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JPH06225788A - 免疫グロブリンイソタイプに対する再形状化されたモノクローナル抗体 - Google Patents

免疫グロブリンイソタイプに対する再形状化されたモノクローナル抗体

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JPH06225788A
JPH06225788A JP5238180A JP23818093A JPH06225788A JP H06225788 A JPH06225788 A JP H06225788A JP 5238180 A JP5238180 A JP 5238180A JP 23818093 A JP23818093 A JP 23818093A JP H06225788 A JPH06225788 A JP H06225788A
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ser
thr
amino acid
antibody
tyr
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ハルトマン ノルマン
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コルビンガー フランク
Jose Saldanha
サルダナ ジョゼ
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Ciba Geigy AG
Tanox Biosystems Inc
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 再形状化されたヒトモノクローナル抗体、そ
れを用いてのアレルギーの診断、予防及び処理に関す
る。 【構成】 免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）のイソタイプ決
定基に対して向けられた再形状化されたヒトモノクロー
ナル抗体及びその誘導体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の
イソタイプ決定基に対して向けられた再形状化されたヒ
トモノクローナル抗体及びその誘導体に関する。前記抗
体及びそれらの誘導体はアレルギーのインビトロ及びイ
ンビボ診断、予防及び処理のために有用である。アレル
ギーは、外来性物質（アレルゲン）に対しての過大な免
疫応答により誘発される過敏性状態である。アレルゲン
との接触のすぐ後でのアレルギー反応により特徴づけら
れる即座（タイプＩ）過敏性は、Ｂ細胞により仲介さ
れ、そして抗原−抗体反応に基づけられており、そして
遅延された過敏性はＴ細胞により仲介され、そして細胞
免疫性の機構に基づかれている。最近、用語“アレルギ
ー”とは、タイプＩ過敏性とますます同義になって来て
いる。
【０００２】即座過敏性は、アレルゲンとの接触に基づ
いて、抗体分泌性血漿細胞に分化するＢ細胞による免疫
グロブリンクラスＥの抗体（ＩｇＥ抗体）の生成に基づ
かれる。ＩｇＥ誘発された反応は、身体のアレルゲン侵
入の部位、すなわち粘膜表面及び／又は局部のリンパ節
で生じる局部的な出来事である。局部的に生成されるＩ
ｇＥはまず、局部的な肥満細胞を敏感にし、すなわちＩ
ｇＥ抗体は、肥満細胞の表面上のＦｃe レセプターにそ
れらの不変部により結合し、そして次に、“あふれた
（ｓｐｉｌｌ−ｏｖｅｒ）”ＩｇＥが循環中に侵入し、
そして身体を通しての循環性好塩基球及び組織固定され
た肥満細胞上のレセプターに結合する。結合されたＩｇ
Ｅが続いてアレルゲンと接触される場合、Ｆｃe レセプ
ターが、アレルゲンの結合により架橋され、これに基づ
いて、細胞が脱顆粒化し、そして多くのアナフィラキシ
ーメディエーター、たとえばヒスタミン、プロスタグラ
ンジン、ロイコトリエン、等を放す。それは、即座過敏
性に典型的な臨床学的徴候、すなわち呼吸器又は腸の平
滑筋の収縮、小さな血管の拡張及び水及び血漿タンパク
質に対するそれらの透過性の上昇、たとえば鼻炎、アト
ピー性エグゼマ（ｅｘｃｅｍａ）及びぜんそくをもたら
す粘膜の分泌、及びかゆさ及び苦痛をもたらす皮膚にお
ける神経末端の刺激を担当するそれらの物質の開放であ
る。
【０００３】さらに、アレルゲンとの二次接触に基づく
反応が、細胞表面上にＩｇＥを表わすことによってアレ
ルゲンとの一次接触の後、いくらかのＢ細胞が表面Ｉｇ
Ｅ陽性Ｂ細胞（ｓＩｇＥ+ Ｂ細胞）の“記憶プール”を
形成するので、増強される。アレルギーの処理のための
有望な概念は、ＩｇＥイソタイプ特異的であり、そして
従って、ＩｇＥを結合することができるモノクローナル
抗体の適用を包含する。このアプローチは、アレルギー
の誘発における初期出来事であり、そしてアレルギー状
態の維持を提供する、ＩｇＥ免疫応答をダウンレギュレ
ーションすることによってアレルギー反応の阻害に基づ
かれている。他の抗体種類の応答は影響されないので、
アレルギー徴候に対する即座及び長く続く効果が達成さ
れる。さらに、抗−アレルギー剤として適切な抗体は、
ＩｇＥ生成血漿細胞である表面ＩｇＥ陽性Ｂ細胞と接触
し、その結果、それらはそれらのＢ細胞を機能的に排除
するように使用され得る。しかしながら、原理上、Ｉｇ
Ｅに対する抗体がまた、Ｆｃe レセプターを架橋するこ
とによってＩｇＥ感受性化肥満細胞からのメディエータ
ー開放を誘発し、従って血清ＩｇＥ及びｓＩｇＥ+ Ｂ細
胞レベルに及ぼす有益な効果に対抗する。結果的に、ア
レルギーの治療に適用できる抗体は、感受性化された肥
満細胞及び好塩基性球上に結合されるＩｇＥと反応する
ことができるべきでないが、しかしｓＩｇＥ+ Ｂ細胞を
認識する能力を保持すべきである。
【０００４】そのようなＩｇＥイソタイプ特異的抗体
は、Ｃｈａｎｇなど．（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
８，１２２−１２６（１９９０））により、ＰＣＴ出願
第８９／０６１３８号及びヨーロッパ特許出願第３９６
５０５号に記載されている。しかしながら、開示される
抗体はヒト起源のものではないので、それらは、外来性
タンパク質としてのそれらの免疫原性、循環におけるそ
れらのかなり長い持続性、及び損傷免疫複合体の考えら
れる形成により、ヒトへの適用のためにほとんど適切で
はない。それらの欠点は、ゲッ歯動物の抗体の可変ドメ
インとヒト抗体不変ドメインとを組合すキメラ抗体に、
ゲッ歯抗−ＩｇＥモノクローナル抗体形質転換すること
によって実質的に減じられ得る。このアプローチは、ゲ
ッ歯動物の親の抗−ＩｇＥ抗体の抗原結合部位を保存
し、そしてヒトイソタイプ及びエフェクター機能を付与
する。しかしながら、ヒトへの使用のためには、そのよ
うなキメラ抗体は、元のゲッ歯動物の抗体よりも十分な
臨床学的利点を有さない。
【０００５】キメラ抗体の免疫原性は、また相補的決定
領域（ＣＤＲ）と呼ばれるゲッ歯動物の超可変部を、再
形状化されたヒト抗体をもたらすヒトＬ及びＨ鎖可変部
ドメインの骨格中に移植することによってさらに減じら
れ得る。この技法は、“一般的”なヒトＨ及びＬ鎖可変
ドメイン内でのそれらの存在のために抗原特異的ゲッ歯
動物のＣＤＲ配列の置換又は組換え移植を包含する（ヨ
ーロッパ特許出願第２３９，４００号）。この技術はヒ
ト抗体への抗原結合部位の臨界及び主要部分をトランス
ファーするであろうことが推定される。
【０００６】天然の損なわれていない免疫グロブリン又
は抗体は一般的に、個々の上部アームの末端で抗原結合
部位を有するＹ形状テトラマー分子を含んで成る。抗原
結合部位は、Ｌ鎖の可変ドメインに関連するＨ鎖の可変
ドメインから成る。より詳しくは、抗体の抗原結合部位
は、Ｈ鎖（ＶH ）の可変ドメインの３ＣＤＲ及びＬ鎖
（ＶL ）の可変ドメインの３ＣＤＲにより実質的に形成
される。ＶL 及びＶH の両者において、ＣＤＲは、下記
一般式（Ｉ）： ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ （Ｉ） 〔式中、ポリペプチド鎖はＮ−末端で始まり、そしてＣ
−末端で終結するように記載される〕で表わされるポリ
ペプチド鎖を形成する４種の骨格領域（ＦＲ）と共に交
互に並ぶ。ＶH 及びＶL のＣＤＲはまた、それぞれＨ
１，Ｈ２，Ｈ３及びＬ１，Ｌ２，Ｌ３としても言及され
る。ＦＲ又はＣＤＲを構成することに関する決定は通
常、同じ種に生じる多くの抗体のアミノ酸配列を比較す
ることによって行なわれ、そして同定のための一般的な
規則は当業界において知られている（“Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｋａｂａｔ Ｅ．
Ａ．など．，ＵＳ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅ
ａｌｔｈ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｐｕ
ｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）。
【０００７】最近、結合のエネルギー論にＬ鎖可変ドメ
インにより付与される貢献は、関連するＨ鎖可変ドメイ
ンにより付与される貢献に比較して小さく、そして単離
されたＨ鎖可変ドメインはそれら自体、抗原結合活性を
有することが見出された。そのような分子は通常、単一
のドメイン抗体として言及される（Ｗａｒｄ，Ｅ，Ｓ，
など．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１，５４４−５４６（１９
８９））。
【０００８】ＣＤＲは、ｂ−シート骨格にドメイン内で
連結されるループを形成する。アミノ酸配列とループの
構造との関係は標準的な構造モデルにより説明され得る
（Ｃｈｏｔｈｉａなど．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８８
７−８８３（１９８９））。このモデルによれば、抗体
は、個々の超可変領域のために少ない主要鎖コンホメー
ション又は“標準的な構造体”のみを有する。そのコン
ホメーションは、ＣＤＲにおける及び一定のループのた
めには、骨格領域における特異的部位での少々のキーア
ミノ酸残基の存在により決定される。異なった免疫グロ
ブリンに同じコンホメーションを有する超可変部が、そ
れらの部位で同じ又はひじょうに類似するアミノ酸残基
を有する。
【０００９】ＣＤＲ移植が、ゲッ歯動物のＣＤＲ−ドナ
ー抗体の親和性よりも有意に低い結合親和性を有する再
形状化されたヒト（又はヒト化された）抗体を生成する
いくつかのゲッ歯動物のモノクローナル抗体について実
施された。最近の発見は、ＣＤＲのトランスファーの他
に、ヒト配列の骨格内の変化はＣＤＲ−移植された生成
物に満足する抗原結合活性を提供するために必要である
ことを示している。
【００１０】Ｑｕｅｅｎなど．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００
３３（１９８９））は、ネズミ抗−Ｔａｃモノクローナ
ル抗体からのＣＤＲがヒト骨格中に移植され得ることを
開示する。ヒト骨格は、ネズミ配列との相同性を最大に
するように選択された。その著者は、ＣＤＲ又は抗原と
十分に相互作用するように選択されるＦＲ内に位置する
アミノ酸残基を同定するためにネズミ親抗体のコンピュ
ーターモデルを使用した。それらの残基はネズミ配列に
見出される残基に突然変異化された。ヒト化された抗−
Ｔａｃ抗体は、ネズミ抗−Ｔａｃ抗体の親和性のたった
約１／３の親和性を有し、そしてこの抗体のヒト特徴の
維持は不確実であった。
【００１１】驚くべきことには、ネズミＣＤＲ−ドナー
抗体の親和性にほぼ等しいか又は越える、抗原、すなわ
ちＩｇＥ結合親和性を有する、ヒトＩｇＥに対して向け
られた再形状化されたヒト抗体を生成することが可能で
あることが現在見出された。従って、順に超可変部ＣＤ
Ｒ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含んで成る抗原結合部位
を含んで成る、ＩｇＥに対して特異的な再形状化された
ヒトモノクローナル抗体、前記ＣＤＲ１がアミノ酸配列
Met-Tyr-Trp-Leu-Glu を有し、前記ＣＤＲ２がアミノ酸
配列Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-As
n-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala を有し、前記ＣＤＲ３が配列Ph
e-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-
Tyr-Phe-Asp-Tyr を有し、前記再形状化されたヒト抗体
がネズミＣＤＲ−ドナー抗体ＴＥＳ−Ｃ２１の親和性に
少なくともほぼ等しい抗原結合親和性を有し、前記再形
状化された抗体の直接的な同等物又は誘導体を提供する
ことが本発明の１つの目的である。配列番号１に示され
るアミノ酸配列において、ＣＤＲ１はアミノ酸３１から
３５であり、ＣＤＲ２はアミノ酸５０から６６であり、
そしてＣＤＲ３はアミノ酸９９から１１２である。ネズ
ミＣＤＲ−ドナー抗体はモノクローナル抗体ＴＥＳ−Ｃ
２１である。
【００１２】好ましくは、本発明は、ａ）順に超可変部
ＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含んで成る第１ドメ
イン；ここで前記ＣＤＲ１がアミノ酸配列Met-Tyr-Trp-
Leu-Glu を有し、前記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Glu-Ile-
Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Ph
e-Lys-Ala を有し、前記ＣＤＲ３が配列Phe-Ser-His-Ph
e-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr-Phe-Asp-
Tyr を有し；及び ｂ）順に超可変部ＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含
んで成る第２ドメイン；ここで前記ＣＤＲ１はアミノ酸
配列Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His を
有し、前記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Tyr-Ala-Ser-Glu-Se
r-Ile-Ser を有し、前記ＣＤＲ３がアミノ酸配列Gln-Gl
n-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr を有し；を含んで成る
抗原結合部位を含んで成る再形状化されたヒト抗体に関
し、ここで前記再形状化されたヒト抗体はネズミＣＤＲ
−ドナー抗体の親和性に少なくともほぼ等しい抗原結合
親和性を有し、さらに前記再形状化された抗体の直接的
な同等物又は誘導体にも関する。前記第１ドメインのＣ
ＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、配列番号１に同定さ
れる配列のタンパク質のＣＤＲである。第２ドメインの
ＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、配列番号３に示さ
れるアミノ酸配列におけるそれぞれのアミノ酸２４〜３
４，５０〜５６及び８９〜８７である。
【００１３】抗原結合部位が第１及び第２ドメインの両
者を含む場合、それらは同じポリペプチド鎖上に位置
し、又は好ましくは、個々のドメインは異なった鎖上に
存在し、第１ドメインは免疫グロブリンＨ鎖又はそのフ
ラグメントの部分であり、そして第２ドメインは免疫グ
ロブリンＬ鎖又はそのフラグメントの部分である。本発
明によれば、再形状化されたヒト抗体は、（１）それが
個々の存在する鎖がヒト様骨格を含んで成る少なくとも
１つの抗原結合部位を含んで成り、そして（２）存在す
るいづれかの不変部がヒト免疫グロブリン不変部と少な
くとも実質的に相同であるか又は好ましくはそれと同一
であることで特徴づけられる分子に関する。本明細書で
使用される場合、“ヒト様骨格”とは、特にヒト免疫グ
ロブリン配列の骨格におけるアミノ酸と同一の少なくと
も約７０又はそれ以上、好ましくは少なくとも約７５又
はそれ以上のアミノ酸を含んで成る、骨格部分ＦＲ１，
ＦＲ２，ＦＲ３及びＦＲ４の配列から成る骨格である。
従って、たぶん再形状化されたヒト抗体のＣＤＲを除く
すべての部分は、１又は複数天然のヒト免疫グロブリン
配列の対応する部分と実質的に相同である。たとえば再
形状化されたヒト抗体は、ネズミ可変部及びヒト不変部
を含んで成るキメラ性抗体を包含しないであろう。
【００１４】ヒト様骨格は、特定のヒト免疫グロブリン
の骨格と同一であり、又は好ましくは、特定のヒト骨格
とは異なり、すなわち限定された数のアミノ酸残基が挿
入され、欠失され又は他のアミノ酸残基により置換され
得る。そのような変性は、単一のＦＲ、すなわちＦＲ
１，ＦＲ２，ＦＲ３又はＦＲ４に制限され、又は２，３
又はすべてのそれらの４種のＦＲを包含する。たとえば
ヒト受容体骨格内の疎水性アミノ酸は、他のアミノ酸に
より置換され得、好ましくはまた疎水性アミノ酸、たと
えば相同アミノ酸は２つのアミノ酸により置換され得、
又は欠失され得る。同様に、ヒト骨格内の親水性アミノ
酸は、他のアミノ酸、２種のアミノ酸により置換され
得、又は欠失され得、それによって、置換するアミノ酸
は好ましくは、元の骨格の水素結合構造を維持する。そ
のような変性は、“手探り法”基礎に基づいて行なわ
れ、すなわちその効果は、創造された再形状化されたヒ
ト抗体の抗原−結合親和性と、ネズミＣＤＲ−ドナー抗
体ＴＥＳ−Ｃ２１の親和性とを比較することによって評
価される。抗原結合親和性の決定のために適切なアッセ
イは下記に記載される。
【００１５】特に、選択されたヒト受容体骨格内の制限
された数のアミノ酸残基、好ましくは１〜１２個の残基
が、ネズミモノクローナル抗体（ヒトＨネズミ交換）、
特にネズミ抗体ＴＥＳ−Ｃ２１において対応する部位で
存在するアミノ酸残基、及び／又は異なったヒト抗体
（ヒトＨヒト交換）において対応する部位で存在するア
ミノ酸残基により置換され得る。好ましくは、アミノ酸
の予想される置換は、抗原結合及び／又はＶL ／ＶH パ
ッキングのためにたぶん重要なものとして見なされる特
定の骨格残基の従来の同定に基づかれている。そのよう
な重要なアミノ酸は、それらの特定の性質及び／又は位
置のために、 −抗体のＣＤＲ内のアミノ酸と接触し、又はそのアミノ
酸近くに位置すると思われ； −抗原との臨界的な相互作用に包含され； −対のＶH ／ＶL 構造の全体の統合性を維持し、ＶH 及
びＶL ドメイン内での又はそれらの間での相互作用に直
接的に又は間接的に影響を及ぼすことに包含されると思
われる骨格残基を含む。
【００１６】いわゆる決定的なアミノ酸の同定のために
適切であることが知られている方法は分子造形法を包含
する。たとえば抗原結合部位の分子モデルは創造され、
そして一般的に入手でき、そして当業者に良く知られて
いるコンピュータープログラムを用いることによってコ
ンピューターモニター上に示され得る。特に、再形状化
された本発明の抗体の企画は、次の段階を含んで成る： ａ）配列番号１及び３に示されるアミノ酸配列及び配列
調和により高い相同性であることが決定されているネズ
ミ抗体のその対応する解決された構造に基づいてのネズ
ミ抗体ＴＥＳ−Ｃ２１のＶL 及びＶH のためのもっとも
らしい分子モデルの構成。前記解決された構造は、同じ
ネズミ抗体又は２種の異なったネズミ抗体に起因する。 ｂ）既知のヒト免疫グロブリン配列、たとえば市販され
ているデータベース、たとえばＫＡＢＡＴデータベース
（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏ
ｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓ
ｔ”，Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．など．，ＵＳ ｄｅｐａｒ
ｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｈｕｍａｎ
ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ ｓｅ
ｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から得られる配列のＶH 及びＶL
からの適切なヒト受容体骨格の選択。適切なヒト受容体
骨格は、データベースにおける配列に比較して、抗体Ｔ
ＥＳ−Ｃ２１のＶH 及びＶL ドメインに対して高い相同
性であり、好ましくは、異常に相同性である特定の免疫
グロブリンからの骨格、又は最っとも好ましくは、抗体
ＴＥＳ−Ｃ２１のＶH 及びＶL ドメインに対して高い相
同性である多くのヒト抗体からのコンセンサス骨格であ
る。移植のために選択されるＨ及びＬ鎖骨格配列は同じ
ヒト抗体に由来される必要はなく、好ましくは異なった
ヒト抗体に由来される。 ｃ）ネズミＴＥＳ−Ｃ２１のＣＤＲ及び式Ｉの選択され
たヒト受容体骨格からのＦＲを含んで成る再形状化され
たヒト抗体のＶH 及びＶL の分子モデルの構成。 ｄ）段階ａ）及びｃ）で得られた分子モデルの比較。
【００１７】本発明の再形状化されたヒト抗体において
は、１つ、いくつかの又はすべての同定された重要なア
ミノ酸残基は、他のアミノ酸残基、特に抗体ＴＥＳ−Ｃ
２１の特定部位に存在する残基により置換され得る。好
ましくは、選択されたヒト骨格内の“元の”アミノ酸残
基は、それが推定される標準的な構造体の一部又は超可
変ループの構造の決定において重要である場合、置換さ
れない。しかしながら、アミノ酸残基の置換は、重要な
アミノ酸に限定され得ない。好ましくは、重要でない残
基に影響を及ぼす変化は、ヒト−ヒトタイプの変化であ
る。
【００１８】本発明の再形状化されたヒト抗体におい
て、アミノ酸Ｃｙｓは−Ｓ−Ｓ−橋を形成する酸化され
た状態で存在できる。本発明により提供される再形状化
されたヒト抗体の例は、単一のドメイン抗体、一本鎖の
抗体及び損なわれていない複数鎖、たとえばテトラマー
抗体（十分な長さのＨ及びＬ鎖及びそのいづれかのフラ
グメント、たとえばＦｖ，Ｆ（ａｂ′）2 及びＦａｂフ
ラグメントを含んで成る）を包含する。
【００１９】単一のドメイン抗体は、単一のドメインを
含んで成る単一の抗原結合部位を含んで成る。一本鎖抗
体（またｓｃＦｖとも称する）は、Ｈ及びＬ鎖の可変ド
メインから実質的に成る。好ましくは、それらの可変ド
メインは、約１０〜３０個、特に約１５個のアミノ酸、
たとえばグリシン及びセリンから選択されたアミノ酸を
含んで成る短いペプチドリンカーを通して共有結合され
る。好ましいペプチドリンカーは、Gly-Gly-Gly-Gly-Se
r の３種の反復性単位から成る１５個のアミノ酸ポリペ
プチドである。一本鎖抗体は、いづれかのＨ又はＬ鎖の
不変部を含まない。
【００２０】本発明の再形状化されたヒト抗体はＩｇＥ
に対して特異的であり、すなわちそれはヒトＩｇＥのイ
ソタイプ決定基に対して向けられる。従って、本発明の
抗体はＩｇＥ種の免疫グロブリンに共通するＨ鎖上の抗
原決定基を認識し、すなわちそれは異なった特異性のＩ
ｇＥ分子と反応するが、しかし他のイソタイプの免疫グ
ロブリン又は免疫グロブリンＬ鎖とは反応しない。
【００２１】本発明の再形状化された抗体は、ネズミＴ
ＥＳ−Ｃ２１の親和性に少なくともほぼ等しいＩｇＥ−
結合親和性を有する必要がある。今後本明細書で使用さ
れる場合、用語“少なくともほぼ等しい”とは、再形状
化されたヒト抗体（試験抗体）のＩｇＥ−結合親和性が
統計学的基礎に基づいて、対照抗体ＴＥＳ−Ｃ２１の少
なくとも約９０％、好ましくは９０％以上、特に約１０
０％〜約２５０％以内である。再形状化された抗体は、
ＴＥＳ−Ｃ２１の対応する構造に対して比較されるべき
である。たとえば、再形状化された抗体が単一のドメイ
ン抗体である場合、その親和性は単一のドメインＴＥＳ
−Ｃ２１に関連づけられるべきである。このネズミ単一
ドメイン抗体は、配列番号１及び３に与えられる情報に
基づいて容易に調製され得る。この記載において、抗体
の“親和性”又は“結合活性”間には区別がないが、し
かし用語“親和性”とは親和性又は結合活性のいづれか
を言及すべきである。
【００２２】対照及び形状化された試験抗体の親和性の
決定は、同じ態様で、すなわち同じアッセイにおいて同
一の条件下で行なわれるべきである。お互い比較される
場合、抗体は、同じ程度の純度を有すべきである。高く
精製された抗体を使用することが好ましい。ＩｇＥのた
めの抗体の結合親和性は、既知の技法及び法則に基づい
て、当業者により容易に確立され得る適切な定量アッセ
イを用いて決定される。
【００２３】決定されるべき適切なパラメーターは、平
衡定数Ｋaff （親和性定数）である。種々の数学的等式
が、抗体−抗原相互作用のための親和性定数の実験的計
算を促進するために開発された。Ｋaff の測定のための
適切な実験方法は、たとえば競争ラジオイムノアッセイ
（ＲＩＡ）又は競争酵素結合イムノアドソーベントアッ
セイ（ＥＩＡ）による結合された抗原：遊離抗原の比の
測定、又はＢｅａｔｔｙなど．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
Ｍｅｔｈ．１００，１７３〜１７９（１９８７））によ
り記載される非競争固相ＥＩＡによる合計の抗体濃度の
測定に依存する。
【００２４】好ましくは、Ｋaff は、ＣＭ５表面チップ
を用いてのＢＩＡコア（ＴＭ）システム上でＩｇＥ抗原
と抗体との即時の生物特異的相互反応（Ｊｏｎｓｓｏ
ｎ，Ｕ．など．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１，
６２０〜６２７（１９９１））を分析することにより決
定される。そのアッセイは製造業者の指針に従って実質
的に行なわれ、そして動定数Ｋass 及びＫdissの測定を
包含する。適切な抗原は、Ｓｅｒｏｔｅｃにより供給さ
れる市販のヒトＩｇＥ（たとえばＢＰ０９４，Ｄｏｔｌ
ｉｋｏｎ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）又はヒト不変部を
有するキメラ性抗体、たとえばＳＥ４４（Ｓｕｎな
ど．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０９，２８９９（１
９８９））である。特に、このアッセイは、次のことを
含んで成る実験サイクルを包含する： １）化学的手段によるチップ表面上へのいわゆる捕獲抗
体の固定化、すなわちネズミ抗体ＴＥＳ−Ｃ２１を含む
測定のためには、抗−マウス抗体、たとえば抗−マウス
ＩｇＧが、又は本発明の再形状化された抗体を含む測定
のためには、抗−ヒト抗体、たとえば抗−ヒトＩｇＧが
使用され、 ２）固定された捕獲抗体への対照又は試験抗体の結合、 ３）一定濃度の抗原と結合された対照又は試験抗体との
接触。
【００２５】好ましくは、いくつかの、たとえば４回の
実験サイクルが、一定量の結合された抗体を用い、そし
てＩｇＥの（既知）濃度を変えることで行なわれる。個
々のサイクルの完結後、その表面を、たとえば酸、たと
えばＨＣｌにより再生する。本発明の再形状化された抗
体の企画は、低い、好ましくは１．９×１０-5／ｓ又は
それ以下の低い解離速度（Ｋdiss）と組合して、高い、
好ましくは２．５×１０5 Ｍ-1／ｓ又はそれ以上の高い
会合速度（Ｋass ）を示す抗体を構成することを目的と
する。
【００２６】本明細書で使用される場合、本発明の再形
状化されたヒト抗体の直接的な同等物は、配列番号１に
示されるようなＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３及び場
合によっては、配列番号３に示されるようなＣＤＲ１，
ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を順に含んで成る再形状化された
ヒト抗体であり、ここで１つの可変ドメイン内で、ＣＤ
Ｒ内での４個までのアミノ酸残基、すなわちＣＤＲ内の
１，２，３又は４個のアミノ酸か他のアミノ酸により置
換される。従って、用語“その直接的な同等物”とは、
単一ドメインの再形状化されたヒト抗体（タンパク質
Ｙ）： （１）ここで、全体として取られる超可変部ＣＤＲ１，
ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は配列番号１に示されるようなＣ
ＤＲに少なくとも９０％相同性であり、そして、 （２）タンパク質ＹのＦＲと同一のＦＲを有し、しかも
配列番号１におけるＣＤＲと同一のＣＤＲを有する本発
明の対照タンパク質の親和性に少なくともほぼ等しい、
ＩｇＥのための親和性を有し；又は結合部位当たり２つ
のドメインを有する再形状化された抗体（タンパク質
Ｙ′）： （１）ここで全体として取られる超可変部ＣＤＲ１H ，
ＣＤＲ２H ，ＣＤＲ３H及びＣＤＲ１L ，ＣＤＲ２L ，
ＣＤＲ３L は配列番号１及び３に示されるようなＣＤＲ
に少なくとも８０％、好ましくは９０％相同性であり、
そして、 （２）タンパク質Ｙ′のＦＲ及び不変部と同一のＦＲ及
び不変部を有し、しかも配列番号１及び３における超可
変部と同一の超可変部ＣＤＲ１H ，ＣＤＲ２H ，ＣＤＲ
３H 及びＣＤＲ１L ，ＣＤＲ２L ，ＣＤＲ３L を有する
本発明の対照タンパク質の親和性に少なくともほぼ等し
い、ＩｇＥのための親和性を有する。
【００２７】後者の基準は、たとえば上記方法に従っ
て、Ｋaff を決定することによって試験され得る。ネズ
ミモノクローナル抗体ＴＥＳ−Ｃ２１は、本発明の再形
状化されたヒト抗体にも共通する次の特徴（特に）を示
す： −それはＦｃe 受容体Ｉ又はIIを生む細胞へのＩｇＥの
結合を阻害し； −ヒトＩｇＥ分泌細胞に特異的に結合し； −Ｆｃe 受容体Ｉ又はIIを生む細胞、たとえば感作され
た肥満細胞及び好塩基性細胞の表面上に結合されるＩｇ
Ｅを認識せず、そして結合せず； −メディエーター（たとえばヒスタミン）開放のきっか
けを生ぜしめず、 −免疫応答におけるＩｇＥ形成を阻害する。
【００２８】それらの特徴的能力は、当業者において知
られている方法、たとえば引用により本明細書に組込ま
れるヨーロッパ特許出願第３９６５０５号に開示される
方法により決定され得る。本発明の好ましい再形状化さ
れた抗体、又はその誘導体は、（ａ）順に超可変部ＣＤ
Ｒ１H ，ＣＤＲ２H 及びＣＤＲ３H 並びにヒトＨ鎖の不
変部又はそのフラグメントを含んで成る１つの免疫グロ
ブリンＨ鎖又はそのフラグメント；ここで前記ＣＤＲ１
H はアミノ酸配列Met-Tyr-Trp-Leu-Glu を有し、前記Ｃ
ＤＲ２H がアミノ酸配列Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-
Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala を有し、前
記ＣＤＲ３H がアミノ酸配列Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-
Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr を有
し；及び（ｂ）順に超可変部ＣＤＲ１L ，ＣＤＲ２L 及
びＣＤＲ３L を含んで成るＬ鎖可変ドメイン並びにヒト
Ｌ鎖の不変部又はそのフラグメントを含んで成る１つの
免疫グロブリンＬ鎖又はそのフラグメント；ここで前記
ＣＤＲ１L がアミノ酸配列Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gl
y-Thr-Asn-Ile-His を有し、前記ＣＤＲ２L がアミノ酸
配列Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser を有し、前記ＣＤＲ
３L がアミノ酸配列Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-
Thr を有する：を少なくとも含んで成る。
【００２９】免疫グロブリンＨ又はＬ鎖のフラグメント
は、十分な長さの鎖ではなく、そして可変ドメイン及び
場合によっては鎖の不変部の一部を含んで成るＨ又はＬ
鎖である。より好ましくは、本発明の再形状化されたヒ
ト抗体又はその誘導体は、（ａ）１位でのアミノ酸で開
始し、そして１２３位でのアミノ酸で終結する配列番号
１１に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有
する可変ドメイン及びヒトＨ鎖の不変部を含んで成る１
つのＨ鎖；及び（ｂ）１位でのアミノ酸で開始し、そし
て１０７位でのアミノ酸で終結する配列番号５に示され
る配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメ
イン及びヒトＨ鎖の不変部を含んで成る１つのＬ鎖を少
なくとも含んで成る。
【００３０】特に好ましくは、本発明の再形状化された
ヒト抗体又はその誘導体は、（ａ）１位でのアミノ酸で
開始し、そして１２３位でのアミノ酸で終結する配列番
号１３に示される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を
有する可変ドメイン及びヒトＨ鎖の不変部を含んで成る
１つのＨ鎖；及び（ｂ）１位でのアミノ酸で開始し、そ
して１０７位でのアミノ酸で終結する配列番号５に示さ
れる配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ド
メイン及びヒトＨ鎖の不変部を含んで成る１つのＬ鎖を
含んで成る。
【００３１】本明細書に与えられる残基は、アミノ酸残
基の数字に対応する。ヒトＨ鎖の不変部は、イソタイプ
α（ａ），δ（ｄ），γ（ｇ）又はμ（μ）のいづれか
から選択され得る。種々のサブクラス、たとえばＩｇＧ
サブクラスのＨ鎖が使用され得る。ヒトｇ１鎖の不変部
が好ましい。異なったクラス及びサブクラスのＨ鎖が異
なったエフェクター機能に関与し、そして従って、Ｈ鎖
不変部のタイプを選択することによって、所望するエフ
ェクター機能を有する再形状化されたヒト抗体が生成さ
れ得る。Ｌ鎖の不変部は、ラムダ（ｌ）又は好ましくは
カッパ（ｋ）鎖である。
【００３２】細胞系ＥＨ３１．８により生成される、Ｈ
３Ｌ１と命名された再形状化されたヒト抗体が最っとも
好ましい。本発明はまた、本発明の再形状化されたヒト
抗体の誘導体にも関する。再形状化されたヒト抗体の誘
導体は、前記抗体の抗原特異性を有する。本発明によれ
ば、誘導体とは、本発明の抗体の変性、たとえば吸着又
は化学的変性により得られるいづれかの分子であること
を意味する。たとえば、誘導体の意図された使用に依存
して、本発明の抗体は、他のタンパク質性又は非タンパ
ク質性分子の共有又は非共有結合により誘導体化され得
る。抗体接合体をもたらす共有結合は、たとえば当業界
において知られているカップリング技法を用いて達成さ
れる。そのような接合体において、抗体はスペーサー又
はリンカー基により又は直接的に、接合パートナーに結
合される。誘導体の例は、放射性ラベルされた再形状化
されたヒト抗体、及びたとえば酵素、螢光又は化学発光
マーカー、適切な細胞毒性又は細胞増殖抑制性物質、金
属キレート、酵素でないタンパク質、たとえばアビジ
ン、又は非タンパク質性分子、たとえばビオチンと本発
明の再形状化されたヒト抗体との接合体である。
【００３３】本発明の抗体接合体のために使用される酵
素は、たとえばホースラディシュペルオキシダーゼ、ア
ルカリホスファターゼ、ｂ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カルボニッ
クアンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾ
チーム、マレートデヒドロゲナーゼ、又はグルコース−
６−ホスフェートデヒドロゲナーゼである。
【００３４】螢光マーカーは、フルオレセイン、フルオ
ロクロム、ロダミン及び同様のものを包含する。化学発
光マーカーは、たとえばルミノールのアクリジニウムエ
ステルである。金属キレートの例は、エチレンジアミン
四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン六酢酸（Ｄ
ＰＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカ
ン、１，４，８，１１−テトラアザテトラデカン−１，
４，８，１１−四酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１
５−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四
酢酸、又は同様のものである。
【００３５】本発明の放射性ラベルされた抗体又はその
フラグメントは、たとえば放射性沃素（ 123Ｉ，
125Ｉ， 131Ｉ）、トリチウム（ 3Ｈ）、炭素
（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、イットニウム（90Ｙ）、テク
ネチウム（ 99mＴｃ）又は同様のものを含む。本発明は
さらに、抗−ＩｇＥ形状化されたヒト抗体、その直接的
な同等物及びその誘導体の製造方法にも関する。
【００３６】本発明の再形状化されたヒト抗体、その直
接的な同等物又はその誘導体は、本発明のタンパク質を
生成する下記にさらに定義されるような適切な宿主細胞
が、インビトロ又はインビボで操作され、そして必要に
より、その所望するタンパク質が単離され、そしてその
誘導体に任意に転換されることを特徴とする、それ自体
既知の方法により調製される。本発明のタンパク質は、
いづれかの適切な形質転換できる宿主を前記タンパク質
の発現を可能にする条件下で培養し、前記タンパク質を
単離し、そして場合によっては、前記単離されたタンパ
ク質を、たとえばタンパク質加水分解により本発明のも
う１つのタンパク質に、又はたとえば他の化合物、たと
えば上記のようなタンパク質又は非タンパク質性分子の
結合により本発明の誘導体に転換することを含んで成る
方法により調製され得る。
【００３７】本発明の好ましい態様においては、（１）
下記に定義されるような本発明の第１及び第２ＤＮＡ構
造体により形質転換された適切な宿主細胞を培養し、そ
して（２）その培養物から活性抗−ＩｇＥ再形状化され
たヒト抗体を回収することを含んで成る、複数鎖抗−Ｉ
ｇＥ再形状化ヒト抗体の生成方法が提供される。複数鎖
抗体は、Ｈ及びＬ鎖可変ドメインを含んで成る少なくと
も１つの抗原結合部位を含んで成る抗体である。
【００３８】他方、Ｈ及びＬ鎖は別々に回収され、そし
てインビトロでの折りたたみの後、活性抗体に再構成さ
れ得る。適切な再構成法は当業界において良く知られて
いる。従って、本発明の複数鎖抗体の製造方法はまた： （１）本発明の第１ＤＮＡ構造体により形質転換される
第１宿主細胞を培養し、そしてその培養物から前記Ｈ鎖
又はそのフラグメントを回収し、そして（２）本発明の
第２ＤＮＡ構造体により形質転換される第２宿主細胞を
培養し、そしてその培養物から前記Ｌ鎖又はそのフラグ
メントを回収し、そして（３）（１）で得られるＨ鎖又
はそのフラグメント及び（２）で得られるＬ鎖又はその
フラグメントから活性抗−ＩｇＥ再形状化抗体をインビ
トロで再構成することを含んで成る。
【００３９】類似する態様において、（１）本発明の一
本鎖又は単一ドメインの再形状化されたヒト抗体をそれ
ぞれコードするＤＮＡ構造体により形質転換される宿主
細胞を培養し、そして（２）前記培養物から前記ペプチ
ドを回収することを含んで成る本発明の一本鎖又は単一
ドメインの再形状化されたヒト抗体の製造方法がまた提
供される。
【００４０】再形状化されたヒト抗体のフラグメント、
たとえばＦａｂ，Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）2 フラグメ
ントは、上記のような組換えＤＮＡ技法により、又は酵
素、たとえばパパイン又はペプシンによる消化及び／又
は化学的還元によるジスルフィド結合の分解によるそれ
自体既知の方法により、上記で調製された損なわれてい
ない複数鎖の再形状化されたヒト抗体から調製され得
る。
【００４１】適切な宿主は、真核細胞、たとえば動物細
胞、植物細胞及び菌類、及び原核細胞、たとえばグラム
陽性及びグラム陰性細菌、たとえばＥ．コリを包含す
る。好ましい真核宿主細胞は、哺乳類起源の細胞及び酵
母細胞である。今後使用される場合、インビトロとはエ
クス ビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）を意味し、従ってたとえ
ば細胞培養及び組織培養条件を包含する。
【００４２】たとえば、インビトロでの哺乳類細胞の増
殖は、通常の市販の培養培地、たとえばダルベッコ変性
イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＲＰＭＩ１６４０（哺乳
類血清、たとえばウシ胎児血清、又は微量元素及び増殖
維持補充物、たとえば支持物細胞、たとえば正常なマウ
ス腹腔滲出細胞、脾臓細胞、骨髄マクロファージ、２−
アミノエタノール、インシュリン、トランスフェリン、
低密度リポタンパク質、オレイン酸又は同様のものによ
り任意に補充されている）である適切な培養培地におい
て行なわれる。
【００４３】インビトロ生成は、比較的純粋な抗体調製
物を供給し、そして多量の所望する抗体の大規模産生を
可能にする。細菌細胞、酵母及び哺乳類細胞の培養のた
めの技法は当業界において知られており、そしてたとえ
ばエアーリフト反応器又は連続撹拌反応器における均質
懸濁培養、又はたとえば中空繊維、マイクロカプセルに
おいて、アガロース微小ビース又はセラミックカートリ
ッジ上での固定された又は捕獲された細胞培養を包含す
る。
【００４４】本発明の多量の所望する再形状化されたヒ
ト抗体はまた、哺乳類細胞をインビボで増殖することに
よっても得られる。このためには、所望する抗体を生成
するハイブリドーマ細胞が組織適合性哺乳類中に注入さ
れ、抗体産生腫瘍の増殖が引き起こされる。場合によっ
ては、動物は、注入の前、炭化水素、特に鉱油、たとえ
ばプリスタン（テトラメチルペンタデカン）により感作
される。１〜３週間後、抗体がそれらの哺乳類の体液か
ら単離される。たとえば所望する抗体を生成するハイブ
リドーマ細胞系Ｓｐ２／０に由来するトランスフェクト
された細胞が、プリスタンにより任意に予備処理された
Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注入され、そして１〜２
週間後、腹水が動物から採取される。
【００４５】細胞培養上清液が、所望する再形状化され
たヒト抗体について、抗原としてヒトＩｇＥを用いて、
好ましくは酵素イムノアッセイ、たとえばサンドイッチ
アッセイ又はドットアッセイ、又はラジオイムノアッセ
イによりスクリーンされる。たとえばサンドイッチ酵素
イムノアッセイは、正しくアセンブリーされた免疫イム
ノグロブリンが細胞培養上清液に存在するかどうかを決
定するために使用され得、それによってＬ鎖ヒト不変部
ｋ又はｌ（適切な場合）に向けられた抗体及び所望する
サブクラス９Ｈ鎖ヒト不変部に向けられた他の抗体が使
用され、その１つは固体支持体に被覆され、そして他の
１つは適切な酵素基質による検出を可能にする酵素に接
合される。そのようなイムノアッセイは、酵素結合イム
ノアドゾーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、ここ
で適切なキャリヤー、たとえばプラスチック製マイクロ
タイタープレートが免疫グロブリンＥにより被覆され、
そして試験されるべき培養上清液と共にインキュベート
される。結合されたモノクローナル抗体は、上清液にお
ける抗−ＩｇＥ抗体を認識する酵素ラベルされた抗体と
共にインキュベートし、そして適切な酵素基質溶液の続
く添加により検出される。酵素基質反応は、たとえば眼
又は光学的測定装置により観察され得る色彩の変化をも
たらす。
【００４６】再形状化されたヒト抗体の単離のために
は、培養上清液又は腹水における免疫グロブリンが、硫
酸アンモニウムによる沈殿化、吸湿性材料、たとえばＰ
ＥＧに対する透析、選択膜を通しての濾過又は同様の手
段により濃縮され得る。必要なら及び／又は所望なら、
抗体は通常のクロマトグラフィー法、たとえばゲル濾
過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用ク
ロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィ
ー、たとえばイムノアフィニティークロマトグラフィー
により精製される。好ましくは、再形状化されたヒト抗
体は、クロマトグラフィー精製段階、たとえばプロティ
ンＡ（本発明の抗体がＦｃ部分を含む場合）によるアフ
ィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグ
ラフィー及び／又はゲル濾過を含んで成る方法により、
それらを含む細胞上清液から単離される。
【００４７】本発明の再形状化されたヒト抗体誘導体
は、それ自体既知の方法により、たとえば他の化合物へ
の再形状化されたヒト抗体の吸着により、又は化学的に
結合された接合体を供給するカップリングにより調製さ
れる。タンパク質、たとえば酵素と本発明の抗体との接
合体は、たとえば上記のようにして調製された抗体とタ
ンパク質とを、カップリング剤、たとえばグルタルアル
デヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ，Ｎ′−ｏ−フェニレンジマ
レイミド、Ｎ−（ｍ−マレイミドベンゾイルオキシ）−
スクシンイミド、Ｎ−（３−〔２′−ピリジルジチオ〕
−プロピオンオキシ）−スクシンイミド、Ｎ−エチル−
Ｎ′−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミ
ド又は同様のものの存在下で反応せしめることによって
調製される。螢光又は化学発光マーカーとの接合体は、
カップリング剤、たとえば上記に列挙されるものの存在
下で、イソチオシアネート、好ましくはフルオレセイン
−イソチオシアネートとの反応により調製される。
【００４８】ヨウ素（ 123Ｉ， 125Ｉ， 131Ｉ）により
放射性ラベルされた再形状化抗体は、それ自体既知の方
法に従ってのヨウ素化により、たとえば放射性ヨウ化ナ
トリウム又はカリウム及び化学酸化剤、たとえば次亜塩
素酸ナトリウム、クロラミンＴ又は同様のもの、又は酵
素酸化剤、たとえばラクトペルオキシダーゼ又はグルコ
ースオキシダーゼ及びグルコースにより本発明の抗体か
ら得られる。本発明の抗体又はフラグメントは、たとえ
ばジエチレントリアミン六酢酸（ＤＰＴＡ）−キレート
化によりイットニウム（90Ｙ）に結合される。テクネチ
ウム−９９ｍによりラベルされた抗体又はフラグメント
は、リガンド交換方法、たとえば錫イオン溶液によるペ
ルテクネート（ＴｃＯ4 - ）の還元、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
カラム上での前記還元されたテクネチウムのキレート化
及びこのカラムへの抗体の適用、又は直接的なラベリン
グ技法、たとえばペルテクネート、還元剤、たとえばＳ
ｎＣｌ2 、緩衝溶液、たとえばナトリウム−カリウムフ
タレート溶液、及び本発明の抗体のインキュベーション
により調製される。
【００４９】タンパク質への本発明の抗体の接合はま
た、組換えＤＮＡ技法、たとえば下記に説明される技法
により直接的に調製され得る。再形状化されたヒト抗
体、その直接的な同等物又はその誘導体を生成するため
の方法は、親和性及び特異性の決定のために十分な量で
所望するタンパク質を生成する。
【００５０】本発明はまた、本発明の再形状化されたヒ
ト抗体及びその直接的な同等物をコードする組換えＤＮ
Ａにも関する。ひじょうに一般的な態様において、本発
明の単一ドメイン再形状化ヒト抗体、本発明の一本鎖再
形状化ヒト抗体、本発明の再形状化ヒト抗体のＨ又はＬ
鎖又はそのフラグメントをコードするＤＮＡ分子が供給
される。定義によれば、そのようなＤＮＡは、コードす
る一本鎖ＤＮＡ、前記コードＤＮＡ及びそれに対しての
相補的ＤＮＡから成る二本鎖ＤＮＡ又はそれらの相補的
（一本鎖）ＤＮＡ自体を含んで成る。より詳しくは、本
発明は、下記に記載されるような第１及び第２ＤＮＡ構
造体に関する。
【００５１】第１のＤＮＡ構造体はＨ鎖又はそのフラグ
メントをコードし、そしてａ）選択的にＦＲ及びＣＤＲ
を含んで成る可変ドメインをコードする第１部分、ここ
で前記ＣＤＲは順にＣＤＲ１H ，ＣＤＲ２H 及びＣＤＲ
３H であり、配列番号１におけるそのアミノ酸配列がそ
れぞれ３１〜３５位、５０〜６６位及び９９〜１１２位
であり；この第１部分は可変ドメインの最初のアミノ酸
をコードするコドンで開始し、そして可変ドメインの最
後のアミノ酸をコードするコドンで終結し；及び場合に
よっては、 ｂ）Ｈ鎖の不変部の最初のアミノ酸をコードするコドン
で開始し、そして前記不変部又はそのフラグメントの最
後のアミノ酸をコードするコドンで終結し、続いてナン
センスコドンが続く、ヒトＨ鎖不変部又はそのフラグメ
ントをコードする第２部分を含んで成る。好ましくは、
この第１部分は、１位でのアミノ酸で開始し、そして１
２３位でのアミノ酸で終結する、配列番号１３に示され
るアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する
可変ドメインをコードする。より好ましくは、第１部分
は、７９位でのヌクレオチドで始まり、そして４４７位
でのヌクレオチドで終結する、配列番号１３に示される
ヌクレオチド配列を有する。第２部分は、ゲノム起原の
ＤＮＡフラグメント（イントロンを含む）又はｃＤＮＡ
フラグメント（イントロンを含まない）であり得る。存
在するなら、ｇ１鎖の不変部をコードする第２部分が好
ましい。
【００５２】第２のＤＮＡ構造体はＬ鎖又はそのフラグ
メントをコードし、そしてａ）選択的にＦＲ及びＣＤＲ
を含んで成る可変ドメインをコードする第１部分、ここ
で前記ＣＤＲは順にＣＤＲ１L ，ＣＤＲ２L 及びＣＤＲ
３L であり、配列番号３におけるそのアミノ酸配列がそ
れぞれ２４〜３４位、５０〜５６位及び８９〜９７位で
あり；この第２部分は可変ドメインの最初のアミノ酸を
コードするコドンで開始し、そして可変ドメインの最後
のアミノ酸をコードするコドンで終結し；及び場合によ
っては、 ｂ）Ｌ鎖の不変部の最初のアミノ酸をコードするコドン
で開始し、そして前記不変部又はそのフラグメントの最
後のアミノ酸をコードするコドンで終結し、続いてナン
センスコドンが続く、ヒトＨ鎖不変部又はそのフラグメ
ントをコードする第２部分を含んで成る。好ましくは、
この第２部分は、１位でのアミノ酸で開始し、そして１
０７位でのアミノ酸で終結する、配列番号５に示される
アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可
変ドメインをコードする。より好ましくは、第２部分
は、８２位でのヌクレオチドで始まり、そして４０３位
でのヌクレオチドで終結する、配列番号５に示されるヌ
クレオチド配列を有する。第２部分は、ゲノム起原のＤ
ＮＡフラグメント（イントロンを含む）又はｃＤＮＡフ
ラグメント（イントロンを含まない）であり得る。存在
するなら、κ鎖の不変部をコードする第２部分が好まし
い。
【００５３】第１及び第２部分の両者を含んで成る第１
及び第２ＤＮＡ構造体が好ましい。この場合、第１及び
第２部分はイントロン配列により分離され得る。好都合
には、第１及び第２ＤＮＡ構造体は、第１部分の上流に
位置し、そしてリーダーペプチドをコードする第３部分
を含んで成り；この第３部分はリーダーペプチドの最初
のアミノ酸をコードするコドンで始まり、そしてそのペ
プチドの最後のアミノ酸をコードするコドンで終結す
る。適切なリーダーペプチドは、宿主生物により鎖の分
泌のために必要とされるペプチドであり、ここでそれら
は発現され、そして続いて宿主により除去される。好ま
しくは、第１及び第２ＤＮＡ構造体の第３部分は、免疫
グロブリン遺伝子のリーダーペプチドをコードする。最
っとも好ましくは、第１ＤＮＡ構造体の第３部分は、１
９位でのアミノ酸により始まり、そして１位でのアミノ
酸により終結する、配列番号１３に示される配列と実質
的に同一のアミノ酸を有するリーダーペプチドをコード
する。また、最っとも好ましくは、第２ＤＮＡ構造体の
第３部分は、２０位でのアミノ酸で始まり、そして１位
でのアミノ酸で終結する、配列番号５に示される配列と
実質的に同一のアミノ酸を有するリーダーペプチドをコ
ードする。
【００５４】本発明はまた、本発明の再形状化されたヒ
ト抗体の直接的な同等物をコードする組換えＤＮＡ、及
びタンパク質への本発明の抗体の接合体をコードする組
換えＤＮＡにも関する。技術の現情況は、当業者が本明
細書に提供される情報を付与する本発明のＤＮＡ分子；
すなわちＣＤＲのアミノ酸配列及び従ってＤＮＡ配列コ
ード（配列番号１及び３）を合成できるであろうような
情況である。本発明の再形状化されたヒト抗体の可変ド
メインをコードするＤＮＡ構造体を得るための適切な方
法は、多くのオリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ方法に
よるそれらの増幅及び所望するＤＮＡ配列を付与するた
めにそれらのスプライシングを含んで成る。可変ドメイ
ン遺伝子を構成するための他の方法は： −特異的なヒトモノクローナル抗体をコードする遺伝子
をクローニングし； −ＦＲ及びＣＤＲをコードするＤＮＡセグメントを決定
し； −ＣＤＲをコードするＤＮＡセグメントを除去し、その
結果、ＦＲをコードするＤＮＡセグメントが連結部での
適切な制限部位と一緒に融合し； −配列番号１及び３における上記で同定された配列に従
って二本鎖合成ＣＤＲカセットを調製し、ここで前記カ
セットは付着端を有し； −ＦＲの連結部で前記カセットを連結する（ヨーロッパ
特許第２３９，４００号）ことを含んで成る。
【００５５】所望により、本発明のＤＮＡ構造体は、種
々の良く知られた方法により、たとえばランダム変異を
誘発することによって又は特定部位変異誘発により変異
誘発され得る。本発明の再形状化されたヒト抗体をコー
ドするＤＮＡ構造体において、変異誘発はＣＤＲ内に位
置するいづれのアミノ酸の変更をも導びかない。本発明
の再形状化された抗体の直接的な同等物をコードするＤ
ＮＡ構造体においては、他のヌクレオチドによるヌクレ
オチドの置換が、１又は複数のＣＤＲにおけるアミノ酸
配列を変更することができる。
【００５６】本発明の再形状化された抗体の直接的な同
等物をコードするＤＮＡは、当業界において知られてい
る方法に従って、たとえば本発明の再形状化された抗体
をコードするＤＮＡのランダム又は部位特異的変異誘発
により調製され得る。不活性変異ではないが、しかしＣ
ＤＲ内に位置する少なくとも１つのアミノ酸残基の置換
をもたらす変異誘発は、このようにして生成されたタン
パク質が上記基準を満たす場合、本発明の再形状化され
た抗体の直接的な同等物をコードするＤＮＡを生成でき
る。
【００５７】明細書の次の部分で使用される場合、本発
明の再形状化されたヒト抗体とは、その直接的な同等物
を包含することを意味する。さらに本発明は、上記ＤＮ
Ａ構造体の少なくとも１種、たとえばＬ鎖可変ドメイン
及び／又はＨ鎖可変ドメインをコードする挿入体を含ん
で成るハイブリッドベクターである組換えＤＮＡにも関
し、ここで前記ベクターは、原核及び／又は真核宿主に
おいて複製できる。
【００５８】本発明の好ましいハイブリッドベクター
は、上記のようなＬ鎖をコードする挿入体及び／又は上
記のようなＨ鎖をコードする挿入体を含んで成る。本発
明のハイブリッドベクターは、複製又は自主的に複製す
る配列の起点、１又は複数の優先的なマーカー配列及び
場合によっては、発現制御配列、シグナル配列及び追加
の制限部位を含んで成る。
【００５９】好ましくは、本発明のハイブリッドベクタ
ーは、発現制御配列に操作可能的に連結される上記挿入
体、特にこの後に記載されるものを含んで成る。ベクタ
ーは典型的には、適合できる宿主細胞と共同して２種の
機能を行なう。１つの機能は、免疫グロブリン鎖をコー
ドする核酸のクローニングを促進し、すなわち有用な量
の核酸を生成することである（クローニングベクタ
ー）。他の機能は、染色体外要素としての維持により、
又は宿主染色体中への統合により、適切な宿主における
複製及び遺伝子構造体の発現を提供することである（発
現ベクター）。クローニングベクターは、上記のような
遺伝子構造体、複製又は自主的に複製する配列の起点、
選択マーカー配列及び場合によっては、シグナル配列及
び追加の制限部位を含んで成る。発現ベクターはさら
に、遺伝子の転写及び翻訳のために不可欠な発現制御配
列を含んで成る。
【００６０】複製又は自主的に複製する配列の起点は、
ＳＶ４０又は他のウィルス源に起因する外因性起点を含
むようにベクターを構成することにより、又は宿主細胞
の染色体機構により提供される。マーカーは、ベクター
を含む宿主細胞の選択を可能にする。選択マーカーは、
重金属、たとえば銅又は抗生物質、たとえばテトラサイ
クリン、アンピシリン、ゲネチシン（Ｇ−４１８）、ネ
オマイシン、カナマイシン又はヒグロマイシンに対する
耐性を付与する遺伝子、又は宿主細胞の遺伝的損傷、た
とえばチミジンキナーゼ、ヒポキカンチンホスホリルト
ランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、又は同
様のものの不在を補足する遺伝子を包含する。
【００６１】シグナル配列は、たとえば抗体の分泌を指
図するリーダーペプチドをコードするプレ配列又は分泌
リーダー、スプライスシグナル、又は同様のものであり
得る。発現制御配列として、ベクターＤＮＡは、プロモ
ーター、転写の開始及び停止及びｍＲＮＡの安定化のた
めに必要な配列及び場合によっては、エンハンサー及び
さらに調節配列を含んで成る。広範囲の種類のプロモー
ター配列が、宿主細胞の性質に依存して使用され得る。
強く且つ同時に、十分に調節されるプロモーターが最っ
とも有用である。翻訳の開始のための配列は、たとえば
シャイン・ダルガーノ配列である。転写の開始及び停止
及びｍＲＮＡの安定化のために必要な配列は、ウィルス
ｃＤＮＡ又はたとえば発現宿主からの真核ｃＤＮＡの非
コード５′−領域及び３′−領域からそれぞれ利用でき
る。エンハンサーは、ゲノム起原又はたとえばシミアン
ウィルス、ポリオーマウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス、
Ｍｏｌｏｎｅｙ肉腫ウィルス又は特にヒトサイトメガロ
ウィルスに由来するウィルス起原の転写−刺激ＤＮＡ配
列である。
【００６２】ベクターＤＮＡの種々のＤＮＡセグメント
は操作可能的に連結され、すなわちそれらは隣接し、そ
してお互い機能的な関係に配置されている。Ｅ．コリ株
における複製及び発現のために適切であるベクターの例
は、バクテリオファージ、たとえばλバクテリオファー
ジの誘導体又はプラスミドである。適切なベクターは、
完全なレプリコン、マーカー遺伝子、制限エンドヌクレ
アーゼのための認識配列（その結果、外来性ＤＮＡ及び
適切には、発現制御配列がそれらの部位で挿入され得
る）、及び場合によってはシグナル配列、及びエンハン
サーを含んで成る。本発明の発現ベクターは、ＤＮＡが
プロモーターにより制御されている、上記で定義された
適切なプロモーター及びＤＮＡ構造体を含んで成る発現
カセットを含んで成る。
【００６３】微生物プロモーターは、感温性リプレッサ
ーにより制御されるバクテリオファージλの強い左方向
プロモーターＰL である。Ｅ．コリプロモーター、たと
えばｌａｃリプレッサーにより調節され、そしてイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドにより誘発されたｌ
ａｃ（ラクトース）プロモーター、ｔｒｐリプレッサー
により調節され、そしてトリプトファン飢餓により誘発
されたｔｒｐ（トリプトファン）プロモーター、及びｌ
ａｃリプレッサーにより調節されたｔａｃ（ハイブリッ
ドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター）である。
【００６４】酵母における複製及び発現のために適切で
あるベクターは、酵母複製開始部及び酵母のための選択
遺伝子マーカーを含む。そのようなベクターの１つのグ
ループは、いわゆる、複製の起点としてのａｒｓ配列
（自立性複製配列）を含む。それらのベクターは、形質
転換の後、酵母細胞内での染色体外に保持され、そして
自立的に複製される。さらに、サッカロミセス セレビ
シアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）からの２μのプラスミドＤＮＡのすべて又は一
部を含むベクターが使用され得る。そのようなベクター
は、細胞内にすでに存在する２μのプラスミド中に組換
えにより組込まれ、又は自立的に複製するであろう。２
μの配列は、高い形質転換頻度及び高いコピー数が達成
される予定である場合に特に適切である。
【００６５】酵母における発現のために適切である発現
制御配列は、高く発現された酵母遺伝子の配列である。
従って、ＴＲＰ１遺伝子、ＡＤＨ１又はＡＤＨII遺伝
子、酸ホスファターゼ（ＰＨ０３又はＰＨ０５）遺伝
子、イソシトクローム遺伝子、又は解糖路に関与するプ
ロモーター、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド
−３−ホスフェートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナー
ゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキ
ナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、
３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナー
ゼ、トリホースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ遺伝子のための
プロモーターが使用され得る。
【００６６】哺乳類宿主細胞のために適切なプロモータ
ーは、ヒト免疫グロブリン、又はウィルス、たとえばＳ
Ｖ４０、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、アデノウィル
ス２、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）、パポーウィルス
ＢＫ変異体（ＢＫＶ）又はマウス又はヒトサイトメガロ
ウィルス（ＣＭＶ）から得られる。ヒトＣＭＶプロモー
ターが好ましい。他方、ベクターは、哺乳類発現生成
物、たとえばアクチン、コラーゲン、ミオシン等からの
プロモーター、又は天然のプロモーター、及び免疫グロ
ブリン遺伝子配列に通常、関係する制御配列を含むこと
ができる。
【００６７】ベクターは真核及び原核宿主の両者のため
に適切である。本発明のＤＮＡ分子が調製されれば、そ
れは便利には、適切な発現ベクター中にトランスファー
され得る。適切なプロモーター、又はＨ鎖又はＬ鎖不変
部をコードする遺伝子を含んで成る発現ベクターは市販
されている。Ｌ鎖及びＨ鎖のための遺伝子構造物は、２
種のベクターの助けにより宿主細胞中に連続的に又は同
時にトランスファーされる。他方、Ｈ及びＬ鎖の両者
は、同じハイブリッドベクター中にクローン化され、そ
して宿主細胞中に単一構造体として１段階方法で導入さ
れる。第３の方法は、連結されていないＤＮＡフラグメ
ントの同時トランスフェクションを利用する。
【００６８】所望する再形状化されたヒト抗体をコード
する組換えＤＮＡは、たとえば形質転換された宿主細胞
を培養することによって調製され得る。特に、そのよう
なＤＮＡは、 ａ）ＩｇＥに対して特異的な再形状化されたヒト抗体の
可変Ｈ及び／又はＬ鎖可変ドメインをコードするＤＮＡ
を調製し； ｂ）ゲノムライブラリィーからＤＮＡを単離し、そして
抗体の不変領域をコードする所望するＤＮＡをＤＮＡプ
ローブを用いて選択することによって、ヒト抗体のＨ及
び／又はＬ鎖不変領域をコードするＤＮＡを調製し； ｃ）段階ａ）のＤＮＡ又は段階ａ）及びｂ）のＤＮＡを
適切なハイブリッドベクター中に導入し； ｄ）得られたハイブリッドベクターを受容宿主細胞にト
ランスファーし、又は所望する遺伝子をコードするＤＮ
Ａを回収し、そして適切な受容宿主細胞中に連結されて
いないＤＮＡをトランスファーし； ｅ）形質転換された宿主細胞を選択し、そして培養し、
そして場合によっては； ｆ）所望するＤＮＡを単離することを含んで成る方法に
より調製され得る。
【００６９】上記方法の段階ｂ）に従ってのゲノムヒト
ＤＮＡが、適切なヒト組織、好ましくはヒト胎盤又はヒ
ト胎児肝細胞から当業界において知られている方法に従
って単離される。ゲノムＤＮＡライブラリィーが、適切
な制限エンドヌクレアーゼによる制限消化によりそれか
ら構成される。そのゲノムＤＮＡライブラリィーがたと
えばニトロセルロース膜上で複製され、そして対象のＤ
ＮＡ配列のためのＤＮＡプローブによりスクリーンされ
る。所望するＤＮＡは、ＰＣＲ技法を用いて増幅され得
る。
【００７０】組換えＤＮＡのトランスファー、たとえば
ハイブリッドベクターのトランスファー及び形質転換さ
れた細胞の選択が下記に説明される。さらに、本発明
は、上記組換えＤＮＡにより形質転換された適切な宿主
細胞、すなわち本発明の所望する再形状化されたヒト抗
体のＨ鎖をコードするＤＮＡ及び／又はＬ鎖をコードす
るＤＮＡにより形質転換される宿主細胞にも関する。宿
主細胞は細胞当たり多数のベクターのコピーを含むこと
が好ましい。
【００７１】本発明の宿主細胞は、インビトロ培養でき
るべきである。適切な宿主細胞は原核又は真核起原のも
のであり、そして細菌細胞、特にＥ．コリ、酵母、たと
えばサッカロミセス セレビシアエ又は哺乳類細胞を包
含する。官能テトラマー抗体の生成のための適切な環境
を提供するためには、真核、特に哺乳類又は酵母起源の
宿主細胞が好ましい。なぜならば、官能テトラマー抗体
分子の生合成は正しい新生ポリペプチド鎖折りたたみ及
びアセンブリーを必要とする。原核宿主、特にＥ．コリ
は、本発明の抗体フラグメント、たとえばＦａｂ−及び
Ｆｖ−フラグメントの生成のために使用され得る。
【００７２】適切な宿主の例は、制限又は変性酵素を欠
く又はほとんど有さない微生物、たとえば細菌、特に
Ｅ．コリの株、及び酵母、たとえばサッカロミセス セ
レビシアエである。本発明の好ましい宿主細胞は、哺乳
類細胞、たとえばＣＯＳ−７細胞、Ｂｏｗｅｓ黒色腫細
胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、胎児
肺細胞Ｌ−１３２及びリンパ起原の哺乳類細胞、たとえ
ばリンパ腫、骨髄腫、ハイブリドーマ、トリオーマ又は
クオドローマ細胞である。
【００７３】それらの宿主細胞は、２つの別々のベクタ
ーの助けにより連続的に又は同時にトランスファーさ
れ、又はこれまで示されたように二重−構造体（Ｌ−鎖
／Ｈ−鎖）ベクターを用いての一段階方法によりトラン
スファーされた、Ｌ鎖遺伝子構造体のみにより、Ｈ鎖遺
伝子構造体のみにより又は両者によりトランスフェクト
される。他方、連結されていない遺伝子構造体は、宿主
細胞中に連続的又は同時にトランスフェクトされ得る。
【００７４】上記のような再形状化されたヒト抗体を分
泌する両遺伝子構造体によりトランスフェクトされた宿
主細胞、特に細胞系ＥＨ３１．８が好ましい。本発明の
宿主細胞の追加の例は、本発明の抗体の高レベルの発現
を促進するように追加のＤＮＡ要素を組込む、Ｈ−及び
Ｌ−鎖遺伝子構造体の他の配向を含む類似する組換えプ
ラスミドによりトランスフェクトされた細胞である。
【００７５】本発明の宿主細胞は、遺伝的に安定してお
り、一定した特異性の本発明の再形状化されたヒト抗体
を生成し、そして好ましくは分泌し、そして強く凍結さ
れた培養物を融解し、そして再クローン化することによ
って活性化され得る。形質転換された宿主細胞は、当業
界において知られている方法により、同化可能な炭素
源、たとえば炭水化物、たとえばグルコース又はラクト
ース、窒素源、たとえばアミノ酸、ペプチド、タンパク
質、又はそれらの分解生成物、たとえばペプトン、アン
モニウム塩又は同様のもの、及び無機塩、たとえばスル
フェート、リン酸及び／又は炭酸ナトリウム、カリウ
ム、マグネシウム及びカルシウムを含む液体培地におい
て培養される。その培地は、さらに、たとえば増殖促進
物質、たとえば微量元素、たとえば鉄、亜鉛、マンガン
及び同様のものを含む。
【００７６】培地は好ましくは、選択圧力を付与し、そ
して形質転換されていない又はハイブリッドベクターを
損なった細胞の増殖を防ぐために選択される。従って、
たとえば、抗生物質が、ハイブリッドベクターがマーカ
ーとして耐抗生物質性遺伝子を含む場合、培地に添加さ
れる。たとえば、必須アミノ酸において栄養要求性であ
り、そしてハイブリッドベクターが宿主欠損を補足する
酵素をコードする遺伝子を含む宿主細胞が使用される場
合、前記アミノ酸を欠く最少培地が、形質転換された細
胞を培養するために使用される。
【００７７】培養は、当業界において知られている方法
によりもたらされる。培養条件、たとえば温度、培地の
pH値及び発酵時間が、本発明のポリペプチド又は誘導体
の最大力価が得られるように選択される。従って、Ｅ．
コリ又は酵母株は好ましくは、約２０℃〜４０℃、好ま
しくは約３０℃の温度及び４〜８、好ましくは約７のpH
で、約４〜３０時間、好ましくは本発明のポリペプチド
又は誘導体の最大収率が達成されるまで、振盪又は撹拌
しながら、含浸培養により好気性条件下で培養される。
【００７８】細胞密度が十分な値に達した場合、培養は
中断され、そしてポリペプチド又は誘導体が単離され得
る。ハイブリッドベクターが適切な分泌シグナル配列を
含む場合、ポリペプチド又は誘導体が、培養培地中に形
質転換された細胞により直接的に分泌される。さもなけ
れば、細胞は、たとえば界面活性剤、たとえばＳＤＳ，
ＮＰ−４０（ＴＭ），Ｔｒｉｔｏｎ（ＴＭ）又はデオキ
シコール酸により破壊されるべきであり、リゾチーム又
は同様に作用する酵素により溶解されるべきである、又
は浸透ショック又は超音波により破壊されるべきであ
る。細胞の破壊はまた、シグナル配列が細胞周辺に所望
するタンパク質の分泌を指図する場合に必要とされるで
あろう。酵母が宿主微生物として使用される場合、細胞
壁は、ダルコシダーゼによる酵素的消化により除去され
得る。他方又はさらに、機械的力、たとえば剪断力（た
とえばＦｒｅｎｃｈプレス、Ｄｙｎｏミル及び同様のも
の）又はガラスビーズ又は酸化アルミニウムと共に振盪
又はたとえば液体窒素における交互の凍結、及びたとえ
ば３０℃〜４０℃での融解並びに超音波処理を用いて、
細胞を破壊することができる。
【００７９】タンパク質、核酸及び他の細胞成分を含
む、細胞の分解の後に得られた混合物の遠心分離の後に
得られた細胞上清液又は溶液は、それ自体既知の態様
で、本発明のポリペプチドを含むタンパク質において富
化される。従って、たとえばほとんどの非タンパク質成
分は、ポリエチレンイミン処理により除去され、そして
本発明のポリペプチド及び誘導体を含むタンパク質はた
とえば、上記方法により単離される。
【００８０】本発明はまた、上記適切な受容宿主細胞が
本発明の１又は複数のベクターにより形質転換され、そ
してその形質転換された細胞が選択されることを特徴と
する、形質転換された宿主細胞の調製方法にも関する。
微生物の形質転換は、たとえばＳ．セレビシアエ（Ａ．
Ｈｉｎｎｅｎなど．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９，１９７８）及びＥ．
コリ（Ｍ．Ｍａｎｄｅｌなど．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．５３：１５９，１９７０）に関して、従来のように
して行なわれる。
【００８１】従って、Ｅ．コリ細胞の形質転換方法は、
たとえばＤＮＡ摂取を可能にするために細胞のＣａ2+前
処理、及びハイブリッドベクターと共にインキュベート
を包含する。形質転換された細胞の続く選択は、たとえ
ばベクターＤＮＡのマーカー配列の性質に依存する親細
胞からの形質転換された細胞の分離を可能にする選択培
地に細胞をトランスファーすることによって達成され得
る。好ましくは、ベクターを含まない細胞の増殖を可能
にしない増殖培地が使用される。酵母の形質転換はたと
えば、グルコシダーゼによる酵素細胞壁の酵素的処理、
ポリエチレングリコール及びＣａ2+イオンの存在下での
ベクターによる前記得られたスフェロプラストの処理、
及び前記スフェロプラストを寒天に埋め込むことによっ
て前記細胞壁の再生を含んで成る。好ましくは、再生寒
天は、上記形質転換された細胞の同時での再生及び選択
を可能にする手段で調製される。
【００８２】高等真核起原の細胞、たとえば哺乳類細胞
系の形質転換は、好ましくはトランスフェクションによ
り達成される。トランスフェクションは、従来の技法、
たとえばリン酸カルシウム沈殿、細胞核中へのマイクロ
インジェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポ
レーション、すなわち細胞膜の透過性を一時的に高める
短い電気パルスによるＤＮＡの導入、又は同様の手段に
より従われる。トランスフェクションは、ヘルパー化合
物、たとえばジエチルアミノエチルデキストラン、ジメ
チルスルホキシド、グリセロール、ポリエチレングリコ
ール又は同様のもの、又はベクターＤＮＡ及びリン酸カ
ルシウムの同時沈殿物の存在下で行なわれ得る。
【００８３】トランスフェクション工程の後、トランス
フェクトされた細胞は、トランスフェクションのために
使用されるＤＮＡの選択マーカーに適合する選択方法の
助けにより同定され、そして選択される。選択マーカー
は、重金属、たとえば銅又は抗生物質、たとえばＧ−４
１８（ゲネチシン、ネオマイシン−誘導体）又はヒグロ
マイシンに対する耐性を付与する遺伝子、又は宿主細胞
の遺伝的損傷、たとえばチミジンキナーゼ、ヒポキサン
チンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸
レダクターゼ又は同様のものの不在を補足する遺伝子を
含む。たとえば、トランスフェクションのために使用さ
れるＤＮＡがゲネチシン耐性のためのマーカーを含む場
合、形質転換された細胞は、抗生物質ゲネチシンの存在
下での培養により形質転換された細胞から同定され、そ
して分離される。
【００８４】本発明の再形状化されたヒト抗体又はその
誘導体は、特に体液、たとえば血清における、インビト
ロでの及びインビボでのＩｇＥの定性及び定量決定のた
めに有用である。たとえば、再形状化されたヒト抗体又
はその誘導体は、ＩｇＥの抗原決定基と前記抗体のパラ
トープとの間の結合相互作用による既知のいづれかのイ
ムノアッセイに使用され得る。そのようなアッセイの例
は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素、イムノフ
ルオレセンス、化学ルミネセンス、免疫沈殿、ラテック
ス凝集又は血球凝集イムノアッセイである。
【００８５】本発明の再形状化されたヒト抗体は、ラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）においてそれ自体で又は放
射性ラベルされた誘導体の形で使用され得る。ＲＩＡの
いづれか既知の変法、たとえば可溶相（均質）ＲＩＡ、
固相（不均質）ＲＩＡ、ＩｇＥの直接的な又は間接的な
（競争）決定による単一ＲＩＡ又は二重（サンドイッ
チ）ＲＩＡが使用され得る。
【００８６】そのようなラジオイムノアッセイの例はサ
ンドイッチＲＩＡであり、ここで適切なキャリヤー、た
とえばマイクロタイタープレート又は試験管、たとえば
ポリスチレン、ポリプロピレン又はポリ塩化ビニルのプ
ラスチック表面、又はプラスチックビーズ、フィルター
紙、デキストラン等、酢酸セルロース又はニトロセルロ
ースシート、磁気粒子又は同様のものが、単純な吸着に
より又は場合によってはキャリヤーの活性化の後、本発
明の抗体により被覆される。次に、ＩｇＥ及び最終的
に、抗原とまた反応し、そしてたとえば 125Ｉにより放
射性ラベルされる再形状化された抗体を含む試験溶液が
添加される。試験溶液におけるＩｇＥの量は、結合され
た再形状化抗体の量に直接的に比例し、そしてキャリヤ
ーに結合される放射能を測定することによって決定され
る。
【００８７】本発明の再形状化されたヒト抗体は、酵素
イムノアッセイにおいてそれ自体で又は酵素接合された
誘導体の形で使用され得る。上記のように、ラジオイム
ノアッセイに関しては、酵素イムノアッセイのいづれか
既知の変法が使用され得る。試験は、放射性ラベルの代
わりに酵素ラベルを用いて上記ラジオイムノアッセイに
類似する態様で行なわれる。試験溶液に存在するＩｇＥ
の量に対応する、形成された免疫複合体の量は、酵素基
質溶液の添加により決定される。酵素基質反応は、たと
えば眼又は光学的測定装置により観察され得る色の変化
をもたらす。
【００８８】本発明の再形状化された抗体は、化学発光
アッセイにおいてそれ自体で又は化学発光マーカーと接
合された誘導体の形で使用され得る。上記のように、ラ
ジオイムノアッセイに関しては、化学発光アッセイのい
づれか既知の変法が使用され得る。試験は、放射性ラベ
ルの代わりに化学発光ラベルを用いて上記ラジオイムノ
アッセイに類似する態様で行なわれる。試験溶液に存在
するＩｇＥの量に対応する、形成された免疫複合体の量
は、発光のきっかけをつくる化合物、たとえばＨ2Ｏ2
及びＮａＯＨを添加し、そして光学的測定装置により光
の発光を測定することによって決定される。
【００８９】ＩｇＥの決定のためへの上記のような本発
明の再形状化されたヒト抗体又はその誘導体の使用はま
た、それ自体既知の他のイムノアッセイ、たとえば免疫
螢光アッセイ、抗体被覆された又は抗原被覆されたラテ
ックス粒子によるラテックス凝集、抗体被覆された又は
抗原被覆された赤血球による血球凝集、抗体被覆された
光学繊維を用いての弱い光アッセイ及び結合の出来事を
電気的又は光学的シグナルに転換する他の直接的に作用
するイムノセンサーを包含する。
【００９０】本発明の再形状化されたヒト抗体又はその
誘導体はまた、好ましくはプラーク形成細胞（ＰＦＣ）
アッセイにおいて、ＩｇＥ産生細胞の決定のためにも有
用である。本発明のプラーク形成アッセイは、固相イム
ノアッセイの原理に基づかれている。固相イムノアッセ
イのいづれか既知の変法、たとえばラジオイムノアッセ
イ、酵素、免疫螢光又は化学発光イムノアッセイ又は同
様の方法が使用され得る。
【００９１】そのようなプラーク形成細胞アッセイの例
は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
に基づくＰＦＣアッセイである。ＩｇＥ−産生細胞の合
計量の決定のためには、サンドイッチＲＩＡのための上
記のような適切なキャリヤーが本発明の抗体により被覆
される。遠心分離、濾過又は同様の手段によりＩｇＥ−
産生細胞を含む体液から得られるそのような細胞の懸濁
液、及びＩｇＥに対して特異的な第２ポリクローナル又
はモノクローナル抗体、たとえば酵素、たとえばアルカ
リホスファターゼと接合される、第１抗体以外のＩｇＥ
の異なったエピトープを認識する本発明の抗体が添加さ
れる。試験懸濁液におけるＩｇＥ−産生細胞の量は、結
合された第２抗体の量に直接的に比例し、そして着色さ
れた反応生成物の進行をもたらす適切な基質溶液を添加
し、そして着色されたスポット（プラーク）を計数する
ことによって決定される。特定のアレルゲンに対して向
けられたＩｇＥを生成するＩｇＥ−産生細胞の画分の決
定のためには、キャリヤーがまず、上記のような細胞懸
濁液の添加の前、アレルゲン又はアレルゲンの吸着可能
接合体により被覆される。アレルゲンに対して向けられ
る試験懸濁液におけるＩｇＥの画分は表面結合されたア
レルゲンに結合し、そして酵素により接合される本発明
の抗体、及び着色された反応生成物の進行をもたらす適
切な基質溶液を添加、そして着色されたスポット（プラ
ーク）を計数することによって決定される。
【００９２】さらに、本発明は、本発明のモノクローナ
ル抗体及び／又はその誘導体、及び場合によっては、他
のモノクローナル又はポリクローナル抗体及び／又は付
随物を含んで成るＩｇＥ及び／又はＩｇＥ産生細胞の定
性及び定量決定のための試験キットにも関する。ラジオ
イムノアッセイのための本発明の試験キットは、たとえ
ば適切なキャリヤー、１又は複数のモノクローナル抗体
の任意に凍結乾燥せしめられた又は濃縮された溶液、放
射性ラベルされたモノクローナル抗体又は放射性ラベル
されたＩｇＥの溶液、ＩｇＥの標準溶液、緩衝溶液及び
場合によっては、非特異的吸着及び凝集体形成を防ぐた
めの界面活性剤、ピペット、反応容器、検量曲線及び同
様のものを含む。試験キットの１又は複数のモノクロー
ナル抗体は、本発明のモノクローナル抗体である。特定
のアレルゲンに対して向けられたＩｇＥを生成するＩｇ
Ｅ−産生細胞の決定のための試験キットは、さらに、ア
レルゲンの溶液又はアレルゲンの吸着性接合体の溶液を
含む。
【００９３】酵素イムノアッセイのための本発明の試験
キットは、たとえば適切なキャリヤー、１又は複数のモ
ノクローナル抗体の任意に凍結乾燥され又は濃縮された
溶液、酵素ラベルされたモノクローナル抗体、酵素ラベ
ルされたＩｇＥ、ポリクローナル抗−ＩｇＥ血清及び／
又は抗−ＩｇＥ抗体を認識し、そして結合する酵素ラベ
ルされたモノクローナル又はポリクローナル抗体の任意
に凍結乾燥され又は濃縮された溶液、固体又は溶解され
た形での酵素基質、ＩｇＥの標準溶液、緩衝溶液、界面
活性剤、ピペット、反応容器、検量曲線、色彩基準表及
び同様のものを含む。試験キットの中の１又は複数のモ
ノクローナル抗体は本発明のモノクローナル抗体であ
る。特定のアレルゲンに対して向けられたＩｇＥを生成
するＩｇＥ−産生細胞の決定のための試験キットはさら
に、アレルゲンの溶液又はアレルゲンの吸着性接合体の
溶液を含む。
【００９４】さらに、本発明の再形状化されたヒト抗体
及びそれらの誘導体は、いづれかの既知の従来の染色技
法、たとえば流動細胞計測分析により表面ＩｇＥ陽性
（ｓＩｇＥ+ ）Ｂ細胞の定質及び定量決定のために使用
され得る。さらに、本発明のモノクローナル抗体及び／
又はそれらの誘導体は、アレルギーの処理及び／又は予
防のために有用である。
【００９５】治療効果は、本発明の再形状化されたヒト
抗体及びその誘導体の特定の特徴によりＩｇＥ免疫応答
をダウンレギュレートすることによって達成される。そ
れらは、遊離ＩｇＥを結合し、そしてＦｃE レセプター
Ｉ又はIIを担持する細胞、特に肥満細胞及び好塩基性細
胞へのＩｇＥの結合を阻害することによって、形成され
たＩｇＥを中和できる。
【００９６】それらは、表面ＩｇＥ陽性Ｂ細胞（ｓＩｇ
Ｅ+ Ｂ細胞）の表面上に発現されるＩｇＥを認識し、そ
して結合し、そして従って、アレルゲンへの第２の暴露
の後、ＩｇＥ生成をもたらす“記憶プール”を形成する
そのような細胞の集団の消耗において有用である。選択
された免疫グロブリン（サブ）クラスの再形状化された
ヒト抗体の生成の可能性は、ｓＩｇＥ+ Ｂ細胞の特定の
殺害をもたらす宿主免疫システムの細胞機構の活性化を
可能にする。これはまた、細胞毒性薬物を標的細胞に運
ぶであろう、そのような細胞毒性薬物と本発明のモノク
ローナル抗体との接合体により達成され得る。
【００９７】本発明の再形状化されたヒト抗体及びそれ
らの誘導体はＦｃE レセプターＩ又はIIを担持する細
胞、たとえば肥満細胞及び好塩基性細胞上での細胞親和
性ＩｇＥを認識しないので、それらはそれらの細胞によ
り仲介体開放を誘発しない。本発明のモノクローナル抗
体及びその誘導体はまた、それらは免疫応答におけるＩ
ｇＥの形成に対して有意な阻害効果を有するので、長く
続く治療効果を有する。
【００９８】結果的に、本発明の再形状化されたヒト抗
体及びそれらの誘導体は、たとえばＩｇＥ抗体及び表面
ＩｇＥ陽性Ｂ細胞の除去、従ってアレルギー応答を排除
し、そしてＩｇＥ形成を阻害することによって、徴候を
処理するよりもむしろ、アレルギーの根底にある原因に
実際的に影響を及ぼす処理を提供する。前記処理は前進
する反復された用量を必要とせず、そして本発明の再形
状化されたヒト抗体及びそれらの誘導体は、アレルギー
の徴候の検出の前、投与による予防処理のために使用さ
れ得ることが特に好都合である。
【００９９】それらはヒトに投与される場合、弱い免疫
原性又は非免疫原性であるので、本発明の再形状化され
たヒト抗体及びその誘導体は特に、インビボ診断、治療
用途及び予防のために有用である。好ましくは、再形状
化されたヒト抗体は、治療目的のために投与される場
合、自己タンパク質としてヒトにより許容される。哺乳
類のための毎日の治療的用量は、患者の状態及び適用の
態様に依存して、体重１kg当たり約０．１mg〜１０mgで
ある。
【０１００】本発明はまた、本発明の再形状化されたヒ
ト抗体及び／又はその誘導体を含んで成る医薬調製物に
も関する。医薬調製物は、たとえば治療的に有効量の再
形状化されたヒト抗体及び／又はその誘導体及び無機又
は有機固体又は液体の医薬キャリヤーを含んで成る。非
経口適用及び吸入のための医薬調製物が好ましい。筋肉
内皮下又は静脈適用又は吸入のための調製物は、たとえ
ば凍結乾燥又は濃縮された調製物からの使用のすぐ前、
等張水溶液又は懸濁液により調製される。医薬調製物
は、滅菌され、そしてたとえば成分を保存し、安定化
し、湿潤し、乳化し又は溶解するためのアジュバント、
浸透圧の調整のための塩、緩衝液及び／又は粘性を調節
するための化合物、たとえば、ナトリウムカルボキシセ
ルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン又はゼ
ラチンを含む。それらは、たとえば従来の混合、溶解又
は凍結乾燥による当業界において知られている方法によ
り調製され、そして約０．０１％〜約５０％の活性成分
を含む。注射のための調製物は、加工され、アンプル、
バイアル又は使い捨て注射装置中に満たされ、そして当
業界において知られている方法に従って滅菌状態下で密
封される。
【０１０１】本発明の医薬調製物は、ヒトにおけるアレ
ルギー反応、特に、アレルギー性ぜん息、アレルギー性
鼻炎及びアトピー性エグゼマ（ｅｘｃｅｍａ）に関連す
る即座タイプの過敏性に特有な反応の予防及び処理のた
めに使用され得る。本発明は特に、再形状化されたヒト
抗体、組換えＤＮＡ、形質転換された宿主細胞、及び例
に記載されるようなその調製方法に関する。次の例は本
発明を例示するものであって、本発明を制限するもので
はない。
【０１０２】略語：ＶL ＝Ｌ鎖可変部；ＶH ＝Ｈ鎖可変
部；ＣＤＲ＝相補的決定領域；ＦＲ＝骨格領域；ＨＣＭ
Ｖ＝ヒトサイトメガロウィルス。 材料：ヒト血漿から精製された、ｋＬ鎖を有するヒトＩ
ｇＧは、すべてＳｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅ
ｒｌａｎｄから購入された（ＩｇＧ１：Ｉ−３８８９；
ＩｇＧ２：Ｉ−４１３９；ＩｇＧ３：Ｉ−４３８９及び
ＩｇＧ４：Ｉ−４６３９）。ヒト骨髄腫血清からのヒト
ＩｇＭ（カタログ番号ＰＨＰ００３）及びヒトＩｇＤ
（カタログ番号ＰＨＰ００５）は、Ｓｅｒｏｔｅｃから
得られた。ヒト血漿からのＩｇＡ（ＩｇＡ１：４００１
０５；ＩｇＡ２：４００１０８）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈ
ｅｍ，Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａ
ｎｄから得られた。
【０１０３】
【実施例】例１：モノクロナール抗体Ｃ２の１ＶL 及びＶH の分子
モデル構築 ヒトＩｇＥを認識するマウスのモノクロナール抗体Ｃ２
１のＶL 領域（配列番号１）及びＶH 領域（配列番号
２）の分子モデルは、ＶL については、高い相同性のマ
ウスの抗リゾチーム抗体ＨｙＨＥＬ−１０（Ｐａｄｌａ
ｎ，Ｅ．Ａ．Ｓｉｌｖｅｒｔｏｎ，Ｅ．Ｗ．，Ｓｈｅｒ
ｉｆｆ，Ｓ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｇ．Ｈ．，Ｓｍｉｔｈ−Ｇ
ｉｌｌ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，Ｄ．Ｒ．，１９８９，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８
６：５９３８；Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｄａｔａｂａｓ
ｅ中に配列３ＨＦＭと称されている、Ｂｅｒｎｓｔｅｉ
ｎｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １１２，５３
５−５４２（１９７７））の解析構造に基づいて構築さ
れ、そして、ＶH については、マウスの抗リゾチーム抗
体ＨｙＨＥＬ−５（Ｓｈｅｒｉｆｆ，Ｓ．，Ｓｉｌｖｅ
ｒｔｏｎ，Ｅ．Ｗ．，Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．，Ｃｏｈ
ｅｎ，Ｇ．Ｈ．，Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｂ
ｉｎｚｅｌ，Ｂ．Ｃ．ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ，Ｄ．
Ｒ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ，８４：８０７５；前記のＢｒｏｏｋｈａ
ｖｅｎ Ｄａｔａｂａｓｅ中に配列２ＨＦＭと称されて
いる）の解析構造に基づいて構築される。ｍＡｂ Ｃ２
１及びＨｙＨＥＬ−１０又はＨｙＨＥＬ−５のＬ鎖及び
Ｈ鎖の可変領域は、それぞれ、９１％と９０％のアミノ
酸の同一性を有している。このモデルは、ＵＮＩＸオペ
レーティング・システム下に作動するＳｉｌｉｃｏｎ
Ｇｒａｐｈｉｃｓ ＩＲＩＳ ４Ｄ上で、そして分子モ
デル構築パッケージＱＵＡＮＴＡ（Ｐｏｌｙｇｅｎ Ｃ
ｏｒｐ．，ＵＳＡ）を使用して構築される。このフレー
ムワーク内の同一残基は保持され；非同一残基はＱＵＡ
ＮＴＡの蛋白モデル構築能力に取り込まれた最大重複手
段（Ｓｎｏｗ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ Ａｍｚｅｌ，Ｌ．
Ｍ．，１９８６，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １：２６７）を用
いて置換される。
【０１０４】マウスＣ２１抗体由来の、ＶL 領域の相補
的決定領域ＣＤＲ１（１１），ＣＤＲ２（Ｌ２）及びＣ
ＤＲ３（Ｌ３）並びにＶH 領域の相補的決定領域ＣＤＲ
１（Ｈ１）及びＣＤＲ２（Ｈ２）は、以前に仮定された
標準的な形態（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．，Ｌｅｓｋ，Ａ．
Ｍ．，Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．，Ｌｅｖｉｔｔ，
Ｍ．，Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ，Ｓ．Ｊ．，Ａｉｒ，
Ｇ．，Ｓｈｅｒｒｉｆ，Ｓ．，Ｐａｄｌａｎ，Ｅ．
Ａ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｄ．，Ｔｕｌｉｐ，Ｗ．Ｒ．，Ｃ
ｏｌｍａｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｓｐｉｎｅｌｌｉ，Ｓ．，Ａｌ
ｚａｒｉ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄＰｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，１
９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７）に一致する。
これらのループの主鎖のねじれ角は、元の抗体の構造内
のもの（Ｌ−１〜Ｌ−２のためのＨｙＨＥＬ−１０及び
Ｈ−１〜Ｈ−２のためのＨｙＨＥＬ−５）と同じに保た
れている。ＶH 領域のＣＤＲ３（Ｈ３）については、標
準的な構造は存在せず、それ故、異なってモデル化され
る。３０の候補ループが、ＱＵＡＮＴＡ内で実行される
如き頒布されたアルゴリズム（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．ａ
ｎｄＴｈｉｒｕｐ，Ｓ．，１９８６，ＥＭＢＯ Ｊ．，
５：８１９−８２２）を使用して、９１の高分解蛋白構
造から抽出され、そして最も良い変異体が肉眼により選
ばれる。このループは、Ｈ３ ＣＤＲのいずれかの側の
上の３つのフレームワーク残基上で固定されている。従
って、ＶH 領域のＨ３は、ＣＤＲ３（Ｌ３）に大まかに
対応している残基８７〜１０６の領域内のＢｅｎｃｅ−
Ｊｏｎｅｓ蛋白ＲＨＥ（Ｆｕｒｅｙ，Ｗ．，Ｗａｎｇ，
Ｂ．Ｃ．，Ｙｏｏ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄＳａｎ，Ｍ．，１９
８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６７：６６１−６９
２）上でモデル化される。
【０１０５】好ましくない原子接触を緩和し、そしてフ
ァン・デル・ワールス力及び静電相互作用を最適化する
ために、ＱＵＡＮＴＡ内で実行される如きＣＨＡＲＭポ
テンシャル（Ｂｒｏｏｋｓ，Ｂ．Ｒ．，Ｂｒｕｃｃｏｌ
ｅｒｉ，Ｒ．Ｅ．，Ｏｌａｆｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．，Ｓｔａ
ｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｓ．ａｎ
ｄ Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｍ．，１９８３，Ｊ．Ｃｏｍｐ．
Ｃｈｅｍ．，４：１８７）を用いて、最も急な降下のそ
して結合勾配エネルギーの細小化に供される。
【０１０６】例２：再形成化されたヒトＣ２１のＶL 及
びＶH 領域の設計 再形状化されたヒトＣ２１のＶL 及びＶH 領域のデザイ
ンは、第一に、ＫＡＢＡＴデータベース（Ｋａｂａｔ，
Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｒｅｉｄ−Ｍｉｌｌｅｒ，
Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．ａｎｄ Ｇｏｔｔｅｓｍａ
ｎ，Ｋ．Ｓ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ
Ｈｕｍｅｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎ
ｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ）に見られ
るようなヒトＶL 及びＶH 領域の上記共通配列（ｃｏｎ
ｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（変異体Ｃ２１−Ｌ
１，Ｃ２１−Ｌ２，Ｃ２１−Ｌ３，Ｃ２１−Ｈ１及びＣ
２１−Ｈ３）に基づいている。さらに、２つの、より再
形状化されたヒトＣ２１のＶH 領域（Ｃ２１−Ｈａｙｌ
及びＣ２１−Ｈａｙ３）は、個々のヒト抗体のフレーム
ワーク領域（ＦＲ）に基づいている。
【０１０７】共通性に基づく再形状化ヒトＣ２１可変領
域の設計のために、マウスＣ２１抗体からのＶL 及びＶ
H 領域のアミノ酸配列を、上記ＫＡＢＡＴデータベース
からのヒト抗体のＶL 及びＶH 領域のための上記共通配
列と比較する。この分析により、マウスＣ２１ ＶL 領
域及びマウスＣ２１ ＶH 領域が、それぞれ、ヒト・カ
ッパＶL サブグループIII 共通配列（７７％のアミノ酸
配列が同じ）及びヒトＶH サブグループＩ共通配列（７
１％のアミノ酸配列が同じ）に最も似ていることが、明
らかにされる。これらのヒト共通配列を、ネズミＣ２１
のＣＤＲ及びその対応共通配列のヒトＦＲを含む、上記
の再形状化されたヒトＣ２１のＬ及びＨ鎖可変領域Ｃ２
１−Ｌ０及びＣ２１−Ｈ０を設計するために使用する。
良好な抗原結合を達成するのに潜在的に重要であり、そ
してＶL ／ＶH パッキングに対して臨界的であることが
できるであろうフレームワーク残基を同定するために、
マウスＣ２１可変領域の分子モデル（例１）を使用す
る。このグラフィック分析の結果として、ＦＲ内の著名
なヒト共通アミノ酸のいくつかを、それらの対応するマ
ウスＣ２１残基と交換する。これらの交換は、以下の範
疇の１つに陥らない場合には、ヒト・フレームワーク領
域内にのみあると考える。 〔１〕ヒト共通配列（ヒト・サブグループ１；ＨＳＧ
１）は、この位置で好まれる主要なアミノ酸を全く示さ
ないが、元のマウスＣ２１配列中に見出されたアミノ酸
は、その対応するヒト免疫グロブリン可変領域サブグル
ープの少なくとも１つの別個の配列内に存在する。例え
ば、ＨＳＧ１は、アミノ酸残基１９に共通配列をもたな
いと記載されている（Ｋａｂａｔ他、前記）、但しいく
つかのヒト抗体は、この位置にＬｙｓ残基をもってい
る。Ｌｙｓは、上記Ｃ２１配列中にもあるので、それ
が、上記再形状化抗体中に保持されている。 〔２〕フレームワーク位置でのアミノ酸は、仮定された
標準的な構造の一部分であり、上記ＣＤＲ又は超可変領
域ループの構造を決定することにおいて重要であり、そ
してそれ故、その抗原結合部位の形状及び完全性を維持
するために必須であると思われている（Ｃｈｏｔｈｉ
ａ，Ｃ．ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，１９８７，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１；Ｃｈｐｔｈｉ
ａ，Ｃ．ｅｔａｌ．，１９８９、前記）。
【０１０８】これらの規則に従って、上記再形状化され
たヒトＬ鎖及びＨ鎖の可変領域Ｃ２１−Ｌ０及びＣ２１
−Ｈ０内の４つ及び６つのアミノ酸を、ヒト共通配列と
比べたときに、交換し、変異体Ｃ２１−Ｌ１′及びＣ２
１−Ｈ１を生じさせる。この交換されたアミノ酸の位置
は、Ｃ２１−Ｌ１′及びその以下に決定された修飾変異
体Ｃ２１−Ｌ１（配列番号５）中の、１，３，４９及び
６０である。Ｃ２１−Ｈ１（配列番号１１）中では、交
換アミノ酸の位置は、３８，４０，６７，７０及び８７
である。上記の規則の例外は、上記再形状化されたヒト
Ｃ２１ ＶH 領域の位置７６であり、当該位置で、我々
は、上記ヒトＶH 共通配列中に見つけられるような、こ
の位置のための最も頻度の多いヒト・アミノ酸（ｔｈ
ｒ）を選択する。
【０１０９】ＶL 及びＶH の更に新しい変異体は、（そ
れぞれ、Ｃ２１−Ｌ１及びＣ２１−Ｈ１に比較しての）
以下の変更を含んでいる： Ｃ２１−Ｌ２（配列番号７）：位置６０でのアスパラギ
ン酸（セリンの代わり） Ｃ２１−Ｌ３（配列番号９）：位置１でのグルタミン酸
（アスパラギン酸の代わり）；位置３でのバリン（ロイ
シンの代わり）； Ｃ２１−Ｈ３（配列番号１３）：位置３８でのアルギニ
ン（リジンの代わり）；位置４０でのアラニン（アルギ
ニンの代わり）；位置６７でのアルギニン（リジンの代
わり）；位置８７でのアルギニン（トレオニン） Ｃ２１−Ｌ１′及びＣ２１−Ｈ１を用いたデータベース
検索により、再形状化されたヒトＣ２１ ＶL 変異体Ｃ
２１−Ｌ１′が、ヒト・カッパＬ鎖可変領域ＨＵＭＩＧ
ＫＡＦ（ＥＭＢＬ ｄａｔａｂａｓｅ，Ｈｅｉｄｅｌ
ｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｎｅｗｋｉｒｋ，Ｍ．
Ｍ．，Ｇｒａｍ，Ｈ．，Ｈｅｉｎｒｉｃｈ，Ｇ．Ｆ．，
Ｏｅｓｔｂｅｒｇ，Ｌ．，Ｃａｐｒａ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ
Ｉｓｓｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｌ．，１９８８，Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８１：１５１１−１５１８）に最
も似ている（９１％の配列が同じ）こと、並びに、再形
状化されたヒトＣ２１ ＶH 変異体Ｃ２１−Ｈ１が、ヒ
トＨ鎖可変領域ＨＵＭＩＧ ＨＡＹ（ＥＭＢＬ ｄａｔ
ａｂｅｓｅ、前記；Ｄｅｒｓｉｍｏｎｉａｎ，Ｈ．，Ｓ
ｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｋ．Ｊ．
ａｎｄ Ｓｔｏｌｌａｒ，Ｂ．Ｄ．，１９８７，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ．，１３９：２４９６−２５０１）に最も
似ている（７８％の配列が同じ）ことが、明らかにな
る。これらの配列は、以下に、それぞれ、ＫＡＦ及びＨ
ＡＹと称する。ＫＡＦ及びヒト・カッパＶLサブグルー
プIII 共通配列のＦＲは、位置４９及び８５のみで異な
る。位置４９では、その推定の抗原結合のために、その
対応マウスＣ２１アミノ酸（リジン）が保持されてい
る、しかるに、位置８５では、ヒトＶL III共通アミノ
酸であるバリンが、ＫＡＦ内にみられるメチオニンに交
換されている。従って、Ｃ２１−Ｌ１′の変更された変
異体は、Ｃ２１−Ｌ１（配列番号５）と名付けるが、個
々のヒトＬ鎖可変領域ＫＡＦ（Ｎｅｗｋｉｒｋ，Ｍ．
Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９８８、前記）に基づいている。
それは、その中に位置８５でバリンの代わりにメチオニ
ンが在るということにおいて、第一の変異体Ｃ２１−Ｌ
１′とは異なっている。この再形状化された変異体Ｃ２
１−Ｌ２（配列番号７）及びＣ２１−Ｌ３（配列番号
９）も、位置８５にメチオニンをもっている。
【０１１０】反対に、ヒトＨ鎖可変領域ＨＡＹ及びヒト
ＶH サブグループＩ共通配列のＦＲは、数カ所で異なっ
ている。この個々のヒト抗体に高程度の類似性を示す再
形状化されたヒトＣ２１ ＶH 領域を構築するために、
再形状化されたヒトＣ２１ＶH 領域の２以上の変異体
を、ヒトＨ鎖可変領域ＨＡＹのＨ鎖可変領域由来のＦＲ
に基づき設計する。ＨＡＹを基礎とする再形状化された
ヒトＣ２１ ＶH 変異体の構築は、再形状化されたヒト
Ｃ２１変異体Ｃ２１−Ｈ１及びＣ２１−Ｈ３の、ＦＲ２
及びＦＲ３内の、それぞれ、位置４３，４４，４８，７
６及び７７での５つの変更を必要とする。これらのＨＡ
Ｙを基礎とする変異体を、それぞれ、Ｃ２１−Ｈａｙ１
（配列番号１５）及びＣ２１−Ｈａｙ３（配列番号１
７）と称する。ＨＡＹ及びヒトＶH サブグループＩ共通
配列のＦＲ間の、位置３０及び７２での２つの追加の違
いは、マウスＣ２１ ＶH 領域内のものとして保持さ
れ、そして交換されるものとして見なされていない。な
ぜなら、それらは、ＣＤＲの構造を定義している標準的
な残基であるからである（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔａ
ｌ．，１９８９、前記）。
【０１１１】例３：ヒト化抗体遺伝子の設計及び構築 ヒト化抗体遺伝子カセットの設計のために、効率的な発
現及びクローニングに必要な追加の配列を、得られたコ
ード領域の５′−及び３′−末端に追加する。再形状化
ヒトＣ２１抗体の効率的な発現のための真核生物のリー
ダー配列を、フレーム内で、設計されたヒト化可変領域
に追加する。再形状化ヒトＣ２１ ＶL領域のためのリ
ーダー配列は、そこからの可変領域がＣ２１ ＶL 領域
の再形状化のために使用されるヒト抗体ＫＡＦのカッパ
Ｌ鎖内で見つかったリーダー配列（Ｎｅｗｋｉｒｋ，
Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９８８、前記）から得られ
る。再形状化ヒトＣ２１ ＶH 領域のためのリーダー配
列は、ヒト抗体ＨＧ３ ＣＬ（Ｒｅｃｈａｖｉ，Ｇ．，
Ｒａｍ，Ｄ．，Ｇｌａｚｅｒ，Ｌ．，Ｚａｋｕｔ，Ｒ．
ａｎｄ Ｇｉｖｏｌ，Ｄ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８０：８５５−８
５９）、すなわち、ヒトＶH サブグループＩのメンバー
（ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，Ｒｅｉｄ−
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．，Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．ａｎｄ Ｇ
ｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ Ｅｄｉｔ
ｉｏｎ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａ
ｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．
Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆ
ｉｃｅ）のＨ鎖内に見つけられたリーダー配列から得ら
れる。再形状化ヒトＣ２１ ＶL ／ＶH 領域のための、
得られた蛋白配列を、次に、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍ
ｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡのＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ内
に見られるような、マウス配列のためのコドン慣用表
（Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｔａｂｌｅ）を使用して、
ＤＮＡ配列に逆翻訳する。そしてまた、設計されたＤＮ
Ａフラグメントに、その５′−末端で、真核生物の翻訳
シグナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，１８９７，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．，１９６：９４７−９５０）を、その３′−
末端で、供与体のスプライジング部位（Ｂｒｅａｔｈｎ
ａｃｈ，Ｒ．，Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．，Ｏ’Ｈａｒｅ，
Ｋ．，Ｇａｎｎｏｎ，Ｆ．ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，
Ｐ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ，７５：４８５３−４８５７）を、そして
その設計された哺乳類発現ベクターへの便利なサグクロ
ーニングのためのＨｉｎｄIII （５′−末端）及びＢａ
ｍＨＩ及びＸｂａＩ（３′−末端）を追加する。
【０１１２】上記の再形状化ヒトＣ２１ ＶL 及びＶH
領域Ｃ２１−Ｌ１及びＣ２１−Ｈ１をコードする設計さ
れたヒト化抗体遺伝子カセットを、次に、合成ＤＮＡポ
リヌクレオチドを使用した遺伝子合成により構築する。
完全なＤＮＡフラグメントを、２０個のヌクレオチドに
より、互いに重複する６つの領域に再分割する。それぞ
れの再形状化ヒトＣ２１可変領域遺伝子カセットのため
に、６つの５′−リン酸化及びＰＡＧＥ−精製ポリヌク
レオチド、すなわち、Ｃ２１−ＬＡ（配列番号１９）、
Ｃ２１−ＬＢ（配列番号２０）、 Ｃ２１−ＬＣ（配列
番号２１）、Ｃ２１−ＬＤ（配列番号２２）、Ｃ２１−
ＬＥ（配列番号２３）、Ｃ２１−ＬＦ（配列番号２
４）、Ｃ２１−ＨＡ（配列番号２５）、Ｃ２１−ＨＢ
（配列番号２６）、Ｃ２１−ＨＣ（配列番号２７）、Ｃ
２１−ＨＤ（配列番号２８）、Ｃ２１−ＨＥ（配列番号
２９）〜ＨＦ（配列番号３０）と名付けるものを、Ｇｅ
ｎｏｓｙｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｈｏｕ
ｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡから購入する。次に、そ
れらを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく遺伝
子合成において組み立てる。５ピコモルのそれぞれのポ
リヌクレオチド（すなわち、ＬＡ〜ＬＦ）を、最初にア
ニーリングし、そして１０mMのＴｒｉｓ−ＨＣｌpH８．
３、１．５mMのＭｇＣｌ2 、５０mMのＫＣｌ、１０mMの
β−メルカプトメタノール、０．０５％（ｗ／ｖ）のＴ
ｗｅｅｎ−２０、０．０５％のＮＰ−４０（Ｍｅｒｃ
ｋ，Ｚｕｅｒｉｃｈ）、２００μＭ／のｄＮＴＰｓ（Ｎ
＝Ｇ，Ａ，Ｔ又はＣ）及び５ＵのＶｅｎｔＴＭ ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）を含む１００μｌの反応液内に希釈する。温度段階
は、Ｔｅｃｈｎｅ ＰＨＣ−２温度サイクラーを使用し
て、９５℃／１分、５０℃／２分及び７２℃／４分であ
る。この第一のサイクルの後、オリゴヌクレオチド・プ
ライマー、Ｃ２１−５′（配列番号３１）及びＣ２１−
Ｌ３′（配列番号３３）又はＣ２１−Ｈ３′（配列番号
３２）の５０ピコモルを所望の５′−及び３′−末端で
ハイブリダイズさせ、完全な長さのＤＮＡフラグメント
を添加し、そして以下：９５℃／１分、６０℃／２分及
び７２℃／２分、のサイクリング・パラメーターを使用
する約２０サイクルのＰＣＲ反応において増幅する。次
に、このＰＣＲ混合液を、クロロホルム１容量で１回抽
出し、そして８Ｍ ＬｉＣｌの１／１０容及びエタノー
ルの３容の添加により、そのＤＮＡを沈殿させる。この
沈殿ＤＮＡを、Ｈ2 Ｏに再溶解し、そして供給者（Ｂｏ
ｅｈｒｉｎｇｅｒ，ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）により示された条件下で、ＨｉｎｄIII 及びＢａｍ
ＨＩ制限酵素処理エンドヌクレアーゼにより処理する。
所望のサイズのＤＮＡフラグメント（Ｃ２１−Ｌ１＝４
１６塩基対及びＣ２１−Ｈ１＝４５９塩基対）を、１％
アガロース／ＴＢＥ内で、電気泳動により精製し、そし
てそのゲルから切除する。ゲル片をより小さなフラグメ
ントに切断し、液体窒素中５分間で冷凍し、そして次
に、マイクロ遠心分離機内の遠心分離（３０分間、１３
６０００×ｇ）により、ガラスウールを通して溶出す
る。室温での、フェノール−クロロホルム抽出及びＬｉ
Ｃｌ／エタノール沈殿の後、上記の精製ＨｉｎｄIII −
ＢａｍＨＩ制限フラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ ＫＳ II Ｍ１３＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサ
ブクローニングし、そしてコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）細胞（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬからのＨＢ１０１
株）にトランスフェクトする。正確なサイズのＤＮＡ挿
入物を含むＫＳ＋Ｃ２１／Ｌ１又はＣ２１／Ｈ１のどち
らかの多数のプラスミド・クローンを、Ｓｅｑｕｅｎａ
ｓｅ（ＵＳＢ）を使用して配列決定する。このＤＮＡ配
列内の点突然変異誘発及び／又は欠失を、異なったクロ
ーン間でのＤＮＡ制限酵素フラグメントの交換及び／又
は頒布された手順（ｋａｍｍａｎｎ，Ｍ．，Ｌａｕｆ
ｓ，Ｊ．，Ｓｃｈｅｌｌ Ｊ．ａｎｄ Ｇｒｏｎｅｎｂ
ｏｒｎ Ｂ．，１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１７：５４０４）に従うオリゴヌクレオチド特異
的ＰＣＲ突然変異誘発により訂正する。正しいＤＮＡ配
列を示すＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩフラグメントを、次
に、Ｌ又はＨ鎖発現ベクターにサブクローニングし、プ
ラスミドＨＣＭＶ−カッパ−Ｃ２１／Ｌ１及びＨＣＭＶ
−ガンマ１−Ｃ２１／Ｈ１（図１に示す）を創出する。
ここでは、再形状化ヒトＬ又はＨ鎖可変領域をコードす
る上記のＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントは、そ
れぞれ、ヒト・カッパ及びガンマＩ定常領域をコードす
るＤＮＡに結合されている。両方のプラスミドは、Ｓｉ
ｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０（ＳＶ４０）、ＨＣＭＶエ
ンハンサー・ドメイン、ＨＣＭＶプロモーター、及びア
ンピシリン選択遺伝子の原型を含んで成る（ｋｅｔｔｌ
ｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１、前記）。
【０１１３】再形状化ヒトＣ２１ ＶL 領域変異体Ｃ２
１−Ｌ２及びＣ２１−Ｌ３を、ＰＣＲ反応の間に生じる
組み換え事件（Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．，Ｆａｌｏｏｎａ，
Ｆ．，Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．，Ｓａｉｋｉ，Ｒ．，Ｈｏｒ
ｎ，Ｇ．ａｎｄ Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．，１９８６，Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｓｙｍｐ．，
５１：２６３ ａｎｄ Ｙｏｌｏｖ，Ａ．Ａ．ａｎｄ
Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．Ａ．，１９９０，Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８：３９８３）を利用するオ
リゴヌクレオチド−特異的突然変異誘発により作りだ
す。オリゴヌクレオチド・プライマー、Ｃ２１−５′
（配列番号３１）、Ｌ／Ｄ６０ＳＬ（配列番号３５）、
Ｌ／Ｄ６０Ｓ−ＳＬ（配列番号３６）（Ｃ２１−Ｌ２の
ための）、ＲＳＰ（配列番号３４）、Ｌ／Ｅ１Ｄ−Ｖ３
Ｌ（配列番号３７）、Ｌ／Ｅ１Ｄ−Ｖ３Ｌ−ＳＬ（配列
番号３８）（Ｃ２１−Ｌ３のための）及びＣ２１−Ｌ
３′（配列番号３３）（Ｃ２１−Ｌ２及び−Ｌ３のため
の）を、２つのＬ鎖のＶ−領域変異体のそれぞれのため
の、２つのＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅により作り
だすために合成する。ターミナル・オリゴヌレクオチド
・プライマー（Ｃ２１−５′，ＲＳＰ及びＣ２１−Ｌ
３′）を除き、オリゴヌクレオチドは、所望のコドン変
更の必要のある配列を取り込む。プライマー対ＲＳＰ及
びＬ／Ｅ１Ｄ−Ｖ３Ｌを除き、約５０ピコモルの適切な
プライマー対を、約１０ngのＫＳ＋Ｃ２１／Ｌ１由来Ｘ
ｈｏＩ−ＮｏｔＩフラグメントと組合せ、３ユニットの
ＶｅｎｔＴＭＤＮＡポリメラーゼ及び２５ＰＣＲ増幅サ
イクルを使用する（６０℃／２５秒、７２℃／４０秒及
び９３℃／２５秒）。プライマー対ＲＳＰ及びＬ／Ｅ１
Ｄ−Ｖ３Ｌのために、約１５０ngのＫＳ＋Ｃ２１／Ｌ１
プラスミドＤＮＡをテンプレートとして使用し、３５サ
イクル（４０℃／３０秒、７２℃／１分及び９３℃／３
０秒）を使用して所望のＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増
幅する。これらの反応の生成物を、アガロース・ゲル電
気泳動により精製し、最初に結合させ、そして約５〜３
０ngのそれぞれのＤＮＡフラグメントを、５ユニットの
ＶｅｎｔＴＭ ＤＮＡポリメラーゼにより増大させる
（９５℃／１分、５０℃／２分及び７２℃／４分）。タ
ーミナル・オリゴヌクレオチド・プライマーＣ２１−
５′及びＣ２１−Ｌ３′を次に添加し、そしてその結合
した完全な長さのＤＮＡフラグメントを、２５サイクル
（９５℃／１分、５０℃／２分及び７２℃／２分）を使
用してＰＣＲ増幅する。Ｃ２１−Ｌ２及びＣ２１−Ｌ３
のためにＰＣＲ増幅されたＤＮＡを、次に、ＤＮＡ制限
エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩを使用
した処理の後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ II Ｍ
１３＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングす
る。次に、正しい配列を、前記のように、ＨＣＭＶ−ガ
ンマ１−発現ベクターに転移させる。
【０１１４】再形状化ヒトＣ２１ ＶH 領域変異体Ｃ２
１−Ｈ３，Ｃ２１−Ｈａｙ１及びＣ２１−Ｈａｙ３を、
Ｃ２１−Ｌ１及びＣ２１−Ｌ２のために記載された同様
の方法で作りだす。これらのＣ２１ ＶH 領域変異体を
得るために、オリゴヌクレオチド・プライマー、Ｃ２１
−５′，Ｈ／Ｒ３８Ｋ−Ａ４０Ｒ−Ｌ（配列番号３
９）、Ｈ／Ｒ３８Ｋ−Ａ４０Ｒ−ＳＬ（配列番号４
０）、Ｈ／Ｒ６７Ｋ−Ｌ（配列番号４１）、Ｈ／Ｒ６７
Ｋ−ＳＬ（配列番号４２）、Ｈ／Ｒ８７Ｔ−Ｌ（配列番
号４３）、Ｈ／Ｒ８７Ｔ−Ｓ（配列番号４４）、Ｈａｙ
ＦＲ２（配列番号４５）、ＨａｙＦＲ２−Ｓ（配列番号
４７）、ＨａｙＦＲ３（配列番号４８）、ＨａｙＦＲ３
Ｓ（配列番号４９）及びＣ２１−Ｈ３′を、ＤＮＡテン
プレートとして、すなわち、異なった再形状化ヒトＣ２
１のＶH 変異体のための所望のコドン変更を含む２本鎖
ＤＮＡフラグメントとして、Ｃ２１−Ｈ１（Ｃ２１−Ｈ
３及びＣ２１−Ｈａｙ１のための）及びＣ２１−Ｈ３
（Ｃ２１−Ｈａｙ３のための）を使用したＰＣＲ増幅の
ために使用する。対応するアガロース・ゲル精製フラグ
メントを次にＰＣＲ組み換えし、前記のように、完全な
長さのＤＮＡフラグメントを産生する。ＤＮＡ制限エン
ドヌクレアーゼＨｉｎｄIII 及びＢａｍＨＩによる処
理、これに続く、前記のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ
II Ｍ１３＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へのクローニ
ングの後に、ＨＣＭＶ−ガンマ１−発現ベクターにクロ
ーニングされる前にその正しい配列についてプラスミド
のクローンをチェックする。
【０１１５】例４：ＣＯＳ細胞中の組み換えプラスミド
のトランジエント発現 再形状化ヒトＣ２１ Ｈ及びＬ鎖をコードする遺伝子を
有するＨＣＭＶ発現ベクターの１０μｇを使用して、Ｃ
ＯＳ細胞をエレクトロポレーションする。１０μｇのＨ
−及びＬ−鎖発現プラスミドを、ＰＢＳ／ｏ（ＧＩＢＣ
Ｏ−ＢＲＬ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによ
り供給されたＣａ２＋及びＭｇ２＋を欠くＰＢＳ；ｃａ
ｔ．ｎｏ．０４１−０４１９０Ｍ）中のＣＯＳ細胞の１
×１０7細胞／ml懸濁液０．８mlに添加する。次に、Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを、上記懸濁細
胞に、２５μＦの静電容量での１９００Ｖのパルスを届
けるために使用する。この細胞は、５％ｖ／ｖのガンマ
グロブリンを含まず、そして熱により不活性化されたウ
シ血清（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚ
ｅｒｌａｎｄ；ｃａｔ．ｎｏ．０６３−０６５１０Ｈ）
を含む１０mlのＤＭＥＭにプレーティングする前に、１
０分間、回復に供される。７２時間のインキュベーショ
ンの後、培地を回収し、細胞及び細胞破壊物を取り除く
ために遠心分離する。次に、このＣＯＳ細胞の上澄み液
を、０．４５μｍの膜を通して濾過し、そしてＥＬＩＳ
Ａにより、ヒト・ガンマ１／カッパ・イソタイプの集合
した抗体の存在について分析する。このヒト化抗体を、
更に、蛋白Ａアフィニティー・クロマトグラフィーによ
り精製する。
【０１１６】例５：ヒトＩｇＧ／カッパ製造のためのＥＬＩＳＡ検定 ９６−ｗｅｌｌのマイクロタイター・プレート（Ｎｕｃ
ＭａｘｉＳｏｒｂ，ｃａｔ，Ｎｏ．４３９４５４）
を、ＰＢＳ／ｏ，pH７．２中のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ
特異的；Ｄｉａｎｏｖａ，＃１０９−００５−０９８）
の１：１０００希釈の５０μｌにより、一夜、被覆す
る。この段階及び全てのこれに続く段階の後、プレート
を、２００μｌのＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−
２０を含むＰＢＳ／ｏ pH７．２）で３×洗浄する。自
由な結合部位を、１００μｌのＲＩＡ−バッファー（Ｐ
ＢＳＴ中の１％ウシ血清アルブミン）により、３７℃で
１時間、保護する。５０μｌのサンプル、及びＲＩＡ−
バッファー中のそれらの希釈液を添加し、そして混合液
を３７℃で１時間インキュベーションする。高精製組み
換えヒト抗体Ｆ５−４４４（ヒト・ガンマ１／カッパ・
イソタイプ、欧州特許出願第４９８７６７号）が、標準
として役立つ。ＲＩＡ−バッファー中のワサビダイコン
・ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉ
ｔｚｅｒｌａｎ；ｃａｔ．ｎｏ．Ａ−７１６４）と結合
したアフィニティー−精製ヤギ抗−ヒト・カッパ−Ｌ鎖
抗血清の１：１０００希釈液の５０μｌを、次に使用
し、そして３７℃で１時間インキュベーションする。Ａ
ＢＴＳ（２，２′−アジノ−ビス（３−エチルベンズ−
チアゾリン−６−スルホン酸））基質溶液（ＢｉｏＲａ
ｄ，Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；
＃１７２−１０６４）を、発色のために使用する。適切
なインキュベーション時間の後、この酵素反応を２％
（ｗ／ｖ）のシュウ酸の等容量を使用して停止させる。
４１５nmでの吸収を、結合し、そして十分に集合したヒ
ト抗体の定量化のために使用する。
【０１１７】例６：ＣＯＳ細胞上澄み液からのヒト抗体の蛋白Ａ精製 トランジエント発現したヒト化抗体を、ＨＲ５／５ Ｆ
ＰＬＣカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，
Ｓｗｅｄｅｎ）中に充填した１mlのＰｒｏｓｅｐ Ａカ
ラム（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｌｔｄ，Ｄｕｒｈ
ａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ）上のアフィニティー・クロマト
グラフィーにより精製する。このカラムを、ＦＰＬＣ系
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅ
ｎ）上で、２ml／分の一定流速で操作し、そしてこのカ
ラムから溶出する蛋白を、２８０nmでの紫外線吸収によ
りフロー・セル内で検出する。このカラムを、ＰＢＳ／
ｏpH８．０（２０mMリン酸Ｎａ、１５０mM ＮａＣｌ）
の１０カラム容量で洗浄すること、１００mMのクエン酸
ナトリウム・バッファーpH３．０による前溶出するこ
と、及びＰＢＳ／ｏ pH８．０の１０カラム容量による
再平衡することにより、調製する。０．４５μｍ膜を通
しての濾過により清澄化された、ＣＯＳ細胞上澄み液
（２０〜５０ml）を、蠕動（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ）
ポンプにより上記カラムの上に直接的に充填する。次
に、このカラムを、紫外線吸収がベースラインに戻るま
でＰＢＳ／ｏ pH８．０で洗浄する。次に、ウシＩｇＧ
を、このベースラインがゼロに戻るまで１００mMクエン
酸ナトリウム・バッファーpH５．０で洗浄することによ
り、溶出する。最後に、１００mMクエン酸ナトリウム・
バッファーpH３．０を使用して、ヒト化抗体を溶出し
て、そしてその溶出液を、１ＭＴｒｉｚｍａ−Ｂａｓｅ
（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）
の添加により、直ちにpH７．０に調整する。このヒト化
抗体の精製度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，１９７０，Ｎａｔｕｒｅ，２７
７：６８０−６８５）を使用したＳＤＳ−ポリアクリル
アミド・ゲル電気泳動により分析する。バイオセンサー
分析のために、この中性とした蛋白Ａの溶出液を、Ｃｅ
ｎｔｒｉｃｏｎ−１０マイクロコンセントレーター（Ａ
ｍｉｃｏｎ）内で濃縮し、そしてこのバッファーをＰＢ
Ｓ／ｏ pH７．２に変更する。この抗体調整物の精製度
に依存して、この蛋白濃度を、２８０nmでの紫外線吸
収、又は、標準として既知の、マッチングするイソタイ
プの精製組み換えキメラ抗体Ｆ５−４４４を使用するヒ
ト・ガンマ／カッパＥＬＩＳＡの、いずれかにより定量
する。
【０１１８】例７：生体特異的相互作用検定（ＢＩＡ）
による、マウスと再形状化ヒトＣ２１抗体との結合活性
及び特異性の分析 再形状化ヒトＣ２１可変Ｌ及びＨ鎖の異なった組合せの
結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）及び特異性（ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃｉｔｙ）を、リアルタイムの生体特異的相互作用検
定（Ｊｏｅｎｓｓｏｎ，Ｕ．，Ｆａｅｇｅｒｓｔａｍ，
Ｌ．，Ｉｖａｒｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，
Ｂ．，Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．，Ｌｕｎｄｈ，Ｋ．，Ｌ
ｏｅｆａｓ，Ｓ．，Ｐｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．，Ｒｏｏｓ，
Ｈ．，Ｒｏｅｎｎｂｅｒｇ，Ｉ．，Ｓｊｏｅｌａｎｄｅ
ｒ，Ｓ．，Ｓｔｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．，Ｓｔａｈｌｂｅｒ
ｇ，Ｒ．，Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．，ＯＥｓｔｌｉ
ｎ，Ｈ．ａｎｄ Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ，Ｍ．，１９９
１，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１：６２０−６２
７）を使用して分析する。全ての実験を、ＣＭ５センサ
ー・チップを使用したＢＩＡｃｏｒｅ商標システム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐ
ｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）上で実施する。捕獲（ｃａｐ
ｔｕｒｅ）抗体として、約１１，０００RU（１１ng／mm
2 ）のポリクロナール・ウサギ抗−マウスＩｇＧ１（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｓｅｎｓｏｒＡＢ，Ｕｐｐｓ
ａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ，ｃａｔ．ｎｏ．ＢＲ−１０００
−５５）又はウサギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢから得る）を、本質的に
先に記載された（Ｊｏｅｎｓｓｏｎ，Ｕ．ｅｔ ａ
ｌ．，１９９１、前記）それらのアミノ基及びＥＤＣ／
ＮＨＳの化学を使用して、上記センサー・チップ上に固
定する。ヒトＩｇＥへの結合の集合速度を決定するため
に、それぞれの抗体について、４つの実験サイクルを実
施する。それぞれのサイクルは、一定量のテスト抗体と
その対応する受取抗体との結合、これに続く、このテス
ト抗体と固定濃度抗体（ヒトＩｇＥ；モノクロナール抗
体ＳＥ４４；３．１２５，６．２５，１２．５及び２５
nM）との相互作用、これに続く、４０mMＨＣｌを使用し
たその表面の最終的な再生から成る。実験の詳細は、以
下のようである：
【０１１９】〔１〕流速は、５μｌ／分であり； 〔２〕ＨＢＳ（１０mM Ｈｅｐｅｓ、３．４mM ＥＤＴ
Ａ、１５０mM ＮａＶ１、０．０５％ ＢＩＡ界面活性
剤、pH７．４）を操作バッファーとして使用し； 〔３〕テスト抗体（ＰＢＳ／ｏ pH７．２中の）を、Ｈ
ＢＳ中で、最終濃度５〜１０μｇ／mlまで希釈し、そし
て捕獲抗体に結合させ、１３００〜２２００RU（１．３
〜２．２ng／mm2 ）の結合テスト抗体を得て； 〔４〕ヒト・モノクロナール抗体ＩｇＥ（ＳＥ４４）
を、上記結合テスト抗体上を９分間通過させ； 〔５〕４μｌの４０mM ＨＣｌを、抗体−抗原複合体を
取り出すために使用し、そして次のサイクルのために、
その表面を準備し； 〔６〕この検定温度を２５℃とする。 この抗体−抗原相互作用の集合定数を、次に、Ｂｉｏｃ
ｏｒｅ商標システム内で実行されるコンピュータ・プロ
グラムを使用して計算する。
【０１２０】分解速度定数を決定するためにも、同様の
プロトコールを使用する、但し、分解相は含まれない。
検定条件は、先に記載したものと同じである。テスト抗
体を、固定された受取（ｃａｔｃｈｉｎｇ）抗体を介し
て、最初に上記センサー・チップ表面に結合させる。最
も高い濃度（２５nM）でのＩｇＥ（ＳＥ４４）を、上記
抗体に結合させる。結合後、ＨＢＳバッファーを、５μ
ｌ／分の一定流速で上記センサー・チップ表面を通過さ
せ、そして１５〜２５分間にわたり共鳴シグナルの減少
を監視する。このセンサー・チップを、最後に、４μｌ
の４０mM ＨＣｌ溶液で洗浄することにより再生する。
抗体：ＩｇＥ複合体の分解は、一次反応であるため、こ
のセンサーグラムの線型部分を、ＢＩＯＣＯＲＥ商標シ
ステム内で実行されるコンピュータ・プログラムを使用
してその分解速度定数を計算するために使用する。
【０１２１】ヒト化Ｃ２１抗体の、速度定数Ｋass （抗
体−抗原集合物の速度定数）及びＫ diss（抗体抗原複合
体の分解の速度定数）及び結合活性（等量定数Ｋaff に
より表される）を、表１に要約する。表１：再形状化ヒ
トＣ２１抗体の速度定数及び結合活性。Ｋass について
は、独立実験の数をカッコ内に与え；それぞれのＫdiss
を、２つの独立した実験において決定する。
【０１２２】
【表１】
【０１２３】これらのヒトＣ−２１抗体の全ては、殆ど
同じ集合定数をもっている。結合の結合活性における減
少は、主に、高い分解速度により引き起こされる。再形
状化ヒトＣ２１ Ｌ鎖の異なる変異体を、そのアミノ末
端での位置１及び３の重要性について分析する。抗原へ
の良好な結合は、これらの位置でのアミノ酸が上記Ｃ２
１ Ｌ鎖中に在るものと同じであるときに得られる。完
全なヒトＫＡＦを使用すれば、ＦＲ１が、そのＨ鎖パー
トナーにも係わらず結合を減少させる。
【０１２４】本再形状化ヒトＣ２１抗体を、生体特異的
相互作用検定により、ヒト免疫グロブリンの全てのイソ
タイプへの結合についてもテストする。最初に、テスト
抗体を、前記のように、センサーチップ上の固定化捕獲
抗体に別々に結合させる。次に、それぞれの固体化ウサ
ギ抗−ヒトＩｇＧとウサギ抗−マウスＩｇＧ１抗体との
交差活性を、全イソタイプ、ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＡ
１，ＩｇＡ２，ＩｇＧ４，ＩｇＧ３，ＩｇＧ２，ＩｇＧ
１及びＩｇＥ（ＳＥ４４）のヒト免疫グロブリンの５μ
ｇ／mlをそれぞれ５分間上記前処理された表面上に次々
に通過させる前に、キメラ抗−ＣＥＡ抗体１０μｇ／ml
ＲｅＫ．４１を使用して５分間遮断（ｂｌｏｃｋ）す
る（ヒト・ガンマ１／カッパ、欧州特許出願第３２３８
０６）。最後に、この表面を、４０mM ＨＣｌにより再
生する。流速、温度及び他の条件は、前記のものと同じ
である。センサーグラムを、ＢＩＯＣＯＲＥ商標システ
ムを使用して記録する。本再形状化されたヒトＣ２１抗
体は、ヒトＩｇＥイソタイプに特異的である。
【０１２５】例８：永久細胞系の調製 トランスフェクションのための、再形状化されたＴＥＳ
Ｃ−２１ヒトＣＭＶＨ−及びＬ−鎖発現ベクターのプラ
スミドＤＮＡを、塩化セシウム勾配における平衡のため
の遠心分離により２回精製する。この組み換え免疫グロ
ブリン遺伝子を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ装置（Ｂｉｏ
Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）の使用によるエレク
トロポレーションにより、マウス骨髄腫ＮＳＯ細胞に導
入する。ＮＳＯ細胞（２〜３×１０7 ）を、リン酸塩−
バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そしてＢｓ
ｐＣＩ−線状化Ｈ−及びＬ−鎖プラスミドＤＮＡのそれ
ぞれ１０μｇを含む０．８mlのＰＢＳに再懸濁する。２
１０Ｖの電場及び９６０μFDの静電容量で、エレクトロ
ポレーションを実施する。回収した細胞を、２％ＦＢＳ
（胎児ウシ血清）を含む無蛋白ハイブリドーマ培地（Ｐ
ＦＨＭ，Ｇｉｂｃｏ）中で希釈し、そして９６−ｗｅｌ
ｌのマイクロタイター・プレート内にｗｅｌｌ当たり１
０4 細胞でプレーティングする。４８時間のインキュベ
ーションの後、トランスフェクト細胞を、０．７mg／ml
のＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ）及び２％のＦＣＳ（胎児ウシ
血清）を含むＰＦＨＭ内で選択する。２週間後、薬剤耐
性コロニーを含むｗｅｌｌを、ＥＬＩＳＡによるヒトＩ
ｇＧの製造のために、スクリーニングする。ＥＬＩＳＡ
は、上記培養上澄み液内に発現した組み換えヒトＩｇＧ
／カッパ抗体の定量のために開発される。Ｉｍｍｕｌｏ
ｎ２（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｓ）の９６−ｗｅｌｌ
プレートを、室温で、ＰＢＳ中の０．５μｇ／mlのヤギ
抗−ヒト・カッパ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ）の１００μｌにより、一夜被覆する。次に、ｗｅ
ｌｌを、Ｂｌｏｔｔｏ（ＰＢＳ中の５％乾燥ミルク粉）
により１時間、ブロックし、そして０．０５％のＴｗｅ
ｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで洗浄する。培養
上澄み液（５０μｌ）を、上記被覆ｗｅｌｌに添加し、
そして１時間インキュベーションする。ＰＢＳＴで洗浄
後、Ｂｌｏｔｔｏ内で１／５０，０００に希釈したワサ
ビダイコン・ペルオキシダーゼ−結合のヤキ抗−ヒトＩ
ｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ）の１００μｌを、それぞれのｗ
ｅｌｌに添加し、そしてそのプレートを１時間インキュ
ベーションする。０．１％の３′，３″，５′，５″−
テトラメチル・ベンジジン（Ｓｉｇｍａ）及び０．００
３％の過酸化水素（ｓｉｇｍａ）を含むペルオキシダー
ゼ基質溶液を、ｗｅｌｌ当たり１００μｌで添加し、そ
して室温で０．５時間インキュベーションを行う。この
反応を５０μｌの２Ｍ硫酸の添加により停止し、そして
それぞれのｗｅｌｌ中の反応混合液の吸光度を、Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈ ＭＲ５０００プレート・リーダーを使用し
て４５０nmでの指示を読む。再形状化されたＴＥＳＣ−
２１ヒトＣＭＶ発現プラスミド、Ｈ１，Ｈ３，Ｌ１、及
びＬ３を、４つの組合せ：Ｈ３Ｌ１，Ｈ３Ｌ３，Ｈ１Ｌ
１、及びＨ１Ｌ３内のＮＳＯ細胞をトランスフェクトす
るために使用する。Ｈ３Ｌ１，Ｈ３Ｌ３，Ｈ１Ｌ１、及
びＨ１Ｌ３のそれぞれ１４２，１２２，６８、及び６４
ｗｅｌｌの全てが、０．０１より低いバックグランドを
伴って、０．０５よりも大きい吸光度の読みを与える。
それぞれの組合せのために、ＩｇＧの分泌レベルに基づ
く１つの細胞系：Ｈ３Ｌ１抗体を分泌するＥＨ３１．
８；Ｈ３Ｌ３抗体を分泌するＥＨ３３．１６；Ｈ１Ｌ１
抗体を分泌するＥＨ１１．１３；及びＨ１Ｌ３抗体を分
泌するＥＨ１３．５を選ぶ。
【０１２６】寄託データ： 以下の細胞系を、１９９２年９月２３日に、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ（ＡＴＣＣ），１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄ
ｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ ２０８５２，
Ｕ．Ｓ．Ａ．に寄託した（寄託番号をカッコ内に与え
る）。 再形状化されたヒト抗体Ｈ３Ｌ１を生産する細胞系ＥＨ
３１．８（ＨＢ １１１３０） 再形状化されたヒト抗体Ｈ１Ｌ１を生産する細胞系ＥＨ
１１．１３（ＨＢ １１１３２） ネズミ・モノクロナール抗体ＴＥＳ−Ｃ２１を生産する
細胞系ＴＥＳ−Ｃ２１（ＨＢ １１１３３） 再形状化されたヒト抗体Ｈ３Ｌ３を生産する細胞系ＥＨ
３１．１６（ＨＢ １１１３１） 再形状化されたヒト抗体Ｈ１Ｌ３を生産する細胞系ＥＨ
１３．５（ＨＢ １１１３４）
【０１２７】配列の列挙 （１）一般情報： （ｉ）出願者： （Ａ）名称：ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ ＡＧ （Ｂ）通り：Ｋｌｙｂｅｃｋｓｔｒ．１４１ （Ｃ）町：Ｂａｓｌｅ （Ｅ）国：スイス （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：４００２ （Ｇ）電話：＋４１ ６１ ６９ １１ １１ （Ｈ）テレファックス：＋４１ ６１ ６９６ ７９
７６ （Ｉ）テレックス：９６２ ９９１ （Ａ）名称：ＴＡＮＯＸ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ，ＩＮ
Ｃ． （Ｂ）通り：１０３０１ Ｓｔｅｌｌａ Ｌｉｎｋ （Ｃ）町：Ｈｏｕｓｔｏｎ （Ｄ）州：Ｔｅｘａｓ （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：７７０２５ （ii）発明の名称：免疫グロブリンイソタイプに対する
再形状化されたモノクローナル抗体 (iii) 配列の数：４９ （iv）コンピューター読み取りフォーム： （Ａ）媒体タイプ：Ｆｌｏｐｐｙ ｄｉｓｋ （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ ＰＣ ｃｏｍｐａｔｉ
ｂｌｅ （Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェアー：ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａ
ｓｅ ＃１．０，Ｖｅｒｓｉｏｎ ＃１．２５（ＥＰ
Ｏ）
【０１２８】（２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３７０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：１．．３６９ （Ｄ）他の情報：／生成物＝ "抗体ＴＥＳ−Ｃ２１のＨ
鎖可変ドメイン" （xi）配列：配列番号１： CAG GTT CAG TTG CAG CAG TCT GGA GCG GAG CTG ATG AAG CCT GGG 45 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly 1 5 10 15 GCC TCA GTG AAG ATC TCC TGC AAG ACT ACT GGC TAC ACA TTC AGT 90 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Thr Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 ATG TAC TGG TTA GAG TGG GTA AAG CAG AGG CCT GGA CAT GGC CTT 135 Met Tyr Trp Leu Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 35 40 45 GAG TGG GTT GGA GAG ATT TCA CCT GGA ACT TTT ACT ACT AAC TAC 180 Glu Trp Val Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr 50 55 60 AAT GAG AAA TTC AAG GCC AAG GCC ACA TTC ACT GCG GAT ACA TCC 225 Asn Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser 65 70 75 TCC AAC ACA GCC TAC CTG CAA CTC AGC GGC CTG ACA TCT GAG GAC 270 Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90 TCT GCC GTC TAC TTC TGT GCA AGA TTC TCC CAT TTT TCC GGT AGT 315 Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser 95 100 105 AAC TAC GAC TAC TTT GAC TAC TGG GGC CAG GGC ACC TCT CTC ACA 360 Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr 110 115 120 GTC TCC TCC G 370 Val Ser Ser
【０１２９】（２）配列番号２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２３個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号２： Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Thr Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Met Tyr Trp Leu Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr 50 55 60 Asn Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90 Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser 95 100 105 Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Leu Thr 110 115 120 Val Ser Ser
【０１３０】（２）配列番号３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３２２個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：１．．３２１ （Ｄ）他の情報：／生成物＝ "ネズミ抗体ＴＥＳ−Ｃ２
１のＬ鎖可変ドメイン" （xi）配列：配列番号３： GAC ATC TTG CTG ACT CAG TCT CCA GCC ATC CTG TCT GTG AGT CCA 45 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro 1 5 10 15 GGA GAA AGA GTC AGT TTC TCC TGC AGG GCC AGT CAG AGC ATT GGC 90 Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly 20 25 30 ACA AAC ATA CAC TGG TAT CAG CAA AGA ACA GAT GGT TCT CCA AGG 135 Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asp Gly Ser Pro Arg 35 40 45 CTT CTC ATA AAG TAT GCT TCT GAG TCT ATC TCT GGG ATC CCT TCC 180 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60 AGG TTT AGT GGC AGT GGA TCA GGG ACA GAG TTT ACT CTA AAC ATC 225 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Asn Ile 65 70 75 AAC AGT GTG GAG TCT GAA GAT ATT GCA GAT TAT TAC TGT CAA CAA 270 Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 AGT GAT AGC TGG CCA ACC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAG 315 Ser Asp Ser Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 ATA AAA C 322 Ile Lys
【０１３１】（２）配列番号４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号４： Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro 1 5 10 15 Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly 20 25 30 Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asp Gly Ser Pro Arg 35 40 45 Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Asn Ile 65 70 75 Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Ser Asp Ser Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu 95 100 105 Ile Lys
【０１３２】（２）配列番号５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４２４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：２２．．４０２ （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍａｔ ペプチド （Ｂ）位置：８２．．４０２ （Ｄ）他の情報：／生成物＝ "Ｌ鎖可変部Ｃ２１−Ｌ
１" （xi）配列：配列番号５： CTCCGCAAGC TTGCCGCCAC C ATG GAG ACC CCC GCC CAG CTG CTG TTC 48 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe -20 -15 CTG CTG CTG CTG TGG CTG CCC GAC ACC ACC GGC GAC ATC CTG CTG 93 Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Asp Ile Leu Leu -10 -5 1 ACC CAG AGC CCC GGC ACC CTG AGC CTG AGC CCC GGC GAG AGG GCC 138 Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala 5 10 15 ACC CTG AGC TGC AGG GCC AGC CAG AGC ATC GGC ACC AAC ATC CAC 183 Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His 20 25 30 TGG TAC CAG CAG AAG CCC GGC CAG GCC CCC AGG CTG CTG ATC AAG 228 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys 35 40 45 TAC GCC AGC GAG AGC ATC AGC GGC ATC CCC AGC AGG TTC AGC GGC 273 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 AGC GGC AGC GGC ACC GAC TTC ACC CTG ACC ATC AGC AGG CTG GAG 318 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 CCC GAG GAC TTC GCC ATG TAC TAC TGC CAG CAG AGC GAC AGC TGG 363 Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp 80 85 90 CCC ACC ACC TTC GGC CAG GGC ACC AAG GTG GAG ATC AAA 402 Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 95 100 105 CGTGAGTATT CTAGAAGGAT CC 424
【０１３３】（２）配列番号６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号６： Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu -20 -15 -10 Pro Asp Thr Thr Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr -5 1 5 10 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 15 20 25 Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile 45 50 55 Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 60 65 70 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met 75 80 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gln 90 95 100 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 105
【０１３４】（２）配列番号７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４２４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：２２．．４０２ （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍａｔ ペプチド （Ｂ）位置：８２．．４０２ （Ｄ）他の情報：／生成物＝ "Ｌ鎖可変部Ｃ２１−Ｌ
２" （xi）配列：配列番号７： CTCCGCAAGC TTGCCGCCAC C ATG GAG ACC CCC GCC CAG CTG CTG TTC 48 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe -20 -15 CTG CTG CTG CTG TGG CTG CCC GAC ACC ACC GGC GAC ATC CTG CTG 93 Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Asp Ile Leu Leu -10 -5 1 ACC CAG AGC CCC GGC ACC CTG AGC CTG AGC CCC GGC GAG AGG GCC 138 Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala 5 10 15 ACC CTG AGC TGC AGG GCC AGC CAG AGC ATC GGC ACC AAC ATC CAC 183 Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His 20 25 30 TGG TAC CAG CAG AAG CCC GGC CAG GCC CCC AGG CTG CTG ATC AAG 228 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys 35 40 45 TAC GCC AGC GAG AGC ATC AGC GGC ATC CCC GAC AGG TTC AGC GGC 273 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 AGC GGC AGC GGC ACC GAC TTC ACC CTG ACC ATC AGC AGG CTG GAG 318 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 CCC GAG GAC TTC GCC ATG TAC TAC TGC CAG CAG AGC GAC AGC TGG 363 Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp 80 85 90 CCC ACC ACC TTC GGC CAG GGC ACC AAG GTG GAG ATC AAA 402 Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 95 100 105 CGTGAGTATT CTAGAAGGAT CC 424
【０１３５】（２）配列番号８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号８： Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu -20 -15 -10 Pro Asp Thr Thr Gly Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr -5 1 5 10 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 15 20 25 Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile 45 50 55 Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 60 65 70 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met 75 80 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gln 90 95 100 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 105
【０１３６】（２）配列番号９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４２４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：２２．．４０２ （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍａｔ ペプチド （Ｂ）位置：８２．．４０２ （Ｄ）他の情報：／生成物＝ "Ｌ鎖可変部Ｃ２１−Ｌ
３" （xi）配列：配列番号９： CTCCGCAAGC TTGCCGCCAC C ATG GAG ACC CCC GCC CAG CTG CTG TTC 48 Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe -20 -15 CTG CTG CTG CTG TGG CTG CCC GAC ACC ACC GGC GAG ATC GTG CTG 93 Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu -10 -5 1 ACC CAG AGC CCC GGC ACC CTG AGC CTG AGC CCC GGC GAG AGG GCC 138 Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala 5 10 15 ACC CTG AGC TGC AGG GCC AGC CAG AGC ATC GGC ACC AAC ATC CAC 183 Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His 20 25 30 TGG TAC CAG CAG AAG CCC GGC CAG GCC CCC AGG CTG CTG ATC AAG 228 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys 35 40 45 TAC GCC AGC GAG AGC ATC AGC GGC ATC CCC AGC AGG TTC AGC GGC 273 Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 AGC GGC AGC GGC ACC GAC TTC ACC CTG ACC ATC AGC AGG CTG GAG 318 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 CCC GAG GAC TTC GCC ATG TAC TAC TGC CAG CAG AGC GAC AGC TGG 363 Pro Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp 80 85 90 CCC ACC ACC TTC GGC CAG GGC ACC AAG GTG GAG ATC AAA 402 Pro Thr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 95 100 105 CGTGAGTATT CTAGAAGGAT CC 424
【０１３７】（２）配列番号１０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１２７個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号１０： Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu -20 -15 -10 Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr -5 1 5 10 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala 15 20 25 Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 30 35 40 Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile 45 50 55 Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 60 65 70 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Met 75 80 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Trp Pro Thr Thr Phe Gly Gln 90 95 100 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 105
【０１３８】（２）配列番号１１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４６８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：２２．．４４７ （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍａｔ ペプチド （Ｂ）位置：７９．．４４７ （Ｄ）他の情報：／生成物＝ "Ｈ鎖可変部Ｃ２１−Ｈ
１" （xi）配列：配列番号１１： CTCCGCAAGC TTGCCGCCAC C ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTG TTC TGC 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys -19 -15 CTG CTG GCC GTG GCC CCC GGC GCC CAC AGC CAG GTG CAG CTG GTG 93 Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val -10 -5 1 5 CAG AGC GGC GCC GAG GTG AAG AAG CCC GGC GCC AGC GTG AAG GTG 138 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val 10 15 20 AGC TGC AAG GCC AGC GGC TAC ACC TTC AGC ATG TAC TGG CTG GAG 183 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr Trp Leu Glu 25 30 35 TGG GTG AAG CAG AGG CCC GGC CAC GGC CTG GAG TGG GTG GGC GAG 228 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Val Gly Glu 40 45 50 ATC AGC CCC GGC ACC TTC ACC ACC AAC TAC AAC GAG AAG TTC AAG 273 Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 55 60 65 GCC AAG GCC ACC TTC ACC GCC GAC ACC AGC ACC AAC ACC GCC TAC 318 Ala Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 70 75 80 ATG GAG CTG AGC AGC CTG ACC AGC GAG GAC ACC GCC GTG TAC TAC 363 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 TGC GCC AGG TTC AGC CAC TTC AGC GGC AGC AAC TAC GAC TAC TTC 408 Cys Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe 100 105 110 GAC TAC TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTG ACC GTG AGC TCA 447 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 GGTGAGTTCT AGAAGGGATC C 468
【０１３９】（２）配列番号１２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１４２個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号１２： Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro -19 -15 -10 -5 Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 1 5 10 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 15 20 25 Tyr Thr Phe Ser Met Tyr Trp Leu Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro 30 35 40 Gly His Gly Leu Glu Trp Val Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe 45 50 55 Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Phe Thr 60 65 70 Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 75 80 85 Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ser His 90 95 100 Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 105 110 115 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 120
【０１４０】（２）配列番号１３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４６８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：２２．．４４７ （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍａｔ ペプチド （Ｂ）位置：７９．．４４７ （Ｄ）他の情報：／生成物＝ "Ｈ鎖可変部Ｃ２１−Ｈ
３" （xi）配列：配列番号１３： CTCCGCAAGC TTGCCGCCAC C ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTG TTC TGC 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys -19 -15 CTG CTG GCC GTG GCC CCC GGC GCC CAC AGC CAG GTG CAG CTG GTG 93 Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val -10 -5 1 5 CAG AGC GGC GCC GAG GTG AAG AAG CCC GGC GCC AGC GTG AAG GTG 138 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val 10 15 20 AGC TGC AAG GCC AGC GGC TAC ACC TTC AGC ATG TAC TGG CTG GAG 183 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr Trp Leu Glu 25 30 35 TGG GTG AGG CAG GCC CCC GGC CAC GGC CTG GAG TGG GTG GGC GAG 228 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Val Gly Glu 40 45 50 ATC AGC CCC GGC ACC TTC ACC ACC AAC TAC AAC GAG AAG TTC AAG 273 Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 55 60 65 GCC AGG GCC ACC TTC ACC GCC GAC ACC AGC ACC AAC ACC GCC TAC 318 Ala Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr 70 75 80 ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGG AGC GAG GAC ACC GCC GTG TAC TAC 363 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 TGC GCC AGG TTC AGC CAC TTC AGC GGC AGC AAC TAC GAC TAC TTC 408 Cys Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe 100 105 110 GAC TAC TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTG ACC GTG AGC TCA 447 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 GGTGAGTTCT AGAAGGGATC C 468
【０１４１】（２）配列番号１４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１４２個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号１４： Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro -19 -15 -10 -5 Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 1 5 10 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 15 20 25 Tyr Thr Phe Ser Met Tyr Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro 30 35 40 Gly His Gly Leu Glu Trp Val Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe 45 50 55 Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ala Arg Ala Thr Phe Thr 60 65 70 Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 75 80 85 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ser His 90 95 100 Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 105 110 115 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 120
【０１４２】（２）配列番号１５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４６７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：２２．．４４７ （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍａｔ ペプチド （Ｂ）位置：７９．．４４７ （Ｄ）他の情報：／生成物＝ "Ｈ鎖可変部Ｃ２１−Ｈａ
ｙ１" （xi）配列：配列番号１５： CTCCGCAAGC TTGCCGCCAC C ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTG TTC TGC 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys -19 -15 CTG CTG GCC GTG GCC CCC GGC GCC CAC AGC CAG GTG CAG CTG GTG 93 Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val -10 -5 1 5 CAG AGC GGC GCC GAG GTG AAG AAG CCC GGC GCC AGC GTG AAG GTG 138 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val 10 15 20 AGC TGC AAG GCC AGC GGC TAC ACC TTC AGC ATG TAC TGG CTG GAG 183 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr Trp Leu Glu 25 30 35 TGG GTG AAG CAG AGG CCC GGC CAG AGG CTG GAG TGG ATG GGC GAG 228 Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Glu 40 45 50 ATC AGC CCC GGC ACC TTC ACC ACC AAC TAC AAC GAG AAG TTC AAG 273 Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 55 60 65 GCC AAG GCC ACC TTC ACC GCC GAC ACC AGC GCC AGC ACC GCC TAC 318 Ala Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 70 75 80 ATG GAG CTG AGC AGC CTG ACC AGC GAG GAC ACC GCC GTG TAC TAC 363 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 TGC GCC AGG TTC AGC CAC TTC AGC GGC AGC AAC TAC GAC TAC TTC 408 Cys Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe 100 105 110 GAC TAC TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTG ACC GTG AGC TCA 447 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 GGTGAGTTCT AGAAGGATCC 467
【０１４３】（２）配列番号１６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１４２個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号１６： Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro -19 -15 -10 -5 Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 1 5 10 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 15 20 25 Tyr Thr Phe Ser Met Tyr Trp Leu Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro 30 35 40 Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe 45 50 55 Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Phe Thr 60 65 70 Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 75 80 85 Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ser His 90 95 100 Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 105 110 115 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 120
【０１４４】（２）配列番号１７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４６７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤＳ （Ｂ）位置：２２．．４４７ （ix）特徴： （Ａ）ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ｍａｔ ペプチド （Ｂ）位置：７９．．４４７ （Ｄ）他の情報：／生成物＝ "Ｈ鎖可変部Ｃ２１−Ｈａ
ｙ３" （xi）配列：配列番号１７： CTCCGCAAGC TTGCCGCCAC C ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTG TTC TGC 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys -19 -15 CTG CTG GCC GTG GCC CCC GGC GCC CAC AGC CAG GTG CAG CTG GTG 93 Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val -10 -5 1 5 CAG AGC GGC GCC GAG GTG AAG AAG CCC GGC GCC AGC GTG AAG GTG 138 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val 10 15 20 AGC TGC AAG GCC AGC GGC TAC ACC TTC AGC ATG TAC TGG CTG GAG 183 Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Met Tyr Trp Leu Glu 25 30 35 TGG GTG AGG CAG GCC CCC GGC CAG AGG CTG GAG TGG ATG GGC GAG 228 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Glu 40 45 50 ATC AGC CCC GGC ACC TTC ACC ACC AAC TAC AAC GAG AAG TTC AAG 273 Ile Ser Pro Gly Thr Phe Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 55 60 65 GCC AGG GCC ACC TTC ACC GCC GAC ACC AGC GCC AGC ACC GCC TAC 318 Ala Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 70 75 80 ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGG AGC GAG GAC ACC GCC GTG TAC TAC 363 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 TGC GCC AGG TTC AGC CAC TTC AGC GGC AGC AAC TAC GAC TAC TTC 408 Cys Ala Arg Phe Ser His Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe 100 105 110 GAC TAC TGG GGC CAG GGC ACC CTG GTG ACC GTG AGC TCA 447 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 GGTGAGTTCT AGAAGGATCC 467
【０１４５】（２）配列番号１８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１４２個のアミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：タンパク質 （xi）配列：配列番号１８： Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro -19 -15 -10 -5 Gly Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val 1 5 10 Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly 15 20 25 Tyr Thr Phe Ser Met Tyr Trp Leu Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro 30 35 40 Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Ser Pro Gly Thr Phe 45 50 55 Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Ala Arg Ala Thr Phe Thr 60 65 70 Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 75 80 85 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Ser His 90 95 100 Phe Ser Gly Ser Asn Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 105 110 115 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 120
【０１４６】（２）配列番号１９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０５個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号１９： TGAAGAAAGC TTGCCGCCAC CATGGAGACC CCCGCCCAGC TGCTGTTCCT 50 GCTGCTGCTG TGGCTGCCCG ACACCACCGG CGACATCCTG CTGACCCAGA 100 GCCCC 105
【０１４７】（２）配列番号２０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：９５個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号２０： GATGTTGGTG CCGATGCTCT GGCTGGCCCT GCAGCTCAGG GTGGCCCTCT 50 CGCCGGGGCT CAGGCTCAGG GTGCCGGGGC TCTGGGTCAG CAGGA 95
【０１４８】（２）配列番号２１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：７５個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号２１： CAGAGCATCG GCACCAACAT CCACTGGTAC CAGCAGAAGC CCGGCCAGGC 50 CCCCAGGCTG CTGATCAAGT ACGCC 75
【０１４９】（２）配列番号２２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号２２： AGGGTGAAGT CGGTGCCGCT GCCGCTGCCG CTGAACCTGC TGGGGATGCC 50 GCTGATGCTC TCGCTGGCGT ACTTGATCAG CAGCCTG 87
【０１５０】（２）配列番号２３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号２３： GCGGCACCGA CTTCACCCTG ACCATCAGCA GGCTGGAGCC CGAGGACTTC 50 GCCATGTACT ACTGCCAGCA GAGCGACAGC TGGC 84
【０１５１】（２）配列番号２４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８２個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号２４： TTTGGATCCT TCTAGAATAC TCACGTTTGA TCTCCACCTT GGTGCCCTGG 50 CCGAAGGTGG TGGGCCAGCT GTCGCTCTGC TG 82
【０１５２】（２）配列番号２５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：９７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号２５： TGAAGAAAGC TTGCCGCCAC CATGGACTGG ACCTGGAGGG TGTTCTGCCT 50 GCTGGCCGTG GCCCCCGGCG CCCACAGCCA GGTGCAGCTG GTGCAGA 97
【０１５３】（２）配列番号２６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号２６： CAGCCAGTAC ATGCTGAAGG TGTAGCCGCT GGCCTTGCAG CTCACCTTCA 50 CGCTGGCGCC GGGCTTCTTC ACCTCGGCGC CGCTCTGCAC CAGCTGCACC 100 TGG 103
【０１５４】（２）配列番号２７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０５個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号２７： CACCTTCAGC ATGTACTGGC TGGAGTGGGT GAAGCAGAGG CCCGGCCACG 50 GCCTGGAGTG GGTGGGCGAG ATCAGCCCCG GCACCTTCAC CACCAACTAC 100 AACGA 105
【０１５５】（２）配列番号２８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１０７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号２８： GTCCTCGCTG GTCAGGCTGC TCAGCTCCAT GTAGGCGGTG TTGGTGCTGG 50 TGTCGGCGGT GAAGGTGGCC TTGGCCTTGA ACTTCTCGTT GTAGTTGGTG 100 GTGAAGG 107
【０１５６】（２）配列番号２９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号２９： AGCAGCCTGA CCAGCGAGGA CACCGCCGTG TACTACTGCG CCAGGTTCAG 50 CCACTTCAGC GGCAGCAACT ACGACTACTT CGA 83
【０１５７】（２）配列番号３０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：８３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号３０： TTTGGATCCT TCTAGAACTC ACCTGAGCTC ACGGTCACCA GGGTGCCCTG 50 GCCCCAGTAG TCGAAGTAGT CGTAGTTGCT GCC 83
【０１５８】（２）配列番号３１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号３１： TGAAGAAAGC TTGCCGCCAC C 21
【０１５９】（２）配列番号３２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号３２： TTTGGATCCT TCTAGAACTC ACC 23
【０１６０】（２）配列番号３３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号３３： TTTGGATCCT TCTAGAATAC TCAC 24
【０１６１】（２）配列番号３４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号３４： AACAGCTATG ACCATG 16
【０１６２】（２）配列番号３５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号３５： CTGAACCTGT CGGGGATGCC GCTGATGCTC 30
【０１６３】（２）配列番号３６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２５個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号３６： CCCGACAGGT TCAGCGGCAG CGGCA 25
【０１６４】（２）配列番号３７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２２個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号３７： GGTCAGCACG ATCTCGCCGG TG 22
【０１６５】（２）配列番号３８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号３８： GAGATCGTGC TGACCCAGAG CCCCGGC 27
【０１６６】（２）配列番号３９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号３９： CCGGGGGCCT GCCTCACCCA CTCCAGCC 28
【０１６７】（２）配列番号４０についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２９個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号４０： GAGGCAGGCC CCCGGCCACG GCCTGGAGT 29
【０１６８】（２）配列番号４１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３４個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号４１： GAAGGTGGCC CTGGCCTTGA ACTTCTCGTT GTAG 34
【０１６９】（２）配列番号４２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２８個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号４２： CAAGGCCAGG GCCACCTTCA CCGCCGAC 28
【０１７０】（２）配列番号４３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号４３： GTCCTCGCTC CTCAGGCTGC TCAGCTCCAT G 31
【０１７１】（２）配列番号４４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号４４： CAGCCTGAGG AGCGAGGACA C 21
【０１７２】（２）配列番号４５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号４５： CCATCCACTC CAGCCTCTGG CCGGGCC 27
【０１７３】（２）配列番号４６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号４６： CCATCCACTC CAGCCTCTGG CCGGGGGCCT GCC 33
【０１７４】（２）配列番号４７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号４７： CAGAGGCTGG AGTGGATGGG CGAGATC 27
【０１７５】（２）配列番号４８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号４８： GTGCTGGCGC TGGTGTCGGC 20
【０１７６】（２）配列番号４９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２１個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム） （xi）配列：配列番号４９： ACCAGCGCCA GCACCGCCTA C 21
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトｋＬ鎖不変ドメインに融合されるＣ２１−
Ｌ１及びヒトｒ１Ｈ鎖不変ドメインに融合されるＣ２１
−Ｈ１を生成するために使用されるＨＣＭＶ−哺乳類発
現ベクターが示される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/19 7236−4Ｂ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 5/22 15/06 ＺＮＡ 15/13 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） 9050−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (71)出願人 592089191 タノックス バイオシステムズ インコー ポレイテッド ＴＡＮＯＸ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ ＩＮ ＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ アメリカ合衆国 テキサス州77025 ヒュ ーストンステラ リンク ロード 10301 (72)発明者 ノルマン ハルトマン スイス国，4125 リーヘン，グスタルテン ライベーク 67 (72)発明者 フランク コルビンガー ドイツ連邦共和国，79114 フライブルク, マルテゼローデンスシュトラーセ １デー (72)発明者 ジョゼ サルダナ イギリス国，イーエヌ１ １ティーイー, ミドルセックス，アンフイールド，リンコ ルン ウェイ 22エー

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 順に超可変部ＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣ
    ＤＲ３を含んで成る抗原結合部位を含んで成る、ＩｇＥ
    に対して特異的な再形状化されたヒトモノクローナル抗
    体；ここで前記ＣＤＲ１がアミノ酸配列Met-Tyr-Trp-Le
    u-Glu を有し、前記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Glu-Ile-Se
    r-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-
    Lys-Ala を有し、前記ＣＤＲ３が配列Phe-Ser-His-Phe-
    Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr-Phe-Asp-Ty
    r を有し、前記再形状化されたヒト抗体がネズミＣＤＲ
    −ドナー抗体ＴＥＳ−Ｃ２１の親和性に少なくともほぼ
    等しい抗原結合親和性を有し；前記再形状化された抗体
    の直接的な同等物又は誘導体。
  2. 【請求項２】 ａ）順に超可変部ＣＤＲ１，ＣＤＲ２及
    びＣＤＲ３を含んで成る第１ドメイン；ここで前記ＣＤ
    Ｒ１がアミノ酸配列Met-Tyr-Trp-Leu-Glu を有し、前記
    ＣＤＲ２がアミノ酸配列Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-
    Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala を有し、前
    記ＣＤＲ３が配列Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Ty
    r-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr を有し；及び ｂ）順に超可変部ＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含
    んで成る第２ドメイン；ここで前記ＣＤＲ１はアミノ酸
    配列Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His を
    有し、前記ＣＤＲ２がアミノ酸配列Tyr-Ala-Ser-Glu-Se
    r-Ile-Ser を有し、前記ＣＤＲ３がアミノ酸配列Gln-Gl
    n-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr を有し；を含んで成る
    抗原結合部位を含んで成り、前記再形状化されたヒト抗
    体がネズミＣＤＲ−ドナー抗体ＴＥＳ−Ｃ２１の親和性
    に少なくともほぼ等しい抗原結合親和性を有する請求項
    １記載の再形状化されたヒト抗体。
  3. 【請求項３】 （ａ）順に超可変部ＣＤＲ１H ，ＣＤＲ
    ２H 及びＣＤＲ３H並びにヒトＨ鎖の不変部又はそのフ
    ラグメントを含んで成る免疫グロブリンＨ鎖又はそのフ
    ラグメント；ここで前記ＣＤＲ１H はアミノ酸配列Met-
    Tyr-Trp-Leu-Glu を有し、前記ＣＤＲ２H がアミノ酸配
    列Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-
    Glu-Lys-Phe-Lys-Ala を有し、前記ＣＤＲ３H がアミノ
    酸配列Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-
    Phe-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr を有し；及び（ｂ）順に超可
    変部ＣＤＲ１L ，ＣＤＲ２L 及びＣＤＲ３L を含んで成
    るＬ鎖可変ドメイン並びにヒトＬ鎖の不変部又はそのフ
    ラグメントを含んで成る免疫グロブリンＬ鎖又はそのフ
    ラグメント；ここで前記ＣＤＲ１L がアミノ酸配列Arg-
    Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His を有し、前
    記ＣＤＲ２L がアミノ酸配列Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-
    Ser を有し、前記ＣＤＲ３L がアミノ酸配列Gln-Gln-Se
    r-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr を有する：を含んで成る請
    求項２記載の再形状化されたヒト抗体。
  4. 【請求項４】 （ａ）１位でのアミノ酸で開始し、そし
    て１２３位でのアミノ酸で終結する配列番号１１に示さ
    れる配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ド
    メイン及びヒトＨ鎖の不変部を含んで成るＨ鎖；及び
    （ｂ）１位でのアミノ酸で開始し、そして１０７位での
    アミノ酸で終結する配列番号５に示される配列と実質的
    に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒトＨ
    鎖の不変部を含んで成るＬ鎖を含んで成る請求項２記載
    の再形状化されたヒト抗体。
  5. 【請求項５】 （ａ）１位でのアミノ酸で開始し、そし
    て１２３位でのアミノ酸で終結する配列番号１３に示さ
    れる配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する可変ド
    メイン及びヒトＨ鎖の不変部を含んで成るＨ鎖；及び
    （ｂ）１位でのアミノ酸で開始し、そして１０７位での
    アミノ酸で終結する配列番号５に示される配列と実質的
    に同一のアミノ酸配列を有する可変ドメイン及びヒトＨ
    鎖の不変部を含んで成るＬ鎖を含んで成る請求項２記載
    の再形状化されたヒト抗体。
  6. 【請求項６】 前記Ｈ鎖がＨ鎖ヒト不変部ｒ１及びその
    誘導体を含んで成る請求項１〜５のいづれか１項記載の
    再形状化されたヒト抗体。
  7. 【請求項７】 前記Ｈ鎖がＨ鎖ヒト不変部ｒ１を含んで
    成り、そして前記Ｌ鎖がＬ鎖ヒト不変部κ及びその誘導
    体を含んで成る請求項３〜５のいづれか１項記載の再形
    状化されたヒト抗体。
  8. 【請求項８】 細胞系ＥＨ３１．８により生成されたＨ
    ３Ｌ１と命名された請求項５記載の再形状化されたヒト
    抗体又はその誘導体。
  9. 【請求項９】 細胞系ＥＨ１１．１３により生成された
    Ｈ１Ｌ１と命名された請求項４記載の再形状化されたヒ
    ト抗体又はその誘導体。
  10. 【請求項１０】 請求項１記載の再形状化されたヒト抗
    体の誘導体。
  11. 【請求項１１】 請求項１記載の再形状化されたヒト抗
    体、その直接的な同等物又は誘導体の調製方法であっ
    て、本発明のタンパク質を生成する適切な宿主を培養
    し、そして必要なら、前記タンパク質を単離し、そして
    場合によってはそれを誘導体に転換することを含んで成
    る方法。
  12. 【請求項１２】 ａ）選択的にＦＲ及びＣＤＲを含んで
    成る可変ドメインをコードする第１部分、ここで前記Ｃ
    ＤＲが順にＣＤＲ１H ，ＣＤＲ２H 及びＣＤＲ３H であ
    り、そのアミノ酸配列が請求項３に同定されており、及
    び場合によっては、 ｂ）ヒトＨ鎖不変部又はそのフラグメントをコードする
    第２部分を含んで成る、Ｈ鎖又はそのフラグメントをコ
    ードするＤＮＡ構造体。
  13. 【請求項１３】 ａ）選択的にＦＲ及びＣＤＲを含んで
    成る可変ドメインをコードする第１部分、ここで前記Ｃ
    ＤＲが順にＣＤＲ１L ，ＣＤＲ２L 及びＣＤＲ３L であ
    り、そのアミノ酸配列が請求項３に同定されており、及
    び場合によっては、 ｂ）ヒトＬ鎖不変部又はそのフラグメントをコードする
    第２部分を含んで成る、Ｌ鎖又はそのフラグメントをコ
    ードするＤＮＡ構造体。
  14. 【請求項１４】 請求項１２記載のＤＮＡ構造体及び／
    又は請求項１３記載のＤＮＡ構造体を含んで成るハイブ
    リッドベクター。
  15. 【請求項１５】 請求項１４記載のハイブリッドベクタ
    ーにより形質転換された宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 細胞系ＥＨ１１．１３である請求項１
    ５記載の宿主細胞。
  17. 【請求項１７】 細胞系ＥＨ３１．８である請求項１５
    記載の宿主細胞。
  18. 【請求項１８】 ヒトにおけるアレルギー反応の予防及
    び／又は処理に使用するための再形状化されたヒト抗
    体、その直接な同等物及び／又は誘導体。
  19. 【請求項１９】 請求項１記載の抗体、その直接的な同
    等物及び／又は誘導体、及び医薬的に許容できるキャリ
    ヤーを含んで成る医薬組成物。
  20. 【請求項２０】 ＩｇＥの定質又は定量測定への請求項
    １記載の抗体、その直接的な同等物及び／又は誘導体の
    使用。
  21. 【請求項２１】 請求項１記載の抗体、その直接的な同
    等物及び／又は誘導体を含んで成る、ＩｇＥの定質又は
    定量測定のための試験キット。
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