JPH06500772A - 改良されたワクチン組成物 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 改良されたワクチン組成物 本発明は、改良された免疫原性を有するワクチン組成物に関する。より詳しくは 、本発明の組成物はタンパク質担体に共有結合したバクテリア多糖と長鎖アルキ ル化合物との組み合わせを含んでなる。担体およびアルキル化合物はアジュバン トとして機能する。

発明の背景 ワクチン組成物は病気の予防において重要であることはよく知られている。宿主 動物を病気の危険にさらさないで、外来物質に対する免疫性を前記宿主に付与す るように免疫系を活性化するように設計された前記物質に前記宿主をさらすこと によって、ワクチンは働く。現在、約２０のワクチンは商業的使用のために開発 された。これらのワクチンは病気一原因となる生物または生物の一部分一を無毒 化するか、あるいは前記生物の特定の無毒の部分を単離することによって作られ る。後者の既知の実施例は、バクテリア性髄膜炎および肺炎のためのワクチンの 基礎として髄膜炎菌および肺炎球菌のバクテリアからの莢膜の多糖の単離物であ る。しかしながら、多糖のワクチンは劣った免疫原であり、発生に劣るか、ある いは障害された免疫系をもつ個体において、適切な量の保護的抗体を発生させな い。後者は若い子供、中年過ぎの人、または自己免疫病の人を包含する。さらに 、事実起こる免疫応答はＴ−独立性または非メモリー性であり、これは促進注射 を与えられたとき、血清変換ｄｅ、増加した抗体の応答を表さないであろう。Ｔ 細胞依存性はＩｇＧ抗体おき、ＩｇＭおよびＩｇＧ抗体はワクチンの反復した注 射のとき形成される。さらに、抗体の応答の大きさは、応答がＴ−依存性である とき、ワクチンの各注射とともに増加する。多糖のワクチンの免疫学が、ジェニ ングス（Ｊｅｎｎ　ｔ　ｎｇｓ）ら、「多糖類（Ｔｈｅ　Ｐｏ１ｙｓａｃｈａｒ ｉｄｅｓ）Ｊ　（Ｇ、Ｏ，Ａｓｐｉｎａｌ１編）、Ｖｏｌ、１．２９１−３２９ 　（１９８２）に概観されている。

適当なタンパク質担体への多糖の接合または共有結合は、Ｔ−依存性またはメモ リー性応答が起こるであろうということにおいて、免疫機能を改良する。１９８ ７年１２月において、最初の接合ワクチンは米国においてヒトにおける使用につ いて承認された。これはジフテリアトキソイドの担体タンパク質に共有結合で接 合されたインフルエンザ菌（Ｈｉｎｆ　Ｉｕｅｎｚａｅ）ｂから成っていた。商 業的多糖ワクチンはその年令において制限された効能をもっていたので、承認は １８力月の年齢の子供についてであった。異なる接合化学により調製された、他 のインフルエンザ菌（Ｈ，ｉｎｆ　Ｉｕｅｎｚａｅ）ｂ接合ワクチンが最近米国 において承認された。

多糖および多糖−タンパク質接合体はより純粋であり、それゆえ古典的な全バク テリアまたはウィルスのワクチンより安全である。すなわち、全体のバクテリア またはウィルスが化学物質、熱または遺伝学的弱毒化により生化学的に無毒化さ れていてさえ、後者はしばしば毒性副生物で汚染されている。しかしながら、多 糖および多糖−タンパク質接合体改良された純度（これはしばしば天然の免疫刺 激物質が除去されているこリポタンパク質およびムラミルジペプチドを含む；こ れらのすべては毒性である。さらに、タンパク質の担体はまたある程度の毒性を 有することがあり、これによりできるだけ少量を使用することが望ましい。例え ば、ジフテリアトキソイドおよび関係する分子ＣＲＭ１９７はヒトにおける使用 のための接合ワクチンに普通に使用されている担体分子である。

しかしながら、大人はこれらの担体分子に対して局所的および前身の過敏反応を 表すことがある。これらの作用を相殺するために、アジュバントをワクチンに関 連して使用して、増強された抗体の形成を誘発する。

例えば、血清変換および引き続＜ＩｇＧ抗体の生産は多糖−タンパク質接合体ワ クチンで免疫化したとき起こり、この応答はマウスにおいて主としてＩｇＧ１で あろう。ＩｇＧ２ａの生産の増加は利益であろう。なぜなら、後者は補体の活性 化に関して最も有効であるからである。補体の経路は多数のバクテリアの感染に 対して重要な防御機構を提供する。

商業的使用のためのアジュバントに関すると、アルミニウムおよびカルシウムの 塩類のみは現在アジュバントとして使用されている。しかしなから、アルミニウ ムおよびカルシウムの塩類は効力のあるアジュバントではない。カルシウム塩類 は制限された用途のみが見いだされた。アルミニウム塩類は他のワクチンととも にいっそう広い用途見いだしたが、多糖−タンパク質接合体ワクチンを使用した 成功はほとんど報告されてきていない。事実、水酸化アルミニウムはインフルエ ンザ菌（Ｈ，ｉｎｆ　Ｉｕｅｎｚａｅ）ｂの多糖−破傷風トキソイド接合ワクチ ンに対する抗体の応答を阻害することが報告された。Ｊ、Ｂ、ロビンス（Ｒｏｂ ｂｉｎｓ）ら、ジｑ斤ナル・サン・ベディアトリクス（Ｊ、Ｐｅｄｉａｔセ ｒｉｃｓ）、ＩＩＪ、６９５−７０２　（１９８８）、Ｊ、Ｂ、ｏビンス（Ｒｏ ｂｂｉｎｓ）らは、また、水酸化アルミニウムおよびチフス菌（Ｓ、ｔｙｐｈｆ ）の多糖−コレラのトキソイドの接合体ワクチンを使用する抗体の応答の同一の 抑制を観察している；ジャーナル・サン・イクスペリメンタル・メディシ：／（ Ｊ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１６６．１５１０−１５ ２４　（１９８７）　。さらに、アルミニウム塩類は注射部位に一時的または慢 性の局所的肉芽腫を誘発することがある。Ｌ、Ｈ，ニアリアー（Ｃｏｌｌｉｅｒ ）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　、１３５４−１３６７　（１９８７）は、破 傷風トキソイドのワクチンに対する発生およびひどさはアルミニウムアジュバン トの存在に依存する。アルミニウムアジュバントの調製は常に再現性があるわけ ではない。そのうえ、アルミニウムは、単独で、直ちの過敏性反応を仲介する原 因となるＩｇＥ抗体の生産を刺激することができる。これはＴ、マツハシ（Ｍａ 　ｔ　ｕｈａ　ｓ　ｉ）ら、ジャーナル・サン・インフエクシャス・ディジージ ス（Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）、１４６．１９２　（１９ ８２）により記載された。

近年、アジュバントとして有機化合物の使用に注意が集中された。はんのわずか の化合物が商業的に入手可能なアルミニウム塩類に類似する方法で：すなわち、 ゆっくり解放する賦形剤または抗原（ワクチン）貯蔵所として機能し、ここで抗 原は注射部位において比較的長い期間にわたって解放される。

このような有機化合物の例は有機界面活性剤および乳化剤、例えば、ＢＡＳＦ： Ｉ−ボレーション（Ｃｏｒｐｏｒａｔ　１ｏｎ）製造のポリオキｅｔｒｏｎｉｃ ｓ）である。アジュバント性のこのようなゆっくりした解放のメカニズムは、免 疫系の過度の刺激の可能性を減少するので、ヒトにおける使用のために長い間受 は入れられてきている。免疫系の過度の刺激は、効力のある免疫刺激剤、例えば 、フロインドアジュバントの使用で起こるような自己免疫の応答に導くことがあ る。こうして、ゆっくりした解放のメカニズムは好ましいメカニズムである。有 機アジュバントの大部分は効力のある免疫刺激剤であることが示されたが、この ような高度に塩化アゼチルアジュバントは毒性である傾向があり、したがってヒ トにおける使用に許容されない。効力のある免疫刺激剤である既知の有機アジュ バントの例は、フロイント完全アジュバントおよびムラミルジペプチドである。

これらの化合物の両者は、毒性の理由で、動物の研究における使用に限定されて いる。アルミニウム塩類をまねる有機アジュバントの多数はアルミニウム塩類よ り毒性である。例えば、Ｄ、ガル（Ｇａｌｌ）、イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ）　、１１．３６９−３８６　（１９６６）に記載されている長鎖アルキ ルアミン類は、一般に、細胞膜の構造に対して崩壊的である。

アミノ酸のチロシンのオクタデシルエステルはアジュバントことが知られている 。最小の免疫刺激性質を有するが、その代わりアルミニウムアジュバントに対す る有機同等体−ゆっくりした解放性の賦形剤として機能する。すなわち、抗原は オクタデシルチロシンと複合化し、不溶性のアジュバントから経時的にゆっくり 解放または脱着されるであろう。

抗原とアジュバントとの開の複合化は種々の弱い、非共有結合の力、例８．９３ ２号およびモロネイ（Ｍｏｌｏｎｅｙ）らに対する米国特許第４．４２８．０２ ９号において見られる。オベレル（Ｏｖｅｒａｌｌ）が開示しているように、ア レルゲン、例えば、ライムギ、草および花粉抽出物と複合化したとき、脱感作の 治療のためのアジュバントとして機能する。モロネイ（Ｍｏｌｏｎｅｙ）らが教 示しているように、破傷風トキソイドおよびホルマリン不活性化した■、ＩＩお よびＩＩＩ型のポリオウィルスと複合化したとき、ワクチンのためのアジュバン トとして機能する。この現象は、さらに、Ａ、ニクソンージョージ（Ｎｉｘｏｎ −Ｇｅｏｒｇｅ）ら、ジャーナル・サン・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ）、１４４．４７９８−４８０２　（１９９０）に記載されており、ここに 開示されているように、オクタデシルチロシンおよび他の芳香族アミノ酸のオク タデシルエステルは、組み換えＢ型肝炎の表面抗原と複合化したとき、Ｂ型肝炎 の候補のワクチンのためのアジュバントとして機能する。

したがって、改良された免疫原性を有する、無毒の多糖タンパク質接合体ワクチ ンーアジュバント組成物を開発することが必要とされている。

本発明は、無毒のバクテリアの多糖−タンパク質接合体のワクチンおよび無毒の 長鎖アルキルのアジュバントを含んでなる、改良されたワクチン組成物に関する 。こうして、本発明の１つの面に従い、多糖−タンパク質接合体の免疫原性を増 幅するために有効量で存在する、無毒のバクテリアの多糖タンパク質接合体およ び無毒の長鎖アルキル化合物を含んでなるワクチン組成物が提供される。

を誘発する方法が提供される。

驚くべきことには、本発明によれば、無毒の長鎖アルキル化合物、とくにアミノ 酸およびペプチドのエステルを多糖−タンパク質接合体のワクチンと複合化する ことができることが発見された。この複合化の結果、長鎖アルキル化合物はゆっ くり解放性のワクチンとして機能する。すなわち、長鎖アルキル化合物は延長し た期間にわたって宿主動物の中に解放する。これは、接合体のワクチン単独によ り生産されたものに関して、増加した抗体の応答を生ずる。上に記載したように 、このアジュバント性のメカニズムはアルミニウム塩類および非接合ワクチンを 使用して観察されるメカニズムと同一である。しかしながら、アルミニウム塩類 は、また前述したように、大部分について、バクテリアの多糖−タンパク質接合 体のワクチンのために無効のアジュバントである。したがって、本発明の長鎖ア ルキル化合物は、同一のアジュバント性のメカニズムは接合体のワクチンのため のアジュバントとして機能する。したがって、なおいっそう驚くべきことには、 無毒の長鎖アルキル化合物は接合体のワクチンの免疫原性を改良する機能をする 。

また、本発明によれば、アジュバントとして無毒の長鎖アルキル化合物、典型的 には長鎖アミノ酸またはペプチドのエステルの存在は、接合体のワクチンに応答 して生産された抗体のアイソタイプであることが発見された。詳しくは、ＩｇＧ ２ａ抗体／ＩｇＧ１の抗体の比はより高く、アジュバントが存在しないとき観察 される比と反対に、本発明に従い長鎖アルキルアジュバントを両者の抗体のアイ ソタイプのレベルは増加す抗体であるとして、ＩｇＧ２ａ抗体は重要であるので 、この比の増加は利益である。

抗体の応答の増加および変調（すなわち、アイソタイプの変化）による、長鎖ア ルキル化合物のアジュバントの効果は、また、担体タンパク質の役割において驚 （べきものである。すなわち、抗体の応答を増加および変調することは接合体の ワクチンの範囲内の担体の機能である。

無毒の長鎖アルキル化合物は好ましくはアミノ酸またはペプチドの陽性に帯電し たエステル、とくに１４〜２０個の炭素原子を含有するアルキルアルコールおよ びアミノ酸、ジペプチドまたはトリペプチドのエステルである。

本発明の組成物において使用するバクテリアの多糖タンパク質接合体は、宿主の 中で免疫応答を誘発することができる。ここで使用するとき、用語「バクテリア 」は、莢膜の多糖、リボ多糖および池の莢膜下の（表面）多糖を包含する。と（ に病原性バクテリアの莢膜多糖は有効な接合体のワクチンの調製に現在量も有用 である。このような莢膜多糖は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　 １ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉ ｄｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ）、ストレプトコッカス・アガラクチアｚ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇ ａｌａｃｔｉａｅ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐ ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）から成る群から単離されたものを包含す る。リポ多→の例は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉｃｏｌｔ）、チフス菌（Ｓａ ｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅ ｒｕｇｉｎｏｓａ）から成る群より単離されたものを包含する。他の莢膜下の多 糖の例は、群Ａ、ＢおよびＣブドウ球菌類（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の普通 の多糖の抗原および肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏ ｎｉａｅ）の普通の多糖の抗原（Ｃ−物質）である。

下の実施例は、有意に異なる化学的構造の多糖、すなわち、メニンゴコッカル（ Ｍｅｎ　ｉｎｇｏｃｏｃｃａ　Ｉ）群Ａ多糖（Ｎ−アシルモノサミン６−ホスフ ェートのホモポリマー）、メニンゴコソカル（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａ　Ｉ） 群Ｂ（（２→８）結合Ｎ−ブタノイルニューラミン酸）およびメニンゴコッカル （Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｅｃａｌ）群Ｃ（（２→９）結合Ｎ−アセチルニューラミ ン酸）からなる接合体を使用する実験を記載する。本発明は、例示したメニンゴ コｙカル（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）接合体に限定されず、また、上に定義 および例示した池のバクテリアの多糖からなる接合体に適用される。

本発明における接合体の中に使用するバクテリアの多糖は、普通の単離技術を使 用して容易に調製される。

バクテリアの多糖を接合または共有結合する担体分子はタンパク質である。好ま しい担体はウシ血清アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋｅ ｙｈｏｌｅ　Ｌｊｍｐｅｔ　Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）である。ヒトにおける使用 に適当なタンパク質の担体は、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、無細 胞の百日咳ワクチン（ＬＰＦトキソり無毒のであり、好ましくはパラペンへイマ ー（Ｐａｐｐｅｎｈｅ　ｉｍｅｒ）ら、イムノケミストリー（Ｉｍｍｕｎｏｃｈ ｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ）。

９．８９１−９０６　（１９７２）に従い得られたＣＲＭ１９７）　、および他 のバクテリアのタンパク質担体、例えば、メニンゴコッカル（ｍｅｎ　ｉｎｇｏ ｃｏｃｃａ　Ｉ）の外膜タンパク質である。好ましくは、担体タンパク質それ自 体は免疫原である。

多糖は担体に当業者に知られている便利な方法によって共有結合することができ る。対称のリンカ−１例えば、Ｊ、Ｂ、ロビンス（Ｒｏｂｂｉｎｓ）ら、ジャー ナル・サン・イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ。

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１５２．３６１−３７６　（ １９８０）に記載されている、アジピン酸ジヒドラジド、あるいはへテロ２官能 性リンカ−１例えば、Ｊ、Ｂ、　ロビンス（ＲｏｂｂｉｎＳ）ら、感染および免 疫学（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、５６．２２９２−２ ２９８　（１９８８）に記載されている、Ｎ−スクシニミジル３−（２−ピリジ ルジチオ）プロピオネートの使用は本発明の範囲内であるが、リンカ−の使用を 回避し、その代わりＨ８Ｊ、ジエニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）ら、ジャーナル ・サン・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１２７．１０１１−１０ １９（１９８１）に記載されている還元性アミン化により、多糖をタンパク質の 担体に直接カップリングすることが好ましい。

バクテリアの多糖の大きさは、平均分子量により定義して、可変性であり、そし てそれを誘導するによりバクテリアおよび多糖を担体にカッ元的アミン化のカッ プリング法では、多糖の分子量は通常５．０００〜５００．０００、例えば、３ ００．０００〜５００．０００、または５゜０００〜５０．０００ダルトンの範 囲内である。

長鎖アルキルのアジュバント、ならびに宿主の中でその代謝から生ずる化合物は 無毒である。長鎖脂肪族アルコールは天然に存在する無毒の物質であることはよ く知られている。例えば、オクタデカノールは、ボッセリン（Ｇｏｓｓｅｌｉｎ ）の「商品の臨床的毒性（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃｏ ｍｍｅｒｃｉａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）Ｊ、第４版、１９７６に記載されている ように、１５ｇ／ｋｇより大きい経口的ＬＤ５０により示されるように、ヒトに おいて完全に無毒である。オクタデシルチロシンは動物において無毒であること が発見され、そして天然に存在するアミノ酸の大部分は無毒である：Ｃ，Ｌ。

ペンネイ（Ｐ　ｅ　ｎ　ｎ　ｅ　ｙ）ら、ワクチン（Ｖａｃｃ　１ｎｅ）　、４ ．９９−１０４　（１９８６）。したがって、オクタデシルチロシンおよび他の アルコールおよびアミノ酸のエステルはヒトにおいて毒性を示さないであろうこ とが期待される。

アジュバントは水性媒質中で約１５０μｍ〜１ｍＭの大きさくメツシュ１８〜メ ツシユ１００、好ましくは約２５０μＭ１またはメツジュロ０）を有する微小粒 子を形成することができ、これにより均一なコンシスチンシーの墾濁液を生ずる べきである。そのうえ、アジュバントの微小粒子は接合体のワクチンを吸収し、 これにより宿主の中へのゆっくりした解放を可能とする。

し 式中、Ｃは水素原子、アミノ酸残基、または１０までのアミノ酸残基を含むペプ チド残基（デカペプチドまで）である：Ｄは水素原子、または医薬として許容さ れる酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、酒石酸、乳酸または酢酸で ある。Ｅは４−ヒドロキシベンジル、ベンジル、４−ヒドロキシフェニル、フェ ニル、４−アミノブチル、イソプロピル、メチル、水素および天然に存在するア ミノ酸の他の残基である；Ａは（ＣＨ２）−１酸素またはＣＨ２Ｏであり、そし てＢは（ＣＨ２ルまたは酸素であり、ここでｎは０〜４であり、ただしＡおよび Ｂは（ＣＨ２）、。

および酸素について同一ではない：そしてＲは１２〜２０個の炭素原子を有する アルキルである。

好ましくは、Ｃは水素、アミノ酸、ジペプチドまたはトリペプチドである。Ｃが アミノ酸である場合、アジュバントのアミノ酸配列はチロシルグリシン、グリシ ルグリシン、グリシルチロシンおよびフェニルアラニルグリシンから成る群より 選択することができる。

Ｃがジペプチドである場合、アジュバントは、例えば、チロシルグリシングリシ ンまたはチロシルアラニルグリジンから選択することができる。アミノ酸残基が キラルである場合、Ｄ一対車体、Ｌ一対車体またはそれらの混合物を使用するこ とができる。アジュバントはアルファアミノ酸からなることがとくに好ましい。

Ｅは４−ヒドロキシベンジル、べＡがＣＨ２ＯでありかつＢが（ＣＨ，）、であ るとき、化合物はＮ−アミノアシルエタノールアミン−〇−ステアレートである 。ＡがＣＨ２ＯでありかつＢが酸素であるとき、化合物はカーボネートである。

より好ましくは、アジュバントはアミノ酸エステル塩酸塩であり、ここでＣは水 素であり、Ｄは塩酸であり、Ａは（ＣＨｚ）、であり、ここでｎは０〜４であり モしてＢは酸素である。

最も好ましくは、アジュバントはオクタデシルチロシン塩酸塩であり、ここでＣ は水素であり、Ｄは塩酸であり、Ｅは４−ヒドロキシベンジルであり、モしてＲ はオクタデシルであり、Ａは（ＣＨ２）ゆであり、そしてＢは酸素である。

一般に、Ｃが水素でないとき、アジュバントの主鎖は実質的にペプチド結合を含 む、すなわち、１つのアミノ酸残基のカルボキシレートはアジュバント残基のア ミンに頭尾結合で直接連結している。あるいは、ペプチド結合はチオアミドであ ることができる。

アジュバントは任意の便利な方法により調製することができる。例えば、アジュ バントのアミジエステル部分はある数の確立された方法の任意の１つにより、例 えば、Ｍ、ポダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｋｙ）ら、「ペプチドの合成（Ｐｅｐｔ ｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）Ｊ、第２版、ウィリイ（Ｗ　ｉ　Ｉ　ｅ　ｙ）　 、ニューヨーク　１９７６およびＲ，Ｗ　レスケ（Ｒｏｅｓｋｅ）、ペプチド（ Ｐｅｐｔ　１ｄｅｓ）（Ｎ、Ｙ、）３、サン・オーガニック・ケミストリー（Ｊ 、Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓ、ｔｒｙ）、５０．１４５７−１４５９　（１ ９８５）に記載されている、メタンスルホン酸を触媒とするエステル化手順であ る。

アジュバントがジペプチドまたはトリペプチドであるとき、ペプチド結合は、前 述の「ペプチドの合成（Ｐｅｐｔｔｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｆｓ）Ｊに記載されて いる手順により形成することができる。さらに、ペプチド結合は固相または液相 のプロトコルにより形成することができる。

アミド、チオアミドまたはチオエステルの結合の形成のために有用である、多数 のプロトコルおよび試薬が存在する。

アジュバントの調製の間に、反応性官能基を一時的に保護することが望ましいこ とがある。例えば、アミンはウレタン型基により保護し、アルコールはｔ−ブチ ルまたはベンジル基により保護し、そして酸はエステル基により保護することが できる。適当な保護−脱保護の条件およびプロトコルは、前述の「ペプチドの合 成（Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）Ｊに記載されている。

アジュバントは前述の任意の技術により精製することができる。好ましい精製技 術はシリカゲルのクロマトグラフィー、とくにＷ、クラーク・スチル（Ｃ１ａｒ ｋ　５ｔｉｌｌ）ら、ジャーナル・サン・オーガニック・ケミストリー（Ｊ、Ｏ ｒｇａｎ　ｔ　ｃ　Ｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ）　、４３．２９２３−２９２５ 　（１９７８）に記載されているように、「フラッシュ」　（急速）クロマトグ ラフィー技術である。しかしながら、ＨＰＬＣを包含する、他のクロマトグラフ ィーの方法をアジュバントの精製に使用られるので、精製は不必要である。

本発明のワクチン組成物は、アジュバント添加した組成物を製造する既知の技術 に従い、適当な無菌の条件下に、アジュバントを多糖−担体タンパク質接合体と 物理的に混合することによって調製する。多糖−担体タンパク質接合体とアジュ バントとの複合化は、接合体上の正味の陰性電荷により促進され、この正味の陰 性電荷は長鎖アルキル化合物のアジュバント上に存在する陽性の電荷に電気的に 引き付けられる。

ヒトにおいて免疫応答を誘発するために必要なアジュバントおよび多糖−担体タ ンパク質接合体の量は相互関係を有するが、普通のワクチンにおいて一般に使用 される範囲内である。例えば、アジュバントの量を増加すると、接合体の量は減 少すること、およびその逆が示唆される。

アジュバントの好ましい量は、組成物の１ｍｌ当たり０．０１〜５ｍｇ、例えば 、０．０５〜３ｍｇ、好ましくは０．５〜１．Ｏｍｇである。接合体の好ましい 量は約１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約５〜４０μｇ／ｍｌである。投与量 はワクチンを与えられる宿主ならびに因子、例えば、宿主の大きさ、体重および 年令に依存するであろう。

本発明のワクチン組成物は、池の製剤学的ポリペプチド組成物について使用され ている技術に類似する技術を使用して配合することができる。

こうして、アジュバントおよび接合体を凍結乾燥した形態で貯蔵し、そして投与 の前に医薬として許容される賦形剤の中で再構成して懸濁液を形成することがで きる。あるいは、アジュバントおよび接合体を賦形剤の中に貯蔵することができ る。好ましい賦形剤は無菌の溶液、とくに無賦形剤は、防腐剤または混合物の貯 蔵安定性または効能を改良する既知の添加剤を含有することができる。適当な防 腐剤は、例えば、チメロサルを包含する。

本発明のワクチンの投与量は変化することができるが、一般に普通のワクチンに おいて使用する範囲内である。単一の投与量の体積は、前述の接合体およびアジ ュバントの濃度において、約Ｑ、１ｍｌ〜約１．５ｍｌ、より好ましくは約０． 　２〜約０．５ｍｌである。

本発明のワクチン組成物は任意の便利な手段により投与することができる。好ま しい投与方法は、皮下、筋肉内、皮肉、または鼻を経る供給を包含する。あるい は、この混合物を生物拡散性移植片から解放することができる。あるいは、１系 列の投与を数日間または数週間かけて実施することができる。

実施例 次の非限定的実施例により本発明を説明する。

実施例１ メニンゴコッカル（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）の群ＡおよびＣの多糖の単離 、調製および接合を記載する。

多糖は群Ａについて髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）株６０４Ａおよ び群Ｃについて２２４１Ｃの培養抽出物から得る。これらの菌株は、病気の抑制 のための研究センター（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｄｉｓ ｅａｓｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、オンタリオ州オッタワ）の菌株保存機関ψ）ら入手 し、そしてケンニイ（Ｋｅｎｎｙ）ら、Ｂｕ　］　１．　Ｗ、　Ｈ，９’、３７ 　：　５６９　（１９５７）に記載されているように化学的に定義される培地の 中で増殖した。発酵槽の増殖（１５時間）後、ホルマリンを０．７５％の最終濃 度に添加してバクテリアを殺した。バクテリアを連続的遠心分離により除去し、 そして多糖を上澄み液から単離し、そしてバンドル（Ｂｕｎｄｌｅ）ら、Ｊ、Ｂ ｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２４９　：　４７９７−４８０１　（１９８４）ｉ、：本質的に記載 されているように、多糖を上澄み液から単離および精製したが、ただし粗製多糖 の溶液を熱（５０〜６０℃）フェノールの代わりに冷（４℃）フェノールと撹拌 することによってタンパク質を抽出した。この変更は多糖の高分子量の形態を生 成および単離することを確実にする。

群Ａの多糖の解重合 天然のメニンゴコッカル（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）の群Ａの多糖（平均分 子量３０，０００　；　１５０ｍｇ）を２０ｍ１の酢酸ナトリウム緩衝液（１０ ０ｍＭ；ｐｆ（５，０）中に溶解し、そして７０℃に加熱した。所望の分子量（ 分子量１２．０００）が得られるまで、スパロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２ゲ ル抽出カラムのＦＰＬＣ（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ））により解 重合をモニターした。この物質を４℃において蒸留水に対して透析し、そして凍 結乾燥して１３．５ｍｇの非晶質固体を得た。

解重合した群Ａの多糖の還元 解重合した群Ａの多糖（１００ｍｇ）を３ｍｌのトリス（ＨＣＩ）緩衝液（２０ ０ｍＭ：　ｐＨ７，２）中に溶解し、モして０℃に冷却した。

ホウ水素化ナトリウムの５ｘ２．５ｍｇのアリコートを撹拌した溶液に３時間か けて添加した。この溶液のｐＨを１００ｍＭの酢酸の添加によｍＭの水酸化ナト リウムで７．５に上げた。この溶液をパイオーゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅ　１）Ｐ６Ｄ Ｇ　（パイオーラド（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａ　ｄ）　）カラム（１，６Ｘ１００ｃｍ ）で脱塩し、そして水で溶離した。空隙体積のピークを集め、凍結乾燥し、そし て１１．７ｍｇの還元した生成物を得た。

ＧＡＭＰの活性化および大きさ決定 解重合および還元した群Ａの多糖（１１０ｍｇ）を５ＱｍＭの過ヨウ素酸ナトリ ウム溶液中に溶解し、そして暗所で室温において１時間保持した。次いでエチレ ングリコール（５０μｌ）を添加し、そしてこの溶液を室温において１時間放置 した。この溶液を水中のバイオ−ゲル（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｇｅ　１）　Ｐ６ＤＧ　（ バイオ−ラド（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａ　ｄ）　）カラム（１，６Ｘ１００ｃｍ）で脱 塩した。空隙体積を集め、そして凍結乾燥すると、酸化された生成物が得られた 。この物質をパイオーゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｔ）Ａｏ、５　（１，６Ｘ１００ｃｍ ；ＰＢＳ　（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中の２００〜４００メツシユ）の カラムで大きさ決定した。スバｏ−ス（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２　（ＨＲＩＯ／ ３０；ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　１ａ））のカラムのＦＰＬＣ（ファーマ シア（Ｐｈ　ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）により測定して、ＫｏＯ，５〜ＫｏＯ， ６（平均分子量ｉｏ、ｏｏｏ〜１５，０００）におけるカラムからの分画を集め 、透析し、そして凍結乾燥した。

群Ｃの多糖の酸化、解重合 天然のメニンゴコッカル（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）の群Ｃの多について記 載したように、解重合反応をＦＰＬＣ分析によりモニターした。所望の範囲の平 均分子量が得られたとき、反応をエチレングリコール（１００μＩ）で停止し、 そしてこの溶液を室温において１時間放置し、そして凍結乾燥した。

ＧＣＭＰの酸化した断片の大きさ決定 ＰＢＳ中のパイオーゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅ　Ｉ）Ａｏ、５カラム（１，６Ｘ１００ ｃｍ；　２００〜４００メツシユ）（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用し てゲル濾過により、酸化したＧＣＭＰを大きさ決定した。

ＦＰＬＣ（前述したように）により測定して、Ｋｏｏ、５〜ＫＤＯ，６（平均分 子量１０．０００〜１５．０００）におけるカラムからの分画を集め、透析し、 そして凍結乾燥した。こうして集めたＧ　ＣＭ　Ｐ断片は両方の末端にアルデヒ ドを含有する。

多糖の接合体 ＡまたはＣの酸化した断片（９０ｍｇ）を１００ｍＭのＮａＨＣＯ３（ｐＨ８， １）緩衝液（２ｍｌ）中に溶解し、そして破傷風トキソイドのモノマー（３０ｍ ｇ）をこの溶液に添加した。シアノホウ水素化ナトリウム（アルドリッヒ（Ａｌ ｄｒ　ｉ　ｃｈ）　、ウィスコンシン州ミルウォーキー；６０ｍｇ）の添加後、 この溶液を３７℃において４日間インキュベーションした。次いで反応混合物を ＰＢＳ中のパイオーゲル（Ｂｉ。

−Ｇｅ　Ｉ）Ａ　（０，５）（２００〜４００ｍ１　：　１．６Ｘ１００ｃｍ） は、それぞれ、２〜３：１の多端／破傷風トキソイドのモル比を有した。

Ｎ−プロピオニルおよびＮ−ブタノイル群Ｂのメニンゴコッカル（Ｍｅｎ　ｉｎ ｇｏｃｏｃｃａ　１）の多糖の調製および接合を次に記載する。

コロミン酸（ｃｏｌｏｍｉｎｉｃ　ａｃｔｄ）と−緒にプロピオン酸およびブタ ン酸の無水物をシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓ　ｉ　ｇｍａＣｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏ、）ミゾリー州セントルイス、から入手した。

コロミン酸は群Ｂのメニンゴコッカル（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）の多糖（ ＧＢＭＰ）と構造的に同一であるので、それを以後ＧＢＭＰと呼ぶ。破傷風トキ ソイドはインスチチュート・アーマンドーフラッピーア（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　 Ａｒｍａｎｄ−Ｆｒａｐｐｉｅｒ）、クベツク、レイベル、から入手し、そして すべての接合体において使用した、そのモノマーの形態はバイオ−ゲル（Ｂｉｏ −Ｇｅｔ）（商標）Ａ（０，５）（２００〜４００メツシユ）のカラム（１，６ Ｘ１００ｃｍ）（パイオーラド（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａ　ｄ）　、カリフォルニア州 すッチモンド）に上の調製物を通過させることによって獲得し、０．０１Ｍのリ ン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７，４）で液平衡化しそして溶離した 。ＧＢＭＰのＮ−説アシル化ＧＢＭＰ（Ｎａ”塩）（１，０ｇ）を５ｍｌの２Ｍ のＮａＯＨ中に溶解しそして、ＮａＢＨ＜　（１５０ｍｇ）の添加後、この溶液 をネジキャップのテフロ（商標）容器（６０ｍ　ｌ　）の中で１１０℃に６時間 加熱した。この手順はジャーナル・サン・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ ｇｙ）　、１３４．２６５１　（１９８５）および米国特許第４．７２７，１３ ６号（これらはハロルドＪ、ジエニ蒸留水に対して広範に透析し、そして凍結乾 燥した。Ｎ−説アシル化ＧＢＭＰが得られたという事実は、Ｎ−説アシル化ＧＢ ＭＰｃｒ）’Ｈ−ＮＭＲスペクトル中のメチルアセトアミドの信号（デルタ２． ０７における一重線）の不存在により決定された。

ＧＢＭＰのＮ−アシル化 Ｎ−説アシル化ＣＢＭＰ　（１，０ｇ）を５０ｍ１の５％の水性ＮａＨＣＯｊ中 に溶解した。２つの個々のアリコート（上の溶液の１０ｍ１）をプロピオン酸ま たはブタン酸の無水物に添加した。これらの試薬を３ｘＱ、５ｍｌのアリコート に室温において３時間かけて添加し、その間この溶液を０，５ＮのＮａＯＨでｐ Ｈ８，０に維持した。メタノール（０，５ｍ１）を無水物の各添加と同時に添加 して、それらの溶解性を増加した。最後に、この溶液を４℃において１６時間撹 拌し、４０℃において蒸留水に対して広範に透析し、そして凍結乾燥した。個々 のＮ−プロピオニル化およびＮ−ブタノイル×されたＧＢＭＰが９０％の越える 収率で得られた。各場合において、本質的に完全なＮ−アシル化がＮ−説アシル 化Ｇ　Ｂ　Ｍ　Ｐのそれぞれの’Ｈ−ＮＭＲスペクトルの中の消失により確証さ れた。

Ｎ−アシル化ＧＢ〜ＩＰの活性化 上のようにして得られたＮ−アシル化ＧＢＭＰを、暗所で室温において２時間領 　ＩＭの水性メタ過ヨウ素酸ナトリウム（１０ｍｌ）中で酸化した。次いて過剰 の過ヨウ素酸塩を１ｍｌのエチレングリコールの添加（ＧＢＭＰを除外する）は 、Ｎ−アシル化ＧＢＭＰの各々の末端の還元性シアル酸残基を転位して、鎖のポ リオール残基を開（。この型の残基は過ヨウ素酸塩に対して感受性であり（参照 、ジャーナル・サン・イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１２７．１ ０１１　（１９８１）および米国特許第４．３５６，１７０号、これらはハロル ドＪ、ジエニングス（Ｈａｒｏｌｄ　Ｊ、　Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）らによる）、こ れによりアルデヒド基はＮ−アシル化ＧＢＭＰの両端に導入される。

異なるＮ−アシル化ＧＢＭＰの大きさ決定溶離液としてＰＢＳを使用するウルト ロゲル（Ｕｌ　ｔ　ｒｏｇｅ　１）（商標）ＡｃＡ４４　（ビーズの直径６０− １４０μｍ）カラム（ＩＢＦバイオテクニークス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ）　、ミゾリー州すベッジ）のゲル濾過を使用して、所望の平均分子量の酸化さ れるＮ−アシル化ＧＢＭＰ物質を得た。ＦＬＰＣ（下を参照）により測定してＫ Ｄｏ、５〜に、０．７におけるカラムから溶離される分画を集め、透析し、そし て凍結乾燥した。３０，０００〜４０，０００ダルトンの範囲の平均分子量を有 する断片に相当するに、０．２〜０．４のこの範囲を、また、集め、そして接合 した。こうして、０．２〜０．７のＫｎ範囲で溶離するＮ−アシル化物質はとく に重要である。

多糖の接合体 酸化された断片（１００ｍｇ）を０．１モルの重炭酸ナトリウム（ｐＨ８，１） 緩衝液（２ｍｌ）中に溶解し、そして破傷風トキソイド（２０ｍｇ）をこの溶液 に添加した。最後に、シアノホウ水素化ナトリウム（４０ｍｇ）の添加後、この 溶液をおだやかに室温において撹拌し過カラムを使用するＦＰＬＣにより追跡し 、ＰＢＳｉｌ衝液ｐＨ新液２中で１ｍｌ／分でイソクラティックに展開し、タン パク質およびＮ−アシル化ＧＢＭＰの断片の両者を２１４ｎｍでモニターした。

断片はＫ。

Ｏ９６を有し、そして破傷風トキソイドはＫＤｏ、３９を有した。多くの場合に おいて、接合は２日間で完結したが、４日の合計の反応時間の間装置した。潜在 的に未反応のアルデヒド基を最後にホウ水素化ナトリウム（２０ｍｇ）で還元し た後、ゲル濾過した。

多糖破傷風トキソイドの接合体を、溶離液としてパイオーゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ ）Ａカラムを使用するゲル濾過により、多糖の断片から分離した。接合体を含有 する溶離液を蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥した。Ｎ−アシル化ＧＢＭ Ｐ破傷風トキソイド接合体は、スベンナーホーム（Ｓｖｅｎｎｅ　ｒｈｏ　１ｍ ）　、Ｌ、　、シアル酸の定量的推定、ＩＩ　比色レジゾルシノール−塩酸法（ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ｉａｌｉｃ　Ａｃ １ｄｓ、ＩＩ　Ａ　Ｃ。

１ｏｒｉｍｅｔｒｉｃ　Ｒｅ５ｏｒｃｉｎｏｌ−Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ　Ａ ｃ１ｄ　Ｍｅｔｈｏｄ）、バイオヒミカ・エト・バイオロジカル ０４　（１９５７）に記載されているレゾルシノールにより決定して、１２〜３ ０％、典型的には１２〜２０％のシアル酸を含有した。これが示すように、接合 体は、それぞれ、２〜３：１の多糖／破傷風トキソイドの比を有した。

長鎖アルキルエステルのアジュバントを粉砕し、そして篩がけし、そして適当な 量を秤量してバイアルに入れ、こうしてリン酸塩緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩、 ｐＨ＝７．４）の添加後の懸濁液の濃度を１〜２ｒｓｇの化合物／ｍ＋とした。

懸濁液をよく混合し、次いで同一緩衝液中の等しい体積の接合体を添加し、そし て全体を４℃において１６時間おだやかに農産した。複合化の終わりにおいて、 アジュバントに複合化した接合体の量を測定しようとするとき、懸濁液を遠心し 、そして上澄み液中の接合体（タンパク質担体）の濃度を、ロウリイ（Ｌｏｗｒ ｙ）ら、ジャーナル・サン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ ｈｅｍ、）、１９３．２６５−２７５　（１９５１）の方法により決定して、結 合しなかった接合体の量を得た。一般に、３０〜９０％の結合した接合体はすぐ れたアジュバント−多糖の接合体の複合体−を表す。結合したおよび結合しない 両者の接合体を免疫化の実験において使用した。

実施例４ この実施例は、いくつかの長鎖（１８個の炭素原子）エステルおよびメニンゴコ ッカル（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａ＋）の多糖−破傷風トキソイド接合体のワク チンのアジュバント性を証明する。

雌の白色ＣＦＩマウス（８〜１０週齢）を、第０．１４および２８日にほぼ１５ μｇの接合体／動物（はぼ３μｇの多糖）を腹腔内注射により免疫化した。マウ スを第３９日に心臓穿刺により採血した。合計の体積／注射は、対照マウスにつ いてのアジュバントの存在または不存在のドの担体に、前述したように、還元的 アミン化カップリング法により接合した。化学的に変性したメニンゴコッカル（ ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）Ｂ多糖を前述したように調製した。

血清中の抗体製炭を次のようにして酵素のイムノアッセイにより決定した；９６ ウエルのポリスチレンのプレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））を、リン酸 塩緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ＝７．４）中の適当な莢膜多糖−ウシ血清 アルブミン接合体で、１μｇ／ウェルの濃度で３７℃において１時間コーティン グした。次いでプレートを３７℃においてリン酸塩緩衝液中の０．１％のウシ血 清アルブミンで１時間ブロッキングした。ブロッキング後、プレートを空にし、 そして０．０５％のツイーン２０洗浄剤を含有するリン酸塩緩衝液（ＰＢＳＴ） で４回洗浄した。空のウェルに分析のための１または２以上の試料を添加し、そ してこれを室温において１時間インキュベージコンした。ＰＢＳＴで５回洗浄し た後、ペルオキシダーゼ淡褐色したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）接合体、ＰＢ ＳＴ中の１／２００、を各ウェルに添加し、そしてプレートを室温において０． ５時間インキュベーションした。さらにＰＢＳＴで５回洗浄した後、テトラメチ ルベンジジンを各ウェルに添加し、そしてプレートを室温において１０分間イン キュベーションした。酵素を触媒とする反応をＩＭのリン酸で停止し、次いで各 ウェルの４５０ｎｍにおける吸収をプレートリーダー（バイオチク（Ｂｉｏｔｅ ｋ））で読んだ。抗体の力価は１．０の吸収を与える試料の希釈の逆数である。

力価を対照（アジュバントなし）に関する比として表す。結果を表１に表す。

表１ 長鎖（Ｃ１８）エステルの存在下にメニンゴコッカル（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃ ａｌ）の接合体のワクチンに対する抗体の応答。力価はアジュバントの不存在下 の抗体の応答の比としてを与える（対照；緩衝化生理食塩水中の接合体のワクチ ン）。

対照（ＰＢＳ）　１．０　１．０　１．０オクタデシルチロシン ０．５　ｍｇ／ｍｌ　３．５　Ｌ、３　１．９１．０　ｍｇ／ｍｌ　３．７　１ ．９　３．２オクタデシルチロシングリシン ０、５ｍｇ／■１　３．０　１．８　１．９Ｎ、グリシルエタノールアミン０〜 ステアレート０．５■ｇ／ｍｌ　１．０　１．５　１．０オクタデシルリジン １．０　ｍｇ／ｍｌ　Ｎ、Ｄ、　１．３　１．８オクタデシルフオルフヱニシン １．０　ｍｇ／ｍｌ　Ｎ、Ｄ、　１．９　１．８Ｎ、　Ｄ、　＝決定せず 表１の結果が示すように、長鎖エステルはバクテリアの多糖−破傷風トキソイド 接合体についてアジュバント作用を示し、これは存在するエステルのタイプおよ びバクテリアの多糖のタイプに依存する。これはオクタデシルチロシンおよびＮ −グリシルエタノールアミンＯ−ステアレートのメニンゴコッカル（ｍｅｎ　ｉ ｎｇｏｃｏｃｃａ　Ｉ）ＡおよびＣ接合体の比較により理解することができる。

実施例５ この実施例は、アジュバントなしからアジュバント添加したメニンゴコッカル（ ｍｅｎ　ｉｎｇｏｃｏｃｃａ　１）の多糖−破傷風トキソイド接合体のワクチン へ行くとき起こるアイソタイプを証明する。

実施例４に記載するように、白色ＣＦＩマウスの免疫化を実施し、そして血清を 得た。９６ウエルのポリスチレンのプレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）） を、実施例４に記載するように、リン酸塩緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ＝ ７．４）中の適当なメニンゴコッカル（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）の多糖− ウシ血清アルブミン接合体でコーティングした。プレートを３７℃において１時 間ブロッキングし、次いで室温において０．５時間リン酸塩緩衝液中の２．５％ のスキムミルクでブロッキングした。

ＰＢＳＴで４回洗浄した後、アイソタイプの分析のために１または２以上の試料 を添加し、そしてこれを室温において１時間インキュベーションした。ＰＢＳＴ で洗浄後、ウサギ抗マウスのサブクラスの特異的プローブ（バイオ−ラド・ラボ ラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、７ウス・タイバ ー（Ｍｏｕｓｅ　Ｔｙｐｅｒ）サブした後、ペルオキシダーゼ標識したヤギ抗ウ サギ（ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）接合体、ＰＢＳＴ中の１／３０００、を添加し、そし てプレートを室温において０．　５時間インキュベーションした。さらにＰＢＳ Ｔで５回洗浄した後、テトラメチルベンジジンを各ウェルに添加し、そしてプレ ートを室温において６分間インキュベーションし、そして反応をＩＭのリン酸の 添加で停止した。各ウェルの４５０ｎｍにおける吸収をプレートリーダー（バイ オチク（Ｂｉｏｔｅｋ））で読んだ。抗体の力価は試料の希釈の逆数×吸収であ る。力価を対照（アジュバントなし）に関する比として表す。結果を表２に表す 。

表２ 抗メニンゴコッカル（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）ＡおよびＣの接合体の応答 。力価はアジュバントの不存在下の抗体の応答の比としてを与える（対照；緩衝 化生理食塩水中の接合体のワクチン）。

アジュバント　免疫グロブリン（メニンゴコッカルＡ）１匹　ｊ屡坤　相侶防　 腹り　Ｂ℃ 対照（ＰＢＳ）　１．０　１．０　１．０　１．０　１．０オクタデシルチロシ ン　２．６　５．７　４．３　４．４　３．４オクタデシルチロシルグリシン　 １．６　３．９　３．６　２．６　１．６免疫グロブリン（メニンゴコッカルＣ ）肱胡　ｊμ坤　■四　パリ　美 対照（ＰＢＳ）　１．０　１．０　１．０　１．０　１．０オクタデシルチロシ ン　２．１　５．２　２Ｊ　４．３　１．７オクタデシルチロシルグリシン　２ ．１　２．９　１．９　２．９　１．７表２の結果が示すように、長鎖エステル は事実アイソタイプの分布に好適な方法で影響を及ぼす。これは、オクタデシル チロシンアジュバントの存在下にＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の比（＝抗メニンゴコツ カル（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）のＡについて２．２：＝抗メニンゴコツカ ル（ｍｅｎｉｎｇｏｅｏｃｃａｌ）のＣについて２．５）を検査することによっ て理解することができる。

実施例に の実施例は、長鎖エステルのアジュバントの存在下の抗体の増加が陽性の生物学 的作用；生きている病原性バクテリアを使用する対抗に対する保護に翻訳される ことを証明する。

実施例４に記載するように、白色ＣＦＩマウスの免疫化を実施した。

マウスを、第４０日に、はぼ２，０００微生物の髄膜炎菌（Ｎ、ｍｅｎｉｎｇｉ ｔｉｄｉｓ）Ｂ；血清型２ｂ、菌株８０１６５の腹腔内注射により対抗した。５ 時間後、マウスから採血し、そして残留する生きているバクテリアを「コロニー 形成単位Ｊ　（ＣＦＵ／ｍｌ）として決定した。

Ｎ−プロピオニルおよびＮ−ブタノイルメニンゴコッカル（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏ ｃｃａ　ｌ）のＢ多糖を、前述したように、Ｎ−説アシル化多糖と適当な酸無水 物との反応により調製した。結果を表３に表す。

ソイド（ＴＴ）接合体およびオクタデシルチロシングリシルアジュバントを使用 するマウスの能動的保護。アジュバント濃度は０．７５ｍｇ／ｍ＋である。

免疫原　ＣＦ！Ｊ／ｍｌ　バクテリア血症のマウスの数１）アジュバント　３５ ８４　５１５ ２）ＮＰｒ多糖　２６６４　５１５ ３）ＮＰｒ多糖ＴＴ接合体　６４０　４１５表３の結果が示すように、アジュバ ントおよび多糖接合体ワクチンは最良の保護を与える。アジュバント単独は有効 ではない。

国際調査報告 嗜−一一一〜−−駄ＰＣＴ／ＣＡ　９１１００３２６国際調査報告 フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ 、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ、 　ＤＫ。

ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　Ｎｉ Ｃ，ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ、ＳＤ、ＳＥ、５ Ｕ （７２）発明者　ジエニングス、ハロルド・ジエイカナダ国ケイ１ジエイ　６ジ ー６・オンタリオ・グロスター・ウッドグレンクレツセント２０４９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バクテリアの多糖タンパク質接合体および有効量の式▲数式、化学式、表等 があります▼ 式中、 Ｃは水素、アミノ酸残基およびペプチド残基から成る群より選択され、Ｄは水素 および医薬として許容される酸から成る群より選択され、Ｅは４−ヒドロキシベ ンジル、ベンジル、４−ヒドロキシフェニル、フェニル、４−アミノブチル、イ ソプロピル、メチル、水素および天然に存在するアミノ酸の残基から成る群より 選択され、Ａは（ＣＨ２）■、酸素またはＣＨ２Ｏであり、そしてＢは（ＣＨ２ ）■または酸素であり、ここでｎは０〜４であり、ただしＡおよびＢは（ＣＨ２ ）■および酸素について同一ではなく、そしてＲは１２〜２０個の炭素原子を有 するアルキルである、の少なくとも１種のアジュバントを含んでなるワクチン組 成物。 ２、前記アジュバントがＬ−立体配置を有するアミノ酸からなる、請求の範囲１ 項に記載の組成物。 ３、前記アジュバントがＤ−立体配置を有するアミノ酸からなる、請求の範囲１ 項に記載の組成物。 ４、前記アジュバントがＤ−立体配置およびＬ−立体配置のアミノ酸の混合物か らなる、請求の範囲１項に記載の組成物。 ５、Ｅが４−ヒドロキシベンジル、ベンジル、４−ヒドロキシフェニル、フェニ ルおよび水素から成る群より選択される、請求の範囲１項に記載の組成物。 ６、Ｅが４−ヒドロキシベンジルである、請求の範囲５項に記載の組成物。 ７、Ｃが水素、アミノ酸および１０アミノ酸残基までを含むペプチド残基から成 る群より選択される、請求の範囲１項に記載の組成物。 ８、前記ペプチド残基がジペプチドおよびトリペプチドから選択される、請求の 範囲７項に記載の組成物。 ９、Ｃがアミノ酸であり、そしてチロシルグリシン、グリシルグリシン、グリシ ルチロシンおよびフェニルアラニルグリシンから成る群より選択される、請求の 範囲７項に記載の組成物。 １０、Ｃはジペプチドであり、そしてチロシルグリシングリシンおよびチロシル アラニルグリシンから選択される請求の範囲８項に記載の組成物。 １１、医薬として許容される酸が塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、酒石酸、乳 酸および酢酸から成る群より選択される、請求の範囲１項に記載の組成物。 １２、前記アジュバントはα−アミノ酸からなる、請求の範囲１項に記載の組成 物。 １３、前記バクテリアの多糖ポリペプチドを生物学的担体にカップリングさせる 、請求の範囲１項に記載の組成物。 １４、前記担体は破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、無細胞の百日該ワ クチン（ＬＰＦ）、交差反応性物質（ＣＲＭ）およびバクテリアのタンパク質担 体から成る群より選択される、請求の範囲１３項に記載の組成物。 １５、前記ＣＲＭがＣＲＭ１９７である、請求の範囲１４項に記載の組成物。 １６、前記バクテリアの多糖は莢膜の多糖、リポ多糖および莢膜下の表面多糖か ら選択される、請求の範囲１項に記載の組成物。 １７、前記莢膜の多糖はインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕ ｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、 肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレ プトコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔ ｉａｅ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈ ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ ｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）から成る群から単離されたものである、請求の範囲１６項 に記載の組成物。 １８、前記リポ多糖は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉ ｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎ ｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）および緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉ ｎｏｓａ）から成る群より単離される、請求の範囲１６項に記載の組成物。 １９、前記莢膜下の（表面）多糖は、群Ａ、ＢおよびＣブドウ球菌類（Ｓｔｒｅ ｐｔｏｃｏｃｃｉ）の普通の多糖の抗原および肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ ｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の普通の多糖の抗原から成る群より選択さ れる、請求の範囲１項に記載の組成物。 ２０、前記アジュバントは１４〜２０個の炭素原子を含有するアルキル化アルコ ールおよびアミノ酸のエステル、ジペプチドおよびトリペプチドである、請求の 範囲１項に記載の組成物。 ２１、前記アジュバントがオクタデシルチロシンである、請求の範囲２０項に記 載の組成物。 ２２、前記アジュバントがオクタデシルチロシルグリシンである、請求の範囲２ ０項に記載の組成物。 ２３、治療的に有効量の請求の範囲１項に記載のワクチン組成物を患者に投与す る工程を含んでなる、患者における免疫応答を誘発する方法。 ２４、前記組成物を筋肉内、皮内、皮下に投与するか、あるいは鼻の供給により 投与する、請求の範囲２３項に記載の方法。 ２５、前記ワクチン組成物の投与はＩｇＥ抗体のレベルを実質的に上昇させない で、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１の抗体の比を増加する、請求の範囲２３項に記載の方 法。 ２６、バクテリアの多糖タンパク質接合体および請求の範囲１項に記載のアジュ バントを免疫学的に有効なワクチン組成物を生成するために十分な量で配合する 工程を含んでなる、ワクチン組成物を形成する方法。