵素カクテル中で室温にて細胞を１４分間インキュベートすることにより、内 皮細胞をフラスコから取り出した。次に、細胞をフラスコの底部からはぎとり、 ０．２％ラクトアルブミン／Ｍ１９９媒質中で遠心分離することにより洗浄した 。生存細胞の数は、トリバンブルー排除による移動アッセイの前に決定した。

６、１．３．２．　フィルターの調製 実験においては、ヌクレオボア（Ｎｕｃ　１ｅｏｐｏｒｅ）ポリプロピレンフィ ルター（８，０ａ　ｍ孔、ＰＶＰＦ、　Ｎｅｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅ社から）を使用 した。フィルターの一面はフィブロネクチン溶液でコーティングした（ＨＢＳＳ 　１ｍｌ当たりｌμｇフィブロネクチン：ペトリ皿に溶液を入れ、次いでフィブ ロネクチン溶液上に置くことにより各フィルターをコーティングするために、３ 〜４ｍｌが使用された）。

６、１．３．３．　チャンバーの調製 ニューロプローブ４８　（Ｎｅｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅ　４８）ウェル化学走性チャ ンバー（Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ　Ｃｈａｍｂｅｒ）を実験に使用した。約２６μ ｍの容積の試験ペプチドを下部室のウェルに添加した。フィブロネクチンでコー ティングされ、上述のように調製されたフィルターを、次いで、底部ウェル上に 置いた。次に、上部チャンバーがとりつけられ、内皮細胞懸濁液（０，７５Ｘ１ ０＠細胞／ｍｌ）を上部チャンバーの大部分のウェルに添加した；残りのウェル はコントロールとして細胞を含まない媒質で充填した。次に、チャンバーは５％ ＣＯ□の湿潤雰囲気下で３７°Ｃにて４時間インキュベートした。

６、１．３．４．　フィルターの取りはずし及びふき取りフィルターを装置から 取りはずした。もし底部チャンバーが血管形成ペプチドを含んでいる場合には、 頂部層からの細胞はフィルターへ、及びそれを通って移動するであろう。しかし ながら、単にフィルターに付着しただけの非移動細胞は除去しておく必要かあっ た。それゆえ、細胞を含有するチャンバーに接触していたフィルタ一部分は、リ ン酸緩衝液（ＰＢＳ）でぬらし、細胞のふき取り用の刃でその表面をきれいにし た。その時点で移動した細胞を実質的に含有していたフィルターは、１晩乾燥さ せ、ロイコスタット（Ｌｅｕｋｏｓ　ｔａｔ　：　フィッシャー）で染色し、フ ィルターの部分の吸光度をデンシトメーターを用いて読みとった。デンシトメト リー追跡時の相対的な増加は、より多くの細胞移動の指標であり、それゆえ、対 応する下部チャンバーに含まれている試験ペプチドの血管形成活性の指標であっ た。

６．２．　結果及び考察 ペプチド４は、ポートン（Ｐｏｒｔｏｎ）　２０９０ｅ配列決定装置において、 ポートン専有のペプチドサポート上に吸着させた後に、配列決定された。ペプチ ドの配列は次のとおりであった：　Ｔｈｒ−２７，５ｐｍ。

Ｔｈｒ−２３，５ｐｍ、　５ｅｒ−３０，０ｐｍ、　Ｇｌｎ−２６，５ｐｍ、　 Ｖａｌ−２２，６ｐｍ、　Ａｒｇ−１０，５ｐｍ。

Ｐｒｏ−９，２ｐｍ、　Ａｒｇ〜４．７ｐｍ、ベックマンダンシルクロリド法を 使用するアミノ酸分析により、ペプチドの全配列が確認された。より一層矛盾の ない結果は、毛細管の内皮細胞化学走性アッセイよりもギムブロン（Ｇｉｍｂｒ ｏｎｅ）ら（１９７４，Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　［ｎｓｔ、　５２： ４１３−４２７）及びランガー（Ｌａｎｇｅｒ）ら（１９７６、Ｎａｔｕｒｅ　 ２６３ニア９７−８００（下記第７節参照））の研究の後でモデル化されたウサ ギの角膜移植アッセイシステムを使用するときに観察された。我々の結果は、第 ３図で総括したデータに加えて、少なくとも６個の異なる実験において、＋２及 び＋３の血管形成応答（１〜４のスケールに対して）をもたらした。第３図は、 オリジナルのオクタペプチド（ペプチドｌ）、及びメリーフィールド法により合 成した７種のペプチド類縁体に関する結果を要約した（Ｂａｒａｎｙ及びＭｉｒ ｒｉｆｉｅＩｄ　（１９８０）、“ペプチド”第２巻、　Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｉ ｅｎｈｏｆｅｒ編、アカデミツクプレス、Ｎ、Ｙ、）。第３図の結果は、コント ロール移植体に比較して、すべてのペプチドが若干の血管形成応答を引き起こし たか、オクタペプチドｌ及びペンタペプチド６が炎症を生じない極めて強力かつ 特異的な血管形成応答を引き起こしたことを明らかに示している。

１０％ヒドロン、１％ポリエチレングリコール及び７０％エタノールの溶液を等 容積の試験ペプチドと混合することにより、移植用ベレットを調製した（５０μ Ｉヒドロン溶液：約５〜１０μｇのペプチドを含有する５０μｌのペプチド溶液 ）。得られた混合物を激しくうす巻き様に攪拌し、次いでプラスチックシート上 に２０μｌのアリコートを置き、脱水させて乾燥ベレットを形成させた。各ベレ ットは、約１又は２μｇの試験ペプチドを含有していた。

得られた移植体は、一般的な麻酔下に、上縁毛細管床（ｓｕｐｅｒｉｏｒｌｉｍ ｂｕｓ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｂｅｄ）から約２〜３　ｍｎのウサギの角膜内に 置いた。ベレットは毛細管床から１ｍｍ以内には置かなかった。

７　、１．３．血管形成の追跡 眼は、ベレット方向への毛細管の直接の成長を３．５及び７日目に調べ、第４図 に従って部類分けした（Ｇｉｍｂｒｏｎｅら、　１９７４．　Ｊ。

Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　［ｎｓｔ、　５２：４１３−４２７）。毛細管の成 長を記録するために、５及び／又は７日目に眼の写真を撮った。７日目に動物を 殺し、角膜の毛細管成長について（ヘマトキシリン及びエオシン染色で）組織学 的に検討した。

７．２．　結果及び考察 血管形成の目視検査により、７日目に毛細管の移動の度合に依存して、０から＋ ４までに評価した。血管形成指数（ＡＩ）は次式にて計算した ＡＩ＝（合計得点／ｎｘ８）Ｘ１００゜得点は観察された血管形成に対し次の数 値を割り当てることにより決定される： 陰性　〜０ ペプチドＷｏｈｌ　１−８の血管形成活性は、第１表に示されている。

ウサギ角膜移植アッセイ（ＲＣ［Ａ）において８個のペプチドの各々かコントロ ールの移植体よりもすぐれていることが観察され、ペプチドＷｏｈｌ−１及びＷ ｏｈｉ６は特に活性であることが判明した。

２．０μｇ／移槌体に比較したｌ。０μｇ／移植体の血管形成活性の組織学的評 価の結果は、第■表に示されている。１．０μｇ／移植体は、２．０μｇ／移植 体よりも一層高い血管形成指数を示すことが見い出された。

第　Ｉ　表 ペプチドの目視による血管形成活性 ペプチド　観察の数　血管形成指数 Ｗｏｈｉｌ　２４　４５ Ｗｏｈ１２　８　３４ Ｗｏｈ１３　７　３２ Ｗｏｈｉ４　８　２３ Ｗｏｈ１５　８　３６ Ｗｏｈｌ−６８４２ Ｗｏｈｌ−７８３１ Ｗｏｈ１８　７　３０ コント叶ル移植体　２４　１７ 第■表 Ｃ８−１の組織学的血管形成活性 ペプチド　観察の数　血管形成指数 １．０μｇ／移植体　１１　８４ ２．０μｇ／移植体　７５９ コン）０−ル移植体　１６　３１ ８、実施例：ラット切開モデルにおける傷治療活性以下の実験は、本発明のペプ チド投与が、実験動物モデル、即ち、正常なラットにおりる切開モデルにおいて 傷治療を促進する１、Ｏｍｌの牛コラーゲン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ　１００．　Ｃ ｏｌＣｏ１１ａ社、　Ｐａ１ｏ　Ａｕｔｏ。

ＣＡ）を一連の１２Ｘ７５ｍｍのポリプロピレン管に置き、１時間半凍結乾燥し た。一群の実験において、コラーゲン媒体は、ｐＨ７，０〜７．４のダルベツコ のリン酸緩衝液（ＤＰＢＳ）中１０．Ｏｕｇ／ｍｌ又は３０．０　μｇ／ｍｌの 濃度のＰ−１ペプチド１．ｏｍｌを含むように再調製された。実験の他の群にお いて、コラーゲン媒体はｐＨ７，０〜７．４のＤＰＢＳ中１０１ｔ　ｇ／ｍｌ、 ３０．０ｔｔ　ｇ／ｍｌ又は１００．０　μｇ／ｍｌの濃度のＰ−１ペプチドｌ 。

Ｏｍｌを含むように再調製された。コントロールについては、コラーゲン媒体は ｐＨ７，０〜７．４のＤＰＢＳ緩衝液１００μｌ中にて再調製した。相応の試験 物質のアリコート（１００μｌ）を調製し、実験動物に投与される迄氷上で保持 した。

８．１．２．　外科的方法 体重３００〜３５０ｇの正常のＳｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙｓラットをエーテ ルで麻酔した。その背部の毛をそり、７０％ＥＴＯＨ及びベタジン（Ｂｅｔａｄ ｉｎｅ）洗浄液で滅菌した。正中線の両側において、２つの６ｃｍの線形切開を 全厚１．５ｃｍで行った。

０日目に、ポジティブ置換ピペットを使用して、一方の切開の端部に１００μＩ の相応の試験物質を適用した。同様にして、他の切開に１００μＩのコントロー ル物質を適用した。切開口は４個の外科クリップで接合した（オートクリップ、 　Ｂｅｃｈｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社のＣ１ａｙ　Ａｄａｍｓ　Ｄｉｖｉｓ ｉｏｎ、　Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、　Ｎ、Ｊ、）。

動物を囲いに入れ、通常の方法で飼育した。手術後、７．１４又は２１１日目動 物を殺し、切開の破壊強さくｂｒｅａｋｉｎｇ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ）及び引張強 さくｔｅｎｓｉｌｅ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ）を測定した。

８．１．３．　引張強さの測定 動物は過剰のエーテルにより安楽死させ、背部の皮膚全体を摘出した。切開の端 部から０．５ｃｍのところから始めて、１．０　ｃｍ増加ごとに印をつけ、各端 部に０．５ｃｍ残した。１．　Ｏｃｍの小片を切り取り、反対側の切開の対応す る小片と対を形成しうるように印をつけた。各切開から得た４〜５の小片を、引 張強さか測定される迄４°Ｃてリン酸緩衝液に貯蔵した。動物が死んでから２〜 ３時間以内に試料の試験を行った。

５０ｋｇの容量のトランスデユーサ−を有するインストロン張力計（モデル１０ １１．インストロム（Ｉｎｓｆｒｏｍ）社、　Ｐａｒｋ　Ｒｉｄｇｅ、［Ｌ）を 使用して、傷の破壊強さ又は引張強さについて、試料を試験した。試料は適所で クランプし、４　ｍｍ／分のスピードで引っ張った。データは、チャートリコー ダ−を使ってチャート速度５．０　ｃｍ／分、感１１ｊ１．Ｏボルトて記録した 。

８．２．　結果及び考察 破壊又は引張強さくダラムで示す）は、張力計を使用して、得られたグラフの最 高の高さから計算した。データは次いて、独立した観察についてのＴテスト及び 対合のＴテスト（ｐａｉｒｅｄ　Ｔ　Ｔｅ５ｔ）を使用して統計的に分析した。

結果は、第５図（Ａ及びＢ）及び第６図に示されている。

第５図（Ａ及びＢ）に示されているように、切開の傷は、１．０μｇのペプチド ｐ−ｔで処理した動物又はブラノールのコントロールに比較して、切開当たり３ ．０μｇのペプチドＰ−１で処理した動物においてより急速に治療された。傷の 引張強さは、切開後７日目及び１４４日目おいて測定した時、より大きかった。

傷治療の最大の促進は、ブラシーボコントロールと比較した時１４４日目記録さ れた。

第６図に示されるように、ペプチドＰ−１は、切開当たり３．０μｇ及び１０μ ｇの濃度で投与すると、傷の治療を増大させた。引張強さは、切開後１４４日目 測定した。切開当たり３．０μｇの用量は、引張強さを改善する際に最も活性で あるように見えた：しかしながら、切開当たり１０．０μｇの用量はほぼ同程度 に活性であった。

結果は、本発明のペプチドＰ−１が、ヒトに投与される用量に相当する濃度で、 ラットの切開モデルにおいて傷の治療を増大させる点て活性であることを明らか に示している。ペプチドＰ−１の効果的な用量の単独投与は、ラットの切開モデ ルにおいて治療を促進するために十分に活性である。これらの観察は、促進され た治療及び／又は血管形成を必要とする病的状態において本発明のペプチドを治 療のために使用しうろことを実証している。

本発明は、上述の態様に特に言及して詳細に記載した。しかしながら、本発明は 、本発明の例示として意図され、開示された態様の範囲に限定されるべきてない ことは理解される。

実際、本明細書で示され、そして記載されたものに加えて、本発明の種々の修飾 が前述の記載から当業者に対して明らかになるてあろう。かかる修飾は、本発明 の特許請求の範囲内に入ることが意図される。

本明細書では種々の参考文献が引用された：これらはすべて参照によりここに引 用されるものとする。

ふ ←− 〇　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ ＆＋−＆＋−− ｇ＞　ＣＬ　ＣＬ　Ｃ３−ＣＬ　よ −〜　ｆ’ｎ−！　Ｌ１＋１　ｓａ　？−ψＭ５ＳＡＡＧＦＣＡＳＲＰＧＬＬＦ ＬＧＬＬＬＬＰＬＶＶＡＦＡＳＡＥＡＥＥＤＧＤＬＱＣＬＣＶＫＴＴＳＱＶＲＰ ＲＨＩ　ＴＳＬＥＶＩＫＡＧＰＨｃＰＴＡＱＬ　ＩＡＴＬＫＮＧＲにＩ（ＬＯＬ ＱＡＰＬＹＫＫＩＩＫにＬＬＥＳ 三文字略号　−文字記号 １（ｅｌ ０　０　０　。

■　Ｎ　ｏｔｎ　♀　呂　８　９！　。

稀指凛須昌叩 ＦＩＧ、４ ○ 「−一一一一一一−−−−−ム［ ０１Ｓ−／−１４；ｆ±”７Ｉ：Ａ）　１９３８国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ダフ、ロナルド　ジー。

アメリカ合衆国　１１９４０　ニューヨーク州イースト　モリチェス、インレッ ト　ビュー　バス　６７

Claims (41)

【特許請求の範囲】
1. １．血管形成活性を示す血小板第４因子に関連したペプチドまたはペプチド誘導 体。
2. ２．（ｉ）図２に示した配列に含まれるアミノ酸配列を有する４アミノ酸ペプチ ドまたは機能的に均等な配列を含み、かつ（ｉｉ）血管形成活性を示す、ペプチ ドまたはペプチド誘導体。
3. ３．（ｉ）図２に示した配列に含まれるアミノ酸配列と少なくとも６６％相同で ある６アミノ酸配列または機能的に均等な配列を含み、かつ（ｉｉ）血管形成活 性を示す、ペプチドまたはペプチド誘導体。
4. ４．配列Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎを含む、請求項１、２または３記載のペプチド またはペプチド誘導体。
5. ５．配列Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを含む、請求項１、２または３記載のペプチド またはペプチド誘導体。
6. ６．アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａ１−Ａｒｇ−Ｐｍ−Ａ ｒｇを有するか、またはその誘導体である、請求項１記載のペプチドまたはペプ チド誘導体。
7. ７．アミノ酸配列Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ− Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを有するか、またはその誘導体である、請求項１記載の ペプチドまたはペプチド誘導体。
8. ８．アミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを有するか 、またはその誘導体である、請求項１記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
9. ９．アミノ酸配列Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを有するか、またはその誘導 体である、請求項１記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
10. １０．アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ−Ｈｉｓ−ｌｌｅ−Ｔｈｒを有するか、またはその誘導体である、請求 項１記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
11. １１．アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌを有するか、また はその誘導体である、請求項１記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
12. １２．アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−ＧｌｒＶａｌ−Ａｒｇを有するか、または その誘導体である、請求項１記載のペプチドまたはペプチド誘導体。
13. １３．アミノ酸配列Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−ｌｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ −Ｌｙｓを有するか、またはその誘導体である、請求項１記載のペプチドまたは ペプチド誘導体。
14. １４．製剤上適当な担体中に請求項１のペプチドまたはペプチド誘導体を含有す る医薬組成物。
15. １５．製剤上適当な担体中に請求項２のペプチドまたはペプチド誘導体を含有す る医薬組成物。
16. １６．製剤上適当な担体中に請求項３のペプチドまたはペプチド誘導体を含有す る医薬組成物。
17. １７．製剤上適当な担体中に請求項４のペプチドまたはペプチド誘導体を含有す る医薬組成物。
18. １８．製剤上適当な担体中に請求項５のペプチドまたはペプチド誘導体を含有す る医薬組成物。
19. １９．製剤上適当な担体中に請求項６のペプチドまたはペプチド誘導体を含有す る医薬組成物。
20. ２０．製剤上適当な担体中に請求項７のペプチドまたはペプチド誘導体を含有す る医薬組成物。
21. ２１．製剤上適当な担体中に請求項８のペプチドまたはペプチド誘導体を含有す る医薬組成物。
22. ２２．製剤上適当な担体中に請求項９のペプチドまたはペプチド誘導体を含有す る医薬組成物。
23. ２３．製剤上適当な担体中に請求項１０のペプチドまたはペプチド誘導体を含有 する医薬組成物。
24. ２４．製剤上適当な担体中に請求項１１のペプチドまたはペプチド誘導体を含有 する医薬組成物。
25. ２５．製剤上適当な担体中に請求項１２のペプチドまたはペプチド誘導体を含有 する医薬組成物。
26. ２６．製剤上適当な担体中に請求項１３のペプチドまたはペプチド誘導体を含有 する医薬組成物。
27. ２７．血管形成活性を示す、効果的な量の、血小板第４因子に関連したペプチド またはペプチド誘導体に組織をさらすことからなる、組織の血管形成を誘導する 方法。
28. ２８．（ｉ）図２に示した配列に含まれるアミノ酸配列を有する４アミノ酸ペプ チドまたは機能的に関連した配列を含み、かつ（ｉｉ）血管形成活性を示す、効 果的な量のペプチドまたはペプチド誘導体に組織をさらすことからなる、組織の 血管形成を誘導する方法。
29. ２９．（ｉ）図２に赤した配列に含まれるアミノ酸配列と少なくとも６６％相同 である６アミノ酸配列または機能的に均等な配列を含み、かつ（ｉｉ）血管形成 活性を示す、効果的な量のペプチドまたはペプチド誘導体に組織をさらすことか らなる、組織の血管形成を誘導する方法。
30. ３０．ペプチドまたはペプチド誘導体が配列Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎを含む、請 求項２７、２８または２９記載の方法。
31. ３１．ペプチドまたはペプチド誘導体が配列ＶａＩ−Ａｒｇ−Ｐｒｏを含む、請 求項２７、２８または２９記載の方法。
32. ３２．ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて行われる、請求項２７、２８または２９記載の方 法。
33. ３３．ヒト患者において行われる、請求項３２記載の方法。
34. ３４．患者が血管不全を有する、請求項３３記載の方法。
35. ３５．患者が糖尿病をわずらっている、請求項３３記載の方法。
36. ３６．糖尿病患者において創傷癒合を促進するために用いられる、請求項２７、 ２８または２９記載の方法。
37. ３７．加圧性潰瘍の創傷癒合を促進するために用いられる、請求項２７、２８ま たは２９記載の方法。
38. ３８．心筋梗塞の創傷癒合を促進するために用いられる、請求項２７、２８また は２９記載の方法。
39. ３９．神経系の損傷において創傷癒合を促進するために用いられる、請求項２７ 、２８または２９記載の方法。
40. ４０．熱傷患者において創傷癒合を促進するために用いられる、請求項２７、２ ８または２９記載の方法。
41. ４１．瘢痕の修正において創傷癒合を促進するために用いられる、請求項２７、 ２８または２９記載の方法。