JPH0943239A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 臨床検査等の分野に広く利用でき、例えば抗
原抗体反応を利用したラテックス凝集法や血球凝集法に
よる梅毒診断薬などの診断薬として利用し得る、汎用性
が高く非特異反応が少ない免疫測定法を提供する。 【解決手段】 測定系に、ポリエチレングリコール又は
ポリグリコシルエチルメタクリレート等の凝集促進剤、
及び正常動物の血清又はその変性物を存在させる。例え
ば梅毒トレポネーマ抗原を不溶性担体に担持させ、抗梅
毒トレポネーマ抗体との抗原抗体反応により生じた不溶
性担体の凝集の度合いを検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗原抗体反応によ
り抗原または抗体を測定する免疫測定法に関し、さらに
詳しくは、抗原抗体反応による凝集反応によって抗梅毒
トレポネーマ抗体を測定する免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】抗梅毒トレポネーマ抗体の検出方法の一
つとして、梅毒トレポネーマ抗原を不溶性担体に担持さ
せ、検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体との抗原抗体反応
によって生じた不溶性担体の凝集の度合いを検出するこ
とにより測定する方法がある。このような測定方法とし
ては、赤血球凝集反応法、ラテックス凝集法が知られて
いる。

【０００３】上記検出方法としては、凝集の有無を肉眼
で判定する方法、反応液に光を照射して散乱光または透
過光を測定する方法があり、肉眼判定は定性法または半
定量法として用いられている。

【０００４】これら凝集反応の測定において、測定感度
の向上または抗原抗体反応の促進を目的として、ポリエ
チレングリコール（特開昭５８−４７２５６号公報）、
ポリグリコシルエチルメタクリレート（特開平４−１２
２８５８号公報）等の水溶性高分子を反応系に添加する
方法が提案されていた。しかしながらポリエチレングリ
コール、ポリグリコシルエチルメタクリレート等の水溶
性高分子では、目的物質以外の共存物質の反応による凝
集、いわゆる非特異凝集が生じ、誤った測定結果を与え
るという問題がある。

【０００５】そこで上記の問題を防止するため、ウシ血
清アルブミン、ウマ血清アルブミン等の免疫学的に不活
性なアルブミン類を反応系に添加する方法が提案されて
いる（特開昭５８−１４４７４８号公報）。しかしなが
ら、上記のようなアルブミン添加によっても、非特異凝
集を抑えるには十分ではなく、非特異凝集の発生しない
免疫測定法が望まれていた。

【０００６】また、正常動物のγ−グロブリン又はその
変性物を反応系に添加する方法が提案されている（特公
昭６１−９４２号公報）。この方法は非特異凝集を抑え
る点で効果が認められるが、血清からγ−グロブリンを
精製するには、カラムクロマトグラフィー操作や濃縮操
作が必要であり、作業が煩雑になり、コストが高くなる
ので汎用性が高くないという欠点があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
を解決するものであり、その目的とするところは、汎用
性が高く、非特異反応が少ない免疫測定法を提供するこ
とである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の免疫測定法は、
測定系に凝集促進剤及び、正常動物の血清又はその変性
物を存在させる。

【０００９】本発明２の免疫測定法は、梅毒トレポネー
マ抗原を不溶性担体に担持させ、抗梅毒トレポネーマ抗
体との抗原抗体反応により生じた凝集の度合いを検出す
ることにより前記抗体を測定する免疫測定法において、
上記抗原抗体反応の測定系に、凝集促進剤及び、正常動
物の血清又はその変性物を存在させる。

【００１０】上記凝集促進剤は、凝集反応の測定におい
て測定感度の向上や抗原抗体反応の促進を目的として添
加されるものである。

【００１１】上記凝集促進剤の種類は、特に限定されな
いが、例えば、ポリエチレングリコール、ポリグリコシ
ルエチルメタクリレートが好ましい。上記ポリエチレン
グリコールとしては、平均分子量が１０００〜５０００
０のものが好ましく、６０００〜２００００のものがよ
り好ましい。上記ポリグリコシルエチルメタクリレート
としては、平均分子量が１０万〜１５０万のものが好ま
しく、５０万〜１２０万のものがより好ましい。

【００１２】上記凝集促進剤の測定系中の濃度は、低く
なると抗原抗体反応の促進効果が十分でなくなり、高く
なると目的成分以外の物質との非特異反応が増大するの
で、０．１〜５．０％（重量対容量百分率：ｗ／ｖ）が
好ましく、より好ましくは０．２〜３．０％（ｗ／ｖ）
である。

【００１３】上記正常動物の血清とは、測定目的物質に
対して免疫学的に抗原又は抗体活性を保有しない血清を
意味し、健康で薬物等の投与を受けていない動物から得
られる血清が望ましい。本発明においては、温血動物、
例えば、ヒト、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス又はモル
モットの血清が好ましく、ウサギ、ヤギ又はヒツジの血
清がより好ましい。

【００１４】本発明では、かかる動物の血清の変性物で
も使用可能である。上記血清の変性物を得る方法として
は、加熱変性、超音波変性、有機溶媒変性などの種々の
方法があり特に限定はされないが、加熱変性が収率がよ
く、効果が大きい点から好ましい。上記加熱変性の方法
としては、正常動物の血清を希釈せずに、又は緩衝液で
希釈して、加熱する方法が挙げられる。上記緩衝液とし
ては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン
緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられ
る。加熱温度としては、４０〜８０℃が好ましく、５０
〜６５℃がより好ましい。また、加熱時間は加熱温度に
依存し、高温の場合は短時間で、低温の場合は長時間で
変性するが、特に限定されるものではなく操作性を考慮
し適宜決められる。

【００１５】上記正常動物の血清又はその変性物の測定
系中の濃度は、低くなると非特異反応の抑制効果が十分
でなく、高くなると目的の抗原抗体反応を抑制するの
で、０．１〜１０．０％（容量対容量百分率：ｖ／ｖ）
が好ましく、０．５〜５．０％がより好ましい。

【００１６】本発明の免疫測定法において、凝集促進剤
及び、正常動物の血清又はその変性物は、測定系に存在
していればよく、例えば担体としてラテックスを用いた
試薬における抗原抗体反応の場合、梅毒トレポネーマ抗
原等を担持したラテックス試薬に予め凝集促進剤及び、
正常動物の血清又はその変性物を添加しておく。

【００１７】またこれらを含まないラテックス試薬を使
用することも可能で、この場合には抗原抗体反応時にこ
れらが該反応系に存在するようにすればよい。例えば、
検体に予め凝集促進剤及び、正常動物の血清又はその変
性物を添加しておく方法や、使用する緩衝液にこれらを
添加しておく方法等があり、特に限定されない。

【００１８】言い換えれば、本発明の測定試薬は、例え
ば、梅毒トレポネーマ抗原等を担持した不溶性担体と上
記物質とを含む１液系の試薬；梅毒トレポネーマ抗原等
を担持した不溶性担体を含む第１試薬と、上記物質を含
む緩衝液からなる第２試薬とで構成された２液系の試
薬；など種々の形態であり得る。

【００１９】上記抗原抗体反応は通常の条件で行われ、
反応媒体としては、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩
衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液等の他、アミノエ
タンスルホン酸誘導体又はアミノプロパンスルホン酸誘
導体を用いた緩衝液であるＰＩＰＥＳ緩衝液又はＨＥＰ
ＥＳ緩衝液が用いられる。測定系のｐＨは、４．５〜１
０．０が好ましく、さらに好ましくは５．８〜８．０で
ある。測定系の温度は、０〜５０℃が好ましく、さらに
好ましくは２０〜４０℃である。反応時間は適宜決めら
れる。

【００２０】上記不溶性担体としては、例えば、有機高
分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球及び細胞膜片、
プラスチック製マイクロタイタープレート等が挙げられ
る。上記有機高分子粉末としては、例えば、不溶性アガ
ロース、セルロース、不溶性デキストラン等の天然高分
子粉末、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸
塩共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン
共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、
酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等の合成高分
子粉末などが挙げられ、特に合成高分子粉末を水に均一
に懸濁させたラテックスが好ましい。

【００２１】上記無機物質粉末としては、例えば、金、
チタン、鉄、ニッケル等の金属片、シリカ、アルミナ、
炭素末などが挙げられる。上記不溶性担体の平均粒径
は、測定方法、測定機器によって異なるが、０．０５〜
１．０μｍのものが通常用いられる。

【００２２】上記不溶性担体に梅毒トレポネーマ抗原を
担持させる方法としては、例えば、化学的または物理的
結合により感作させる方法が挙げられる。上記抗原とし
ては、例えば、菌体破砕物、精製物、または遺伝子組み
換えにより人工的に合成されたもの等が挙げられ、これ
らは単独で用いられても、併用されてもよい。

【００２３】上記試薬を用いて抗原抗体反応を測定する
際の測定系としては、例えば、ラテックス凝集反応、血
球凝集反応等が利用される。上記反応により生じた凝集
を測定する方法としては、凝集の程度を光学的に観察す
る方法あるいは目視により観察する方法等が挙げられ
る。

【００２４】具体的には、光学的に観察する方法におい
ては、測定は検体、検体希釈液及び抗梅毒トレポネーマ
抗体を担持させた不溶性担体を混合した後、該混合液の
散乱光強度、吸光度、または透過光強度を検出する。測
定の波長は３００〜２４００ｎｍが使用でき、測定方法
は公知の方法に従い、用いる不溶性担体の粒径、濃度、
反応時間によって散乱光強度、吸光度、または透過光強
度の増加もしくは減少を測定する。またこれらの方法は
単独で用いられても、併用されてもよい。

【００２５】目視により観察する方法においては、通
常、検体と抗原が担持された不溶性担体を含む溶液を判
定板上で混合し、揺り動かした後、凝集の有無を判定す
る。判定には、単に肉眼で判定する以外に、ビデオカメ
ラで撮影し画像処理を施すことによって判定することも
できる。

【００２６】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例につき説明
する。 （実施例１） 〔梅毒トレポネーマ抗原担持ラテックス液の調製〕梅毒
トレポネーマ抗原を蛋白濃度として１５μｇ／ｍｌで含
有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）４００μ
ｌを平均粒径４００μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０％（ｗ／ｖ）、積水化学工業社製）１００μｌ
に添加し、１時間攪拌した。次いでウシ血清アルブミン
（以下「ＢＳＡ」とする）を１％（ｗ／ｖ）含有する１
００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍｌを添加し、
１．５時間攪拌した。この液を１０℃で３０分間、１８
０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた沈殿物にＢＳＡ
を０．２５％（ｗ／ｖ）含有する１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）５ｍｌを添加し、ラテックスを懸濁さ
せ、梅毒トレポネーマ抗原担持ラテックス液を調製した
（第１試薬）。

【００２７】〔検体希釈液の調製〕１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．４）９０ｍｌに、ポリエチレングリコー
ル６０００（ＰＥＧ６０００、平均分子量７５００、ナ
カライテスク社製）を２．５％（ｗ／ｖ）となるように
溶解し、更に、正常ウサギ血清を５ｍｌ添加・混合し、
検体希釈液を調製した（第２試薬）。 〔抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬〕本実施例の抗梅毒
トレポネーマ抗体測定試薬は、上記梅毒トレポネーマ抗
原担持ラテックス液からなる第１試薬と、上記検体希釈
液からなる第２試薬とから構成される２液系の試薬であ
る。

【００２８】〔抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法〕生
化学自動分析装置（日立７０５０型、日立製作所社製）
により、ヒト血清中の抗梅毒トレポネーマ抗体量を以下
の方法で測定した。測定条件は温度３７℃、波長５７０
ｎｍとした。測定は、標準液又は検体（ヒト血清：抗梅
毒トレポネーマ抗体量は未知）２０μｌを分注後、直ち
に検体希釈液（第２試薬）３５０μｌの添加・混合、次
いで５分後、ラテックス液（第１試薬）５０μｌの添加
・混合を行った。ラテックス液添加後８０秒から３２０
秒の間の吸光度変化量から、抗体量既知の標準液（標準
抗梅毒トレポネーマ抗体液）の抗体量と吸光度変化量の
検量線により、検体中の抗梅毒トレポネーマ抗体量を求
めた。

【００２９】（実施例２）実施例１における検体希釈液
の調製において、ポリエチレングリコール６０００を
２．５％（ｗ／ｖ）となるように溶解したことのかわり
に、ポリグリコシルエチルメタクリレート（ｐＧＥＭ
Ａ、平均分子量１１０万、日本精化社製）を１．０％
（ｗ／ｖ）となるように溶解したことの他は、実施例１
と同様にして測定を行った。

【００３０】（実施例３）検体希釈液の正常ウサギ血清
のかわりに、正常ヤギ血清を用いたことの他は、実施例
１と同様にして測定を行った。

【００３１】（実施例４）実施例１における検体希釈液
の調製において、ポリエチレングリコール６０００を
２．５％（ｗ／ｖ）となるように溶解したことのかわり
に、ポリグリコシルエチルメタクリレート（ｐＧＥＭ
Ａ、平均分子量１１０万、日本精化社製）を１．０％
（ｗ／ｖ）となるように溶解したこと、及び正常ウサギ
血清のかわりに、正常ヤギ血清を用いたことの他は、実
施例１と同様にして測定を行った。

【００３２】（実施例５）検体希釈液の正常ウサギ血清
のかわりに、６０℃、３０分間加熱変性させた正常ウサ
ギ血清を用いたことの他は、実施例１と同様にして測定
を行った。

【００３３】（実施例６）検体希釈液の正常ウサギ血清
のかわりに、６０℃、３０分間加熱変性させた正常ヤギ
血清を用いたことの他は、実施例１と同様にして測定を
行った。

【００３４】（実施例７）実施例１における検体希釈液
の調製において、ポリエチレングリコール６０００を
２．５％（ｗ／ｖ）となるように溶解したことのかわり
に、ポリグリコシルエチルメタクリレート（ｐＧＥＭ
Ａ、平均分子量１１０万、日本精化社製）を１．０％
（ｗ／ｖ）となるように溶解したこと、及び正常ウサギ
血清のかわりに、６０℃、３０分間加熱変性させた正常
ウサギ血清を用いたことの他は、実施例１と同様にして
測定を行った。

【００３５】（実施例８）実施例１における検体希釈液
の調製において、ポリエチレングリコール６０００を
２．５％（ｗ／ｖ）となるように溶解したことのかわり
に、ポリグリコシルエチルメタクリレート（ｐＧＥＭ
Ａ、平均分子量１１０万、日本精化社製）を１．０％
（ｗ／ｖ）となるように溶解したこと、及び正常ウサギ
血清のかわりに、６０℃、３０分間加熱変性させた正常
ヤギ血清を用いたことの他は、実施例１と同様にして測
定を行った。

【００３６】（比較例１）実施例１における検体希釈液
の調製において、正常ウサギ血清を添加しなかったこと
の他は、実施例１と同様にして測定を行った。

【００３７】（比較例２）実施例１における検体希釈液
の調製において、ポリエチレングリコール６０００を添
加しなかったことの他は、実施例１と同様にして測定を
行った。

【００３８】（比較例３）実施例１における検体希釈液
の調製において、ポリエチレングリコール６０００及び
正常ウサギ血清を添加しなかったことの他は、実施例１
と同様にして測定を行った。

【００３９】〔非特異反応抑制率の測定〕比較例１に従
って抗梅毒トレポネーマ抗体量未知のヒト血清を測定し
た場合、抗梅毒トレポネーマ抗体量が１０Ｔ．Ｕ．（タ
イターユニット）以上の値を示す血清は梅毒陽性、１０
Ｔ．Ｕ．未満の値を示す血清は梅毒陰性と判定される。
非特異反応抑制率を以下の方法で測定した。まず、抗梅
毒トレポネーマ抗体を含有しないことを既存の抗梅毒ト
レポネーマ抗体測定試薬（富士レビオ社製、セロディア
ＴＰＨＡ）で確認済の正常ヒト血清検体の２００ケにつ
いて、比較例１に従って抗梅毒トレポネーマ抗体量を測
定した。その結果、非特異的な反応により１０Ｔ．Ｕ．
以上の値を示し、見掛け上、梅毒陽性と判定された正常
ヒト血清検体から１０ケの検体（検体No.1、検体No.2、
検体No.3、検体No.4、検体No.5、検体No.6、検体No.7、
検体No.8、検体No.9、検体No.10 とする）を選んだ。

【００４０】上記のようにして選ばれた１０ケの検体に
ついて、実施例１〜８に従って抗梅毒トレポネーマ抗体
量を測定した。その結果を表１に示した。なお、上記の
比較例１に従って得られた測定結果も表１に併せて示し
た。

【００４１】各実施例について、１０ケの検体中の１０
Ｔ．Ｕ．未満の測定値を示した検体の割合を求め、非特
異反応抑制率とし表１に示した。

【００４２】

【表１】

【００４３】表１から、比較例１に従って測定すると、
非特異反応のため、見掛け上、梅毒陽性と判定される検
体が、実施例１〜８に従って測定すると非特異反応が高
度に抑制されて、梅毒陰性と正しく判定されることが分
かる。

【００４４】なお、比較例２および比較例３は、凝集促
進剤を含まないため、本測定方法では測定に必要な感度
が得られず、抗梅毒トレポネーマ抗体量を測定不可能で
あった。従って、比較例２および比較例３についての測
定結果は省略する。

【００４５】

【発明の効果】本発明の免疫測定法は上述の通りであ
り、血清からγ−グロブリンを精製する必要もなく、凝
集促進剤、及び正常動物の血清又はその変性物から適切
なものを選択することにより、汎用性が高く非特異反応
が少ない免疫測定法として広く利用できる。本発明は、
例えば、ラテックス、赤血球等の担体を使用し、抗原抗
体反応を利用したラテックス凝集法や血球凝集法による
診断薬として広く応用できる。本発明２の抗梅毒トレポ
ネーマ抗体を検出する免疫測定法は上述の通りであり、
血清からγ−グロブリンを精製する必要もなく、凝集促
進剤、及び正常動物の血清又はその変性物から適切なも
のを選択することにより、汎用性が高く非特異反応が少
ない梅毒測定法として広く利用できる。本発明２は、例
えばラテックス、赤血球等の担体を使用し、抗原抗体反
応を利用したラテックス凝集法や血球凝集法による梅毒
診断薬として応用でき、該試薬は梅毒の診断及び治療の
ために臨床検査等の分野に広く利用できる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗原抗体反応により抗原又は抗体を測定
   する免疫測定法において、上記抗原抗体反応の測定系
   に、凝集促進剤及び、正常動物の血清又はその変性物を
   存在させることを特徴とする免疫測定法。
2. 【請求項２】 梅毒トレポネーマ抗原を不溶性担体に担
   持させ、抗梅毒トレポネーマ抗体との抗原抗体反応によ
   り生じた不溶性担体の凝集の度合いを検出することによ
   り前記抗体を測定する免疫測定法において、上記抗原抗
   体反応の測定系に、凝集促進剤及び、正常動物の血清又
   はその変性物を存在させることを特徴とする請求項１記
   載の免疫測定法。