JPH06294771A

JPH06294771A - 電気泳動媒体及びそれを用いる分析装置

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Publication number: JPH06294771A
Application number: JP5080926A
Authority: JP
Inventors: Hideki Kanbara; 秀記神原; Katsuhiko Murakami; 勝彦村上; Satoshi Takahashi; 智高橋; Takashi Anazawa; 隆穴沢; Keiichi Nagai; 啓一永井
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1993-04-07
Filing date: 1993-04-07
Publication date: 1994-10-21
Anticipated expiration: 2014-11-10
Also published as: JP2974537B2

Abstract

(57)【要約】【目的】キャピラリー方式の特長を保持し、取扱いが
容易で廉価なキャピラリーアレー電気泳動装置を提供す
る。【構成】２枚の高分子シート１，２間に多数の溝を有
するスペーサシート３を挟んだ構造を有する。スペーサ
シート３の溝にはゲルを充填してゲルキャピラリー６を
構成する。ゲルキャピラリー６の密度は検出部側８で大
きく、試料注入部側７で粗である。試料注入部側７は、
取扱いを容易にするため、切れ込みを入れて各キャピラ
リー５を分離している。【効果】高分子シートを用いることにより数多くのキ
ャピラリーを１枚のシート中に設けることができ、廉価
なゲルキャピラリーアレー板を供給できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白
などの分離検出装置に関し、特に新規なゲル電気泳動媒
体及びそれを用いる分析装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡ、ＲＮＡ等の分離分析技術は、遺
伝子解析や遺伝子診断を含むライフサイエンス分野の基
礎技術として重要である。特に最近では、ヒトゲノム解
析に関連して高速・高スループットでＤＮＡ等を分析で
きる装置の開発が望まれている。

【０００３】従来、ＤＮＡ塩基配列決定をはじめとする
これらの物質の分析にはゲル電気泳動装置が用いられて
きた。例えば蛍光検出を用いるＤＮＡシーケンサーで
は、２枚のガラス板（３０ｃｍ〜４０ｃｍ）の間に厚さ
０．２〜０．３ｍｍのポリアクリルアミド製ゲルを作製
し電気泳動分離媒体として用いていた。最近では、より
高速・高スループットの分析法を求めるニーズに答えて
ゲルキャピラリー電気泳動、特にキャピラリーを多数本
並べて同時に電気泳動させる方式が開発されている。こ
の方式は、内径０．０５〜０．１ｍｍ、外径０．２〜
０．３ｍｍの溶融石英製キャピラリーにゲルを詰めて使
用している〔アナリティカルケミストリー、第６２
巻、第９００頁（１９９０年）（ Analytical Chemistr
y ６２，９００（１９９０））〕。この方式は、平板型
ゲルに比べて発熱が小さいため大きな泳動電界をかける
ことができる利点があり、高速泳動に適している。実
際、従来４〜５時間かかっていた泳動分離を１時間以内
で行えるなど、注目される結果が得られているが、キャ
ピラリーが高価であることや、多くのサンプルを同時に
泳動させることができないなどの難点があった。特に後
者についてはキャピラリーを複数本並べたマルチキャピ
ラリー方式の検出装置の実現が望まれていた。

【０００４】また最近、Mathies らは、キャピラリーを
多数本並べたキャピラリーアレー電気泳動を報告してい
る〔アナリティカルケミストリー、第６４巻、第９６
７頁（１９９２年）（ Analytical Chemistry ６４，９
６７（１９９２））〕。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、このマルチキ
ャピラリー方式は高価なキャピラリーを多数本並べて使
用するものであり、しかもそれらは数回使用するとゲル
が劣化して使用できなくなるため、ランニングコストが
非常に高くつく難点があった。また、測定の度毎にキャ
ピラリーを位置合わせして並べたり、測定部の被覆を除
去しなければならないなど測定に要する手間も大きかっ
た。

【０００６】そこで、キャピラリー方式の持つ長所、す
なわち、１．高速・高スループット泳動が可能であること２．電界注入できるので試料注入が容易であることなどの長所を保持し、上述した難点を取り除いた手法の
開発が望まれていた。本発明は、このような要求に答え
る新規なゲル電気泳動媒体及びそれを用いた分析装置を
提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明では、高分子物質
でキャピラリーを構成するか、あるいは高分子シート中
に多数のキャピラリーを形成させてゲルを充填し、電気
泳動媒体として用いることによって前記目的を達成す
る。複数のキャピラリー泳動路は、少なくとも２枚のシ
ート状高分子フィルムの間に設けられた溝で構成するこ
とができ、一例としては２枚のシート状高分子フィルム
の間に挟まれたスペーサシートによって形成される。

【０００８】キャピラリーアレーシートの一端部におけ
る泳動路の配置密度は他端部における泳動路の配置密度
と異なっており、配置密度が粗である方の端部は各キャ
ピラリーが先端から所定長さだけ相互に分離されて試料
注入部となり、配置密度が密である端部は検出部に接続
される。本発明の電気泳動媒体は光学的検出装置と組み
合わせて分析装置を構成する。検出は、試料が電気泳動
媒体から溶出した後に行うのが好適である。

【０００９】

【作用】高分子物質によるキャピラリーは、高分子シー
ト中に型を用いた加圧成形やエッチングの技術をを用い
て、あるいは中空糸製造法などによって廉価に作製する
ことができる。試料注入側と検出側でキャピラリーの密
度分布を変化させて作製し、試料注入側ではキャピラリ
ー密度を粗にして相互に分割することにより、一本毎に
独立してキャピラリーに試料注入する操作を作業性よく
能率的に行うことができる。また、検出側は密に配置し
たので、検出部がコンパクトになるとともに高効率の検
出を行うことができる。分析装置では、有機物高分子物
質によって作製したキャピラリーから試料を溶出した状
態で検出を行うため、有機物高分子物質に起因する強い
蛍光を生じることがないので高感度の計測を行うことが
できる。

【００１０】

【実施例】本発明の実施例について以下に説明する。図
１は、本発明の一実施例によるゲルキャピラリーアレー
シート９の一部破断斜視図である。このゲルキャピラリ
ーアレーシート９は、厚さ約０．２ｍｍの２枚のＰＥＴ
（ポリエチレンテレフタレート）フィルムからなる保持
シート１，２の間に厚さ約０．１ｍｍのスペーサシート
３を挟んだ構造を有している。スペーサシート３には、
光エッチング加工等によって図示するような細溝６が形
成されている。スペーサシート３に設けられた溝６の幅
は０．１〜０．２ｍｍであり、溝のピッチはシート下部
で約０．５ｍｍ、シート上部で約２ｍｍである。溝６は
図の例では１０本設けられているが、特に本数に制限が
あるわけではない。各溝６は内部にゲルが充填されてい
て泳動路を形成しており、泳動路長は約３０ｃｍであ
る。

【００１１】ゲルキャピラリーアレーシート９の上部
は、先端から約５ｃｍの長さに渡って切れ目を入れるこ
とにより個々の泳動路５に分割されている。この溝が粗
に配置されて先端が分割されたた側７は試料注入部とな
り、密に配置された側８は測定時に検出部に接続され
る。このようにゲルキャピラリーアレーシート９の試料
注入部側７でキャピラリー６を粗に配置し、個々のキャ
ピラリー５を分割することにより、ゲルキャピラリーア
レーシートの取扱い及び各泳動路６の試料注入部４への
試料の注入操作を容易に行うことができる。また、検出
部側８のキャピラリー配置を密にすることにより、検出
装置がコンパクトになり分析の信頼性を高めることがで
きる。

【００１２】このゲルキャピラリーアレーシート９は、
次のようにして作製される。まず保持シートとなるＰＥ
Ｔフィルム１に、スペーサシート３となる感光性基を含
むアクリルシート等の感光性樹脂フィルムを接着剤によ
り接着する。それを細溝マスクパターンを用いて露光
し、露光部あるいは未露光部を溶解して泳動路となる溝
パターンを形成する。溝パターンは、シート９の一方の
側８から他方の側７に向かって末広がりの配置をとる。
スペーサシート３に泳動路となる溝パターンを形成した
後、その上に第２の保持シートであるＰＥＴフィルム２
を接着剤により接着する。次いで、所望の形状に切断し
溝が粗に配置された側７に先端から所定の長さまで切り
込みを入れ、各キャピラリー管５の先端部分を分離して
キャピラリーシートが作製される。

【００１３】次に、こうして作製されたキャピラリーシ
ートの一端をシリンジ中に押し込んで密封固定し、シリ
ンジ中に入れられた架橋剤を３重量％［３％Ｃ（ Cross
linking material concentration ）］含む５重量％
［５％Ｔ（ Total concentration ）］のポリアクリル
アミドゲル溶液（５％Ｔ，３％Ｃ）を細溝中に圧入して
ゲルキャピラリー６を形成する。保持シート１，２の材
質としては、ＰＥＴの他にもポリアクリル樹脂やポリイ
ミド樹脂などポリアクリルアミドゲルとなじみの良い高
分子を使用することができる。スペーサシート３は整形
した高分子シートを使用せず、液状のものを一定の厚さ
に塗布してシートを得てもよい。

【００１４】なお、本実施例では３枚の高分子シートを
重ね、その中間のスペーサシートをエッチング加工して
キャピラリーアレーシートを作製したが、整形された２
枚のシートを重ねてキャピラリーアレーを形成してもよ
い。すなわち、一方の保持シート１に金型を用いた加圧
成形又はエッチングによって細溝を形成し、その上に他
方の保持シート２を接着することによってキャピラリー
アレーシートを作成してもよい。

【００１５】図１のキャピラリーアレーシート９は、１
日放置してゲル形成後、図２の装置に装着して使用す
る。シート下端部あるいは上端部のゲル形成が乱れてい
るときにはシート端の一部を切断除去し、ゲル端面をき
れいな状態にして使用する。ゲルの末端部を常にきれい
な状態とするためには、第３図に示すように、キャピラ
リーアレーシート９の端部をガイドカバー１８で覆い、
シートの他端部から前述のようにシリンジを用いてゲル
をガイドカバー１８の間にまで充填し、ガイドカバー１
８間に補助部ゲル１９を作成する。そして、使用時にガ
イドカバー１８をはずして鋭利な刃物で図３に破線部２
０で示した位置で補助部ゲル１９を切断除去するように
するのが有利である。

【００１６】ゲルキャピラリーアレーシート９は、下部
８をホルダーガイド２１で挟んでフローセル１１内にセ
ットされる。ホルダーガイド２１は、キャピラリーアレ
ーシート９に接する側面に上下方向に連通する複数の流
体流通路が設けられている。セル１１内にはバッファー
液（１×ＴＢＥ；９０ｍＭ Tris borate、ｐＨ８．３、
０．２ｍＭＥＤＴＡ）が満たされており、このバッフ
ァー液は前記ホルダーガイド２１に設けられた流路を通
って上から下へキャピラリーアレーのまわりを流れ、セ
ル１１の検出部１２を通った後、シースフロー液流出路
１０を通って下部バッファー液１４に流入する。

【００１７】キャピラリーへの試料注入は、図示しない
試料溜にキャピラリーアレーシート９上部の分離したキ
ャピラリー５を１本づつ挿入し電界を短時間印加するこ
とによって、試料注入部４から各キャピラリーへ電界注
入される。試料が注入されたキャピラリー５の端部は共
通のバッファー液漕１３に浸され、上下のバッファー液
槽１３，１４に挿入した電極（図示せず）に泳動電圧を
印加することにより、試料の電気泳動分離が行われる。

【００１８】ゲルキャピラリー部で分離された試料はキ
ャピラリー端部から流出してフローセル内を下部に向か
って泳動するが、その途中の検出部１２で紙面垂直方向
から入射された図示しないレーザ光線によって照射され
る。そして、試料から発せられた蛍光は、キャピラリー
アレーシート９の表面に向けて配置されたフィルター１
５を通して高感度ＣＣＤカメラ１６によって同時に検出
される。ＣＣＤカメラ１６からの検出信号はデータ処理
装置１７に送られて必要な演算処理が施される。有機物
キャピラリーアレーの無い泳動路上を励起光照射して蛍
光検出を行うので、キャピラリーアレーから発せられる
蛍光が検出を妨害することがない。

【００１９】シースフロー液流出路１０は必ずしも各キ
ャピラリー毎に分離して設ける必要はないが、各キャピ
ラリーに対応させた中空のキャピラリーアレーとし泳動
路を中心に多数のシースフローを形成させるようにする
と、隣接するキャピラリーの溶出物が検出部１２で混合
するのを確実に回避することができて有利である。もち
ろんキャピラリーアレーシート９の下端部を蛍光の少な
い石英製のキャピラリーアレーに接続してセル１１を省
略することもできる。

【００２０】また、キャピラリーの試料注入部は泳動電
圧の印加で発熱してゲル破壊がおこり易く、そのため繰
り返し使用することが難しい。試料注入側７を短いキャ
ピラリーに接続して使用すると、ゲルが変質した接続キ
ャピラリーを交換するだけでゲルシートを多数回使用で
きる利点がある。検出の方式の１例として、図２には、
一列に並んだ泳動路を側面から同時に光照射し、線状蛍
光像をＣＣＤカメラで撮像するシステムを示した。図２
は１種類の蛍光体からの蛍光像を検出する例であるが、
プリズム等を用いて複数の蛍光体を波長分離して計測す
ることも可能である。また、光源と検出器を固定した移
動台をキャピラリーアレーシートに沿って移動走査する
ことにより、各試料からの蛍光を順次検出するようにし
てもよい。

【００２１】さらに、前記実施例は複数のキャピラリー
を高分子シートによって形成したが、現在種々の分野で
使用されている中空糸の製造技術によって有機物ポリマ
ーの中空管すなわちキャピラリーを作り、そのキャピラ
リーを多数本束ねて用いることもできる。その場合、束
ねたキャピラリーの一端を一直線上に配列すると、蛍光
検出法等で測定する際、好都合である。高分子ポリマー
としてはＰＥＴ、ポリアクリル樹脂、ポリイミド樹脂な
どを使用することができる。キャピラリー中へのゲルの
注入は、前記実施例と同様にシリンジを用いる圧入法で
行うことができる。

【００２２】

【発明の効果】以上述べたように、本発明によれば、柔
軟で扱いやすくキャピラリーの持つ長所を備える廉価な
キャピラリーアレーを得ることができる。また、キャピ
ラリーの厚さや幅は高精度に制御できるので泳動路間の
泳動速度差を小さくすることができる利点がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例によるゲルキャピラリーアレー
シートの概念図。

【図２】図１のゲルキャピラリーアレーシートを用いた
電気泳動分析装置の概念図。

【図３】補助部ゲル付キャピラリーアレーシートの説明
図。

【符号の説明】

１，２…有機高分子保持シート、３…スペーサーシー
ト、４…ゲルキャピラリー試料注入部、５…分離したキ
ャピラリー管、６…ゲルキャピラリー、７…分離キャピ
ラリー部、８…計測部パックトキャピラリー管部、９…
ゲルキャピラリーアレーシート、１０…シースフロー液
流出用キャピラリー、１１…フローセル、１２…検出
部、１３…上部バッファー液、１４…下部バッファー
液、１５…フィルター、１６…高感度ＣＣＤカメラ、１
７…データ処理装置、１８…ガイドカバー、１９…補助
部ゲル、２０…切断部位、２１…ホルダーガイド

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者穴沢隆東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内 (72)発明者永井啓一東京都国分寺市東恋ケ窪一丁目280番地株式会社日立製作所中央研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】高分子物質によって作製され内部に複数
のキャピラリー泳動路を有することを特徴とする電気泳
動媒体。
【請求項２】前記キャピラリー泳動路が少なくとも２
枚のシート状高分子フィルムの間に設けられた溝で構成
されていることを特徴とする請求項１記載の電気泳動媒
体。
【請求項３】前記キャピラリー泳動路が２枚のシート
状高分子フィルムの間に挟まれたスペーサシートによっ
て形成されていることを特徴とする請求項２記載の電気
泳動媒体。
【請求項４】一端部におけるキャピラリー泳動路の配
置密度が他端部におけるキャピラリー泳動路の配置密度
と異なっていることを特徴とする請求項２又は３記載の
電気泳動媒体。
【請求項５】一端部においてシート状高分子フィルム
に切れ目を入れることによって各キャピラリーが先端か
ら所定長さだけ相互に分離されていることを特徴とする
請求項２、３又は４記載の電気泳動媒体。
【請求項６】配置密度が粗である方の端部においてシ
ート状高分子フィルムに切れ目を入れることによって各
キャピラリーが先端から所定長さだけ相互に分離されて
いることを特徴とする請求項４記載の電気泳動媒体。
【請求項７】前記キャピラリー泳動路の配置密度が粗
である側の端部が試料注入側であることを特徴とする請
求項４又は６記載の電気泳動媒体。
【請求項８】前記分離された側のキャピラリー泳動路
端部に試料注入部を有することを特徴とする請求項５記
載の電気泳動媒体。
【請求項９】泳動路が複数本の高分子細管からなり、
該複数の高分子細管の少なくとも片方の末端が直線状に
束ねられていることを特徴とする電気泳動媒体。
【請求項１０】前記泳動路にゲルが充填されているこ
とを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項記載の電気
泳動媒体。
【請求項１１】請求項１〜１０のいずれか１項記載の
電気泳動媒体及び光学的検出手段を含む分析装置。
【請求項１２】前記光学的検出手段は前記電気泳動媒
体に接続されたセル、光源及び光検出器を含むことを特
徴とする請求項１１記載の分析装置。
【請求項１３】試料の検出は、電気泳動媒体から溶出
した試料に励起光を照射し、蛍光を検出することによっ
て行われることを特徴とする請求項１２記載の分析装
置。
【請求項１４】前記光検出器は撮像装置であることを
特徴とする請求項１１、１２又は１３記載の分析装置。