JPH06289020A - 歯槽骨由来タンパクの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 歯周症の診断に有用な歯槽骨由来タンパクの
測定方法を提供する。 【構成】 歯槽骨由来タンパクの免疫学的測定方法であ
って、検体試料として歯肉溝滲出液を用いることを特徴
とする歯槽骨由来タンパクの測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、歯槽骨由来タンパクの
測定方法、及び歯肉溝滲出液から歯槽骨由来タンパクの
抽出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】歯周疾患は、歯の支持体を失わせるとい
う意味で、重要な疾患である。最近の研究によると、歯
周疾患における歯周組織破壊は、個々の部位において比
較的短期間に起こり、その後は長期間の非活動期が続く
ことが示され、歯周疾患は、部位特異的に活動期と休止
期を繰返しながら進行していく炎症性疾患であるという
概念が受け入れられるようになってきた。

【０００３】従来の上記の疾患に関する診断法として、
歯周炎指数（ＧＩ）、プロービング時の出血、ポケット
の深さ（ＰＤ）、アタッチメントレベル（ＡＬ）、デン
タルＸ線写真などの種々の臨床パラメーターを用いて歯
周疾患の診査ならびに診断を行なっている。すなわち同
一部位に対し、最低２つの時点における臨床パラメータ
ーを測定して、その変化量を求めて、評価を行なうが、
この方式では活動期病変であったという結果を知るだけ
の可能性が高く、活動期を予知、あるいは早期診断する
ことはできない。

【０００４】上記の欠点をおぎなうために、歯肉溝滲出
液中の物質をはかり、歯周疾患の評価を行なう研究があ
る。例えば、βグルクロニダーゼ（文献１）、プロスタ
グランジンＥ₂ （文献２）、プロテアーゼ、フラゲナー
ゼ、ヒアルノニダーゼである。

【０００５】しかしながら、これらは、細菌やそれらを
排除するべく出現した宿主側の炎症関連細胞由来の物質
であり、真の歯周疾患の病勢を表わしているとはいいが
たかった。

【０００６】

【発明を解決しようとする課題】このような点から、１
回の検査によって、活動期を適確に予知、あるいは極め
て早期に診断できるような検査方法が望まれていた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決すべ
く、歯肉溝滲出液の骨由来タンパクを採取し、効率よく
抽出し、高感度に測定することにより、歯周疾患の診断
や治療効果判定に有用であることを見い出し、本発明に
到達した。

【０００８】すなわち本発明は、歯槽骨由来タンパクの
免疫学的測定方法であって、検体試料として歯肉溝滲出
液を用いることを特徴とする歯槽骨由来タンパクの測定
方法である。

【０００９】さらに本発明は、上記の測定方法を用いて
歯槽骨由来タンパクを測定し、得られた測定値に基いて
歯周疾患の治癒効果を判定する方法、及び歯肉溝滲出液
から歯槽骨由来タンパクを抽出することを特徴とする歯
槽骨由来タンパクの抽出方法である。

【００１０】本発明の抽出方法において、歯肉溝滲出液
からの滲出液は、膜状、繊維状物、又はキャピラリー状
物によって採取することができる。

【００１１】かかる膜状、繊維状物、又はキャピラリー
状物としては、例えばニトロセルロース膜、セルロー
ス、濾紙、ペリオペーパー、濾紙のこより状物、ナイロ
ン膜、ＰＤＧＦ膜、プラスチックのキャピラリー、グラ
スファイバー紙、レーヨン繊維、ガラス繊維、わた等が
あげられる。また、この抽出は、タンパク及び／又は非
イオン系界面活性剤を含有する溶液を用いて抽出するこ
とができる。

【００１２】かかるタンパク成分としては、例えばアル
ブミン、オロソムコイド、ペプシン、カゼイン、γ―グ
ロブリン、卵アルブミン、ヘモシアニン等があげられ
る。非イオン系界面活性剤としては、例えば、ポリオキ
シエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルキロ
ールアマイド、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、
ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンエーテル、ポ
リオキシエチレンアルキルアミン等があげられる。

【００１３】タンパク成分を含有する溶液を抽出液とす
る場合には、０．００５重量％以上、好ましくは０．０
１〜２０重量％を挙げることができる。０．００５重量
％未満では被抽出蛋白の不安定さで好ましくなく、また
２０重量％を超えると抽出効率の点でで好ましくない。
タンパク成分がスキムミルクである場合には、０．００
５重量％以上が好ましく、上限は１．０重量％が好まし
い。また、非イオン系界面活性剤を含有する溶液を抽出
液とする場合には、０．００５重量％、好ましくは０．
０１〜２重量％を挙げることができる。０．００５重量
％未満では抽出効率が悪く好ましくなく、また２重量％
を超えると抽出された蛋白の不安定性等の理由で好まし
くない。

【００１４】タンパク成分及び／又は非イオン系界面活
性剤を含有する溶液は、例えばタンパク成分等を緩衝液
等の水性媒体に溶解することによって得られる。

【００１５】かかる水性媒体としては、例えばリン酸緩
衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリス緩衝液、ヘペス緩
衝液、炭酸緩衝液等が挙げられ、なかでも、トリス緩衝
液が好ましい。

【００１６】このタンパク成分等を含有する溶液のｐＨ
は６．０〜８．５の範囲が好ましい。６．０未満あるい
は８．５を超える条件では歯槽骨由来蛋白の抽出効率が
おちるため好ましくない。

【００１７】本発明の測定方法においては、検体試料と
して、このような歯肉溝滲出液を用いる。滲出液を吸着
した試料から、抽出液を用いて抽出する場合、超音波を
もいいてもよいし、自然浸漬でもよいし、攪拌してもよ
い。

【００１８】本発明の骨由来タンパクとしては、オステ
オカルシン、ＴＲ―ＡＣＰ、オステオポンチン、ＴＧＦ
―β、ＩＧＦ―Ｉ、ＩＧＦ―IIなどから選ばれる少なく
とも１以上のタンパクが挙げられる。これらのなかでも
オステオカルシンが好ましい。

【００１９】本発明の免疫学的測定方法としては、例え
ばサンドイッチ免疫測定法、ラテックス凝集法、競合的
免疫測定法等を挙げることができる。

【００２０】これらの免疫学的測定方法は、いずれも従
来公知の測定方法であり、例えば「酸素免疫測定法」
（石川栄治著）等にその方法が記載されている。

【００２１】具体的にサンドイッチ免疫測定法で、標識
物質として酵素を用いる方法（ＥＩＡ）について本発明
の測定方法を実施する場合を説明する。このサンドイッ
チ法によるＥＩＡにおいては、本発明の歯槽骨由来タン
パクに対する抗体を通常２種用い、例えば次のような手
順に従い定量する。すなわち、２種の抗体のうちの一方
の抗体（第１抗体）を適当な不溶性担体（例えばプラス
チック容器）に固定化する（以下これを“固定化抗体”
という）。次いで不溶性担体と測定しようとする試薬又
は検体試料との非特異的結合を避けるために適当な物質
（例えば牛血清アルブミン）で不溶性担体の表面を被覆
する。このようにして得られた第１抗体が固定化された
不溶性担体を検体試料と一定時間及び温度で接触させ反
応させる。この間に固定化工程（第１抗体）と検体試料
中の歯槽骨由来タンパクが結合する。次いで不溶性担体
を適当な洗浄液で洗った後、適当な酵素標識した歯槽骨
由来タンパクに対する他方の抗体（第２抗体）の溶液
（例えば水溶液）と一定時間及び温度で接触させ、固体
化抗体に結合した歯槽骨由来タンパクと第２抗体を反応
させる。これを適当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体
上の固体化抗体と歯槽骨由来タンパクを介して結合して
存在する第２抗体に標識された標識物質の量を測定す
る。

【００２２】なお上記サンドイッチ法は、固定化抗体、
標識抗体及び歯槽骨由来タンパクを含有する検体試料を
同時に混合し、一定時間及び温度でこれら三者を同時に
接触させ反応させて行うこともできる。

【００２３】かくしてその値から検体試料中の歯槽骨由
来タンパクの量を算出することができる。通常、サンド
イッチ法では、第１抗体と第２抗体とが双方ともモノク
ローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体で
あってもよいし、一方をモノクローナル抗体とし、他方
をポリクローナル抗体として用いることもできる。

【００２４】競合法としては、例えば固相に固定した抗
原と測定すべき抗原とに対し、一定量の標識抗体を競争
的に反応させて固相抗原・標識抗体複合体を形成せし
め、洗浄操作の後、固相に結合した標識抗体の標識物質
の量を測定する方法や、固相に抗体を固定し、標識抗原
と測定すべき抗原とを競争的に反応させて固相抗体・標
識抗原複合体を形成せしめ、洗浄操作の後、固相に結合
した標識抗原の標識物質の量を測定する方法を挙げるこ
とができる。

【００２５】サンドイッチ法及び競合法のそれぞれにお
いて、ＩｇＧをペプシンで消化して得られたＦ（ａ
ｂ′）₂ ；Ｆ（ａｂ′）₂ を還元して得られたＦａ
ｂ′；又は抗体をパパインで消化して得られたＦａｂな
どの、抗原に結合する抗体フラグメントを固定して固定
抗体として、また、これらを標識して標識抗体として使
用することができる。

【００２６】本発明の歯槽骨由来タンパクの測定方法に
おいて使用される不溶性担体としては、例えばポリスチ
レン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、
ポリアクリロニトリル、弗素樹脂、架橋デキストラン、
アガロース、ポリサッカライドなどの高分子の他、紙、
ガラス、金属及びこれらの組合せなどを例示することが
できる。不溶性担体の形状は、例えばトレイ状、球状、
繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、試験管などの種々
の形状であることができる。

【００２７】本発明の免疫学的測定方法においては、例
えばサンドイッチ免疫学的測定法等の場合に第１抗体を
固定する不溶性担体として繊維状物、例えば不織布、紙
等を用いる場合には、後記のいわゆるドライタイプ免疫
測定法によって測定することができる。

【００２８】また、不溶性担体としてポリスチレンビー
ズ、金属微粒子等を用いる場合には、いわゆる均一系免
疫測定法（homogeneous immunoassay ）によって測定す
ることができる。

【００２９】また、標識抗体の標識物質としては、酵
素、蛍光物質、発光物質及び放射性物質等を使用するこ
とができる。酵素としては、ベルオキシダーゼ、アルカ
リフォスファターゼ、β―Ｄ―ガラクトシダーゼなど
を、蛍光物質としてはフルオレッセインイソチオシアネ
ート、フィコビリプロテインなどを、発光物質としては
イソルシノール、ルシゲニンなどを、そして放射性物質
としては ¹²⁵Ｉ、 ¹³¹Ｉ、 ¹⁴Ｃ、 ³Ｈなどを使用するこ
とができるが、これらは例示したものに限らず、免疫学
的測定法に使用し得るものであれば、他のものでもよ
い。

【００３０】標識剤が酵素である場合には、その活性を
測定するために基質及び必要により発色剤が用いられ
る。これらの例としては、例えば、酵素として西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等のペルオキシダーゼを
用いる場合には、基質として過酸化水素を用い、発色剤
として２，２′―アジノジ―（３―エチルベンズチアゾ
リンスルホン酸）アンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５―ア
ミノサリチル酸、ｏ―フェニレンジアミン、４―アミノ
アンチビリン又は３，３′，５，５′―テトラメチルベ
ンジジンなどを、酵素としてアルカリフォスファターゼ
を用いる場合には、基質としてｏ―ニトロフェニルフォ
スフェートなどを、酵素としてβ―Ｄ―ガラクトシダー
ゼを用いる場合には基質としてフルオレセイン―ジ―
（β―Ｄ―ガラクトピラノシド）又は４―メチルウンベ
リフェリル―β―Ｄ―ガラクトピラノシドなどと組み合
わせて用いられる。

【００３１】ラテックス凝集法においては、歯槽骨由来
タンパクに対する抗体を用い、検体試料中の該タンパク
をラテックスに固定し、歯槽骨由来タンパクと抗体固定
ラテックスによる凝集の程度により、歯槽骨由来タンパ
クの量を測定する。抗体は、一般にはポリクローナル抗
体を用いるが、モノクローナル抗体であってもよく、こ
の場合は、２種類以上の抗体を同一又は異なるラテック
スに固定して使用する。

【００３２】ドライタイプ測定法としては、例えば簡便
スティック法、等のような歯槽骨由来タンパクを含む検
体試料と、歯槽骨由来タンパクに対する１つの抗体（標
識物）をあらかじめ混合して反応させ、他のエピトープ
を認識する抗体を一部固定した繊維状物、紙状物等のメ
ンブレインに、この混合溶液を通過させ、次いで洗浄液
を通過させて十分洗浄し、その後、固定抗体上に歯槽骨
由来タンパクを介してサンドイッチ型に結合した標識抗
体の標識量を検出し、抗原量を算出する。

【００３３】また、金コロイド法（Color Immuno Chrom
atograph Assay（ＣＩＣＡ法））としては、歯槽骨由来
タンパクを含む検体試料と、歯槽骨由来タンパクに対す
る抗体の金コロイド結合物とを反応させ、免疫反応の結
果生じる金コロイド凝集体の色の変化で、抗原量を算出
する。

【００３４】

【実施例】以下、実施例、参考例により本発明を詳述す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。実施例・参考例において％表示は、特にことわらな
い限り重量％を示す。

【００３５】

【参考例１】モノクローナル抗体を用いたサンドイッチ
法ＥＩＡによる歯槽骨由来タンパク（ヒト・オステオカ
ルシン）の測定方法（ＷＯ９０／０９５８７号明細書を
参照のこと） （１）抗体固定化ビーズの調製 ポリスチレン製ビーズ（直径６ｍｍ）をよく洗浄してか
ら、これをヒト・オステオカルシンのＮ末端ペプチド（
¹Ｔｙｒ―²⁰Ａｒｇ）（Ｎ２０）に対するモノクローナ
ル抗体Ｃｌｏｎ―１０Ｂの２０μｇ／ｍｌの濃度を有す
るＰＢＳ溶液中に４℃の温度で１昼夜放置した後、ＰＢ
Ｓで洗浄し、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ
溶液中に、４℃の温度で１昼夜放置してポストコーティ
ング処理をして、Ｃｌｏｎ―１０Ｂ抗体固定化ビーズを
得た。なお、モノクローナル抗体Ｃｌｏｎ―１０Ｂを産
生するハイブリドーマ１０Ｂは、工業技術院微生物工業
技術研究所にＦＥＲＭ―３５３８として平成３年８月２
８日付で受託されている。

【００３６】（２）ＨＲＰ標識抗体の調製 先に本発明者らが出願したＷＯ９０／０９５８７号の中
で作成したヒト・オステオカルシンのＮ末端ペプチド（
¹Ｔｙｒ―²⁰Ａｒｇ）に対するポリクローナル抗体（抗
Ｏｓｔ―Ｎ（２０））の２．０ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液
１ｍｌに、１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．２）１００μｌ
と、４０μｇのペプシンを２０μｌの同緩衝液に溶解し
て加え、３７℃、４時間反応させた。

【００３７】反応終了後、ＰＢＳにて平衡化したセファ
デックスＧ２５カラム（φ２ｃｍ×４５ｃｍ）を用いて
分離しＦ（ａｂ′）₂ を採取した。Ｆ（ａｂ′）₂ の１
ｍｇ／ｍｌ ０．０１Ｍリン酸、０．１５Ｍ ＮａＣｌ
（ｐＨ７．４）溶液２ｍｌに、ＭＢＳ １０ｍｇ／ｍｌ
の濃度のジメチルホルムアミド溶液５０μｌを添加し、
２５℃の温度で３０分間反応させた。次いでセファデッ
クスＧ―２５を充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸
緩衝液（０．１Ｍ ＰＢ）（ｐＨ６．０）でゲル濾過を
行い、マレイミド化抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。

【００３８】一方、ＨＲＰの１０ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍ
ＰＢ（ｐＨ６．５）溶液２ｍｌにＳ―アセチルメルカ
プト無水コハク酸の６０ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミ
ド溶液１２０μｌを加え、２５℃で２時間反応させた。

【００３９】次に０．１Ｍトリス―塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を８００μｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ１６０μ
ｌ、１Ｍヒドロキシルアミン１．６ｍｌを加え、０℃で
４分間反応させた。その後、反応液をコロジオンバッグ
に入れ、０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ６．０）、５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ含有溶液を用いて、４℃で３日間透析し、チオール
化ＨＲＰを得た。

【００４０】次に、マレイミド化抗体２ｍｇとチオール
化ＨＲＰ４ｍｇとを混合し、コロジオンバッグを用いて
氷冷下に４〜１０ｍｇ／ｍｌの蛋白濃度になるまで濃縮
し、１５〜２０℃で一夜放置した。その液を、ウルトロ
ゲルＡｃＡ４４（ＬＫＢ社）を充填したカラムでゲル濾
過し、ＨＲＰ標識抗Ｏｓｔ―Ｎ（２０）抗体を得た。

【００４１】（３）サンドイッチＥＩＡ測定系 （１）で調製したＣｌｏｎ―１０Ｂ抗体固定化ビーズ１
個と、精製したヒト・オステオカルシン（標準物質）を
０〜２０ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する１％ＢＳＡ含有
０．０５Ｍ ＴＢＳ（ｐＨ８．０）２００μｌと（２）
で作成したＨＲＰ標識抗体の１％ＢＳＡ含有０．０５Ｍ
ＴＢＳ（ｐＨ８．０）溶液２００μｌとを、各試験管
に添加して、２５℃の温度で２時間インキュベートし
た。次に試験管内の溶液を吸引除去した後、０．０５Ｍ
ＴＢＳ（ｐＨ８．０）で洗浄してから、３，３′，
５，５′―テトラメチルベンジジン塩酸塩０．０２％及
びＨ₂ Ｏ ₂ ２．５ｍＭを含有する０．１Ｍリン酸／クエ
ン酸緩衝液（ｐＨ４．３）を０．４ｍｌずつ各試験管に
加え、２５℃の温度で３０分間反応させた後、反応停止
剤として１Ｎ硫酸水溶液を１ｍｌずつ加えて酵素反応を
停止させた。次いで、この溶液を分光光度計を用いて４
５０ｎｍの波長における吸収強度を測定した。これを標
準物質濃度０〜２０ｎｇ／ｍｌに対応してプロットした
検量線を図１に示した。この結果から、本発明の測定方
法を用いれば０．０５ｎｇ／ｍｌまで精度よく測定可能
であることがわかる。

【００４２】なお、この測定方法によって、完全ヒト・
オステオカルシン（４９アミノ酸残基）とそのＮ末端フ
ラグメントをほぼ同じ感度で測定できた。以下の実施例
で測定された検体試料中のヒト・オステオカルシンとし
て、完全ヒト・オステオカルシン、又はこの完全ヒト・
オステオカルシンとそのＮ端フラグメントとの総計を、
共にＨＯＣとして表わす。

【００４３】

【参考例２】歯槽骨由来タンパク（ＴＲ―ＡＣＰ）免疫学的測定方法 Kraenzlin, M.E. らの方法（J. Clin. Endoc. Metab.１
９９０，７１，４４２―４５１）に従い測定した。すな
わち、骨から、破骨細胞由来のＴＲ―ＡＣＰを精製し、
これに対する抗体を作成した。これを用いてＴＲ―ＡＣ
Ｐの測定系を構築した。図２に示すごとく、良好な濃度
依存性を示した。

【００４４】

【参考例３】歯槽骨由来タンパク（ＩＧＦ―II）の測定系の構築 Hokken-Koelega, A.C.S.らの方法（J. Clin. Endoc. Me
tab.１９９０，７１，６８８―６９５）に従い測定し
た。すなわち、ＩＧＦ―IIの抗体を採取し、これを用い
てＩＧＦ―II測定系の構築を検討した。その結果を図３
に示す。図３のごとく、良好な濃度依存性を示した。

【００４５】

【実施例１】歯槽骨由来タンパク（ヒト・オステオカルシン）のモデ
ル抽出方法 ヒト・オステオカルシン２００ｎｇ／ｍｌを１μｌのペ
リオペーパーに滴下し、これによって繊維状物としての
紙を用いて歯槽骨由来タンパクを採取したこととし、次
いで下記Ａ液〜Ｄ液の各抽出液（各、ｐＨ７．０）を用
いて浸漬することにより抽出した。 Ａ液：１％ＢＳＡ、０．０２％ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ Ｂ液：１％ＢＳＡ／ＰＢＳ Ｃ液：０．０２％ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ Ｄ液：ＰＢＳ ４分間浸漬後、抽出液を１００μｌサンプリングして、
その抽出液中のヒト・オステオカルシンの濃度（ＨＯＣ
ｎｇ／ｍｌ）を参考例１の方法で測定した。その結果を
図４に示す。

【００４６】ＰＢＳのみに比較して、Ｂ液、Ｃ液の回収
率は、上昇傾向にあるが、Ａ液が最もよい抽出効率を与
えた。

【００４７】

【実施例２】抽出液のｐＨによる影響 ヒト・オステオカルシン２００ｎｇ／ｍｌを各１μｌず
つペリオペーパーに滴下し、抽出液のｐＨを５．５〜
８．５に変え、抽出液中のヒト・オステオカルシンの濃
度（ＨＯＣｎｇ／ｍｌ）を参考例１の方法で測定した。
その結果を図５に示す。図５に示すごとく、至適ｐＨは
６．５〜８．０であることが判った。

【００４８】

【参考例４】ラテックス凝集法による歯槽骨由来タンパク（ヒト・オ
ステオカルシン）の測定 参考例１（２）で作成した抗Ｏｓｔ―Ｎ（２０）抗体
（ポリクローナル抗体）を、ラテックスに物理吸着させ
た。ヒト・オステオカルシンの希釈系列の５０μｌと、
抗Ｏｓｔ―Ｎ（２０）抗体固定ラテックスとを混合し、
反応させた。その結果を図６に示す。ヒト・オステオカ
ルシンの濃度（ＨＯＣｎｇ／ｍｌ）依存的に凝集反応が
起っていることが判る。

【００４９】

【実施例３】簡便スティック法による歯槽骨由来タンパク（ヒト・オ
ステオカルシン）の測定 ペリオペーパーをＣＮＢｒにより活性化し、これに参考
例１（１）で作成した抗Ｏｓｔ―Ｎ（２０）モノクロー
ナル抗体（１０Ｂ）を固定する。１０Ｂ固定ペリオペー
パーを用いて、歯肉溝滲出液を採取し、参考例１（２）
で作成したＨＲＰ標識抗Ｏｓｔ―Ｎ（２０）ポリクロー
ナル抗体溶液に１分間浸漬する。水道水にて洗浄後、
３，３′，５，５′―テトラメチルベンジジン塩酸塩
０．０２％及びＨ₂ Ｏ₂ ２．５ｍＭ液に浸漬し、発色反
応を３分間行う。発色した液の吸光度（４５０ｎｍ）を
測定した。

【００５０】比較として、参考例１の方法の測定法（サ
ンドイッチＥＩＡ法）を用いた結果との相関を図７に示
す。本測定系によって、簡便な測定系が正しく機能して
いることが判る。

【００５１】

【実施例４】金コロイド法による歯槽骨由来タンパク（ヒト・オステ
オカルシン）の測定 ニトロセルロースメンブレインの検出部に、参考例１
（１）で得られた抗Ｏｓｔ―Ｎ（２０）モノクローナル
抗体（１０Ｂ）を固定し、金コロイド標識した参考例１
（２）で作成した抗Ｏｓｔ―Ｎ（２０）ポリクローナル
抗体（Ｆ（ａｂ′）₂ が含有された部分の末端に、検体
試料を採取する部分を設計した。歯槽骨滲出液を、検体
採取部分につけ、溶媒を用いて展開した。検出部にて形
成された金コロイド標識抗体―抗原（ヒト・オステオカ
ルシン）―固定抗体複合体中の抗原量（ＨＯＣｎｇ／ｍ
ｌ）を金コロイド量換算で算出した。その結果を図８に
示す。図８のごとく、定量的な方法であることが示され
た。

【００５２】

【実施例５】歯肉溝滲出液からの歯槽骨由来タンパク（ヒト・オステ
オカルシン）の採取、抽出及びその測定 各ステージの歯周疾患患者の歯肉溝滲出液をペリオペー
パーを用いて採取し、実施例１のＡ液により抽出したも
のを、参考例１の測定系に供した。その結果を図９に示
す。

【００５３】歯周炎指数（ＧＩ）１、２、３に従って、
滲出液中のヒト・オステオカルシン濃度（ＨＯＣｎｇ／
ｍｌ）の上昇傾向がみられ、ヒト・オステオカルシンと
歯周炎の進展との相関が示唆された。

【００５４】

【実施例６】本発明の測定方法による歯周疾患のモニタリング 実施例５と同様の方法で、初診、歯石除去（スケーリン
グ：ＳＣ）直前、及び治療後の歯周疾患患者の歯肉溝滲
出液中の歯槽骨由来タンパク（ヒト・オステオカルシ
ン）濃度（ＨＯＣｎｇ／ｍｌ）を経時的に同時に、ポケ
ットの深さ（ＰＤ）、歯周炎指数（ＧＩ）、アタッチメ
ントレベル（ＡＬ）も測定した。最長４週目まで測定し
た。その結果を図１０に示す。明らかに、治療効果を反
映することが示された。 （文献１）Lamster IBら、"Enzyme activity in crevic
ular fluid for detection and prediction of clinica
l attachment loss in patients with chronic adult p
eriodontitis." J Periodontol 1988; 59: 516-523. ( 文献２）Offenbacher S ら、"The use of crevicular
fluid prostaglandin Ez levels as a predictor of p
eriodontal attachment loss." J Periodont Res1986;
21: 101-112.

【図面の簡単な説明】

【図１】参考例１における歯槽骨由来タンパク（ヒト・
オステオカルシン）のサンドイッチ法による検量線を示
す。

【図２】参考例２における歯槽骨由来タンパク（ＴＲ―
ＡＣＰ）の免疫学的測定方法による検量線を示す。

【図３】参考例３における歯槽骨由来タンパク（ＩＧＦ
―II）の免疫学的測定方法による検量線を示す。

【図４】実施例１における、歯槽骨由来タンパク（ヒト
・オステオカルシン：ＨＯＣｎｇ／ｍｌ）のモデル抽出
法による抽出結果を示す。図中、Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤは抽
出液の種類を表わし、Ａは、１ｗｔ％ＢＳＡ、０．０２
ｗｔ％ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ、Ｂは１ｗｔ％ＢＳＡ／
ＰＢＳ、Ｃは０．０２ｗｔ％ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳを
含有し、及びＤはＰＢＳのみからなる抽出液を表わす。

【図５】実施例２における、各種ｐＨ抽出液による歯槽
骨由来タンパク（ＨＯＣｎｇ／ｍｌ）の抽出への影響を
示す。

【図６】参考例４における歯槽骨由来タンパク（ヒト・
オステオカルシン）のラテックス凝集法による検量線を
示す。

【図７】実施例３における歯槽骨由来タンパク（ヒト・
オステオカルシン）の簡便ラテックス法による測定結果
と、参考例１におけるサンドイッチＥＩＡ法による検量
線との相関を示す。

【図８】実施例４における歯槽骨由来タンパク（ヒト・
オステオカルシン）の金コロイド法による測定結果を示
す。

【図９】実施例５における歯周炎指数（ＧＩ）と歯肉溝
滲出液中の歯槽骨由来タンパク（ヒト・オステオカルシ
ン）濃度（ＨＯＣｎｇ／ｍｌ）の相関を示す。

【図１０】実施例６における本発明の測定方法による歯
周疾患のモニタリングの結果を示す。図中、実線はヒト
・オステオカルシン濃度（ＨＯＣｎｇ／ｍｌ）を示し、
ＡＬはアタッチメントレベル、ＰＤはポケットの深さ、
ＧＩは歯周炎指数を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 中本 忠克 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 歯槽骨由来タンパクの免疫学的測定方法
   であって、検体試料として歯肉溝滲出液を用いることを
   特徴とする歯槽骨由来タンパクの測定方法。
2. 【請求項２】 該歯槽骨由来タンパクが、オステオカル
   シン、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲ―ＡＣ
   Ｐ）、オステオポンチン、ＴＧＦ―β、ＴＧＦ―Ｉ、及
   びＴＧＦ―IIから選ばれる少なくとも１以上の歯槽骨由
   来タンパクである請求項１記載の測定方法。
3. 【請求項３】 該免疫学的測定方法が、ラテックス凝集
   法、サンドイッチ免疫測定法、及び競合的免疫測定法か
   ら選ばれるいずれかである請求項１記載の測定方法。
4. 【請求項４】 該免疫学的測定法が、抗歯槽骨由来タン
   パク抗体を不溶性担体に固定した固定抗体を用いる方法
   であって、該不溶性担体が繊維状物である請求項１記載
   の測定方法。
5. 【請求項５】 該不溶性担体が、金コロイドである請求
   項４記載の測定方法。
6. 【請求項６】 請求項１記載の測定方法を用いて歯槽骨
   由来タンパクを測定し、得られた測定値に基いて歯周疾
   患の治癒効果を判定する方法。
7. 【請求項７】 歯肉溝滲出液から歯槽骨由来タンパクを
   抽出することを特徴とする歯槽骨由来タンパクの抽出方
   法。
8. 【請求項８】 該滲出液が、膜、繊維状物、又はキャピ
   ラリー状物によって採取されたものである請求項７記載
   の抽出方法。
9. 【請求項９】 該抽出が、タンパク成分０．００５重量
   ％以上及び／又は非イオン系界面活性剤０．００５重量
   ％以上を含有する溶液を用いるものである請求項７記載
   の抽出方法。
10. 【請求項１０】 該溶液のｐＨが６．０〜８．５の範囲
    である請求項９記載の抽出方法。
11. 【請求項１１】 該タンパク成分が、スキムミルクであ
    る請求項９記載の抽出方法。