JPH06502398A - ヘパリン分画の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

ヘパリン分―の使用 本発明は、抗トロンビンｍに対して低い親和性を有するヘパリンの、マラリア治 ＊ｌｉＭ合成への使用に関する。 背景 ヘパリンは、血液凝固系の阻害剤として最も知られており、従って抗凝固剤とし て広（使用されているが、多くの他の生物学的活性をも有している（　Ｊａｑｕ ｅｓ、　＋１７９）。大きさや抗トロンビンに対する親和性に従って分画されう るのは、関連した分子の不均一混合物である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ａｔ　ｍｌ、 、＋９７６＋。そのようなヘパリン分画は、その抗凝固活性によって非常に使化 しくＡｎｄｅｒ客ｏｎ、　１９７６）、その抗凝固性は抗トロンビン結合に依存 している。 ヘパリンは、熱帯熱原虫マラリアの患者の治療に用いられてきているが（Ｍｉｔ ｃｈｌｌ、１１７４：　ｋｌｕｎｌｒ　＠ｔ　ｉｌ、１９８０：Ｓ＠ｌ＋ｓｋｉ ｍｐ　ａｎｄ　ＷｏＨｈｉｕｇ　１９）Ｉ）、結果は曖昧である。マラリア原虫 ノーレジ（ｋｎｏｗｌｅｓｉ）に感染したアカゲザルの実験において、ヘパリン による治療は、何人かの著者によると（Ｄｅｎｎｉｉ　ａｎｄ　Ｃｏｎｒａｄ　 １９６ｇ１、効果的にサルを治療したが、一方池の著者は、効果がないことを見 いだした（［Ｉｏｖｘｒｄ　ａｎｄ　Ｃｏ１１ｌｎｓ１９）２Ｊａｉｄ　ａｎｄ 　５ｕｃｈａｒロ１９フ２）。インビトＣのヘパリンは、熱帯熱原虫の発病及び 這行を阻害することを示しており（Ｓｉマ訂１−畠ｎａｎｄ　Ｃｈｏｗｄｈｕｒ ｉ　１９８３）、それらの研究のうちのひとつは、ヘノ（リンと、抗トロンビン ｍに対する親和性が高いあるいは低いヘパリン分画の５０％阻害投与量が、同じ である；１ｍｇ／ｍ＋ことを報告している（Ｂｕｔｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ　１９ ８８）。 発明の開示 マラリア寄生虫に対するヘパリンの効果をさらに研究するために、興なった熱帯 ＃原虫系統を使用して、インビトａにおいて、へ・ぐす／と、Ｋ）ａンビン親和 性または平均分子量の興なる種々のヘパリン分画の発病阻害能力を分析した。我 々は、翼なったヘパリン分画の、脳マラリアの病原に含まれると考えられる現象 である自発的に形成された熱帯熱原虫赤血球ａゼフト（Ｉｏｓｓｅ＋ｔｅｌを分 裂させる可能性についても分析した。 我々が研究したヘパリン分画は、 ＨＡ−ヘパリン、抗トａ）と７ｍ　（ＡＴｔ［［）に高い親和性をもつヘパリン Ｌ＾−ヘパリ／、ＡＴｍに低い親和性をもつヘパリンＨＭＷ−ヘバリ／、高分子 ！ヘバリン ＬＭＷ−ヘパリン、低分子量ヘパリン Ｎ−アセチル化８Ｍヘパリン、低い抗凝固活性をもつ高分子量へ／（リンである 。 本発明は、抗トロ／ピノｍに低いａ相性をもつヘパリン（ＬＡ−ヘパリン）を、 マラリア治療の薬荊製造に使用することに関する。さらに詳しくは、抗トロンビ ンｍに低いｌｉ和性をもつヘパリンの治療用投与量が、その薬剤中に２から２０ ０ｍｇである。抗トロノビ／ｍに低い親和性をもつヘパリンは、ヘパリンに比較 して、延長された出血時間を好ましく短縮する。用いたＬＡ−ヘパリンの特別の 抗凝固活性は、好ましくはＡＰＴＴによる同定で≦３０１υ／ｍｇである。１日 の投与量は１ｋｇにつき０．０５〜５ｍｇでよい。抗トロ／ピノｍに低いｔＵ和 性をもつヘバリ／は、池のマラリア治療薬剤と組み合わせて使用してよい。 本発明は、マラリアの治療方法にも関しており、治療に有効な量の抗トロンビン ｍに低い親和性をもつヘパリンが、そのような治療で必要に応じて患者に投与さ れる。 投与は、注射または注入によるのが好ましい。ヘパリンの適当で効果的な置は、 １日の投与量が約２から約２００ｍｇとなるような量である。 本発明に従って製造されたマラリア治療薬は、治療目的で使用される従来の製薬 学の実務に従って製薬（ｒｏｒｍｕｒａ　Ｌｅ）される。そのような組成物は、 製薬上許容されるキャリア、即ち固体、半固体、または液体と組み合わせて、抗 トロノと７ｍに低い親和性をもつ活性成分ヘパリンを含んでいてもよい。そのよ うな薬剤を構成する組成物は、興なった経路を通して投与するために設計されて もよい。 本発明の技術の利用において、その組成物の好適な形態は、錠剤、カプセル、ン 口、ブ、懸濁液、溶液、あるいは注射または注入に適した形態であるが、注射ま たは注入を目指した後者の形態が好ましい。その組成物は、従来から製薬上許容 されている物質を含んでいてもよい。それらは、従来の製薬実務で、薬剤の製薬 の分野の当業者が理解できる方法で、希釈剤、結合剤、色素、芳香剤、保存剤、 崩壊剤等として含ませるのである。 ヘパリ／の注射または注入可能な組成物は、ヘパリ／のレベルで特に好ましい。 また、それは、注射または注入での投与の後、効果的なマラリアの治療をもたら す。 活性成分即ち抗トロンビンｍに低い親和性をもつヘパリンの投与量は、広い範囲 で変えてもよいが、好ましい範囲は、−８約２から約２００ｍｇの間である。 投与量は、当然、マラリアの進行度、型、そしてぎ者の状きにより、場合に応じ て決められる。 表１−４は、実施例１−５に示した実験を表している。 図１は、異なった系統の鎖帯−凍虫の分裂体（ｓｅｒｏｚｏ口ｅ）感染阻害を示 している。 図２は、ロゼアトでの通常のヘバリ／とヘパリン分画の分裂効果をしめす。 以下の物質と方法を用いた。 種々の濃度の、保存剤を含まない標準ヘパリンナトリウム（ｏ、ａｓ−ｓｏ。 ０８ｇ　／　ｍ　ｇ　）　（Ｌｏｖｅｎｓ　ＡＢ　Ｍａｌｍｏ、ｓｗｅｄｅｎ） を、四系統の熱帯熱原虫で、その分袋体発病に対する影響を試験した。この明細 書では、１０Ｍｇ櫨卓ヘパリノ／ｍ１が、約ＩＵ／ｍｌに相当する。 製剤グレードのヘパリンナトリウム（ｋｍｂｉ）を、セブアクリル（Ｓｅｐｈｓ ｃｒｙｌ）Ｓ−２００（ファーマシア（ｐｈａｒｍａｃｉａ）Ｉり上で、ゲル濾 過を行い、高い及び低い分子量（ＭＷ）の分画を、また、上で述べたように、抗 トａンビンーセフ１０−ス　４Ｂ上のアフィ二ティークａマドグラフィーによっ て、抗トロンビンｍに高い（ＨＡン低い（ＬＡ＞１１相性をもツヘパリン（＾ｒ ｃｌｅｒｓｏｎ　ｅｔａｌ＋９７Ｌｎｒａ　１０５）を生成した。、高分子量で 低い抗トロンピノｌｌ和性をもつヘパリン分画を、高分子量の分画のＮ−脱硫酸 化（Ｉｎｏｕｅ　ａｎｄ　ｎａｇａｓａｗａ　１９７４）、Ｎ−アセチル化（Ｄ ｉｎｉｓｈｅｆｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ）によって製造した。 抗凝固活性は、ＡＴＰＰ　（活性化された部分トロノボプラスチ７時間）検定（ Ａｎｄａｒｉｏｎ　ｅｔ　ａｌｌによって決定され、国＠Ｈｔ位で表わした。そ の国際単位は、生物学上の標準とコントａ−ルに関する国際会議、ロンド／、英 国、からめ、藁３回ヘパリン国原基準を参照した。ヘパリンの特性は、表１に要 約した。 ヘパリン分画は、示したように、一度を変えて導かれた偉事ヘパリンと比較しＬ Ａ−ヘパリンの生成 ヒト血清からｙ、ｓｂＩ　＜パイオフアーマ（Ｂｉｏｐｈａｒｍａ））で精製し た先トロンビンｍを、ＣＮＢｒ活性化セファ０−ス４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） に、約５ｍｇ抗トロンビ／／ｍＩゲルの密度で結合させた。このゲル５００ｍ１ を、５ｃｍｘ３０ｃｍのカラムに充填し、０゜１５ＭのＮａＣ１を含む０．０５ Ｍ。 ｐＨ７，４のトリスバ１ファーで平衡させた。ＬＡ−ヘパリン合成のために、平 衡バッファーに溶解した約３００ｍｊ１のヘパリ／をこのカラムに通し、吸着さ れないヘパリンを回収した。 ＨＡ−ヘパリン生成のために、６００−９００ｍｇのヘパリンロードをこのカラ ムに過した・カラム洗浄後、Ｎ５ＣＩ一度を１．５Ｍまで上げることによりＨＡ −ヘパリンを脱着した。 この方法またはＨ（Ｈの技術を眉いて生成されたＬＡ−ヘパリンは、低いｖＬ凝 固活性を有する。この活性の大きさは、検定方法や眉いた技術によって変わるが 、ＡＴＰＰ及び国際基準を用いた場合、典型的なＬＡ−ヘパリンは≦３０１Ｕ／ ｍｇの抗凝固活性を有する。 出血時間 ヘパリンとＬＡ−ヘパリンの出血効果を比較するため、テンプレート出血時間試 験を、スブラクーダーウェイ（Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄ聰ｗｌｅｙ）ラットで行った （Ｄａｊａｎａ　ａｔ　ａｌ　１９７９）。体重２００−２５０ｇの動物を、Ｍ ｅｂｕｍ＋ｓｌ　′５ｔｅｓｏｌ　Ｉｄ　（ＤｕｍａｘＡ／Ｓ、）ベンハーゲン ）で麻酔した。テップレート装置（Ｓｉｍｐｌａｔｅ、Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｄｌａ ｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｄｕｒｈａｍ、ノースカロライナ）を、尾の背１１１部分に 長尺方向に、大静脈を避（するようＣζ注意して取り付けた。傷ａがらの血液を 、３０秒毎に吸い取り紙で注！深（取り除いた。５匹のうｌトのうち最も短いも のを各々の化合物や投与量に使用した。出血時間は、尾が切開された時から、最 初に出血が止まった時まで測定した。出血時間は、正確に３０秒毎に記録し、２ ０分より長い出血時間は＞２０と記載した。各々のラットについて２種の出血時 間を決めた。すなわち、薬剤投与の１０分前と１０分後であり、結果は出血時間 の延長として表わした。 寄生虫 熱帯熱原虫の翼なりた４系統の寄生虫を、インビトロで、トレガーとイエセ／（ Ｔｒｓｇｅｒ　ａｎｄ　Ｊｅｎｓｅｎ、＋９７６）の方法に従って、血液グルー プ０−の赤血球中で培養した。これらの系統は、Ｆ３２（クノザニア）：ＦＣＲ −３Ｋ＋（インと７）：　ＰＦＩ　５５／ＲＥＳＡ抗原を持たないＦＣＲ−３の クローン変体（Ｃａｐｐａｉ　ａｔ　ａｌｌ１ｇ幻、Ｐｇｌｏ　ＡＩ＋ｏＭ統（ ９ガンダ）から得られたロゼツト化寄生虫のクロー７であるＲ”ＰＡＩ　（ＬＪ ｄｏｍｓａＨｐａｒｃｈ　６）　ａ１１９１＋である。標準へバリンによる再発 病阻害は４系統すべてに対して試験し、ヘパリン分画によるものは、Ｆ３２及び Ｒ”ＰＡＩに対して試験した。ヘノザリン分−の赤血球ロゼｙ）分裂の可能性は 、Ｒ″ＰＡＩＪＦ＋統のロゼ１トに対して試験した。 分裂体発病阻害検定 インビトロの発病阻害を、以前ワーリンら（Ｗａｈｌｌｎ、１９８４）によって 開示されたようにおこなった。簡単に言えば、主に後期）０７＋ｅゾイテ（ｔｒ ｏｐｈｏｚｏ　ｉ　ｔ　ｅ）と早期ンフォント（ｓｃｈｉｚｏｎｔ）からなる熱 帯熱原虫培地を、出発とする約０．５％のパラ／タエミア（ｐａｒｉｓｉｔｓｅ ｍｉａ）と２％のトヘマトクリフトまで希釈した。微小培地は、９６ウエルで、 平坦な底面を持つ微小培地プレート（ｌウェルが１００μりに設定した。培地を ３７℃で２０時間、１００μｌの完全組ｌＩ培ｌ！媒体中で培養し、その債へ／ ｆゾリンるいはへバリン分画濃度を増加させた。培ＩＩ後のｐａｒＩＩｓ　＋　 ＋ａは１．　５−３％の間で変化した。培地を２回洗浄した後、亦血球単分子腰 をマルチ試験スライド上に、グルタルアルデヒド固定により形成し、空気乾燥し た。すべての試験は、４回行った。寄生虫は、アクリジンオレンジ（１０Ｍｇ／ ｍ＋）＋２１０秒浸し、入射紫外線下で、蛍光顕微鏡で計数した。ｐａｒａｓｉ ｔａｅｍｉａの比率は、スクリーンした４００００の赤血球から計算した。発病 阻害は、次式で計算した。 １００％（％標準パラシクエミアー％試験パラ／タエミア）／（％標準ｌイラシ タエミア） ヘパリンの効果が可逆的かどうかを実験するために、寄生虫の後期ステージ（ト ａフー／イテと早期／ツオント）を１．　Ｏ１’、０．　Ｏｌ　ｆｆ１ｇへ／４ １７ン／ｍｌで６時間培養した。６時間後、半分のセルを２回培費媒体で洗ｆｐ し、さらに１４時間媒体のみで培養した。ヘパリンの残っている他の半分は、合 計２０時間培養した。 赤血球ロゼツトの分裂 熱帯熱原虫の単禦体（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ　ウガノダ；　Ｒ”ＰＡＬ＋Ｐａ　Ｉ 　ａＡＩ　ｔｏ系統から得られた寄生虫ロゼ７トのクローン）を、緩衝媒体に加 えた１０％の通常の血清を用い、標準の方法に従って連続的に培養した。富化を フィコルーインパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｔｓｏｐａｑｕｅ、Ｆ’ｌＦ）で行い、 限昇希釈でクローン化した。実験は、５％ヘマトクリフト、後期ステージの４− ５％パランタエミア、そして７０−８０％の（Ｒ”ＰＡＬ）Ｈゼットに対して行 った。寄生虫培地は、少量のアクリジンオレンジを混合し、ガラススライド上に 実装して、５０の連続視野で入射紫外光下の４０％レノズを用いて計数した。視 野は、スライドにわたって、ひとつの角から他の角に対角騨状に計数し、ガラス 上のロゼツトの不均一性を補償した。２以上の非ｇ染赤血球に結合している感染 赤血球は、ロゼツトとして計１し、そのロゼツトは、後期ステージ（トロフォゾ イテと７フゾント）の感染赤血球の合計に対するロゼツト内の感染赤血球の数で あられした。 ロゼツトの検定に先だって、クローン化寄生虫Ｒ’ＦＡＩの一部（２５−５０μ Ｉ）を、通常のヘパリンと翼なったヘパリン分−の種々の希釈液と混合し、９６ ウエルの微小タイター（ｔｌｔｅｒ）プレートで、パラフィルムとす１ド（ｌｉ ｄ）（Ｌｉｎｂｒｏ、ＦＩｏｗＬａｂｓ、、ｏ７クビル、米国）でカバーして３ ７℃で３０分培養した。各ウェルのロゼツトを、添加剤として標準血清を用いた 基準のものと比較した。 実施例１ 標準ヘパリンの、異なった系統の熱帯熱原虫の発病阻害に対する影響ａｌｌヘパ リンの、興なった系統の熱帯熱原虫の発病阻害に対する影響を図］に示す。図は 、異なった系統の熱帯熱原虫Ｒ”ＦＡＩ　（＋）、Ｆ３２（２）、ＦＣＲ３Ｋ” （３）及びＦＣＲＰＦＩ　５５’りの、ヘパリンの種々の濃度ａｔ／ｍｌ　（１ Ｍ軸）での分裂体発病の阻害を示している。発病阻害の比率（Ｎ軸）は、２０時 間の培養の後に得た。高濃度のヘパリン（≧１００μｇ／′ｍ＋）を用いたとき は、検査したすべての系統において、ＲＢＣ中への分裂体発病が全体的に阻害さ れた。 ５−１０Ｍｇ７ｍ＋のヘパリフ濃度のときは、すべての系統で５０％の発病阻害 が見られた。 実施例２ ２つの系統の熱帯熱原虫に対する分裂体の影響分子量または抗トロンビンｍに対 する親和性で分離されたへ／ｆリリン翼なった分画について、その２つの系統の 熱帯＃１原虫に対する分裂体の影響につ％ｓて試験した。表２（系統Ｆ３２）に 示すように、低分子量の分画は、すべての分画の中で最も効果が少なく、７０μ ｇ／ｍ＋の濃度で５０％の発病阻害であった。高分子量分画及び抗トロンビン■ に対して高親和性の分画は、標準へｌ（リンの活性とほぼ同等であり、約ＩＯμ ｇ／ｍｉｌ＋）濃度で５０％の発病阻害であった。最も有効に阻害する分画は、 抗凝集性を持たない低親和性分画であり、この分画は、ｌμｇ／ｍｌの１１１度 で５０％の発病阻害であった（！［２）。この結果は、Ｒ”ＦＡＩ系統に対して も同じであった（データは示さない）。 高分子量で、低抗凝固活性をもつヘパリン分画（Ｎ−アセチル化で得られる）も また、発病に対する影響を試験した。表２に見られるように、この分画は、高分 子量分画と同様に、５０％の発病阻害の濃度がそれぞれ１０及び１１μｇ／ｍ＋ であつた＠ Ｘ絶倒３ 樟準ヘパリ／の可逆的効果 表３に見られるように、標準ヘパリン（Ｋａｂｌ）の効果は、すべての濃度で可 逆的であった。ｐａｒａｓｉ＋ａｅｍｉｓの比率は、６時間ヘノ（リン（１００ ０μｇ／ｍ＋）に晒した培地と、その後洗浄したヘノヂリ７無しの標ＩＩ物とは 同じで、各々」、９．１．８％であった。一方、ヘパリン（＋ｏｏｏμｇ／ｒｒ ＋＋）で２０時間処理した培地はｐａｒａｓｅｔａｅｍ＋ａが全く無かった（− １００％阻害）。 実施例４ 赤血球ロゼブトの分裂に対するヘパリン及びヘパリン分画の影響赤血球ロゼブト の分裂に対するヘパリン及びヘパリン分画の影響を図２に示す。 図は、ロゼブトに対する通常のヘパリン（Ｎ）及びヘパリン分画の分裂効果を示 している。（ＨＡ−高親和性、ＬＡ−低ｇ和性、ＨＭＷ−高分子量、ＬＭＷ−低 分子量）翼なった分画の有効性は、低分子量分画を除いて非常に類似しているが 、低分子量分画はヘパリン及び他の分画に比較して約５０分の１の有効性しかな い。 従って、ヘパリンによる赤血球ロゼ１トの分裂や赤血球ロゼ７ト形成の阻害は、 その抗凝固活性には無関係であり、平均分子量が＞５ｓｏｏダルドア（ｄａｌｔ ｏｎ）であることを必要とする。 実施例５ ヘパリン及びＬＡ−ヘパリンの出血時間ヘパリン及びＬＡ−ヘパリンの出血時間 を表４に示す。２ｍｇ／ｋｇの標準ヘパリンは、側室したすべての速度で２０分 を越える出血時間をもたらし、１ｍｇ／ｋｇでは、出血時間を４．５分長くする 。反対に、ＬＡ−ヘパリンでは、出血時間の重大な遅延、４．２分、を得るには 、８倍量の投与、８ｍｇ／ｋｇ、を必要とする。従って、ＬＡ−ヘパリンでは、 標準ヘパリンに比較して、出血に影響する能力が、非常に減縮されている。 １１論 我々は、ヘパリンが、すでに知られているものよりも、イ／ビトＧでの分裂体発 病のより有効な阻害薬であることを示してきた。試験した４つの翼なった系統の 熱帯熱原虫の間で違いは認められず、すべて５０％の発病阻害には、約５μｇ／ ｍ１のヘパリンを必要とする。ヘパリンを用いたイ／ビトａのマラリア発病阻害 の初期の研究（Ｂｕｔｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ　１９８８：　Ｓｊｖａｒａｗａｎ 　ａｎｄ　Ｃｈｏ拳ｄｈｕｒｉ　１９８３＋では、５０％の発病阻害を達成する には、ｌ５−５０倍のヘバリ／を必要としていた。我々が活性を示すことを見い だしたヘパ９フ４度は、ヒトのイ／ビボ治療。 例えば血栓予防や奥の静脈のトＯ／ｆ／ス治療に使用される範囲である。 分子量や抗トロ／ピノ■に対する親和性の異なるヘパリン分画は、すべて発病の 阻害に有効である。最も有効な分画は、抗トロンビン親和性の低いものである。 この分画は、通常のヘパリンや高親和性の分画よりほぼ１０倍有効である。これ らの発見は新しく、驚くべきことである。なぜならば、ブ１チ＋−（Ｂｕｔｃｈ ｅｒ）らは、高及び低親和性の分画の阻害効果が違わないことを見いだしている （＋９８８）からである。ブ１チャイーらは、彼らの研究において１ｍｇ／ｍ＋ の濃度を使用しており、それは、我々の研究の中で活性を見いだしたＬＡ−へｔ ４す／の濃度（ｌμｇ／ｍ＋＞の１０００倍である。 明らかに、抗凝固特性や、抗トロンビンｍ親和性は、寄生虫阻害に不可欠ではな い。ここに示したように、ＬＡ−ヘパリンに関する出血の低い危険性（表４）や 高い寄生虫発病阻害有効性（表２）によって、ＬＡ−へ・（す／は、出血の危険 性が通常のヘパリンの使用を阻んでいるマラリアの有効な薬剤になる。 高分子量分画は、通常のヘパリ／と同程度に有効であり、低分子量分画よりほぼ １０倍の効果がある。このことは、最も有効なヘパリンの成分は比較的高分子量 のものであることを示している。抗凝固活性の無いＮ−アセチル化された高分子 量分画は、無変性の高分子量分画と同程度に有効である。このことは、発病の阻 害と血ｆＩＪｌｆ固が、ヘパリンの別々の特性であることを示しているユこの変 性された分画は、低親和性ヘパリンよりも低い発病阻害効果を持つ。このことは 、高い有効性には、完全なＮ−硫酸化及び、′またはｒ通常の」サイズの分配が 必要であることを示唆している。抗トロンビン高ｎ和性の物質を除いた高分子量 分画は、低親和性ヘパリン分画と同等かそれ以上有効となることができる。高分 子量低親和性ヘパリ／とＮ−アセチル化標準ヘバリ／の比較がこの疑問を解く。 低ｎＫＪ性ヘパリンが最も有効な阻害剤である理由は、現在のところ解明されて いない。 寄生虫発病に対するヘバリ／の作用の形格はわかっていない。へ・イリンは赤ｌ １１１Ｌｆ寄生虫間に永続的な効果を有していないように見える。なざならば、 ヘパリンをンツオントが破壊される前に洗い除くと、阻害が可逆的であるからで ある。ブ。 チャーら（１９８８）とは逆に、ノツオントの破裂に対するヘパリンの阻害効果 は無く、分裂体の発生が見られた。たとえ高濃度のヘパリンでも、すべてのシフ ォントは破壊され、培地に寄生虫は全く検出されなかった。しかし、ヘパリンが 、自由な分裂体に、その発生後に作用するのか、あるいは非感染赤血球の膜と結 合し、分裂体の細胞内への透過を阻止するのかはわかっていない。この機構の研 究には、さらなる実験が必要である。 ヘパリンは、重篤なマラリアの病原に含まれることを暗に意味する他の機構に対 して、強く、投与量に依存した能力、即ち熱帯熱原虫マラリアの０発的な赤血球 ａゼブト化を逆行させることをしめしているａ　（ｃａｒｌｔｏｎ　ｅｔ　！＋ 　１９９０；Ｕｄｏｍｘａｎｇｐｅ＋ｅｈ　れ　ａｌ　１９８９）。このロゼ１ ト現象は、分裂体発病や、重賞マラリアの原因に含まれるのと同様に、寄生虫部 面にも含まれると縄唱されていた（ＣｉｒｌＬｏｎａｔ　ａｌ１９９０；Ｗｉｈ ｌｇｒｅｎ　ｅＬａｌ　１９８９）ａ従って、赤血球中への寄生虫発病に対する 効果に加えて、ヘパリンは、患者の血管中の感染及び非感染の赤血球の凝集体を 溶解させたり形成を阻害することによる、脳マラリアの治療成果や阻害に対して 有益な効果をも有している。ここで示した新しい発見は、低い抗凝固性と低い出 血促進効果をもち、最も効果的な分裂体発病阻害剤であるヘパリン分画は、通常 のヘパリンと同様にロゼブト形成を逆行させることにおいて有効である（図２） 。 ヘパリンの治療的使用に関連した小さな出血危険性が、マラリア患者において止 血が阻害されることによって増加すため、低抗凝固性で出血時間延長効果の低い ヘパリン分画は、マラリア治療の為の有効な治ｒＩ１．ｆＩ価値がある。 我々の発見から、我々は低親和性へバリ：／　（ＬＡ−ヘパリ／）は、低い１１ １度で、インビトロでのマラリアに非常に良い効果を持っている。このＬＡ−ヘ バリ／は、ｊ！常のヘパリンから抗トａノビ／ｌｌ１１＆親和性のヘパリンを取 り除くことによって生成され、低い抗凝固性（ＡＴＰＰで≦３０１υ／ｍｇ）と 、ヘパリンより非常に低い出血危険性を持つ。これらの発見は、驚くべきことで 、新しく、従来けつして開示されたり予想されたりしていない。マラリア治療の ための薬剤製造におけるし八−ヘパリンの使用は、治療的価値を有する。Ｌ＾− へノセリンは、単独でも、マラリア治療用の既存のあるいは新しい薬剤と組み合 わせて使用することができる。Ｌ＾−ヘパリンは、マラリアが、マラリア治療用 に確立された化学療法試薬に耐性をもつ寄生虫によって起こった場合に、特に有 益である。 寥考文献 ＾ｎｄｅｒｓｏｎ、Ｌ、−０，，，Ｔ、Ｗ、Ｂａｒｒｏｗｅｌｉｆｆｅ、εＨｏ ：ｓｅｒ、　Ｅ＾、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ、　Ｇ、Ｅ、Ｃ，５ｉ唐刀A１９ フロ、　丁ｈｒｏ＠ｂ、Ｒｅｓ、、９：　５１５−５８３抗トロンビン酊を結合 させたマトリックス上のアフィニティークリマドグラフィー及びゲル濾過によっ て分画されたヘパリンの抗凝固特性。 ＥｕｔｅｈａｒＪ、Ａ、、Ｃ，Ｒ，Ｐａｒｉｓｈ、、Ｗ、Ｂ、Ｃｏｗｄｅｎｔ、 １９０．　Ｔｒａｎｓ、Ｒａｙ、Ｓｏｃ、Ｔｒａｐ、Ｍｅｄ、　ｌｌｙｇ、　８ ２：　５５ｇ−５５９猿合多ａｌｌによる熱帯熱原虫のインビ）ｃｙでの成長阻 害。 Ｃａｐｐｊｉ、Ｒ，、Ｍ、Ｒ，ｖａｎ　５ｅｈｒａｖｅｎｄｉｊｌｅ、　Ｒ，Ａ ｎｄｅｒｓ、　Ｍ、Ｇｒｅｇｏｒｙ　Ｆｅｅｅｒｓｏｎ、　k、Ｍ、Ｔｈｏｍ ｌｇ、＾Ｆ、Ｇｏ＋＋＋＋ａｎ、　ＤＪ、［ｅ＊ｐ、　１９８９．　Ｍｏ１ｅ１ ．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　９：　３５°−３５８７熱帯熱原虫１１＋１体ＦＣ Ｒ３において、ＲεＳ八抗へが、サブテσメリアグデイレーン嘗ン（ｓｕｂＩｅ ｌｏｓｅｒｉｅ　ｄｅｌｓｕｉｏｎｌによって阻害されることの説明。 Ｃ１ｒｌｓｏｎｊ、、　Ｇ、Ｈｏ１ｓｑｕｉｓ１．　Ｄ、１．Ｔａｙｌｏｒ、　 Ｐ　Ｐｅｒｌｗａｎｎ、　Ｍ、ｌａｈｌｇｒｅｎ、＋９９０D　Ｐｒｏｃ ｌｌｍｌｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳ＾　Ｈ：２ＳＩＩ−２５１５自発的に 形成された熱帯熱厚虫赤血Ｉｉａゼアトを分裂するヒスチノ／−リッチのタンパ クｆｆ　（Ｐ　Ｔ−ＨＲＰ　Ｉ＞に対する抗体。 Ｄａｎｉｓｈａｆｓｋｙ、１．、１１．Ｂ、Ｅｉｂｅｒ、　Ｊ、Ｊ、Ｃａｒｒ、 １９６０．＾ｒｅｈ、　Ｂｉｏｃｈｅ＊、　ＢｉｏｐｈｙｓA　９０：　１ １４−Ｉ２１゜ ヘパリンの化学に関する実験１．　脱硫酸化およびアセチル化。 Ｄｉｎｎｉｉ、Ｌ、１１．、Ｍ、Ｅ、Ｃｏｎｒａｄ、１９ｇ＋１．Ｌａｎｃｅｔ ７６９−フッ１゜猿の（ｓｉｓｉｉｎ＞マラリアにおけるヘパリンの抗凝固性及 び抗マラリア性。 Ｄｅｊｉｎａ、Ｅ、、Ａ、Ｃａ１ｌｉｏｎ１．＾、Ｑｕｉ＋＋Ｌｉｎａ、Ｇ、Ｇ ５５ｔａｎｏ、１９７９．Ｔｈｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、＋５：１X１ −１９７゜ Ｅｋｒｅ、ｌｌ−Ｐ、１９８５．　Ｉｎｔ、　Ｊ、ｌ−５ｕｎｏｐｈａｒａａｅ 、フ　２フｌ−２８０抗トロンビンｍに対する親和性または分子量が異なるヘパ リン分画によるヒト補体の阻害。 Ｅｋｒｓ、［Ｉ−Ｐ、、Ｂ、Ｆｊｅｌｌｎｅｒ、Ｏ，Ｈａｇｅｒ＋＋＋ｉｒｋ、 １９８６Ｉｎｋ、Ｊ、Ｉｗｓｕｎｏｐｈａｒ＊ａｃ、８：２V？−２ 翼なったヘパリン分画による、ヒト皮膚の実験的炎症に依存した補体の阻害。 Ｔｌｏｖｓｒｄ、Ｗ、＾、、Ｗ、Ｅ、Ｃｏ１１ｉ＋ｕ、１９７２．　Ｌａｎｃｅ ＋　７３８−７３９猿のマラリア原虫ノーレンマラリアにおけるヘパリン治療。 Ｉｎｏｕｅ、Ｙ、、Ｅ、Ｍａｇｘｓａｗｘ、＋９７６、Ｃ１ｒｂｏｈｙｄｒ、Ｒ ａｇ、４Ｇ：　８フー９５水またはメタノールを含むジメチルスルホキ／ドによ る、ヘパリンの選択的Ｎ−脱硫酸化。 Ｊａｑｕａｓ、Ｌ、Ｂ、＋９７９．　５ｃｉｅｎｃｅ　２０６：　５２８−５３ ３新しいパラディム（ｐｓｒａｄＩＫ箇）を加えた古薬品。 １１ｉｔｅｈｅ１１．　＾Ｄ、１９７４．　Ｓ、Ａｆｒ、Ｍａｄ、Ｊ、４８：　 １３５３−４重篤な脳マラリアの最近の経験。 Ｍｕｎｉｒ、Ｍ、、　Ｔ、Ｈｕｓｓｄａ、、　Ｔ、Ｈ，Ｒａ＊ｐｅｎｇａｎ、１ ．Ｍｕｓｔａｄｊａｂ、　Ｆ、Ｈ，Ｗｕｌｕｒ、１９８０．@Ｐｅｄｉａｔ ｉｃＩｎｄｏｎａｉｉａｎａ２０：４フー５０脳マラリア治療におけるヘパリン 。 Ｒａ１ｄ、　１１＾、　Ｐ、５ｕｃｈａｒｉｔ、　１９７２．Ｌａｎｃｅｔ　１ １１０−１１１２゜猿の／−レンマラリアにおけるヘパリンとアミ７カブａノ酸 。 ５Ｉｖｓｒｅ＠ａｎ、Ｃ＾、Ａ、Ｎ、Ｒａ１．Ｃｈｏｖｄｈｕｒｉ、１９ｇ！、 Ｉｎｄ、Ｊｏｕｒ、ｏｆＥｘｐ、８ｉｏ１．２１：２４フー２５０゜ 熱帯熱原虫のイノビトロ成長に対するへｚ＜す／ナトリウムの影響。 Ｓｓｉｔｉｋａｍｐ、Ｈ，、Ｆ、Ｈ，ｆｏｌｔｈｉｕｓ、＋９７１．Ｂｒ１ｔ、 Ｍａｄノ、ｌニア１４−７１６脳を含む悪性３日マラリア治療におイする新しい 概念。 τａｇｅｒＪ、、Ｊ、Ｂ、Ｊｅｎｓｅｎ、１９７６．５ｃｉｅｎｃｅ１９３．６ ７３−６７５゜連続培養におけるヒトマラリア寄生虫。 Ｌｌｄｏｓａｓｎｇｐｅｔｃｈ、Ｒ，、Ｂ、Ｗａｈｌｉｎ、Ｊ、Ｃａｒｌｓｏｎ 、にＢｅｒｚｉｎｓ、ｉｌ、Ｄｅｒｉｉ、Ｍ、ＡｉｋｘｗａA　Ｐ、Ｐ ｅｒｌｍａｎｎ、ｌｉＪａｈｌｇｒｅｎ、１１．　１９８９．　ｌ　Ｅｘｐ、Ｍ ａｄ、１６９：　１８１５−１８４０自発的に赤血球ロゼ７）を形成する熱帯外 原虫感染赤血球。 Ｗａｈｌｇｒｅｎ、Ｍ、、Ｊ、Ｃａｒｌｓｏｎ、Ｒ，Ｕｄｏｓｓａｎｇｐｅｌｃ ｈ、Ｐ、Ｐｅｒｌｍｉｎｎ、＋９６９．Ｐａｒａｓｉｔ、Ｔ盾р■ Ｆ　Ｓ：　Ｉｎ−１０ 熱帯鎮原虫感染赤血球が自発的に赤血球ロゼ、トを形成する理由。 ｆａｈｌｉｎ、Ｂ、、Ｍ、ＩＦａｈｌｇｒｅｎ、Ｈ，ＰｅｒＩｍａｎｎ、に　Ｂ ｅｒｚｌｎｓ、＾、Ｂｅｒｋｍａｎ、Ｍ、Ｐａｔａｒｒｏｙ潤AＰ Ｐｅｒｌｓａｎｉ、１９８４．　Ｐｒｏｃ、１ｌａｔ１．　Ａｃ１ｄ、Ｓｃｉ、 ８１＋　７９１２−７９１分裂体発病を効果的に阻害するＭ＋５５，０００熱帯 熱原虫抗原に対するヒト抗、体。 表１　ヘパリン分画の特性 平均分子量　抗凝固活性 （グルトノ）　（Ｉｌｌ／ｍｇ） ヘパリン　Ｋａｂｌ　１１．０００　１８０ＨＡ−へｔ４’Ｊン”　Ｉ　１．　 ５００　３４０ＬＡ−ヘパリン”　１０．５００　２８ＮＭＷ−ヘハ’Ｊ　ン” 　＋　７．　ＯＯＯ２７０ｌＭＷ−ヘパリン”　５．６００　２１Ｎ−アセチル 化　ＨＭ　１６．０００　＜１０ａ　）　抗トロンビ／［［Ｉに対する親和性の 高いヘパリンｂ）抗トロンとン■に対する親和性の低いヘバリ／Ｃ）高分子量ヘ パリン ｄ）低分子量ヘバリ／ Ｃ）低抗凝固活性をもつ高分子量ヘパリノ表２　興なったヘパリフ分画による熱 帯熱原虫の発ａｍ害化合物ｓｌ　５Ｑ％発病阻害濃度 Ｎ−アセチル化　ＨＭＷ−ヘパリ／１０龜）表１の脚注＃照 表３　ヘパリンによる分裂体発病阻害の可逆性培地　ヘパリン　％バラサイタエ ミア　％発病ヘパリン”　１０００　０　１００ 洗浄ヘパリンＯン　１０００　１．９　０洗浄へバリア　１００　１．９　０ 洗浄ヘパリン　１０　１．８　０ ａ）培地（標準）中で２０時間培養した寄生虫実験開始当初のバラセタエミアは ０．　６％ｂ）ＰＩ々のｍ１度のへパリ／？ｉ在下で２０時間培養した寄生虫ｃ ）Ｉ々の一度のヘパリン存在下で６時間培養し、＃ｘ体で洗浄した後、媒体中で さらに１４時間培養した寄生虫 表４　ヘパリンまたはＬＡ−へＩイリン投与後のう１トの尾ζこおＩする出血時 間化合物　投与量　出血時間 ｍｇ／ｋｇ　延長（分）　〉２０分（％）２　１７．３　１００ 出血時間の詳細は本文１１％

【図１】 ヘバリン漬度（ｕｇ−ｍｌ） 【図２１ 国際調査報告 一一一−ａ＋Ａ鶴−−−ｌｋ　ＰＣ′ｒｌＳＦ　９１１００６６８国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。 ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　Ｓ、　ＣＡ、Ｆ Ｉ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　Ｎｏ、　ＳＤ。 ＳＵ、　ＵＳ （７２）発明者　ベルルマン、ピータ−；　スウェーデン国　Ｓ−１１１２７ス トックホルム　マーラルトルゲット　１３ （７２）発明者　ワールグレン、マッッスウェーデン国　Ｓ−１３１４０ナッカ ビル力バーゲン　１２

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．抗トロンビンＩＩＩに対して低い親和性を有するへバリンの、マラリア治療 用薬剤の製造のための使用。
2. ２．抗トロンビンＩＩＩに対して低い親和性を有するへバリンが、へバリンに比 較して．出血時間延長が短縮されている請求項１に記載の使用。
3. ３．抗トロンビンＩＩＩに対して低い親和性を有するへバリンの量が、薬剤中で ２から２００ｍｇである請求項１または２記載の使用。
4. ４．広トロンビンＩＩＩに対して低い親性を有するヘバリンの１日の投与量が、 １ｋｇにつき０．０５から５ｍｇである請求項１から３のいずれかに記載の使用 。
5. ５．抗トロンビンＩＩＩに対して低い親和性を有するへバリンの抗凝固活性が、 ＡＴＰＰによる同定で≦３０である請求項１から４のいずれかに記載の使用。
6. ６．マラリア治療用の他の薬剤との組合せにおける請求項１から４のいずれかに 記載の使用
7. ７．その治療を必要としている患者に、治療上有効な量の抗トロンビンＩＩＩに 対して低い親和性を有するヘバリンを投与することからなるマラリア治療の方法 。
8. ８．投与が注射または注入により行われる請求項７の方法。
9. ９．前記有効な量が、１日の投与量が約２から約２００ｍｇのヘバリンとなるよ うナ範囲にある請求項７または８記載の方法。