JPH0632630B2

JPH0632630B2 - 家畜，家禽の病原性細菌の産生する蛋白質抗原の製法

Info

Publication number: JPH0632630B2
Application number: JP61021245A
Authority: JP
Inventors: 輝武矢挽; 直深見; 厚浜野
Original assignee: ZENKOKU NOGYO KYODOKUMIAI RENGOKAI
Current assignee: ZENKOKU NOGYO KYODOKUMIAI RENGOKAI
Priority date: 1986-02-04
Filing date: 1986-02-04
Publication date: 1994-05-02
Anticipated expiration: 2009-05-02
Also published as: JPS62181797A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、感染症診断に用いられる家畜（禽）の病原性
細菌の産生する蛋白質抗原の製法に関する。

（従来の技術）最近の畜産業界の発展は目覚しく、特に生産性の向上を
目指し、多頭飼養による規模拡大には驚くべきものがあ
る。しかし、それにともなつて生産性の向上を阻害する
要因として慢性の疾病が畜産経営にとつて大きな脅威と
なつており、これの浄化が急務である。そのため、その
疾病（主に感染症）の診断が重要である。特に、その感
染症の診断を簡便で適確な診断法として、家畜（禽）の
病原性細菌の産生する蛋白質抗原を用いる診断法が好ま
しく採用されているが、この蛋白質抗原を大量に製造す
ることが要請されて居り、従来の製法として、液体培養
法を通じての下記の製法がある。即ち、先づ、液体培地
に病原性細菌を培養し、遠心分離あるいは過除菌によ
つて菌体と培地中に産生された蛋白質抗原を含む上清あ
るいは液とに分離し、その上清あるいは液を減圧濃
縮法ならびに限外過法（分画分子量の異なる幾つかの
限外過膜を用いる）を用いて、一定濃度に濃縮・精製
するか、また硫酸アンモニウム等の塩類を用い塩析によ
つて、その蛋白質抗原含有液を回収し使用する等の方法
がとられている。

又、別の製法として、次のようなものがある。即ち、液
体培地中に半透膜袋を懸垂し、その半透膜の袋中に菌液
（精製水、生理食塩液あるいは緩衝液に菌を懸濁）を入
れ、外液のある液体培地をマグネツト・スターラー等で
攪拌し乍ら培養し、培養後半透膜袋を取り出し、遠心分
離によつて菌体と菌液中に産生された蛋白質抗原を含む
上清とに分離し、その上清を半透膜チユーブに詰め、濃
縮剤で濃縮し、その抗原物質を回収する方法である。

（発明が解決しようとする問題点）上記従来の製法には夫々次のような欠点がある。即ち、
上記の限外過を行う場合、培養細菌によつて産生され
たムコ多糖などの粘稠性物質あるいは培地中の獣・魚肉
エキス、ペプトン、あるいは獣畜などの血液や血清成分
などの種々の高分子量の成分によつて限外過がスムー
ズに進行しないため多くの時間を要し、またこの操作を
２回以上繰り返し行うことなどから、濃縮・精製工程が
煩雑でしかも，必要とする蛋白質抗原物質が限外過膜
に吸着されたりするので、その抗原物質の回収も悪い。

又、上記の遠心分離による上清あるいは過除菌による
液について、硫酸アンモニウム等の塩類を用いた塩析
法によつて蛋白質抗原を回収する場合は、大量の塩類を
少量ずつ加えるため長時間を要し、塩析後遠心分離を行
い、その沈渣を少量の精製水で溶解し、半透膜チユーブ
に詰め、その塩類を透析によつて除去しなければならな
い。それには大量の精製水、および生理食塩液、あるい
は緩衝液を用いる必要があり、その分離、精製、回収工
程が煩雑で時間も多く要し、しかも回収後の抗原物質の
蛋白変性による失活もみられる。

又、上記の液体培地中に、半透膜袋を懸垂し、その半透
膜中に菌液を入れて培養する場合は、使用液体培地量あ
たりの蛋白質抗原物質の産生量が少なく、また、その回
収液には培地中に含まれる低分子量の色素等が混入し、
これら物質を除去するため、精製水、および生理食塩
液、あるいは緩衝液等で透析しても除去することが困難
で、精度の高い良質の抗原製品が得られない等の不都合
を伴なう。

（問題点を解決するための手段）本発明は、かゝる上記従来法の欠点を除去し、従来法に
比し著しく簡単な製造工程で、短時間に、高収率で且つ
高品質に蛋白質抗原を製造し得るようにした家畜（禽）
の病原性細菌の産生する蛋白質抗原の製法を提供するも
ので、半固形培地上に該培地中の栄養成分は通過させる
が、蛋白質抗原を通過させない半透膜を付着し、その半
透膜上に家畜（禽）の病原性細菌の培養菌液を塗布し、
本培養を行い、蛋白質抗原を該半透膜上に産生させた
後、その半透膜をその産生した蛋白質抗原と共に半固形
培地から剥離し、次で該半透膜を洗浄し、得られた洗浄
液から該抗原を菌体と分離して回収することを特徴とす
る（実施例）次に本発明の実施例を詳述する。

本発明によれば、半固形培地を使用する、その代表は、
一般に、寒天培地として知られているものである。病原
性細菌用の寒天培地は、ペプトン類、獣（魚）肉エキ
ス、酵母エキス、塩類、綿羊、馬、鶏、牛、豚、兎など
の血液、あるいは血清、ブトウ糖、デンプン等の糖類、
あるいはＬ−塩酸システイン、ヘミン等から適宜選択配
合し、これに１〜２％の割合の寒天を加え、加熱、溶解
し、主に高圧滅菌110℃〜121℃、10〜15分間）し、45〜
50℃に冷えてから滅菌ペトリ皿に15〜20ml注ぎ固めたも
のである。尚、血液又は血清を配合する場合は、これ以
外の成分組成のものを前記の高圧滅菌、冷却してから血
液又は血清を加えてよく攪拌、混合して寒天培地とす
る。次に、このように調製した所定組成の半固形培地上
に、半透膜を付着する。半透膜としては、家畜、家禽の
病原性細菌の産生する蛋白質抗原を通過させないものを
使用する。その蛋白質抗原の分子量は10,000〜200,00
0、更にサブユニツトとしてその多くの分子量は20,000
〜50,000であることから、分画分子量の範囲が3,500〜5
0,000のものを使用するのが一般的である。次に、その
半透膜上に、家畜（禽）の病原性細菌の培養菌液を塗布
する。その病原性細菌としては、たとえばアクチノマイ
セス（Actinomyces）属、ボルデテラ（Bordetella）
属、パスツレラ（Pasteurella）属、フソバクテリウム
（Fusobacterium）属、アクチノバチラス（Actinobacil
lus）属、ヘモフイルス（Haemophillus）属に属する細
菌が使用される。

かかる病原性細菌の具体例としては、たとえばストレプ
トコツカス・エクイシミレス（Streptococcus equisimi
lis）、ストレプトコツカス・ズイス（Streptococcus s
uis）、スタフィロコツカス・ハイカス（Staphylococcu
s hyicus subsp.hyicus）、スタフイロコツカス・アウ
レウス（Staphylococcus aureus）、アクチノマイセス
・ピオゲネス（Actinomyces pyogenes）、ボルデテラ・
ブロンヒセプテイカ（Bordetella bronchiseptica）、
ヘモフイルス・パラズイス（Haemophilus parasuis）、
アクチノパチラス・プロエロニユーモニア（Actinobaci
llus pleuropneumoniae）、パスツレラ・マルトシダ（P
asteurella multocida）、フソバクテリウム・ネクロフ
オラム（Fusobacterium necrophorum）等があり、それ
らの細菌が産生する蛋白質抗原ならびにその対象動物は
下記第１表に示される。

即ち、予め滅菌処理した半固形培地面に貼つた特定の分
画分子量の半透膜上に、目的とする特定の蛋白質抗原を
産生する病原性細菌を予め培養した新鮮培養菌液の一定
量を置き、その菌液を均一に塗布する。これを、その菌
種に応じて、好気、嫌気、炭酸ガス置換などの所望の培
養条件下で、25〜40℃の培養温度で１８時間〜１４日培
養する（本培養）。この培養において、半固形培地に含
まれる蛋白質などの高分子物質が半透膜を通過して、移
植した該菌と接触することがない反面、培地中の塩類、
ビタミン、ペプチド、アミノ酸、およびその他の低分子
物質の栄養成分は半透膜を通過して該菌に供給され、そ
れらの栄養素によつて菌は発育する。該菌は発育にとも
ないその菌に応じた種類の蛋白質抗原物質を産生する。
しかしその産生された抗原物質は高分子のため半透膜を
通過して、培地中に拡散することはなく、半透膜上には
菌体と該菌が産生した蛋白質抗原物質および低分子量の
培地成分が残る。

尚、培地中の色素の多くは、蛋白質等の高分子物質と結
合しているため、半透膜を通過することがない。微量の
遊離色素も、寒天によつて固定せられるので半透膜を通
過して抗原物質側に混入することが防止される。

この本培養後、培地面の半透膜を剥ぎ取り、緩衝液でこ
れに付着している抗原物質等の残留物を洗い落とし、そ
の洗浄液について遠心分離を行うことで菌体と蛋白質抗
原物質を含む上清とに分離する。遠心分離は3,000〜15,
000rpmで、１０〜６０分間の範囲で操作すれば、菌体は
遠心管底に菌塊として残るので、上清液のみ回収する。
回収された上清液中には蛋白質抗原物質と低分子量の培
地成分および緩衝液の塩類等が含まれる。この上清液を
半透膜チユーブに詰め、市販の第１工業薬品（株）製Ａ
Ｇガム、和光純薬（株）製ポリエチレングリコール＃60
00などの濃縮剤で濃縮し、培地成分の低分子培地成分を
除去し、かくして、蛋白質抗原の濃度の高い溶液を得る
ことができる。

さらに、濃縮された蛋白質抗原溶液を半透膜チユーブに
入れたまゝ精製水で透析を繰り返すことによつて塩類な
どの低分子量を除去し、より純度の高い蛋白質抗原物質
を得ることもできる。回収された濃縮液即ち抗原は、ボ
ツクスタイトレーシヨンによつて活性単位を決定し、一
定の単位抗原になるように希釈液（緩衝液）を加え、蛋
白質抗原が変性、失活しない方法で凍結乾燥し、診断用
蛋白質抗原を得る。これで得られた本発明による診断用
抗原は、冷暗所などで長期間安定に保存することができ
る。

尚、病原性細菌の菌株を分離し、純粋培養して本法の前
記本培養に用いる種菌又は元菌を作製する培養法は、従
来用いられる任意の培養法でよく、液体培養、半固形培
養などで、その培地組成は、前記の半固形培地のそれと
同じでよい。

又、所定の病原性細菌の菌株は、動物用生物学的製剤協
会、農林水産省家畜衛生試験場などから容易に入手で
き、又各感染症に羅患している家畜から分離、固定した
ものを使用すればよい。

次に更に本発明の具体的実施例につき説明する。

実施例アクチノマイセス・ピオゲネス菌株（農林水産省家畜衛
生試験場から分与を受けたものを用いるか、あるいはア
クチノマイセス・ピオゲネス感染豚から本菌を分離し、
それからプロテアーゼ産生能の高い菌株を選択して使用
してもよい）を、半固形倍地である血液寒天培地に接種
し、嫌気条件下で、３７℃、１〜２日培養し、寒天培地
上の集落を再度新しい血液寒天培地に移植し、３７℃で
１〜２日間嫌気的に培養し、種菌を得る。ここまでは従
来法と同様である。

この種菌を、下記表に示す組成の変法ＶＬ寒天培地又は
その表中の寒天を除いた組成の変法ＶＬ液体培地により
培養し元菌を作製する。

即ち、この種菌を該変法液体培地に接種し、嫌気条件下
で、３７℃、１〜２日培養後、無菌的に遠心（3,000〜
8,000rpm、１０〜３０分間）し、遠心上清を捨て、沈渣
菌体を滅菌リン酸緩衝食塩液（pH7.0〜7.2）（滅菌生理
食塩液、あるいは滅菌精製水でもよい）に懸濁し、元菌
を得る。或は、前記種菌を、さらに半固形培地にした該
変法ＶＬ寒天培地に塗布し、嫌気的に３７℃で１〜２日
間培養し、その菌苔を滅菌リン酸緩衝食塩液（pH7.0〜
7.2）（滅菌生理食塩液あるいは滅菌精製水でもよい）
に懸濁し、さらにこれを１〜２回繰り返し、菌体を洗浄
（遠心はいずれも3,000〜8,000rpm、１０〜３０分間で
ある）後、再び滅菌リン酸緩衝食塩液（pH7.0〜7.2）
（滅菌生理食塩液あるいは滅菌精製水でもよい）に懸濁
し、これを元菌とする。

次に、別個に、あらかじめ滅菌した半透膜（分画分子量
8,000〜10,000の透析膜チユーブから作る）を、無菌的
に貼り付けた半固形培地である変法ＶＬ寒天培地（前記
と同じ組成培地）の半透膜上に、例えば、液体培養によ
る元菌の懸濁させた培養菌液（湿菌量約10mg/ml）0.1ml
を均一に塗布後、嫌気的に３７℃で１〜２日間培養を行
う（本培養）。本培養後、培地面の半透膜を剥ぎ取り、
0.1Ｍトリス・塩酸緩衝液pH8.0で洗浄し、その洗浄液に
ついて遠心分離（8,000rpm、３０分間）を行つて、菌体
とプロテアーゼ抗原を含む上清とに分離する。菌体は遠
心管底に菌体塊として残るので、上清液のみ回収する。
回収された上清中にはプロテアーゼ抗原と低分子量の培
地成分および緩衝液成分等が含まれる。この上清液を半
透膜チユーブ（分画分子量8,000〜20,000）に詰め、冷
暗室（約４℃）で濃縮剤（ＡＧガムあるいはポリエチレ
ングリコール＃6,000等）で処理して濃縮し、純度の高
いプロテアーゼ抗原を得る。回収されたプロテアーゼ抗
原液はボツクス・タイトレーシヨンによつて活性単位を
決定した。（その抗原活性（寒天ゲル内沈降試験）は
１：32〜１：62であつた。又その液中には色素が認めら
れなかつた。）一定の単位抗原になるように0.1Ｍトリ
ス・塩酸緩衝液pH8.0を加え、プロテアーゼ抗原が変性
・失活しない真空凍結乾燥法で凍結乾燥し、診断用プロ
テアーゼ抗原を得た。

比較例１精製水３に溶解する各培地成分の量を2.7の精製水
に溶解した変法ＶＬ液体培地中に半透膜袋を懸垂し、そ
の半透膜袋中に前記実施例１で得た同じ元菌であるアク
チノマイセス・ピオゲネス（Actinomyces pyogenes）菌
の懸濁液300mlを入れ、炭酸ガス培養後、半透膜袋を取
り出し、遠心分離によつて菌体とアクチノマイセス・ピ
オゲネス菌が産生したプロテアーゼ（蛋白分解酵素）抗
原が含まれる上清とに分離し、その上清を回収し、濃縮
したところ１：32以上の抗原活性（寒天ゲル内沈降試
験）を示すプロテアーゼ抗原液が約５〜１５mlと少量し
か得られなかつた。しかも培地中に含まれる低分子量の
色素等が混入していた。これら物質の除去のため精製
水、および生理食塩液、緩衝液等で透析してもそれ等が
除去されなかつた。

比較例２実施例１によつて得たアクチノマイセス・ピオゲネスの
変法ＶＬ液体培養菌液の元菌を約17倍量の変法ＶＬ液体
培地に接種し、炭酸ガス培養し、遠心分離によつて菌体
と培地中に産生されたプロテアーゼ（蛋白分解酵素）抗
原を含む上清とに分離し、その上清を半透膜チユーブに
詰め、濃縮剤で約1/10に濃縮し、さらに緩衝液で塩析し
た後、その上清を分画分子量の異なる２種の限外過膜
（分画分子量：３０万および１万）を用いた限外過法
で、プロテアーゼ抗原を一定濃度に濃縮・精製した。そ
の製造日数が１１〜１５日間要した。

実施例１の本発明の製法で要する６〜７日と比較して２
倍以上の日数を要した。

比較試験例１実施例１によつて得られた本発明品と比較例２によつて
得られた従来品との蛋白質抗原標品（診断用プロテアー
ゼ抗原）について、その１バイアルを３２倍量の蒸溜水
で希釈し、その吸収波長を比較検討した。その結果を添
付図面に示す。この図はアクチノマイセス・ピオゲネス
感染症診断用プロテアーゼ抗原の紫外・可視吸収図を示
したもので、この図から、本発明品（破線）について
は、可視波長領域で全く吸収を示さず、無色透明の溶液
となるが、一方従来品（実線）ではかなりの吸収を示
し、着色された溶液であることがわかる。

比較試験例２実施例１に示す本発明の製法と比較例２に示す従来の製
法とによるプロテアーゼ抗原液の収量を比較した。

その結果を下記第２表に示す。

上記表から明らかなように、６回の試作で培地１当り
の最終的回収抗原溶液について、本発明法は約１８〜２
０mlであつたのに対して、従来法は約９〜１１mlで、本
発明法が約1.9倍も多い収量が得られた。また、蛋白質
の比較で、本発明法は16.668mg〜18.68mg、従来法は7.1
82mg〜8.745mgで、平均約2.2倍も本発明法が多かつた。

（発明の効果）このように本発明によるときは、半固形培地上に該培地
中の栄養成分は通過させるが、蛋白質抗原を通過させな
い半透膜を付着し、その半透膜上に、家畜、（禽）の病
原性細菌の培養菌液を塗布し、本培養を行うようにした
ので、半透膜上に、産生された蛋白質抗原は、培地中の
高分子物質、色素などの不純物との混合なしに得ること
ができると共に、その生産性が向上し得られる等の効果
を有する。また、本培養後は、該半透膜を半固形培地か
ら剥離し、その半透膜を洗浄し、得られた洗浄液から蛋
白質抗原を回収するので、従来法に比し産生蛋白質抗原
液の濃縮、精製が容易になし得られ、分離、回収、精製
作業が容易となり、また短時間に且つ高収率に而も高品
質の蛋白質抗原を製造することができる等の効果を有す
る。

【図面の簡単な説明】

図面は、本法並に従来法により得られた蛋白質抗原製品
の紫外可視吸収特性曲線を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:44） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】半固形培地上に該培地中の栄養成分は通過
させるが、蛋白質抗原を通過させない半透膜を付着し、
その半透膜上に家畜（禽）の病原性細菌の培養菌液を塗
布し、本培養を行い、蛋白質抗原を該半透膜上に産生さ
せた後、その半透膜をその産生した蛋白質抗原と共に半
固形培地から剥離し、次で該半透膜を洗浄し、得られた
洗浄液から該抗原を菌体と分離して回収することを特徴
とする蛋白質抗原の製法。
【請求項２】半透膜の文画分子量は、3,500〜50,000で
ある特許請求の範囲１に記載の製法。
【請求項３】病原性細菌は、アクチノマイセス属、ボル
デテラ属、パスツレラ属、スタフイロコツカス属、スト
レプトコツカス属、フソバクテリウム属、アクチノバチ
ラス属およびヘモフイルス属に属するものである特許請
求の範囲１に記載の製法。