JPH06213897A

JPH06213897A - アルデヒド含有ポリマーから製造した生物学的活性試薬、検査キット、分析要素及び使用方法

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Publication number: JPH06213897A
Application number: JP5244785A
Authority: JP
Inventors: Richard Calvin Sutton; カルビンサットンリチャード; Ignazio S Ponticello; サルバトーレポンティセロイグナツィオ; Susan J Danielson; ジーンダニエルソンスーザン
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Eastman Kodak Co
Priority date: 1992-10-01
Filing date: 1993-09-30
Publication date: 1994-08-05
Anticipated expiration: 2017-08-05
Also published as: EP0597510B1; EP0597510A1; DE69319064T2; JP3311831B2; US5401633A; DE69319064D1

Abstract

(57)【要約】【目的】迅速且つ便利に製造することができ、種々の
使用条件下でコロイド的に安定である生物学的活性試薬
を提供する。【構成】生物学的活性試薬が、生物学的活性物質を側
鎖アルデヒド基を有するポリマー粒子に共有結合的に反
応させることによって製造される。このような基は、構
造：【化１】（式中、Ａｒはアリーレンであり、Ｒ及びＲ¹は独立に
水素、ハロゲン又は低級アルキルであり、Ｒ²及びＲ³
は独立に主鎖中の炭素数１〜４のアルキレンであり、Ｒ
⁴はアリーレンであり、ｍは０又は１であり、そしてｎ
は１〜４の整数である）により表わされる重合性モノマ
ーにより与えられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ポリマー粒子を使用し
て製造された生物学的活性試薬に関する。本発明はま
た、検査キット及びこれを含む分析要素並びにこのよう
な試薬を使用するイムノアッセイ（免疫分析）及び特異
的結合アッセイに関する。更に、本発明はこの試薬を使
用する分析的精製方法に関する。本発明は、種々の臨床
的、診断的、医学的及び研究的目的のために使用するこ
とができる。

【０００２】

【従来の技術】医療実務及び研究に於いて並びに分析及
び診断方法に於いて、生物学的流体のような種々の流体
中に存在する化学的及び生物学的物質の迅速で正確な分
析のための継続している必要性がある。例えば、人間又
は動物の体液又は組織中の医薬、ホルモン、ステロイ
ド、ポリペプチド、代謝産物、毒素、ウイルス、微生物
又は核酸の存在は、有効な研究、診断又は治療のために
迅速且つ正確に分析しなくてはならない。

【０００３】殆どの分析方法は、検出すべき未知の物質
（「リガンド」として知られている）が対応する「レセ
プター」分子と特異的に且つ優先的に反応する「特異的
結合」反応として知られているものに基づいている。殆
どのよく知られている特異的結合反応は、抗体及び抗原
（免疫的応答を生ずる物質、即ち抗体の産生）のような
免疫反応剤の間で起きるが、（糖質とレクチンとの間
の、アビジンとビオチンとの、又は補体核酸のハイブリ
ッド形成のような）他の特異的結合反応もまたよく知ら
れている。

【０００４】即ちレセプター分子は、ポリマー粒子、ガ
ラスビーズ、動物及び人間の赤血球、細菌細胞並びに種
々のサイズの他の固体粒子のような特定の基質の上に効
果的に固定されてきた。例えば、エポキシ、エルボキ
シ、アミノ、ヒドロキシ及びアルデヒドのような種々の
表面反応性基を有するポリマーから製造された担体粒子
が、米国特許第４，４０１，７６５号及び米国特許第
４，４８０，０４２号に記載されている。

【０００５】米国特許第４，５６３，４３１号には、生
物学的活性物質の結合のためにアルデヒド基に転化され
る表面アセタール基を有する生物学的活性ラテックス粒
子が記載されている。この外側のポリマーは、炭素数２
〜７のアミドアルキル基を介してビニル部分に結合して
いる側鎖アセタールを有するモノマーから製造される。
これに記載されているポリマーは親水性である傾向を有
し、それがかなりの水溶性を有しそれでイムノアッセイ
に於いて固体基質として有用ではないので、これは生物
学的試薬を製造するには最善ではない。

【０００６】米国特許第４，５５２，６３３号には、ク
ロトンアルデヒド、アクロレイン、メタクロレイン及び
シトラールのようなビニルモノマーにより与えれらる表
面アルデヒド基を有する他の微粒子担体が記載されてい
る。これらのモノマーは、それらがスチレン型モノマー
により与えられるような十分な疎水性を有していないの
で不利である。親水性であるクマクラ等により記載され
たモノマーは水性媒体中で長期間貯蔵する際に不安定で
ある。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】当該技術分野に於い
て、迅速且つ便利に製造することができ、種々の使用条
件下でコロイド的に安定である生物学的活性試薬を提供
するニーズが依然としてある。従来のアルデヒドモノマ
ーは水溶性の問題があり、特に乳化重合法を使用して重
合したとき、このモノマーはラテックスの水相を汚染す
る水溶性ホモポリマー及びコポリマーを形成する。更
に、このような親水性モノマーは、スチレン及びスチレ
ン誘導体のような望ましい疎水性モノマーと容易に共重
合しない。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記の問題点は、（Ｉ）
水に非膨潤性であり、その外表面が、側鎖アルデヒド基
を有し且つ構造：

【０００９】

【化２】

【００１０】（式中、Ａｒはアリーレンであり、Ｒ及び
Ｒ¹は独立に水素、ハロゲン又は低級アルキルであり、
Ｒ²及びＲ³は独立に主鎖中の炭素数１〜４のアルキレ
ンであり、Ｒ⁴はアリーレンであり、ｍは０又は１であ
り、そしてｎは１〜４の整数である）により表わされる
エチレン性不飽和重合性モノマーから誘導されるポリマ
ーからなる水不溶性粒子、並びに（II）該粒子に側鎖ア
ルデヒド基を介して共有結合で結合した生物学的活性物
質を含む生物学的活性試薬により克服される。

【００１１】本発明はまた、１個又はそれ以上の反応域
を有し、かつ該反応域の少なくとも１個に上記の生物学
的活性試薬を含有する流体浸透性基体からなる分析要素
を提供する。更に、特異的結合リガンドの測定方法は、Ａ．対象の特異的結合リガンド又はそのレセプターと、
上記の試薬（但し、該生物学的活性物質は該リガンド又
はそのレセプターの何れかと特異的に反応性である）と
の水不溶性特異的結合錯体を形成し、そしてＢ．該リガンドの存在又は量の指標として該錯体の存在
を検出することからなる。

【００１２】分析分離方法は、Ａ．生物学的活性物質を含有する混合物を、アフィニテ
ィークロマトグラフィー試薬（但し、該試薬は上記の通
りであり、そして特異的結合物質が生物学的活性物質の
検体混合物中の１種又はそれ以上の予め測定された生物
学的活性物質に対して特異的である）の上を通過させ
て、該試薬と予め測定された生物学的活性物質との錯体
を形成し、そしてＢ．１種又はそれ以上の錯体化した予め測定された物質
又は１種もしくはそれ以上の溶出液中に残留する物質の
何れかを捕集することからなる。

【００１３】本発明はまた、Ａ．対象の核酸と、上記の試薬（但し、該生物学的活性
物質は対象の核酸に対して相補的であるオリゴヌクレオ
チドである）との間の水不溶性ハイブリッド形成性生成
物を形成し、そしてＢ．対象の核酸の決定として該ハイブリッド形成性生成
物を検出することからなる核酸の検出方法を提供する。

【００１４】

【作用】本発明の実施で有用なポリマーは、側鎖アルデ
ヒド基を有し且つ構造：

【００１５】

【化３】

【００１６】により表わされる１種又はそれ以上のエチ
レン性不飽和重合性モノマーから誘導されるホモ−又は
コポリマーである。上記の式に於いて、Ａｒは、（フェ
ニレン、ナフチレン、キシリレン及びトリレンのよう
な）芳香核の炭素数が６〜１４の置換又は非置換のアリ
ーレンである。好ましくは、Ａｒは置換又は非置換のフ
ェニレンである。Ａｒは、１個又はそれ以上の（メチ
ル、エチル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ペンチル及び
ヘキシルのような）炭素数１〜６のアルキルで置換され
ていてもよい。好ましくは、これは非置換である。Ｒ²
は、オルト、メタ又はパラ位でＡｒに結合していてよ
く、パラ位が好ましい。

【００１７】Ｒ及びＲ¹は、独立に水素、（フルオロ、
クロロ又はブロモのような）ハロゲン又は（メチル、エ
チル、イソプロピル又はｎ−ブチルのような）炭素数１
〜４の置換若しくは非置換の低級アルキルである。好ま
しくは、Ｒは水素であり、Ｒ ¹は水素又はメチルであ
る。Ｒ²及びＲ³は、独立に（メチレン、エチレン、ト
リメチレン、イソプロピレン、ｎ−ブチレン及びｔ−ブ
チレンのような）主鎖中の炭素数が１〜４の置換又は非
置換のアルキレンである。好ましくはＲ²はメチレン
で、Ｒ³はメチレン及びエチレンである。

【００１８】Ｒ⁴は、（上記のＡｒと同様に定義され
る）芳香核の炭素数が６〜１４の置換又は非置換のアリ
ーレンである。好ましくは、Ｒ⁴は置換又は非置換のフ
ェニレンである。上記構造式に於いて、ｍは０又は１で
あり、そして好ましくはｍは０である。また、ｎは１，
２，３又は４であり、好ましくはｎは１である。

【００１９】特に有用なモノマーには、ｏ−，ｐ−又は
ｍ−ホルミルフェニルビニルベンジルエーテル、ｏ−，
ｐ−又はｍ−（２−ホルミルエチル）フェニルビニルベ
ンジルエーテル、２−，３−又は４−ホルミルナフチル
ビニルベンジルエーテル、（３−又は４−ホルミル−２
−メチルフェニル）ビニルベンジルエーテル、ホルミル
ビフェニリルビニルベンジルエーテル、及び４｛４−
［４−（４−ホルミルフェノキシメチル）フェノキシメ
チル］フェノキシメチル｝スチレンが含まれる。

【００２０】上記のモノマーは、１種又はそれ以上の他
のエチレン性不飽和重合性モノマーと共重合して有用な
コポリマーを与えることができる。更に詳しくは、この
コポリマーは一般に（ａ）１〜１００重量％の１種又はそれ以上の前記構造
によって表わされるエチレン性不飽和重合性モノマー、
（ｂ）０〜９９重量％の１種又はそれ以上の成分（ａ）
に定義されるもの以外の疎水性エチレン性不飽和重合性
モノマー、並びに（ｃ）０〜２０重量％の１種又はそれ
以上の成分（ａ）及び（ｂ）に定義されるもの以外のエ
チレン性不飽和重合性モノマーから誘導される単位を有
する。

【００２１】好ましくは、このポリマーは、２〜２０重
量％の成分（ａ）、７０〜９８重量％の成分（ｂ）及び
０〜１０重量％の成分（ｃ）からなる。上記の成分
（ｂ）の有用なモノマーには、ビニル芳香族化合物（例
えば、４−ビニルトルエン、α−メチルスチレン、２，
５−ジメチルスチレン、４−ｔ−ブチルスチレン及び２
−クロロスチレンのようなスチレン及びスチレン誘導
体）、アクリル酸エステル及びメタクリル酸エステル及
びアミド（例えば、メチルアクリレート、メチルメタク
リレート、ｎ−ブチルアクリレート、２−エチルヘキシ
ルメタクリレート、ベンジルアクリレート及びＮ−フェ
ニルアクリルアミド）、ブタジエン、アクリロニトリ
ル、酢酸ビニル、酢酸ビニルベンジル、臭化ビニル、塩
化ビニリデン並びに２個又はそれ以上の重合性基を有す
る架橋性モノマーのような、コポリマーに所望の追加の
疎水性を付与するエチレン性不飽和重合性オレフィンモ
ノマーが含まれる。有用な架橋性モノマーには、ジビニ
ルベンゼン、アリルアクリレート並びにジ−及びトリア
クリレート類及びメタクリレート類（例えば、２，２−
ジメチル−１，３−プロピレンジアクリレート、１，４
−シクロヘキシレンジメチレンジメタクリレート、エチ
リジントリメタクリレート、エチレンジアクリレート、
エチレンジメタクリレート、プロピレンジアクリレート
及びプロピレンジメタクリレート）並びにポリマー化学
の当業者に容易に明らかである他のものが含まれる。

【００２２】成分（ｃ）として有用なモノマーには、
（塩又は遊離酸として）負の又は正の電荷を有するモノ
マー及び非イオン性極性モノマーのような、性質が一層
親水性であるものが含まれる。帯電したモノマーの代表
的な例には、ナトリウム２−アクリルアミド−２−メ
チルプロパンスルホネート及びナトリウム３−アクリ
ロイルオキシプロパンスルホネートのような、スルホン
酸塩、硫酸塩又はカルボン酸塩が含まれる。代表的な非
イオン性極性モノマーには、ヒドロキシアルキルアクリ
レート及びメタクリレート（例えば、２−ヒドロキシエ
チルアクリレート、２，３−ジヒドロキシプロピルアク
リレート及び２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、
並びにアクリルアミド及びメタクリルアミド（例えば、
アクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、メ
タクリルアミド及びＮ−イソブチルアクリルアミド）が
含まれる。

【００２３】本発明のポリマーは、標準的な乳化重合法
又は懸濁重合法を使用して製造することができる。好ま
しくは、このポリマーは界面活性剤、乳化剤又はコロイ
ド安定化剤の不存在下で連続乳化重合を使用して製造さ
れる。本発明の試薬は、ポリマー粒子の外表面に反応性
基（即ち、側鎖アルデヒド基）を介してポリマー粒子に
共有結合で結合している１個又はそれ以上の生物学的活
性物質を有する。本明細書に於いて使用するとき、用語
「生物学的活性物質」は、生体内に見出される有機化合
物又は細胞物質若しくは生体の診断、治療又は遺伝子工
学で有用である有機化合物、及び他の生物学的又は化学
的物質と相互作用する能力を有する有機化合物の全てを
含むことを意味する。このような物質は生物学的液体中
に自然に生じているものであってもよく、そうでなくて
もよい。このような物質は、粒子上の反応性基との直接
的反応又は間接的反応を介して粒子に結合し得るもので
なくてはならない。多くのこのような結合方法はよく知
られている。

【００２４】所望ならば、生物学的活性物質を変性する
か又は化学的に変えて、結合のための結合単位を与える
ことを含む結合のための反応性基を与えることができ
る。共にオリゴヌクレオチドの変性に指向している米国
特許第４，９１４，２１０号及びＷＯ−Ａ−８９／２９
３２号、米国特許第４，７１９，１８２号、Ｅｒｌａｎ
ｇｅｒ他のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３４巻、１０
９０頁（１９５９年）、Ｗｅｓｔｏｎ他のＢｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，６１２巻、４０〜４９
頁（１９８０年）及びＢｏｒｚｉｎｉ他のＪ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４４巻、３２３〜３３２頁
（１９８１年）のような文献の教示を含む、このような
結合単位の化学的変性又は使用についての当該技術分野
に於いて公知の多数の技術がある。

【００２５】本発明の試薬を製造するための一般的な方
法は下記の通りである。即ち、ポリマー粒子を緩衝水溶
液（一般的にpH＝５．５〜８．５）中で生物学的活性物
質と混合する。粒子の固体％は一般的に０．０１〜１０
％であり、好ましくは０．１〜３％である。生物学的活
性物質の量は一般的に少なくとも１×１０^-4重量％であ
り、０．００１〜０．１重量％であることが好ましい。

【００２６】物質と粒子との混合は、２０〜３７℃の温
度で２〜３０時間行う。時間の長さは、温度、粒子上の
特定の反応性基、特定の生物学的活性物質及び所望の被
覆量と共に変わるであろう。どのような適当な緩衝剤も
使用することができるが、燐酸塩、２−（Ｎ−モルホリ
ノ）エタンスルホン酸及びＮ−（２−ヒドロキシエチ
ル）ピペラジン−Ｎ′−３−プロパンスルホン酸が好ま
しい。

【００２７】本発明の分析方法又は診断方法に於いて、
そのためのレセプター分子がある全ての特異的結合リガ
ンドを検出するために、この試薬を使用することができ
る。本発明の試薬中の生物学的活性物質は、リガンド又
はそのレセプターの何れかと特に反応性である。リガン
ドの検出は（生物学的流体のような）水性液体の検査検
体を使用して溶液又は（下記の）乾式形で、又は組織若
しくは細胞物質の溶液中で行うことができ、定量的、定
性的又はその両方でできる。特に、本発明は動物、人又
は植物の生物学的液体を検定するために使用することが
できるが、好ましくは、全血、血清、血漿、リンパ液、
胆汁、尿、脊髄液、唾液、涙液、歯苔、汗、便分泌物、
細胞液、組織培養液、スワブ検体、膣分泌物及び精液を
含む人の液体を検定するために使用することができる。
骨格筋、心臓、腎臓、肺臓、脳、骨髄又は皮膚のような
人又は動物組織の液体標本を検定することも可能であ
る。

【００２８】一般に、特異的結合リガンドの分析方法
は、Ａ．対象の特異的結合リガンド又はそのレセプターと、
（Ｉ）上記のような水不溶性非多孔性粒子、及び（II）
該粒子に側鎖アルデヒド基を介して共有結合で結合し、
該リガンド又はそのレセプターの何れかと特異的に反応
性である生物学的活性物質を含む試薬との水不溶性特異
的結合錯体を形成し、そしてＢ．該リガンドの存在又は量の指標として該錯体の存在
を検出することからなる。

【００２９】一つの態様に於いて、この試薬は水溶性特
異的結合リガンドを測定するための競合結合アッセイで
使用することができる。このリガンドはこのリガンドの
水溶性レセプター及び本発明の試薬と錯体を形成する。
溶液アッセイは、試薬及び対象のリガンドを含むと推測
される検査検体の懸濁液中に試薬が含まれるものであ
る。結合した（即ち、錯体を形成した）物質又は結合し
ていない（即ち、錯体を形成していない）物質の何れか
が、このアッセイで測定できる。

【００３０】本発明の方法はまた乾式分析要素を使用し
て行うことができる。最も単純な要素は、（好ましくは
吸収性又は液体浸透性の）基体、例えば、濾紙又は濾紙
片のような自己支持性の吸収性又は吸湿性材料の薄いシ
ートからなっている。この基体は１個又はそれ以上のそ
の中で生じる化学的、生物学的又は特異的結合反応のた
めの反応帯域を有している。本発明の試薬はこれらの帯
域の少なくとも１個の中に存在している。他の任意の帯
域には、染料、染料供与化合物、スカベンジャー、酸化
防止剤、酵素基質又は緩衝剤及び当業者に容易に明らか
な他の物質が含まれていてもよい。このような要素は試
験片、分析要素、スライド又は浸漬棒として当該技術分
野に於いて公知である。

【００３１】この要素を作るために有用な吸収性材料に
は、（多孔紙のような）セルロース系材料、多孔質ポリ
マーフィルム、ガラス繊維のマット、織布又は不織布及
び当業者に公知の他の材料が含まれていてよい。本発明
の試薬を使用する要素中に含有させることが好ましい
が、試薬を検定の時点で検査検体と一緒に要素に加える
こともできるので、このことは限定的ではない。しかし
ながら、好ましくはリガンド類似体及び（適当な受容体
を含む）本発明の試薬を、異なった帯域で要素の中に配
置し、そうして錯体の形成が早過ぎないようにする。

【００３２】本発明の一つの好ましい態様に於いて、分
析要素は、順に液体接触でそれに配置された、アッセイ
で検出できる信号を与えるための１種又はそれ以上の試
薬を含む試薬層、及び多孔質展開層を有する非多孔質支
持体からなり、この要素は更に、１個又はそれ以上の層
中に、対象のリガンドのためのレセプター（例えば、抗
体）からなる本発明の試薬を含む。このリガンドの検出
できるように標識を付けた類似体を、本発明の試薬を含
む層以外の層に配置することができる。

【００３３】好ましくは、リガンド類似体は下記のもの
のような酵素で標識付けすることができる。リガンドは
抗原物質、ホルモン、ハプテン又は医薬であり、レセプ
ターは対応する抗体である。本発明の他の態様は、当該
技術分野に於いて凝集アッセイとして知られているもの
であり、その場合リガンドは本発明の試薬と錯体化して
粒子の検出できる凝集体又は集塊を形成する。得られた
凝集体は、種々の方法、例えば、目視により又は適当な
光散乱検出装置により検出することができる。

【００３４】免疫学的種は抗原物質及びレセプター、即
ちその抗体であってよい。また、免疫学的種は抗体及び
レセプター、即ちそれに特異的な抗原物質であってよ
い。更にまた、免疫種は抗体及びレセプター、即ちそれ
に特異的な抗体であってよい。更に別の態様に於いて、
本発明の試薬は（しばしば「サンドイッチ」アッセイと
呼ばれる）イムノメトリーアッセイ（ｉｍｍｕｎｏｍｅ
ｔｒｉｃａｓｓａｙ）で使用することができる。

【００３５】本発明の他の態様は、目的の核酸を相補的
プローブ（ｐｒｏｂｅ）（その一つは適当に標識付けを
し、他方は固定化するか又は固定化し得る）を使用して
検出する、ハイブリッド形成アッセイとして知られてい
るものである。本発明の試薬はこのようなアッセイに於
いて固定化プローブとして使用することができる。ハイ
ブッリド形成アッセイの例は例えば、米国特許第４，３
５８，５３５号及び米国特許第４，４８６，５３９号に
示されている。

【００３６】本発明の分析分離方法は、生物学的物質の
混合物から１種又はそれ以上の対象のアナライト（被検
体）を単離するために使用することができる。即ち、本
発明の試薬（又は粒子に結合した異なった物質を有する
幾つかの試薬）を、一般的に、生物学的物質の混合物を
含む液体を通すカラム内に入れ、試薬でこの液体から単
離したいこれらの物質を抽出させる。これは核酸、酵
素、炭水化物、蛋白質、脂質、ビタミン、ステロイド、
抗体、ペプチド又はホルモンの精製で有用であろう。こ
の方法はまたアフィニティークロマトグラフィーとして
も知られている。

【００３７】アフィニティークロマトグラフィーはま
た、蛋白質の変性体を精製した蛋白質から除去するため
に蛋白質の希釈溶液を濃縮するために、及び特定の化学
的変性で生じた蛋白質及びペプチド成分の分離及び分割
で使用することもできる。本発明の他の用途は、例え
ば、ＥＰ−Ａ−０３８８１７１に記載されているような
複製連鎖反応増幅から得られるもののような核酸を精製
することである。

【００３８】特に、ハイブリッド形成アッセイ用のキッ
トには、対象の核酸に対して相補的なオリゴヌクレオチ
ドを有する本発明の試薬及びアッセイのために必要な１
種又はそれ以上の他の試薬（例えば、標識付けしたプロ
ーブ又は複製連鎖反応試薬）、（洗浄又は抽出溶液のよ
うな）溶液又は（ピペット、フィルター、検査器具又は
検査容器のような）物品が含まれる。

【００３９】他の態様に於いて、リガンドの測定（例え
ば、イムノアッセイ、サンドイッチアッセイ、診断検査
又は競合結合アッセイ）用の有用なキットには、本発明
の試薬及びアッセイのために必要な１種又はそれ以上の
他の試薬、溶液又は物品（例えば、リガンド類似体、標
識付けしたレセプター、染料供与組成物、基質、洗浄溶
液、フィルター、検査装置、抽出試薬及び当該技術分野
で公知の他のもの）が含まれる。

【００４０】下記の例に於いて、全てのパーセントは他
に特定しない限り重量基準である。例１生物学的活性試薬の調整この例は本発明の試薬の調整を示す。側鎖アルデヒド基
を有するポリマー粒子を調製するために、下記の３種の
試薬溶液を、連続的に攪拌しながら、８０℃に加熱した
反応容器内に下記の送液速度で送液した。

【００４１】溶液１：スチレン（８３９．４ｇ）、ｐ−
ホルミルフェニルビニルベンジルエーテル（４４．１８
ｇ）及びドデカンチオール（８．８４ｇ）を含む。２．
５mL／分で送液。溶液２：過硫酸アンモニウム（１７．６７ｇ）及び蒸留
水（１６６１．９６ｇ）を含む。４mL／分で送液。

【００４２】溶液３：メタ重亜硫酸ナトリウム（８．８
４ｇ）及び蒸留水（１６６１．９６ｇ）を含む。３．７
mL／分で送液。３６０分間の添加時間の後、送液を停止して固体２０．
４％を有するラテックス１０７７ｇを得た。粒子の調製
の際に界面活性剤は使用しなかった。得られたラテック
スを７日間蒸留水に対して透析した後、得られた精製さ
れたラテックス（pH５．８６）には１．４４μｍの平均
径を有する粒子の固体１４．８％が含まれていた。

【００４３】ポリマー粒子の乾燥重量３０mgを含むラテ
ックスの一部を、³Ｈウシγグロブリン（０．２mg）と
混合し、遠心管中で燐酸ナトリウム緩衝液（０．１モル
濃度、pH６）で１．５mLの最終体積にした。粒子への蛋
白質の結合を、蓋をした管の中で４５度の角度で装着し
た回転板に取り付けて３０〜３５rpm での転動回転によ
り室温で２４時間続けた。これを標識付けした管＃１と
した。

【００４４】第二の管（＃２）は、反応の２４時間前に
シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１０ナノモル濃度、１
５０μＬ）を管に添加した他は同じ内容物を有してい
た。管＃３及び＃４を、燐酸緩衝液の代わりに４−（２
−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホ
ン酸（０．１モル濃度、１．５mL）を使用した他は、そ
れぞれ管＃１及び＃２と同様にして調製した。

【００４５】２４時間反応を行った後、過剰のウシγグ
ロブリン（３０mg、緩衝液中３０mg／mL）を夫々の管に
添加した。次いで内容物を室温で更に４時間インキュベ
ーションした。粒子に結合した標識付けした蛋白質の全
量を、（ａ）管内容物の５００μＬ中の１分間当たりの
全カウント数（ｃｐｍ）、（ｂ）管内容物の１mL試料の
遠心後の上澄み液中に残留するｃｐｍ及び（ｃ）（ｂ）
で得られたペレットを洗浄した後粒子に結合したｃｐｍ
を測定することによって決定した。

【００４６】粒子に共有結合で結合した標識付けした蛋
白質の画分を、ドデシル硫酸ナトリウム（１％）の存在
下で３７℃で約２４時間転動回転で試薬をインキュベー
ションした後、決定した。全結合蛋白質を決定するため
に上記した同じ方法を、また共有結合で結合した標識付
けした蛋白質の量を決定するために使用した。その結果
を下記の表Ｉに示す。

【００４７】

【表１】

【００４８】これらのデータは、シアノ水素化ホウ素ナ
トリウムの存在下で標識付けした蛋白質が共有結合で結
合したことを示している。

【００４９】例２試薬の安定性この例は本発明の試薬の改良された安定性を示す。安定
性を示すために、例１に記載した試薬を、４℃で７カ月
間熟成した後共有結合で結合した³Ｈウシγグロブリン
の量について評価した。同様の試薬を調製した直後に評
価した（「新鮮」即ち熟成無し）。この試薬は９：１重
量比のスチレン及びｐ−ホルミルフェニルビニルベンジ
ルエーテルから調製した。

【００５０】上記例１に記載した方法を使用して、共有
結合で結合した蛋白質の量は下記の表IIに示す通りであ
ると決定された。

【００５１】

【表２】

【００５２】これらのデータは、試薬の貯蔵が試薬の安
定性に悪い影響を与えなかったことを示している。ま
た、「熟成」試薬は例１の表Ｉに示す試薬と有利に匹敵
するものであった。

【００５３】例３抗体を有する試薬の調製この例は、チロキシンに特異的である抗体及び側鎖アル
デヒド基を有するポリマー粒子から形成した本発明の試
薬の調製を示す。３０mg乾燥重量のポリマー粒子を含む
例１に記載したラテックスの一部を、チロキシンに特異
的なモノクローナル抗体（０．２mg，Ｃａｍｂｒｉｄｇ
ｅＣａｔａｌｏｇＮｏ２００−０７７ＭＬｏｔ
＃Ａ５６４１）と混合し、遠心管中で燐酸ナトリウム
緩衝液（０．１モル濃度、pH６）で１．５mLの最終体積
にした。粒子への抗体の結合を、蓋をした管の中で４５
度の角度で装着した回転板に取り付けて３０〜３５ｒｐ
ｍでの転動回転により室温で２４時間続けた。これを標
識付けした管＃１とした。

【００５４】第二の管（＃２）は、反応の２４時間前に
シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１０ナノモル濃度、１
５０μＬ）を管に添加した他は同じ内容物を有してい
た。管＃３及び＃４を、燐酸緩衝液の代わりに４−（２
−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホ
ン酸（０．１モル濃度、１．５mL）を使用した他は、そ
れぞれ管＃１及び＃２と同様にして調製した。

【００５５】２４時間反応を行った後、ウシγグロブリ
ン（３０mg、緩衝液中３０mg／mL）を夫々の管に添加し
た。次いで内容物を室温で更に４時間インキュベーショ
ンして、本発明の試薬を得た。

【００５６】

【発明の効果】本発明は、種々の分析方法、診断方法及
び精製方法で有用である試薬を提供する。これらの試薬
は、対象の蛋白質、核酸及びその他の生物学的物質との
反応のために容易に利用できる官能性基を有するポリマ
ーから製造される。このような結合は、結合した材料の
原型を維持する方法で得られ、比較的低い温度及び穏和
な（pHのような）操作条件を使用する。得られた試薬は
溶液中及び塗布した配合物中に界面活性剤又はその他の
分散剤が存在しなくてもコロイド的に安定である。その
他の利点には、５又はそれ以下のpHを有する水性媒体中
での驚異的な貯蔵安定性が含まれる。

【００５７】本発明の利点は、本明細書に記載したよう
な側鎖芳香族アルデヒド基を有する重合性モノマーから
製造した水不溶性粒子から試薬を製造することによって
与えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者スーザンジーンダニエルソンアメリカ合衆国，ニューヨーク 14609, ロチェスター，ラクロワドライブ９

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（Ｉ）水に非膨潤性であり、その外表面
が、側鎖アルデヒド基を有し且つ構造：【化１】（式中、Ａｒはアリーレンであり、Ｒ及びＲ¹は独立に
水素、ハロゲン又は低級アルキルであり、Ｒ²及びＲ³
は独立に主鎖中の炭素数１〜４のアルキレンであり、Ｒ
⁴はアリーレンであり、ｍは０又は１であり、そしてｎ
は１〜４の整数である）により表わされるエチレン性不
飽和重合性モノマーから誘導されるポリマーからなる水
不溶性粒子、並びに（II）該粒子に側鎖アルデヒド基を
介して共有結合で結合した生物学的活性物質を含んでな
る生物学的活性試薬。
【請求項２】１個又はそれ以上の反応域を有し、かつ
該反応域の少なくとも１個に請求項１記載の生物学的活
性試薬を含有する流体浸透性基体からなる分析要素。
【請求項３】Ａ．対象の特異的結合リガンド又はその
レセプターと、請求項１記載の試薬（但し、該試薬は該
リガンド又はそのレセプターの何れかと特異的に反応性
である生物学的活性物質を含む）との水不溶性特異的結
合錯体を形成し、そしてＢ．該リガンドの存在又は量の指標として該錯体の存在
を検出することからなる特異的結合リガンドの分析方法。
【請求項４】Ａ．対象の核酸と、請求項１記載の試薬
（但し、該試薬は対象の核酸に対して相補的であるオリ
ゴヌクレオチドを含む）との間の水不溶性ハイブリッド
形成性生成物を形成し、そしてＢ．対象の核酸の分析として該ハイブリッド形成性生成
物を検出することからなる核酸の検出方法。