JP3559648B2 - キャピラリーアレー電気泳動装置 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は蛋白、核酸、糖等の生体関連物質の分析装置に関し、特にＤＮＡ、ＲＮＡの塩基配列決定、又は制限酵素の多型性の計測を行なうキャピラリーアレー電気泳動装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ゲノム計画等の進展と共にＤＮＡを始めとする生体関連物質の分析が重要となってきている。これら生体関連物質の分析にはゲル電気泳動が用いられている。２枚のガラス板の間に平板状のゲルを作り電界を与えゲルの中でＤＮＡ等を泳動させてサイズにより分離する。最近、泳動中の、蛍光体で標識したＤＮＡ等の試料を実時間で計測する装置、ＤＮＡシーケンサー等が市販され広く使用されている。一方、より簡便で、高速、高スループットを実現できる装置として、内径０．０２ｍｍ〜０．１ｍｍ程度の石英製毛細管に分離媒体を入れ多数本並べたものを平板ゲルに代えて用いるキャピラリーアレー電気泳動装置が発展してきている（Ｎａｔｕｒｅ ３６１（１９９３）５６５−５６６）。
【０００３】
蛍光検出装置では光源（レーザーを用いる事が多い）からの光が、泳動する試料を照射する方向と、試料を標識する蛍光体から発する蛍光を受光する方向とのなす角が、直角の方が散乱光等の背景光の原因となる光を小さくできるので都合が良い。キャピラリーアレーではキャピラリーを多数並べて、キャピラリーの中を泳動するＤＮＡ等を計測するが、検出器は個々のキャピラリーからの光を検出できるように、キャピラリーが並んだ平面に向かい合う型で設置されている。
【０００４】
試料を標識する蛍光体から蛍光を励起するための励起光を照射する方法としては、（１）キャピラリーアレー上を各キャピラリー毎にスキャンして、各キャピラリー毎を泳動するＤＮＡを照射したり（文献：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４、（１９９２）９６７−９７２）、
（２）個々のキャピラリー内からバッファー液中にＤＮＡを抜き出し泳動路と直角方向から泳動路が並んだ平面に沿って平行に光を照射して、バッファー液中を泳動するＤＮＡを照射する、代表的な方法がある。複数キャピラリーを並べて複数キャピラリーを直接同時に励起光を照射しないのは、最初の数本のキャピラリーで光が散乱されたり、屈折されたりして全てのキャピラリーを照射できないからである（文献：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６、（１９９４）１０２１−１０２６）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来提案されている上記（１）の方法では、１個の泳動路当たりの光照射時間が短く十分な受光量が得られにくく、また検出器も同時にスキャンする等の場合には故障しやすい問題がある。一方、上記（２）の方式では、バッファー液中で分離した成分が拡散して混合しない様に、バッファー液をフローさせるシースフロー式が提案されているが、キャピラリーからシースフロー中にＤＮＡ断片を溶出させると希釈され、試料を計測する計測部におけるＤＮＡ断片の濃度が低下するので感度低下を招きやすい問題があった。
【０００６】
また、シースフローセルと専用のキャピラリーアレーホルダーを用意する必要がある上、最近注目されているポリマーゲルを用いた詰め替え可能なキャピラリーゲル装置には不向きである問題があった。これは詰め替えゲルがキャピラリー端からシース液中に流れ出たり、詰め替え操作をシースフローセルを介して行なう必要があり、装置が複雑になるためである。
【０００７】
本発明の目的は、上記従来技術の問題を解決するために、オンカラム蛍光計測を行ないながら、複数のキャピラリーを機械的に走査することなく、又は光学的に光ビームを走査することなく、複数のキャピラリーを実質的に同時に照射して、複数のキャピラリーの各々を泳動する蛍光標識された試料から発する蛍光を実質的に同時に計測できるキャピラリーアレー電気泳動装置を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を達成するため、本発明では、試料が泳動するキャピラリーの泳動末端近傍のキャピラリーの保護皮膜を除去した部分に、キャピラリーを通してレーザーを照射し蛍光を計測する方式として、キャピラリーとレンズを交互に平面状に多数配列するか、又はキャピラリーとレンズを指定の順序で混合して平面状に多数配列して、キャピラリーアレーが形成する平面に沿って複数のキャピラリー、及びレンズを実質的に同時に貫通するようにレーザーを入射し、全てを同時に照射する。また、レーザーの照射により試料を標識する蛍光体から発する蛍光を検出する上記保護皮膜を除去したレーザー光照射部の周囲を、水等のガラスの屈折率に近い（空気より）物質で満たし、レーザー光照射部をレーザーで照射する。
【０００９】
多くのキャピラリーを１つのレーザーで直列に照射した場合、照射レーザー光はキャピラリーを通過するにつれ減衰する。これは（１）界面におけるレーザー光の反射、及び（２）キャピラリーのレンズ作用により光が発散し、キャピラリー外部に光が逃げる、の２つの原因による。
【００１０】
キャピラリーは凸レンズと類似の働きをし、キャピラリー内部のゲルは凹レンズと同じ働きをしてレーザーが発散してしまう。しかし、キャピラリーの配列の間にレンズを配置してレーザー光の発散を抑えることにより、多数本のキャピラリーの中心軸の近傍からレーザーをそらすことなく全てのキャピラリーを実質的に同時に照射できる。さらに、キャピラリー、及びレンズを水等の溶液中に浸漬する事より、界面での反射を気相中に置くよりはるかに小さくでき、実質上無視できる。
【００１１】
より詳細に本発明を説明すると、本発明のキャピラリー電気泳動装置は、蛍光標識が付加された試料が泳動する泳動媒体が充填される複数のキャピラリーと、上記蛍光標識を励起する励起光を得る光源と、上記蛍光標識から発する蛍光を検出する光検出器と、上記励起光が照射される上記複数のキャピラリーの間に配置される光集束手段とを具備し、上記励起光が照射される上記複数のキャピラリーと上記光集束手段の部分は平面状に配列され、上記励起光は上記複数のキャピラリーと上記光集束手段とを貫通して照射することに特徴がある。
【００１２】
上記キャピラリー電気泳動装置において、上記励起光の照射される部分において、上記キャピラリーと上記光集束手段とが交互に配置されること、上記光集束手段が円柱状レンズからなり、上記円柱状レンズの軸が上記キャピラリーとほぼ平行に配置されること、
上記光集束手段は液体または固体で内部が満たされたキャピラリーであること、上記光集束手段は上記励起光の照射軸上に配列される球面レンズ又は球形レンズであること、
上記励起光が照射される上記複数のキャピラリーと上記光集束手段の部分が、液体中に配置されること、この液体が水であること、
上記複数のキャピラリーと上記光集束手段の少なくとも上記励起光が照射される部分の外面に反射防止膜が形成されること等にも特徴がある。
【００１３】
さらに、本発明のキャピラリー電気泳動装置は、屈折率が１．４０以上のポリマーからなり、蛍光標識が付加された試料が泳動する泳動媒体が充填される複数の石英キャピラリーと、上記蛍光標識を励起する励起光を得る光源と、上記蛍光標識から発する蛍光を検出する光検出器と、上記励起光が照射される上記複数のキャピラリーの部分は平面状に配列され水中に配置され、上記励起光は上記複数のキャピラリーを貫通して照射すること、
屈折率が１．４０以上のポリマーからなり、蛍光標識が付加された試料が泳動する泳動媒体が充填される複数の石英キャピラリーと、上記蛍光標識を励起する励起光を得る光源と、上記蛍光標識から発する蛍光を検出する光検出器と、上記複数のキャピラリーの間に配置される光集束手段とを具備し、上記励起光が照射される上記複数のキャピラリーと上記光集束手段の部分が平面状に配列され水中に配置され、上記励起光は上記複数のキャピラリーと上記光集束手段とを貫通して照射すること、
屈折率が１．４０以上のポリマーからなり、蛍光標識が付加された試料が泳動する泳動媒体が充填される複数の石英キャピラリーと、上記蛍光標識を励起する励起光を得る光源と、上記蛍光標識から発する蛍光を検出する光検出器と、６本以下の上記キャピラリー毎に周期的に配置される光集束手段とを具備し、上記励起光が照射される上記複数のキャピラリーと上記光集束手段の部分が平面状に配列され水中に配置され、上記励起光は上記複数のキャピラリーと上記光集束手段とを貫通して照射すること、
屈折率が１．３８以上のポリマーからなり、蛍光標識が付加された試料が泳動する泳動媒体が充填される複数の石英キャピラリーと、上記蛍光標識を励起する励起光を得る光源と、上記蛍光標識から発する蛍光を検出する光検出器と、５本以下の上記キャピラリー毎に周期的に配置される光集束手段とを具備し、上記励起光が照射される上記複数のキャピラリーと上記光集束手段の部分が平面状に配列され水中に配置され、上記励起光は上記複数のキャピラリーと上記光集束手段とを貫通して照射すること、
屈折率が１．３６から１．４１の範囲にあるポリマーからなり、蛍光標識が付加された試料が泳動する泳動媒体が充填される複数の石英キャピラリーと、上記蛍光標識を励起する励起光を得る光源と、上記蛍光標識から発する蛍光を検出する光検出器と、上記キャピラリーと交互に配置される光集束手段とを具備し、上記励起光が照射される上記複数のキャピラリーと上記光集束手段の部分が平面状に配列され水中に配置され、上記励起光は上記複数のキャピラリーと上記光集束手段とを貫通して照射することに特徴があり、
これらの特徴を有する上記キャピラリー電気泳動装置において、上記光集束手段が円柱状レンズからなり、上記円柱状レンズの軸が上記キャピラリーとほぼ平行に配置されること、上記光集束手段は上記励起光の照射軸上に配列される球面レンズ又は球形レンズであることに特徴がある。
【００１４】
また、本発明のキャピラリー電気泳動装置は、蛍光標識が付加された試料が泳動する泳動媒体が充填される複数のキャピラリーからなる複数のキャピラリーアレーと、上記蛍光標識を、上記複数のキャピラリーアレーの各々の上記複数のキャピラリーの平面状に配置される泳動末端の外部で励起する励起光を得る光源と、上記蛍光標識から発する蛍光を検出する光検出器と、上記複数のキャピラリーアレーの各々が延長された空間の、上記励起光が照射される光軸上に配置される凸レンズとを具備し、上記励起光は、上記泳動末端の外部を照射することに特徴があり、上記励起光は、上記泳動末端の近傍に形成されるシースフローを照射することにも特徴がある。
【００１５】
また、本発明のキャピラリー電気泳動装置は、蛍光標識が付加された試料が泳動する泳動媒体が充填される複数のキャピラリーと、上記複数のキャピラリーの末端で上記複数のキャピラリーの間に配置される光集束手段とからなる複数のキャピラリーアレーと、上記蛍光標識を、上記複数のキャピラリーアレーの各々の末端で励起する励起光を得る光源と、上記蛍光標識から発する蛍光を検出する光検出器とを具備し、上記励起光が照射される上記複数のキャピラリーアレーの各々の末端は平面状に配列され積層され、上記励起光は積層された各層毎に上記複数のキャピラリーと上記光集束手段とを貫通して照射することに特徴があり、上記光集束手段が円柱状レンズからなり、上記円柱状レンズの軸が上記キャピラリーとほぼ平行に配置されること、上記光集束手段は上記励起光の照射軸上に配列される球面レンズ又は球形レンズであることにも特徴がある。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を図を用いて詳細に説明する。
【００１７】
（第１の実施例）
図１は、本発明のキャピラリーアレーの一例を示すレーザー照射部（もちろん、キャピラリーの保護皮膜は除去されている）の断面図である。図１に示すように、ゲル２０が内部に充填されたキャピラリー１の１０本が平面状に配列されたキャピラリーアレーに対して、平面に平行な方向からレーザー光２が１０本のキャピラリーを実質的に同時に貫通するように照射される。なお、ここでは、空気、キャピラリー材質、ゲル、水の各々の屈折率を、１．００、１．４６、１．３６、１．３３とする。
【００１８】
キャピラリーアレーのレーザー照射部を空気中に配置し、レーザー光を照射する場合、空気とガラス界面における反射は約４％であり、キャピラリー１本当たり８〜９％の照射光が反射されることになる（キャピラリーの外面、内面での反射を含む）。一方、レーザー照射部を水中に配置し、レーザー光を照射する場合では、界面当たりの反射は１桁小さく、合計４界面ある１本のキャピラリーの通過当たり〜１．５％程度の照射光の減衰が生じる。空気中でキャピラリーを１０本配置してレーザー光を照射すると、１０本目のキャピラリーは１本目のキャピラリーの約３５％（１本のキャピラリー当たりの照射光の減衰を１０％とすると、０．９^１０＝０．３５となる）の強度のレーザー光で照射されることになる。
【００１９】
一方、水中でキャピラリーをレーザー光で照射し、レーザー光がキャピラリーによる屈折等で発散しないとすると、１０本目のキャピラリーは１本目のキャピラリーの約８６％（１本のキャピラリー当たりの照射光の減衰を１．５％とすると、０．９８５^１０＝０．８６となる）の強度のレーザー光で照射されることになる。約７０本のキャピラリーを平面状に配置して、７０本目のキャピラリーがレーザー光で照射される強度は１本目の約３５％（１本のキャピラリー当たりの照射光の減衰を１．５％とすると、０．９８５^７０＝０．３５となる）であり、水中の方がはるかに反射による光の損失が少ないことがわかる。しかし、水中ではキャピラリーにより光は発散する。
【００２０】
図２は、外径０．２ｍｍ、内径０．１ｍｍのキャピラリーにゲルを充填したキャピラリーアレー（１０本）を水中に配置した場合に、キャピラリーを通過するレーザー光の光路をシミュレーションにより示す。図２は、図１と同様に、ゲル２０が内部に充填されたキャピラリー１の１０本が平面状に配列されたキャピラリーアレーに対して、平面に平行な方向からレーザー光２が１０本のキャピラリーを実質的に同時に貫通するように照射されたときの、レーザー光の進行する光路３を示している。図２から明らかなように、ゲル２０の中心部分をレーザー光が通過しない場合が多く、十分な強度のレーザー光がゲルの中心部分に照射できないことが分かる。この理由は、キャピラリーの内部のゲルの屈折率が約１．３６でありガラスの屈折率１．４６に比べて小さく、ゲルが凹レンズとして作用するためである。もちろん、キャピラリー１の外壁部は凸レンズとして作用するが、周りが水（屈折率１．３３）であるため、空気中ほど大きくレーザー光を集光せずにゲルを含むキャピラリーは全体として凹レンズとして作用する。
【００２１】
次に、十分な強度のレーザー光がキャピラリーアレーのゲルの中心部分に照射する構成について以下説明する。本実施例では、ロッドレンズとしてガラス円柱棒（材質はキャピラリーの材質と同じく石英とし、外径は石英キャピラリーの外径と同じく０．２ｍｍである）を使用して、キャピラリーの配列の間に配列して、レーザー光を集光させる。
【００２２】
図３は、外径０．２ｍｍ、内径０．１ｍｍのキャピラリーの内部にゲルを満たした石英キャピラリーを１０本分析管として使用し、各キャピラリーの間に石英製（屈折率１．４６）の外径０．２ｍｍの棒を配列し水中に配置した場合の、レーザー光の光路のシミュレーション結果を示す。即ち、キャピラリー１とガラス棒４の各々１０本ずつが交互に水中に配置される。図３の結果から明らかなように、キャピラリーアレーに入射するレーザー光２のほぼ全てがゲル２０中を通過することがわかる。この場合、ガラス棒の径をキャピラリーと同じ径にしたが、なお太くしても良い。しかし、ロッドレンズの中心部とゲルの中心部とを同軸に合わせて並べる必要があり同じ太さが都合が良い。
【００２３】
また、石英ガラス棒の代わりにガラスと屈折率の近い液体を満たした石英キャピラリーを配置しても同様の効果がある。例えば、キャピラリー内部をホルムアシド（屈折率１．４５）で満たすと良い。ガラス棒の場合、レーザー光が通過する界面は入射側と出射側の２ヶ所であり、キャピラリーの場合の界面の数の半分である。即ち、界面での反射による光損失を考える時、ガラス棒２本でキャピラリ１本に相当する損失となる。例えば、約４８本の石英キャピラリーと、各石英キャピラリーの間に石英キャピラリーと同じ外径の石英ガラス棒とを水中で配置（合計４７本）したキャピラリーアレーにレーザー光を照射する場合、４８本目の石英キャピラリーへのレーザー光の照射光量は、１本目の石英キャピラリーへのレーザー光の照射光量の約３４％（１本のキャピラリー当たりの照射光の減衰を１．５％とし、レーザー光が、４８＋（４７／２）→７２本相当の石英キャピラリーを通過するとして、０．９８５^７２＝０．３４となる）であり、空気中でのレーザー光照射の場合の１０本目の石英キャピラリーへのレーザー光の照射光量にほぼ等しくなる。
【００２４】
即ち、水中にキャピラリーアレーを配置し、石英ガラス棒（ロッドレンズ）を石英キャピラリーの間に配置する構成をとることにより、空気中に１０本のキャピラリーを配列する場合に比較して、約５倍の数のキャピラリーをレーザー照射できることがわかる。断面が円の棒状レンズ（ロッドレンズ）の代わりに、凸レンズ、球状レンズ、棒状の凸レンズ等を使用しても同様の効果が得られることは言うまでもない。
【００２５】
さらに、後で図６において詳細に説明するように、屈折率を適切に選んだ泳動媒体（ポリマー）を使用する場合には、ロッドレンズを使用することなく複数本の石英キャピラリーへのレーザー光の照射光量を、試料を標識する蛍光体を励起して蛍光を検出するに十分な光量とすることができる。例えば、屈折率が１．４０以上のポリマーを使用すればロッドレンズを使用する必要はなく、図２に示すレーザー光の光路の広がりよりも狭い、図３に示すレーザー光の光路のようになり、ポリマーをほぼ完全にレーザー光で照射できる。
【００２６】
図４は、本実施例のキャピラリーアレーを使用したキャピラリーアレー蛍光計測装置（ＤＮＡシーケンサー）の概略構成を示す図である。図４に示すキャピラリーアレーは、キャピラリー、及びガラス棒は蛍光セル内に固定され、レーザーが照射される。図３と同様に、外径０．２ｍｍ、内径０．１ｍｍの石英キャピラリー１、外径０．２ｍｍの石英ガラス棒（ロッドレンズ）４の各々１０本を、それぞれ交換に並べて配置した。石英キャピラリー１、及び石英ガラス棒４は光学セル５中でそのレーザー光照射部（キャピラリーの保護被服が除去された部分であり、レーザー光２がキャピラリーアレーのなす平面に沿って平行に石英キャピラリー１、及び石英ガラス棒４を貫通するように照射され、レーザー照射部分を通過する試料を標識する蛍光体からの蛍光を検出する）が、透明ガラス板にサンドイッチされる型で水中に保持される。各キャピラリーの両端はバッファー液中につけられ電界が印加される（但し、図４ではキャピラリーのレーザー照射部分の近傍を描いた）。レーザー光はレーザー光照射部のキャピラリーアレー、ロッドレンズの各中心軸を貫通するように側面から照射する。
【００２７】
キャピラリーに充填されたゲル内をＤＮＡ等がゲル中を泳動する。レーザー光照射部を通過するＤＮＡを標識する蛍光体から発する蛍光は、キャピラリーアレーのなす面に垂直な方向から、集光レンズ６、フィルター７、結像レンズ８を通過しアレーセンサー（一次元、又は二次元ＣＣＤカメラ等）上に結像し検出される。多種類の蛍光体でラベルされたＤＮＡを検出するには、既に報告されている像分割プリズム（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６（１９９４）１０２１−１０２６）と複数のフィルター、又は回転フィルターを使用する。
【００２８】
図５は、図４に示す構成において、２４本のキャピラリーゲルを使用して計測された蛍光信号の一例を示す。図５において、横軸１３は２４本のキャピラリーの位置に対応し、レーザー光入射位置より数えたキャピラリー番号、左縦軸１１は電気泳動時間（分）、右縦軸１２は塩基長を表わす。蛍光信号（像の濃度は蛍光強度を表わす）１０は図５中のキヤピラリー番号が大となる（レーザー光源から離れる）に従って弱くなるので、見やすいように同一の塩基長に対する蛍光信号がほぼ同じ強度になるように強度補正した結果を示している。本実施例の構成では、レーザー光の照射はキャピラリーを貫通して行なうオンカラム計測であるので、キャピラリー端部の形状には影響されず無関係に計測が行なえる。
【００２９】
即ち、ポリマー状のゲルを使用する場合、キャピラリー端部からポリマーが徐々にバッファー液中に流出する場合でも、レーザー光照射部に影響を及ぼさない程度にレーザー光照射部とキャピラリー端部が離れていれば、蛍光信号の計測に何ら影響はない。このようなポリマーゲルは圧力をかけて排出し、新しいゲルと置き換えてキャピラリーを繰り返し使用できるので便利であり、また装置の全自動化にも都合が良い。
【００３０】
図６は、以上説明した本実施例の構成において、分離用の泳動媒体の屈折率の影響を検討した結果を示す図である。図６は、上記で説明したアクリルアミド（屈折率１．３６）の構成を変化させ、屈折率が１．３６から１．４１の異なる値をもつ泳動媒体を使用して、石英キャピラリーと同外径、同屈折率をもつロッドレンズを水中に配置して使用する時の、２０本の石英キャピラリーとロッドレンズとの組合せ条件と、２０本目の石英キャピラリーでのレーザー光の照射効率（２０本目の石英キャピラリーでのレーザー光の照射強度／１本目の石英キャピラリーでのレーザー光の照射強度）の関係を示す。図６の縦軸は、２０本目の石英キャピラリーでのレーザー光の照射効率（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ２０−ｔｈ ｃａｐｉｌｌａｒｙ）、図６の下縦軸は、石英キャピラリーとロッドレンズの周期的配列におけるガラスキャピラリー比（ｇｌａｓｓ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｒａｔｅ）を示す。
【００３１】
図６の上縦軸は、石英キャピラリーとロッドレンズの周期的配列における、比＝ロッドレンズの本数／石英キャピラリーの本数を示す。図６の上縦軸の具体的例を説明をすると、０はロッドレンズを使用しない場合（図１に相当）、１／６は６本の石英キャピラリー対し１本のロッドレンズが配置されることを、１／５は５本の石英キャピラリー対し１本のロッドレンズが配置されることを、１／４は４本の石英キャピラリー対し１本のロッドレンズが配置されることを、１／３は３本の石英キャピラリー対し１本のロッドレンズが配置されることを、１／２は２本の石英キャピラリー対し１本のロッドレンズが配置されることを、それぞれ示す。
【００３２】
屈折率を適切に選んだ泳動媒体（ポリマー）を使用する場合には、ロッドレンズを使用することなく複数本の石英キャピラリーへのレーザー光の照射光量を、試料を標識する蛍光体を励起して蛍光を検出するに十分な光量とすることもできることを図６の結果示している。レーザー光の照射光量を、２０本目の石英キャピラリーでのレーザー光の照射効率により評価すると以下のように、
（１）屈折率が１．４０以上のポリマーを使用する時、ロッドレンズを使用する必要はなく、レーザー光の照射効率＞０．６５を達成できること、
（２）屈折率が１．４０以上のポリマーを使用する時、１本のロッドレンズに対して６本以下の石英キャピラリーを組合せ周期的に配置して、レーザー光の照射効率＞０．８５を達成できること、
（３）屈折率が１．３８以上のポリマーを使用する時、１本のロッドレンズに対して５本以下の石英キャピラリーを組合せ周期的に配置して、レーザー光の照射効率＞０．６５を達成できること、
（４）屈折率が１．３６から１．４１の範囲にある時、１本のロッドレンズと１本の石英キャピラリーとを交互に配置して、レーザー光の照射効率＞０．８０を達成できること等、が明らかである。
【００３３】
（第２の実施例）
図７は、キャピラリー、及びレンズを水中に浸漬する代わりに、反射防止膜をキャピラリー、及びレンズ外面に形成して、キャピラリーアレーを構成し、空気中でキャピラリーアレーにレーザー光を照射する例であり、（ａ）はキャピラリー、レンズの外周全面に、（ｂ）キャピラリー、レンズの外周面の一部に反射防止膜を形成する例である。反射防止膜を形成することにより、キャピラリーの表面での反射は０．５％程度に減少できる。この結果、１本のキャピラリーを通過する際のレーザー光の損失は約１％となり、レーザー光が１００本のキャピラリーを通過した後でも、レーザー光の強度は約３６％と十分強く、多数本のキャピラリーを同時に照射できる。反射防止膜２１は、少なくともレーザー光の光路に面するキャピラリー１、レンズ４の外周面に形成されていればよい。例えば、キャピラリー１、レンズ４の外周面の内、対向する約９０°の範囲に反射防止膜２１を形成し、キャピラリー、レンズの中心軸を結ぶ線上に、キャピラリー、レンズの外周面に形成された反射防止膜の中央部分が配置されるように、キャピラリー、レンズを密着して配置する。
【００３４】
反射防止膜の形成は、各キャピラリーを矩形のホルダーに固定し、反射防止膜（ＭｇＦ_２膜、多層膜等）を、対向する両面から蒸着する。平面状に配列したキャピラリーの上下の側が反射防止膜となるようにする。または、反射防止膜蒸着部の間隔を２ｍｍ以上離して各キャピラリーを並べアレー状に保持し、反射防止膜を蒸着し、各キャピラリーの反射防止膜蒸着部を密着させて使用する。もちろん、各キャピラリーを矩形のホルダーに固定しホルダーを回転させながら反射防止膜をキャピラリーの全周に蒸着してもよい。
【００３５】
周知のように、単層反射防止膜の厚さは、レーザ光の波長をλ、空気の屈折率を、ｎ_０＝１．００、単層反射防止膜の屈折率をｎとする時、０°入射の単一波長λの光の場合、単層反射防止膜の厚さｄは、ｄ＝λ／（４ｎ）で与えられる。例えば、ＭｇＦ_２膜の屈折率を、ｎ＝１．３８、λ＝５３２ｎｍとすると、ｄ＝９６．４ｎｍとなる。また、理想的には、単層反射防止膜の屈折率は石英の屈折率を、ｎ_ｂａｓｅ＝１．４６とすると、√（ｎ_ｂａｓｅ）＝１．２１で与えられ、λ＝５３２ｎｍとすると、ｄ＝１１０ｎｍとなる。さらに、０°入射の単一波長λの光の場合、空気、第１層、第２層、石英の構成とし、第１層、第２層からなる２単層反射防止膜の屈折率をｎ_０、空気の屈折率をｎ_０＝１．００、２層の各反射防止膜の屈折率をｎ_１、ｎ_２、石英の屈折率を、ｎ_ｂａｓｅ＝１．４６とするとする時、反射率を０とするためには、ｎ_０＝（ｎ_１ ^２・ｎ_ｂａｓｅ）／ｎ_２ ^２の関係を満たすようにして、第１層、第２層の厚さを、λ／４とすればよい。例えば、ｎ_１＝１．３８（ＭｇＦ_２）とすると、ｎ_２＝１．６７に近い物質を第２層として選べばよい。
【００３６】
（第３の実施例）
図８はシースフロー中にレーザー光を照射して試料を検出するさいに、レーザー光の進行方向の一定距離毎に凸レンズを配置して、レーザー光を再収束させる例を示す図である。この構成は、レーザー光照射がキャピラリーを貫通して行なわれる場合の他に、キャピラリー内を泳動する生体関連物質をキャピラリーから抜き出して、レーザー光を照射して検出する場合にも有効である。第１の実施例のように、キャピラリーアレーのなす面に沿ってキャピラリーを貫通してレーザー光を照射する場合、キャピラリーの軸方向に垂直な方向には前述した光を収束させる効果があるが、縦方向（管の軸方向）はレンズ効果がなく、レーザー光を細く絞った状態で長い距離を照射することは困難である。一方、キャピラリー内で分離されたＤＮＡ等をシースフロー中にキャピラリーから抜き出して、レーザー光を照射する場合にも事情は同じであり、シースフロー中ではレーザー光はあまり減衰しないが、長い距離に渡って細いレーザー光中で試料を照射できない。そこで一定距離毎に凸レンズを配置し、レーザーを縦横方向に再収束させることが有効である。図８に示す例は、シースフローセル（図示せず）内に、１００本のキャピラリー１を配置し、各キャピラリーの溶出端の近傍で、各キャピラリーから溶出した蛍光標識された試料１６を一度にレーザー光で照射し、図８の紙面と垂直な方向から蛍光を、図４に示すのと同様の方法で検出する。キャピラリーを５０本ずつの２つのブロックに分け、その中間のレーザー軸上に凸レンズ１５を配置し、レーザービームを再収束させている。使用したレンズは焦点距離２０ｍｍの両凸レンズである。第１の実施例の構成において、ロットレンズ４の代わりに、凸レンズ、又は球状レンズを使用してもよいことは言うまでもない。
【００３７】
（第４の実施例）
図９はキャピラリーアレーを重ね、レーザー光の照射位置をキャピラリーアレー毎にずらして複数の蛍光像を作り検出する構成例を示す図であり、（ａ）は正面図、（ｂ）は側面図である。キャピラリーアレー１−１、１−２、１−３を重ねて、レーザー光２−１、２−２、２−３を、それぞれキャピラリーアレー１−１、１−２、１−３を貫通させて照射する。キャピラリーの本数を多くし過ぎるとレーザー光の進行に従い、レーザー光の巾が大きくなり、レーザー光の照射密度が低下して、レーザー光の照射はできても試料の検出が困難になる。蛍光を検出する検出器としては、ラインセンサーやエリアセンサーが良い。しかし、長い幅の蛍光像を受光しようとする時、結像レンズを使用して蛍光像の縮小像を検出器上に作るが、受光量が小さくなってしまう。この場合、図９に示すように、蛍光像を二次元的に形成して、エリアセンサー（図示せず）で検出することが有効である。図９に示すキャピラリーアレーでは、キャピラリー（外径０．２ｍｍ、内径０．１ｍｍ）とガラス棒（ロットレンズ）（外径０．２ｍｍ）とを交互に配列（キャピラリー、ロットレンズの各５０本のそれぞれを交互に配列（１つのキャピラリーアレーの巾は２０ｍｍとなる））したものを３段重ねて、水中に配置した。各段のレーザー光の照射位置をキャピラリー軸方向にずらして、キャピラリーアレーに対して垂直な方向から見た時、蛍光像がお互いに重ならないようにする。即ち、各段のレーザー光の照射位置で発する蛍光（蛍光像）は図９（ａ）の紙面に垂直な方向から（図９（ｂ）では左側から）検出される。
【００３８】
キャピラリーアレーはバッファー液中に置かれ、キャピラリー端部近傍のキャピラリーを貫通して、レーザー光が照射される。レーザー光の照射位置の間隔は約７ｍｍである。３本の蛍光像は像分割プリズム、色フィルターを通して１２本の線状蛍光像として二次元検出器上に結像され、全部で６００個の点画像として検出される。これから１５０個の発光点から発した蛍光をＤＮＡに付加された蛍光体の種類毎の信号に分離して、塩基配列が決定できる。
【００３９】
（第５の実施例）
以上説明した（第１の実施例）から（第４の実施例）では、平面状に配列されたキャピラリーのなす平面に平行に、１方向から各キャピラリー軸を通るようにレーザビームを照射する構成について説明したが、（第１の実施例）から（第４の実施例）において、図１０に示すように、２方向から各キャピラリー軸を通るようにレーザビームを照射する構成としてもよい。図１０（ａ）の構成は、レーザビーム２（単一波長のレーザ光、又は複数のレーザ光源からの複数波長のレーザ光を混合して同軸にしたレーザ光でもよい）を、半透明鏡２９、及び３０−１、３０−２、３０−３により、分岐させて２方向から各キャピラリー軸を通るようにレーザビームを照射する構成である。図１０（ｂ）の構成は、２つのレーザビーム２、２’を、対向する２方向から複数のキャピラリーに照射するする構成であり、レーザビーム２、２’はそれぞれ単一波長のレーザ光、又は複数のレーザ光源からの複数波長のレーザ光を混合して同軸にしたレーザ光でもよい。
【００４０】
図１０（ａ）、（ｂ）の構成では、（第１の実施例）から（第４の実施例）において、各キャピラリーに照射されるレーザ光の強度の低下を、改善してより強い強度のレーザ光を各キャピラリーに照射できる。この結果、より多数の本数を使用するキャピラリーアレイ電気泳動が可能となる。なお、図１０（ａ）の構成では、分岐させて２方向から各キャピラリー軸を通るようにレーザビームを照射するため、レーザ光照射強度が減少するので、高出力のレーザ光源の使用が望ましい。更に、（第１の実施例）から（第４の実施例）に、図１０（ｂ）の構成を適用する際に、レーザビーム２が含む単数、又複数のレーザ光の波長と、レーザビーム２’が含む単数、又複数のレーザ光の波長とを同一波長、異なる波長のいずれかとする。
【００４１】
図１０では、図１に示すキャピラリーアレーの構成を例にとり、本実施例を説明したが、本実施例は、図１に示すキャピラリーアレーの構成に限らず、図３、図４、図６、図７、図９に示すような、集光レンズを含むキャピラリーアレーの構成にも適用でき、さらに図８に示すようなシースフロー中で試料を検出する場合にも適用できる。
【００４２】
以上説明したように、本発明では複数キャピラリーを機械的に走査、光学的に光ビームを走査せず、複数キャピラリーを実質的に同時照射して試料からの蛍光を検出するキャピラリーアレー電気泳動装置が可能となる。
【００４３】
【発明の効果】
複数のキャピラリーを同時に照射するレーザービームをキャピラリー配列中に置いたレンズにより集光させ、多数のキャピラリーを泳動する試料を効率良く励起でき、検出感度が向上する。複数のキャピラリーを同一平面上に配列して、平面に沿って複数のキャピラリーを実質的に同時に貫通するようにレーザーを照射するさいに、レーザー光源から離れたキャピラリーほど反射、屈折等によってレーザー強度が下がり、感度が低下することを防止できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施例であるキャピラリーアレーの一例を示すレーザー照射部の断面図。
【図２】図１のキャピラリーアレーを水中に配置した場合に、キャピラリーを通過するレーザー光の光路をシミュレーションにより示す図。
【図３】図１のキャピラリーの各々の間に石英製棒を配列し水中に配置した場合の、レーザー光の光路のシミュレーション結果を示す図。
【図４】実施例１のキャピラリーアレーを使用したキャピラリーアレー蛍光計測装置（ＤＮＡシーケンサー）の概略構成を示す図。
【図５】図４の構成において、２４本のキャピラリーゲルを使用して計測された蛍光信号の一例を示す図。
【図６】実施例１の構成において、分離用泳動媒体の屈折率の影響を検討した結果を示す図。
【図７】本発明の第２の実施例であり、反射防止膜をキャピラリー、及びレンズ外面に形成してキャピラリーアレーを構成し、空気中でキャピラリーアレーにレーザー光を照射する例を示す図であり、（ａ）はキャピラリー、及びレンズの外周全面に、（ｂ）キャピラリー、及びレンズの外周面の一部に反射防止膜を形成する例を示す図。
【図８】本発明の第３の実施例であり、シースフロー中にレーザー光を照射して試料を検出するさいに、レーザー光の進行方向の一定距離毎に凸レンズを配置して、レーザー光を再収束させる例を示す図。
【図９】本発明の第４の実施例であり、キャピラリーアレーを重ね、レーザー光の照射位置をキャピラリーアレー毎にずらして複数の蛍光像を作り検出する構成例を示す図であり、（ａ）は正面図、（ｂ）は側面図。
【図１０】本発明の第５の実施例であり、２方向から各キャピラリー軸を通るようにレーザビームを照射する構成を示し、（ａ）はレーザビームを半透明鏡によりレーザビームを分岐させて２方向から各キャピラリー軸を通るように照射する構成、（ｂ）は２つのレーザビームを、対向する２方向から複数のキャピラリーに照射する構成を示す図。
【符号の説明】
１…キャピラリー、１−１、１−２、１−３…キャピラリーアレー、２、２’、２−１、２−２、２−３…レーザー光、３…シュミレーションによるレーザー光の光路、４…レンズ（ロッドレンズ（ガラス棒）、凸レンズ、球状レンズ等）、５…光学セル、６…集光レンズ、７…フィルター、８…結像レンズ、９…アレーセンサー、１０…２４本のキャピラリーによる蛍光信号、１１…泳動時間、１２…読み取り塩基長、１３…キャピラリー番号、１４…シースフロー、１５…凸レンズ、１６…試料、２０…泳動媒体（ゲル、ポリマー）、２９、３０−１、３０−２、３０−３…半透明鏡。

Claims (12)

1. 蛍光標識が付加された試料が泳動する泳動媒体が充填される複数のキャピラリーと、前記蛍光標識を励起する励起光を照射する光源と、前記蛍光標識から発する蛍光を検出する光検出器と、前記励起光が照射される前記複数のキャピラリーの間に配置される光集束手段とを具備し、前記複数のキャピラリーと前記光集束手段の前記励起光が照射される部分は平面状に配列され、前記励起光は前記複数のキャピラリーと前記光集束手段とを貫通して照射することを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
2. 請求項１に記載のキャピラリー電気泳動装置において、前記励起光の照射される部分において、前記キャピラリーと前記光集束手段とが交互に配置されることを特徴とする請求項１に記載のキャピラリー電気泳動装置。
3. 請求項１に記載のキャピラリー電気泳動装置において、前記光集束手段はロッドレンズであることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
4. 請求項１に記載のキャピラリー電気泳動装置において、前記光集束手段は球面レンズまたは球型レンズであることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
5. 請求項１に記載のキャピラリー電気泳動装置において、前記複数のキャピラリーと前記光集束手段の前記励起光が照射される部分が、液体中に配置されることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
6. 請求項５に記載のキャピラリー電気泳動装置において、前記液体が水であることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
7. 蛍光標識が付加された試料が泳動する、屈折率が１．４０以上の泳動媒体が充填される複数の石英キャピラリーと、前記蛍光標識を励起する励起光を得る光源と、前記蛍光標識から発する蛍光を検出する光検出器と、前記複数のキャピラリーの間に配置される光集束手段とを具備し、前記励起光が照射される前記複数のキャピラリーと前記光集束手段の部分が平面状に配列され水中に配置され、前記励起光は前記複数のキャピラリーと前記光集束手段とを貫通して照射することを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
8. 蛍光標識が付加された試料が泳動する、屈折率が１．４０以上の泳動媒体が充填される複数の石英キャピラリーと、前記蛍光標識を励起する励起光を得る光源と、前記蛍光標識から発する蛍光を検出する光検出器と、６本以下の前記キャピラリー毎に配置される光集束手段とを具備し、前記励起光が照射される前記複数のキャピラリーと前記光集束手段の部分が平面状に配列され水中に配置され、前記励起光は前記複数のキャピラリーと前記光集束手段とを貫通して照射することを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
9. 蛍光標識が付加された試料が泳動する、屈折率が１．３８以上の泳動媒体が充填される複数の石英キャピラリーと、前記蛍光標識を励起する励起光を得る光源と、前記蛍光標識から発する蛍光を検出する光検出器と、５本以下の前記キャピラリー毎に配置される光集束手段とを具備し、前記励起光が照射される前記複数のキャピラリーと前記光集束手段の部分が平面状に配列され水中に配置され、前記励起光は前記複数のキャピラリーと前記光集束手段とを貫通して照射することを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
10. 請求項７から請求項９の何れかに記載のキャピラリー電気泳動装置において、前記光集束手段が円柱状レンズからなり、前記円柱状レンズの軸が前記キャピラリーとほぼ平行に配置されることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
11. 請求項７から請求項９の何れかに記載のキャピラリー電気泳動装置において、前記光集束手段は前記励起光の照射軸上に配列される球面レンズ又は球形レンズであることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。
12. 請求項１、請求項７から請求項９の何れかに記載のキャピラリー電気泳動装置において、前記励起光は２方向から前記複数のキャピラリーの軸を通るように照射されることを特徴とするキャピラリー電気泳動装置。

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