JPH06503465A - 髄膜炎菌のクラスｉの外膜タンパク質のワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 バクテリアの髄膜炎は、軟膜炎の中またはそれに隣接するバクテリアの生長によ り引き起こされる中枢神経系の炎症の病気である。髄膜炎は、子供および若い大 人に影響を与える急性感染症であり、そして他の因子のなかでも、他のバクテリ アおよびウィルスの病原体を包含する髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉ ｎｇｉｔｉｄｉｓ）により引き起こされる。

髄膜炎菌は、莢膜または細胞壁の抗原の存在に依存して、血清学の群に細分され る。現在認識されている血清群は、血清凝集により分離されるように、ＡＳＢ、 、Ｃ，Ｄ、Ｗ−１、ｘ、ｙＳｚ、および２９Ｅを包含する。群Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｗ− １３５およびＹの血清群の特異せの原因となる多糖類は精製された。

髄膜炎菌についての保菌者の割合は、病気の発生より非常に高い。ある人は一時 的保菌者であるが、他の人は慢性の保菌者であり、多少連続的にあるいは時々の 方法で髄膜炎菌を放出する。髄膜炎菌の保菌者の状態は、免疫化のプロセスであ り、そしてコロニー化の２週以内に、髄膜炎菌に対する抗体の産生は同定するこ とができる。バクテリアの抗体は莢膜の多糖類および他の細胞壁の抗原の両者に 対する向けられるように思われる。

研究において、骨髄炎菌の外膜は３〜５の主要なタンパク質を有し、主な４１． ０００Ｍｒまたは３８．０００Ｍｒのタンパク質は血清型特異的抗原決定基を有 することが示された。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドの電気泳動 ゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上の外膜タンパク質のプロフィルにおいて、かなりな 程度の菌株間の異質性が存在する。

ペプチドのマツピングの鎖により定められるように、タンパク質は普通のペプチ ド構造に基づいて５つのクラス、１〜５と表示する、からなる。

異なる血清型の構造の間である程度共有される４６．０００ＭｒのクラスＩのタ ンパク質に対して、バクテリアのモノクローナル抗体が産生された。［フラッジ （Ｆｒａｓｃｈ）　、Ｃ，Ｅ、ら（１９８５）ｐ、６３３、「骨髄炎菌のワクチ ンにおける新しい発展（Ｎｅｗ　Ｄｅｖｅｌ。

ｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ）Ｊ　、 Ｇ、　Ｋ、スターツルニク（Ｓｃｈｏｏｌｎｉｋ）ら（編）、病原性ナイセリア １ｆ（Ｔｈｅ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｎ１５ｓｅｒｉａ）アメリカン・ソサイ アティ・フォー・マイクロバイオロジー（Ａｍｅ　ｒ　１ｃａｎ　５ｏｃｉｅｔ ｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤ、Ｃ，］。

群Ａ、Ｃ，Ｗ−１３５またはＹの骨髄炎菌の莢膜多糖類を使用して、有機体に対 するワクチンが開発された。これらのワクチンは短い期間有効であったが、それ らは免疫学的メモリーを誘発せず、そして被検体はほぼ３年以内に再びワクチン 接種してそれらの抵抗性を維持しなくてはならなかった。群Ｂの多糖類は免疫原 性に劣り、そして首尾よいワクチンは産生されなかった。低い活性についての可 能な説明は、ヒトの組織、例えば、脳において見いだされた交差反応性抗原によ り誘発される群Ｂの多糖類に対する耐性であった。さらに、研究において、群Ｂ の骨髄炎菌の病気を有した患者の回復期の血清中のバクテリアの抗体の大部分は 外膜タンパク質に対して向（ブられる。

１ｆｆＢの髄膜炎菌の病気に対シ、て保護するためのワクチンは開発され、ここ で外膜タンパク質（ＯＭＰ）の非共有結合の複合体および群Ｂの多糖類が投与さ れた。ベウベリイ（Ｂｅｕｖｅｒｙ）ら（１９８３）インフェク７／ヨシ・アン ド・イミュニイー（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、）４０　：　３６９−３８０ｏ Ｌかしながら、Ｂ多糖類は一時的ＩｇＭ抗原の応答を誘発し、この応答は免疫保 護を与えない。さらに、菌株毎に髄膜炎菌の外膜タンパク質において大きい抗原 の多様性および変動性が存在する。さらに、リポ多糖類はＯＭＰの中に存在し、 そして同様によく抗原の変動性を示す。

とくに乳児および大人において、感染からの免疫性を提供する髄膜炎菌の病気に 対して、安全なかつ有効なワクチンが要求されている。

発明の要約 本発明は、分離した外膜の小胞（ＯＭＶ）　、髄膜炎菌ＣＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　 ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の実質的に純粋なされたクラスＩの外膜クンパ′！ 質（ＯＭＰ）　、クラスＩのＯＭＰの断片および髄膜炎菌、＼　ｍｅｎｉｒ＋ｇ ｉｔｉｄｉｓ）に対するバクテリアの抗体と反応性の連続または不連続の、免疫 原性および保護的エピトープを含有する、クラスＩのＯＭＰから誘導されたオリ ゴペプチド、および髄膜炎菌（Ｎｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対するワクチン 接種のための分離したＯＭＶ、髄膜炎菌のクラス■のＯＭＰ、断片またはオリゴ ペプチドに関す分離したＯＭＶ、髄膜炎菌のクラスＩのＯＭＰ、それから誘導さ れた断片またはオリゴペプチドは、１価または多価のサブユニットのワクチンを 単独で、混合物で、あるいは化学的接合体または遺伝子の融合体として使用する ことができる。好ましいワクチンにおいて、異なる疫学的に関連する髄膜炎菌株 を使用する。さらに、分離したＯＭＶ、クラス■のＯＭＰ、断片またはオリゴペ プチドは髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の他の抗原と組み合わせて （混合物、融合体または接合体として）使用することができる。例えば、それら は髄膜炎菌（Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の莢膜のポリマーまたはオリゴ マー（またはそれらの断片）と組み合わせるか、あるいは異なるサブタイプのク ラスＩの外膜タンパク質（またはそれらのエピトープ）と組み合わせて使用する ことができる。さらに、それらは他の感染性バクテリア、ウィルス、真菌または 寄生体の抗原とともに用途することができる。クラスＩのＯＭＰのＴ細胞のエピ トープは、また、定められ、そしてこれらは他のワクチン成分と組み合わせて使 用して、ワクチンに対する保護的免疫応答を増強することができる。

本発明は、分離したＯＭＶ、クラスＩのＯＭＰ、断片およびオリゴペプチドを産 生ずる方法、およびそれらを含有する種々のワクチン１合物に関する。分離した ＯＭＶのクラスＩのＯＭＰは、クラス２／３の外膜タンパク質を発現しない、突 然変異の髄膜炎菌株により産生ずる二とができる。断片は臭化シアンの切断およ び引き続く精製により産生ずることができる。分離したＯＭＶ、クラス■のＯＭ Ｐ、断片およびオリゴペプチドは、組み換えＤＮＡ技術、化学的合成または化学 的または酵素的切断により産生ずることができる。これらの材料は、引き続いて 、キャリ゛ヤーのへブチドまｊ−はタンパク質に、髄膜炎菌＜Ｎ、　ｍｅ　ｎ　 ｉ　ｎ　ｇ　１ｔｉｄｉｓ）の他の抗原に、あるいは他の微生物の抗原に、化学 的または遺伝子的カップリングにより接合または融合して、多価の抗原の接合体 または融合ペプチドまたはタンパク質を産生ずることができる。それらは接合の ために、例えば、アミノ酸の付加または他のカップリング基により修飾すること ができる。ワクチン接種のために、分離したＯＭＶ’。

クラス■のＯＭＰ、断片またはオリゴペプチドを記載した任意の形態で、必要に 応じて添加剤、例えば、アジュバントとともに製剤学的に許容されうる賦形剤中 で配合することができる。

本発明は、また、クラス■のＯＭＰ、断片またはオリゴペプチドをエンコードす る、分離し７た核酸に関する。核酸は、分離したＯＭＶ、クラスＩのＯＭＰ、断 片またはそれらから誘導された任意のオリゴペプチドを産生ずる、適当な発現系 の中に組み込むことができる。これらの核酸は、発現された融合ポリペプチドを 含有するワクチン配合物に対する免疫応答を増強するとき有用な、追加のポリペ プチドをエンコードする配列を含有するように、遺伝子の融合体として修飾する ことができる。さらに、髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉ　ｔ　１ｄｉｓ）のクラ スＩのＯＭ　Ｐは、他のゲラム陰性病原体のポリン（ｐｏｒｉｎ）タンパク質に 対してアミノ酸配列および構造が相同性であり、こうして本発明のクラス■のＯ Ｍ　Ｐ　、断片およびオリゴペプチドは他のグラム陰性病原体のためのワ、クチ ンの開発を可能とする。

図面の簡単な説明 第１図。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により髄膜炎菌のクラスＩの外膜タン パク質をエンコードする遺伝子の増幅の概要。

第２図。いくつかの髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔ　１ｄｉｓ）のサブタイプ のクラスＩの外膜タンパク質のＶＲＩ　（第１可変領域）をエンコードする５゛ 遺遺伝子列。

第３図。いくつかの髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のサブタイプの クラスＩの外膜タンパク質のＶＨ２（第２可変領域）をエンコードする３゛遺遺 伝子列。

第４図。菌株Ｐ１．７１６、Ｐｌ、１．６およびＰＬ、１５からのクラスＩのタ ンパク質の予測したアミノ酸配列をスバニング（ｓｐａｎｎｉｎｇ）する、固相 のデカペプチドとモノクローナル抗体との反応によるエピトープの走査。隣接す るデカペプチドは５アミノ酸残基だけ異なる。注解は、配列を誘導した菌株、使 用したｍＡＢおよびそのサブタイプの特異性を示す。

第５図。可変領域ＶＲＩおよびＶＨ２に相当するオーバーラッピングするデカペ プチドの系列とモノクローナル抗体との反応、隣接するペプチドは単一のアミノ 酸残基だけ異なる。注解は、配列を誘導した菌株、使用したｍＡＢおよびそのサ ブタイプの特異性を示す。

第６図。髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のクラス■のＯＭＰサブタ イプＰ１．７．１６の可変領域のエピトープを発現する組み換えフラジェリンの 構成。

第７図。髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔ　１ｄｉｓ）のクラスＩのＯＭＰサブ タイプＰ１．７．１６の可変領域のエピトープを発現する組み換えフランニリン の構造。

第８図。組み換えフラジェリンの高性能液体クロマトグラフィーの代表的なりロ マトグラム。

第９図。組み換えフランニリンのＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅによる代表的な 分析。

第１０図。ＣＲＭ、、、に接合した髄膜炎菌（Ｎ、Ｍｅｎｉｎｇｉ　ｔ　１ｄｉ ｓ）のクラスＩのＯＭＰのエピトープからなる接合体の代表的なウェスタンプロ ット分析。

第１１図。髄膜炎菌＜Ｎ、Ｍｅｎｉｎｇｉｔ　１ｄｉｓ）のクラスＩのＯＭＩ） ザブタイプＰ１．７．１６の推定上のコンフォメー／ヨン。

発明の詳細な説明 本発明は、分離したＯＭＶ、骨髄炎菌のクラスＩのＯＭＰ、ＯＰＭの断片（例え ば、臭化シアンの適用により調製した）および外膜タンパク質のエピトープを有 するオリゴペプチドからなるワクチン：クラス２／３の外膜タンパク質を発現し ない突然変異株を使用する、分離したＯＭ〜′、純粋なりラスＩの外膜タンパク 質の調製０組み換えＤ　Ｎ　Ａ発現ベクター中のクローニングしたＤＮＡの助け により分離した分かけての純粋なりラスＩの外膜タンパク質の調製に関する。本 発明は、また、分離したＯＭＶ、クラスＩのＯＭＰまたはその一部分、クラスＩ のＯＭＰの遺伝子の融合体、そのタンパク質またはエピトープを産生ずる目的で 遺伝子二二学の適用、および短いペプチドをもつエピトープは合成的に調製する ことができるので、ペプチド合成により多価のクラスＩの外膜ワクチンの調製に 関する。

髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質は、適当なサブタイプのエピトープを含有 する菌株が群Ａ、Ｂ、、Ｃ，Ｗ−１３５およびＹ菌株からのものであるどうかに 無関係に、菌株に対して強いバクテリアの免疫応答誘発ことが明らかにされた。

多糖類のワクチンは、はとんどの血清型に対して広い、広範な作用をもつワクチ ンとして、本発明によるワクチンにより増強または置換することができる。クラ スＩの外膜タンパク質に対して特異的な保護的バクテリアのモノクローナル抗体 は、切断された断片と、およびクラスＩの外膜タンパク質のアミノ酸配列を使用 して調製された短い合成ペプチドと強く反応する。髄膜炎菌の病気は現在おもに 群Ｂの髄膜炎菌により引き起こされるので、そして群Ｂの髄膜炎菌の中に存在す るクラスＩの外膜タンパク質は、また、群Ａ、Ｃ，Ｗ−１３５、Ｙ髄膜炎菌の中 に存在するので、髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の群Ｂから誘導さ れた１または２以上のクラス■のＯＭＰからなる本発明のワクチンは群Ａ、Ｃ， ，Ｗ−１３５およびＹにより引き起こされる病気を防止するとき有効であるべき である。好ましくは、このようなワクチンの調製は、疫学的基盤に基づいて選択 した、少なくとも２つの異なる免疫原性および保護的エピトープから出発する。

本発明によるワクチンは、例えば、ＯＭＶ配合物中にまたは１または２以上の仔 つシ腸ホスファターゼを産生ずる突然変異株からの精製により得られる、少なく とも１つのタンパク質、あるいは臭化シアンの断片化により調製された少なくと も２つの断片、あるいは約１０の主要なエピトープ、または組み換えＤＮＡ技術 を経る遺伝子の発現により得られ、所望のエピトープを含有する、産生物から選 択した、少なくとも２つの合成ペプチドからなる。広い領域の髄膜炎菌株に対す る効能を最大とするために、異なる保護的エピトープの数が大きくなればなるほ ど、ワクチンはよりよくなる。さらに、本発明によるワクチンは有利には髄膜炎 菌ＡおよびＣまたは必要に応じてＷ−１３５およびＹの多糖類および／または洗 浄剤を含有することができる。好ましくは、ＡおよびＣの多糖類はタンパク質ま たはポリペプチドのギヤリヤーに共有結合でカップリングされる。

これらのキャリヤーは、例えば、次のものを包含する二分離したＯＭＶ、クラス ＩのＯＭＰのタンパク質、無毒の突然変異（ＣＲＭ）　、組み換えサルモ不う属 （Ｓａ　１ｍｏｎｅ　１１　ａ）フラジェリンおよびウィルスの粒子、例えば、 レトロウィルスのＶＰ６タンパク質、肝炎Ｂの表面抗原またはレトロウィルスの ＶＲＩおよびＶＲ２のタンパク質。両者の両性イオン、カチオン、アニオンおよ び非イオンを発生する洗浄剤を使用することができる。このような洗浄剤の例は 、ツビッタージエント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）３−１０、ツビッタージエン ト（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）３−１４　（Ｎ−テトラデシル−Ｎ、　Ｎ−ジメ チル−３−アンモニア−１−プロハンスルホネート）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ） −２０、デオキシ塩素酸ナトリウム、塩素酸ナトリウムおよびオクチルグルコシ ドである。本発明によるワクチンは、また、吸収剤、例えば、水酸化アルミニウ ム、リン酸カルシウム、または有利にはリン酸アルミニウムを含有することがで きる。断片、タンパク質、ペプチドは、また、放出のために免疫刺激性複合体（ ＩＳＣＯＭＳ）、リポソームまたは微小球で処理することができるおよび／また はアジュバントとしてまたは他のアジュバント・と組み合わせて使用することが でき、こうしてより大きい免疫原性が得られる。

本発明は、分離したＯＭＶ、実質的に純粋な髄膜炎菌のクラスＩの４膜タンパク 質（任意のサブタイプの）およびそのエピトープを烏有するタンパク質の断片を 包含する。断片は、髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する保護的 バクテリアの抗体により境界されるエピトープを含有する、２５ｋＤ以下の分子 量の部分であることができる。これらは、少な（とも一部分がクラス■のＯＭＰ のエピトープに相当するアミノ酸配列から構成される、タンパク賀分解の断片お よび合成オリゴペプチドを包含する。

分離したＯＭＶ、クラスＩのＯＭＰ、断片またはそれらから誘導されたエピトー プ含有オリゴペプチドは、自然の配列と異なるが、本質的に生物学的に同等であ る、アミノ酸配列から成ることができる。これらの配列は、機能的に同等のアミ ノ酸残基が配列内の残基と置換されてサイレントの変化を生ずる配列を包含する 。例えば、配列内の１または２以上のアミノ酸残基は、機能的同等体として作用 し、サイレントの変更を生ずる、同様な極性の他のアミノ酸により置換すること ができる。配列内のアミノ酸のための置換基はアミノ酸が属するクラスの他の構 成員から選択することができる。例えば、非極性（疎水性）のアミノ酸は、グリ シン、アラニン、ロイシン、イソロイノン、バリン、プロリン、フェニルアラニ ン、トリプトファンおよびメチオニンを包含する。極性中性のアミノ酸は、セリ ン、スレオニン、ノステイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを包 含する。帯電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジン を包含する。負に帯電した（酸性）アミノ酸は、アスパラキン酸およびグルタミ ン酸を包含する。

さらに、分離したＯＭＶ、クラスＩのＯＭＰ、断片またはオリゴペプ　。

千ドは、異なるサブタイプの他のクラスのクラスＩのＯＭＰ、Ｔ細胞のエピトー プ、Ｂ細胞のエピトープ、キャリヤーのペプチドまたはタンノ＜り質またはアジ ュバントの分子を包含する他の分子へ接合するために修飾することができる（例 えば、カップリング基、例えば、アミノ酸のンステインおよび／またはリシンま たは他の連鎖基および／またはスペーサー基の取り付けにより）。

詳細に下に記載するように、クラスＩのＯＭＰ、断片またはオリゴペプチドはワ クチンにおいて異なる形態（例えば、単独で、混合物で、あるいは接合体および 組み換えＤＮＡベクターから産生された遺伝子融合体として）で使用することが できる。これらの精製のために、材料は髄膜炎菌（Ｎ、　ｍｅｎ　ｉｎｇ　ｉ　 ｔ　ｉｄ　ｉ　ｓ）からの分離により、タンノくり質分解の消化により、化学的 合成により、あるいは組み換え分子としての発現により産生ずる。二とができる 。分離したＯＭＶ、クラスＩのＯＭＰおよび断片およびクラスＩのＯＭＰのオリ ゴペプチドの産生の方法および使用を下に記載する。

クラスＩのＯＭＰのタンパク質のモデル化および構造の分析は、いくつかのＥ、 ｅｏｌｉの外膜タンパク質についての原理を使用して実施した。［ボｉクゲル（ Ｖｏｇｅ　＋）　、Ｈら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ 、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、上旦旦　１９１（１９８６）　フ；レンス（Ｆｅｒｅ ｎｃｅ）　、Ｔ　ら、ンヤーナルーオブ・モＩツキ、ラー・バイオｏ／−（Ｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、λ立上、４９３　（１９８８）およびトマソセン（Ｔｏ ｍｍａｓ　５ｅｎ）　、Ｊ　、「メンブＩ／ン゛ハイオケ不ソス（Ｍｅｍｂｒａ ｎｅ　Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）Ｊ、ＮＡＴＯＡＳ１ノリーズ（Ｓｅ　ｒ　ｉ　ｅ 　５）ＨＩ３、ｐｐ３５コ、二、−ヨーク州スブリンカーーフエルラーグ（１９ ８８）］、ｊクラスＩのＯＭＰの誘導されたアミツノ酸配列を、モデル化の研究 および比較のために使用した。アミノ酸配列の相同性を他のグラム陰性ノ１クチ リアと比較し、モして類似性をタンパク質の構造について確立した。露出した表 面ループおよびｌ・ランスメンブレン構造は、これらのタンパク質と非常に類似 した。髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の変動性および一定の領域の 保護的エピトープおよびに関する情報を使用して、アミノ酸配列に基づいて、評 価しそしてそれにについてのワクチンの中に含めるべき病原性グラム陰性バクテ リアのための保護的エピトープが存在する場所を予測することができる。

分離したＯＭＶの産生 ＯＭＶは、ベラベリー（Ｂｅｕｖｅｒｙ）ら（１９８３）Ｉｏｃ、ｃｌｔ、に記 載されている断片化後、培養物の上澄み液またはバクテリアの細胞から産生ずる ことができる。１より多い骨髄炎菌からのタンパク質を有するＯＭＶは、異種タ ンパク質を発現するように操作した菌株から分離することができる。

クラスＩのＯＭＰおよびそのＣＮＢｒ断片の産生および精製クラスｌおよびクラ ス３の外膜タンパク質は、ベラベリー（Ｂｅｕｖｅｒｙ）Ｅ、Ｃら、アントニエ ・ワン・リーウベンヘク・ツヤ−ナル・オブ・マイクロバイオロン−（Ａｎｔｏ ｎｉｅ　ｗａｎ　Ｌｅｅｕｖｅｎｈｏｅｋ　Ｊ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）５２： ２３２（１９８６）に記載されているように、分離することかできる。クラス２ または３のＯＭＰを含有しない実質的に純粋なりラスＩのＯＭＰの産生は、この 方法により、クラス２／３のＯＭＰを発現しない突然変異の髄膜炎菌株を使用し て達成される。クラス■のＯＭＰの産生のための好ましい菌株は、ＣＢＳ　６３ ６．８９として受託されたＨＩ１１５である。

断片は、淋菌のタンパク質についてティーアリンク（Ｔｅｅｒｌｉｎｋ）Ｔ　ら 、ツヤ・−ナル・オブ・イクスペリメンタル・メディノン（Ｊ。

Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、Ｌよ６６：６３　（１９８７）に記載されているように、臭化 ンアンの切断により産生ずることができる。Ｎ−末端の断片はＣＢ−１と呼び、 モしてＣ−末端の断片はＣＢ−２と呼ぶ。これらのＣＮＢｒ断片は、ビイグック ス（Ｖｙ　ｄ　ａ　ｘ”）またはアクアポル（Ａｑｕａｐｏｒ’）Ｒ−３００カ ラムの逆相ＨＰＬＣを経て、水／アセトニトリルの勾配を使用して精製すること ができる。あるいは、断片は多数の冷時の１−リクロロ酢酸の沈澱により精製す ることができる。これらの手順は妨害汚染物質（例えば、緩衝液の塩、洗浄剤お よび断片の汚染物質）の９５％より多（を除去する。

Ａ　タンパク質分解の消化の調製 髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔ　１ｄｉｓ）に対するバクテリアの抗体と反応 性のエピトープを含有するオリゴペプチドは、クラス■のＯＭＰ、ＣＢ−１また はＣＢ−２の断片をプロテアー七、例えば、エンドＬｙｓ−Ｃ、エンドＧｌｕ− Ｃ＃よびブドウ球菌属（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ　１ｎｓ）ｎｏＶ８−プロテ アー七で消化することによって産生ずることが７きる。消化した断片は、例えば 、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術により精製することができる 。

Ｂ　化学的合成による調製 本発明のオリゴペプチドは、標準の面相ペプチド合成［バラニイ（Ｂａｒａｎｙ ）　、Ｇ　およびメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、Ｒ，Ｂ、　、ザ・ ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２：１−２８４、グロス（Ｇｒｏｓｓ） 、Ｅ、およびメイエ〉ホウフｙ−（Ｍｅｉｅｎｈｏ　ｆ　ｅ　ｒ）　、Ｊ、　Ｌ アカデミツク・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）、ニューヨーク］により 、ｔ−プチルオキシカルボニルアミノ酸およびフェニルアセトアミドメチル樹脂 ［ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌ＋）、Ａ、Ｒ，ら、ジャーナル・オブ・オーガニ ック・ケミストリー（Ｊ、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、）旦：２８４５−２８５２　（１ ９７８）］またはポリアミド支持体上の９−フルオレニルメチルオキシカルボニ ルアミノ酸しトリランド（ｄｒｙｌａｎｄ）、Ａ　およびシェパード（Ｓｈｅｐ ｐａｒｄ）　、Ｒ，Ｃ，、ジャーナル・オブ・ケミカル・ソサイアティ−（Ｊ、 Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ、Ｉ、１２５−１３７　（１９ ８６）］を使用して合成することができる。あるいは、合成ペプチドはペブスカ ン（ｐ　ｅ　ｐ　ｓ　ｃ　ａ　ｎ）合成［ゲイセン（Ｇｅｙｓｅｎ）　、Ｈ，Ｍ 　ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソ、ズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１． Ｍｅｔｈｏｄｓ）０３　：　２５９　（１９８７）：ブロノーディングス・オブ ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン／ズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃ ａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、８１　：　３９９８　（１９８４）］　、ケンブリ ッジ・リサーチ・バイオケミカルス（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、英国ケンブリッジによるか、あるいは標準の液相 ペプチド合成により調製することができる。オリゴペプチドの免疫学的性質を実 質的に低下させない他の方法においてアミノ酸の欠失または置換（および伸長お よびアミノ酸への付加を包含する）。

Ｃ組み換えＤ　Ｎ　Ａ技術による調製 クラスＩのＯＭＰ、およびクラスＩのＯＭＰのエピトープを示す断片およびオリ ゴペプチドは、組み換えＤＮＡ技術により産生ずることができる。一般に、これ らは、所望のＯＭＰ、［バーロウ（Ｂａｒｌｏｗ）ら、（１９８９）モレキュラ ー・マイクロバイオロジー（ＭＯｌ　〜１ｉｃｒｏ、）、β　１３１１断片また はオリゴペプチドの配列をエンコードするＤＮＡ配列を得ること、および適当な ベクター７／宿主の発現系の中にクラス■のＯＭＰの１または２以上の同様なま たは異なるＤＮＡ配列を導入し、そこでそれを発現することを伴う。ＤＮＡは、 クラスＩのＯＭＰをエンコードする遺伝子またはＯＭＰの機能的エピトープをエ ンコードする遺伝子のセグメントから成ることができる。ＤＮＡは、髄膜炎菌（ Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の他の抗原（例えば、同一のまたは異なる他の クラスの外膜夕〉バク質）、あるいは他のバクテリア、ウィルス、寄生体または 真菌の抗原をエンコードするＤＮＡに融合して、遺伝子的に融合した（共通のペ プチド主鎖を共有する）多個の抗原をつくることができる。例えば、クラスＩの ＯＭＰの断片は、髄膜炎菌（Ｎｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の異なるサブタイプ の他のクラスＩの外膜タンパク質（または断片またはそのエピトープ）に融合し て、多数のクラス■の外膜タンパク質の安定性の抗原決定基からなる融合タンパ ク質を生成することができる。

遺伝子操作技術を、また、使用して、エンコードされたペプチドまたはタンパク 質を特性決定し、修飾しおよび／または適合させることができる。例えば、部位 特異的突然変異誘発は、ＯＭＰ断片を保護的ドメインの外側の領域において修飾 して、例えば、下位断片の溶解性を増加して精製を容易にすることができる。Ｄ ＮＡは、また、種々の有機体中のＯＭＰ断片の過度の産生またはそれらの組み合 わせを行うように操作することができる。

クラスＩのＯＭＰ、断片またはオリゴペプチドをエンコードするＤＮＡは、バー ロウ（Ｂａｒｌｏｗ）、Ａ、Ｋ　ら、インフェクンヨン・アンド・イミュニイー （Ｔｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、）５５：２７３４−４０　（１９８７）および［ バーロウ（Ｂ　ａ　ｒ　ｌ　ｏｗ）ら、モレキュラー・マイクロバイオロジー（ Ｍｏ　１．　Ｍｉ　ｃ　ｒｏ、　）　、３　：１３１　（１９８９）］に記載さ れているように、合成または分離しそして配列決定することができる。クラス■ のＯＭＰの遺伝子は、バクテリアのＤＮＡから、ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）および ファルーナ（Ｆａｌｏｏｎａ）、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄ、Ｅｎｚｙｍ、１５ ５：３３５−３５０の方法により、その中に開示されているプライマー配列を使 用して増幅することができる。異なるサブタイプのクラスＩのＯＭＰのための関 係するＤＮＡ配列は、記載される手順により得ることができ、そしてアミノ酸配 列を推定することができる。

種々の宿主−ベクターの系を使用して、本発明のオリゴペプチドを発現すること ができる。王として、ベクター系は使用する宿主細胞と適合しなくてはならない 。宿主−ベクターの系は、は次のものを包含するが、これらに限定されない：バ クテリオファーシＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡで形質転換さ れたバクテリア：微生物、例えば、酵母菌のベクター系を含有する酵母菌：ウィ ルス（例えば、ワクンニアのウィルス、アデノウィルスなど）が感染した哺乳動 物の細胞系：ウイルス（例えば、バクロウィルス）が感染した昆虫の細胞系。こ れらのベクター系の発現要素は、それらの強さおよび特異性が変化する。利用す る宿主−ベクター系に依存して、ある数の適当な転写および翻訳の要素のいずれ をも使用することができる。

クローニングしたＤＮＡの効率よい発現を得るために、プロモーターは発現系中 に存在しなくてはならない。ＲＮＡポリメラーゼは、通常、プロモーターに結合 し、そして遺伝子または連鎖した遺伝子の群および調節要素（オペロンと呼ぶ） の転写を開始する。プロモーターはそれらの「強さ」、すなわち、転写を促進す るそれらの能力を変化する。強いプロモーターを使用して転写を高いレベルにし 、それゆえ、ＤＮＡの発現を高いレベルにすることが望ましい。宿主細胞系に依 存して、適当なプロモーターの任意の１つを使用することができる。例えば、Ｅ 、ｃ。

ｌｌ、そのバクテリオファージまたはプラスミド、プロモーター、例えば、ｌａ ｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、リポソームのＲ ＮＡプロモーター、およびコリファーシアムダのＰ、またはＰＬプロモーター、 およびは次のものを包含するが、これらに限定されない他のもの：１ａｃＵＶ５ 、ｏｍｐＦ、ｂｌａＸ　ｌｐｐなど、を使用して、隣接するＤＮＡセグメントの 高いレベルの転写を指令することができる。さらに、ハイブリッドのｔｒｐ−１ ａｃＵＶ５　（ｔａｃ）プロモーターまたは他の合成りＮＡ技術を使用して、挿 入されたＤＮＡを転写することができる。

特異的に誘発されないかぎり、プロモーターの作用を阻害し７ない、バクテリア の宿主細胞および発現ベクターを選択することができる。ある種のオペロンにお いて、特異的インデューサーの添加は挿入されたＤＮＡの効率よい転写のために 必要である、例えば、ｌａｅオペロ＞（ヨラクトースまたはＩＰＴＧ（イソプロ ピルオチオーベーターＤ−ガラクトシド）の添加により誘発される。種々のオペ ロン、例えば、ｔｒｐなどは異なる制御下にある。トリプトファンが生長培地中 に存在しないとき、ｔｒｐオペロンは誘発される；そしてラムダのＰｔプロモー ターは、温度感受性ラムダのレセプターを含有する宿生細胞、例えば、ｃ１８５ ７において温度を増加することによって誘発することができる。このようにして 、プロモーター−指令の転写の９５％より多くは非誘発細胞において阻害するこ とができる。こうして、組み換えペプチドまたはタンパク質の発現はコントロー ルすることができる。これは、ＤＮＡの発現産生物が宿主細胞に対して致死的で あるか、あるいは有害である場合、重要である。このような場合において、形質 転換体はプロモーターが誘発されないような条件下に培養することができる：次 いで、細胞が生長培地中で適当な密度に到達したとき、プロモーターはタンパク 質の産生のために誘発することができる。

１つのこのようなプロモーター／オペレーター系は、ｒｔａｃＪまたはｔｒｐ− １ａｃプロモーター／オペレーター系である［ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）およ びペンネット（Ｂｅｎｎｅ　ｔ）、１９８２、遺伝子（Ｇｅｎｅ）２０　：　２ ３１２−２４３　：デベル（ＤｅＢｏｅｒ）、欧州特許出願第６７．５４０号、 １９８２年５月１８日］。このハイブリッドのプロモーターは、−３５ｂｏ　（ −３５領域）のｔｒｐプロモーターおよび一１０ｂｐ［−１０領域またはプリブ ナウ・ボックス（Ｐｒｉ　ｂｎｏｗ　ｂｏｘ）ＥのＩａｃプロモーター（ＲＮＡ ポリメラーゼ結合部位であるＤＮＡの配列）を組み合わせることによって構成さ れる。

トリプトファンのプロモーターの強いプロモーター特性を維持することに加えて 、ｔａｃはまたｌａｅリブレンサーによりコントロールされる。

真核生物の宿主細胞中でクローニングするとき、エンハンサ−配列（例えば、Ｓ Ｖ４０　ＤＮＡの７２ｂｐの直列の反復またはレトロウィルスの長い末端反復ま たはＬＴＲなど）を挿入して、転写効率を増加することができる。エンハンサ− 配列は」組の真核生物のＤＮＡ要素であり、これらの要素は付近の遺伝子に関す るそれらの位置および向きに対して比較的無関係の方法で転写の効率を増加する ように思われる。遺伝子に対して直ぐ５°に位置しなくてはならない古典的なプ ロモーター要素［例えば、ポリメラーゼ結合部位およびゴウルドバーグーホグネ ス（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓ）のｒＴＡＴＡＪホックスコと異なり、 エンハンサ−配列は真核生物の遺伝子から上流、その内部でまたはそれより下流 で機能する顕著な機能を有する。したがって、挿入されたＤＮＡに関するエンハ ンサ−配列の位置はそれほど臨界的てはない。

特異的開始シグナルは、また、原核生物の細胞中の効率よい遺伝子の転写および 翻訳に要求される。これらの転写および翻訳の開始シグナルは、それぞれ、遺伝 子特異的メツセン、・ヤーＲＮＡおよび合成されるタンパク質の量により測定し たとき、「強さ」が変化することがある。ブロモ−・クーを含有するＤ　Ｎ　Ａ 発現ベクターは、また、種々の「強い」転写および／または翻訳の開始シグナル の任意の組み合わせを含有することができる。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ中の効率よ い翻訳は、リポソーム結合部位を提供するために、開始コドン（ＡＴＧ）に対し て約７〜９塩基５゛の／ヤインーダルカルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ） 配列を必要とする。こうして、宿主細胞のりホソームにより利用されうる５Ｄ− ＡＴＧの組み合わせを使用することができる。このような組み合わせは、は次の ものを包含するが、これらに限定されない、コリファーシアムダのｃｒｏ遺伝子 またはｎ遺伝子からか、あるいはＥ、ｃｏｌｉのトリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ，， ＢまたはＡ遺伝子からのＳ　Ｄ　−、Ａ　Ｔ　Ｇの組み合わせ。さらに、組み換 えＤＮＡにより産生された５Ｄ−ＡＴＧの組み合わせまたは合成ヌクレオチドの 組み込みを包含する他の技術を使用することができる。

発現ベクター中へのＤＮＡの挿入について記載されている方法の任意のものを使 用して、プロモーターおよび他の遺伝子の制御要素をベクター内の特異的部位の 中に結合することができる。発現のための髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉ　ｔ　 １ｄｉｓ）の配列をベクターのプロモーターおよび制御要素に関して発現ベクタ ー中の特定の部位に挿入することができ、こうして減少ＤＮＡ分子が宿主細胞の 中に導入されるとき、外来遺伝子の配列は宿主細胞により発現（すなわち、転写 および翻訳）されるようにすることができる。

組み換えＤＮＡベクターは適当な宿主細胞（バクテリア、ウィルス、酵母菌、哺 乳動物細胞など）の中に形質転換、形質導入またはトランスフエクンヨン（ベク ター／宿主細胞の系に依存する）により導入することができる。ベクターを含有 する宿主細胞は、ベクターの中に通常存在する１または２以上の適当な遺伝子マ ーカー、例えば、ｐＢＲ３２２中のアンピノリン抵抗性またはテトラサイクリン 抵抗性、または真核生物の宿主系中のチミジンキナーゼ活性の発現に基づいて選 択する。発現ベクターはクローニングベクターは、通常マーカー機能を含有する 、クローニングベクターから誘導することができる。このようなりローニングベ クターは、は次のものを包含することができるが、これらに限定されない・ＳＶ ４０およびアデノウィルス、ワタシニアのウィルスのベクター、昆虫のウィルス 、例えば、バクロウィルス、酵母菌のベクター、バクテリオファージのベクター 、例えば、ラムダｇｔ−ＷＥＳ−ラムダＢ、ツヤロン２８、ツヤロン４Ａ、ラム ダ４Ａ、ラムダｇｔ−１−ラムダＢＣ、ラムダｇｔ−１−ラムダＢ、Ｍ１３ｍｐ ７、Ｍ１３ｍｐ８、Ｍ１３ｍｐ９、またはプラスミドＤＮＡベクター、例えば、 ｐＢＲ３２２、ｐＡＣ１０５、ｐＶＡ５１、ｐＡｃＹｃ１７７、ｐＫＨ４７、ｐ ＡＣＹＣ１８４、ｐＵＢｌｌｏ、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、Ｃｏ１Ｅ１、ｐＳＣ ｌｏｌ、ｐＢＲ３Ｆ、３、ｐＭＬ２１、Ｒ３Ｆ２１２４、ｐｃＲｌ、ＲＰ４、ｐ ＢＲ３２８など。

ＤＮＡインサートを含有する発現ベクターは、３つの一般的アプローチにより同 定することができる　（１）挿入された遺伝子に対する相同性の配列からなるＤ ＮＡ−ＤＮＡのハイブリダイゼーション＝　（２）「マーカー」遺伝子機能（例 えば、抗生物質に対する抵抗性、形質転換表現型、チミンンキナーゼ活性など） の存在または不存在：および（３）遺伝子産生物の生理学的免疫学的または機能 的性質に基づく挿入された配列の発現。

所望のクラスＩのＯＭ　））のアミ、／酸配列を発現する推定上の組み換えクロ ーンがいったん同定されたなら、遺伝子産生物は次のようにして分析することが できる。免疫学的分析は本質的に重要である。なぜなら、究極の目標は遺伝子産 生物をワクチン配合物中でおよび／または診断の・イムノアツセイにおいて抗原 として使用することであるからである。を発現するされたペプチドまたはタンパ ク質は髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対するバクテリアの抗体と 免疫反応性であるべきである。、二の反応性は標準の免疫学的技術、例えば、ラ ジオイムノ沈澱、ラジオイムノ競争、ＥＬＩＳＡまたはイムノプロットにより実 証することができる。

いったん遺伝子産生物がクラスＩのＯＭＰの断片と同定されるか、あるいはオリ ゴペプチドがその機能的エピトープを含有すると、それは標準の方法、例えば、 クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性および大きさ決定のカラムク ロマトグラフィー）、遠心、示差的溶解度によるか、あるいは精製またはタンパ ク質についての任意の他の標準の技術により分離および精製することができる。

原核生物の細胞からの異種タンパク質の精製のためのいくつかの技術が存在する 。参照、例えば、オルソン（Ｏｌｓｏｎ）、米国特許第４．５１８．５２６号、 ウェツエル（ＷｅｔｚｅｌＬ米国特許第４．５９９，１９７号およびハング（Ｈ ｕ　ｎ　ｇ）ら、米国特許第４．７３４．３６２号ｏ　Ｌ／　ｂ’　Ｌ／　すが ら、産生じ精製した調製物は、ヒトに対して有害でありうる宿主の毒素を実質的 に含有べきではない。とくに、グラム陰性バクテリアの宿主細胞、例えば、Ｅ、 ｃｏｌｉまたはサルモネラ属（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ）中て発現されると き、精製されたペプチドまたはタンパク質はエンドトキ７ンの汚染物質を実質的 に含有してはならない。

本発明のクラスＩのＯＭＰ、断片およびオリゴペプチドは１価または多価のワク チンとして配合することができる。これらの材料は前述の方法により産生または 分離されたままで使用することができる。それらは、他の抗原、例えば、他の抗 原のＢ細胞またはＴ細胞のエピトープと混合、接合または融合することができる 。さらに、それらはオリゴペプチドについて後述するようにキー・リヤーのタン パク質に接合することができる。

・＼ブテンのすりゴペプチドを使用する（すなわち、同種の抗体と反応するが、 それ自体て′”７２疫応答を引き出すことができないペプチド）とき、それは免 疫原性のキャリヤー分子に接合することができる。免疫原性んキャリヤーへの接 合はオリゴペプチドを免疫原性とする。接合は標準の手順により実施することが できる。ハプテンのオリゴペプチドのために好ましいキャリヤータンパク質は、 毒素、トキソイド、または破傷風、−２・フチ１１ア、百日咳、／ニードモナス 属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、Ｅ、ｃｏｌｉ、ブドウ球菌＠　（Ｓｔａｐｈｙ ｌｏｃｏｃｃｕｓ）　、および連鎖球菌１）ｉＥ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ）の突然変異交差反応性物質（ＣＲＭ）である。とくに好ましいキャリヤーは、 ＣＲＭ１９７タンパク質を産生ずるＰ、ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ株Ｃ７（β１９ ７）から誘導された、ジフテリア毒素のＣＲＭ　ｌｅ　７である。この菌株はＡ ＴＣＣ受は入れ番号５３２８１を有する。あるいは、キャリヤータンパク質また は他の免疫原性タンパク質の断片またはエピトープを使用することができる。例 えば、ハブテンはバクテリアの毒素、トキソイドまたはＣＲＭのＴ細胞エピトー プにカップリングすることができる。参照、米国特許出願筒１５０．６８８号、 １９８８年２月１日提出、発明の名称「接合体ワクチンのためのキャリヤー分子 としてのＴ細胞エピトープを表す合成ペプチド」、そのの教示を引用によってこ こに加える。他のキャリヤーは、ロタウィルスｖＰ６、肝炎８表面抗原またはバ ルボウイルスＶＰ】および〜’Ｐ２を包含する。

本発明のペプチドまたはタンパク質は、髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｊ ｓ）の抗原または他の有機体の抗原と組み合わせて、多価のサブユニットのワク チンとして投与することができる。他の有機体のあるものは、次のものを包含す る：インフルエンザ菌（Ｈ，１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉ ｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｂ、ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、淋菌（Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈ ａｅａｅ）　、Ｅ、ｃｏｌ１１肺炎連鎖球菌（Ｓ、ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）など 。例えば、それらは髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のオリゴサツカ リドまたは多糖類の莢膜成分と組み合わせて投与することができる。莢膜成分は 血清学の群、例えば、ＡＸＢ、Ｃ，Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、２９ＥおよびＷ２Ｂ５の任 意のものから誘導することができる。

異なるサブタイプのクラスＩの外膜タンパク質を使用することができる。これら は組み合わせて使用して髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔ　ｉＳ）に対するバク テリアの抗体を引き出すことができる。例えば、Ｐｌ、７．　１６サブタイプの クラス■の外膜タンパク質から誘導された断片を、他のサブタイプ、例えば、Ｐ ｌ、１、Ｐｌ、１．１６：Ｐｌ、２：Ｐｌ、６：Ｐｌ、９：Ｐｌ、１５；Ｐ、１ ６：またはＰＬ、４　［アブディラヒ（、Ａｂｄ　ｉ　ｌ　］　ａｈ　ｉ）　、 Ｈ，ら、１９８８　マイクロバイアル・バソゲネシス（Ｍｉｃｒｏ、Ｐａｔｈｏ ｇ、）　、４　：　２７コの外膜タンパク質または外膜タンパク質の断片と一緒 に、あるいは骨髄炎菌の多糖類と混合物の形態でまたは化学的接合体として一緒 に使用することができる。他の外膜タンパク質のエピトープと組み合わせた投与 のために、それらは、別々に、混合物としてまたは接合体または遺伝子の融合ペ プチドまたはタンパク質として投与することができる。接合体は、タンパク質の 物質をカップリングする標準の技術またはサツカリドのポリマーをタンパク質に カップリングする技術により形成することができる。

融合体は、記載したように、組み換えＤＮＡ技術により調製し、た融合した遺伝 子構成体から発現させることができる。

前述したように、クラスＩのＯＭＰ、断片またはそれらから誘導された任意のオ リゴペプチドを他の病原性有機体［例えば、バクテリア（マイクロカプセル化ま たは非マイクロカプセル化）、ウィルス、真菌および寄生体］の抗原と組み合わ せて使用することができる。他の有機体の追加の例は、ＲＳウィルス、ロタウィ ルス、マラリア寄生虫、およびクリプトコツカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐ ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏ　ｆ　ｏ　ｒｍａｎ　ｓ）を包含する。

ペプチドまたはタンパク質を単独でまたは記載した種々の組み合わせでを有する ワクチン組成物の配合において、免疫原を適当な濃度に調節し、そして任意の適 当なワクチンアジュバントを使用して配合する。適当なアジュバントは、は次の ものを包含するが、これらに限定されない、表面活性物質、例えば、ヘキサデシ ルアミン、オクタデシルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、リソレシチン 、ジメチルノオクタデシルアンモニウムブロミド、メトキンヘキサデシルグリセ ロール、およびプルロニンクポリオール、ポリアミン、例えば、ビラン、デキス トラサルフェート、ポリＩＣ、カルボポール、ペプチド、例えば、ムラミルペプ チドおよび誘導体、２・メチルグリラン、ラフトノン、油乳濁液、および鉱物ケ ル、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムなど、リンフすカインお よび免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）。免疫原は、また、リポソーム、微小球の 中に組み込むことができるか、あるいは多糖類および／またはワクチン配合にお いて使用する他のポリマーに接合することができる。

ワクチンはヒトまたは動物に種々の方法で投与することができる。これらは、皮 膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口的および鼻内の投与のルートを包含 する。

生ワクチン 本発明のペプチドおよびタンパク質は、生ワクチンとして投与することができる 。ワクチンの受容体に組み換え微生物を接種し、この組み換え微生物は受容体に おいて増殖し、クラスＩのＯＭＰ、その断片またはオリゴペプチドを発現し、そ して髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉ　ｔ　１ｄｉｓ）に対する免疫応答を引き出 す。生ワクチンは次のものを包含するアデノウィルス、サイトメガロウィルスお よび好ましくは、ポックスウィルス、例えば、ワクシニア［バオレッチ（Ｐａｏ ｌｅｔｔｉ）およびバニカリ（Ｐａｎｉｃａｌｉ）、米国特許第４．６０３．１ １２号］および弱毒化サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株［ストッカー（ Ｓｔｏｃｋｅｒ）、米国特許第４．５５０．０８１号およびカーチス（Ｃｕｒｔ ｉｓｓ）ら、ワクチン（Ｖａｃｃ　１ｎｅ）６　：１５５−１６０　（１９８８ ）］。さらに、クラス■のＯＭＰのエピトープは弱毒化バクテリア株の鞭毛の中 に組み込むことができる。

生ワクチンはとくに有利である。なぜなら、それらは実質的に長（持続する免疫 性を与えることができる、延長した刺激に導くからである。

免疫応答が引き続く髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔ　１ｄｉｓ）の感染に対し て保護的であるとき、生ワクチンそれ自体は髄膜炎菌（Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔ ｉｄｉｓ）に対する予防的ワクチンにおいて使用ことができる。

多価生ワクチンは、髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の異なるエピト ープ（例えば、他のサブタイプまたはそのエピトープからの４膜夕〉・バク質） を発現する、１つまたはいくつかの組み換え微生物から調製することができる。

さらに、他の病原性微生物のエピトープはワクチンの中に組み込むことができる 。例えば、ワクシニアのウィルスは髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ） のものに加えて他のエピトープのための解読配列を含有するように操作すること ができる。このような組み換えウィルスそれ自体は多価ワクチンにおける免疫原 として使用できる。あるいは、各々が髄膜炎菌（Ｎ、　ｍｅｎ　ｉｎｇ　ｉ　ｔ 　ｉｄ　ｉ　ｓ）の外膜タンパク質の異なるエピトープおよび／または他の病気 を引き起こす微生物のエピトープの遺伝情報を指定する異なる遺伝子の混合物を 、多価ワクチンとして配合することができる。

不活性化ウィルスのワクチンを調製することができる。不活性化したワクチンは 、通鳳化７″的処理（例えば、ホルムルデヒドの処理）により、：殺されている 」、すなわち、感染性は破壊されている。理想的には、ウィルスの感染性は、ウ ィルスの免疫原性を有するタンパク質に影響を与えないで、破壊される。不活性 化したワクチンをタンパク質を調製するために、所望のエピトープを発現する組 み換えウィルスを大量に培養により増殖して、必要な量の関連する抗原を提供す る。異なるエピトープを発現する活性化した・ウィルスの混合物は、「多価」ワ クチンの配合のために使用することができるつある場合において、これらの「多 価」の不活性化ワクチンは好ましくは生ワクチン配合物である。なぜなら、潜在 的な困難が一緒に投与した生ワクチンの相互の干渉から生ずるからである。いず れの場合においても、不活性化したウィルスまたはウィルスの混合物を適当なア ジュバント中で配合して、抗原に対する免疫応答を増強することができる。適当 なアジュバントは次のものを包含する表面活性物質、例えば、へモサデシルアミ ン、オクタデシルアミノ酸エステル、オクタデシルアミン、リソレンチペジメチ ルーンオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ、Ｎ−シコクタデンルーＮ’　、 Ｎ“　−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパンジアミン）、メトキンへキサデ シルグリセロール、およびブロンポリオール：ポリアミン、例えば、ピラン、デ クストランサルフェート、ポリＩＣ、カルボポル：ペプチド、例えば、ムラミル ペプチドおよびその誘導体、ジメチルグリラン、ラッチシン。

油孔濁液、および鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム 、およびリンフ才力イン。

種々の骨髄炎菌のクラス■の外膜タンパク質に対するタイプ特異的モノクローナ ル抗体を調製した。これらのモノクローナル抗体は、次のサブタイプを認識する ：Ｐ１．１；Ｐ１．２：Ｐ１．６；Ｐ１．７：Ｐｌ、９：Ｐｌ、１０：Ｐｌ、１ ５；Ｐ　１．６．およびＰｌ、１７（ここてＰｌ　１４と呼ぶ）。モノクローナ ル抗体は、ＲＩＶＭ、オランダ国ピルトウベン、から「骨髄炎菌の血清型決定の モノクローナルキ・ノド（Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ　Ｋｉｔ　Ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ 　Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃ　ｉ）Ｊとして入手可能である。すべてのこれらのモ ノクローナル抗体は、ウニスタンプロンティングにより試験したとき、ＳＤＳ（ ドギノル硫酸すトリウム）変性タンパク質と反応する。また、ある数のこれらの モ、・°クローナル抗体は４２ｋＤのクラスＩの外膜タンパク質の２５ｋＤのＣ ＮＢｒ断片と反応することが明らかになった。この結果が意味するように、クラ スＩの外膜タンパク質のエピトープは主として直線のタイプであり、したがって 合成ペプチドでコピーすることができる。出願人が実施した試験の疫学の結果に より、記載したモノクローナル抗体は￥ｆＡ、ＢＳＣの骨髄炎菌の大部分をサブ タイピングすることができことを示し、これは制限された異質性を示唆する。各 クラスＩの外膜タンパク質は、また、２つの個々のタイプ特異的エピトープを含 有するように思われる［アブディラヒ（Ａｂｄ　ｉ　ｌ　ｌ　ａｈ　ｉ）および プールマン（Ｐｏｏ　１ｍａｎ）　、マイクロバイアル・パソゲネンス（Ｍｉｃ ｒｏ、Ｐａｔｈｏｇ、）、１９８８．４：ｐｐ、２７−３２：同上、ＦＥＭＳ　 マイク０／＜イオロンーーイムノロジー（Ｍｉｃｏｒｏｂｉｏｌ。

Ｉｍｍｕｎｏ　１．）４７　：　Ｉ’）Ｉ）、１３９−１４４１゜クラス２．／ ３のを含有しない突然変異（Ｈ１１１５）の培養から由来する、精製したクラス Ｉの外膜タンパク質（下を参照）サブタイプＰ１７１６は、マウスにおいて２５ μｇの投与量で１６４の血清の希釈物のバクテリアの抗体の応答を誘発するよう に思われた。髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質、クラス２／３の外膜タンパ ク質およびリポ多糖類に対するモノクローナル抗体をバクテリアの作用に関して 比較（，７た。クラスＩの外膜タンパク質に対するモノクローナル抗体は、最強 のバクテリアを有するように思オつれた（参照、表１）。バクテリアの応答は、 ブールマン（Ｐｏｏｌｍａｎ）、Ｊ、Ｔ、（１９８５）、スクールニック（Ｓｃ ｈｏｏｌｎｉｃｋ）、Ｇ、Ｊ　ら（編）、［病原性ナイセリア属ｊ　ＣＰａｔｈ ｏｇｅｎｉｅ　Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａｅ）ｉ、へＳＮバブリケー７ａ＞（Ｐｕｂｌ ｉｃａｔｉｏｎ）、ワラントンＤＣ１、ｐ　５６２゜ これらのモノクローナル抗体の殺バクテリア活性は、ザラコラ不ン（Ｓａｕｋｋ ｏｎｅｎ）ら、１９８７、マイクロバイアル・バソゲネンス（Ｍｉｃｒｏｂｉａ ｌ　Ｐａｔｈｏｇｇｅｎ、）３：２６１のう・・川・の骨髄［笈のモデルにおい て測定した生体内の保護的活性とよく相関関係をもつように思われる。

実施例ＩＡ　多数の′７−５スＩの遺伝子ｈａｃ骨髄炎菌株の構成りローンによ り染色体遺伝子の置換、わずかに異なる変法、は、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　 ｇｏｎｏｒｒｈａｅａｅ）についで記載された。

［スティン（Ｓｔｅ　ｉｎ）　、Ｄ、Ｃ，、ＣＩ　ｉｎ、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＲ ｅｖ、　；−（Ｓｕｐｐｌ、　Ｌ　５１４６−８１４９　（１９８９）、１゜こ の方法は髄膜炎１１（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）におい てクラス■の遺伝子に適用することができることを、われわれは発見した。これ は次の方法で実施した・い）株２９９６　（サブタイプＰ１２）のクラス■の遺 伝子をベクターｐＴｚ１９Ｒの中にクローニングした。［メッド（Ｍｅａｄ）　 、Ｄ、、へ　ら、プロティン・エランニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎ ｅｅｒｉｎｇ）よ、６７　（１９８６）１゜完全な遺伝子は、Ｘｂａｌｆｉ化し たベクターＤＮＡに結合した２　２ｋｂのＸｂａＩ断片上に位置する。

（１］）生ずるプラスミドを株！（４４／７６（サブタイプＰ１７１６）の形質 転換に使用した。アクセプターの株ん細胞をプラスミドＤＮＡとともにＭ　ｇ　 ２　”および通常の骨髄炎菌の培地の存在下にインキュベーションした。それら を引き続いて希釈し、そしてプレイティングし、そして生ずるコロニーをＰｌ、 ２特異的モノクロ−アル抗体に結合するそれらの能力について試験した。このよ うな形質転換体はほぼ１０−３の頻度で見いだされた。それ以上の特性決定によ り、Ｈ４４／７６クラスＩの遺伝子の置換が事実起こったことが示された。この 方法の本質的特徴は、髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）中で複製する ことができない円形のプラスミドＤＮＡ分子上のドナー遺伝子の存在である。な ぜなら、直線化ＤＮＡの使用は形質転換体をまったく産生じなかったがらである 。

２つのクラス■の遺伝子をもつ株の構成は、前述の方法の変更により実施した。

この目的で、Ｐｌ、２クラスＩの遺伝子をクローンのクラス５の遺伝子の中に挿 入した。クラス５の遺伝子の族は２つの特徴を有し、これらの特徴はその遺伝子 をこの構成にとくに適当なものとする。「メイアー（Ｍｅｙｅ　ｒ）　、Ｔ、Ｆ 、およびパン・プラテン（Ｖａｎ　Ｐｕｔ　ｔｅｎ）　、Ｊ、Ｐ、Ｍ、　、ＣＩ 　ｉｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ。

２　（Ｓｕｐｐｌ、）　、５１３９−５１４５　（１９８９）：　（ｉ）骨髄炎 菌のゲノムの中に４または５つのクラス５の遺伝子が存在する、および（１１） これらの遺伝子の発現は実験室の条件下において生長は不必要である。クラス５ の遺伝子を８４４／７６株からクローニングし、モしてＰｌ、２遺伝子をクラス ５の遺伝子の中にまたはそれに非常に密接して位置するｓｐｈ　１部位の中に挿 入した。生ずるハイプリントのプラスミド、ｐＭＣ２２、を株ＨＩＩＩ５、Ｈ４ ４，７６のクラス３欠損突林変異、の形質転換に使用した。Ｐｌ、２特異的モノ クローナル抗体と反応するコロニーを分離し、そして特性決定した。１０のこの ような形質転換体のうちの９は、アクセプター株のＰｌ　１６エビトープを失な っていることが発見された。これが示すように、すべてのこれらのクラスの組み 換えはクラスＩの遺伝子の間でのみ起こって、サブタイプの置換を生ずる。しか しながら、両者のクラスＩのサブタイプ、すなわち、Ｐｌ　７１６およびｐｌ、 ２を作った、１つの形質転換体が発見され、プラスミドおよび染色体上のクラス ５の遺伝子の配列の間の組み換えが起こったにちかいないことを示唆する。これ はウェスタンブロッティングおよびサザンブロノティングにより確証され、ここ でウェスタンブロッティングは両者のタイプのクラスＩのタンパク質の存在を明 らかにし、そしてサザンブロッティングは第２のクラスＩの遺伝子の獲得を実証 した。

この構成を他のクラスＩのサブタイプを使用して続けることによって、４または ５つの異なるクラスＩの遺伝子をもつ株をつくることができる。

同一のクラス５の遺伝子は各引き続く形質転換工程において使用ことかでき、異 なるクラス５の遺伝子は別々にクローニングし、そして使用することができる。

これらの組み換え株を使用して、異なる精製したクラス■のＯＭＰの混合物を調 製することができる。

実施例ＩＢ　細菌学的培養物からの分離したＯＭＶの精製精製は、ベウベリイ（ Ｂｅｕｖｅｒｙ）ら（１９８３）ｌ　ｏｃ、ｃ　ｉｔ　に従い実施する。

この培養は所望の野生型菌株、クラス２／３の外膜タンパク質をもたｔい突体変 異の骨髄炎菌株および／または相同性および異種の組み換え微生物を使用し、て 実施することかでき、前記組み換え微生物は、存在するオーブンリーディ〉・グ フＩノームによるか、あるいはよらないでベクターを過度に産生ずることによっ て１または２以」二の所望の骨髄企画のクラスｌの外膜タンパク質および７・′ またはエピトープを発現するので、融合タンパク質または交換したエピトープを もつタンパク質を調製することができる。

野生型菌株の容易に入手可能なものは、次の通りである　Ｈ４４／７６（Ｂ：１ ５：ＰＩ、７．１６）［ホルテン（Ｈｏ　１　ｔ　ｅｎ）　Ｅ、　、ノＢ１、ス イス国］　：Ｂ２１０６Ｉ　（Ｂ・４．Ｐｌ、２）［バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ） Ｕ、　、西ドイツ国］　：３９５　（Ｂ：ＮＴ：ＰＩ、９）［ジョンスドッチル （Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ）Ｋ、　、アイスランド国］［アナ１−フン（ｊ〜ａｈ ｔｍａｎ）Ｍ、　、西ドイツ国］。クラス３の陰性突然変異の１例は、ＨＩＩＩ ５　（Ｂニー：Ｐｌ、１６）受は入れ番号ＣＢ５６３６．８９である。

これらの菌株は一７０℃において予備培養物から震盪フラスコの中に接種し、そ してこれらから４０．１５０または３５０リツトルの発酵培養物の中に移された 。半合成培地は次の組成を有した　し−グルタミン酸　１．３ｇ／ｌ、Ｌ−７ス テインーＨＣＩ　０．０２ｇ／ｌ、Ｎａ２ＨＩ−）０４’２ＨＩＯ１０ｇ／”］ 、ＫＣＩ　０．０９ｇ／Ｉ、ＮａＣ１６ｇ／ｌ、ＮＨ４Ｃｌ　１．２５ｇ／Ｌ　 ＭｇＳＯ４・７Ｈ，ＯＯ，６ｇ／ｌ、グル：］−７，５ｇ／ｌ、Ｆｅ　（ＮＯ３ ）　３１００μモル、酵母透析物。

発酵槽中の培養の間、ｐＨおよびＰＯ２を監視し、そして自動的にｐＨ７，０〜 ７２および空気飽和１０％に調節した。細胞を初期の定常期に生長させ、遠心お よび無菌の０１モルのＮａＣ１で洗浄することによって収穫（７、そして−２０ ℃において貯蔵するか、あるいは凍結乾燥した。

実施例２　細菌学的培養物からのクラスＩの外膜タンパク質の精製この培養は所 望の野生型菌株、クラス２／３の外膜タンパク質を含まない突然変異の髄膜炎菌 株および／′または相同性および異種の組み換え微生物を使用して実施する。二 とができ、前記微生物は存在するオーブンリーディングフレームおよび／または 操作されたリーディングフレームによるか、あるいはよらないでベクターを過度 に産生ずることによって、１または２以トの所望の髄膜炎菌のクラスＩの外膜タ ンパク質および／またはエピトープを発現するので、融合タンパク質または交換 さねたエピトープをもつタンパク質を調製することができる。

野生型菌株の容易に入手可能なものは、次の通りである　Ｈ４４／７６（Ｂ：１ ．５：ＰＩ、７．１６）Ｅホルテン（Ｈｏ　ｌ　ｔ　ｅｎ）Ｅ　、ノＢ　、スイ ス国コ　：Ｂ２１０６１　（Ｂ　４：Ｐｌ、２）　「バーカー（Ｂ（Ｂ：９：Ｐ ｌ、９）［フラーｙ’ｙユ（Ｆｒａｓｃｈ）Ｃ、米国コ　、旦買アチ丁−マン（ Ａｃｈ　ｔｍａｎ）Ｍ、、西ドイツ国コ。クラス３の陰性突然変異の１例は、Ｈ ｌ、’　１５　（Ｂニー：Ｐｌ、１６）受は入れ番号ＣＢ５６３６．８９である 。

これらの菌株は一７０℃において予備培養物から震盪フラスコの中に接種し、そ してこれらから４０．１５０または３５０リツトツノの発酵培養物の中に移され た。半合成培地は次の組成を有した　し−グルタミン酸　１　３ｓ；／ｌ、Ｌ− ７ステイン・ＭＣＩ　０．０２ｇ／Ｌ　ＮａｔＨＰ○４−２Ｈ２０１０ｇ／ｉ、 ＫＣＩ　Ｏ，０９ｇ／ＬＮａＣ１ｂｇ／；、　ＮＨ４Ｃｌ　１．２５ｇ／ｌ、Ｍ ｇＳＯ４・７Ｈ□００７６ｇ／′１、グル＝−，７：、５ｇ、／１．　Ｆｅ　（ ＮＯ３）３１００μモル、酵母透析物。

発酵槽中の培養の間、ｐＨおよびＰＯ２を藍視し、そして自動的にｐＨ７，０〜 ７２および空気飽和１０％に調節した。細胞を初期の定常期に生長５せ、遠心お よび無菌の０１モルのＮａＣＩで洗浄することによって収穫し、そして−２０℃ において貯蔵するか、あるいは凍結乾燥した。

バクテリアの塊を、例えば、０５モルのＣａＣ］□、１％（Ｗ／Ｖ）ソビッター ジェント（Ｚｗｉ　ｔ　ｔｅｒｇｅｎｔ）３−１４　（２ｗ３−１４）および０ ．１４モルのＮａＣｌ５ｐＨ４，Ｏの助けにより、１００／ｇの凍結乾燥し５た バクテリアの塊を使用して抽出した。この懸濁液を室温において１時間撹拌し、 次いで遠心（１時間、３０００Ｘｇ）Ｌ、その後懸濁液を無菌の方法で収集した 。２０％（Ｖ　／　Ｖ　）のエタノールを上澄み液に添加し、次いで３０分間撹 拌し、産生物を遠心（３０分、１０．０００／ｇ）、その後懸濁液を無菌的に収 集した。次いで、上澄み液をアミコン・ホロウ・ファイバー・システム（Ａｍｉ ｃｏｎ　Ｈ。

１１ｏｗ　Ｆｉｂｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ）（ＨＩＤｘ５０、カントオフ５０．００ ０）中で透析Ｉｔ過により濃縮し、そしてＣａＣｌ２およびエタノールを除去し た。Ｓ線巻を０１モルの酢酸ナトリウム、２５ミリモルのＥＤ′ｒＡ、０　０５ ％の２ｗ３−１４、ｐＨ６，０をもとの体積に希釈し５、次いで希釈濾過により 濃縮した。この手順を再び５回反復した。

最終濃縮物のｐＨを４０の値に調節した。２０％（ｖ　／　ｖ　）のエタノール を屡線巻に添加し、そして３０分間撹拌後、産生物を遠心した（３０分、１０． ０００／ｇ）。全タンパク質をカラムクロマトグラフィーによ１］洗浄剤、例え ば、２ｗ３−１４の存在下に精製する。しばしばセフ　７　Ｑ−ズ（Ｓｃｐｈａ ｒｏｓｅ）Ｓ−３００のゲル濾過ならびにＤＥ・＼Ｅセファローズ（Ｓｅｐｈａ ｒｏｓｅ）のイオン交換を適用する［ベウヘリイ（Ｂｅｕｖｅｒｙ）ら（１９８ ６）ｓｕｐｒａ］　。使用した方法、洗浄剤、カラムクロマトグラフィーは唯一 の適用可能な方法ではなく、しかも例であり、そし７て限定として見なしてはな らない。

実施例３　クラス１のＯＭＰのペプチド断片の調製および特性決定臭化シアンを 使用して、髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質を調製した。精製したクラス１ またはクラスＩまたは３の外膜タンパク質を７０％（Ｖ／Ｖ）のギ酸中に取り、 そして室温において１６時間１０倍過剰のＣＮＢｒで処理した。ＣＮＢｒおよび ギ酸を蒸発により除去し、そして領　２モルのトリスＨＣＬ６モルの尿素溶液、 ｐＨ７，２により置換した。上澄み液をセフアリル（Ｓｅｐｈａｒｙｌ）Ｓ−２ ０００のゲル濾過により精製した。ベウベリイ（Ｂｅｕｖｅｒｙ）ら（１９８６ ）ｓｕｐｒａｏ ＣＢ２断片の酵素の消化 エピトープをさらに描写するために、髄膜炎菌のＣＢ２断片をエンドＡｒｇ−Ｃ ，エンドＧｌｕ−Ｃまたはｖ−８で消化し、そして生ずる断片をＨＰＬＣにより 分離した。簡単に述べると、３モルの尿素を含有する２５ミリモルのホスフェー ト１０．１ミリモルのトリス緩衝液（ｐＨ８，０）０）１ｍｌ中の２０ナノモル のＣＢ２断片を、３７℃において１４〜１８時間、０゜２ナノモルのエンドＡｒ ｇ−Ｃ（蒸留水中の１４〜１８ｍｇ／ｍｌ）または０２２ナノモルのエンドＧ１ ｕ−Ｃ（蒸留水中の１４〜１８ｍｇ／ｍ＋）で消化した。生ずる消化した断片を 逆相ＨＰＬＣによりバイダク（＼’ｙｃｌａｃ）−Ｃ４カラムおよびトリフルオ ロ酢酸−アセトニトリルの勾配を使用して分離した。

エンドＡｒｇ−Ｃ消化から溶離された生なピークは７〜９Ｋｄａｌの見掛けの分 子量を有したが、エンドＧｌｕ−Ｖ−８後に観測された王なピークは４〜６Ｋｄ ａｌの見掛けの分子量を有した。分離したピークは、引き続いてウェスタンプロ ットにより、モノクローナル抗体のブール「アダム（Ａｄａｍ）Ｉ、６２−ＤＩ ２−８、ＭＮ、５−ＣＩｌＧおよびＭＮ１４−Ｃ１１６）と反応することが示さ れた。

Ｐｌ、１６エピトープは、Ｈ４４／７６　（Ｂ・１５　Ｐｌ、７１６）のクラス ■の外膜タンパク質のＣ末端のＣＮＢｒ断片上に存在するように思われる。Ｐｌ 、１６エピトープのさらに特性決定は、］７Ｋｄ（Ｎ末端）および２５Ｋｄ　（ Ｃ末端）のアミノ酸配列の決定により実施した。Ｃ末端の２５Ｋｄをさらにｖ８ プロテアーゼ、エンドＬｙｓＣ、ニジ１ζＧｌｕ−Ｃおよびエンド、Ａｒｇ−Ｃ で断片化した。Ｐｌ、１６モノクロ一アル抗体で陽性であった断片を出来るだけ 配列決定した。得られた配列は、次の通りである全タンパク質のＮ末端 ＤＶＳＬＹＧＥＩＫＡＧＶＥＤＲＮＹＱＬＱＬＴＥＡＱＵＡＡＮ ２５ＫｄのＣ末端のＣＮＢｒ断片のＮ末端・（〜ｉ）　Ｐ′Ｖ″５ＶＲＹＤＳＰ ＥＦＳＧＦＳＧＳＶＱＦＶＰＩ○Ｎ５ＫＳＡＹＴＰＡＹＹＴＫＤＴＮＮＮＰＩ、 １６モノクコ一ナル抗体と反応する断片を、それぞれ、７〜９Ｋｃｊおよび４〜 ６Ｋｄをもつ〜゛８８プロテアーゼびエンドＡｒｇ−Ｃの断片を使用して分離し た。ここのＮ末端サブン分析は、次の通りである 〜８　７−９Ｋｄ断片 ＦＳＧＦＳＧＳＶＱＦＶＰＩＱＮＳＫＳＡＹＴＰＡＹＹＴＤＴＮ Ａｒｇ−Ｃ４−６Ｋｄ断片 ＰＶＳＶＲＹＤＳＰＥＦＳＧＦＳＧＳＶＱＦＶＰ　ＩＱＮＳＫＳＡＹＴＰＡＹＹ ＴＫ。

実施例４・　クラスＩのＯＭＰ遺伝子のＤＮＡ配列クラりＩのＯＭＰのアミノ酸 配列を、種々のサブタイプをもつ４つの髄膜炎菌のクラスＩのＯＭＰの構造遺伝 子のヌクレオチド配列から推定した。４つのアミノ酸配列との比較により、これ らのエピトープの組成および位置を予測することができた。さらに、Ｐｌ、７お よびＰｌ、１６エピトープは、ペプチドの合成およびそれぞれのモノクローナル 抗体の結合の実証により確証された。

クラス■のＯＭＰをラムダｇ１１１の中にクローニングし［Ｐｌ、１６について 、ベウベリイ（Ｂｅｕｖｅｒｙ）ら（１９８７）インフニクンヨン・アンド・イ ミュニイー（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、）５５　：　２７４３−２７４０１そ してＭ１３配列決定ベクター中でサブクローニングし、そしてＤＮＡ配列を標準 の連鎖停止ジデオキシヌクレオチド技術により決定した。

Ｐｌ、１６：Ｐｌ、１５、Ｐｌ、７．１６およびＰｌ、２タンパク質についての 完全な誘導されたアミノ酸配列は、次の通りである・６０　７８　Ｂｏ　９０　 １００　１１０ＤｒＧ５ｒ１ＧＦＫＧ５ＥＤＬＧεＧＴ−ＫＡＶＷＯＬＥＱＤＶ ＳＶ入５ＧＧＡｊＱｌ＋アｆｌｕｓｌ’ＸＧＴＪｄ；’Ｅ−ｔＧＴＴ、ＲＭ刀魔 uｋ 〒注二のアミノ酸］５はこの配列のアミノＡ、Ａ、Ｓ、１８４および１８５の間 に位置する。

からのクラスＩのＯＭＰ遺伝子のＤＮＡ配列決定ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）および フ７０−す（Ｆａｌｏｏｎａ）ＣメソＩズ・インーｒ−ンノモａノー（Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）１５５　：　３３５−５０，１９８７コ のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、第１図に示す概要に従い、 全体のクラス■のＯＭＰ遺伝子の特異的断片を増幅した。

プライマーをアプライド・ノ＼イオンステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ）３８０ＢのＤＮＡ合成装置で合成し、そして標準のＰＣＲの３０サイ クルの増幅反応において、Ｔａｑボリメラーセを使用してサーマル！イクラー（ Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ）　［ｙ＜−キン−エルマー・セツス（Ｐｅｒｋ ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）、コ不ヂカソト州ノーウオークコにおいて供給 会社の推奨に従い使用した。

約１３００．９００および４５０ｂｐの増幅した断片を、第１図に示すプライマ ーの組み合わせからの各血清型のゲノムのＤＮＡ調製物から発生させた。使用し たプライマーは、次の配列を有しこ。

ＰＲＩ：　（ｆｆ−のプうイマ−の仲良をもっ４１塩基つ７０丁　ＡＡＡ　ＡＣ ＣＡＣＧ　ＣＣＣＡＣＴ　丁ＴＣ人ＡＧ　ＡＣＣＴＡＴ　ＣＣＣ（、ＲＣττＴ ＣＣＰＲ２：（１Ｆ遍のプライマーの陣俣掻も−）４２閤１丁Ｃ丁　＾＾＾　Ａ Ｃに　ＡＣ（：　ＣＣＣＡＧＴ　Ｃ；ＧＣＣＡＡ　ＴＴＣＣＣＴ　ＡＣＣＣＴＧ 　ＣＣＣＧＣＣＰＲ３：（Ｉｌｌのプライマーの伸長をらつ４２塩基）ＴＣＴ　 ＡＡＡ　ＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴ　ＣＡＴ　ＣＡＣＧＴＡ　ＣＡＣＣＧＣＣτ （：　ＡＣＣＧにＣ？Ｒ４（僚層のプライマーの伸長をも−）４０ｍＪＡ）丁Ｃ Ｔ　ＡＡＡ　ＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＧＴ　にＣＡ　（：ＡＴ　ＮＣＣＣＡＣＴＣ Ａ　ＣＡＴ　Ｔ（：ＣＡＰＩＬ５：１１＃ＭのブライＴ−ＩＦ）ｉｌＩｌ長をら っ４Ｑ境〜丁ＣＴ　ＡＡＡ　ＡＣ（、ＡｃＣＣ，ＣＣＡＣＴ　ＣＧＧ　ＡＴＣＣ ＣＴ　ＡＣＣτ丁Ｔ　Ｃ；ＣＣＴＴＣＡＰＲ６＋　（１ｔｊｌＦｌブライＹ−〕 １ｌｌｌ長をもｚ４０場＆）ＴＣＴ　ＡＡＡ　ＡｃＣＡＣＣＧＣＣＡＣＴ　ＡＡ ＣＴＣＡ　ＴＴＣＧＣＡ　ＡＣＣＣＧＡ　ＣＣＣＧ口ＪＤ：　（２４塩基　） ＲＥＶ：　（２３塩基　） 「非対称のＰＣＲＪの増幅において、３７０Ａ型の自動化Ｄ　Ｎ　、Ａ配列決定 装置［アプライド・バイオ７・ステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ｓ）、カリフォルニア州ふぉすた−してぃ］で使用した普遍蛍光配列決定プライ マーに相当する５′末端に］８塩基の伸長を有するプライマーの１００×過剰を 使用して、配列決定のための過剰の一本鎖の鋳型を合成した。鋳型としてＰＣＲ 発生した一本鎖のクラス■の遺伝子の断片との標準のシデオキシヌクレオチド連 鎖停止配列決定反応において、Ｔａｑポリメラーゼを使用した。菌株Ｈ４４，／ ７６　（ＰＬ、７．１６）、Ｍ１０８０　（ＰＬ、１．７）　、Ｈ３５５（ＰＬ 、１５）　、６９４０　（Ｐｉ、６）　、６５５７　（Ｐｌ、１４）　、８７０ ２２７　（ＰＬ、］Ｏ）およびＢ２Ｏ（Ｐｌ、１０）の遺伝子断片につい゛Ｃ誘 導された配列を、第２図および第３図に示す。

クラスｌのＯＭＰ遺伝子の直接配列決定により確証されたこれらの遺伝子から、 γミノ酸２４−３４および１．７６−１８７に相当する配タリは４つのクラス■ のＯＭＰ配列において顕著に可変であることが推定された。これらの位！からの ３つのアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端は、また、自然のタンパク質配列にお けるエピトープの安定性の表示および予期せざる挿入または欠失を最大にさせる 、これらのエピトープにおける可能な包含について考えられた。さらに、他のク ラス■のＯＭＰのＤＮＡおよびアミ、／酸配列をＰ］、７．１６配列と比較して 、最大の整列およびエピトープの予測を可能とすべきである。第１の可変領域の エピトープおよび第２の可変領域のエビＹ・−ブを、それぞれ、ＶＲｌおよびＶ Ｈ２と呼ぶ。−れらの領域はサブタイプのエピトープをエンコードする。これは ペプチドの合成およびペプチドとｐｌ　２；Ｐｌ、７；ＰＩ。

１５およびＰｌ　１Ｇ特異的モノクローナル抗体との反応により確証された。

５アミ７ノ酸により食い違うオーバーランピングするデカペプチドの完全な組を 、ＰＬ、１６タンパク質配列を使用して調製した。抗Ｐ１．１６モノクローナル 抗体は、期待するように反応したＰｌ　１６からのデカペプチドＹＹ　Ｔ　Ｋ　 Ｄ　Ｔ　ＮＮ　Ｎ　Ｌと反応し、そして他のデカペプチドと反応しなかった。、 （第、・４図）１、菌株Ｈ４４／７６　（Ｐｌ、７．１６）　、Ｍ２Ｏ（ＰＬ、 １６）およびＭＣ５１（ＰＬ、１５）のクラス■のＯＭＰの領域２４−３４およ び１７６−１８７におい７１つ（１）のアミノ酸配列をもっオーバーランビング するデカペプチドのちて、１より多いペプチドはサブタイプ特異的モノクローナ ル抗体と反応した。たいていの場合において、これらのオーハーラ２・ヒ′ング するペプチドの１または２以上の群は、サブタイプ特異的モノクローナル抗体と 、他のものより強く反応した（第５図）。

これらのペプチドをＶＲＩおよびＶＲ２エピトープとして表示する。

Ｐｌ、７．１６菌株において、配列ＹＹＴＫＮＴＮＮＮＬが存在し、残基１８０ におけるＤのＮへの変化は抗体結合の減少に多少の作用を有する。Ｐｌ　１５中 の配列ＨＹＴＲＱＮＮＴＤＶＦは、タンパク質中でＰｌ、１６エピトープと同一 の相対的位置に存在し、そして抗Ｐ１１５モノクローナル抗体への結合の原因と なる。ＡＱＡＡＮＧＧＡＳＧはある結合を示し、そして１〜３アミノ酸だけ下流 のペプチドは、ｐｌ、７モノクローナル抗体に対してさらにより大きい結合を示 す。ＶＨ２の配列ＨＦＶＱＱＴＰＱＳＱＰは抗Ｐ１，２モノクローナル抗体への 結合の原因となる。ＰＬ、１６およびＰＬ、１５中のタンパク質の配列ＱＰＱＶ ＴＮＧＶＱＧＮおよびＰＰ５ＫＳＱＰは、また、エピトープを表すと思われる。

実施例６Ｂ・　クラスＩのＯＭＰの一定領域のエピトープの同定表面のループを 形成するペプチドを調製し、そして破傷風トキソイドに接合した。バイオリンク ス（Ｂｉｏｌｙｎｘ）４］　７０自動化ペプチド合成装置［ファーマノア（Ｐｈ ａｒｍａｃ　ｉａ）／ＬＫＢコを、次の例外を除外して、連続的流れの固相合成 のために使用した。合成の最後のサイクルにおいて、ＳＡＭＡ−ＯＰ　ｆ　ｐ　 （０，５ミリモル）［ドリンフォウト）Ｊ、Ｗ、（１９８９）、Ｐｈ、Ｄ、Ｔｈ ｅｓｉｓ、オランダ国しイデンコを１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０，５ ミリモル）の存在下に３０分間、ピペリジン処理の省略する標準のプロトコル（ すなわち、ｒＦｍｏｃ−説プロツキング工程」、これはこの場合において望まし くないＳ−税アセチル反応を引き起こすであろう）を使用してカップリングした 。これらをＳＡＭＡ−ペプチドと呼ぶ。

ＴＴに接合されたペプチドおよびそれらの表面領域の位置は、次の通りである・ ０２５ｂ　ＸＡｈＮＱＲＪ４ＡｒｒＬｒＬＸＧＳｋＴＳＤヒ↓ＧＦ！、１６．　 ループ５ｏ２フ　エ〜）Ｌｌｍ）ＡＣＸＶ＾Ｖ？ｊｔＮｏ１７ｙ　クラス　２． 　ループ　５０２９　ｊｃＧ５ｖｌｊ１Ｍ；ｔ！’１ＡＯＧＧＫ５に７八〜　ク ラス　２２　ループ　１破傷風トキソイドへのＳＡＭＡ−ペプチドの接合は、次 のようにして実施した。ＤＭＦ（１００μｌ）中のＮ−スクンニミジルブロモア セテート（４，７ｍｇ、１０μモル）の溶液を、０１モルのリン酸ナトリウム緩 衝液ｐＨ７，８（３，５ｍ１）中の破傷風トキソイド（ＴＴ）（２０ｍｇ）の溶 液と混合した。１時間後、１．８ｍｌの反応混合物を、５ミリモルのＥＤＴＡを 含有する０、１モルのリン酸ナトリウム（ＰＥ緩衝液）ｐＨ６，１中で平衡化し たセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＰＤ−１０カラム［ファーマシア（Ｐｈ ａｒｍａｃ　ｉａ）］を使用してゲル濾過した。ブロモアセチル化破傷風トキソ イドを同一の緩衝液で溶離し、そして３．５ｍｌで集めた。。ブロモアセチル化 破傷風トキソイドの溶液を、ＳＡＭＡペプチド（４，５ｍｇ、３μモル）に添加 し、そしてヘリウムで脱気した。次に、１５０μｌの０．　２モルのヒドロキシ ルアミン（ＰＥ緩衝液中、ｐＨ６，１）を添加した。１６時間後、残るブロモア セチル基を緩衝液、ｐＨ６，１（１５０μｍ）中の２−アミノエタンチオール塩 酸塩（４μモル）の添加によりブロッキングした。さらに１６時間後、ペプチド −ＴＴ接合体をＰＤ−１０カラムのゲル濾過により精製し、ＰＥ緩衝液、ｐＨ６ ，１で溶離した。適当な分画を一緒にし、そして４℃において貯蔵した。

免疫学的活性を決定するために、２５μｇ（合計のタンパク質）／投与のペプチ ド−ＴＴ接合体を、第０週および第４週に６〜８週齢のＮＩＨ異系交配のマウス に皮下注射した。（注　ワクチンＬＢＶ　０１７−ＴＴおよびＬＢＶ　０１８− ＴＴを１０μｇの合計のタンパク質／投与）で使用した。血清を第１投与後６週 で収集し、そしてＥＬＩＳＡアソでイにおいて抗体の応答について評価した［ベ ウベリイ（Ｂｅｕｖｅｒｙ）ら（１９８３）インフェクンヨン・アンド・イミュ ニイー（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、）４０：３６９０３８０コ。次の抗原をマ イクロタイターのウェルの中にコーティングした　外膜タンパク質（ＯＭＰ）　 、精製したクラスＩのＯＭＰ　［ポール７：／　（ＰＯＯ１ｍａｎ）　、Ｊ、Ｔ 、ら（１９８９）インフエクション・アンド・イミュニイー（Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、）５７　：１００５］および非接合ペプチド。血清のバクテリアの 活性（Ｂ　Ｃ）を、また、測定した［［ポールマン（Ｐｏｏｌｍａｎ）　、Ｊ、 　Ｔ、ら（１９８５）ｓｕｐｒａ］。

結果を下表２に表す。

＊（）内の数はこの力価を示す光学密度（○　Ｄ　）レベルを示す。

これらのデータが示唆するユ）に、髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎ　ｉｎｇｉ　ｔｉｄｉ ｓ）のクラス］および２のＯＭＰの試験した一定の表面ループのうちで、ループ ５は、髄膜炎ｆｉｌ（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の多数の菌株のクラス１ および２と交差反応する抗体を産生ずる少なくとも１つの領域を表すように思わ れる。

クラスＩの髄膜炎菌のエピトープを含有するハイブリッドのフラジェリンをつく るために、１系列のオリゴヌクレオチドを一次のタンパク質配列のデータおよび エピトープのマツピングのデータに基づいて表示した。外膜Ｐｉ、７．Ｉ６のＶ ＲＩおよびＶＲ２に基づく２つのオリゴヌクレオチドは、それらが単一または多 数のコピーでサルモ不う・ムエンヘン（Ｓ、ｍｕｅｎｃｈｅｎ）フラジェリンの ための遺伝子内のクローニング領域の中１−クローニングすることができるよう に設計１７た。翻訳停止、・ゲナルをオリゴヌクレオチドの非解読鎖上に含めて 、クローニングさね一二イン（ナートのを発現するによるスクリーニングを促進 した。

せルモ不う゛メ２７ンヘ７（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｅｕｃｈｅｎ）の７ラノ エリンＨ１−ｄ（へＴＣＣに受託された、受は入れ番号６７６８５）のための構 造遺伝子の全体の解読領域およびプロモーター領域を含有するプラスミドベクタ ーｐＰＸ１．６５０を、フランエリシ遺伝子の３つのリーデノングフレームの各 々におけるオリゴヌクレオチドまたは遺伝子断片の挿入に適する、いくつかの独 特クローニング部位を含有するように修飾し７た。まず、ｐＰＸ１６５０をＥｃ ｏＲＶて？Ｆｔ化し、ＥｃｏＲ，ＶはｐＰＸ１６５０を２回切断し、４８塩基対 を分離し、そして再結合してプラスミドｐＰＸ１６５１を産生し、このプラスミ ドは独特ＥｃｏＲＶクローニング部位を有し、そしてフラジェリンタンパク質に おいて１６アミノ酸の欠失を生ずる。ｐＰＸ１６５１は、Ｈｌ−ｄフラジェリン に対して向けられたポリクローナル抗体でブロービングしたウェスタンブロンド 上のＥ、ｃｏｌｉの組み換え体をスクリーニングすることによって同定された。

ｐＰＸ１６５］は、野生型のフランエリ：／（１６５０の）より小さいフラジェ リンを有する、いくつかの候補の間で同定され、そして配列決定により評価した 。第２に、ｐＰＸ１６５１をＢａｍＨＩで制限し、オーバーラッピングする末端 をクレノー酵素でフィリングアウトしてえ、ベクターのポリリンカー領域におけ るＢａｍＨＩ制限酵素を除去した後、再結合した。最終の工程として、生ずるベ クターをＥｃｏＲＶで消化し、そして次のオリゴヌク１／オチドリン力−を挿入 した。

５′　、ＡＴＧ　ＡＴＣＧＡＴ　ＧＧＡ　ＴＴＣ３’３’　ＴＡＧ　ＴＡＧ　Ｃ ＴＡ　ＣＣＴ　ＡＡＧ　５′候補を新しくつくられたＢａｍＨＩ部位についてス クリーニングし、そし７てＢａｍＨＩ部位を有するいくつかの候補を、二本鎖Ｄ ＮＡ配列決定方法によりリンカ−の向きについてスクリーニングし、た。上の向 きのリンカ−を有する１つの候補は、ｐＰＸ１６４７として保持された５′、Ｇ ＡＴ　、へＴＣＡＴＣＧＡＴ　ＧＧＡ　ＴＴＣＡＴＣ。

ＥｃｏＲＶ　Ｃ１ａｌ　ＢａｍＨ１ プラスミドｐＰＸ１６４７　（第７図）をＢａｍＨＩで消化し、そしてＶＲｌま たは〜“Ｒ２のためにいずれかのオリゴヌクレオチドをＥ、ｃ。

１ｉ細胞の中にクローニングした、所望の組み換え体についてのスクリーニング は、プラスミドのミニリゼイトのＤＮＡを適当な診断制隈酵素で消化し、そして ５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の減少した移動度について特異鞭毛抗血清（Ｈｌ、−ｄ）で ハイブリッドの鞭毛をブロービングして発現についてスクリーニングすることに よって達成された。ある数の生ずるクローンは５ＤＳ−ＰＡＧＥ上の移動度の減 少を示し、ｖＲｌまたはＶＨ２のためのオリゴヌクレオチドの１または２以上の 適切な挿入を示した。

各々のいくつかをＤＮＡの配列決定による分析のために保持した。タロー〉ＣＢ Ｉ　２はｖＲｌ−のオリゴヌク１７オチドの２つのコピーの直列の挿入から生じ 、そしてクローンＣＢＩ−４は４つのオリゴヌクレオチドの挿入から生ずる。同 様に、ＣＢ２　ＰはＶＲ２オリゴヌクレオチドの単一・−のインサートを含有し 、そしてＣＢ２　Ｗは期待したトリマーのインサートを示し、ＣＢ２　Ｐクロー ンは単一の塩基対の変化を含有し、これは発現されたＶＲ２融合タンパク質中の Ｌ　ｅ　ｕからＰｈｅへの変化を生じ、そしてそれ以上の研究ために保持しなか った。Ｅ、ｃｏｌｉ中の組み換えフラジェリンのクローンを、いずれかのｖＲｌ またはＶＨ２のエビト・−ブと反応することが知られでいるモノクローナル抗体 ［アブディラヒ（、へｂｃｊｉｌｌａｈｉ）およびプールマン（ｐｏｏＩｍａｎ ）、マイク０バイアル・バソケ不ンス（Ｍｉｃｒｏ、Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉ　 ｓ）４　：　２７−３２．１９８８．ＲＩＶＭ、オランダ国コでプロービングし たモノクローナルＡｄａｍ−１（Ｐｌ、７）およびＭｎ１４−Ｃ１１６（Ｐｌ、 ７）は、＼７Ｒ１の２または４の直列のインサートを含有するハイブリッドのフ ラノニリンと反応するが、ＶＨ２を含有するクローンと反応しない。両者のモノ クローナルのＣＢＩ−４より弱いＣＢ１−２との反応は、エピトープの密度のた めであるようである。同様に、モノクローナル６２　（ＰＬ、１６）およびＭｎ １４−ｃ　１１−Ｇ　（ＰＩ。

１６）は、ＣＢ２クローンと反応するが、ＶＲＩインサートと反応しない。ＣＢ ２　Ｐクローンは、多分ＬｅｕのＰｈｅへの変化のために、いずれのＶＲ２抗体 とも反応しない。

これらのクローンの各々を、Ｈｌ−ｄ位置にＴｎｌＯ挿入を有する、ａｒｏＡ　 Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ株（ＳＬ５９２７）の中に形質転換して、ハイブリッドの鞭毛 の機能を検査した。４つのクローンの各々は運動性のバクテリアを生じた：形質 転換体の運動性は、クローンＣＢ２　Ｐを包含する、対応するモノクローナル抗 体により阻害され、完全な鞭毛中のエピトープに対するＶＲ２モノクローナルの 親和性を示した。この結果が示すように、エピトープは細胞の表面に露出され、 そして抗体はエピトープに対して接近可能である。

両者のＶＲＩおよびＶＲ２エピトープを含有するハイブリッドのフラジェリンは 、ＣＢＩ−４またはＣＢ２　ＷをＢａｍＨＩで切断し、そして異種エピトープを クローニングすることによってつくった。クローンＣＢ１２−７およびＣＢ１２ −１．０は、そねぞれ、２または４のＶＲＩの直列のインサートの背後のＶＲ２ オリゴヌクレオチドの単一のコピーのインフレームの挿入から生ずる：クローン ＣＢ２１−ＦはＶＨ２の３直列のコピーの背後のＶＲＩエピトープの１つのコピ ーの挿入から生ずる。ＣＢ１２−７およびＣＢ１２−１０はＶＲ１モノクローナ ル抗体によってのみ認識され、そしてＣＢ２１−ＦはＶＲ２モノクローナルによ ってのみ認識される。これらの結果は、予測した配列を明らかにするＤＮＡの分 析と一緒に、エピトープの密度が組み合わせたハイブリットにおいて低ずぎるこ とを示す。ＶＲＩおよびＶＨ２の両者のエピトープの密度が増加し・たノ１１′ ブリ・ノドのフラノニリンをつくるために、ＣＢ１２＝１０をＢａｍＨＩて消化 し、そしてＶＨ２をエンコードするオリゴヌクレオチドを挿入した。クローン１ ２−１０−６はＶＲ２エピトープの２一つのそれ以上の直列のインサートを念有 し、ＶＲＩの４つの直列のコピーに引き続いてＶＨ２の３つのコピーが存在する ハイブリッドのフラ７・ニリン分子を生ずる。第３図ａおよびｂに示すように、 ３つのハイブリッドのフランニリンのワクチンの候補は期待する分子の性質を有 する。

ＶＲＩの４つのコピーを含有するフラジェリン（ｐｃＢ１ｘ４）は抗Ｈ１−ｄ（ 抗フランニリン）および抗ＶＲＩのモノクローナル抗体と反応するが、抗ＶＲ２ モノクローナル抗体と反応しない、ＶＨ２の３つの直列のコピーを含有するフラ ジェリン（ｐＣＢ２−Ｗ）は抗Ｈ１−ｄおよび抗〜“Ｒ２抗体と反応するが、抗 ＶＲＩと反応しない：ＶＲ１のコピーおよびＶＨ２の３コピーを含有する組み合 わせ他ハイブリッドは両者の抗ＶＲＩおよび抗ＶＲ２のモノクローナル抗体と反 応する。組み合わせたハイブリッドは、非運動性の受容体Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ株の 中に導入したとき、運動性を特定した。

サブユニットのワクチンとし、て、目標は適当な最初のワクチンの候補を高い量 および高い純変で得ることである。適当なワクチンの候補は、モノクローナル抗 体に対する反応法および非運動性のサルモネラ属（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ ）宿主株の機能に基づいて、上のタイプの構成体から選択することができる。サ ブ二二、／トのフラジェリンのワクチンは親のフランニリンのすべての機能の面 を保持することは必要ではないが、精製の目的で表面の局在化を少なくとも保持 すべきである。いくつかのサブユニットのフラジェリンの髄膜炎菌のワクチンを 、モノクローナル抗体に対する反応性に基づいて前述のハイブリッドの分子から 選択し、そしてバクテリアの運動性の回復に基づく表面の局在化を意味する。３ つのフラジェリンのワクチン候補は、ＶＲＩの４つの直列のインサート、ＶＨ２ の３つの直列のインサート、または４つのＶＲＩのインサートおよび引き続く３ つのＶＨ２のイン±−トを含有した。フラジェリンはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏ ｎｅｌ　ｌａ）の主要なタンパク質であるので、フラジェリンについて確立され た技術を使用するワクチン接種のための十分な材料を容易に精製することができ る［ロウガン（Ｌｏｇａｎ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂ ａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）１６９　：　５０７２−５０７７．１９８７］。

実施例８：　組み換えフラジェリン分子の初期の精製３つのハイブリッドのフラ ジェリンのワクチン候補および野生型（ｐＰＸ１６５０から誘導された）を、１ リツトルのＬＢブロスを含有する４リツトルのバッフル付きフェーンバッチ（Ｆ ｅｒｎｂａｃｈ）フラスコの中に接種した。バクテリアの培養物を３７℃におい て震盪（２００ｒｐｍ）Ｌながら２２〜２４時間インキュベーションした。これ らの培養条件下に、鞭毛の大部分をバクテリアの細胞表面からはぎ落とし、そし て上澄み液の培地中で局在化した。表面の物質を得るために、鞭毛を６〜８リツ トルの培地から分離した。ワクチン接種のための精製したフラジェリン調製物を 得るために、鞭毛のフィラメントをバクテリアの培養上澄み液から次の手順によ り収穫した：硫酸アンモニウムを培養物の上澄み液に添加して、最終の溶液を５ ０％の飽和にした：この溶液を４℃においておだやかに数時間撹拌し、そして沈 澱した物質をＧＳＡローター中で５００Ｏｒｐｍで３０分間遠心することによっ て収集した。収集した硫酸アンモニウム沈澱した物質をＰＢＳ中で再構成し、そ してＰＢＳに対する４℃において１２〜１５時間透析した。透析した物質を１ｏ ｏ、０００Ｘｇで１時間５Ｗ−２７０−ター中で高速度の遠心にかけて、鞭毛の フィラメントを沈降させた。沈降した物質は、主としてフラジェリンから成り、 次の方法によりさらに沈澱させた。

実施例９：　組み換えフラジェリンのＨＰＬＣ精製高度に精製されたフラジェリ ンを調製するために、構成体、とくにｐＣＢ１２−１０−６を発現するサルモネ ラ属（Ｓａ　１ｍｏｎｅ　］　ｌ　ａ）を前述したように生長させ、そして細胞 を１０，０ＯＯＧにおいて沈澱させた。次いで、培養物の上澄み液を５０％の硫 酸アンモニウムで沈澱させ、１０．０ＯＯＧで遠心し、そして３０ｍ１のＰＢＳ の中に再懸濁した。再懸濁した沈澱を６モルの尿素、１ミリモルのＰＭＳＦ、２ ミリモルのＮＥＭ、および５ミリモルのＥＤＴＡを含有する１０ミリモルのトリ ス緩衝液（ｐＨ＝８．０）に対して４℃において一夜透析した。次いで、透析し た物質を２つのセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）のミ二カラム（各々３．Ｏ ｍｌの体積、４．Ｏｍｌの溶離液）に通過させた。

カラムを６モルの尿素を含有する１０ミリモルのトリス（ｐＨ＝８．０）中の５ ０ミリモルのＮａＣ１で、次いで６モルの尿素を含有する１０ミリモルのトリス （ｐｌ（＝８．　０）中の１モルのＮａＣｌで溶離（５×）した。５０ミリモル のＮａＣ１の最初の４つの溶離収集物（２０ｍｌ）をプールし、そして１．、Ｏ ｍｌの６モルの尿素中のアセテート緩衝液（ｐＨ＝４．０）に対して室温ζ−お いて透析した。次いて、透析した分画をＴＳＫ　ＳＰ　ＰＷカチオン交換ＨＰＬ Ｃカラム（７５ｍｍｘ３０Ｏｍｍ）上に適用した。カラムを６モルの尿素を含有 する１０ミリモルのアセテート（ｐＨ＝４．０）から成る移動相で溶離した。勾 配０〜３００５９モルのＮａＣ１を６モルの尿素を含有する１０ミリモルのアセ テート（ｐＨ＝４．０）中で５〜３０分の間隔て確立した。３０分後、勾配は次 の５分にわたって６モルの尿素を含有する１０ミリモルのアセテート中の３００ ミリモルのから１モルのＮａＣｌまでになった。フラジェリン構成体はほぼ２４ 分で集められ、これは約２００ミリモルのＮａＣｌに相当する。分画をＰＢＳに 対して透析し、そして物質について決定した純度は抗フラジェリン抗体を使用す るウェスタンプロットにより確立された。代表的なＨＰＬＣ分析および５ＤＳ− ＰＡＧＥは、それぞれ、第８図および第９図示されている。

実施例１０：　骨髄炎菌−フラジェリン糖接合体の調製群Ｃの骨髄企画の莢膜多 糖類（ＧＣＭ　ＣＰＳ：ロット＃８６　ＮＭｏｌ）は、本質的にバンドル（Ｂｕ ｎｄ　ｌ　ｅ）ら、バンドル（Ｂｕｎｄｌｅ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロ ジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２４９：４７９７−８０１．１９７４に従い調製した 。

髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｃ１ｌは、ウォルタ ー・リード・アーミイ・インスチチュート（Ｗａｉｔｅｒ　Ｒｅｅｄ　Ａｒｍｙ 　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）（ワシントＤ、　Ｃ，）から入手した。菌株をヒツジ血 液寒天プレート上で２回予備培養物し、次いで液状種培地ナイセリア属（Ｎｅｉ ｓｓｅｒｉａ）化学的に定められた培地、ＮＣＤＭ　［ケン不イ（Ｋｅｎｎｅｙ ）ら、Ｂｕ　ｌ　１．Ｗ、８．０の４０１の液体培地を液体の予備培養物で接種 した。菌株の純度を各段階において検査した。遠心後、上澄み液をセタブロン（ Ｃ６ｔａｖｌ。

ｎ）を０１％の最終濃度に添加することによって沈澱させ、そして不溶性複合体 は冷たい１モルの塩化カルシウム（ＣａＣ１２）の中に再溶解した［ゴットノユ リソヒ（Ｇｏｔｓｃｈｌｉｅｈ）ら、ジャーナル・／／Ｖ）の最終濃度に添加し た。１時間後、懸濁液を集め、そしてその濃度を８０％（ｖ／ｖ）に増加した。

１時間後、遠心（２０分、５．０００ｇ）により沈澱が得られ、これを連続的に 無水エタノール、アセトン、およびジエチルエーテルで洗浄し、次いで真空デシ ケータ−内で五酸化リン（Ｐ２Ｏ３）の存在下に一定重量に乾燥した。この粗製 ＣＰＳを一２０℃において貯蔵した。

純粋な調製物を得るために、次いでＣＰＳを酢酸ナトリウムの緩衝液（飽和溶液 の１１０希釈物、ｐ）（’ｉ’、０）中に溶解し２、そして熱フェノールで４回 抽出した［ウエストファル（Ｗｅｓｔｐｈａ＋）ら、Ｚ。

＞；ａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ、７ｂ：１４８−５５．１９５２］　。０．１モルの ＣａＣｌ２に対して一緒にした水性相の透析および引き続く遠心（３〜５時間、 １００．ＯＯＯｇ）後、前述したように、最終のエタノール沈澱は透明な上澄み 液について実施し、そして生ずる沈澱を有機溶媒で洗浄し、そして乾燥した。次 いで、純粋なＣＰＳを一２０℃において貯蔵し、た。

精製の各段階後、ＣＰＳを炭水化物のＮ−アセチルノイラミン酸、ＮＡＮＡ［ス ベン不ルホルド（Ｓｖｅｎｎｅ　ｒｈｏ　］　ｄ）　、バイオヒミカ・ニド・バ イオフィシカーアクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、ＡｃｔａＬ　２４： ６０４．９５７］、Ｏ−アセチル［ヘストリン（ＨｅｓｒｔｉｎＬジャーナル・ オブ・ハイオワ／カル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、１８０：２４９．１９４９］、およびタンパク質（２ ６０ｎｍ）含量について分析し、そしてその分子量をゲル濾過により検査した。

群Ｃの髄膜炎菌の莢膜多糖類（ＧＣＭ　ＣＰＳ）を同時に解重合し、そして水性 緩衝液中の過ヨウ素酸六トリウム（Ｎ　ａ　Ｉ　０４）の酸化を経て活性化した ［アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、）ら、ンヤーナル・オブ・イムノロジー（ Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ）、１３７：１１８１−６．１９８６　ニーＴ−ビイ　（Ｅ 　ｂ　Ｙ）　ら、Ｐｅｄｉａｔ、Ｒｅｓ、２０　：　３０８Ａ、］−９８６＋ア ンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、Ｊ、Ｐｅｄｉａｔｒ、１１１　（５）：６ ４４−５０，１９８７；アンダーソン（ＡｎｄｅｒｓｏｎＬ米国特許第４．７６ ２．７１．３号：１９８８］、反応を水性溶離液中の高性能ゲル透過クロマトグ ラフィー（ＨＰＧＰＣ）により、紫外線（ＵＶ）および屈折率（ＲＩ）の検出を 使用して監視した。

反応は停止し、そして活性化したオリゴサツカリド（ＧＣＭ　Ｏ８）を水中の低 圧ゲル透過（Ｇ　Ｐ　Ｃ）により脱塩し、次いで凍結乾燥した。次いで、溶液を 水中で調製し、引き続いて一次的貯蔵のために凍結した。

ＧＣＭ　Ｏ３およびフラジェリンｐｃＢ１２−１０−６を水性の中性の緩衝液中 で混合し、そして接合をンアノホウ水素化すトリウム（ＮａＢＨ３ＣＮ　）の添 加により開始した［アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、米国特許第４．７６２ ．７１３号：１９８８　：米国特許第４．　６７３゜５４７号、１９８７１米国 特許第４．７６１．２８３号、１９８８コ。

この反応はｂ日間実施（−１その間ＨＰ　Ｇ　Ｐ　Ｃにより監視した。それを最 後に透析／″遠心−“、゛イクロコ］／セレト１７−ターにより停止し、た、最 後の調製物は冷時に壬メロサルの存在下に貯蔵してバクテリアの生長を防止し、 た。生ずる糖接合体は発現されたＶＲＩおよびＶＲ２の髄膜炎菌のエピトープを 免疫系に提示する機構を提供するばかりでなく、かつまた髄膜炎菌のオリコサ、 カリドのプレゼンテーションのためのキャリヤー分子として働く、 接合体の調製においで、次の条件を使用した。精製したフランニリンのｐＣＢ１ ２−１０−６を１５％のスクロース（３，５ｍｇ／ｍり中に溶解し、次いで一２ ０℃において貯蔵した。ＧＣＭ　ＣＰＳ　（９，７ｍｇ：ｌ終濃度　５ｒｎｇ／ ｍｌ）を、暗所で攪拌しながら、０．０５モルのリン酸六トＩｊウム緩衝液（ｐ Ｈ６，２−６５）中の１００ミリモルのＮａ１Ｏ，により室温において酸化した 。アリコート（１００μｍ）を規則的な間隔て取り出し、反応をエチレングリコ ール（１０μｌ）の添加により停止（７、そして分析は０２モルのホスフェート −生理的塩類緩＃ｉｄ　（Ｐ　Ｂ　Ｓ　：　Ｑ、２モルのリン酸ナトリウム、０ ９％のＮａＣ１、ｐＨ７，８）中のウォーターズ（Ｗａ　ｔ　ｅ　ｒ　ｓ）　（ ？サチュセ７’７州ミルフィー−ド）内ルトラヒドロゲル（ＵＩ　ｔ　ｒａｈｙ ｃｊ　ｒｏｇｅ　］″）２５０’−１２０Ｃカップリングされた２カラム：２Ｘ ３００ｍｍｘ７８ｍｍ）のＨＰＧＰＣにより、０．３ｍｌ／分の流速で、紫外線 （２０６ｎｍ）およびＲ】検出を使用して実施した。２．５時間後、反応はエチ レンクリコール（反応体積の１／’１０）の添加により停止し、モしてＧＣＭ　 Ｏ５を氷山のハイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（カリフォルニア州すッチモント ）のｌ＼イオーケル（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｇｅ　］Ｒ）Ｐ−２（２００−４００メソシ ユ、３０ｃｍｘ１．５ｃｍ）により約１８ｍ１／時間て脱塩した。分画を集め（ １，２ｍ、）そしてＮＡＮＡ炭水化炭水化物上チルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）Ｉ バリー（Ｂａｒｒｙ）ら、ツヤ−ナル・オブ・ノエ不うル・マイクロハイオロノ ー（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ　］、）２９　：　３３５−５２．１９６２］ およびアルデヒド［ポロ（Ｐｏｒｒｏ）ら、アナリティカル・バイオケミストリ ー（ＡｎａｌｙｔＢｉｏｃｈｅｍ、）１１８：３０１．−３０６．１９８１コに ついて分析した。陽性の分画をプールし、そして凍結乾燥した。次いで、脱塩し たＧＣＭ　Ｏ３（４，７ｍｇ）を水中に溶解しく１０ｍｇ／ｍｌ）そして−２０ ℃において凍結した。

ＧＣＭ　ＯＳおよびｐｃＢ１２−１０−６の溶液を、ＨＰＧＰＣ（それぞれ、２ ０６および２８０ｎｍにおける紫外線）により、凍結の前および接合の前に分析 した。溶離のプロフィルの正確な類似性により確証して、貯蔵の間に消化は起こ らなかった。

ＧＣＭ　Ｏ３（２ｍｇ；最終濃度　２．６ｍｇ／ｍｌ）およびフラジェリンｐｃ Ｂ１２−１０−６　（２，３ｍｇ；最終濃度：３ｍｇ／ｍｌ）をポリプロピレン 管内で０．　４モルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７０）中の混合し、そして ＮａＢＨ３ＣＮを添加（１２μモル）して接合を開始した［アンダーソン（Ａｎ ｄｅｒｓｏｎ）、米国特許第４，７６２．７１３号：１９８８　；米国特許第４ ．６７３．５４７号：米国特許第４．７６１．．２８３号コ。反応混合物は室温 において１日間、次いで３５℃において４日間撹拌しないで放置した。この反応 はＨＰＧＰＣ（２８０ｎｍにおける紫外線）異なる段階において監視し、最後に 透析／ａ縮によりマイクロコンセントレータ−で停止した。最終濃度をＮＡＮＡ ［バリー（Ｂａｒｒｙ）ら、ツヤ−ナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオｏ ン　（Ｊ、Ｇｅｎ　〜ｉｉ　ｃ　ｒｏｂ　ｉ　］、）　２９　：　３３５−１う ２．１９６２１および（０，１２ｍｇ、／ｍＩにおいて０．０９ｍｇ）およびタ ユ７・バク質［し１ウリイ（Ｌｏｗｒｙ）ら、ンヤーナル・オブ・７＜イオロノ カル・ケＥ　ストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）１９３：２６５−２７５． １９５］）（１，１２ｍｇ：Ｌ　４５ｍｇ／ｍｌ）含量について分析した。次い で、それを４°Ｃにおいてチメロサル（００１％、Ｗ、／Ｖ）の存在下に貯蔵し てバクテリアの生長を防止した１、接合体の調製は、また、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　 （硝酸銀の染色）およびウェスタンプロフト分析により検査した。いくつかの高 分子量の）＜ノドはケル上に純粋なｐｃＢ１２−１０−６のバンドより上にかつ 積み重なったウェル付近に現れ、後者は接合の間に交差連鎖が起こった証拠であ った。ウェスタンプロット分析において、各バンドは使用した抗血清（抗ＧＣＭ 、−ＶＲＩおよびＶＲ２）と反応性であることが示され、接合の共存結合を証明 した。

Ｍ２ＯおよびＭ２１と表示するペプチドをＡＢＩ型のペプチド合成装置で同相合 成によりｔＢｏｃ化学を使用して産生じ、２官能性交差剤、スルフォスクシニミ ノル（４−ヨウドアセチル）アミノベンゾエート「スルフｔ　（Ｓｕｌ　ｆｏ） ＳＬＡＢ：ピアース（Ｐ　ｉ　ｅ　ｒ　ｃ　ｅ）から購入した］を使用して発表 された手順ロウエルトマン（Ｗｅ　］　ｔ　ｍａ　ｎ）Ｊ、に、ら（１９８３ン ／＜イｒ−テクニークス（Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｇｕｅｓ’）１．１４８　１５ ２１の変更法に従い、ＣＲＭ　＋　９７１アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、 米国特許第４．７６２．７１３号］にカップリングした。簡単に述べると、ＣＲ Ｍ　＋　ｅ　７をスルフォ５ＩＡＢにより活性化し、５ＩＡＢとＣＲＭ、９□の アミノ基との間のアミド結合を生じた。活性化したＣＲＭ１９７から反応しなか った架橋剤をゲル濾過により除去した後、カルボキシ末端のンステイン残基をも つ連鎖スペーサー（下線をした文字で表されている）を含有するペプチド（Ｍ２ ＯまたはＭ２１）を活性化ＣＲＭと混合し、そして室温において２〜４時間イン キュベーションした。反応後、接合した物質をＰＢＳに対して４℃において広範 に透析した。

Ｍ２０ペプチド（ＶＲ２エピトープ）の配列は、次の通りであるニドτｙｒ−丁 γトτｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−丁ｈｒ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−τｈ ｒ−Ｌ＠ｕ−Ｖ−ａ　ｌ−１’　ｒ　ｏ　−酷り旦ｈ−Ａシヒ≦＊　−郭Ｍ２１ ペプチド（ＶＲＩエピトープ）の配列は、次の通りである。

ト＾１ａ−（：Ｉｎ−Ａｌａ−＾１畠−＾５ｎ−Ｃ１ｙ−Ｃ１ｙ−Ａｌａ−５ｅ ｒ４１ｙ−にｌｎ−Ｖａｌ−Ｌ−ｙｓ−Ａｌｍ−に１ヱ込暉ヒ≦１四り 接合した物質を５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜［インモビリン（Ｉｍｍｏ ｂ　ｉ　ｌ　ｏｎ）　、ミリポア（Ｍｉ　ｌ　］　１ｐｏｒｅ）］に移し、そし てＶＲＩおよびＶＲ２エピトープを認識する特異的モノクローナル抗体と反応し た。第１０図ａおよび第１０図すは、ＶＲｌおよびＶＲ２特異的モノクローナル 抗体（Ａｄａｍ　Ｌ　Ｇ２−ＤＩ２−８　（Ｐｌ７）　、ＭＮ５−Ｃ１１−Ｇ　 （ＰＩ。１６）およびＭＮＩ４−Ｃ１１−６（Ｐｌ、７）］のプブーに対して、 Ｍ２ＯおよびＭ２１のＣＲＭ　＋　、を接合体のウェスタンプロット分析を示す ０Ｍ２０およびＭ２１ペプチドに対する抗体の応答を酵素連鎖イムノアッセイ手 順によりアンセイするために、ＢＳＡ接合体は、ベルナトウィズ（Ｂｅｒｎａｔ ｏｗｉ　ｃｚ）およびマツエダ（Ｍａｔｓｕｅｄａ）［アナリティカル・バイオ ケミストリー（Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１５５．９５−１０２　（１ ９８６）コに記載されているように、異なる２官能件の架橋剤、Ｎ−スクシニミ ジルブロモアセテートを使用することによって調製した。タンパク質へのペプチ ドの共有結合のカップリングは、ＣＲＭ＋ｏｔ接合体について記載したように、 電気泳動にかけた試料のウェスタンブロッティングにより確証された。

ＣＲＭ＋＊ｔへのＶＲＩおよびＶＨ２のエピトープの接合がＣＲＭ、、、のＴ細 胞の認識に悪影響を及ぼすかどうかを決定するために、ビクスラ−（Ｂ　ｉ　ｘ 　］　ｅ　ｒ）およびアタッン（Ａｔａｓｓｉ）［Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｃｏｍｍｕｎ、１２：５９３．１９８３コに前に記載されたように、Ｔ細胞の増 殖のアッセイを実施した。蘭単に述べると、ＳＪＬ／ｊマウスをＣＦＡ中で乳化 した５０μｇの自然ＣＲＭ１９７で免疫化した。７日後、リンパ節を取り出し、 ＲＰＭＩ中で培養し、そして種々の濃度のタンパク質（０，０５〜］、００．０ μｇ／ｍｌ）およびペプチドで対抗した。３日間インキュベーションした後、培 養物を［３Ｈ］−チミジンで１６時間バルンングし、次いで計数のために収穫し た。

表３に示すよ・うに、ＣＲＭ＋　、７とＣＲＭ　１ｅ　７−偽接合体とを比較す ると、接合手順それ自体はタンパク質のＴ細胞の認識を変更しないことが示され る。Ｍ２ＯおよびＭ２１−ＣＲＭ、、７接合体により誘発されたＴ細胞の応答は 、ＣＲＭ　Ｉ　Ｑ−、それ自体により引き出される応答に本質的に等しいか、あ るいはそれより大きく、ＣＲＭ　＋　ｅ　７上の下細胞のエピトープの認識はベ ブヂｈの接合により悪影響を及ぼされないことか示される。対竪物質のＣｏｎＡ 、ＬＰＳおよび破傷風トキソイドに対する応答は期待される通りであり７′−８ 寒奥廼１３：ｉ６倦に４谷１勲ｉ竺ふ遺１す１シρｙワクチンｐりｌ引艷惟Ｍ膜 企画のＶＲｌおよび、／またはＶ　Ｒ２のエピトープを発現する組み換えフラジ ェリンを、実施例７．８および９に記載するように、調製しそして精ｖ：した。

さらに、髄膜炎菌のエピトープのＶＲｌおよびＶＨ２を表す合成ペプチドを、実 施例１２におけるように、合成し、キャリヤー分子のＣＲＭ、９□にカップリン グし、そして精製した。これらの物質の各を成力の各々について１０または１０ ０μｇ／ｍｌのタンパク質濃度で、ワクヱンを配合した（３７）クチン組成物は 、また、リン酸アルミニウムを１ｍｇ／ｍｌで含有するか、あるいは特記しない 限り、フロイント完全アンユバントと配合しまたか、あるいは補助物質を含有し なかった。

免疫原性を評価するために、異系交配のスーイスウェブスター（Ｓｗｉｓｓ　Ｗ ｅｂｓｔｅｒ）マウスを第０週および第２週においてコまたは１０μｇのタンパ ク質／・′投与て筋肉内で免疫化した。血清を２週の間隔で収集１７、アノ→τ イのためにプールし、そしてＥＬＴＳＡにより外膜複合体（ＯＭＣ）　、精製し た○ＭＰ　（Ｍ２１−ＢＳＡ’）　、ＢＳＡにカップｌ、弓ズしたＶＲ２ベブ千 ｆ”　（Ｍ２Ｏ−ＢＳＡ）　、野生型フラ’ｉ　、ｘ　’）シ・、およびＣＲＭ 、、、に対する抗体の活性についてスクリーニングした。第６週に得られた血清 について実施されたＥＬＩＳＡの結果を表４に示す。

’１／１００希釈のアッセイの下限またはそれより低いすべての採血前の値。

２すべでのワクチンは、特記しない限り、１ｍｇ／ｍｌのリン酸アルミニウムを 使用して配合した。

あるいは、種々のワクチンを６〜８週齢のＮＩＨ異系交配のマウスにおいて免疫 原性について評価した。マウスを１００μｇ（合計のタンパク質）／投与で第０ 週および第４週にワクチンで皮下的に免疫化し、そして血清を第６週に集めた。

血清を、実施例６に記載するように、ＥＬ■ＳＡのアッセイにより抗原を使用し て評価した。殺バクテリア活性を実施例６におけるように測定した。結果を表５ に記載する。

ＶＲＩ、ＶＲ２または両者のＶＲｌおよびＶＲ２のカセットを含有する組み換え フラノニリンは、精製したＰｌ　１６に対して、そしてより低い探度にＯＭＣに 対して交差反応性である、抗体の応答を引き出すことにおいて有効であった。１ ０μｇのｐｃＢｌ−４またはｐＣＢ２−ｗで免疫化１、また動物からの血清は、 それらのそれぞれのペプチド−ＢＳＡ接合体に結合しプ；らびにＰｌ、１６およ びＯＭＣと交差反応する抗体を誘発し、た。両者の髄膜炎菌のエピトープを含有 する構成したｐ　ＣＢ　］、　２−１０−６を使用して、同様な結果が得られた 。さらに、各構成体は有意の抗フラジェリンの力価を同様によく誘発した。対照 的に、対照の野生型フランニリンはフラジェリンそれ自体に対して応答性の抗体 のみを誘発した。免疫化前に隼めた血清は、評価した物質に対する前以て存在す る応答を示さなかった。

データは、また、明春または他のアジュバント、例えば、ＣＦ、へを使用する組 み換えフラジェリンの配合の有益性を実証する。構成体ｐＣＢ１２−４０−６を リン酸アルミニウムを添加して、あるいは添加しないで配合した。表２に示すよ うに、ｐｃＢｌ２−ＩＯ−６は、単独で、ペプチドの接合体ならびに精製したＰ ｌ、】、６ならびにＱＭＣと反応性の抗体の応答を誘発することができた。対照 的に、同一の構成体は、明瞥と配合（、たとき、等しい投与量でより大きい抗体 の応答を引き出すことができた。同様に、組み換えフラジェリンｐｃＢ１−４お よびｐＣＢ２−ｗは、また、ＣＦ　Ａと配合した。再び、等しいまたはより高い 抗体力偽はＧＰＡの存在下に観測された。

骨髄企画のＶＲＩおよび＼’Ｒ２接合体を使用する免疫原性の研究の結果を、ま た、表４に示すっ両者のＭ２ＯおよびＭ２１　ＣＲＭ＋＊７接合体ならびに等し い量の両者を含有する混合物は、抗ＣＲＭＩ９７の応答ならびに抗クラスＩのＯ ＭＰの応答を誘発することができた。

これらの予備的データが示すように、キャリヤーに化学的に接合しているか、あ るいはキャリヤーに遺伝子的に融合した、クラスＩのＯＭＰの可変領域のエビト ・−ブは免疫応答を引き出すことができる。新しいエピトープ−キャリヤー接合 体を、標準の技術を使用して、つ（って、ワクチン、例えば、１）より大きいエ ピトープ、２）多数のエピトープの反復をもつペプチドおよび／または３）異な るキャリヤーの使用、に対する免疫応答を増強することができる。

実施例１４・　骨髄炎菌−ヒト血清アルブミン糖接合体の調製ＧＣＭ　ＣＰＳを 酸加水分解により解重合させ、そして得られたＧＣＭ　Ｏ３を引き続いて水性緩 衝液中でＮａｌ０．酸化を経て活性化した。

反応は水性溶離液中でＨＰＧＰＣにより、紫外線およびＲＩの検出を使用して監 視した。反応の各々を水中のＧＰＣ脱塩により追跡した。ＧＰＣＯ８およびヒト アルブミン（ＨＡ）を混合し、そして本質的に実施例１０において骨髄炎菌−フ ラジェリン糖接合体について記載したように接合した。最後の調製物をバクテリ アの生長を防止するためにチメロサルの存在下に冷所で貯蔵した。

接合体の調製において、次の実験の条件使用した。ヒトアルブミン［ＨＡ：ノブ ７　（Ｓ　ｉ　ｇｍａｌｌ）　、ミゾリー州セントルイス］を１５％のスクロー ス中に溶解しく１０ｍｇ／ｍｌ）　、次いで一２０℃において貯蔵した。ＧＣＭ 　ＣＰＳ　（Ｏット＃８６　ＮＭ　０１；１０６ｍｇ；最終濃度　ＩＱｍｇ／′ ｍｌ）を０．ＩＮのＨＣｌ中で撹拌しながら５０℃において加水分解した。アリ コート（２５ｇｌ）を規則的な間隔て取り出し、反応を水酸化、ｈＨリウム（Ｎ ａＯＨ）の添加により停止し、そして記載したようにＨＰ　Ｇ　Ｐ　Ｃにより分 析した。３時間４０分後、反応をＮａＯＨの添加により停止し、そしてＧＣＭ　 Ｏ８をＧＰＣにより脱塩した。分画を集め（１，２ｍ１）　、そして前述のよう に分析した。陽性の分画をプールし、そして凍結乾燥した。次いで、脱塩したＧ ＣＭＯＳ　（８９ｍｇ）を−２０℃において貯蔵した。ＧＣＭ　Ｏ５（１１８ｍ ｇ　；最終濃度　５ｍｇ／ｍｌ）を０．０５モルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐ Ｈ６，２−６，５）中の２ミリモルのＮａｌ０．で室温において暗所において撹 拌しながら酸化することによって、活性化したＯ８を調製した。３０分後、エチ レングリコールの添圓により反応を停止した。ＨＰＧＰＣの分析は、活性化の間 にＯ３の分子量の減少を示さなかった。次いで、脱塩および比色分析を前述した ように実施した。生ずる活性化ＧＣＭ　Ｏ５（８，８ｍｇ）を水中に溶解しく　 １０　ｍ　ｇ　／　ｍ　り、そして−２０℃で凍結した。

ＧＣＭ　Ｏ３およびＨＡの両者の溶液を、凍結前および接合の前に、ＨＰＧＰＣ （それぞれ、２０６および２８０ｎｍの紫外線）により分析した。正確に類似す る溶離のプロフィルにより確認されるように、貯蔵の間に劣化は起こらなかった 。

Ｇ　ＣＭ　○Ｓ　（６ｍｇニーＩｋＰ：濃変：　２．５ｍｇ／ｍｌ）およびＨＡ （１２ｍｇ：最終濃度　５　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）をポリプロピレン管内で０ ４モルのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）中で混合し、そしてＮａＢＨ３ ＣＮ　（６０１１モル）を添加して接合を開始した「アンダーソン（Ａｎｄｅｒ ｓｏｎ）、米国特許第４．７６２．７１３号：１９８８：米国特許第４．　６７ ３．５・４７号、１９８７　：米国特許第４．　７６１゜２８３号、１９８８〕 。反応混合物を、撹拌せずに、室温において１日間、次いで１５３５℃において ４日間放置した。この反応はＨＰＧＰＣ（２８０ｎｍにおける紫外線）異なる段 階において監視し、最後に透析／濃縮によりマイクロコンセントレータ−で停止 した。最終濃度をＮＡＮＡ　［ハ’）−（Ｂａｒｒｙ）ら、／ヤーナル・オブ・ ンエ不うル・マイクロ／＜イオロシー（Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉ　ｌ。）２ ９：３３５−５Ｌ　１９６２コ　（２，０７ｍｇＸ１）、８６ｍｇ／ｍｌにおい て）および（０，１２ｍｇ／ｍＩにおいて０．０９ｍｇ）およびタンパク質［ロ ウリイ（Ｌｏｗｒｙ）ら、ンヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）１９３：２６５−２７５．１９５１］　（９，５１ ｍｇ：３．９６ｍｇ／ｍｌｌニーおいて）ノ含量ニツいて分析した。次いで、そ れを４℃においてチメロサル（０，０１％、Ｗ　／　Ｖ　）の存在下に貯蔵して バクテリアの生長を防止した。

接合体の調製は、また、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（硝酸銀の染色）およびウェスタン プロット分析により検査した。拡散のバンドはゲル上に現れ、純粋なＩ−（Ａよ り有意に広い分子量の範囲をカバーした。ウェスタンプロット分析において、こ のバンドは使用した抗血清（抗ＧＣＭ）と反応性であることが示され、接合の共 有結合を証明した。

髄膜炎菌のオリゴサツカリド−組み換えフラジェリンのワクチンを、前述したよ うに調製し７、そして１００μｇのタンパク質／ｍｌで配合した。また、糖接合 体に加えて、リン酸アルミニウムを１ｍｇ／ｍｌまたはフロイント完全アジュバ ントを含有するワクチン組成物を調製した。

免疫原性を評価するために、異系交配のスイスウェブスター（Ｓｗｉｓｓ　Ｗｅ ｂｓｔｅｒ）マウスを第０週および第２週において１０μｇのタンパク質で筋肉 内で免疫化した。血清を第０，２週で集め、次いで１週の間隔で第６週まで集め た。収集後、プールした血清試料をＥＬＦＳＡによりヒト血清アルブミン、０Ｍ Ｃ５Ｐ１．１６、ＣＢＩおよびＣＢ２−ＢＳＡ接合体およびフランニリンに対す る髄膜炎菌Ｃオリコサツカリド接合に対する抗体の活性についてアッセイした。

ＭｅｎＣ−ＣＢ１２−１０６糖接合体は、組み換えフラジェリン中で発現された オリゴサツカリドおよび髄膜炎菌のＢ　ＯＭＰエピトープの両者と反応性の免疫 応答を引き出すことにおいて有効であった。表５Ｂに示すように、研究に入って から３週程度に短い期間で、完全フロインドアンユバシト中の１μｇのＭｅｎＣ −ＣＢ１２−１０６で免疫化したマウスはＭｅｎＣ−Ｈ８Ａ、ＯＭＰおよび両者 のＣＢＩおよびＣＢ２のエピトープに対する検出可能な抗体を有した。さらに、 すべてのＭｅｎＣ−ＣＢ１２−１０６の調製物は、アジュバントに無関係に、Ｍ 　ｅ　ｎ　Ｃ−ＣＲＭ１９７で免疫化後観測される応答より大きい、ＭｅｎＣ− Ｈ３Ａに対する抗体の応答を引き出した。

１　初期の採血前の（第０週）試料についての力価はく１００であった。

２　リン酸アルミニウムを１ｍｇ／ｍｌでアジュバントとして使用した。

有効なワクチンは１または２以上のＴ細胞のエピトープを含有しな（ではならな い。タンパク質的のＴ細胞のエピトープは、マーガリット（Ｍａｒｇａｌｉｔ） ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、１ｍｍｕｎｏ　１）１３８　：　２ ２１３　（１９８７）またはロスバード（Ｒｏｔｈｂａｒｄ）およびタイラー（ Ｔａｙ　ｌ　ｏｒ）　、ＥＭＢＯジャーナル（Ｊ、）７　：９３　（１９８８） に記載されているように、予測することができる。これらの予測方法は、髄膜炎 菌（Ｎ、ｍｅｎ　ｉｎｇｉｔ　１ｄｉｓ）株Ｐ１．７．１６、Ｐｌ、６およびＰ ｌ、５のクラスＩのＯＭＰのアミノ酸配列に適用した。これらの方法により同定 される潜在的Ｔ細胞のエピトープを含有する配列のセグメントは、表６および７ 示されている。予測されたペプチドを標準のＦＭＯＣ手順により合成し、標準の 方法により精製し、そして表８に示すように同定された。

予測されたペプチドが実際にＴ細胞のエピトープを含有するかどうかを決定する ために、ヒト末梢血液のリンパ球（Ｐ　Ｂ　Ｌ）を刺激するそれらの能力をリン パ球の増殖アッセイにより試験した。簡単に述べると、末梢血液をＨＬ　Ａ型別 正常のボランティアからか、あるいはＭＰＣ−２［ブールマン（Ｐｏｏ　Ｉｍａ ｎ）　、Ｊ、Ｔ　ら、アンドユニ・ヴアン・リーウウエンヘク（、Ａｎｔｏｎｉ ｅ　ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ）４のＯＭＰおよび群Ｃの多糖類を含有し た、で前辺て免疫化したボランティアから集めた。リンパ球を末梢血液からフィ コルーハイバーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）［ファーマシア・ファイン ・ケミカルス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）ＡＢ、ス ウェーデン国つップサラ］で分離し、そして１０％の熱不活性化しプールしたヒ ト末梢血液を含有する、補充したＲＰＭ１１６４０　［ギブコ・ラボラトリーズ （Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、スコツトランド国パイスリイ］中 の１×１０５細胞／ウエルで培養した。培養物を種々の濃度の予測されたＴ細胞 のエピトープ（０，０５〜１０μｇ／ｍｌ）で対抗した。生体外の対抗後、培養 物を６日間インキコベーションし、次いで０．　５μＣｉの［３Ｈ］−チミジン でパルシング（１８時間）した。次いで、培養物を収穫し、そして液体シンチレ ーションにより計数した。データを刺激指数として表し、ここで指数は抗原の存 在下に得られたＣＰＭ対抗原のの不存在下に得られたＣＰＭの比として計算した 。

表９に示すように、］６の予測されたペプチドのうち１０はＴ細胞を刺激する多 少の能力を示した。これらは、１．６−３４．４７−５９．７８−９０．１０３ −１２１．１２４−１３７．１５１−１５８．１７６−１８５．２２３−２４５ ．２７６−２９１および３０４−３２２に同定されたペプチドを包含する。ある 場合において、ペプチドは両者の免疫化し、たならびに非免疫の個体において応 答を刺激した。非免疫の個体における応答は、前の無症候性の感染に帰属させる ことができる。

領域１７６−１８５として同定されたＴ細胞のエピトープの場合において、Ｔ細 胞の応答の増強はモノクローナル抗体ＭＮ５Ｃ１１Ｇ　（Ｐｌｌ−６）の添加後 観測された。簡単に述べると、ＰＢＬを生体外で領域１７５−１８５を含有する 合成ペプチドで対抗するか、あるいはＭ　Ｎ、）Ｃ１］−Ｇの変化する希釈物と 混合したこのペプチドで対抗した。表１０に示すように、Ｔ細胞の応答の増強は ＭＮ５Ｃ１１Ｇの添加後に観測され、モノクローナル抗体は領域１７６−１８５ を認識ｔたことが示され、そして免疫系へのペプチドのプレゼンテーンヨンを促 進する。こうして、′ｒおよびＢ細胞のエピトープは、一致するか、あるいはク ラス■のＯＭＰ内の隣接する配列上に見いだされることが確立された。

いくつかの場合においてＴ細胞系およびクローンは種々のペプチドに対して応答 する個体から確立された。簡単に述べると、Ｔ細胞系は、分離したリンパ球を２ ４ウエルのプレート中でＩＸ］、０’細胞／ｍｌで培養することによって得られ た。１０％のヒト血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０の培地は、また、１２ＬＴ ／ｍｌの組み換えＩＬ−２［ベーリンカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）］を含有し た。さらに、５ｘｌＯ’の相同性の照射した（３．０ＯＯＲ）抗原を表す細胞（ ＡＰＣ）を、また、各ウェルに添加した。ある場合において１、八ＰＣはＨＬＡ 適合性ドナーから得た。系統から、Ｔ細胞のクローンを制限希釈により０５細胞 ／ウニルの頻度で分離した。クローンは照射したＡ　Ｐ　ＣおよびＩ　Ｌ−２（ ２Ｕ／ｍｌ）の存在下に抗原による２週の刺激により維持した。クローンは本質 的に前述したようにリンパ球の増殖のア・ソセイにより試験したがただし、クロ ーンは照射し？−，ＡＰＣの存在下にｌＸｌ０’細胞／ウエルで培ｔした。

記載したようにし、て得られたクローンを、生体外で、７つの異なる髄膜炎菌の 株からのＯＭＰで対抗した。表１１に示すように、クローンはＴ細胞のエピトー プまたは検査した７つのＯＭＰに対して共通のエピトープを認識した。種々のペ プチドに対するこれらのクローンの反応性はまだ決定されていないが、それにも かかわらず、種々の菌株の間のＴ細胞のエピトープの共通性を示す。ここでこれ らのクローンは確立されそして同定されたので、それらのペプチドの反応性は種 々の用途のためのＴ細胞のエピトープを示すであろう。

ｇ６ マルガリフトらの方法（）　Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８・２２１３．１９８？）に ぽう両極性のａ−らせんのｒｒ在についての＆！腹炎閘のｒ’１．１６０ＭＰの 配列のう）析ブロックの中Ａ　Ｆｌｌ寛　入Ｓ Ｐ　４７−５ｏ　８５−１０ｓ　９．４６９−７４　１０５−１３５　１６．０ 罠　７９−８８　９０〜１２０　２３．Ｏ１２フー１３５　１００−１２０　２ ２．４１９９−２０２　９０−１２０　６．４Ｐ　２０１−２１１　Ｉｔｓ−９ ５８，７，２６０−２６３９０−１２５！１＋　＠Ｐ　２６５〜２６９　９０− １２０　１１ｊ２７４−２フフ　ＩＱｓ−１２０９，１１２９７−３００Ｚｏｏ −１３５９，１ ｖ　３２０−３２４　８０−１００　１０．９３４６−３５１　８０−１１５　 １１０ｇ３フ＆−３１９８５−１２０ｇ、５ 表　７ ウス昌−＋：およびタイラーの方法（ＥＭＢＯＪ、７９３、＋　９８８１　によ ’）決？さｔｚｆ：ｕＮ％ＺのＰ１＋６０ＭＰの配テ１内の潜在的Ｔ細胞のエピ トープを表すモチーフ（Ｆ線領域）のａ在 ？＋１ＸＩＫＬＴ＾ＬＶＬ３人ＬＦＬＡＡ％ｌＡＤＶｇＬＹＯＥＸＸ入ＧＶＫＧ ＩＮＸＱｋＱＬＴＥＱＰＱＶＴＮＧＶＱＧＨＱＶＫＶＴＫｋＫｍｌＬＸ真ＴＫＩ ＭＤｒＧ＄　Ｆ　！　Ｇ　ｒ　Ｋ　Ｇ　＄　ｔ　Ｄ　Ｌ　Ｇ　ｔ　Ｇ　Ｌ　５　 Ｌ　Ｅ　Ｑ　Ｄ　Ｖ　＄　Ｖ　Ａ　Ｇ　Ｏに　ｋ　＄　Ｑ　Ｉｌｌ　f ＮＲＥＳ　ｒ！ＧＬＡＧＥＦＧ？ＬＩＬＡＧＩＶＡＭＱｒＤＤＡｇＱＡＩＮＦＩ ｌｆＤＩＮＮＤＶＡＩＱＬＣ！ヱｔｌｌＤＤＩｌデＶＳＶ諷τｏｚｔｔｒｓａｒ ｇａｓｗ。

ＦＶＰＡＯＮｊＫｇＡＹＥＰＡＴＹ？ＫＤ？圓ＮＩＬｉＬＩＦＰＡＶＶＯＥＦＯ ＩＩＤＶＹＹＡＯＬ）ｌＹ＆ｌ１ｌｃＧＦＡＱＮＹＡｒＫＹ＾罠厘入ｘｖｏ簾ｗ Ａｒｔｔ、ｒＬ！Ｇ＄Ａ？＄ｔ１ｇＡＫＧ？ＤＦＬＫＩＩＩＱＶＩＩ諷を丁ＧＧ Ｙ！冨ＧＯＬＮＬＡＬＡＡＱＬＤＬｇＥＭＧＤＥＡＫＴＫＨｇデ？冨ｆＡＡ？Ａ ｌ１ｒｌｒＧ）ＩＡＶＦ罠Ｘ　ｇ　ＹＡＭＧｒＤＬｒｔｌＬＧＫＫＧｔＨＴｇＹ ＤＱｌ　！ＡＧＶｔ）Ｙｒ３ｒｇＫｍ１丁８ＡＩＶＳＧｋ’ｌＬＫ諷圓テ０１０ １１ＹＴＱＩＮ＾Ａｌ！Ｖｌ：ＬＩＩＫＦ表　８ 合成されたＴ−謝されたＴ綿鞄のエピトープの要約２、　４７−５９　τに！５ ＤｒＧＳｒｌＧｒＫ３、　５７−７１　ＧｒＫＧＳＥＤＬＧＥＧＬＫＡ１／４、 　７８−９０　ＶＳＶＡＧＧＧｋＳＱＷＧＮ５、　１０３−１２１　丁ＬＲＡＧ ＲＶＡＮＱｒＤＤＡＳＱＡｒＮ６、　１２４−１３７　Ｄ５ＮＮＤＶＡ５Ｑｔ、 ＧＩｒＫフ、　ｌ５Ｘ−１ｓａ　ＧＧｒＳＧｒＳＧｌｌ−１７６−１１１５ＹＹ ＴにｔＪＴＮに）ＪＬ９、　１９０−２０２　人ＷＧＫＰＧＳＤＶＹＹＡ１０、 　２１５−２２８　Ｙ＾ｒＫＹＡＲ）ＪＡＨＶＧＩＮｌｌ、　２２３−２４５　 ｋＭＶＧＫＮｋｒＥＬｒＬＩＧＳ入ＴＳＤｔＡＫＧ１２、　ハト２６１　ＤＥＡ ＫＧ？ＤＰＬＫＮＨＱＶＨＲＬ丁ＧＧＹＩＬ　２７６−２９１　ＬＳｔＮＧＤＫ ＡＫＴＫＮ！；ＴＴｔ１４、　３０４−３２２　ＶＰＲＩＳＹＡ）ＩＧｒＤＬ！ ＥＲＧＫＫＧ１５、　３１７−３２９　ｔＫＧＫＫＧｒ：ＮＴｓＹＤＱ１６、　 ３５２−３Ｇ６　莢罠ＮＴＧＸＧＮＹＴＱＩＮ＾＾トル＾１別ボラ／ティＴにお りる藺＃Ｉ棗隋のｈ続ベブヂドに対するリン／Ｃ躇の応答のｒｒ１Ｈ９＞ｆｚ７ ／ＨＬＡ〒　１　２　】　４　Ｓ　ｇ　フ　＠　９１・　１１　１２　１３　１ ４　１５　Ｂ応答は次のようなスコアを有するニー、Ｓｌ＜２；±、２＜ＳＩ＜ 及び＋、ＳＩ＞３゜ 下線の領域はモノクローナル抗体ＭＮ５Ｃ１１Ｇにより認識される配列を示す。

実施例１７　クラス■のＯＭＰの膜のトポロン−のためのタンパク質いくつかの 大腸菌の外股タンパク質の構造について認識された原理を使用してモデルを構成 した［ホウゲル（■○ｇｅ　ｌ）　、Ｈら（１９８６）ｓｕｐｒａ：フエレンチ （Ｆｅｒｅｎｃｉ）、Ｔ　ら（１９８８）ｓｕｐｒａ；およびトマッセン（Ｔｏ ｍｍａｓｓｅｎ）、Ｊ、（１９８８）ｓｕｐｒａ］。中心の仮定は、他の膜をス バニングするタンパク質のセグメントはベーターシートを形成するということで ある。詳しくは、クラス１のタンパク質の場合において、露出したトランスメン ブレンのセグメントにおける分割は、次の方法において到達した。

］、　クラス１のタンパク質（サブタイプＰ１．１６）のアミノ酸と淋菌のＰＩ ＡおよびＰＩＢタンパク質のアミノ酸配列との比較［カボネノチ（Ｃａｒｂｏｎ ｅｔｔｉ）、Ｎ、Ｈ，ら（１９８７）Ｐトソユリチ（Ｇｏｔｓｃｈｌ　１ｃｈ） Ｅ、Ｃ１ら（１９８７）ＰＮＡＳ　８４：８１３５１は３４％の同一性を明らか にする。このモデルにおいて、可変配列は表面の露出された部分を形成し、これ に対して保存された領域はほとんど外膜および周辺質の中に位置する。こうして 、後者の２つの領域はすべての夕〉バク質の間に保存される残基の５８％を構成 する。

２、　親水性の最大はヒトロバノーのプロフィル［カイト（Ｋｙｔｅ）、Ｊ　ら （１９８２）　／ヤーナル・オブ・モレキュラー・バイオロン−（Ｊ、Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、）１５７：１０５コにおいて露出された領域に相当することが観測さ れた。

３、トランスメンブレンのセグメントは９−１２塩基の両極性のベーター鎖を優 先的に形成することができ、少なくとも］つの側は完全に疎水性残基から成る。

これらの条件は、１６の膜−スパニングセグメントのうちで１２において満足さ れる。

４、　周辺質の側における残基の数は最小となる。

第１１図は、外膜中のクラス１のタンパク質のフォルディング（ｆ。

Ｉｄｉｎｇ）のためのモデルを示す。示した配列はサブタイプＰ１．１６のため のものである。図面の上部は表面の露出された領域を示すが、これに対して中央 部分は仮定したトランスメンブレンのセグメントを示し、その長さは１０に設定 される。アミノ酸は交互することが示されており、ここでそれらは両極性のベー ター鎖を形成することができる。このモデルは８つの表面ループを含有し、ここ で第１および第４のループはタイプ特異的および保護的可変領域のエピトープを 含有する。これらのエピトープは、ワクチンに配合するとき示されたように、保 護的免疫応答を引き出すことができる。ループ５は一定であり、そ（７て他のＯ ＭＰに対する交差反応性抗体を引き出すことが示され、モしてワクチンの配合に 有用である。

個々のタンパク質の１または２つの可変エピトープ領域は、これらの膜タンパク 質のいわゆる表面ループ上に位置する。このようなポリンの外膜タンパク質は２ より多い表面ループを含有する。これが意味するように、異なるクラス１の外膜 タンパク質の中にほぼ同一のアミノ酸配列を有する表面ループが同様によく存在 する。これは、ワクチンの目的にクラス１の外膜タンパク質の共通のペプチドを 同様によく使用する通を開く。さらに詳しくは、髄膜炎菌のクラス１の外膜タン パク質Ｐ１１６の概略的二次元のモデルは第１１図に図解されている。このモデ ルは８つの表面ループを邑有し、ここで第１および代４のループは、菌株のサブ タイプの結果に基づいて示したように、タイプ特異的エピトープを含有する。第 １の表面ループは、前述の一定の領域を表す。ループ５の一定領域に対する抗体 は、髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＯＭＰ複合体と反応するように ７Ｗわれる。誘導されたばかりの、クラス１のＯＭＰのアミノ酸配列を髄膜炎菌 （Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のクラスのＯＭＰ　Ｃムラカミ、Ｋ　ら、（ １９８９）インフェクノヨン・アンド・イミュニイー（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕ ｎ、）５７：２３１８コそして淋［（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈａｅ ａｅ）のボリンＰＩＡおよびＰＩＢタンパク質と比較した。クラスＩのＯＭＰの モデルについて使用したのと同様な原理で、配列は次のように整列された・ルー プ】 Ｃ１ａｓｓ　工Ｘ　ｆ）ＶＴＬＹＧτ工ＫＡＧＶ　ＥＧＲＮＸＱＡＱＬＴｇＱＰ Ｐ：ｖＳＲＶＫＤＡＧループ４ τ工ＧＲＶＥＳｋｌＥ１　５Ｖ’ＲＹＤＳＰＶ’Ｅ’ＡＧｒＳＧＳＶＱ　ＹＶＦ ’ＲＤＮＡルーブ６ 構造の類似性はトランスメンブレンおよび表面ループの領域で示される。クラス ■のＯＭＰについてここで入手可能な情報および特定のポリンタンパク質のルー プ領域のループの大きさ、位置、種間のアミノ酸の相同性または異質性に基づく 情報を使用して、淋菌（Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈａｅａｅ）を包含する他の病原性グ ラム陰性バクテリアのためのワクチンの中に組み込むエピトープの予測は可能で ある。クラスＩのＯＭＰについて使用したのと同一の方法を使用して、これらの エピトープはワクチンの目的について評価することができる。

微生物の受託 髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉ　ｔ　１ｄｉｓ）株Ｈ４４７６（Ｂ　：１５、Ｐ ｌ　７．１６）は、１９８９年１２月１１日にセントラール・ビューロウ・ブー ア・シンメルカルツレン（Ｃｅｎｔｒａａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈ ｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｎ）　（ＣＢＳ）、オランダ国バールンに受託され、 そして受入れ番号ＣＢＳ　６３５．８９を有する。髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇ ｉｔｉｄｉｓ）クラス２／３のＯＭＰ欠乏突然変異ＨＩ　Ｉ　Ｉ−５は、１９８ ９年１２月１１日にＣＢＳ。

オランダ国バールンに受託され、そして受入れ番号ＣＢＳ　６３６．８当業者は 、ここに記載した発明の特定の実施態様と同等の多（の実施態様を認識するか、 あるいは日常の実験を越えない実験を使用して確証することができるであろう。

このような同等の実施態様は次の請求の範囲により包含されることを意図する。

Ｆｉｇｕｒｅユ ＰＣＲ産生物： ＲＥＶ◆ＰＲ３４５０ｂｐ ０１、ｉ←　ＬＩ　Ｌ−Ｉ　Ｕ め・口 αＱ　−１［＋　＠Ｑｌｌ−Φ　弓　１１　唖−〇　の←　−←−〇−−〇−〇 −〇−〇←−〉ロ　ｘ（（ｌｊｘ　（ｌｊべじべＱべじ０←　ｏａｏ　Ｏ−−、 ｏａ −〇　−０−−ａｌ　ａｌ　リ ＋＋１０　−Ｑ〜　〜　のトリ←　−Ｑ酔　２？　“９ 嚇＜　Ｏ ＜ロ　Ｉ（〉０ ミニに　°　詫　Ｅ−ｙＦ−ｙ１″　８２？　。

−Ｉ−１（＜ロ　・　・　・　−ト　・　・噂υ　哩−゛　：　亜　：９ −Ｕ　マａ（ （ｕ　＋ｌ＜Ｑ　・　・　ロυ　・　・　・＝２　：　′″Ｏ０−←　○　ｕｕ ｕｕｕ−べ　・　ａｌｌ＆＋ 口Ｑ　＝Ｑ　・　−＞ロ　・ ““　“＜　、　、：　＃Ｅ　：　： ；て　′　°　“４ ０″ロ　＜＜ｕＱ　、　：：：炬含Ｕ含Ｑ才町ト　ニー−〇　＠Ｑ　・ −＜ｃ５　申　・　舎　リ←　―　Ｏロペ　く・（・べ　Ｑ−←　ｕ　ｏ唖ト　 ・　０υ　ロ　００　ロ１１←　Ｍｘ（Ｊ　・　−〇 〉ロ　・　−（Ｌ５　−ＬＩ　・　・ ローｕｈｈｈＦ− ｃｙＩＣＪ、；ヒ　：　：　／１・○　。

ぺυ　・　〉Ｕ　・　−ψト　・ ｈ←　０．←　、　吐　ＵＵＵ　リ　・　・−〇　・　−＜−１Ｉ＜ ０ロ　・　ぺＣ・　ベロ　・　・　・ ａｔＪ＆ｉ；２−一瓢、１ナー・Ｉ：暖；−１ｔ１１Ｑ・φ３は＜　棄兵≧Ｃ≧ 　；炬　９１．２ ト← うＱ　ｚ　・　Ｃニドｕ　■ω ・Ｑ　・　、　；て　０　゛ ＜Ｑ　・　・　べＱ Ｗｌｊ　・　−〇　−←　申 ｘｕ−−ｍ＜　゛　計 １−＜　・　＜Ｕ　・ ―べΦ０　０←ｏト　−○　←　・　・＞＜　ＣＥ＋ｔａ　（Ｊしυ　ト（・　 ・　・　・　−一べ山ト　錫（ＪＩＩＩＬＩ　Ｅ−←　・　・柱ニョｊｏＥｏ　 ＜箸５　コ５　：：、−１：（Ｊ）・ＣＥ−１ｔｉｈνローペロベ　−０・　・ 　・；乏；８；　：：賃Ｘ’（；Ｌｉ；ω　；８　・　・　：　・しくｅｌ−１ ｌ：ω−トー　・口Ｏ鴫ロ　−ト　・　・ぶ０ｍ（＠べ０口＞＜トベトペ　＞べ 　・　・　・　・←（（・べ・す・−・−・−・　−ト　・　・　・ロ偽−クベ Ｉ：ロヘ・−ロα　・Ｃ・　Ｑ−←　・　・ｃ＋ａ＋＜＋−１争ｏ６−＞−ｍ　 １−Ｏ＞べ　・−・合一（０口・ａＬｌべ・−（（にくベ　ヘ←ト　・　・　・ −Ｑ−）−フ・ｃ−ｃ　−ａ　・ ご＝：Ｓ２す七２；。讃妬δ　；ｊ；　：　：　：　：　：１、ＩＣ５−・　− ・　−・　Φ　−・Ｌ４　為０　・　・　・ｇＱ二　ｉ　広・島＜ｒ：、ｒニー ｏ　・　・ト＜←　ト　−　・−−・ト　・　ロＵ　・−Ｃ５＜　−ｏＯ＠　− ００８（１・　Ｏ。

・　・　−〇−・−・− ごて　、、ＬＩ＜。Ｏｎ　、１１．　、（。、　２σ１←　・ ＜Ｑ　・ ＳＳＵ　・　・　・　・　・　・　ΦＱ　・　・　・　・　・−〇　・　・　・ 　・　・　・　＝ト　・　・　・べ（＝＝）・・中・・・４−１□＋１−４−・ Φ←　・　・　・　・　・　・　：ＩＱ　・　・　・　・　―＝七　：：：−＝ ［−＋゛“　゛ ・　・　−−・　・　・　・　・ 口＞ｈ　−・−−、、：１（５コ　コ・Ｃ−仁トコ・コ・−＋　−（ｊ　−、拳 　−φ　・　−べ一雫−争トロ・−争一争〜Ｑｕ　゛　・　・　・　・　００口 ・口・べ・ベベロ　ロ・ｈω　・　・　・　・　・　・　ロ・←　・　・　・　 ・　・　・−〇　・　・　・　申　・　ＦＴＪ：ｈ　・　・　・　・　・Ｃ！＋ ｌｊ　・　・　・　・　・　ヘート　・　・　◆　・　・豚ｑ：：、：：　駁： ｕ：ｏ：ｏ；ｏ：ｕ＋：。

・　・　・　ｅｌＱ＋−Ｑ＋・へ・へ・１・ａ・ｐＣＢ　１２−１０−６の代表 的なＳＤＳ−Ｐａｇｅレーン＃　試料 １　ブランク ２　高分子量の標準 ３　透析したｐｃＢ１２−１０−６、工程２４　ｐｃＢ１２−１０−６のピーク を過ぎた分画５　ＨＰＬＣから精製したｐＣＢ１２−１０−６、ＰＢＳ中で透析 した、２０μｇ ６　ＨＰＬＣから精製したｐｃＢ１２−１０−６、ＰＢＳ中で透析した、１μｇ ７　ＬＰＳ−５８２８ ８ブランク ９　高分子量の標準 １０　ブランク ＣＢＩおよびＣＢ２のＣＲＭ１９７接合体の代表的なウェスタンプロット分析の 写真 １　分子量の標準 ２　Ｍ２Ｏ−ＣＲＭ、１０μｇ ３　Ｍ２Ｏ−ＣＲＭ、２０μｇ ４　分子量の標準 ５　Ｍ２１−ＣＲＭ、１μｇ 補正音の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）ｌ、特許出願の表示 １）ＣＴ／ＵＳ８９１０５６７８ ２、発明の名称 髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質のワクチン３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国ニューヨーク州１４６２３−１４９３０チエスター・ス ィート３００・コーボレートウツズ３０名　称　プラクシス・バイオロジクス・ インコーホレーテッド（ほか１名） ４、代理人　〒１０７ 第６図。髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のクラスＩのＯＭＰサブタ イプＰ１．７．１６の可変領域のエピトープを発現する組み換えフラジェリンの 構成。

第７図。髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のクラス■のＯＭＰサブタ イプＰＬ、７．１６の可変領域のエピトープを発現する組み換えフランニリンの 構造。

第８図。組み換えフラジェリンの高性能液体クロマトグラフィーの代表的なりロ マトグラム。

第９図。組み換えフラジェリンの５ＤＳ−ＰＡＧＥによる代表的な分析。

第１０図。ＣＲＭ＋ｓｔに接合した髄膜炎菌（Ｎ、　ｍｅｎ　ｉｎｇｉ　ｔ　１ ｄｉｓ）のクラス■のＯＭＰのエピトープからなる接合体の代表的なウェスタン プロット分析。

第１１図。髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のクラスＩのＯＭＰサブ タイプＰ１．７．１６の推定上のコンフォメーノヨン。

発明の詳細な説明 本発明は、分離した○Ｍ〜ｒ１髄膜炎菌のクラスＩのＯＭＰ、○ＰＭの断片（例 えば、臭化ンアンの適用により調製した）および外膜タンパク質のエピトープを 有するオリゴペプチドからなるワクチン、クラス２／３の外膜タンパク質を発現 しない突然変異株を使用する、分離した○ＭＶ、純粋なりラス■の外膜タンパク 質の調製：組み換えＤＮＡ発現ベクター中のクローニングしたＤＮＡの助けによ り分離した分かけての純粋なりラスＩの外膜タンパク質の調製に関するっ本発明 は、また、分離したＯＭＶ、クラスＩのＯＭＰまたはその一部分、クラス■のＯ ＭＰの遺伝子の融合体、そのタンパク質才たはエピトープを産生ずる目的で遺伝 子工学の適用、および短いペプチドをもつエピトープは合成的に調製することが できるので、ペプチド合成により多価のクラスＩの外膜ワクチンの調製に関する 。

クラスＩのＯＭＰのタンパク質のモデル化および構造の分析は、いくつかのＥ、 ｃｏｌｉＯ外膜タンパク質についての原理を使用して実施した。［ボウケル（Ｖ ｏｇｅ　ｌ）　、Ｈら、ンヤーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、１９０：１９］、（１９８６）：フェレシス（Ｆｅｒｅ ｎｃｅ）、Ｔ　ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ １．Ｂｉｏｌ、）、２０１．４９３　（１９８８）およびトマッセン（Ｔｏｍｍ ａｓｓｅｎ）　、Ｊ、　、ｒメンブレン・バイオゲネシス（Ｍｅｍｂｒａｎｅ　 Ｂｉｏｇｅｎｅｓ　１ｓ）Ｊ、ＮＡＴＯＡＳＩシリーズ（Ｓｅｒｉｅｓ）ＨＩ３ 、ｐＩ）３５１、ニューヨーク州スプリンガーーフェルラーグ（１９８８）］。

クラスＩのＯＭＰの誘導されたアミノ酸配列を、モデル化の研究および比較のた めに使用した。アミノ酸配列の相同性を他のグラム陰性バクテリアと比較し、そ して類似性をタンパク質の構造について確立した。露出した表面ループおよびト ランスメンブレン構造は、これらのタンパク質と非常に類似した。髄膜炎菌（Ｎ 、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の変動性および一定の領域の保護的エピトープお よびに関する情報を使用して、アミノ酸配列に基づいて、評価しそしてそれにに ついてのワクチンの中に含めるべき病原性グラム陰性バクテリアのための保護的 エピトープが存在する場所を予測することができる。

分離したＯＭＶの産生 ＯＭＶは、ベラベリ＝（Ｂｅｕｖｅｒｙ）ら（１９８３）、インフェ３６９−３ ８０に記載さオ］ている断片化後、培養物の上澄み液またはバクテリアの細胞か ら産生ずることができる。１より多い髄膜炎菌からのタンパク質を有するＯＭＶ は、異種タンパク質を発現するように操作した菌株から分離することができる。

、さらに、組み換えＤＮＡにより産生された５Ｄ−ＡＴＧの組み合わせまたは合 成ヌクＩノオチドの組み込みを包含する他の技術を使用することができる。

発現ベクター中へのＤＮＡの挿入について記載されている方法の任意のものを使 用して、プロモーターおよび他の遺伝子の制御要素をベクター内の特異的部位の 中に結合することができる。発現のブ：めの髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ ｄｉｓ）の配列をベクターのプロモーターおよび制御要素に関して発現ベクター 中の特定の部位に挿入することができ、こうして減少ＤＮＡ分子が宿主細胞の中 に導入されるとき、外来遺伝子の配列は宿主細胞により発現（すなわち、転写お よび翻訳）されるようにすることができる。

組み換えＤＮＡベクターは適当な宿主細胞（バクテリア、ウィルス、酵母菌、哺 乳動物細胞など）の中に形質転換、形質導入またはトランスフェクソヨン（ベク ター／宿主細胞の系に依存する）により導入することができる。ベクターを含有 する宿主細胞は、ベクターの中に通常存在する］または２以上の適当な遺伝子マ ーカー、例えば、ｐＢＲ３２２中のアンピンリン抵抗性またはテトラサイクリン 抵抗性、または真核生物の宿主系中のチミランキナーゼ活性の発現に基づいて選 択する。発現ベクターはクローニングベクターは、通常マーカー機能を含有する 、クローニングベクターから誘導することができる。このようなりローニングベ クターは、は次のものを包含することができるが、これらに限定されない・ＳＶ ４０およびアデノウィルス、ワクシニアのウィルスのベクター、昆虫のウィルス 、例えば、バクロウィルス、酵母菌のベクター、ノ＼クテリオファージのベクタ ー、例えば、ラムダｇｔ−ＷＥＳ−ラムダＢ、淋菌（Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈａｅａ ｅ）　、Ｅ、ｃｏｌ　ｉ、肺炎連鎖球菌（Ｓｐ１６ｕｍｏｎｉａｅ）など。例え ば、それらは髄膜炎菌（Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のオリゴサツカリド または多糖類の莢膜成分と組み合わせて投与することができる。莢膜成分は血清 学の群、例えば、ＡＳＢ、Ｃ，Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、２９ＥおよびＷ１３５の任意の ものから誘導することができる。

異なるサブタイプのクラスＩの外膜タンパク質を使用することができる。これら は組み合わせて使用して髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔ　１ｄｉｓ）に対する バクテリアの抗体を引き出すことができる。例えば、Ｐｌ、７．１６サブタイプ のクラス■の外膜タンパク質から誘導された断片を、他のサブタイプ、例えば、 Ｐｌ、１、Ｐｌ、１．１６：Ｐｌ。

２：Ｐｌ、６；Ｐｌ、９；Ｐｌ、１５；Ｐ、１６；またはＰｌ、４［アブディラ ヒ（Ａｂｄｉｌｌａｈｉ）、Ｈら、１９８８　フィクロバイアル・パソゲ不シス （Ｍｉｃｒｏ、Ｐａｔｈｏｇ、）、４：２７］の外膜タンパク質または外膜タン パク質の断片と一緒に、あるいは髄膜炎菌の多糖類と混合物の形態でまたは化学 的接合体として一緒に使用することができる。他の外膜タンパク質のエピトープ と組み合わせた投与のために、それらは、別々に、混合物としてまたは接合体ま たは遺伝子の融合ペプチドまたはタンパク質として投与することができる。接合 体は、タンパク質の物質を力・ノブリングする標準の技術またはサツカリドのポ リマーをタンパク質にカップリングする技術により形成することができる。融合 体は、記載し５たように、組み換えＤＮＡ技術により調製した融合した遺伝子構 成体から発現させることができる。

前述したように、クラスＩのＯＭＰ、断片またはそれらから誘導された任意のオ リゴペプチドを他の病原性有機体［例えば、バクテリア（マイクロカプセル化ま たは非マイクロカプセル化）、ウィルス、真菌および寄生体］の抗原と組み合わ せて使用することができる。他の有機体の追加の例は、ＲＳウィルス、ロタウィ ルス、マラリア寄生虫、およびクリプトコツカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐ ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）を包含する。

いずれの場合においても、不活性化したウィルスまたはウィルスの混合物を適当 なアノユハント中で配合して、抗原に対する免疫応答を増強することができる。

適当なアノユバントは次のものを包含する二表面活性物質、例えば、ヘギサデシ ルアミン、オクタデシルアミノ酸エステル、オクタデシルアミン、リンレシチン 、シメチルーシオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ、Ｎ−ジコクタデ〉・ル ーＮ’　、Ｎ’　−ビス（２−ヒドロキシエチル−プロパン・シアミン）、メト キノヘキサデシルグリセロ−／し、およびブロンポリオール、ポリアミン、例え ば、ビラン、デクストランサルフェート、ポリＩＣ，カルホポル、ペプチド、例 えば、ムラミルペプチドおよびその誘導体、ジメチルグリラン、ツフチラン、油 乳濁液、および鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、 およびリニ／フォカイン。

種々の髄膜炎菌のクラス１の外膜タンパク質に対するタイプ特異的モノクローナ ル抗体を調製じた。これらのモノクローナル抗体は、次のサブタイプを認識する 　Ｐｌ、１：Ｐｌ、２：Ｐｌ、６：Ｐｌ、７：Ｐｌ９：Ｐｌ、１０：Ｐｌ、１５ ；Ｐ、１６：およびＰｌ、１７（ここてＰｌ　１４と呼ぶ）。モノクロ−＋ル抗 体は、ＲＩＶＭ、オランダ同ヒルトウヘン、から１″髄膜炎菌の皿清型決定のモ ノクロ−士ルキノｈ（ＭＯｎｏｌｏｎａｌ　Ｋｉｔ　Ｓｅｒｏｔｙｐｉｎｇ　Ｍ ｅｎｉｎｇｏｃ。

ｃｃｉ）Ｊとして入手可能である。すべてのこれらのモノクローナル抗体は、ウ ニスタンブロッティングにより試験したとき、ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウ ム）変性タンパク質と反応する。また、ある数のこれらのモノクローナル抗体は ４２ｋＤのクラスＩの外膜タ゛／バク質の２５にこれらのモノクローナル抗体の 殺バクテリア活性は、サラコラ不ン（Ｓａｕｋｋｏｎｅｎ）ら、１９８７、マイ クロバイアル・パソゲ不ソス（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｐａｔｈｏｇｇｅｎ、）３ ：２６１のラットの髄膜炎のモデルにおいて測定した生体内の保護的活性とよく 相関関係をもつように思われる。

実施例ＩＡ　多数のクラスＩの遺伝子を有する髄膜炎菌株の構成りロー冒こより 染色体遺伝子の置換、わずかに異なる変法、は、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇ ｏｎｏｒｒｈａｅａｅ）について記載された○［スティン（Ｓｔｅ　ｉｎ）　、 Ｄ、Ｃ，、ＣＩ　ｉｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ｒｅｖ　２　（Ｓｕｐｐｌ、）　、　５１４６−３１４９　（１９８９’）　コ 　。　この方法は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ） においてクラスＩの遺伝子に適用することができることを、われわれは発見した 。これは次の方法で実施した （ｉ）株２９９６　（サブタイプＰ１２）のクラスＩの遺伝子をベクターｐＴＺ １９Ｒの中にクローニングした。ロメソド（Ｍｅａｄ）、Ｄ　、へ　ら、ブロテ １′ン・ニンノニアリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）１．６ ７　（１９８６）ｊ　ｏ完全な遺伝子は、Ｘｂａｌ消化したベクター・Ｄ　Ｎ　 Ａに結合した２、２ｋｂのＸｂａＩ断片」二１こ（立置する。

（１２）生ずるプラスミドを株Ｈ４４／７６　（サブタイプＰＬ、７１６）の形 質転換に使用した。アクセプターの株ん細胞をプラスミドＤ　Ｎ　ＡとともにＭ 　ｇ２−および通常の髄膜炎菌の培地の存在下にインキユベーションした。それ らを引き続いて希釈し、そしてプレイティングし、そして生ずるコロニーをＰｌ 　２特異的モノクローナル抗体に結合するそれらの能力について試験した。この ような形質転換体はほぼ１０−３の頻度で見いだされた。それ以上の特性決定に より、Ｈ４４／７６クラスＩの遺伝子の置換が事実起こったことが示された。こ の方法の本質的特徴は、髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）中で複製す ることができない円形のプラスミドＤＮＡ分子上のドナー遺伝子の存在である。

なぜなら、直線化ＤＮＡの使用は形質転換体をまったく産生じなかったからであ る。

２つのクラスＩの遺伝子をもつ株の構成は、前述の方法の変更により実施した。

この目的で、Ｐｌ、２クラスＩの遺伝子をクローンのクラス５の遺伝子の中に挿 入した。クラス５の遺伝子の族は２つの特徴を有し、これらの特徴はその遺伝子 をこの構成にとくに適当なものとする。［メイアー（Ｍｅｙｅ　ｒ）　、Ｔ、Ｆ 　およびハン・ブッテン（Ｖａｎ　Ｐｕｔ　ｔｅｎ）、Ｊ、Ｐ、Ｍ、　、ＣＩ　 ｉｎ、Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ。

２　（Ｓｕｐｐｌ、Ｌ　５１３９−８１４５　（１９８９）：　（ｉ）髄膜炎菌 のケノムの中に４または５つのクラス５の遺伝子が存在する、および（１１）こ れらの遺伝子の発現は実験室の条件下において生長は不必要である。クラス５の 遺伝子を８４４／７６株からクローニングし、モしてＰ］、２遺伝子をクラス５ の遺伝子の中にまたはそれに非常に密接して位置する５ｐｈＩ部位の中ｊ二挿入 した。生ずるハイブリニ・ドのプラスミド、ｐＭＣ２２、を株ＨＩ　１１５．８ ４４．７６のクラス３欠損突然変異、の形質転換に使用した。Ｐｌ　２特異的モ ノクローナル抗体と反応するコロニーを分離巳、そして特性決定した。１０のこ のような形質転換体のうちの９は、アクセプター株のＰｌ　１６エビトープを失 なっていることが発見された。これが示すように、すべてのこれらのクラスの組 み換えはクラスＩの遺伝子の間でのみ起こって、サブタイプの置換を生ずる。し かしながら、両者のクラス■のサブタイプ、すなわち、Ｐｌ　７１６およびｐｌ 、２を作った、】つの形質転換体が発見され、プラスミドおよび染色体」二のり 冊ス５の遺伝子の配列の間の組み換えか起こったにちがいナシ）ことを示唆する 。これはウェスタンブロッティングおよびザサンブロソティングにより確証され 、ここでウェスタンブロッティングは両者のタイプのクラスＩのタンパク質の存 在を明らかにし、そしてサザンブロ！ティングは第２のクラスｒの遺伝子の獲得 を実証した。

この構成を他のクラスＩのサブタイプを使用して続けることによって、４または ５つの異なるクラス■の遺伝子をもつ株をつくることができる。

同一のクラス５の遺伝子は各引き続く形質転換工程において使用ことができ、異 なるクラス５の遺伝子は別々にクローニングし、そして使用することができる。

これらの組み換え株を使用して、異なる精製したクラスＩのＯＭＰの混合物を調 製することができる。

実施例ＩＢ　細菌学的培養物からの分離したＯＭＶの精製精製は、ベラヘリ・イ （Ｂｅｕｖｅｒｙ）ら（１９８３）インフェクション・アンド・イミュニイー（ Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、）４０：３６９〜３８０に従い実施する。

この培養は所望の野生型菌株、クラス２／３の外膜タンパク質をもたない突然変 異の髄膜炎菌株および／または相同性および異種の組み換え微生物を使用して実 施することができ、前記組み換え微生物は、存在するオーブンリーディングフレ ームによるか、あるいはよらないでベクターを過度に産生ずることによって］ま たは２以上の所望の髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質および／またはエピト ープを発現するので、融合タンパク質または交換したエピトープをもつタンパク 質を調製することができる。

５０ミリモルのＮａＣ１の最初の４つの溶離収集物（２０ｍｌ）をプールし、そ して１．０ｍｌの６モルの尿素中のアセテート緩衝液（ｐＨ＝４．０）に対して 室温において透析した。次いで、透析した分画をＴＳＫ　ＳＰ　ＰＷカチオン交 換ＨＰＬＣカラム（７５ｍ、ｍＸ３００ｍｍ）上に適用した。カラムを６モルの 尿素を含有する１０ミリモルのアセテート（ｐＨ＝４．０）から成る移動相て溶 離した。勾配Ｏ〜３００ミリモルのＮａＣ１を６モルの尿素を含有する１０ミリ モルのアセテート（ｐＨ＝４．０）中で５〜３０分の間隔で確立した。３０分後 、勾配は次の５分にわたって６モルの尿素を含有する１０ミリモルのアセテート 中の３００ミリモルのから１モルのＮａＣｌまでになった。フラジェリン構成体 はほぼ２４分で集められ、これは約２００ミリモルのＮａＣ１に相当する。分画 をＰＢＳに対して透析し、そして物質について決定した純度は抗フラノニリン抗 体を使用するウェスタンプロットにより確立された。代表的なＨＰ　Ｌ　Ｃ分析 および５ＤＳ−ＰＡＧＥは、それぞれ、第８図および第９図示されている。

実施例１０′　鼠！久−ユニラヱ上四乞裏遥含倦省！！群Ｃの髄膜炎菌の莢膜多 糖類（ＧＣＭ　ＣＰＳ：ロット＃８６ＮＭ０１）は、本質的にハンドル（Ｂｕｎ ｄ　ｌ　ｅ）ら、ンヤーアル・オブ・・＼イオロノカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂ ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、λ↓ユ４７９７−８０１．１９７４に従い調製した。

髄膜炎菌（＼ｅｉＳＳｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｃ１１は、つオ ルター・リード・アーミイ・インスチチュート（Ｗａ　ｌ　ｔ　ｅｒ　Ｒｅｅｄ 　、へｒｍｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）（ワンントＤ　Ｃ）から入手した。菌株を ヒツジ血液寒天プレート上で２回予備培養物し、次いで液状種培地ナイセリア属 （Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）化学的に定められた培地、ＮＣＤＭ　［ケン不イ（Ｋｅ ｎｎｅｙ）ら、　Ｂｕ　ｌ　１．　Ｗ、Ｈ。

再び、等しいまｔ二はより高い抗体力価はＧ　Ｐ　Ａの存在下に観測された。

髄膜炎菌のＶＲＩおよびＶＲ２接合体を使用する免疫原性の研究の結果を、また 、表４に示す。両者のＭ２ＯおよびＭ２１−ＣＲＭＩ９７接合体ならびに等しい 量の両者を含有する混合物は、抗ＣＲＭ１９７の応答ならびに抗クラス■のＯＭ Ｐの応答を誘発することができた。

これらの予備的データが示すように、キャリヤーに化学的に接合しているか、あ るいはキャリヤーに遺伝子的に融合した、クラスＩのＯＭＰの可変領域のエピト ープは免疫応答を引き出すことができる。新しいエピトープ−キャリヤー接合体 を、標準の技術を使用して、つくって、ワクチン、例えば、１）より大きいエピ トープ、２）多数のエピトープの反復をもつペプチドおよび／′または３）異な るキャリヤーの使用、に対する免疫応答を増強することができる。

未湾男↓１−　即炎閘−ヒート迫清ア／ｌユン糖接合侠９遷娼ＧＣＭ　ＣＰＳを 酸加水分解により解重合させ、そして得られたＧＣＭＯ３を引き続いて水性緩衝 液中てＮａＩｏ４酸化を経て活性化した１゜反応は水性溶離液中てＨＰＧＰＣに より、紫外線およびＲ１の検出を使Ｌ１］シて監視した。反応の各・ヤを水中の ＧＰＣ脱塩により追跡した。ＧＰＣＯ８およびヒトアルブミン（ＨＡ）を混合し 、そして本質的に実施例］０において髄膜炎菌−フラ、ニリン糖接合体について 記載したよう構造の類似性はトランスメンブレンおよび表面ループの領域で示さ れる。クラス■のＯＭＰについてここで入手可能な情報および特定のポＩ）ンタ ンパク質のループ領域のループの大きさ、位置、種間のアミノ酸の相同性または 異質性に基づ（情報を使用して、淋菌（Ｎ、ｇｏｎｏｒｒｈａｅａｅ）を包含す る他の病原性グラム陰性バクテリアのためのワクチンの中に組み込むエピトープ の予測は可能である。クラスＩのＯＭＦ’について使用したのと同一の方法を使 用して、これらのエビ）・−プはワクチンの目的について評価することができる 。

微生物の受託 髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株Ｈ４４７６（Ｂ　：　１．５、Ｐ ｌ　７．１６）は、１９８９年１２月１１日にセントラール・ビューロウ・ブー ア・シンメルカルツ１ノン（Ｃｅｎｔｒａａｌ　Ｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃ ｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｎ）（ＣＢＳ）、オランダ国バールンに受託され、 そして受入れ番号ＣＢＳ　６３５．８９を有する。髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇ ｉｔｉｄｉｓ）クラス２／３のＯＭＰ欠乏突然変異ＨＩＩＩ−５は、１９８９年 １２月１１日にＣＢＳ。

オランダ国ハールンに受託され、そして受入れ番号ＣＢＳ　６３６．８９を有す る。

同等の実施態様 当業者は、ここに記載した発明の特定の実施態様と同等の多くの実施態様を認識 するか、あるいは日常の実験を越えない実験を使用して確鉦することができるで あろう。、このような同等の実施態様は次の請求の範囲により包含されることを 特徴する 請求の範囲 １、有効量の非自然の髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ ｓ）から分離された外膜複合体からなり、前記複合体は少なくとも１つの髄膜炎 菌のクラスＩの外膜タンパク質、その断片またはエピトープを含有するまたはオ リゴペプチドからなる、髄膜炎菌の病気に対して有効なワクチン。

２、髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質は、クラス２／３の外膜タンパク質を 発現しない突然変異の髄膜炎菌株から由来する、上記第１項記載のワクチン。

３、クラス■の外膜タンパク質、断片またはオリゴペプチドは、前記クラス■の 外膜タンパク質、断片またはオリゴペプチドをエンコードする異種遺伝子を含有 する微生物により産生される、上記第１項記載のワクチン。

４、クラスＩの外膜タンパク質、断片またはオリゴペプチドは、群Ａ、Ｂ、Ｃ， Ｗ−１３５またはＹの髄膜炎菌から誘導される、上記第１項記載のワクチン。

５、クラス■の外膜タンパク質、断片またはオリゴペプチドは、群Ｂの髄膜炎菌 から誘導される、上記第１項記載のワクチン。

１７、免疫刺ｔｉ複合体（ＩＳＣＯＭ）をさらに含む、上記第１項記載のワクチ ン。

〕８、クラス■の外膜タンパ脂質、断片またはオリゴペプチドはリポソーム内に 含有さねている、上記第１項記載のワクチン。

１９、クラス１の外膜タンパク質、断片才たはオリゴペプチドは脂質に力、・ブ リングされている、上記第１項記載のワクチン。

２０、約２５ｋＤ以下の分子量を有し、そして髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　 ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ’）に対するバクテリアの抗体と反応性の連続または 不連続のエピトープを含有する、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｑｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇ ｉｔｉｄｉｓ）のクラスＩの外膜タンパク質の実質的な精製された断片。

２１、クラスＩの外膜タンパク質はサブタイプＰ１．　７．　１．６である、上 記第２０項記載の断片。

２２、髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｒＮｓ）のクラスＩの外膜タンパク質 の臭化ノアンの切断により産生され、はぼ２５ｋＤの分子量を有する、上記第２ 〕項記載の断片。

２３、異なる髄膜炎菌のポリン（ｐｏｒｉｎ）タンパク質の間のアミノ酸配列が 変化する、クラスＩの外膜タンパク質のＢ細胞のエピトープを含有する実質的に 精製されたオリゴペプチド。

２４、ＱＰＱＶＴＮＧＶＱＧＮ、ＰＰ５ＫＳＱＰ、ＱＡＡＮＧＧＡＳＧ、’１’ ＹＴＫＤＴＮＮＮＬＴＬ、ＹＹＴＫＮＴＮＮＮＬＴＬ、ＹＹＴＫＤＴＮＮＮＬ、 ’ｉ”ＹＴＫＮＴＮＮＮＬ、ＨＦＶＱＱＴＰＱＳＱＰおよび／またはＨＹＴＲＱ ＮＮＴＤＶＦから成る群より選択される少な（とも１つのアミノ酸配列を含有す る、上記第２３項記載のオリゴペプチド。

２５、異なる髄膜炎菌のポリン調製の間のアミノ酸配列の中に保存された、クラ スＩの外膜タンパク質のＢ細胞またはＴ細胞のエピトープを含有する実質的に精 製されたオリゴペプチド。

２６、ＮＭ炎企画クラスＩの外膜タンパク質のＴ細胞のエピトープを含有する実 質的に精製されたオリゴペプチド。

２７、髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質の一部分またはそのエピトープを含 有するオリゴヌクレオチドをエンコードする、分離された核酸。

２８、製剤学的に許容されうる賦形剤中の１または２以上の髄膜炎菌のクラスＩ の外膜タンパク質またはその断片および、必要に応じて、アジュバントからなる ワクチン組成物を投与することからなる、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅ ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する保護の免疫応答を引き出す方法。

４２、キャリヤーのタンパク質、そのペプチドまたはエピトープに融合し、そし て自然のクラス■の外膜タンパク質より実質的に少ない、髄膜炎菌のクラスＩの 外膜タンパク質のエピトープからなる、遺伝子の融合ペプチドまたはタンパク質 。

４３、エピトープはＱＰＱＶＴＮＧＶＱＧＮ、ＰＰ５ＫＳＱＰ、ＱＡＡＮＧＧＡ ＳＧ、ＹＹＴＫＤＴＮＮＮＬＴＬ、ＹＹＴＫＮＴＮＮＮＬＴＬ、ＹＹＴＫＤＴＮ ＮＮＬ、ＹＹＴＫＮＴＮＮＮＬ、ＨＦＶＱＱＴＰＱＳＱＰおよび／またはＨＹＴ ＲＱＮＮＴＤＶＦから成る群より選択される、上記第４２項記載の遺伝子の融合 ペプチドまたはタンパク質。

４４、その内部に挿入された髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質のエピトープ のためのアミノ酸配列を有するフラジェリンタンパク質からなる、融合タンパク 質。

４５、アミノ酸配列は、フラジェリンタンパク質的に、フラジェリンタンパク質 の機能に対して非必須である領域において挿入されている、上記第４４項記載の 融合タンパク質。

４６、アミノ酸配列はフラノニリンタンパク質の超可変領域の中に挿入されてい る、上記第４５項記載の融合タンパク質。

４７、そｎに接合した髄膜炎菌の莢膜のオリゴサソカリトまたは多糖類をさらに 含む、上記第４４項記載の融合タンパク質。

４８、上記第４４項記載の融合タンパク質をエンコードする、組み換え遺伝子。

４９、自然のクラスＩの外膜タンパク質より実質的に少ない、髄膜炎菌（Ｎｅｉ ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のクラス■の外膜タンパク質、また は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対するクラス ＩのＯＭＰ特異的抗体と反応性の連続または不連続のエピトープを発現すること ができる、組み換え微生物。

５０、オリゴペプチドはＱＰＱＶＴＮＧＶＱＧＮＸＰＰＳＫＳＱＰ。

ＱＡＡＮＧＧＡＳＧ、ＹＹＴＫＤＴＮＮＮＬＴＬ、ＹＹＴＫＮＴＮＮＮＬＴＬ、 ＹＹＴＫＤＴＮＮＮＬ、ＹＹＴＫＮＴＮＮＮＬ、ＨＦＶＱＱＴＰＱＳＱＰおよＵ ／まｆ：はＨＹＴＲＱＮＮＴＤＶＦから成る群より選択される、上記第４９項記 載の微生物。

５１、ワクシニアのウィルス、アデノウィルス、またはサイトメガロウィルスで ある、上記第４９項記載の微生物。

５２、サルモネラＩｊＥ　（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　ｌ　ｌａ）のバクテリアテある 、上記第４９項記載の微生物。

５３、髄膜炎菌のクラス■の外膜タンパク質のエピトープは組み換えフラジェリ ンとして発現される、上記第４９項記載の微生物。

５４、上記第４９項記載の微生物を個体に接種することからなる、髄膜炎菌（Ｎ ｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対して免疫化する方法。

５５、クラス２および３の外膜タンパク質を産生ずることができない突然変異の 髄膜炎菌株。

５６、クラス２および３の外膜タンパク質を産生ずることができない突然変異の 髄膜炎菌株ＨＩ　Ｉ　Ｉ　５、ＣＢ５６３６．８９゜５７、非天然のクラス■の 外膜タンパク質をエンコードする異種遺伝子で形質転換された、クラス２および ３の列膜タンパク質を産生ずることができない、突然変異の髄膜炎菌株。

５８、ａ１ポリンタンパク質のアミノ酸配列を獲得し、ｂ、ポリンタンパク質の アミノ酸配列を髄膜炎菌のクラスＩの外膜タン”７Ｍ　（ＯＭＰ）のアミノ酸配 列と比較して、クラスＩのＯＭＰ中の既知の対応する構造に基づいて、ポリンタ ンパク質の露出した表面ループの構造の位置、大きさおよび配列を予測し、そし てＣ１予測された構造の位置、大きさおよび配列に基づいて表面ループ構造中の 潜在的ワクチンのエピトープを同定する、からなる、グラム陰性のポリンタンパ ク質のワクチンのエピトープを同定する方法。

５９、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の完全なり ラス■の外膜タンパク質、その遺伝子の融合タンパク質または髄膜炎菌（Ｎｃｉ ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対するクラス■のＯＭＰ特異的抗 体と反応性の連続または不連続のエピトープを発現することができる、組み換え ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉｄ）の菌株。

国際調査報告 １−一−−−〜−帽−ｗ−ｍ　ＰＣτ／υＳ　８９１０５６７ＢＮ＃＋＃彎噌− ＾１両ＣＩ−−−・ＰＣＴ／ＵＳ８９１０５６７８国際調査報告 フロントベージの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　１／２１　７ ２３６　ｉＢ Ｌ５／３１ ／／Ｃ０７Ｋ　７／１０ （ＣＩ　２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：３６） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：４２） （Ｃ１２Ｎ　１５／３１ Ｃ１２Ｒ１：３６） Ｃ０７Ｋ　９９：００ （３１）優先権主張番号　８９．０１６１２（３２）優先口　１９８９年６月２ ６日（３３）優先権主張国　オランダ（ＮＬ）（８］）指定国　ＥＰ（ＡＴ、Ｂ Ｅ、ＣＨ，ＤＥ。

Ｅ、Ｓ、ＦＲ，ＧＢ、ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、ＳＥ）、　ＡＵ、ＤＫ、ＦＩ、Ｊ Ｐ、　Ｎｏ、　ＵＳ （７２）発明者　セイド、ロバート・シー、ジュニアアメリカ合衆国カリフォル ニア用９４１２１サンフランシスコ・ツウエンテイフイフスアベニュー５９０ ＦＩ （７２）発明者　ホ〜ゲルホウト、ベーターオランダ国２８０５エスゼツドゴウ ダ・イデンブルグストラート１３ （７２）発明者　ウイールツ、エマニュエル・ジエイ・エイチ・ジエイ オランダ国３５８３エイチダプリューユトレヒト・マウリツストラーＩへ１０６ （７２）発明者　パン・デル・レイ、ベーターオランダ国３５８３エイエムユト レヒト・アドリアーンバンオスタデラーン１２４ −ノ１コ、′トベージの続き く７２＞発明吉　パラデイソ、ビータ−・アールアメリカ合衆国ニューヨーク州 １４５３４　ビッツフォード・ギルフォードウェイ６ 〈７２）発明台　ボールマン、ヤシ・ティオランダ国１１５１エーイケイブレク インウォーターランド・レーテイシデ８ イギリス国ハンプシャーニスオー５］６ジーテイ・ロムゼイ・ウェストウニロウ ・アニスオー１８デイアール・ロウナムズ・ファーニイハースト　アベニュー１ ５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、有効量の外膜小胞からなり、前記小胞は発現する相同性および／または異種 のまたは少なくとも１つの髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質またはそのエピ トープを含有する断片またはオリゴペプチドから分離されたものである、髄膜炎 菌の病気に対して有効なワクチン。 ２、髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質は、クラス２／３の外膜タンパク質に 対して陰性である突然変異の髄膜炎菌株から由来する、上記第１項記載のワクチ ン。 ３、クラスＩの外膜タンパク質、断片またはオリゴペプチドは、前記クラスＩの 外膜タンパク質、断片またはオリゴペプチドをエンコードする異種遺伝子を含有 する微生物により産生される、上記第１項記載のワクチン。 ４、クラスＩの外膜タンパク質、断片またはオリゴペプチドは、群Ａ、Ｂ、Ｃ、 Ｗ−１３５またはＹの髄膜炎菌から誘導される、上記第１項記載のワクチン。 ５、クラスＩの外膜タンパク質、断片またはオリゴペプチドは、群Ｂの髄膜炎菌 から誘導される、上記第１項記載のワクチン。 ６、５〜１０の種々の群の髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質、断片またはオ リゴペプチドからなる、上記第１項記載のワクチン。 ７、タンパク質断片はクラスＩの外膜タンパク質の臭化シアン処理により得られ る、上記第１項記載のワクチン。 ８、クラスＩの髄膜炎菌の外膜タンパク質は、エンドＬｙｓ−Ｃ、エンドＡｒｇ −Ｃ、エンドＧｌｕ−Ｃおよびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ） Ｖ８−プロテアーゼから成る群より選択される酵素を使用するタンパク質分解に より得られる、上記第１項記載のワクチン。 ９、オリゴペプチドは髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質のエピトープと結合 する少なくとも１つの抗体からなる、上記第１項記載のワクチン。 １０、オリゴペプチドは、【配列があります】、【配列があります】、【配列が あります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、 【配列があります】、【配列があります】、および【配列があります】から成る 群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列からなる、上記第１項記載のワ クチン。 １１、エピトープは髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質の表面ループのアミノ 酸２４−３４および１７６−１８７の区域に位置する、上記第１項記載のワクチ ン。 １２、クラスＩの外膜タンパク質、断片またはオリゴペプチドは、Ｔ細胞のエピ トープに化学的カップリングを経て接合されている、上記第１項記載のワクチン 。 １３、クラスＩの外膜タンパク質、断片またはオリゴペプチドは、タンパク質産 生物との接合体の形態のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｗ−１３５および／またはまたはＹの多糖 類を含有する、上記第１項記載のワクチン。 １４、両性イオン、カチオン、アニオンおよび／または非イオンを発生する洗浄 剤をさらに含む、上記第１項記載のワクチン。 １５、洗浄剤は、ツビッタージェント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）Ｚｗ３−１０ 、ツビッタージェント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）Ｚｗ３−±４、ツイーン（Ｔ ｗｅｅｎ）−２０、塩素酸ナトリウム、オクチルグリコシドおよびデオキシ塩素 酸ナトリウムから成る群より選択される、上記第１項記載のワクチン。 １６、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムおよびリン酸カルシウムから成 る群より選択される吸着剤をさらに含む、上記第１項記載のワクチン。 １７、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）をさらに含む、上記第１項記載のワクチン 。 １８、クラスＩの外膜タンパク質、断片またはオリゴペプチドはリポソーム内に 含有されている、上記第１項記載のワクチン。 １９、クラスＩの外膜タンパク質、断片またはオリゴペプチドは脂質にカップリ ングされている、上記第１項記載のワクチン。 ２０、約２５ｋＤ以下の分子量を有し、そして髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　 ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対するバクテリアの抗体と反応性の連続または不 連続のエピトープを含有する、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉ ｔｉｄｉｓ）のクラスＩの外膜タンパク質の実質的な精製された断片。 ２１、クラスＩの外膜タンパク質はサブタイプＰ１．７．１６である、上記第２ ０項記載の断片。 ２２、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のクラスＩの外膜タンパク質 の臭化シアンの切断により産生され、ほぼ２５ｋＤの分子量を有する、上記第２ １項記載の断片。 ２３、異なる髄膜炎菌のポリン（ｐｏｒｉｎ）タンパク質の間のアミノ酸配列か 変化する、クラスＩの外膜タンパク質のＢ細胞のエピトープを含有するオリゴペ プチド。 ２４、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列 があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】 、【配列があります】および／または【配列があります】から成る群より選択さ れる少なくとも１つのアミノ酸配列を含有する、上記第２３項記載のオリゴペプ チド。 ２５、異なる髄膜炎菌のポリン調製の間のアミノ酸配列の中に保存された、クラ スＩの外膜タンパク質のエピトープを含有するオリゴペプチド。 ２６、髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質のＴ細胞のエピトープを含有するオ リゴペプチド。 ２７、髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質、そのエピトープを含有する断片ま たはオリゴヌクレオチドをエンコードする、分離された核酸。 ２８、製剤学的に許容されうる賦形剤中の１または２以上の髄膜炎菌のクラスＩ の外膜タンパク質またはその断片および、必要に応じて、アジュバントからなる ワクチン組成物を投与することからなる、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅ Ｈｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対する保護の免疫応答を引き出す方法。 ２９、断片は、Ｔ細胞のエピトープ、Ｂ細胞のエピトープまたはキャリヤーのペ プチドまたはタンパク質に接合されているか、あるいはそれに遺伝子的に融合さ れている、上記第２８項記載の方法。 ３０、接合は断片の末端にシステインまたはリジンを通してカップリングされて いる、上記第２９項記載の方法。 ３１、キャリヤーはバクテリアの毒素、ＣＲＭまたはトキソイドである、上記第 ２９項記載の方法。 ３２、クラスＩの外膜タンパク質はサブタイプのＰ１．７．１６である、上記第 ２８項記載の方法。 ３３、製剤学的に許容されうる賦形剤中の髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅ ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対するバクテリアの抗体と反応性のクラス１の外膜タ ンパク質の連続または不連続のエピトープを含有する少なくとも１つのオリゴペ プチドおよび、必要に応じて、アジュバントからなるワクチン組成物を投与する ことからなる、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に 対する保護の免疫応答を引き出す方法。 ３４、オリゴペプチドは【配列があります】、【配列があります】、【配列があ ります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【 配列があります】、【配列があります】および／または【配列があります】から 成る群より選択されるアミノ酸配列を含有する、上記第３３項記載の方法。 ３５、タンパク質分解の断片は、Ｔ細胞のエピトープ、Ｂ細胞のエピトープまた はキャリヤーのペプチドまたはタンパク質に接合されているか、あるいはそれに 遺伝子的に融合されている、上記第３３項記載の方法。 ３６、接合は断片の末端にシステインまたはリジンを通してカップリングされて いる、上記第３３項記載の方法。 ３７、キャリヤーはバクテリアの毒素、ＣＲＭまたはトキソイドである、上記第 ３５項記載の方法。 ３８、キャリヤーのタンパク質またはそのエピトープに接合された髄膜炎菌のク ラスＩの外膜タンパク質、そのエピトープを含有する断片またはオリゴペプチド からなる、抗原の接合体。 ３９、オリゴペプチドは、【配列があります】、【配列があります】、【配列が あります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、 【配列があります】、【配列があります】および／または【配列があります】か ら成る群より選択される、上記第８項記載の抗原の接合体。 ４０、抗原のキャリヤーはバクテリアの毒素、ＣＲＭまたはそのエピトープであ る、上記第３９項記載の抗原の接合体。 ４１、キャリヤーのタンパク質はＣＲＭ１９７である、上記第４０項記載の抗原 の接合体。 ４２、キャリヤーのタンパク質、そのペプチドまたはエピトープに融合した髄膜 炎菌のクラスＩの外膜タンパク質のエピトープからなる、遺伝子の融合ペプチド またはタンパク質。 ４３、エピトープは【配列があります】、【配列があります】、【配列がありま す】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列 があります】、【配列があります】および／または【配列があります】から成る 群より選択される、上記第４２項記載の遺伝子の融合ペプチドまたはタンパク質 。 ４４、その内部に挿入された髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質のエピトープ のためのアミノ酸配列を有するフラジェリンタンパク質からなる、融合タンパク 質。 ４５、アミノ酸配列は、フラジェリンタンパク質内に、フラジェリンタンパク質 の機能に対して非必須である領域において挿入されている、上記第４４項記載の 融合タンパク質。 ４６、アミノ酸配列はフラジェリンタンパク質の超可変領域の中に挿入されてい る、上記第４５項記載の融合タンパク質。 ４７、それに接合した髄膜炎菌の莢膜のオリゴサッカリドまたは多糖類をさらに 含む、上記第４４項記載の融合タンパク質。 ４８、上記第４４項記載の融合タンパク質をエンコードする、組み換え遺伝子。 ４９、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のクラスＩ の外膜タンパク質、または髄膜炎菌（ＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｌｎｇＩｔｉｄ ｉｓ）に対するバクテリアの抗体と反応性の連続または不連続のエピトープを含 有する断片またはオリゴペプチドを発現することができる、感染性組み換え微生 物。 ５０、オリゴペプチドは【配列があります】、【配列があります】、【配列があ ります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【 配列があります】、【配列があります】および／または【配列があります】から 成る群より選択される、上記第４９項記載の微生物。 ５１、ワクシニアのウィルス、アデノウィルス、またはサイトメガロウィルスで ある、上記第４９項記載の微生物。 ５２、サルモネラ層（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のバクテリアである、上記第４９ 項記載の微生物。 ５３、髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質のエピトープは組み換えフラジェリ ンとして発現される、上記第４９項記載の微生物。 ５４、上記第４９項記載の微生物を個体に接種することからなる、髄膜炎菌（Ｎ ｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対して免疫化する方法。 ５５、クラス２および３の外膜タンパク質を産生することができない突然変異の 髄膜炎菌株。 ５６、突然変異の髄膜炎菌株ＨＩＩ１５、ＣＢＳ６３６．８９。 ５７、非天然のクラスＩの外膜タンパク質をエンコードする異種遺伝子で形質転 換された、クラス２および３の外膜タンパク質を産生することができない、突然 変異の髄膜炎菌株。 ５８、ａ、ポリンタンパク質のアミノ酸配列を獲得し、ｂ、ポリンタンパク質の アミノ酸配列を髄膜炎菌のクラスＩの外膜タンパク質（ＯＭＰ）のアミノ酸配列 と比較して、クラスＩのＯＭＰ中の既知の対応する構造に基づいて、ポリンタン パク質の露出した表面ループの構造の位置、大きさおよび配列を予測し、そして ｃ、予測された構造の位置、大きさおよび配列に基づいて表面ループ構造中の潜 在的ワクチンのエピトープを同定する、からなる、グラム陰性のポリンタンパク 質のワクチンのエピトープを同定する方法。