JPH06503330A

JPH06503330A - 骨吸収を阻害する化合物及び組成物

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Publication number: JPH06503330A
Application number: JP4501609A
Authority: JP
Inventors: ケンプ，ブルース　イー．; ニコルソン，ジェフリー　チャールズ; マーティン，トーマス　ジェイ．; フェントン，アンナ　ジェーン; ハモンズ，アール．グレン
Original assignee: ザユニバーシティオブメルボルン; ジェネンテック，インコーポレイティド
Priority date: 1990-12-13
Filing date: 1991-12-13
Publication date: 1994-04-14
Anticipated expiration: 2017-04-30
Also published as: CA2096933A1; DK0561877T3; DE69131355T2; ATE181336T1; HUT64565A; AU666838B2; JP3280021B2; AU9063291A; EP0561877B1; HU9301726D0; GR3030947T3; DE69131355D1; EP0561877A1; US5688760A; CA2096933C; WO1992010511A1; EP0561877A4; ES2135398T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】骨吸収を阻害する化合物及び組成物本発明は、骨吸収を阻害する化合物及び組成物、並びに骨吸収を阻害するための方法に関する。特に、本発明は、ポリペプチドＰＴＨｒＰ（副甲状腺ホルモン関連タンパク質）のカルボキシル末端フラグメント及び骨吸収を阻害するその誘導体に関する。

ＰＴＦＩｒＰ　（また、名称アデニル酸シクラーゼ刺激因子−ＡＣＳＦにより知られている）は、まず、扁平上皮癌（ＢＥＮ細胞）細胞抽出物からＴ、Ｊ。

Ｍａｒｔｉｎ教授及び同僚により単離され、そして均質性に精製されたタンパク質である（Ｍｏｓｅｌｅｙなど；Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８５：５０４８〜５０５２．１９８７）　、　ＰＴＨｒＰをコードする核酸が５ｕｖａなど（Ｓｃｉｅｎｃｅ２３７：８９３〜８９６．１９８７）により単離され、そして特徴づけられた。そのＰＴＨｒＰ遺伝子は、３１残基シグナル配列、続いて５残基塩基性Ｐｒｏ配列及び次にＰＴＨｒＰの配列を有するポリペプチドをコードする。ヒト遺伝子転写体は、アミノ酸１−１３９．１−１４１又は１−１７３を含んで成る成熟ＰＴＨｒＰを生成するために選択的スプライシングを受ける。前記１−１４１形が卓越していると思われる。フルプロＰＴＨｒＰのアミノ酸配列は図２に示されており、その図は種々のスプライス変異体（＊により示される）を示す。

ＰＴＨｒＰは３種の主成分ドメインを含む、残基１から残基８３に拡張し、そしてＮ−末端ドメインと称するそのＮ−末端ドメインは、ＰＴＨに関連し、そしてＰＴＨｒＰのＰＴＨレセプター結合官能価を含む配列を含む。その後、Ｃ−末端方向に、残基８４から１０６に拡張し、塩基性ペプチドと称し、そして最後に、残基１０７〜１４１又は（他のスプライス変異体における１０７〜１０７〜１７３）でＣ−末端ペプチドを含む高い塩基性の領域が存在する。

ＰＴＨｒＰの作用は、アデニル酸シクラーゼの活性化、単離された破骨細胞による器官培養における骨吸収のインビトロ刺激、及びホスフェート排泄及び環状ＡＭＰの腎臓形成のインビボ促進を包含するＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）の作用に密接に類似する。　ＰＴＨｒＰポリペプチドは、過度の骨吸収に起因する、非転移性骨破壊及び高カルシウム血症に関連する。

過剰の骨吸収は、多くの非−悪性及び悪性疾患、たとえば骨粗鬆症、骨のパンエツト病、悪性の体液性高カルシウム血症及び転移性骨疾患に関連する。さらに、宇宙飛行士経験は、ゼロの重力の条件下で骨吸収を高めた。過剰の骨吸収は、骨折及び破壊に対してますます敏感になるもろく且つ弱い骨、及び骨湾曲及び関連する姿勢の問題を生ぜしめる体重下での奇形を導く。

高カルシウム血症はまた、器官及び組織のカルシウム沈着化、すなわち組織及び器官内でのカルシウムの沈着にも関連する。カルシウム沈着化は器官機能の低下及び細胞死を導くことができる。腎臓は特に、カルシウム沈着化に対して敏感であり、低められた機能及び究極的には、付随する重大な合併症を伴って、腎臓不全を導く。

少なくともアミノ酸１０７〜１１１（すなわちアミノ酸１０７−１１１〜１０７ −１７３）及びその誘導体を含んで成るＰＴ［ＩｒＰのカルボキシル末端フラグメントは骨吸収の可能性あるインヒビターであることが現在発見された。この驚くべき観察は、骨吸収を促進する“完全な”ＰＴＨｒＰ及びそのＮ−末端フラグメントの主活性とは著しく異なっている０本発明は、この驚くべき発見に基づいて予測される。

本発明の第１の観点によれば、ＰＴＨｒＰ　１０７−１３８が特異的に排除されている条件下で、ＰＴＨｒＰの少なくともアミノ酸１０７−１１１又はその誘導体から成るＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメントを含んで成る、骨吸収阻害活性を有する化合物が供給される。

従って、本発明のこの観点によれば、前記化合物は、アミノ酸１０７−１１１〜アミノ酸１０７−１７３のＰＴＨｒＰ及びその誘導体のいづれかのカルボキシル末端フラグメント、すなわち５〜６６個のアミノ酸を含んで成るペプチド、を含む、たとえば、そのような化合物は、ＰＴＨｒＰ（１０７−１１１）　、　ＰＴＨｒＰ（１０７−１１２）、ＰＴＨｒＰ（１０７−１１９）、ＰＴＨｒＰ　（１０７−１３２）、ＰＴＦＩｒＰ（１０７−１５０）及びＰＴＨｒＰ（１０７−１７３）を含む。そのようなフラグメントのすべてはＰＴＨｒＰのアミノ酸１０７ −１１１を含むので、それらは骨吸収阻害活性を含むであろう。

ＰＴＨｒＰのアミノ酸１０７のアミノ末端は、加水分解可能な保護基により保護され得る。用語“加水分解可能な保護基”とは、遊１１１１Ｎ−末端を付与するために加水分解できる（たとえば酸加水分解、塩基加水分解、タンパク質加水分解性又は他の酵素による酵素加水分解及び同様の手段により）いづれかの基を言及するためにその広い態様で使用される。アミノ保護基は当業界において良く知られており、そしてたとえばＧｒｅｅｎなど。（１９８１＋　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　ＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　１ｎｃ、＋　これは引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。加水分解可能な保護基の例は、次のものを包含するニアシル、特に有機アシル、たとえば置換された又は置換されていない脂肪族炭化水素−オキシカルボニル、たとえばアルコキシカルボニル（たとえばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、５−ペントキシカルボニル）、ハロアルコキシカルボニル（たとえばクロロメトキシカルボニル、トリブロモエトキシカルボニル、トリクロロエトキシカルボニル）、アルカン−又はアレン−スルホニルアルコキシカルボニル（たとえば２−（メシル）エトキシカルボニル、２−（ｐ−トルエンスルホニル）・エトキシカルボニル）、アルキルチオ−又はアリールチオアルコキシカルボニル（たとえば２−（エチルチオ）エトキシカルボニル、２−（ｐ−１リルチオ）エトキシカルボニル）、置換された又は置換されていないアルカノイル、たとえばハロ（低級）アルカノイル（たとえばホルミル、トリフルオロアセチル）、単環性又は融合された環状−脂肪族オキシカルボニル（たとえばシクロへキシルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル）、置換された又は置換されていないアルケニルオキシカルボニル（たとえばアリルオキシカルボニル）、置換された又は置換されていないアルキニルオキシカルボニル（たとえば１，１−ジメチルプロパルジルオキシカルボニル）、置換された又は置換されていない了り−ルオキシカルボニル（たとえばフェノキシカルボニル、ｐ−メチルフェノキシカルボニル）、置換された又は置換されていないアラルコキシカルボニル（たとえばベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、Ｐ−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル、ｐ　−（ｐ− メトキシカルニルアゾ）−ベンジルオキシカルボニル、Ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、α−ナフチルメトキシカルボニル、ｐ−ビフェニルイソプロポキシカルボニル、フルオレニルメトキシカルボニル）、置換された又は置換されていないアレネスルホニル（たとえばベンゼンスルホニル、ｐ−）ルエンスルホニル）、１損された又は置換されていないジアルキルホスホリル（たとえばジメチルホスホリル）、置換された又は１損されていないジアラルキルホスホリル（たとえば０，０−ジベンジルホスホリル）、置換された又は置換されていない了り−ルオキシアルカノイル（たとえばフェノキシアセチル、ｐ−クロロフェノキシアセチル、２−ニトロフェノキシアセチル、２−メチル−２−（２−ニトロフェノキシ）プロピオニル）、置換された又は置換されていないアリール、たとえばフェニル、トリル；置換された又は置換されていないアラルキル、たとえばベンジル、ジフェニルメチル、トリチル又はニトロベンジル、又はｌ又は複数のアミノ酸、アミノ酸保護基に関しては、ＰＴＨｒＰのアミノ＃１０６は、アミノ＃１０７の遊ＷＩＮ−末端を生成するためにタンパク質分解によりＰＴＨｒＰのカルボニル末端フラグメントから切断できる。本発明の化合物がＰＴＨｒＰアミノ酸１０６を含む場合、ＣＦ　＋＋６　ｉ　Ｗ１１？　；　Ｄ＋ｔｚ　ｉ　Ａ＋３３又はＥ　Ｉ４ｔ　）　ＰＴＨｒＰ　１０６−１４１が特異的に排除されることが理解される。上記から明らかなように、特にヒト身体、たとえば血流又は消化管における条件下で加水分解できるいづれかのアミノ酸保護基が本発明において利用され得る。

ＰＴＨｒＰのアミノ酸１０７−１１１は、驚くべきことには、アミノ酸配列における有意な変動が骨吸収阻害活性の損失を伴わないで耐えられることにおいて、柔軟である。本発明の化合物の誘導体は、下記に示されるような式（Ｉ）及び（ＩＩ）により示され得る：Ａは、いづれかのアミノ酸の残基、好ましくは遊ＭＮ −末端又は加水分解可能な保護基により保護されたＮ−末端を有するＴｈｒ、　Ａｌａ又はＣｙｓであり；Ｂは、アミノ酸の塩基性残基、好ましくは、場合によっては、ハロゲン、Ｃｌ− ３アルキル及び又はＣｌ−Ｚのアルコキシにより１又は複数のメチレン基で置換されているＡｒｇ又はホモＡｒｇであり；Ｃは、アミノ酸の非極性又は荷電されていない極性残基、好ましくはＳｅｒ、　Ａｌａ、　Ｔｈｒ又はＣｙｓであり、ここでヒドロキシル又はスルフィドリル基は生理学的に加水分解できるエステル又はエーテルを付与するために任意にエステル化又はエーテル化され；Ｄは、アミノ酸の非極性又は荷電されていない極性残基、好ましくはＡｌａ、　Ｇｌｙ、アミノイソ酪酸、Ｍｅｔ、　Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ又はＣｙｓ　（任意に、生理学的に加水分解できるエステル又はエーテルによりエステル化又はエーテル化され得る）であり；Ｘは、芳香族アミノ酸の側鎖、好ましくはＴｙｒ、　Ｐｈｅ、メチル　フェニル　アラニン又はナフチル　アラニンであり、ここでいづれかのそのようなアミノ酸のフェニル環はハロゲン、ＮＯｘ、　ＮＬ、　ＯＨ。

Ｃｌ−＋アルキル及び／又はＣｌ−Ｓアルコキシにより任意に置換され：そしてＺは次のものである、 −ＣＯｏＲ，、ここでＲ８はＨ又はＣｌ−３低級アルキルであり；−（ＡＡ）　（ＡＡ）ｎ、ここでＡＡはいづれかのアミノ酸であり、ｎは０〜４０の整数であり、ここでｎが１以上である場合、ＡＡは同じであっても又は異なっていても良く、そして好ましくは少な（とも１つのＡＡが分子を安定化できるジスルフィド結合の導入を促進するためにＣｙｓであり； −ＣＨ，ＯＲＺ、ここでＲ２は水素又は生理学的に許容でき、生理学的に加水分解できるエステル又はエーテルの残基であり；Ｒ，は水素、Ｃｌ−Ｚアルキル、フェニル、ベンジル又はＣ，−１゜フェニルアルキルであり、Ｒ４は水素、Ｃｌ−Ｘアルキル、又はＲ１が水素又はメチルである場合、式−ＣＩ（Ｒｓ）−Ｕであり、ここでＲ３は水素、−（ＣＨｉ）　ｚ−ＯＨ又は−（ＣＨｚｈ−ＯＨであり、又は天然α−アミノ酸のα−炭素原子に結合する置換基を表し；そしてＵは式Ｒ１及びＲ２は上記の通りであり、Ｒ６は水素又はＣ１−３アルキルであり、そしてＲ７は水素、Ｃｌ−Ｚアルキル、フェニル又はＣ？−。フェニルアルキルであり、ここで前記１ｉ−ＣＩ（Ｒｓ）−ＵがＤ−又はＬ−配置を有し；但し、ＰＴＨｒＰ　１０７−１３８は特異的に排除され；そしてＡがＳｅｒである場合、ＣはＴｈｒではない。

弐（Ｉｆ）の化合物は、下記式を有する：Ｄ”　ＤＡＤＳ　Ｄ”　Ｄ’　（ＩＩ）式中、Ｗ、Ａ、Ｓ、Ｒ及びＴは標準の１文字コードを用いてアミノ酸を表わし、そしてＤはＤ−アミノ酸配置を示す。

塩基性非極性及び荷電されている極性残基は、当業界において良く知られており、そしてたとえばＬｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、第２版、Ｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ、　１９７８　；これは引用により本明細書に組込まれる）に記載される。

弐（１）のアミノ酸は、Ｄ−又はＬ−配置で存在するが、但し、その得られるペプチドは骨吸収阻害活性を有し、その活性は本明細書に記載されるような通常のバイオアッセイにより容易に試験され得る。ペプチドはＤ−又はＬ−配置又はその組合わせでアミノ酸を含むことができる。好ましくは、式（Ｉ）の化合物はＬ〜配装で存在する。

前で言及したように、出願者は、アミノ酸１０７での遊＠Ｎ−末端が一般的に骨吸収阻害活性のために必要であることを見出した。しかしながら、Ｎ−末端加水分解可能保護基を含む本発明の化合物はまた、骨吸収阻害活性を有し、ここで前記保護基は、動物の消化管又は血流において分解される。

対照的に、本発明の化合物のカルボキシル末端官能価の性質は、その化合物が骨吸収阻害活性を有する限り、重要なものではない。

一般的に、カルボキシル末端官能価は、ペプチド摂取、能力又は安定性を高めるために選択される。これに間しては、たとえばＣ１−、アルキル基を含む、生理学的に加水分解可能なエステル又はエーテルがペプチド摂取及び／又は安定性を高めることができる。

本明細書で使用される場合、用語“ＰＴＨｒＰＯカルボキシル末端フラグメント ”とは、ＰＴＨｒＰのアミノ酸１０７−１１１〜アミノｍ１０７−１７３を言及する。それらのカルボキシル末端フラグメントはまた、オステオスタチンとしても知られている。

上記に示される式（Ｉ）及び（ＩＩ）のアミノ酸１０７−１１１及びその誘導体を含む化合物は、それらが分子量、生化学的性質及びＰＴＨｒＰの大きな方のカルボキシル末端フラグメント及びその誘導体よりも容易な合成のような性質において従来の医薬試薬により類似するので、特に好都合である。

低分子量ペプチド及びその合成は特に、標準の固相（Ｋｅｎｔ、　Ｓ、Ｂ。

Ｈ，、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ　（１９８Ｂ）　５７．９５７〜９８９）又は液相タンパク質合成技法（Ｆｉｎｎ、　Ｆ、　Ｍ、、　ａｎｄ　Ｈｏｆｍａｎｎ、　Ｋ、、　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、　ＥｄｉｔＮｅｕｒａｔｈ、　Ｈ−＋旧比Ｒ，Ｌ、、　ａｎｄ　Ｂｏｅｄｅｒ、　Ｃ，Ｌ、＋　（１９７６）　Ａｃａｄｅｓ＋１ｃＰｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１０６〜２５６ページ）（それらはペプチド化学の分野において良く知られている）に従う、ペプチドは、保護された又は保護されていない形で２種のアミノ酸又はペプチド単位（少な（とも１つのアミノ酸を含む）をアミド結合により連続的に一緒に結合することによって生成される０合成ペプチドは、当業界で良く知られた技法、たとえばアミノ酸分析、逆相ＨＰＬＣ及び細管電気泳動を用いて特徴づけられる。

従って、アミノ酸又はその誘導体はペプチド鎖中にアセンブルされ、式（Ｉ）の化合物が得られる。ペプチド合成は、固体支持体上で又は溶液相において生じ、その後、得られるペプチドは適切な試薬により処理され、保護基が除去され、固相から切断され、そしてその後、分子量（サイズ排除クロマトグラフィー）、電荷（カチオン及びアニオン交換）、疎水性度及び同様のものに基づいて標準の技法により精製される。ペプチドの一般的に均質形で供給され、又は実質的に純粋であり、すなわち少なくとも９０重量％及び好ましくは９５重量％又はそれ以上の所望するペプチドを含んで成る。

例によれば、ＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメントは、Ｆａ＋ｏｃ又はｔ −Ｂｏｃ化学（Ｋｅｎｔ、前記）、又は当業界で良く知られている他のタンパク質合成方法に従って調製され得る。

ＰＴＨｒＰカルボキシル末端フラグメント及びその誘導体は、姐換え細胞培養で構造され、特にここで、前記フラグメントは約１５個又はそれ以上のアミノ酸を含んで成る。それを行うためには、まず、特定のＰＴＨｒＰ　Ｃ−末端フラグメントをコードする核酸を確保することが必要である。これは、Ｓｕνａなど、（前記）により記載されるように、標準合成方法に従ってのヌクレオチド合成により、又はＰＴＨｒＰをコードするヒトｃＤＮＡの操作によりもたらされる。いったん適切なりＮＡフラグメントが調製されれば、追加のクローニング又は発現のためにＰＴＨｒＰをコードする核酸を複製できるベクター中に挿入することは当業者のための簡単なことである。ベクターは、適合する宿主細胞（宿主−ベクターシステム）と共同して２種の機能を行うために有用である。１つの機能は、ＰＴＨｒＰのカルボキシ末端フラグメントをコードする核酸のクローニングを促進し、すなわち核酸の有用な量を生成することである。他の機能は、ＰＴＨｒＰのカルボキシ末端フラグメントの発現を方向づけることである。それらの機能の１つ又は両者は、ベクター宿主システムにより行われ得る。

発現及びクローニングベクター、並びにＰＴＨｒＰのカルボキシ末端フラグメントの発現のために使用され得る宿主細胞は、当業者に良く知られており、そしてたとえばＭａｎｉａｔｉｓなど、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　１９８２）により記載されている。

発現及びクローニングベクターは、１又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にするヌクレオチド配列を含む。

そのような配列は種々の細菌及びウィルスにおいて良く知られている。

発現及びクローニングベクターは、ベクター含有細胞の同定のための選択可能マーカーとしても知られる選択遺伝子を含むべきである。そのような遺伝子は一般的に、ベクターにより形質転換された宿主細胞の生存又は増殖のために必要なタンパク質生成物をコードする。選択可能マーカーは当業界において良く知られている。

他のクローニングベクターと違って発現ベクターは、宿主生物により認識され、そしてＰＴＨｒＰカルボキシ末端フラグメントをコードする核酸に操作可能的に結合されるプロモーターを含むべきである。

ＰＴＨｒＰカルボキシ末端フラグメントは、真核又は原核細胞、たとえば細菌、酵母、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の複細胞生物からの核細胞において発現され得る。

ＰＴＨｒＰＯカルボキシ末端フラグメントは好ましくは、分泌されたタンパク質として細胞培養物から回収されるが、但し、それらは分泌配列を伴わないで直接的に発現される場合、宿主細胞溶解物から回収され得る。分泌され又は回収された生成物は、良く知られたタンパク質精製段階、たとえばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー及び同様の方法により精製され得る。

ＰＴＨｒＰＯカルボキシル末端に対応する低分子量ペプチド、たとえばＰＴＨｒＰ（１０７−１１１）及び式（Ｉ）の化合物が特に好ましい場合、組換え方法よりもむしろペプチド合成技法が一般的に使用されるであろう。

アミノ酸１０７−１１１及び１１２〜１７３までのＰＴＨｒＰの追加のアミノ酸を含んで成る、ＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメントはまた、特に骨吸収阻害活性に対してそれ自体寄与しないアミノ酸１１２−１７３の領域においては、変動を受けやすい。従って、ＰＴＨｒＰのアミノ酸１１２−１７３は、当業界において良く知られた変動、たとえばアミノ酸の置換、欠失、挿入又は変性を受けやすいが、但しそのような変異体は骨吸収阻害活性を有する。

通常、誘導体は実質的な変異体であり、ここでＰＴＨｒＰのカルボキシ末端フラグメントにおける少なくとも１つの残基が欠失されており、そして他の残基がその位置に挿入されている。置換は典型的には、次の表に従って行われる：表１元来ｑ１玉　皇Ｉ削ｉｌｌ爽Ａｌａ　ｇｌｙ；　ｓｅｒＡｒｇ　１ｙｓＡｓｎ　Ｇｉｎ；　ｈｉｓＨｉｓ　ａｓｒＢ　ｇｌｎＬｙｓ　ａｒｇ；　ｇｌｎ；ｇｌｕＭｅｔ　ＩｅｕＨ１ｌｅＰｈｅ　ｍｅｔ；　ｌｅｕ；　ｔｙｒＶａｌ　１ｌｅＨｌｅｕ挿入は、Ｎ−又はＣ−末端結合のいづれかで選択された残基に隣接して導入され、そして好ましくは、対で導入れれる。

はとんどの置換及び挿入は、ＰＴＨｒＰカルボキシ末端フラグメントの特徴において基の変化を生成しないであろう０本発明で使用され得るＰＴＨｒＰのカルボキシ末端フラグメントの置換及び挿入変異体は、骨吸収阻害活性を有する。

本発明のアミノ酸配列変異体は好ましくは、野性型アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を変異誘発することによって構成される。一般的に、ＤＮＡの特定領域又は部位が変異誘発のために標的決定され、そして従って、それを達成するために使用される一般的な方法は、部位特異的突然変異誘発として言及される。その変異誘発は、ＤＮＡ変性酵素、たとえば制限エンドヌクレアーゼ（特定位置でＤＮＡを切断する）、ヌクレアーゼ（ＤＮＡを劣化する）及び／又はポリメラーゼ（ＤＮＡを合成する）を用いて行われる。

ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化、続く連結は、Ｓａｗｂｒｏ（１１（など。

（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ）ｌａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ｌ：１９８９）のセクション１５．３に記載されるように、欠失を生成するために使用され得る。この方法を使用するためには、外来性ＤＮＡがプラスミドベクター中に挿入されることが好ましい。外来性（挿入された）　ＤＮＡ及びベクターＤＮＡの両者の！ＩＪＩＩ！地図は利用されるべきであり、又は外来性［ＩＮＡ及びベクターＤＮＡの配列は知られるべきである。外来性ＤＮＡは、ベクターには存在しないユニーク制限部位を有すべきである。次に、欠失は、酵素の製造業者により提案される条件下で適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて、外来性ＤＮＡをそれらのユニーク制限部位間で消化することによってその外来性ＤＮＡに製造される。使用される制限酵素がプラント末端又は適合性末端を創造する場合、それらの末端は、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、（前記）のセクション１．６８に記載されるように、リガーゼ、たとえばバクテリオファージＴ４　ＤＮＡリガーゼを用い、そしてその混合物を１６°Ｃで１〜４時間、ＡＴＰ及びリガーゼ緩衝液の存在下でインキュベートすることによって直接的に一緒に連結され得る。

末端が適合性でない場合、それらはまず、ＤＮＡポリメラーゼ■又はバクテリオファージＴ４　ＤＮ＾ポリメラーゼのフレノウフラグメントを用いることによってプラント化されるべきでありとここで前記両者は、消化されたＤＮＡのオーバーハング一本饋端をフィルインするために４種のデオキシリオヌクレオチドトリホスフエートを要する。

他方、それらの末端は、ヌクレアーゼ、たとえばヌクレアーゼＳ１又はヤエナリ（■ｕｎｇ−ｂｅａｎ）ヌクレアーゼを用いてプラント化され得、・ここで前記の両者はＤＮＡのオーバーハング−末鎖を再び切断することによって機能する。

次に、ＤＮＡはりガーゼを用いて再連結される。

得られる分子は欠失変異体である。

類似する手段が、Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、（前記）のセクション１５．３に記載しているようにして挿入変異体を構成するために使用され得る。ユニーク制限部位での外来性ＤＮＡの消化の後、オリゴヌクレオチドが、外来性ＤＮＡが切断された部位中に連結される。オリゴヌクレオチドは、挿入されるべき所望するアミノ酸をコードするように消化され、そしてさらに、直接的な連結が可能なように、消化された外来性ＤＮＡの末端と適合できる５′及び３′末端を有する。

オリゴヌクレオチド−特異的変異誘発は、本発明の置換変異体を調製するために好ましい方法である。それは、欠失及び挿入変異体を便利に調製するためにも使用され得る。この技法は、Ａｄｅｌｍａｎなど、、　（ＤＮＡ、　２　：　１８３　（１９８３）　）により記載されているように、当業界においては良く知られている。

置換された１つ以上のアミノ酸を有する変異体は、いくつかの方法のうちの１つにより生成され得る。アミノ酸がポリペプチド鎖に隣接して一緒に位置する場合、それらは所望するアミノ酸置換のすべてをコードする１つのオリゴヌクレオチドを用いて同時に変異誘発され得る。しかしながら、アミノ酸がお互い同じ距離に位置する場合（たとえば１０個以上のアミノ酸により分離される）、所望する変化のすべてをコードする一本のオリゴヌクレオチドを生成することはより困難である。代わりに、２種の方法のうち１つの方法が使用され得る。第１の方法においては、別々のオリゴヌクレオチドが置換されるべき個々のアミノ酸のために生成される。次に、それらのオリゴヌクレオチドが一本鎖鋳型ＤＮＡに同時にアニールされ、そしてその鋳型から合成されるＤＮＡの第２の鎖が所望するアミノ酸置換のすべてをコードするであろう。他の方法は、所望する変異体を生成するために変異誘発の複数のルートを包含する。第１のルートは、単一変異体のために記載される通りである。第２のルートは、鋳型として変異誘発の第１のルートで生成された変異ＤＮＡを利用する。従って、この鋳型はすでに１又は複数の変異を含む。次に、追加の所望するアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドがこの鋳型にアニールされ、そして得られるＤＮＡの鎖は、変異誘発の第１及び第２のルートの両者からの変異誘発をコードする。この得られるＤＮＡは、同じように、変異誘発の第３のルートにおいて鋳型として使用され得る。

ＰＴＨｒＰのアミノ酸１０７−１１１〜１０７４７３のカルボキシル末端フラグメント及び式（１）及び（ＩＩ）の化合物の誘導体はまた、対象のフラグメントの標的決定されたアミノ酸残基と、選択された鎖、末端残基又は官能基と組合うことができる有機又は他の誘導体化剤とを反応せしめ、又は選択された組換え宿主細胞において機能する機構又は後翻訳変性を管理することによっても生成され得る。

システイニル残基はα−ハロアセテート（及び対応するアミン）、たとえばヨード酢酸又はヨードアセトアミドと最も反応され、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体が付与される。システイニル残基はまた、プロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミダゾイル）プロピオン酸、クロロアセトールホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロヌルクリ−ニトロトロフェノール又はクロロ−７−ニドロベンゾー２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応により誘導体化される。ｆＩかなＰＴＨｒＰはシスティン残基をほとんど欠いているので、有機誘導体化は、挿入性又は置換性システィン−含有ＰＴＨｒＰカルボキシ末端変異体、たとえば免疫原ペプチドへの架橋を促進するためにＮ又はＣ−末端システィンが挿入されているＰＴＨｒＰカルボキシ末端フラグメントによってのみ適用できる。

ヒスチジル残基は好ましくは、ｐＨ５，５〜７．０でジエチルピロカルボネートとの反応により誘導体化される。なぜならば、その物理はヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるからである。パラ−ブロモ−フェナシルプロミドはまた有用であり；その反応はｐｎｓ、ｏで、０、ＩＭＯカコジル酸ナトリウムにおいて行われるべきである。

シシニル及びアミノ末端残基が、無水琥珀酸又は他の無水カルボン酸と反応せしめられる。それらの物質による誘導体化は、シニニル残基の変化を逆にする効果を有する。αアミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬は、イミドエステル、たとえばメチルビコリンイミデート；ピリドキサールホスフェート；ピリドキサール；硼水素化物；トリニトロベンゼンスルホン酸；０−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒化反応を包含する。

アルギニル残基は、いくつかの従来の試薬、たとえばフェニルグリオキサール、２．３−ブタンジオン、１．２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンの中の１つの試薬との反応により変性される。

アルギニン残基の誘導体化は、その反応が、グアニジン官能基の高いｐＫａのためにアルカリ条件下で行われることを必要とする。さらに、それらの試薬は、リシンのε−アミノ基及びアルギニンのω−アミノ基と反応できる。

チロシル残基自体の特定の変性は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によりチロシル残基中へのスペクトルラベルを導入することへの特定の興味を伴って、集中的に研究されて来た。最も通常には、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンが、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３ −ニトロ誘導体を形成するために使用される。チロシル残基は、ラジオイムノアッセイへの使用のために、ラベルされたタンパク質を調製するために１１５！又はＩ２′■を用いてヨウ素化され、ここでクロラミンＴ方法がこの目的のために広く採用される。

カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’　 −Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’　）、たとえば１−シクロへキシル−３−（２−モルホリニル−（４）−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）−カルボジイミドとの反応により選択的に変性される。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル及びグルタミル残基に転換され、ここでこれは、アスパラギン及びグルタミンをコードするように核酸を変異誘発するもう１つの手段である。

三官能物質による誘導体化は、免疫原性ポリペプチドを有するタンパク質の分子間凝集物を調製するために、並びに抗体のアッセイ又はアフィニティー精製への使用のために水不溶性支持体マトリックス又は表面にカルボキシル末端フラグメントを架橋するために有用である０通常使用される架橋剤は、１．１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、たとえば４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモニ官能価イミドエステル、たとえばジスクシンイミジルエステル、たとえば３．３′ −ジチオビス（スリミンイミジループロビオネート）、及び二官能価マレイミド、たとえばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンを包含する。誘導体化剤、たとえばメチル−３−（（ｐ−アジドフェニル）ジチオ〕プロピオイミデートは、光の存在下で架橋を形成できる光活性中間体を生成する。他方、反応性水不溶性マトリックス、たとえば臭化シアン活性化炭水化物及びアメリカ特許第３，９６９，２８７号；第３，６９１，０１６号；第４．１９５．１２８号；第４，２４７．６４２号；第４，２２９，５３７号及び第４，３３０，４４０号に記載される反応性物質がタンパク質固定化のために使用される。

本発明の化合物が組換え的に生成される場合、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用に起因するある後翻訳誘導体化が生じる。°組換え宿主細胞”とは、ＡＣ５Ｐのカルボキシル末端フラグメントを発現する発現ヘクターを含む、原核又は真核細胞、たとえばＥ、コリ、種々のタイプの酵母細胞、ＣＨＯ細胞及び同様のものを意味する。グルタミン酸及びアスパラギニル残基は、その対応するグルタミル及びアスパルチル残基に後−過渡的に脱アミン化され得る。

他方、それらの残基は、温和な酸性条件下で脱アミノ化される。それらの残基のいづれかの形が、本発明の範囲内に存在する。

他の後翻訳変性は、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のメチル化（Ｔ、　Ｅ、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、　Ｈ，Ｈ，Ｆｒｅｅｓ＋ａｎ　＆　Ｃｏ、、５ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ　７９〜８６ページ（１９８３）　）　、Ｎ−末端アミンのアセチル化、及びＣ−末端カルボキシルのアミド化を包含する。

ＰＴＨｒＰのカルボキシ末端変異体又は誘導体の活性は、その変異体又は誘導体が骨吸収阻害活性を有するかいなかを決定するためには、通常のスクリーニングアッセイにより容易に評価され得る。たとえば、破骨細胞は骨の断片上に沈着され、そして試験化合物の存在下及び不在下でインキュベートされ得る。破骨細胞は組織化学的に決定され得、そして次に、たとえば超音波処理により、骨断片とのインキュベーションに続いて、除去され得、そして骨表面が単離された破骨細胞当たりに生成される吸収ピントを測定するために顕微鏡により試験され得る。

吸収ビットの数が計数され、そしてそれらの面積が、たとえばディジタル化された形ａ測定器（ｌｌｏｒｐｈｏｍｅｔｅｙ）により定量化する。骨吸収に対しての阻害活性を有する変異体又は誘導体はもちろん、骨の吸収において破骨細胞の活性を阻害し、このことは、骨断片の分析により容易に確認され得る。同様に、骨吸収の阻害に効果を有さない又は骨吸収を刺激する変異体又は誘導体は、骨断片上での吸収ピットの形成により明示されるであろう。

他の便利なアッセイがまた、ＰＴＨｒＰカルボキシ末端フラグメントの変異体及び誘導体の活性を検出するために使用され得る。

ＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメント及びその誘導体は、ナトリウム、カリウム、ホスフェート、クロリド及び同様のもののようなイオンとの非毒性塩として調製され得る。一般的に、ＰＴＨｒＰカルボキシル末端フラグメントはリン酸緩衝溶液に貯蔵され、又は賦形剤、たとえば垢アルコール、たとえばマンニトール又はソルビトール；単［１１、たとえばグルコース、マンノース、ガラクトース又はフルクトース；オリゴｗ！類、たとえばマルトース、ラクトース又はスクロース；及びタンパク質、たとえばヒト血清アルブミンの存在下で凍結乾燥され得る。

前記賦形剤はまた、水性貯蔵に基づく不活性化又は沈殿に対してのＰＴＨｒＰカルボキシ末端フラグメント及び誘導体の安定性にも寄与し、そしてそれ自体知られている他の安定剤と一緒に使用され得る。

そのような安定剤は、キレート化剤、たとえばＥＤＴＡ　、酸性アミノ酸；及び非イオン性界面活性剤、たとえばポリエチレングリコール、又はポリエチレン及びポリプロピレングリコールのブロックコポリマーを包含する。

ＰＴＨｒＰカルボキシ末端フラグメントの注入又は注射のためのキャリヤーは、滅菌等張水溶液、たとえば注射のための塩溶液又は５％デオストロースであり得る。それらの調製物は、鼻腔内、皮下、静脈内、腹腔内又は他の従来の投与路により注射又は注入される。

ＰＴＨｒＰカルボキシル末端フラグメント及びその誘導体はまた、持効性キャリヤーにも供給され得る。適切な例として、形状化された製品の形での半透過性ポリマーマトリックス、たとえば全開又はマイクロカプセルを挙げることができる。移植できる持効性マトリックスは、Ｌ−グルタミン酸及びγエチルーＬ−グルタメートのコポリマー（Ｕ、Ｓｉｄｍａｎなど、＋１９８３．　’Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ”２２　（１）　：５４７〜５５６）　、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｒ，Ｌａｎｇｅｒなど、、　１９８１．　”Ｊ、　Ｂｉｏｍｅｄ、　Ｍａｔｅｒ、　Ｒｅｓ、’　１５　：　１６７〜２７７及びＲ，Ｌａ −ｎｇｅｒ＋　１９８２．　’Ｃｈｅｗ、　Ｔｅｃｈ、’１２：９８〜１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｒ，ｌａｎｇｅｒなど、、前記）、又はポリ−Ｄ −（−）−３−ヒドロキシ醋酸（ＥＰ　１３３，９８８Ａ）を包含する。特効性組成物はまた、リポソーム的に包含されたＰＴＨｒＰカルボキシ末端フラグメントも含む、　。

ＰＴＨｒＰカルボキシ末端フラグメントを含むリポソームは、次に記載されるそれ自体既知の方法により調製される：ＤＥ　３，２１８，１２１Ａ；　Ｅｐｓ− ｔｅｉｎなど、、　１９３５．　”ｐｒ□（、Ｎ６ｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ”８２　：　３６８８−３６９２；Ｈｗａｎｇなど、、　１９８０．　”Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ’　７７：４０３０−４０３４；ＥＰ　５２３２２Ａ、　ＥＰ　３６６７６Ａ、　ＥＰ　８８０４６Ａ、　ＥＰ　１４３９４９Ａ、　ＥＰ　１４２６４１Ａ、日本特許出願第８３ −１１８００８号、Ｕ、Ｓ、特許第４，４８５，０４５号ａｎｄ第４．５４４，５４５号；及びＥＰ　１０２，３２４Ａ、通常リポソームは小さな（約２００〜８００人）の単層タイプのものであり、ここで脂質含有物は約３０モル％以上のコレステロールであり、その選択された割合は、ＰＴＨｒＰカルボキシ末端フラグメント結合の最適な割合のために＊＊される。

本発明のもう１つの観点によれば、本明細書に記載されるＰＴＨｒＰのカルボキシル末端の少なくともアミノ＃１０７−１１１又はその誘導体、並びに１又は複数の医薬的に許容できるキャリヤー又は賦形剤を含んで成る組成物が供給される。

本発明のもう１つの観点によれば、ジスルフィド、エーテル又はアミド結合により化学的に結合された、又は融合生成物として発現される、又は静電性、疎水性、又は細胞毒性活性、標的決定活性（すなわち特定の細胞タイプのための親和性）又は骨吸収阻害活性を有する化合物との他の同様の相互作用により関連される、ＰＴＨｒＰのカルボキシル末端の少なくともアミノ＃１０７−１１１又はその誘導体を含んで成るキメラ性分子が供給される。適切な化合物は、種々の細胞タイプに結合する抗体；細胞毒性分子、たとえばリシンのＡ−鎖及び細胞毒性薬物；及び骨吸収阻害活性を有する化合物、たとえばカルシトニンを包含する。

本発明のさらにもう１つの観点においては、骨吸収の阻害のための方法が提供され、ここで前記方法は、ＰＴＨｒＰＯカルボキシル末端の少なくともアミノ酸１０７−１１１又はその誘導体を含んで成る化合物の骨吸収阻害効果量並びに場合によっては、少なくとも１種の医薬的に許容できるキャリヤー又は賦形剤を、そのような処理の必要な対象に投与することを含んで成る。

本発明のさらにもう１つの観点によれば、過剰骨吸収により特徴づけられる疾病、たとえば骨粗鬆症、骨のパジェント病、悪性の体液性高カルシウム血症及び転移性骨疾患の処理方法が提供され、ここで前記方法は、ＰＴＨｒＰＯカルボキシル末端の少なくともアミノ酸１０７−１１１又はその誘導体を含んで成る化合物の骨吸収阻害効果量並びに場合によっては、少なくとも１種の医薬的に許容できるキャリヤー又は賦形剤を、そのような処理の必要な対象に投与することを含んで成る。

患者へのＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメントの投与の量、キャリヤー、頻度及びルートは、多くの要因の中で、患者の状態、標的疾患、投与の所望するルート及びカルボキシル末端フラグメントの活性に依存するであろう。これば、治療の間、医者により容易に決定され、そしてモニターされる。

単に例示的ではあるが、ＰＴＨｒＰＯカルボキシル末端フラグメントの骨吸収阻害有効量は、０．０１Ｍｇ〜１ｇ又はこれ以上である。　ＰＴＨｒＰのカルボキシ末端フラグメントの投薬単位は、約０．０５Ｍｇ〜１０＋ｓｇ、好ましくは１ μｇ　；及びより好ましくは１１０１Ｉ〜５０ｔＩｇの活性剤を含んで成る。再び、単に例示的ではあるが、ＰＴＨｒＰの骨吸収阻害有効量は、０．００１　ｕｇ　〜１ｍｇのＰＴＨｒＰ　／Ｋｇ体重である。

ＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメントは、注射により、たとえば静脈内、筋肉内、皮下又は腫瘍内注射により患者に投与され得る。

他方、投与は、鼻腔内、皮下、静脈内、腹腔内又は他の同様のルートを用いて注入により行われ得る。追加の投与は、経口、直腸、経皮、又は薬理学的に活性な化合物の投与のために当業界において良く知られている投与の他の従来のルートにより行われ得る。

本発明の種々の観点は、次の図及び例により例示されるが、それらは本発明を限定するものではない。

図１は、ブレブローＰＴＨｒＰのアミノ酸配列を示し；図２は、ピント数／破骨細胞（ＯＣ）数として測定される、骨吸収に対するＰＴＨｒＰペプチド１−１４１（対照）、１０７−１３９．１０７−１３９．１５４−１７３゜１２９−１３９及び鶏ＰＴＨｒＰ（１０７−１３９）の効果を示す。ペプチドは、１ｎＨの濃度で使用された；図３は、図２と実質的に同じであり、そして対照（ＰＴＨｒＰ　１−１４１）及びＰＴＨｒＰ　１０７−１３９に比較しての、骨吸収に対する種々の濃度でのＰＴＨｒＰ（１０７−１１１）の効果を示し；そして図４は、種々のペプチドに関する用量応答図を示し、ここで吸収ピット／処理された破骨細胞／対照の比が対数〔ペプチド〕モル濃度でプロットされている。

例Ｉ破骨細胞の単離及び骨吸収に対するアッセイ：破骨細胞を、新生雌−１ｓｔａｒラットの長骨を培養培地（ＨＥＰＥＳ−１ｊ衝化Ｍｅｄｉｕｇ＋　１９９　（Ｐｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの商標〕）にキューレットでかき取ることによってそのラットから単離した。得られた細胞懸濁液を、すすぐ前、２０分間、除油されたウシ皮質骨の１００　μ−の厚さのスライス上に固定した。この短い固定期間の後、大部分の汚染細胞をすすぎ段階で除去し、機能的に純粋な破骨細胞の集団を得た。次に、前記骨スライスを、組織培養培地（１００ｉｕ／＋ｗｌのベンジルペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１０％の熱不活性化されたウシ胎児血清により補充されたイーグルの最少必須培地（ＦｌｏｗＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）において、試験物質の存在又は不在下で、９５％空気、５％ＣＯ２下で７．３のｐＨで３７°Ｃでインキュベートした。２４時間後、細胞を固定し、タルトレート耐性酸ホスファターゼ（ＴＩ？ＡＣＰ）と細胞化学的に反応せしめ、そしてＴＲＡＣＰのために強い反応を有する複数核細胞の数（すなわち破骨細胞）を計数した。次に、細胞を０．２５ＭのＮＨ，ＯＨにおける超音波処理によりはぎ取り、その後、走査電子顕微鏡のために処理した。

個々の骨スライスの全表面を走査し、そして吸収ピントの数を計数した。選択された実験においては、ビットの深さを評価する。個々のペプチドのために個々の濃度点で最少６個の複製体が存在した。個々の実験は少なくとも３度（り返された。

統計学的有意性は、個々の処理と対照とを比較するために、５ｔｕｃｌ−ｅｎｔ　’　３と試験を用いて決定された。骨吸収は、ピット数１０Ｃ／骨スライス、合計の掘られる計画部分１０Ｃ／骨スライス又は骨の合計の掘られた体積１０Ｃ／骨スライスとして示され得る。そのようなアッセイは日常的であり、そして骨吸収阻害活性のために多数の化合物のスクリーニングに容易に従う。

例２ペプチドの調製及び精製：組換えｈＰＴＨｒＰ　（Ｌ　１４１）及び組換えｈＰＴ［１ｒＰ（１−１０８）を、前に記載されたようにして調製し、そして精製した（　５ｕｖａなど、、前記；引用により本明細書に組込まれる］　、　ｈＰＴＨｒＰ（１０７−１３９）　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　ＡｌａＴｈｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　ＨｉｓＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ−ＣＯＯＨ。

及び他のペプチドを、ＡＰｐｌｊｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｐｅｐｔｉｃｌｅ　ＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒＭｏｄｅｌ　４３０を用いて、カルボキシ−末端アミドとして合成した。ＩＩＦ分解に続いて、ペプチドを、６０％（Ｖ／Ｖ）のアセトニトリル及び０．１％（ν／ｖ）のトリフルオロ酢酸により横腹から抽出し、そして凍結乾燥せしめた。粗ペプチドを、０，１％のトリフルオロ酢酸の存在下で、アセトニトリルグラジェントを含むイオン交換クロマトグラフィー（２，５Ｘ　９０ｃｍのカラム、ＣＩ８．２０〜３０　ｔｔ　ｍ、　３００人樹脂、Ｖｙｄａｃ、　Ｃａ１ｉ−ｆｏｒｎｉａ）により精製した。合成ペプチドの組成物を、Ｂｅｃｋｍａｎ　６３００アミノ酸分析器を用いての定量アミノ酸分析により評価した。環状ＡＭＰアッセイ；破骨細胞を上記のようにして、１２−ウェル組織培養プレート（Ｌｉｎｂｒｏ）に分離した。その培養物をイソブチルメチルキサンチン（１ｍＭ）により２０分間、前処理し、その後、試験ペプチドの投与を１０分間にわたって行った。環状ＡＭＰを９５％（ｖ／ｖ）エタノール／１１のＨＣＩ　により抽出し、そしてラジオイムノアッセイにより測定した。４〜６個の複製物ウェルを、個々の処理グループに使用した。

例３ＰＴＨｒＰのカルボキシ末端配列に対応するペプチドを、次のようにして合成した：ＰＴＨｒＰ　（１０７−１４１）ＰＴＨｒＰ　（１０７−１３２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１１）ＰＴＨｒＰ（１２９−１４１）ＰＴＨｒＰ（１２９−１３９）ＰＴＨｒＰ　（１５４−１７３）　−ＰＴＨｒＰのもう１つのスプライシングに基づく配列ＰＴＨｒＰ（１−１４１）ニワトリＰＴＨｒＰ　（１０７−１３９）それらのペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒに基づいて固相技法により合成し、そしてイオン交換クロマトグラフィー及び逆相ＨＰＬＣにより精製した。

ペプチドのアミノ酸含存置を、ＢｅｃｋｍａｎＡｓｉｎｏ　Ａｃ１ｄ　Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて、加水分解の後決定した。

上記ペプチドを合成し、破骨細胞性骨吸収を担当する、ＰＴＨｒＰのカルボキシ末端領域の部分を決定した。ヒトＰＴＨｒＰ（１０７−１３９）及び（１０７− １３２）並びにニワトリＰＴＨｒＰ　（１０７−１３９）は例１に従って決定された吸収の実質的な阻害を生成するが、図２から明らかなように、ＰＴＨｒＰ（１２９−１３９）、ＰＴＨｒＰ（１５４−１７３）又はＰＴＨｒＰ（１−１４１）　（対照）は何の効果も示さない。

図３は、ペプチドＰＴＨｒＰ（１０７−１１１）が１０−”　〜１０−”Ｍで破骨細胞性骨吸収の可能性あるインヒビターであることを示す。ＰＴＨｒＰ　（１０７−１３９）は、ＰＴＨｒＰ（１０７−１１９）と同じような活性を有する（データは示されていない）。

ＰＴＨｒＰ（１０７−１３９）のために作動するシグナルトランスダクション機構は、カルシトニンのための機構とは区別できるように思われる。

サケカルシトニンに対しての２．５倍の応答に比較して、ＰＴＨｒＰ（１０７− １３９）に対しての応答における環状ＡＮＤの上昇は存在しなかった。

破骨細胞に対するＰＴＨｒＰ（１１７−１３９）の効果は、タンパク質キナーゼＣインヒビター１（７（１−（５−イソキノリンスルホニル）−２メチルピペラジンにより阻止され得る。

ＰＴｌ（ｒＰ（１０７−１１１）による骨吸収阻害活性は、この例から明らかである。この配列を含む、ＰＴＨｒＰのカルボキシ末端フラグメントはまた、骨吸収阻害において活性的である。従って、アミノ酸１０７−１１１を含む、ＰＴＨｒＰのいづれかのカルボキシ末端フラグメントは、破骨細胞性骨吸収を阻害することにおいて活性的である。

例４効果的なアミノ末端切断及び拡張：配列ＰＴＨｒＰ（１０７−１１１）に対するアミノ末端切断及び拡張を研究した。

例３の方法に従って、化合物を合成し、そして例１の方法に従って骨吸収阻害活性についてアッセイした。結果は表２に示される。

アミノ酸は、標準の一文字アミノ酸コードを用いて示され、そして骨吸収阻害活性は“＋”により示され、そして不活性は“−”により示される。

表２ＴＲ５ＩＶ　＋ＳＡ−アミノ酸１３９９ＰＴＨｒＰ　［１０９−１３９］　−ＲＴＲ５ＡＷ　＋ ” 。ＲＴＲ５ＩＶ　− Ｐｒｏ　ＴＲ５ＡＷ　＋＊：誘導体ＲＴＲ５ＡＷの骨吸収阻害活性は、ＴＲ５Ａ−及び他の誘導体の活性の約１０％であった。

ペプチドＰＴＨｒＰ（１０９−１３９）は活性でなく、そしてペプチドＰＴＨｒＰ（１０８−１３９）のデータも活性でないことを示した。これは、ＰＴＨｒＰのアミノ酸１０７−１１１が骨吸収阻害活性のために必要とされることを明白に示す。

アミノ酸１０７での遊離Ｎ−末端の臨界性を、ペプチドＴＲ５Ａ−へのＲ基（アルギニン）の付加により研究した。ＲはＰＴＨｒＰの位置１０６に見出されるアミノ酸である。このペプチドは、ＰＴＨｒＰ（１０７−１１１）の活性の約１０％を示した。遊離Ｎ−末端はＰＴＨｒＰのカルボキシ末端フラグメントのアミノ酸１０７では必要とされないが、又はむしろ、ペプチドＰＴＨｒＰ（１０６−１１１）におけるアミノ酸１０６が切断され、ＰＴＨｒＰ（１０７−１１１）を付与することがこの結果から推定され得る。

上記二者択一を研究するために、Ｄ−アミノ酸形におけるＲをペプチドＴＲ５ＡＨに付加し、１）１１１３４Ｍを得た。Ｄ−アミノ酸は、タンパク譬分解酵素によりタンパク質加水分解されない。従って、ＰＴＨｒＰ（１０６−１１１）がアミノ酸１０７で遊離アミノ末端を生成するためにアミノ酸１０６の切断により活性的になる場合、Ｄ−アミノ酸を有する誘導体、特にＤＩは不活性であることが予測される。ＰＴＨｒＰＯカルボキシ末端フラグメントのアミノ酸１０７で遊ＭＮ−アミノ酸末端が必要とされず、且つさらに、位置１０６でのアミノ酸の性質が重要でない場合、誘導体ＤＩＴｌｌＡＩ＋１は活性的であることが予測される。上記に示される結果は、ＰＴＨｒＰのアミノ酸１０６に対応するＤ−アミノ酸の付加がＴＲ５ＡＷペプチドの活性を破壊することを示す、従って、アミノ酸１０７での遊離Ｎ−末端は必要とされる。保護基がＰＴＨｒＰカルボキシルフラグメント又はその誘導体のアミノ酸１０７から切断されない場合、骨吸収阻害活性は失われる。

さらに、この観点のための支持は、ペプチドＰＴＲ３ＡＷにより明らかである。

Ｐにより示されるようなアミノ酸プロリンは、ペプチド鎖からタンパク質分解酵素により一般的に切断できない。予測されるように、ＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメントのアミノ酸１０６としてのプロリンの存在は、活性を破壊する。

ＰＴＨｒＰ（１０６−１１１）に対応するペプチドＩ？Ｔｌ？ＳＡＷは骨吸収阻害活性を有するので、加水分解可能基はアミノ酸１０７のアミノ末端及びその誘導体に付加され得る。アミノ酸１０７のＮ−末端へのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の付加を包含する実験はまた、そのような誘導体が骨吸収阻害活性を示すことを示しくデータは示されていない）、これは、そのアミノ末端からのＴＦＡの除去によるということが明らかである。

例５ＰＴＨｒＰ（１０７４１１）のアミノ酸誘導体を調製し、そしてＮ４に従って骨吸収阻害についてアッセイし、ＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメント、すなわちＰＴＨｒＰ（１０７−１１１）の活性部位の相対的形成性を研究した。結果は表３に示される。

表３アミノ酸置換の効果配列　活性ＴＲ５Ａｋ　十５ｕｃｃ　ＴＲ５ＡＩＩ　− ＰＲＳＡＷ　＋ＡＲＳＡＩＩ　＋ＴＫＳＡＷ　＋ＴＲＡＡＷ　＋５ＲＴＡＷ　＋ＴＲＳｍｅＡ　Ｈ＋５ＲＴＡＷ　＋ＴＲ３ＡφＧ　＋ＴＲＣＡＷＰＧＴＣ＋ＴＨ３Ａｋ　十ＴＲ５ｎｐ　Ａ　＋５ＲＴＡＷ　− Ｄ’Ｄ”Ｄ’Ｄ”Ｄ”　＋ここで　ｎｐＡは３（２−ナフチル）アラニンであり、φＧはα−フェニルグリシンであり、Ｉｌｅはα−メチルであり、５ｕｃｃはＮ−スクシニル−であり、 “Ｄ”はＤ−アミノ酸異性体を示す。

ＰＴＨｒＰのアミノ酸１０７−１１１は有意な変動に対して耐性であり、すなわちアミノ酸置換は活性の損失を伴わないで行われ得ることが上記結果から明らかである。

配列ＴＲ３ＩＶ（ＰＴＨｒＰ　１０７−１１１に対応する）においてＴにより示されるアミノ酸１０７はアミノ酸のいづれかの残基である。この例において、アミノ酸１０７はＴｈｒ、Ａｆａｒ　Ｄｒｏ＋　Ｓｅｒ、　ｍｅｓｅｒ及び５ｕｃｃＴｈｒの種々である。

配列Ｔ［１ＳＡ−においてＲにより示されるアミノ酸１０８は一般的にアミノ酸の塩基性残基である。この例において特別に示される場合、アミノ酸１０８は＾ｒｇ＋　Ｌｙｓ、　Ｈｔｓ及びＤ−Ａｌａであり得る。

配列Ｒ５ＡＷにおいてＳにより示されるアミノ酸１０９は、アミノ酸の非極性又は荷電されていない極性残基であり得る。この例において特別に示される場合、アミノ酸１０９はＳｅｒ、　Ａｌａ、　Ｇｌｙ、　Ｃｙｓ、　Ｔｙｒ及びＤ−Ｓｅｒであり得る。

配列ＴＲ３Ａ−においてＡにより示されるアミノ酸１１０はまた、アミノ酸の非極性又は電荷されていない残基であり得る。この例において特別に例示される場合、アミノ酸１１０は、Ａｆａｒ　ＭｅＡｌａ、３　（２−ナフチル）−アラニン及びＤ−Ａｒｇであり得る。

ＰＴＨｒＰのカルボキシ末端フラグメントのアミノ酸１１１は、一般的に芳香族アミノ酸である。アミノ酸置換は、Ｔｙｒ、α−フェニルグリシン及びα−ナフチルアラニンを包含する。

それらの特定のアミノ酸変異体は、本発明に記載される発明を限定するものではない。

アミノ酸変異体及び変性を含むペプチドは、ＰＴＨｒＰのカルボキシ末端フラグメントの種々の誘導体が骨吸収阻害活性を有するかいづれかを決定するために例１に従って容易に試験され得る。

アミノ酸１１１を越えてのカルボキシ末端の拡張は、活性に悪影響を与えない。

驚くべきこと辷は、レトロインバートされた（ｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｔｅｄ）配列ｐｌ′ＤＡ　ｌ）３　ｐＨＤＴは、骨吸収を阻害することにおいて活性であることが見出された。このペプチドのレトロインバートされたコンホーメーションは、活性を模倣するために、側鎖配向において配列↑Ｒ３ＩＶに十分に１！偵すると思われる。

表４は、単離された破骨細胞により骨吸収を阻害するＰＴＨｒＰの能力に対するペプチドの長さ及びアミノ酸組成物の効果を示す。

表４亙盪：　ＡＣ：　Ｎ−アセチル−、Ｓｕｃ　：　Ｎ−スクシニル−、＋ａｅＡ　：　ｃｒメチルアラニン、　ｐｈＧ　：αフェニルグリシン、　ｎａｐ＾：３（２−ナフチル）アラニン、　ＣＩＦ　：バラクロローし一フェニルアラニン。

＊　：ＥＣ，、’　ｓ　（活性ペプチドのみ）は、１０−　’　”Ｍ〜１０−’ Ｈの間での濃度を試験する少なくとも２つの用量一応答曲線から計算された。

ω：　１０−９？Ｉ又は１０−　”　Ｍで骨吸収の阻害は見出されない。Ｉｉｌ：天然ヒト、ラット及びマウスＰＴ［ＩｒＰ　（１０７−１１１］　、　１１　：天然のニワトリＰＴＨｒＰ　（１０７−１１１３−ｔ　：ＥＣ８６は計算されなかったが、しかしペプチドは１０−　”　Ｍ及び１０−’ＭでＴＲ５Ａ−と同じように有効である。囲まれた領域は、天然の哺乳類及びニワトリＰＴＨｒＰと相同の残基を示す。

図４は、ペプチドＴＲ５ＡＷ、　ＲＴＲＳＡＷ、　Ｄ”Ｄ’Ｄ’Ｄ嵐ＤＴ及びＤ厘ｉ寅８１のための用量応答図を示し、ここで吸収ビット／処理された破骨細胞／対照の比がペプチドの対数モル濃度に対してプロットされた。

ＴＲ５ＩＶが最も活性的なペプチドであり、ＤＨＤＡ　ｐｓ　ｐＨ［）Ｔが最少の活性ペプチドである。

例６本発明の化合物のインビボ活性を、哺乳類治療のためのモデルとして、ラットで試験した。

哺乳類血清カルシウムベルは恒常性機構により強く調節され、そしてほとんどの変動を示さない。モデルペプチド、すなわちＰＴＨｒＰ１０７−１３９を、１１００ｎの量で１００ｇの体重のラット（ｎ＝１０）中に静脈内に注射し、その後、血清カルシウムレベルを、標準方法に従って原子吸収分光計により３０及び６０分で測定した。動物の対照グループを、正の対照、すなわちカルシトニン（血清カルシウムレベルの低下を引き起こす）、及び塩溶液の形での負の対照により注射した。

１０匹のラットの２つのグループを、これらの対照に使用した。

通常の塩溶液により注射された対照のラットにおいては、血清カルシウムレベルは、注射の後３０及び６０分で、約２．５８ｍモル濃度であった。このレベルは、正常な血清カルシウムレベルに影響すると思われる。　ＰＴＨｒＰ　１０７− １３９により注射された動物に関しては、注射の後３０分での平均血清カルシウムレベルは２．３５ｍモル濃度であった。

これは、付随する骨の改造を伴って、骨吸収の妨害又は阻害に起因する血清カルシウムレベルの有意な低下に影響を及ぼす、注射の後６０分で、ＰＴＨｒＰ　１０７−１３９により注射されたラットは、約２．５５ｍモル濃度の血清カルシウムレベルを有した。このデータは、ＰＴＨｒＰ　１０７−１３９が血清カルシウムレベルの一時的な低下を引き起こし、そして血清カルシウムレベルの正常化は、ＰＴＨｒＰ　１０７−１３９の注射後、約３０分で達成されることを示す。

カルシトニンが１００ｇの体重当たり１１００ｎの量でラットに投与される場合、類似する結果、すなわち血清カルシウムの一時的な低下がＰＴＨｒＰ　１０７ −１３９に関して見出され、そして約２．３５ｍモル濃度に血清カルシウムの３０分間にわたっての低下が伴った。

ＰＴＨｒＰ　１０７−１３９は、本発明の範囲内での化合物の代表である。

１０７−１１１エピトープを含むペプチドは、ＰＴＨｒＰ　１０７−１３９と同じインビボ効果を示すことが、インビトロ骨吸収阻害データに基づいて予測される。

インビボでの破骨細胞骨吸収に対するＰＴＨｒＰ　１−３４の間接的な刺激作用に比較してのＰＴＨｒＰ　１０７−１１１の直接的な阻害作用がスケムＡに示される。

骨細胞に対するＰＴＨｒＰの作用−スケムＡ当業者は、本明細書に記載される発明が特別に記載された変動及び変性以外の変動及び変性に対し敏感であることを理解するであろう。本発明は本発明の範囲内にあるすべてのそのような変動及び変性を包含することが理解されるべきである０本発明はまた、本明細書に言及され、又は示されるすべての段階、特徴、組成物及び化合物、及びいづれか複数の前記段階又は特徴のいづれか及びすべてを包含する。

配列表（２）配列番号１についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０９個のアミノ酸（Ｂ）型二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二直鎖状（ｉｉ）配列の種Ｉ！＝タンパク質（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：　ＰＴＨｒＰのカルボキシ末端フラグメント（Ｂ）位置：１０７〜１７３（Ｃ）同定方法：　ＤＮＡクローニング及び配列決定：他のカルボキシル末端配列への類似性（Ｄ）他の情報：骨吸収の阻害（ｘ）出版物情報：（Ａ）著者：　５ｕｖａ＋　Ｌ、　Ｊ、１など（Ｂ）標題：悪性高カルシウム症に包含される副甲状腺ホルモン関連タンパク質（Ｃ）９１誌：　５ｃｉｅｎｃｅ（Ｄ）巻：２３９（Ｆ）ベージ：８９３〜８９６（Ｇ）年：　１９８７（Ｋ）配列番号ｌにおける関連する残基、１０７〜１７３及びより特定には１０７〜１１１　＋アミノ酸１１２〜１７３の１つ又は複数Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＷＸＧｉＪＲＸ　ＬＬｅｕ　Ｓｅｒ　ＴｙｒにＬａ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　Ｃ７ｍ　Ｇ１７　Ａｒ９　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓ＠ｒ工１ｅ　Ｇｉｎ　Ａｓ５ｐ　Ｌａｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｐｈａ　Ｐｈａ　Ｌ＠ｕ？ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　ｃ；よＹ　ＬＩＹ８　Ａｒｇ　１ＪＹ８　１ｊＪＬ ■ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成５年６月２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＰＴＨｒＰ１０７−１３８が特異的に排除される条件下で、ＰＴＨｒＰの少なくともアミノ酸１０７−１１１又はその誘導体から成るＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメントを含んで成る、骨吸収阻害活性を有する化合物。
２．ＰＴＨｒＰ（１０７−１１１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１７０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１７１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１７２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１７３）又はその誘導体を含んで成る請求の範囲第１項記載の化合物。
３．前記ＰＴＨｒＰのアミノ酸１０７のアミノ末端が加水分解可能な保護基により保護される請求の範囲第１又は２項記載の化合物。
４．下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中：Ａは、いづれかのアミノ酸、好ましくはＴｈｒ，Ａｌａ又はＣｙｓであり；Ｂは、ハロゲン、ニトロ，Ｃ１−３アルキル及び又はＣ１−３のアルコキシにより１又は複数のメチレン基で置換されているＡｒｇ又はホモＡｒｇであり；Ｃは、Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｔｈｒ又はＣｙｓであり、ここでヒドロキシル又はスルフィドリル基は生理学的に加水分解できるエステル又はエーテルを付与するために任意にエステル化又はエーテル化され；Ｄは、Ａｌａ，Ｇｌｙ，アミノイソ酪酸、Ｍｅｔ，Ｓｅｒ（任意に、生理学的に加水分解できるエステル又はエーテルによりエステル化又はエーテル化されている）、Ｔｈｒ，又はＣｙｓ（任意にエステル化又はエーテル化され得る）であり；Ｘは、Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，メチル　フェニル　アラニン又はナフチル　アラニンであり、ここでいづれかのそのようなアミノ酸のフェニル環はハロゲン、ＮＯ２，ＮＨ２，ＯＨ，Ｃ１−３アルキル及び／又はＣ１−３アルコキシにより任意に置換され；そしてＺは次のものである、 −ＣＯＯＲ１、ここでＲ１はＨ又はＣ１−３低級アルキルであり；−（ＡＡ）（ＡＡ）ｎ、ここでＡＡはいづれかのアミノ酸であり、ｎは０〜４０の整数であり、ここでｎが１以上である場合、ＡＡは同じであっても又は異なっていても良く、そして好ましくは少なくとも１つのＡＡが分子を安定化できるジスルフィド結合の導入を促進するためにＣｙｓであり； −ＣＨ２ＯＲ、ここでＲ２は水素又は生理学的に許容でき、生理学的に加水分解できるエステル又はエーテルの残基であり；▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒ３は水素、Ｃ１−３アルキル、フェニル、ベンジル又はＣ９−１０フェニルアルキルであり、Ｒ４は水素、Ｃ１−３アルキル、又はＲ３が水素又はメチルである場合、式−ＣＨ（Ｒ５）−Ｕであり、ここでＲ５は水素、−（ＣＨ２）２−ＯＨ又は−（ＣＨ２）３−ＯＨであり、又は天然α−アミノ酸のα−炭素原子に結合する置換基を表し；そしてＵは式−ＣＯＯＲ１、−ＣＨ２ＯＲ２又は▲数式、化学式、表等があります▼であり、ここでＲ１及びＲ２は上記の通りであり、Ｒ６は水素又はＣ１−３アルキルであり、そしてＲ７は水素、Ｃ１−３アルキル、フェニル又はＣ７−１０フェニルアルキルであり、ここで前記基−ＣＨ（Ｒ５）−ＵがＤ−又はＬ−配置を有する〕で表わされる請求の範囲第１項記載の化合物。
５．前記アミノ酸残基Ａが加水分解可能な保護基により保護される請求の範囲第４項記載の化合物。
６．下記配列：ＲＴＡＷＡＲＳＡＷＴＲＳＡＹＴＲＡＡＷＴＲＳＡｐＷＡＲＡＡＷＷＤＷＤＳＤＲＤＴＴＲＣＡＷＰＧＴＣＰＲＳＡＷＴＫＳＡＷＡＲＡＡＷＴＲＧＡＷＴＲＳｍｅ　ＡＷＴＲＳＡ　φ　ＧＴＨＳＡＷＰＲＳＡＷＴＲＳ　ｎｐＡＨｅＳＲＴＡＷ〔ここで“Ｄ”はＤ−アミノ酸異性体を示し；ψＧはα−フェニルグリシンであり；Ｍｅはｎ−メチルであり；そしてｎｐＡはナフチルアラニンである〕から選択される請求の範囲第２項記載の化合物。
７．請求の範囲第１〜６のいづれか１項記載の化合物及び１又は複数の医薬的に許容できるキャリヤー又は賦形剤を含んで成る組成物。
８．細胞毒性物費、標的決定物質又は骨吸収阻害活性を有する物質から選択された物質に関連する、ＰＴＨｒＰの少なくともアミノ酸１０７−１１１又はその誘導体から成るＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメントを含んで成るキメラ分子。
９．前記細胞毒性分子がリシンのＡ−鎖又は細胞毒性薬物である請求の範囲第８項記載のキメラ分子。
１０．前記標的決定物質がモノクローナル又はポリクローナル抗体、又は特定細胞型又は組織に対して親和性を有する物質である請求の範囲第７項記載のキメラ分子。
１１．前記骨吸収阻害活性を有する物質がカルシトニンである請求の範囲第７項記載のキメラ分子。
１２．骨吸収の阻害方法であって、ＰＴＨｒＰの少なくともアミノ酸１０７−１１１又はその誘導体から成るＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメントの骨吸収阻害有効量及び場合によっては、少なくとも１種の医薬的に許容できるキャリヤー又は賦形剤を、そのような処理の必要な患者に投与することを含んで成る方法。
１３．前記ＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメントが、ＰＴＨｒＰ（１０７ −ＩＩ１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１５）ＰＴＨｒＰ（１０７−Ｉ１６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１７０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１７１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１７２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１７３）又はその誘導体から選択される請求の範囲第１２項記載の方法。
１４．骨吸収阻害活性を有する前記ＰＴＨｒＰ誘導体が請求の範囲第４項記載の化合物である請求の範囲第１２項記載の方法。
１５．骨吸収阻害活性を有する前記ＰＴＨｒＰ誘導体が請求の範囲６項記載の化合物である請求の範囲第１２項記載の方法。
１６．過剰の骨吸収により特徴づけられる疾病の処理方法であって、ＰＴＨｒＰの少なくともアミノ酸１０７−１１１又はその誘導体から成るＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメントの骨吸収阻害有効量及び場合によっては、医薬的に許容できるキャリヤー又は賦形剤を、そのような処理の必要な患者に投与することを含んで成る方法。
１７．前記ＰＴＨｒＰのカルボキシル末端フラグメントが、ＰＴＨｒＰ（１０７ −１１１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１１９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１２９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１３９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１４９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１５９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６３）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６４）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６５）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６６）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６７）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６８）ＰＴＨｒＰ（１０７−１６９）ＰＴＨｒＰ（１０７−１７０）ＰＴＨｒＰ（１０７−１７１）ＰＴＨｒＰ（１０７−１７２）ＰＴＨｒＰ（１０７−１７３）又はその誘導体から選択される請求の範囲第１６項記載の方法。
１８．骨吸収阻害活性を有する前記ＰＴＨｒＰ誘導体が請求の範囲４項記載の化合物である請求の範囲第１６項記載の方法。
１９．骨吸収阻害活性を有する前記ＰＴＨｒＰ誘導体が請求の範囲第５項記載の化合物である請求の範囲第１６項記載の方法。
２０．前記疾患が、骨粗鬆症、骨のパジェット病、悪性の体液性高カルシウム血症及び転移性骨疾患から成る群から選択される請求の範囲第１６項記載の方法。
２１．ゼロ重力に関連する骨吸収の改良方法である請求の範囲第１２項記載の方法。