JPH06205679A

JPH06205679A - Ａｍｐａ結合性ヒトグルタミン酸レセプター

Info

Publication number: JPH06205679A
Application number: JP5177170A
Authority: JP
Inventors: Rajender Kamboj; ラジエンダー・カンボイ; Candace Elliott; カンダス・エリオツト; Stephen L Nutt; ステイーブン・エル・ナツト
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-06-10
Filing date: 1993-06-10
Publication date: 1994-07-26
Also published as: CA2098054A1; MX9303444A; EP0574257A2; EP0574257A3

Abstract

(57)【要約】【構成】ヒトＧｌｕＲ１Ｂ、ＧｌｕＲ２Ｂ、ＧｌｕＲ
３Ａ及びＧｌｕＲ３Ｂレセプター、及び、それらのＡＭ
ＰＡ結合性断片から選択されるＡＭＰＡ結合性ヒトＧｌ
ｕＲレセプターをコードする領域を含む単離ポリヌクレ
オチド、並びに、単離されたヒトＧｌｕＲレセプター。【効果】中枢神経系疾患の治療研究、例えば治療化合
物のスクリーニングに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明は、神経生物学の分野にお
ける組換えＤＮＡ技術の特許出願に関する。より具体的
には、興奮性アミノ酸（ＥＡＡ）レセプター類、特にヒ
トのＥＡＡレセプター類をコードするＤＮＡのクローニ
ング及び発現に関する。

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】哺乳
類の中枢神経系（ＣＮＳ）においては、神経刺激波動の
伝達は、「送信用」ニューロンにより放出される神経伝
達物質の間の相互作用により制御されており、この神経
伝達物質は、その後「受信用」ニューロン上のレセプタ
ー表面に結合して、そのニューロンの興奮を引き起こ
す。Ｌ−グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）はＣＮＳ
中における最も量の多い神経伝達物質で有り、脊椎中の
主要な興奮経路を仲介する。従って、グルタミン酸は興
奮性アミノ酸（ＥＡＡ）と称され、更に、それに対して
反応するレセプター類は、グルタミン酸レセプター類、
あるいは、より一般的にはＥＡＡレセプター類としてま
ちまちに呼ばれている。哺乳類の脳から単離した組織、
及び、様々な合成ＥＡＡレセプターアゴニスト類を使用
したおかげで、ＥＡＡレセプターの薬理学的知識は幾分
正確なものになった。ＥＡＡレセプターファミリーの一
員は、このようなアゴニスト類に対する異なった結合に
基づき、現在３つの主な型に群別されている。グルタミ
ン酸に加えてアゴニストであるＮＭＤＡ（Ｎ−メチル−
Ｄ−アスパルテート）にも結合するＥＡＡのある型は、
ＥＡＡレセプターのＮＭＤＡ型と呼ばれる。ＮＭＤＡに
結合しない、ＥＡＡレセプターの他のグルタミン酸結合
型は、２つの他のＥＡＡレセプターアゴニスト、つま
り、ＡＭＰＡ（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチ
ル−イソオキザソール−４−プロピオネート）、及び、
カイネート（ｋａｉｎａｔｅ）との結合の好適性に従っ
て命名されている。特に、グルタミン酸には結合するが
ＮＭＤＡには結合せず、かつ、ＡＭＰＡよりはカイネー
トに対してより大きい親和性で結合するレセプター類
は、カイネート型のＥＡＡレセプター類と呼ばれる。同
様に、グルタミン酸に結合するがＮＭＤＡには結合せ
ず、かつ、カイネートよりは大きい親和性でＡＭＰＡに
結合するＥＡＡレセプター類をＡＭＰＡ型のＥＡＡレセ
プター類として呼ぶ。グルタミン酸結合性ＥＡＡレセプ
ター群は、生理学的及び医学的に非常に重要なものであ
る。グルタミン酸は、長期増強作用（学習及び記憶）の
多くの特性、シナプスの可形性の発達、癲癇発作、脳卒
中もしくは他の低酸素状況後に生じる虚血により引き起
こされる神経損傷、並びに、神経変成過程の他の形態に
関与している。しかしながら、これらの過程を調節する
治療法の開発は、ＥＡＡレセプターの界面上で特異的に
相互作用する、選択的結合性薬剤分子類を発見するため
に用いる、レセプター材料の任意の均質な供給源がない
ために、非常に困難であった。候補薬剤をスクリーニン
グするために現在使用されている脳由来の組織は不均質
なレセプターの供給源であり、それらの表面に、興味の
ＥＡＡレセプター／リガンド界面の研究を妨害する多く
のレセプター型を保有している。ヒトの治療法の探索
は、ヒト起源の脳組織を入手することが限定されている
ことにより更に複雑である。従って、興味のレセプター
のみを産生するように遺伝子工学的に処理された細胞類
を取得することが望まれる。クローン化されたレセプタ
ー遺伝子類を発現する細胞株を使用して、所望のレセプ
ターのための均質である基質が、薬剤スクリーニング計
画用に提供される。最近、非ヒト起源の、主としてラッ
トに由来するＥＡＡレセプター類の置換ポリペプチド類
をコードする遺伝子類が発見された。Ｈｏｌｌｍａｎｎ
ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４２：６４３，１９
８６、は、元来ＧｌｕＲ−Ｋ１と称される（しかし、現
在では単にＧｌｕＲ１と呼ばれている）遺伝子の、ラッ
トからの単離を記載している。この遺伝子は、ラットの
ＥＡＡレセプター群の一員をコードしており、かつ、元
来、カイネート型のものであるものと思われていた。Ｋ
ｅｉｎａｎｅｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４
９：５５６，１９９０、によるその後の研究により、再
びラットにおいて、以前に単離されていたＧｌｕＲ１と
同じであり、ＧｌｕＲ−Ａと呼ばれる遺伝子が、実は、
カイネート型ではなく、むしろＡＭＰＡ型のレセプター
をコードすることが示されている。これら２グループの
研究者達は、それ以来、ラット起源から単離した５つも
の関連遺伝子を報告している。Ｂｏｕｌｔｅｒｅｔ
ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１０３３，１９９
０、は、ＧｌｕＲ１に加え、そのラットは、ＧｌｕＲ
２、ＧｌｕＲ３、及び、ＧｌｕＲ４と呼ばれる３つの他
の関連遺伝子を含むことを明らかにし、更に、Ｂｅｔｔ
ｌｅｒｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ５：５８３，１
９９０は、ＧｌｕＲ５について記載している。Ｋｅｉｎ
ａｎｅｎら（上掲）は、それぞれ、ＧｌｕＲ１、Ｇｌｕ
Ｒ２、ＧｌｕＲ３、及び、ＧｌｕＲ４に厳密に対応す
る、ＧｌｕＲ−Ａ、ＧｌｕＲ−Ｂ、ＧｌｕＲ−Ｃ、及
び、ＧｌｕＲ−Ｄと呼ばれる遺伝子類について記載して
いる。Ｓｏｍｍｅｒｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９：１５８０，１９９０も又、ＧｌｕＲ−Ａ、Ｇｌ
ｕＲ−Ｂ、ＧｌｕＲ−Ｃ、及び、ＧｌｕＲ−Ｄについ
て、各遺伝子についての２つの選択的にスプライシング
された形態類を示している。これらの著者、並びに、Ｍ
ｏｎｙｅｒｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ６：７９９，
１９９１は、これらの遺伝子の異なってスプライシング
された異形物類がラットの脳において異なった状態で発
現されることを示すことができた。これらの分子クロー
ニングの発達から、ラットの脳内に存在する場合のＥＡ
Ａレセプター類及びそれらのサブユニット類の構造特性
が明らかにされた。ＥＡＡレセプター構造の最近のモデ
ルによると、各々は構造がヘテロ形式であり、膜に固定
された個々のサブユニット類からなっており、各々のサ
ブユニットは、４つの膜貫通領域を有し、更に、ある程
度リガンドの結合特性を指図し、かつ、レセプター複合
体により作用させられるイオン開門（ｉｏｎ−ｇａｔｉ
ｎｇ）機能に関与する細胞外領域を有している。Ｋｅｉ
ｎａｎｅｎら（上掲）は、例えば、ＧｌｕＲ−Ａ、Ｇｌ
ｕＲ−Ｂ、ＧｌｕＲ−Ｃ、及び、ＧｌｕＲ−Ｄと表示さ
れるものを含むラットのＧｌｕＲレセプターの各サブユ
ニットは、それらが単一状態である際に、グルタミン
酸、ＡＭＰＡ及びカイネートにより開門される陽イオン
チャンネル活性を示すことを示している。しかしなが
ら、例えば、ＧｌｕＲ−Ｂと組み合わせたＧｌｕＲ−Ａ
のように、組み合わせて発現される場合には、著しく大
きい電流を有する開門されたイオンチャンネルが、宿主
哺乳類細胞により産生される。ヒトにおけるＣＮＳ障害
を治療するのに有効な治療法についての探索に際し、当
然のことながら、今日までに単離されているラットレセ
プターを使用して可能になるよりは、よりヒトの状況に
類似する候補化合物類についてのスクリーニング法を提
供することが強く望まれる。特に、ヒトの治療化合物類
についての適切なスクリーニング法を作製する目的で、
ヒトのレセプター類をコードするクローン化された遺伝
子類、及び、それらの遺伝子を発現する細胞株類を提供
することが望まれる。従って、これらが本発明の目的で
ある。

【課題を解決するための手段】本発明は、ＡＭＰＡ結合
性ヒトＥＡＡレセプター類の一群をコードする、単離さ
れたポリヌクレオチド類を提供し、それらのレセプター
類を、本明細書中においては「ＧｌｕＲレセプター類」
と称する。ヒトが生まれつき有するＣＮＳレセプター類
を特異的にコードするポリヌクレオチド類を提供するこ
とにより、本発明は、ヒトの神経系を評価するための手
段、特に、ＡＭＰＡ結合性ヒトＥＡＡレセプター類と、
選択された天然及び合成リガンド類との間に存在する治
療に応用可能な相互作用を評定するための手段を提供す
る。その態様の一つにおいて、本発明は、ヒトのＧｌｕ
Ｒ群に属するＥＡＡレセプターをコードする、単離され
たポリヌクレオチドを提供する。あるいは、このポリヌ
クレオチドは、ヒトのＧｌｕＲレセプターのＡＭＰＡ結
合性断片、もしくは、ヒトのＧｌｕＲレセプターのＡＭ
ＰＡ結合性変異体をコードすることができる。本発明の
特定的な実施態様によると、単離されたポリヌクレオチ
ドは、アミノ酸配列（配列番号：２）が図１に示されて
いるヒトのＧｌｕＲ１Ｂレセプター、アミノ酸配列（配
列番号：４）が図２中に示されているヒトのＧｌｕＲ２
Ｂレセプター、及び、アミノ酸配列（配列番号：６）が
図３に示されているヒトのＧｌｕＲ３Ａレセプターをコ
ードする。本発明の他の実施態様によると、ポリヌクレ
オチドは、ヒトのＧｌｕＲレセプターのＡＭＰＡ結合性
変異体をコードする。このような変異体の一つは、本明
細書中においてヒトのＧｌｕＲ３Ｂレセプターとして同
定されており、そのアミノ酸配列は図４に示されている
（配列番号：８）。本発明の様々な特定的な実施態様に
おいては、ポリヌクレオチドは、例えばｃＤＮＡのよう
なＤＮＡ、もしくは、メッセンジャーＲＮＡのようなＲ
ＮＡからなる。本発明の他の実施態様においては、ポリ
ヌクレオチドは、ヒトのＧｌｕＲレセプター組織分布の
オートラジオグラフィー研究に使用するために、放射ラ
ベル化物のようなレポーター分子にカップリングさせる
ことができる。本発明の更に別の実施態様においては、
放射ラベルしたものを含む本発明のポリヌクレオチド類
の断片類を、グルタミン酸レセプターをコードするポリ
ヌクレオチド類の検出のためのプローブとして、生物学
的被検体中に存在するこのようなポリヌクレオチド類を
増幅させるのに適切なプライマー類として、あるいは、
ＧｌｕＲレセプターもしくはＡＭＰＡ結合性断片類もし
くはそれらの変異体類の発現のための鋳型としてのいず
れかとして利用することができる。本発明の他の態様に
よると、ＡＭＰＡ型のヒトグルタミン酸レセプターを産
生し、かつ、本発明のポリヌクレオチドの、その中への
取り込みにより特徴付けられる細胞宿主が提供される。
本発明の実施態様においては、ポリヌクレオチドはＤＮ
Ａ分子であり、かつ、細胞宿主内における発現及び分泌
のために取り込まれ、培養に際して、機能的な膜結合ヒ
トＧｌｕＲレセプターを産生する。本発明の他の実施態
様においては、ポリヌクレオチドはＲＮＡ分子であり、
それは細胞宿主内に導入されて、機能的な膜結合性翻訳
産物としてヒトＧｌｕＲレセプターを産生する。本発明
の他の態様によると、リガンド結合アッセイを実施する
のに有用なヒトのＥＡＡレセプターの、実質的に均質な
供給源を得る方法が提供され、その方法は、遺伝子工学
的に処理された本発明の細胞宿主を培養し、その後、培
養した細胞類を回収する段階を含む。随意に、培養した
細胞類を処理して、リガンド結合アッセイに使用するた
めに、その膜調製物を得てもよい。本発明の他の態様に
よると、テストリガンドとヒトのＥＡＡレセプターとの
間の相互作用をアッセイするための方法が提供され、そ
の方法は、適切な条件下において、そのテストリガンド
をヒトのＧｌｕＲレセプター源、つまり、本発明の細胞
宿主もしくはそれから誘導された膜調製物と共にインキ
ュベートし、その後、その物質とレセプター源との間の
結合の程度もしくは結果を測定する段階を含む。これら
及び本発明の他の態様を、添付する図面を参照してより
詳細に記載する。本発明は、ＡＭＰＡ結合型のヒトＣＮ
Ｓレセプター類に関し、より具体的には、本明細書中
「ＧｌｕＲレセプター類」と称するファミリーに属する
新しいレセプター類に関し、かつ、このようなレセプタ
ー類をコードする単離されたポリヌクレオチド類を提供
する。用語「単離された」は、本明細書中では、一般的
には約４，０００ヌクレオチド以下の長さの無傷のポリ
ヌクレオチドに言及して用いられ、更に、この無傷のポ
リヌクレオチドは、あるいは、ヒトの他の蛋白質をコー
ドするＤＮＡから単離される。本明細書中に用いられる
ように、用語「ＧｌｕＲレセプター類」は、ヒトのＧｌ
ｕＲ１Ｂ、ＧｌｕＲ２Ｂ、及び、ＧｌｕＲ３Ａレセプタ
ー類、それらに関係するＡＭＰＡ結合性変異体類、並び
に、ＧｌｕＲ１Ｂ、ＧｌｕＲ２Ｂ、及び、ＧｌｕＲ３Ａ
レセプター類のＡＭＰＡ結合性断片類を含むことを意図
する。本発明の範囲内に含まれるレセプター変異体類
は、親レセプター、つまり、ＧｌｕＲ１Ｂ、ＧｌｕＲ２
Ｂ、ＧｌｕＲ３Ａ、及び、ＧｌｕＲ３Ｂの内の一種の機
能的変異体であり、これは、保存的アミノ酸置換を含
む。レセプター類、及び、変異体類、及び、その断片類
に関して本明細書中に用いられている用語「ＡＭＰＡ結
合性」は、リガンド結合プロフィルに関するものであ
り、この結合プロフィルは、本明細書中に記載されてい
るアッセイ類のような、慣用的なアッセイ類を用いて決
定されるように、グルタミン酸結合及び、グルタミン
酸、カイネートもしくはＮＭＤＡのいずれのものに対す
るよりもより大きいＡＭＰＡに対する相対結合親和性を
示すものである。本明細書においては、ＡＭＰ結合性レ
セプターは、それを産生する細胞宿主が、ＡＭＰＡに対
して適切に露出された際に、ｎｏｖｏチャンネル活性を
示す場合に「機能的」であると言われており、その活性
は、たとえばＨｏｌｌｍａｎｎら（上掲）により記載さ
れている確立された電気生理学的アッセイ、または、細
胞膜を横切るコンダクタンスを決定するのに適する他の
任意のアッセイにより決定される。本発明のヒトのＧｌ
ｕＲ群の一員は、一般的にはＥＡＡレセプター類の特徴
を有する構造特性を保持しており、それらには、細胞外
Ｎ−及びＣ−末端領域、並びに、細胞表面膜内にレセプ
ターを固定させるように作用する４つの内部疎水性領域
が含まれる。より具体的には、ＧｌｕＲ１Ｂレセプター
は、１８アミノ酸残基のＮ末端シグナルペプチドをもつ
前駆体形で当初は産生され、シグナルペプチドを消失
し、かつ、図１において１文字コードにより示される配
列（配列番号：１及び２）内に配置する８８８アミノ酸
からなる成熟形で細胞表面に輸送される。特記しない限
り、用語「ヒトのＧｌｕＲレセプター」は、一般的、あ
るいは、レセプター群の特定の一員に言及して、のいず
れにおいても、レセプターの成熟形を意味する。従っ
て、これらのレセプター類のアミノ酸残基は、図１−４
において、成熟蛋白質配列に関して番号付けされてい
る。ＧｌｕＲ１Ｂレセプターの構造ドメインに関して、
ヒドロパシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）解析により４つ
の推定上の膜貫通ドメインが明らかにされ、１つは残基
５２１−５４０を含む範囲に及び（ＴＭ−１）、他のも
のは残基５６７−５８５（ＴＭ−２）に及び、３番目の
ものは残基５９６−６１４（ＴＭ−３）に及び、更に、
４番目のものは残基７８８−８０８（ＴＭ−４）に及ぶ
ものである。この割り当てに基づくと、天然の膜結合型
でのヒトのＧｌｕＲ１Ｂレセプター構造は、５２０アミ
ノ酸のＮ末端細胞外ドメインからなり、その後に、４つ
の膜貫通ドメイン領域及び細胞外の８０アミノ酸のＣ末
端ドメインを含む疎水性領域が続くものと思われる。Ｇ
ｌｕＲ２Ｂレセプターは、前駆体形においては２１アミ
ノ酸残基のＮ末端シグナルペプチドを持っており、か
つ、成熟形においては、図２において１文字コードによ
り示される配列（配列番号：３及び４）内に配置する８
６２アミノ酸からなる。このレセプターの構造ドメイン
に関しては、ヒドロパシー解析により４つの推定上の膜
貫通ドメインが明らかにされ、１つは残基５２５−５４
４を含む範囲に及び（ＴＭ−１）、他のものは残基５７
１−５８９（ＴＭ−２）に及び、３番目のものは残基６
００−６１８（ＴＭ−３）に及び、更に、４番目のもの
は残基７９２−８１２（ＴＭ−４）に及ぶものである。
この割り当てに基づくと、天然の膜結合形でのヒトのＧ
ｌｕＲ２Ｂレセプター構造は、５２４アミノ酸のＮ末端
細胞外ドメインからなり、その後に、４つの膜貫通ドメ
イン及び細胞外の５０アミノ酸のＣ末端ドメインを含む
疎水性領域が続くものと思われる。ヒトのＧｌｕＲ群の
一員であるＧｌｕＲ３Ａは、前駆体形では２２アミノ酸
残基からなるＮ末端シグナルペプチドを保持しており、
かつ、成熟形で細胞表面へと輸送されるが、この成熟形
はシグナルペプチドを消失しており、かつ、図３におい
て１文字コードにより示される配列（配列番号：５及び
６）内に配置する８６６アミノ酸からなる。ＧｌｕＲ３
Ａレセプターの４つの推定上の膜貫通ドメインを以下に
示す。１つは残基５２７−５４６を含む範囲に及び（Ｔ
Ｍ−１）、他のものは残基５７５−５９３（ＴＭ−２）
に及び、３番目のものは残基６０４−６２２（ＴＭ−
３）に及び、更に、４番目のものは残基７９６−８１６
（ＴＭ−４）に及ぶものである。この割り当てに基づく
と、天然の膜結合型でのヒトのＧｌｕＲ３Ａレセプター
構造は、５２６アミノ酸のＮ末端細胞外ドメインからな
り、その後に、４つの膜貫通ドメイン及び細胞外の５０
アミノ酸のＣ末端ドメインを含む疎水性領域が続くもの
と思われる。上記に示したＧｌｕＲ親レセプターに構造
的に関連した変異体類も存在する。特に、ヒトのＧｌｕ
Ｒ３Ａレセプターに構造的に関連した変異体、つまり、
ＧｌｕＲ３Ｂレセプターもやはり同定されている。この
変異体は、ヒトの脳組織内に天然に存在し、かつ、Ｇｌ
ｕＲ３Ａ同様、ＧｌｕＲ３Ｂレセプターは図４に示され
るように（配列番号：７及び８）、成熟した膜結合型に
おいては８６６アミノ酸の長さである。このＧｌｕＲ３
Ｂレセプターは、当初は、ＧｌｕＲ３Ａレセプター上に
保持されているものと同じシグナルペプチドを有してい
る。４つの膜貫通ドメインがやはり、ＧｌｕＲ３Ｂ配列
からも明らかにされ、かつ、これらのドメインは、Ｇｌ
ｕＲ３Ａレセプターに関連して同定された同一のアミノ
酸領域内に存在することが示される。一次構造に関して
は、ヒトのＧｌｕＲ３Ｂレセプターは、膜貫通ドメイン
ＴＭ−３及びＴＭ−４を分離している３６アミノ酸領
域、つまり残基７４８−７８３の点でＧｌｕＲ３Ａレセ
プターとは異なる。比較として、この領域内のＧｌｕＲ
３Ａ及びＧｌｕＲ３Ｂの配列を、図５において比較した
（配列番号：９及び１０）。様々なリガンド類を用い
て、かつ、膜結合形でヒトＧｌｕＲレセプター類を産生
するために遺伝子工学的に処理した哺乳類細胞から誘導
された膜調製物類を用いて行った結合アッセイにより、
ヒトのＧｌｕＲレセプター類は、特にカイネート及びＮ
ＭＤＡと比較して、ＡＭＰＡに対して選択的に結合する
ことが示された。この特性は、ＡＭＰＡ型のレセプター
類と神経学的障害及び疾患との間の医学的に重要な関連
性に結び付けると、本レセプター類、並びに、ＡＭＰＡ
結合性断片類及びその変異体類は、このようなレセプタ
ー類とそれらの天然のリガンドであるグルタミン酸との
間のインビボにおける相互作用を調節するのに有用なリ
ガンド類のスクリーニング及び発見における貴重な道具
として作用することが示される。従って、本発明の重要
な態様は、インビトロにおけるリガンド結合及び／又は
チャンネル活性化アッセイに使用するためのレセプター
の予め準備の整った均質な供給源として使用するため
の、ヒトのＧｌｕＲレセプターを産生するように遺伝子
工学的に処理した細胞の作製に属する。リガンド結合ア
ッセイ類に使用するためには、不均質な膜結合産物とし
てのヒトＧｌｕＲレセプターを産生する原核生物もしく
は真核生物のいずれかの宿主細胞を、遺伝子工学技術の
適用により作製することが望ましい。本発明の１つの実
施態様によると、このように処理した細胞類の作製は、
選択された宿主細胞内に組換えＤＮＡ構築物を導入する
ことにより達成されるが、この組換えＤＮＡ構築物にお
いては、所望のヒトＧｌｕＲレセプターの分泌形態、つ
まり、その天然のシグナルペプチドもしくはその不均質
な機能的等価物を保持する形態をコードするＤＮＡが、
レセプターをコードするＤＮＡの発現を亢進させ、従っ
て、所望のヒトＧｌｕＲレセプター蛋白質を産生するよ
うに選択された宿主内において機能する発現調節因子類
と操作可能なように結合している。このような細胞類
を、本明細書中では、その中に「発現するように」取り
込ませた、レセプターをコードするＤＮＡを有するとし
て特徴付ける。レセプターをコードしたこのＤＮＡは、
このようなＤＮＡが特定の宿主内において天然には見出
されない場合は、特定の細胞宿主に関して「異種のも
の」と称する。ヒトのＧｌｕＲレセプターの産生のため
の宿主として使用するために選択された特定の細胞型
は、原核生物及び真核生物細胞類の両方を含む、当分野
において現在利用できる数種の細胞型の任意のものであ
ることができるが、当然のことながら、天然の状態にお
いて興奮性アミノ酸を結合することができる表面レセプ
ターを産生して、遺伝子工学的に処理した細胞系から得
られたアッセイ結果を混乱させる細胞型であるべきでは
ない。一般的に、このような問題は、宿主として非神経
細胞系を選択することにより回避され、かつ、因習的に
行われているように、非ヒト細胞系を使用して更に回避
することができる。神経型でありかつヒト型の細胞は、
それにもかかわらず、発現宿主類として使用することが
できると判断されるが、但し、アッセイ結果において、
テストリガンドに結合する「バックグラウンド」が説明
される必要がある。本発明のある実施態様によると、ヒ
トのＧｌｕＲレセプター産生のための宿主として使用す
るために選択した細胞系は哺乳類細胞である。このよう
な細胞系の数種の型は、現在、遺伝子工学操作用に入手
することができ、これらには、Ｐｒｏ５変異体（ＡＴＣ
ＣＣＲＬ１２８１）を初めとするＫ１系（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ６１）を例とするチャイニーズハムスター卵
巣（ＣＨＯ）細胞類、ＳＶ４０で形質転換させたアフリ
カグリーンモンキー腎臓のＣＶ−１系（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ７０）、ＣＯＳ−１系（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５
０）、及び、ＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５
１）に由来する線維芽様細胞類、マウスＬ細胞類、マウ
ス３Ｔ３細胞類（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、マウ
スＣ１２７細胞類、２９３系（ＡＴＣＣＣＲＬ１５
７３）のヒト胎児腎臓細胞類、ＨｅＬａ系（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２）のものを初めとするヒトの癌細胞類、細胞
系ＩＭＲ−３２（ＡＴＣＣＣＣＬ１２７）、ＳＫ−
Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣＨＴＢ１０）、及び、ＳＫ−Ｎ
−ＳＨ（ＡＴＣＣＨＴＢ１１）の神経芽細胞腫細胞
類がある。様々な遺伝子発現系がこれらの宿主類を用い
る用途のために応用されており、現在ではこれらを市販
品として入手することができ、かつ、これらの系の任意
の一つを選択して、ヒトのＧｌｕＲレセプターをコード
するＤＮＡの発現を行わせることができる。典型的には
プラスミドベクターの形態で入手することができるこれ
らの系が、ＤＮＡで構成されている発現調節配列を含む
機能成分を発現カセットに組み込み、この発現調節配列
は、宿主に認識され、かつ、そのＤＮＡの５’端に接続
した場合に、レセプターをコードするＤＮＡの発現を可
能にする。この系は更に、レセプターをコードする領域
の３’端に接続した場合に発現を停止するＤＮＡ配列を
組み込む。従って、選択された哺乳類細胞宿主における
発現については、レセプターの分泌形態をコードするＤ
ＮＡがその宿主により認識される発現調節ＤＮＡ配列に
接続してある組換えＤＮＡ発現構築物を作製するが、そ
の発現調節ＤＮＡ配列は、発現を行わせるための、レセ
プターをコードするＤＮＡの５’領域、及び、発現を停
止させるための３’領域を含む。組換えＤＮＡ発現構築
物を含有するプラスミドベクターは、典型的には、複製
起点として通常ウイルスに由来するこのような他の機能
成分類を組み込み、発現宿主内におけるプラスミドの複
製を可能にするが、更に、大腸菌のような細菌宿主内に
おけるプラスミド増幅についてもこのことが望まれる。
安定に形質転換された組換え細胞類の選択を可能にする
マーカーを提供するために、ベクターは更に、形質転換
体類について生存に有利な性質を付与する遺伝子も組み
込むが、それは、ネオマイシンを補充した培地中でその
形質転換体類が培養される場合のネオマイシン耐性をコ
ードする遺伝子のようなものである。レセプターをコー
ドするＤＮＡの哺乳類細胞発現を行うために使用するこ
とができる様々な組換えＤＮＡ発現系は、サイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、
サルのウイルス（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス
（ＭＭＴＶ）、及び、他のものからのプロモーターのよ
うな、哺乳類細胞類に感染するウイルス類のプロモータ
ー類を利用するものである。発現を行わせるのに有用な
ものは、レトロウイルス類のＬＴＲのようなプロモータ
ー類、温度により調節されかつドロソフィラから単離さ
れたもののような昆虫細胞のプロモーター類、並びに、
重金属類により調節されるもののような哺乳類の遺伝子
プロモーター類、つまり、メタロチオネイン遺伝子プロ
モーター、及び、他のステロイド誘導性プロモーター類
である。組換えＤＮＡ発現ベクター内への組み込みにつ
いては、選択されたヒトのＧｌｕＲレセプター（例え
ば、ヒトのＧｌｕＲ１Ｂ、ＧｌｕＲ２Ｂ、もしくは、Ｇ
ｌｕＲ３Ａレセプター類のうちの一つ）、あるいは、Ａ
ＭＰＡ結合性断片もしくはその変異体（例えば、Ｇｌｕ
Ｒ３Ｂ）をコードするＤＮＡを、遺伝子単離もしくは遺
伝子合成の選択された技術を適用することにより取得す
ることができる。本明細書中の実施例においてより詳細
に記載されているように、ヒトのＧｌｕＲレセプター類
はヒトの脳組織のゲノム内にコードされており、従っ
て、慣用的な遺伝子単離及びクローニング技術を注意深
く適用することにより、ヒトのＤＮＡライブラリーから
取得することができる。これは、典型的には、ヒトの脳
組織、好ましくは小脳もしくは海場組織の新鮮な供給源
からの全メッセンジャーＲＮＡの抽出、その後の、メッ
セージのｃＤＮＡへの変換、及び、例えば細菌プラスミ
ド、より典型的には、バクテリオファージ内でのライブ
ラリーの形成を必要とする。ヒトのＤＮＡの断片を含む
このようなバクテリオファージは、典型的には、個々の
ファージプラークもしくはコロニーを単離することがで
きるように、感受性大腸菌細菌の層の上での培養により
増殖させる。ファージコロニーにより保有されているＤ
ＮＡを、その後、典型的には、ニトロセルロースもしく
はナイロンをベースにしたハイブリッド形成用膜上に固
定化し、その後、注意深く調節した条件下で、放射能
（もしくは他の方法）でラベルした適切な配列のオリゴ
ヌクレオチドプローブに対してハイブリッド形成させ
て、レセプターをコードするＤＮＡもしくはその断片を
保有する特定のファージコロニーを同定する。例えば、
選択的なハイブリッド形成、つまり、プローブに対して
完全に相補的であるＤＮＡ配列のハイブリッド形成を、
厳格なハイブリッド形成条件下で行うことが理解されよ
う。典型的には、そのように同定された遺伝子もしくは
その一部分を、核酸配列分析のために、プラスミドベク
ター内にサブクローン化する。本発明の特定の実施態様
においては、ＧｌｕＲ１Ｂレセプターは、図１に図示し
てあるＤＮＡ配列（配列番号：１）によりコードさ
れ、ＧｌｕＲ２Ｂレセプターは図２に図示してあるＤＮ
Ａ配列（配列番号：３）によりコードされ、更に、Ｇ
ｌｕＲ３Ａ及びＧｌｕＲ３Ｂレセプターは図３に図示し
てあるＤＮＡ配列（配列番号：５）及び図４に図示し
てあるＤＮＡ配列（配列番号：７）によりコードされ
ている。あるいは、ＧｌｕＲレセプターをコードする示
されているＤＮＡ配列内のコドンを、同義のコドン等価
物と置換することができるが、このような同義のコドン
置換は当業者に良く知られている。図示されているＤＮ
Ａ配列は、本明細書中に例示されている方法におけるヒ
ト脳のｃＤＮＡライブラリー内で同定されるｃＤＮＡ配
列を構成している。ヒトのＧｌｕＲレセプター群の様々
な一員のヌクレオチド配列を本明細書内に提供してある
が、レセプター類をコードするポリヌクレオチドは他の
経路により取得することも可能であると判断される。遺
伝子合成及び／又は増幅の自動化された技術を実施し
て、それらをコードするＤＮＡを作製することができ
る。ヒトのＧｌｕＲレセプターをコードするＤＮＡの長
さのため、自動合成の適用には、最高でも３００ヌクレ
オチドの長さまでの遺伝子の領域を個々に合成し、その
後、最終的な組立のために、相補性を有する張り出し部
分（ｏｖｅｒｈａｎｇｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔ
ｙ）を利用して正確に連続してつなぎ合わせる、段階的
遺伝子構築を必要とするかもしれない。個々に合成され
た遺伝子領域を、確立されたポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）技術を利用して、組立の前に増幅させることがで
きる。自動化した遺伝子合成技術の適用により、天然の
ヒトＧｌｕＲレセプター、つまり、ＧｌｕＲ１Ｂ、Ｇｌ
ｕＲ２Ｂ、ＧｌｕＲ３Ａ、及び、ＧｌｕＲ３Ｂ、の変異
体類をコードするポリヌクレオチドを作製する手段を提
供する。例えば、本明細書中に記載されているヒトのＧ
ｌｕＲレセプターをコードするポリヌクレオチド類を、
本明細書中に示されている天然のポリヌクレオチド配列
内に表わされているコドンの代わりに同義のコドンを置
換することにより作製することができる、と判断され
る。更に、例えば、一つもしくは複数の、例えば１−１
０の、単一アミノ酸置換、欠失、及び、付加を取り込む
ヒトのＧｌｕＲレセプターの変異体をコードするポリヌ
クレオチドを作製することができる。スリーニングの目
的で、レセプターの天然リガンド結合プロフィルを維持
させることが多くの場合において望まれるため、例え
ば、電荷のようなものを有するアミノ酸におけるいわゆ
る保存的置換にアミノ酸置換を限定し、かつ、例えば、
成熟したレセプターのおおよそ最初の２０Ｎ末端残基、
及び、レセプタードメインのマッピングにおいて明確に
されているような他の領域内においての、レセプター活
性について余り重要でない部位に対する置換に限定する
ことが望まれる。保有する適切な鋳型ＤＮＡを使用し
て、ＰＣＲ増幅の技術を、最終遺伝子の全てもしくは一
部分を直接作製するのに使用することもできる。この場
合、一片もしくは互いに連結することができる数片の最
終産物のＰＣＲ増幅を引き起こすプライマーを合成す
る。これは、平滑末端を有する増幅されたＤＮＡ断片類
の段階的連結によって、好ましくは、天然に存在する制
限エンドヌクレアーゼ部位を含む断片類の段階的連結に
よって行うことができる。この適用法においては、ＣＤ
ＮＡもしくはゲノムＤＮＡのいずれかをＰＣＲ増幅のた
めの鋳型として使用することが可能である。前者の場合
においては、ｃＤＮＡ鋳型を、市販品として入手するこ
とができる、もしくは、自ら作製した、小脳及び海馬を
含む様々なヒトの脳組織のｃＤＮＡライブラリーから取
得することができる。一旦取得したら、レセプターをコ
ードするＤＮＡを、任意の適切な発現ベクター内に発現
のために組み込み、更に、宿主細胞を、ＤＮＡ介在性形
質転換、電気穿孔法、もしくは、分子ガン（ｐａｒｔｉ
ｃｌｅｇｕｎ）法形質転換のような慣用的な方法を使
用して、そのベクターでトランスフェクトさせる。発現
ベクターを選択して、一時的にもしくは適切な方法での
いずれかでレセプターをコードするＤＮＡを発現する、
形質転換させた細胞系を提供することができる。一時的
な発現については、宿主細胞類を、典型的には、哺乳類
細胞中において機能する複製起点を有する発現ベクター
で形質転換させる。安定な発現のためには、このような
複製起点は必要ないが、ベクターは典型的には、形質転
換体類に、それらの選択を可能にする、生存に有利な性
質を付与する産物をコードする遺伝子を含有している。
このような選択可能なマーカーをコードする遺伝子に
は、ミコフェノール酸に対する耐性を付与する大腸菌の
ｇｐｔ遺伝子、抗生物質Ｇ４１８及びネオマイシンに対
する耐性を付与するトランスポゾンＴｎ５由来のｎｅｏ
遺伝子、ＤＨＦＲ−細胞類の表現型をＤＨＦＲ＋細胞類
へと変化させるマウス細胞類もしくは大腸菌由来のｄｈ
ｆｒ配列、及び、ＴＫ−細胞の表現型をＴＫ＋細胞にす
る単純ヘルペスウイルスのｔｋ遺伝子がある。一時的発
現及び安定した発現の両者とも、リガンドスクリーニン
グアッセイ類に使用するための、形質転換した細胞系、
及び、それから誘導される膜調製物を提供することがで
きる。スクリーニングアッセイ類に使用するためには、
レセプターをコードするＤＮＡを一時的に発現する細胞
類を後に使用するために凍結保存することができるが、
速い速度のプラスミド複製が結局は細胞を死に至らせる
ため、通常は数日のうちに、その形質転換細胞をできる
かぎり早めに使用するべきである。このようなアッセイ
類は、無傷の細胞類、あるいは、このような細胞類に由
来する膜調製物類のいずれかを使用して行うことができ
る。膜調製物類は、典型的にはリガンド結合実験のため
のより都合の良い基質を提供し、従って、結合用基質と
して好ましい。スクリーニング、つまり、リガンド結合
実験の目的で膜調製物類を調製するには、凍結した無傷
の細胞類を冷水懸濁液状態のうちに均一化させ、遠心後
に膜ペレットを回収する。その後、このペレットを冷水
で洗浄し、更に、透析して、グルタミン酸のような、取
り除いておかないとアッセイ中における結合に競合する
内因性ＥＡＡリガンドを除去する。その後、あるいは、
凍結乾燥した形態で保存した後に、透析した膜をリガン
ド結合アッセイにおいて行うのと同じように使用するこ
とができる。あるいは、一時的なトランスフェクション
後約２日で、あるいは、安定にトランスフェクトさせた
細胞を新しいプレートに撒いておおよそ同じ期間後に回
収した無傷の新鮮な細胞を、膜調製物類について使用し
たのと同じ方法でリガンド結合アッセイに使用すること
ができる。細胞を使用する際に、細胞は、損傷を与えな
いようにより温和な遠心により回収する必要があり、か
つ、全ての洗浄は、例えば、リン酸緩衝塩水のような緩
衝化された培地で行い、細胞の浸透圧ショック及び破裂
を回避する必要がある。物質、つまり、リガンドの候補
の、本発明のヒトＧｌｕＲレセプターに対する結合は、
典型的には、予め決定してある量の細胞由来膜、一般的
には約２５μｇから１００μｇ（例えば、蛋白質測定に
より測定する）、を使用して評価する。一般的には、競
合的結合アッセイは、ＡＭＰＡに関連するテスト化合物
の親和性を評価するのに有用である。この競合的結合ア
ッセイは、様々な濃度で添加してあるラベル化していな
いテスト化合物の存在下において、例えば［^３Ｈ］−Ａ
ＭＰＡのような放射ラベルしたＡＭＰＡと共にこの膜調
製物をインキュベートすることにより実施することがで
きる。インキュベーション後、置換されたもしくは結合
している放射ラベル化ＡＭＰＡのいずれかを回収及び測
定して、基質として使用された特定のレセプターについ
ての、テスト化合物とＡＭＰＡの相対結合親和性を決定
することができる。この方法においては、ＡＭＰＡ結合
性のヒトＥＡＡレセプター類についての様々な化合物の
親和性を測定することができる。あるいは、グルタミン
酸の放射ラベル化類似物を競合的リガンドとして、放射
ラベル化ＡＭＰＡの代わりに使用することができる。レ
セプターをコードするＤＮＡを発現する細胞を使用する
他の方法としては、リガンドの性質決定を、例えばキセ
ノプス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞のような細胞類を使
用して行うこともでき、この卵母細胞は、レセプターを
コードするメッセンジャーＲＮＡの卵母細胞の細胞質へ
の注入、もしくは、レセプターをコードするＤＮＡの卵
母細胞の核への注入による導入後、機能的な膜結合性レ
セプターを産生する。細胞質分配用のメッセンジャーＲ
ＮＡを作製するためには、レセプターをコードするＤＮ
Ａを、典型的には、最初に、プラスミドベクター内のＴ
３もしくはＴ７バクテリオファージプロモーターのよう
な適切なプロモーター領域の近傍にサブクローン化させ
て、ＲＮＡメッセージへの転写を可能にする。その後、
ＲＮＡを、インビトロにおいて挿入した遺伝子から転写
させ、回収し、その後、キセノプスの卵母細胞中に注入
する。ＲＮＡ溶液のｎＬ容量の注入後、この卵母細胞を
最高数日間インキュベートして放置し、その後、浴溶液
中に供給された特定のリガンド分子に対して反応する能
力についてのテストを行う。機能的なＥＡＡレセプター
類は、イオンが選択的に通過することができる膜チャン
ネルの操作より部分的に作用するため、浴溶液中の特定
なリガンド分子に対して反応するレセプターの機能を、
典型的には、確立された方法において、細胞内に挿入さ
れた微小電極を利用することにより、電流として測定す
ることができる。レセプターをコードするＤＮＡを、リ
ガンドのスクリーニングに有用な細胞系を作製するのに
使用することに加え、本発明の他の態様によると、ＤＮ
Ａの発現を行わせて、構造研究のため、抗体類を作製す
るため、及び、他の実験的用途のために、レセプターの
ＡＭＰＡ結合性断片類を可溶性形態で製造することがで
きる。ＡＭＰＡ結合性残基に反応することができるヒト
のＧｌｕＲレセプター部分は細胞の外側に存在し、つま
り、細胞外物質であることが予想される。従って、最初
の例においては、この細胞外リガンド結合ドメインを大
量にかつ単離された形態、つまり、レセプターの残りの
部分を含まない状態で提供することにより、レセプター
−リガンド相互作用の性質決定を可能にすることが望ま
れる。これを実施するためには、ヒトのＧｌｕＲレセプ
ターをコードするＤＮＡの全長を、翻訳停止コドンを、
細胞外Ｎ末端領域内の、最初の膜貫通ドメイン（ＴＭ
１）をコードする配列の直前、つまり、ＧｌｕＲ１Ｂに
おいては残基５２１の前、ＧｌｕＲ２Ｂにおいては残基
５２５の前、もしくは、ＧｌｕＲ３Ａ及びＧｌｕＲ３Ｂ
の残基５２７の前に導入するように、部位特異的突然変
異誘発により修飾することができる。膜内へレセプター
を「固定（ａｎｃｈｏｒ）」させる任意の膜貫通ドメイ
ンがもはや産生されないため、修飾した遺伝子の発現の
結果として細胞外リガンド結合ドメインのみの、可溶性
形態での分泌が生じる。その後に標準的なリガンド結合
アッセイを行って、そのように産生される細胞外ドメイ
ンに対する候補化合物の結合の度合いを決定することが
できる。当然のことながら、部位特異的突然変異誘発を
使用して、単離されたドメインに対するリガンド結合の
度合いを至適化させる目的で、細胞外領域の数種の異な
る変形体を産生する必要があるかもしれない。本発明の
リガンド結合アッセイに使用するために、はじめに、種
々の技術のうち任意の１つを用いて、レセプターのＡＭ
ＰＡ結合性断片を固体支持体に固定する。１つの方法で
は、レセプターペプチド断片のＣ末端を、誘導体化され
た不溶性ポリマー性支持体、例えば架橋ポリスチレンも
しくはポリアミド樹脂に結合させることができる。固体
支持体に固定したら、その断片を利用して候補リガンド
をレセプター結合親和性に関してスクリーニングする。
この目的には、通常、全長レセプターを用いる上記の競
合型リガンド結合アッセイが使用される。固体支持体に
しっかりと固定された断片は、候補リガンドの存在中、
天然リガンドすなわちＡＭＰＡと結合される。ＡＭＰＡ
または候補リガンドのいずれか一方を、例えば放射能で
ラベルし、適当なインキュベーション期間後、結合した
ラベルまたは非結合ラベルの量を測定することによっ
て、ＡＭＰＡの置換の度合いを決定する。あるいは、成
熟蛋白質のアミノ末端に由来するのではなく、その代わ
りにむしろカルボキシ末端に由来するレセプターの細胞
外ドメイン、例えば、４番目の膜貫通ドメイン（ＴＭ
４）のすぐ後に来る、つまり、ＧｌｕＲ１Ｂのアミノ酸
残基８０９−８８８、ＧｌｕＲ２Ｂの残基８１３−８６
２、あるいは、ＢｌｕＲ３ＡもしくはＧｌｕＲ３Ｂの残
基８１７−８６６の間に存在するドメインを産生するこ
とが望まれる。この場合、部位特異的突然変異誘発及び
／又はＰＣＲに基づく増幅技術を容易に使用して、目的
のレセプタードメインをコードする遺伝子の定義された
断片を提供することができる。遺伝子断片をコードする
ＤＮＡが発現ベクターにより提供される翻訳開始コドン
に隣接して挿入され、かつ、必要な翻訳読み取り枠が注
意深く保存されているという条件で、このようなＤＮＡ
配列を使用して、所望のレセプター断片の発現を、細胞
内で、あるいは、分泌様式で行なうことができる。Ｇｌ
ｕＲレセプターのこのようなＡＭＰＡ結合性断片類の産
生を、様々な宿主細胞内において行うことができるであ
ろう。ＣＨＯ細胞類のような哺乳類細胞類をこの目的に
使用することができ、この場合、発現は、典型的には、
例えば、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター
のような高いレベルでの発現を可能にさせる発現プロモ
ーターにより行われる。あるいは、昆虫のＳｆ９（スポ
ドプテラ・フルギペルダ）細胞類のような非哺乳類細胞
を使用することができ、この場合、発現は、典型的に
は、バキュロウイルスの発現プロモーター、例えば、強
力な後期ポリヘドリン蛋白質プロモーターにより行われ
る。繊維状菌類の発現系を使用して、ＥＡＡレセプター
のこのような細胞外ドメインを大量に分泌させることも
できる。例えば、発現をａｌｃＡプロモーターにより行
うアスペルギルス・ニデュランスは、このような許容で
きる系を構成する。このような発現宿主類に加え、細胞
内にせよ細胞外にせよ、異種の遺伝子類もしくは遺伝子
断片類を発現することができる、任意の原核生物もしく
は他の真核生物の発現系が同様に許容されるであろう。
特に、例えば脳組織内におけるヒトのＧｌｕＲレセプタ
ーの存在及び／又は局在の検出に使用するために、本発
明は、他の態様において、ヒトのＧｌｕＲレセプターに
対するラベル化抗体をも提供する。このような抗体類を
産生するためには、先に記載したような微生物もしくは
哺乳類細胞宿主内で産生されるか、あるいは、標準的な
ペプチド合成技術により産生される、無傷の可溶性レセ
プターもしくはその免疫原性断片、つまり、免疫反応を
誘導することができる断片、のいずれかを免疫原として
使用することができる。免疫原性断片としての使用に特
に適するヒトのＧｌｕＲレセプターの領域は、レセプタ
ーの細胞外領域、もしくは、その細胞外領域の一部分に
対する配列に相当するものを含む。それは例えば、Ｇｌ
ｕＲ３Ａレセプターの残基１−５２６からなるペプチド
類、もしくは、少なくとも約１０残基からなるその断片
（特に、残基１７８−１９３もしくは４７９−５２２を
含む断片類がそれに含まれる）、及び、ＧｌｕＲ３Ａレ
セプターの膜貫通ドメインＴＭ−２とＴＭ−３との間の
領域に相当するペプチド類（残基５９４−６０３からな
るペプチドのようなもの）である。Ｃ末端ドメイン（Ｇ
ｌｕＲ３Ａレセプターの残基８１７−８６６）もしくは
その断片からなるペプチドを、抗体類の作製に使用する
こともできる。選択されたヒトのＧｌｕＲレセプターも
しくは免疫原性断片に対する抗体類の作製は、ポリクロ
ーナル抗体の産生については、慣用的な免疫化プロトコ
ール、及び、ヒツジ、ヤギ及びウサギのような様々な哺
乳類宿主類のうちの任意のものを使用して実施すること
ができる。あるいは、モノクローナル抗体の産生につい
て、脾細胞のような免疫細胞を免疫化した動物から回収
し、ハイブリドーマ技術を使用して骨髄腫細胞に融合さ
せることができる。融合産物を、その後、選択培地中で
培養することによりスクリーニングし、抗体を産生する
細胞を継続的な増殖、及び、抗体回収のために回収す
る。その後、回収した抗体を、放射ラベル、酵素ラベ
ル、ルミネッセンスラベル、もしくは、その類のものの
ような検出可能なラベルに対して、この目的のために確
立されたリンカー技術を使用して共有結合的にカップリ
ングさせることができる。例えば、放射ラベル化した形
態のような、検出可能なようにラベル化した形態におい
ては、ヒトのＧｌｕＲレセプターをコードするＤＮＡも
しくはＲＮＡ、及び、選択されたその領域を、本発明の
他の態様に従って、ハイブリッド形成用のプローブとし
て使用して、例えば、ヒトもしくは他の哺乳類ゲノム
（もしくは、ｃＤＮＡライブラリー）中に存在する配列
関連遺伝子を同定するか、あるいは、脳組織のような検
体中のヒトＧｌｕＲをコードするＤＮＡの位置を決定す
ることもできる。これは、例えば^３２Ｐで放射ラベルし
てあるヌクレオチド類を中に取り込んでいる無傷のコー
ディング領域、あるいは、その断片のいずれかを使用し
て実施することができる。ある検体内に含まれるヒトの
ＧｌｕＲをコードするＤＮＡを同定するためには、それ
をコードする全長ｃＤＮＡ、あるいは、それについて特
有な断片のいずれかを使用することが望ましい。図１−
４（配列番号：１−８）を参照すると、このようなヌク
レオチド断片には、少なくとも約１７核酸を含むもの、
そうでない場合には、レセプターの細胞外Ｎ末端もしく
はＣ末端領域をコードする領域に配列が一致するもの、
あるいは、その５’非翻訳もしくは３’非翻訳領域を示
すものがある。このようなオリゴヌクレオチド配列、及
び、無傷の遺伝子自身を当然のことながら使用して、ヒ
トのＧｌｕＲに関連するヒト遺伝子、特に、そのｃＤＮ
Ａ等価物を、標準的なハイブリッド形成技術によりクロ
ーン化することもできる。本発明の実施態様は、以下に
示す特定の実施例において詳細に記載されているが、こ
の実施例に制限されるものと解釈されるべきでない。

【実施例】実施例１ヒトＧｌｕＲ３ＡレセプターをコードするＤＮＡの単離ヒトＧｌｕＲ３Ａレセプターをクローン化するのに使用
した特定の方法を、図６に概略的に図示し、以下により
多くの詳細を記載した。ヒトのＧｌｕＲ３Ａレセプター
をコードするｃＤＮＡは、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌ
ｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ社（ＬａＪｏｌｌａ，Ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から、大腸菌を
ベースにしたラムダーファージライブラリー（ラムダー
ＺＡＰ）として取得した。このｃＤＮＡライブラリー
を、最初に、ｈｕｍＥＡＡｌａとして表示されるカイネ
ート結合性のヒトＥＡＡレセプターの３’領域を構成す
る１．１ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩＤＮＡ断片を
用いて精査した。この特定のカイネート結合性レセプタ
ーは、１９９１年８月２６日に出願され、参考として本
明細書中に取り込まれる本出願人の同時係属中の米国特
許出願第０７／７５０，０９０号に記載されている。ヒ
トのＥＡＡｌａレセプターをコードし、１．１ｋｂのプ
ローブを回収することができるＤＮＡをブダペスト条約
に従って、１９９１年８月２１日に、米国、メリーラン
ド州、ロックビルにあるＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ
ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、受託
番号ＡＴＣＣ７５０６３を得た。プローブを用いるハイ
ブリッド形成は、３０℃で一晩行い、フィルターは、
０．５％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣを用いて２５℃で５
分間洗浄し、続いて、０．５％ＤＳＳＣを含む２×ＳＳ
Ｃを用いて５０℃で１５分間洗浄した。最終洗浄は、
０．５％のＳＤＳを含む１×ＳＳＣを用いて、５０℃で
１５分間行った。フィルターを一晩Ｘ線フィルム（Ｋｏ
ｄａｋ社）に対して露出した。以下に示すハイブリッド
形成条件下（６×ＳＳＣ、５０％のフォルムアミド、５
％のデンハート溶液、０．５％のＳＤＳ、１００μｇ／
ｍｌの変成させたサーモン精子ＤＮＡ）でスクリーニン
グした１０^６個のクローンのうち、僅か２つの海馬ｃＤ
ＮＡライブラリー挿入物が同定され、一つものもは約
１．６ｋｂで、ＲＫＣＨ５２１と表示され、他のものは
約２．２ｋｂで、ＲＫＣＨ２２１と表示される（図
６）。配列決定のために、’５２１及び’２２１ファー
ジをプラーク精製し、その後、提供者の仕様書に従っ
て、ファゲミド（ｐｈａｇｅｍｉｄｓ）として切断し
て、挿入断片を保持している、ファゲミドベクターのブ
ルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）−ＳＫ変異体
を作製した。’２２１クローンの全配列に亘る配列決定
により、５’非コーディング領域の約７８塩基、及び、
コーディング領域の約２．１ｋｂを伴う推定上のＡＴＧ
開始コドンが明らかにされた。’５２１挿入断片全体に
亘る配列決定により、’２２１挿入断片と重複する重要
な領域が明らかにされ、かつ、停止コドンの位置は決定
されていないが、幾つかの追加的３’配列が提供され
た。’５２１配列中には明白な停止コドンがなかったの
で、その遺伝子の３’領域を探索した。この目的のため
に、Ｋｅｉｎａｎｅｎら（上掲）により報告されている
ラットのＧｌｕＲ３レセプター配列の３’領域にアニー
リングすることができるオリゴヌクレオチドプローブを
最初に合成した。３２−Ｐでラベルしたプローブの特異
的配列を以下に提供する（配列番号：１３）。５’−ＡＣＡＣＴＣＡＧＡＡＴＴＡＣＧＣＴＡＣＡＴＡ
ＣＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴ−３’ 同じ海馬ｃＤＮＡライブラリーを、その後、ラットをベ
ースにしたプローブを使用し、以下に示すハイブリッド
形成条件下で再スクリーニングした：６×ＳＳＣ、２５
％のフォルムアミド、５％のデンハート溶液、０．５％
のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変成させたサーモン精子
ＤＮＡ、４２℃。これにより、１．２ｋｂの挿入断片が
明らかになり、これを、ＲＫＣＳＨＧ１３２と表示し
た。全プローブの配列決定により、予め単離されてい
る’５２１挿入断片の３’端と重複している５’端が明
らかになり、更に、停止コドン、並びに、３’非翻訳配
列の約１５塩基も明らかになった。無傷のクローン中の
全コーディング領域を提供するために、図６に示した方
法を利用して、３．０ｋｂのブルースクリプト−ＳＫフ
ァゲミドのバックグランド中に含まれる２．８ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ挿入断片としてｈＧｌｕＲ３Ａを
コードするＤＮＡを保有するファゲミドｐＢＳ／Ｈｕｍ
ＧｌｕＲ３Ａを作製した。ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ挿入
断片の全配列を、図３に提供した（配列番号：５及び
６）。５．８ｋｂのファゲミドｐＢＳ／ｈｕｍＧｌｕＲ
３Ａを、ブダペスト条約に従って、米国、メリーランド
州、ロックビル市にあるＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣ
ｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに、１９９２年３
月１９日に寄託し、受託番号ＡＴＣＣ７５２１８を得て
いる。実施例２ヒトＧｌｕＲ３ＢレセプターをコードするＤＮＡの単離ヒト胎児脳のｃＤＮＡライブラリーを、更に、ヒトのＧ
ｌｕＲレセプターについての探索についてスクリーニン
グした。この特定のライブラリーは、Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ社（ＬａＪｏ
ｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）か
ら、ＥｃｏＲＩをベースにしたラムダーｇｔ１０ライブ
ラリーとして取得した。このライブラリーを、最初に、
報告されているラットＧｌｕＲ３遺伝子配列の３’領域
にハイブリッド形成することができるオリゴヌクレオチ
ドをハイブリッド形成用プローブとして使用してスクリ
ーニングした。先に記載したようなハイブリッド形成条
件（６×ＳＳＣ、２５％のフォルムアミド、４２℃、
等）を用いたスクリーニングにより、約２．３ｋｂのサ
イズの一つの挿入断片が明らかになり、これをＲＫＣＳ
ＦＧ３４と表示した。その挿入断片を保持するブルース
クリプト−ＳＫファゲミドを放出させるために切断後、
配列決定により、’３４挿入断片と、先に単離してある
ＧｌｕＲ３Ａクローンの３’端との間の実質的な配列の
同一性が明らかになり、かつ、’３４挿入断片上に部分
的にコードされていた遺伝子の５’端が消失したことが
示唆された。組み合わせた遺伝子を提供するために、
５’領域をＧｌｕＲ３Ａ挿入断片から切り出し、更に、
これを使用して、内部にあるＨｉｎｄＩＩＩ部位におい
て’３４挿入断片の５’端を作製した。これは、図７に
図式化して示したように実施した。得られた無傷のロー
ンを、ヒトＧｌｕＲ３Ｂと表示した。実施例１のＧｌｕ
Ｒ３Ａクローンと本実施例のＧｌｕＲ３Ｂクローンとの
間の配列比較により、アミノ酸配列として図５に図示す
る（配列番号：９及び１０）非類似性の短い領域のみが
明らかになった。６．１ｋｂのファゲミドｐＢＳ／ｈｕ
ｍＧｌｕＲ３Ｂを、ブダペスト条約に従って、米国、メ
リーランド州、ロックビルにあるＡｍｅｒｉｃａｎＴ
ｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに、１９
９２年３月１９日に寄託し、受託番号ＡＴＣＣ７５２１
９が与えられている。実施例３ヒトＧｌｕＲ１ＢレセプターをコードするＤＮＡの単離ヒトＧｌｕＲ１ＢレッセプターをコードするｃＤＮＡ
を、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔ
ｅｍｓ社（ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ
ａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から、ＥｃｏＲＩをベースにした
ラムダーファージライブラリーとして取得したヒト胎児
脳のｃＤＮＡを精査することにより同定した。このｃＤ
ＮＡライブラリーを、Ｈｏｌｌｍａｎｎｅら（上掲）
により報告されているラットＧｌｕＲ１レセプター配列
の５’領域にアニールすることができるオリゴヌクレオ
チドプローブを使用してスクリーニングした。３２−Ｐ
ラベルしたプローブの特異的配列を以下に示す（配列番
号：１４）。５’−ＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣ
ＡＧＣＧＡＣＡＣＧＴＴＴＧＡＧＡＴＧ−３’ 胎児脳のｃＤＮＡライブラリーを、以下に示すハイブリ
ッド形成条件下でスクリーニングした：６×ＳＳＣ、２
５％のフォルムアミド、５％のデンハート溶液、０．５
％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変成させたサーモン精
子ＤＮＡ、４２℃。フィルターを、０．５％のＳＤＳを
含む２×ＳＳＣで、２５℃で５分間洗浄し、次に、０．
５％のＳＤＳを含む２×ＳＳＣで、５０℃で１５分間洗
浄した。最終洗浄は、０．５％のＳＤＳを含む１×ＳＳ
Ｃで、５０℃で１５分間であった。フィルターを一晩Ｘ
線フィルム（Ｋｏｄａｋ社）に露出した。スリーニング
した１０^６個のクローンのうち、約３．２ｋｂの唯一つ
のｃＤＮＡ挿入断片が同定され、それをＲＫＣＳＦＧ９
１と表示した。配列決定のために、’９１ファージをプ
ラーク精製し、その後、提供者の仕様書に従ってファゲ
ミドとして切り出し、挿入断片を保持しているファゲミ
ドベクターのブルースクリプト−ＳＫ変異体を作製し
た。’９１クローンの全配列に亘る配列決定により、
５’非コーディング領域の約６１塩基及びコーディング
領域の２，７１８塩基を伴う、推定上のＡＴＧ開始コド
ンが明らかになった。更に、停止コドン、並びに、３’
非翻訳配列の約４３８塩基も明らかになった。ＥｃｏＲ
Ｉ／ＥｃｏＲＩ挿入断片の全配列を図１に提供した（配
列番号：１及び２）。３．０ｋｂのブルースクリプト−
ＳＫファゲミドバックグランド中に含まれる３．２ｋｂ
のＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ挿入断片としてレセプターを
コードするＤＮＡを保持する、ｐＢＳ／ｈｕｍＧｌｕＲ
１Ｂと表示される６．２ｋｂのファゲミドを、ブダペス
ト条約に従って、米国、メリーランド州、ロックビルに
あるＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎに、１９９２年５月２８日に寄託
し、受託番号ＡＴＣＣ７５２４６が付与されている。実施例４ヒトＧｌｕＲ２ＢレセプターをコードするＤＮＡの単離ヒトＧｌｕＲ２Ｂレセプターをクローン化するのに用い
た特定の戦略を図１０において図式化して示し、かつ、
より多くの詳細を以下に記載した。ヒトＧｌｕＲ２Ｂレ
セプターをコードするｃＤＮＡは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅＣｌｏｎｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ社（ＬａＪｏｌ
ｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から、
ＥｃｏＲＩをベースにしたラムダーファージライブラリ
ー（ラムダーＺＡＰ）として取得したヒト海馬のｃＤＮ
Ａを精査することにより同定した。このｃＤＮＡライブ
ラリーを、Ｋｅｉｎａｎｅｎら（上掲）により報告され
ているラットのＧｌｕＲ２レセプター配列の３’領域に
アニールすることができるオリゴヌクレオチドプローブ
を使用してスクリーニングした。３２−Ｐラベルしたプ
ローブの特異的配列を以下に提供した（配列番号：１
５）。５’−ＧＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣ
ＧＧＧＡＡＧＴＡＡＧ−３’ 海馬ｃＤＮＡライブラリーを、以下に示すハイブリッド
形成条件下でスクリーニングした：６×ＳＳＣ、２５％
のフォルムアミド、５％のデンハート溶液、０．５％の
ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変成させたサーモン精子Ｄ
ＮＡ、４２℃。フィルターを、０．５％のＳＤＳを含む
２×ＳＳＣで、２５℃で５分間洗浄し、次に、０．５％
のＳＤＳを含む２×ＳＳＣで、５０℃で１５分間洗浄し
た。最終洗浄は、０．５％のＳＤＳを含む１×ＳＳＣ
で、５０℃で１５分間であった。フィルターを一晩Ｘ線
フィルム（Ｋｏｄａｋ社）に露出した。スリーニングし
た１０^６個のクローンのうち、約２．７ｋｂの一つのｃ
ＤＮＡ挿入断片が同定され、それをＲＫＣＳＨＧ８４と
表示し、更に、約２．９ｋｂの別のｃＤＮＡ挿入断片が
同定され、それをＲＫＣＳＨＧ４１と表示した（図１
０）。配列決定のために、’８４及び’４１のファージ
をプラーク精製し、その後、提供者の仕様書に従ってフ
ァゲミドとして切り出し、挿入断片を保持している、フ
ァゲミドベクターのブルースクリプト−ＳＫ変異体を作
製した。’８４クローンの全配列に亘る配列決定によ
り、５’非コーディング領域の約３１４塩基及びコーデ
ィング領域の約２．４ｋｂを伴う推定上のＡＴＧ開始コ
ドンが明らかになった。’４１挿入断片の全配列に亘る
配列決定により、’８４挿入断片と重複する重要な領域
が明らかになり、更に、’８４挿入断片中には見いださ
れなかった停止コドン、並びに、３’非翻訳配列の約４
４１塩基も明らかになった。無傷のクローン中の全コー
ディング領域を提供するために、図１０に示した戦略を
利用して、３．０ｋｂのブルースクリプト−ＳＫファゲ
ミドバックグランド中に含まれる３．４ｋｂのＥｃｏＲ
Ｉ／ＥｃｏＲＩ挿入断片としてｈＧｌｕＲ２Ｂをコード
するＤＮＡを保持するファゲミドｐＢＳ／ＨｕｍＧｌｕ
Ｒ２Ｂを作製した。ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ挿入断片の全
配列を、図２に提供した（配列番号：３及び４）。６．
４ｋｂのファゲミドｐＢＳ／ｈｕｍＧｌｕＲ２Ｂを、ブ
ダペスト条約に従って、米国、メリーランド州、ロック
ビルにあるＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに、１９９２年３月１９日に寄
託し、受託番号ＡＴＣＣ７５２１７が付与されてい
る。実施例５ヒトＧｌｕＲ３Ａレセプターを産生する遺伝子工学的に
処理した細胞の構築図８に示した戦略を使用して、発現ベクター内へのＧｌ
ｕＲ３ＡレセプターをコードするｃＤＮＡの組み込みを
促進させた。哺乳類細胞中の一時的発現については、ヒ
トＧｌｕＲ３ＡレセプターをコードするｃＤＮＡを哺乳
類の発現ベクターｐｃＤＮＡＩ内に組み込んだが、この
ベクターは、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏａｔｉ
ｏｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，
ＵＳＡ：カタログ番号Ｖ４９０−２０）から市販品と
して入手することができる。これは、真核生物系内にお
けるｃＤＮＡ発現、及び、原核生物系内におけるｃＤＮ
Ａ分析のために設計された多重機能性の４．２ｋｂのプ
ラスミドベクターである。ＣＭＶプロモーター及びエン
ハンサー、スプライスセグメント及びポリアデニル化シ
グナル、ＳＶ４０及びポリオーマウイスルの複製起点、
及び、配列決定及び突然変異誘発のために一本鎖ＤＮＡ
を解放するためのＭ１３オリジン、センス及びアンチセ
ンスＲＮＡ転写物の産生のためのＳｐ６及びＴ７ＲＮＡ
プロモーター、及び、ＣｏｌＥ１様の高コピープラス
ミドオリジンが、このベクター内に取り込まれている。
ポリリンカーは、ＣＭＶプロモーター（及び、Ｔ７プロ
モーターの３’）の下流に適切に配置されている。Ｇｌ
ｕＲ３ＡレセプターをコードするｃＤＮＡの発現ベクタ
ー内への組み込みを促進するために、ＮｏｔＩ部位を、
ブルースクリプト−ＳＫのｃＤＮＡ挿入断片の５’フラ
ンク上に導入し、その後、このｃＤＮＡ挿入断片を、
２．８ｋｂのＮｏｔＩ／ＮｏｔＩ断片としてｐＢＳ／ｈ
ｕｍＧｌｕＲ３Ａから放出し、これをその後、ｐｃＤＮ
ＡＩポリリンカー中のＮｏｔＩ部位に組み込んだ。Ｎｏ
ｔＩ接合部位にまたがる配列決定を行い、ｐｃＤＮＡＩ
内の適切な挿入方向を確認した。得られたプラスミドは
ｐｃＤＮＡＩ／ｈｕｍＧｌｕＲ３Ａと表示され、これ
を、その後、一時的発現のために、選択された哺乳類細
胞宿主内へ導入したが、この場合この宿主細胞は、サル
由来の、ＣＯＳ−１系の線維芽細胞様細胞であった（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ１６５０として、メリーランド州、ロ
ックビルのＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒ
ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手することができ
る）。ＧｌｕＲ３ＡをコードするＤＮＡの一時的発現の
ために、ＣＯＳ−１細胞を、１０^６個のＣＯＳ細胞当た
り約８μｇのＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ１／ｈｕｍＧｌｕＲ３
Ａとして）で、ＤＥＡＥを介在するＤＮＡトランスフェ
クション法によりトランスフェクトさせ、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら（上述）により記載されている方法に従って、ク
ロロキン（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）で処理した。簡潔
に述べると、ＣＯＳ−１細胞を、５×１０^６細胞／皿の
密度でプレートに撒き、その後、ＦＢＳを補充してある
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２４時間増殖させた。その後、
培地を除去し、細胞をＰＢＳ内で洗浄し、次に、培地内
で洗浄した。その後、細胞に、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中
に、ＤＥＡＥデキストラン（０．４ｍｇ／ｍｌ）、１０
０μＭのクロロキン、１０％のＮｕＳｅｒｕｍ、ＤＮＡ
（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含むトランスフェクション溶液
を加えた。３７℃における３時間のインキュベーション
後、細胞をＰＢＳ及び培地で先ほど記載したように洗浄
し、その後、ＤＭＥＭ／Ｆ１２倍地中に含まれる１０％
のＤＭＳＯで１分間ショックを与える。細胞を、１０％
のＦＢＳを補充してある培地中で２−３日間増殖させ、
インキュベーション終了時に、培養皿を氷上に置き、氷
冷ＰＢＳで洗浄し、その後、掻き取って取り出した。そ
の後、細胞を、１０００ｒｐｍで１０分間の遠心により
回収し、リガンド結合アッセイに使用するために、細胞
ペレットを液体窒素中で凍結した。凍結した細胞の融解
アリコートのノザンブロット分析により、保存下におけ
る細胞中での、レセプターをコードするｃＤＮＡの発現
を確認した。類似した方法で、安定にトランスフェクト
させた細胞系を、２つの異なる細胞型を宿主として使用
して調製することもでき、これらの細胞型は、ＣＨＯ
Ｋ１及びＣＨＯＰｒｏ５である。これらの細胞系を構
築するために、ヒトＧｌｕＲ３ＡをコードするｃＤＮＡ
を、安定な発現を可能にする、哺乳類の発現ベクターｐ
ＲＣ／ＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内に組み込ん
だ。この部位への挿入により、ｃＤＮＡは、サイトメガ
ロウイルスプロモーターの発現調節下にあり、かつ、ウ
シの成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化部位及びター
ミネーターの上流にあり、かつ、選択可能なマーカーと
してのネオマイシン耐性遺伝子（ＳＶ４０の初期プロモ
ーターにより作動させられる）を含むベクターのバック
グランド内に配置させられた。先に記載したように作製
されたプラスミドを導入するために、宿主であるＣＨＯ
細胞を、最初に、１０％のＦＢＳを補充したＭＥＭ培地
中に、５×１０^５の密度で撒いた。２４時間の増殖後、
そのプレートに新鮮な培地を添加し、３時間後に、細胞
を、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、上述）を用いてトランスフェクトする。簡潔に
述べると、３μｇのＤＮＡを、緩衝化したカルシウム溶
液と混合し、室温で１０分間インキュベートした。等量
の緩衝化したリン酸溶液を添加し、この懸濁液を室温で
１５分間インキュベートした。次に、このインキュベー
トした懸濁液を細胞に加えて４時間してから除去し、１
５％のグリセロールを含む培地で細胞にショックを与え
た。３分後、細胞を培地で洗浄し、正常な増殖条件で２
４時間インキュベートした。ネオマイシンに耐性な細胞
を、Ｇ４１８を含む（１ｍｇ／ｍｌ）、１０％のＦＢＳ
を補充したアルファーＭＥＭ培地中で選択する。Ｇ４１
８耐性細胞の個々のコロニーを約２−３週間後に単離
し、クローンを選択し、その後、アッセイの目的のため
に増殖させる。実施例６ヒトＧｌｕＲ１Ｂレセプターを産生する遺伝子工学的に
処理した細胞の構築図９に示した戦略を使用して、ＧｌｕＲ１Ｂレセプター
をコードするｃＤＮＡの、発現ベクター内への組み込み
を亢進させた。特に、ＮｏｔＩ部位を、ブルースクリプ
ト−ＳＫのｃＤＮＡ挿入断片の３’フランク上に導入
し、その後、このｃＤＮＡ挿入断片を３．２ｋｂのＮｏ
ｔＩ／ＮｏｔＩ断片としてｐＢＳ／ｈｕｍＧｌｕＲ１Ｂ
から切り出し、これをその後、ｐｃＤＮＡＩポリリンカ
ー内のＮｏｔＩ部位に組み込んだ。接続部分にまたがる
配列決定を行い、ｐｃＤＮＡＩ内における適切な挿入方
向を確認した。得られたプラスミドはｐｃＤＮＡ１／ｈ
ｕｍＧｌｕＲ１Ｂと表示され、これをその後、一時的発
現のために、先に記載した、サル由来の、ＣＯＳ−１系
の線維芽細胞様細胞内に導入した。ＧｌｕＲ１Ｂをコー
ドするＤＮＡの一時的発現のために、ＣＯＳ−１細胞
を、１０^６個のＣＯＳ細胞当たり約８μｇのＤＮＡ（ｐ
ｃＤＮＡ１／ｈｕｍＧｌｕＲ１Ｂとして）で、実施例５
に記載した方法を使用してトランスフェクトした。実施例７ヒトＧｌｕＲ２Ｂレセプターを産生する遺伝子工学的に
処理した細胞の構築図１１に示した戦略を使用して、ＧｌｕＲ２Ｂレセプタ
ーをコードするｃＤＮＡの、発現ベクター内への組み込
みを亢進させた。特に、ＮｏｔＩ部位を、ブルースクリ
プト−ＳＫのｃＤＮＡ挿入断片の５’フランク上に導入
し、その後、このｃＤＮＡ挿入断片を、３．４ｋｂのＨ
ｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ断片としてｐＢＳ／ｈｕｍＧｌ
ｕＲ２Ｂから放出し、これをその後、ｐｃＤＮＡＩポリ
リンカー内のＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ部位に組み込ん
だ。接続部分にまたがる配列決定を行い、ｐｃＤＮＡＩ
内における適切な挿入方向を確認した。得られたプラス
ミドはｐｃＤＮＡ１／ｈｕｍＧｌｕＲ２Ｂと表示され、
これをその後一時的発現のために、先に記載した、サル
由来の、ＣＯＳ−１系の線維芽細胞様細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６５０として、メリーランド州、ロックビル
のＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎから入手することができる）内に導入し
た。ＧｌｕＲ２ＢをコードするＤＮＡの一時的発現のた
めに、ＣＯＳ−１細胞を、実施例５において設定したよ
うに１０^６個のＣＯＳ細胞当たり約８μｇのＤＮＡ（ｐ
ｃＤＮＡ１／ｈｕｍＧｌｕＲ２Ｂとして）でトランスフ
ェクトした。実施例８リガンド結合アッセイ凍結した状態のトランスフェクトした細胞を、手動のホ
モジナイザーを使用して氷冷した蒸留水内に再懸濁さ
せ、５分間超音波処理をし、その後、５０，０００ｇで
２０分間遠心した。上清を除去し、膜ペレットを−７０
℃において凍結保存した。ＣＯＳ細胞膜ペレットを、氷
冷した５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５５、５
℃）内に再懸濁させ、結合について競合すると思われる
内因性グルタミン酸を除去する目的で、再び、５０，０
００ｇで１０分間遠心した。ペレットを、氷冷した５０
ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５５）緩衝液内に再懸
濁させ、得られた膜調製物を、以下に記載する結合実験
のための組織源として使用した。蛋白質は、標準として
ＢＳＡを使用して、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）試薬を用
いて測定した。その後、結合アッセイを、蛋白質測定に
より決定された２５−１００μｇに等しい量のＣＯＳ由
来の膜等価物、及び、選択された放射ラベルしてあるリ
ガンドを用いて行った。特に、ＡＭＰＡ結合アッセイに
ついては、インキュベーション用混合物は、１ｍｌの最
終容量中に０．１ＭのＫＳＣＮ及び２．５ｍＭのＣａＣ
ｌ_２を含み、２５−１００μｇの組織蛋白質、及び、
Ｄ，Ｌ−アルファー−［５−メチル−^３Ｈ］アミノ−３
−ヒドロキシ−５−メチルイソキサゾール−４−プロピ
オン酸（^３Ｈ−ＡＭＰＡ、２７．６Ｃｉ／ミリモル、最
終１０ｎＭ）からなる。非特異的結合は、１ｍＭのＬ−
グルタミン酸の存在下で測定した。試料をプラスチック
製のミニバイアル中で、氷上で６０分間インキュベート
し、結合したリガンドと遊離のリガンドを、５０，００
０ｇにおける３０分間の遠心により分離した。ペレット
を、６ｍｌの冷却したインキュベーション緩衝液で２度
洗浄し、その後、５ｍｌのＢｅｃｋｍａｎ社のＲｅａｄ
ｙ−ＰｒｏｔｅｉｎＰｌｕｓシンチレーション用混合
液を計数のため添加した。カイネート結合アッセイにつ
いては、インキュベーション混合物は、１ｍｌの最終容
量の冷却したイキュベーション緩衝液中に含まれる２５
−１００μｇの組織蛋白質、及び、［ビニリデン−
^３Ｈ］カイニン酸（５８Ｃｉ／ミリモル、最終５ｎＭ）
からなっていた。非特異的結合を、１ｍＭのＬ−グルタ
ミン酸の存在下で測定した。試料を、ＡＭＰＡ結合アッ
セイについてインキュベートし、結合したリガンドと遊
離のリガンドを、Ｂｒａｎｄｅｌ社の細胞ハーベスタ
ー、及び、氷冷した０．３％のポリエチレンイミン中に
予め浸してあるＧＦ／Ｂフィルターを使用する迅速濾過
により分離した。フィルターは、６ｍｌの冷却したイン
キュベーション緩衝液で２度洗浄し、その後、計数のた
めに、５ｍｌのＢｅｃｋｍａｎ社のＲｅａｄｙ−Ｐｒ
ｏｔｅｉｎＰｌｕｓシンチレーション用混合液を添加
してあるシンチレーション用バイアルに入れた。この方
法で行ったアッセイにより、ヒトのＧｌｕＲ３Ａレセプ
ターを産生するＣＯＳ細胞に由来する膜調製物を使用し
た場合、１０ｎＭの［^３Ｈ］−ＡＭＰＡにおいて、２５
−３０ｆｍｏｌｅ／ｍｇ蛋白質の特異的結合が（図１
４）明らかにされ、また、ヒトＧｌｕＲ１Ｂレセプター
を産生するＣＯＳ細胞に由来する膜調製物を使用した場
合、１０ｎＭの［^３Ｈ］−ＡＭＰＡにおいて、１００−
１５０ｆｍｏｌｅ／ｍｇ蛋白質の特異的結合が明らかに
され（図１２）、更に、ヒトＧｌｕＲ２Ｂレセプターを
産生するＣＯＳ細胞に由来する膜調製物を使用した場
合、１０ｎＭの［^３Ｈ］−ＡＭＰＡにおいて、７５０−
８５０ｆｍｏｌｅ／ｍｇ蛋白質の特異的結合が明らかに
された（図１３）。Ｍｏｃｋでトランスフェクトした細
胞は、テストした任意のリガンドの特異的結合を示さな
かった。スキャッチャード分析により、組換えにより発
現されるヒトのＧｌｕＲ１Ｂ及びＧｌｕＲ２Ｂレセプタ
ーは、各々、４６ｎＭ（図１５）及び約３６．３±７．
４ｎＭ（図１６）の解離定数（Ｋｄ）を有する単一クラ
スの［^３Ｈ］ラベルされたＡＭＰＡ結合部位をそれぞれ
含むことが明らかにされた。更に、ＧｌｕＲ１Ｂ及びＧ
ｌｕＲ２Ｂレセプターの最大ＡＭＰＡ結合は、各々、８
４７及び８１６±３０２ｆｍｏｌｅ／ｍｇ蛋白質である
ことが分かった。［^３Ｈ］−ＡＭＰＡ置換アッセイも、
ＣＯＳ細胞中ＧｌｕＲ２Ｂレセプターについて実施し、
選択されたリガンドの相対結合親和性を決定した。図１
７に示されるようなこれらの結果により、ＧｌｕＲ２Ｂ
レセプターに対する^３Ｈ−ＡＭＰＡの結合を置換するこ
とにおけるリガンド類の効力の等級順位は、以下に示す
ようなものであることが示される。キスカレート（ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ）＝ＡＭＰＡ＞
ＤＮＱＸ＞ＣＮＱＸ＞グルタミン酸＞ドモエート（ｄｏ
ｍｏａｔｅ）＞カイネート。これらの結果は、明らか
に、ヒトのＧｌｕＲレセプターが特異性を伴ってＡＭＰ
Ａに結合することを立証している。この活性は、カイネ
ートもしくはＮＭＤＡの立証可能な結合は殆どないかま
たは全くないという事実と考え合わせると、明らかに、
ヒトのＧｌｕＲレセプターがＥＡＡレセプターのＡＭＰ
Ａ型であることに帰する。更に、この結合プロフィルに
よりレセプターは確実な仕方で結合していることが示さ
れ、従って、ヒトの脳に由来する組換え体でない対応物
（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）のリガンド結合「サイン」
が確実に予測される。これらの特徴により、組換えレセ
プターは、そのレセプターに結合するリガンド化合物の
選択及び特徴決定、及び／又は、このレセプターから他
のリガンドを置換することにより作用することができる
化合物の選択及び特徴決定に特に有用なものとなってい
る。実質的に純粋な形態でのＧｌｕＲレセプター遺伝子
の単離は、そのレセプターが、単一で均質なレセプター
種として発現されることができるということであるが、
これにより、ヒト及び他の哺乳類の脳からの複雑で不均
質なレセプター調製物を使用してこのような性質決定を
試みる場合に起こる正確さの欠落が、このリガンド結合
アッセイからは取り除かれている。

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３２２０塩基対配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の特徴：特徴を表わす記号：ＣＤＳ存在位置：６２．．．２７８２特徴を表わす記号：ｓｉｇ＿ペプチド存在位置：６２．．．１１５特徴を表わす記号：ｍａｔ＿ペプチド存在位置：１１６．．．２７８２配列

【化１】

【化２】

【化３】

【化４】配列番号：２配列の長さ：９０６アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列

【化５】

【化６】

【化７】

【化８】配列番号：３配列の長さ：３４０７塩基対配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の特徴：特徴を表わす記号：ＣＤＳ存在位置：３１５．．．２９６６特徴を表わす記号：ｓｉｇ＿ペプチド存在位置：３１５．．．３７４特徴を表わす記号：ｍａｔ＿ペプチド存在位置：３７５．．．２９６６配列

【化９】

【化１０】

【化１１】

【化１２】

【化１３】配列番号：４配列の長さ：８８３アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列

【化１４】

【化１５】

【化１６】

【化１７】配列番号：５配列の長さ：２７６１塩基対配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の特徴：特徴を表わす記号：ｓｉｇ＿ペプチド存在位置：７９．．．１４４特徴を表わす記号：ｍａｔ＿ペプチド存在位置：１４５．．．２７４５特徴を表わす記号：ＣＤＳ存在位置：７９．．．２７４５配列

【化１８】

【化１９】

【化２０】

【化２１】配列番号：６配列の長さ：８８８アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列

【化２２】

【化２３】

【化２４】配列番号：７配列の長さ：３０７０塩基対配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ配列の特徴：特徴を表わす記号：ｓｉｇ＿ペプチド存在位置：７９．．．１４４特徴を表わす記号：ｍａｔ＿ペプチド存在位置：１４５．．．２７４５特徴を表わす記号：ＣＤＳ存在位置：７９．．．２７４５配列

【化２５】

【化２６】

【化２７】

【化２８】配列番号：８配列の長さ：８８８アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列

【化２９】

【化３０】

【化３１】

【化３２】配列番号：９配列の長さ：４６アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列

【化３３】配列番号：１０配列の長さ：４６アミノ酸配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列

【化３４】配列番号：１１配列の長さ：１３塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡオリゴヌクレオチ
ド）配列ＡＧＣＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣ１３配列番号：１２配列の長さ：９塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡオリゴヌクレオチ
ド）アンチセンス：Ｙｅｓ配列ＧＣＧＧＣＣＧＣＡ９配列番号：１３配列の長さ：４０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡオリゴヌクレオチ
ド）配列ＡＣＡＣＴＣＡＧＡＡＴＴＡＣＧＣＴＡＣＡＴＡＣＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＴ４０配列番号：１４配列の長さ：４０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡオリゴヌクレオチ
ド）配列ＣＣＡＧＡＴＣＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＡＧＣＧＡＣＡＣＧＴＴＴＧＡＧＡＴＧ４０配列番号：１５配列の長さ：３２塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡオリゴヌクレオチ
ド）配列ＧＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＴＣＧＧＧＡＡＧＴＡＡＧ３２

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】この図は、ヒトＧｌｕＲ１Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：１及び２）。

【図１Ｂ】この図は、ヒトＧｌｕＲ１Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：１及び２）。

【図１Ｃ】この図は、ヒトＧｌｕＲ１Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：１及び２）。

【図１Ｄ】この図は、ヒトＧｌｕＲ１Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：１及び２）。

【図１Ｅ】この図は、ヒトＧｌｕＲ１Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：１及び２）。

【図１Ｆ】この図は、ヒトＧｌｕＲ１Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：１及び２）。

【図２Ａ】この図は、ヒトＧｌｕＲ２Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：３及び４）。

【図２Ｂ】この図は、ヒトＧｌｕＲ２Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：３及び４）。

【図２Ｃ】この図は、ヒトＧｌｕＲ２Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：３及び４）。

【図２Ｄ】この図は、ヒトＧｌｕＲ２Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：３及び４）。

【図２Ｅ】この図は、ヒトＧｌｕＲ２Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：３及び４）。

【図２Ｆ】この図は、ヒトＧｌｕＲ２Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：３及び４）。

【図３Ａ】この図は、ヒトＧｌｕＲ３Ａレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：５及び６）。

【図３Ｂ】この図は、ヒトＧｌｕＲ３Ａレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：５及び６）。

【図３Ｃ】この図は、ヒトＧｌｕＲ３Ａレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：５及び６）。

【図３Ｄ】この図は、ヒトＧｌｕＲ３Ａレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：５及び６）。

【図３Ｅ】この図は、ヒトＧｌｕＲ３Ａレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：５及び６）。

【図４Ａ】この図は、ヒトＧｌｕＲ３Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：７及び８）。

【図４Ｂ】この図は、ヒトＧｌｕＲ３Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：７及び８）。

【図４Ｃ】この図は、ヒトＧｌｕＲ３Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：７及び８）。

【図４Ｄ】この図は、ヒトＧｌｕＲ３Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：７及び８）。

【図４Ｅ】この図は、ヒトＧｌｕＲ３Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：７及び８）。

【図４Ｆ】この図は、ヒトＧｌｕＲ３Ｂレセプターをコ
ードするＤＮＡ配列、及び、そのアミノ酸配列を示す
（配列番号：７及び８）。

【図５】この図は、非類似性の領域におけるヒトＧｌｕ
Ｒ３Ａレセプター（配列番号：９）及びヒトＧｌｕＲ３
Ｂレセプター（配列番号：１０）のアミノ酸配列を示
す。

【図６】この図は、図３において説明される、ヒトＧｌ
ｕＲ３ＡレセプターをコードするＤＮＡのクローニング
に使用する戦略を示している。

【図７】この図は、図４において説明される、ヒトＧｌ
ｕＲ３ＢレセプターをコードするＤＮＡのクローニング
に使用する戦略を示している。

【図８】この図は、ＧｌｕＲ３Ａレセプターをコードす
るＤＮＡを組み込んだ組換えＤＮＡ発現構築物を作製す
るのに使用する戦略を示している。

【図９】この図は、ＧｌｕＲ１Ｂレセプターをコードす
るＤＮＡを組み込んだ組換えＤＮＡ発現構築物を作製す
るのに使用する戦略を示している（配列番号：１１及び
１２もこの図中に示してある）。

【図１０】この図は、図２において説明されている、ヒ
トＧｌｕＲ２ＢレセプターをコードするＤＮＡのクロー
ニングに使用する戦略を示している。

【図１１】この図は、ＧｌｕＲ２Ｂレセプターをコード
するＤＮＡを組み込んだ組換えＤＮＡ発現構築物を作製
するのに使用する戦略を示している。

【図１２】この図は、ヒトＧｌｕＲ１ＢレセプターのＡ
ＭＰＡ結合特性を示している。

【図１３】この図は、ヒトＧｌｕＲ２ＢレセプターのＡ
ＭＰＡ結合特性を示している。

【図１４】この図は、ヒトＧｌｕＲ３ＡレセプターのＡ
ＭＰＡ結合特性を示している。

【図１５】この図は、ヒトＧｌｕＲ１Ｂ及びＧｌｕＲ２
ＢレセプターのＡＭＰＡ結合のスキャッチャード分析を
示している。

【図１６】この図は、ヒトＧｌｕＲ１Ｂ及びＧｌｕＲ２
ＢレセプターのＡＭＰＡ結合のスキャッチャード分析を
示している。

【図１７】この図は、ＧｌｕＲ２Ｂレセプターについて
のＡＭＰＡ競合結合データをグラフで示している。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ 21/08 8214−4Ｂ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 593137299 ステイーブン・エル・ナツトカナダ国、オンタリオ・エム・８・ブイ・２・エル・２、エトビコーク、バーリントン・ストリート・74、アパートメント・ナンバー・１ (72)発明者ラジエンダー・カンボイカナダ国、オンタリオ・エル・５・エヌ・１・アール・４、ミシソウガ、アービダ・サークル・2869 (72)発明者カンダス・エリオツトカナダ国、オンタリオ・エム・８・ブイ・２・エル・２、エトビコーク、バーリントン・ストリート・74、アパートメント・ナンバー・１ (72)発明者ステイーブン・エル・ナツトカナダ国、オンタリオ・エム・８・ブイ・２・エル・２、エトビコーク、バーリントン・ストリート・74、アパートメント・ナンバー・１

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトのＧｌｕＲ１Ｂ、ＧｌｕＲ２Ｂ、Ｇ
ｌｕＲ３Ａ及びＧｌｕＲ３Ｂレセプター類、並びに、そ
のＡＭＰＡ結合性断片類からなる群から選択されるＡＭ
ＰＡ結合性ヒトＧｌｕＲレセプターをコードする領域を
含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】ＧｌｕＲ１Ｂレセプターをコードする、
請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】ＧｌｕＲ２Ｂレセプターをコードする、
請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】ＧｌｕＲ３Ａレセプターをコードする、
請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】ＧｌｕＲ３Ｂレセプターをコードする、
請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】ヒトのＧｌｕＲ１Ｂ、ＧｌｕＲ２Ｂ、Ｇ
ｌｕＲ３Ａ及びＧｌｕＲ３Ｂレセプターからなる群から
選択されるＧｌｕＲレセプターのＡＭＰＡ結合性変異体
をコードする領域を含む単離されたポリヌクレオチドで
あって、該変異体が、該レセプターの結合プロフィルを
有し、かつ、保存的アミノ酸置換により該レセプターか
ら変化している、前記ポリヌクレオチド。
【請求項７】請求項１から６において定義されるポリ
ヌクレオチドを中に取り込んである、組換えＤＮＡ構築
物。
【請求項８】中に取り込まれる該ポリヌクレオチド
が、細胞宿主内において該レセプターの発現及び分泌を
可能にするＤＮＡと操作可能なように結合されている、
請求項７に記載の組換えＤＮＡ構築物。
【請求項９】請求項１〜６のいずれか一項に定義され
ている異種ポリヌクレオチドを中に取り込んでいる細胞
宿主。
【請求項１０】哺乳類細胞である、請求項９に記載の
細胞宿主。
【請求項１１】請求項９または１０に定義されている
細胞宿主から誘導されるＡＭＰＡ結合性の膜調製物。
【請求項１２】ヒトＧｌｕＲレセプターの実質的に均
質な供給源を得るための方法であって、請求項９または
１０に定義されている細胞宿主を培養し、その後、その
ように培養した細胞を回収する段階を含む、前記方法。
【請求項１３】培養した該細胞から膜調製物を得る後
続の段階を含む、請求項１２に記載の、ヒトＧｌｕＲレ
セプターの実質的に均質な供給源を得るための方法。
【請求項１４】ヒトＥＡＡレセプターへの結合に関し
物質をアッセイする方法であって、請求項９または１０
に定義されている細胞宿主と共に、あるいは、該宿主か
ら誘導されるＡＭＰＡ結合性の膜調製物と共に、適切な
条件下で該物質をインキュベーションし、更に、ヒトＧ
ｌｕＲレセプターとその物質との間の結合の程度を測定
する段階を含む、前記方法。
【請求項１５】ヒト起源の他の蛋白質類を本質的に含
まない形態での、ＧｌｕＲ１Ｂ、ＧｌｕＲ２Ｂ、Ｇｌｕ
Ｒ３Ａ及びＧｌｕＲ３Ｂレセプター類、並びに、そのＡ
ＭＰＡ結合性断片類からなる群から選択される、単離さ
れたヒトＧｌｕＲレセプター。
【請求項１６】ＧｌｕＲ１Ｂ、ＧｌｕＲ２Ｂ、Ｇｌｕ
Ｒ３Ａ、及び、ＧｌｕＲ３Ｂレセプター類からなる群か
ら選択されるヒトＧｌｕＲレセプターのＡＭＰＡ結合性
断片。
【請求項１７】ＧｌｕＲ１Ｂ、ＧｌｕＲ２Ｂ、Ｇｌｕ
Ｒ３Ａ、及び、ＧｌｕＲ３Ｂレセプター類からなる群か
ら選択されるヒトＧｌｕＲレセプターを結合する抗体。
【請求項１８】ＧｌｕＲ１Ｂ、ＧｌｕＲ２Ｂ、Ｇｌｕ
Ｒ３Ａ及びＧｌｕＲ３Ｂレセプター類からなる群から選
択されるヒトＧｌｕＲレセプターの免疫原性断片。
【請求項１９】少なくとも約１７核酸を含み、かつ、
請求項１に定義されるポリヌクレオチドと選択的にハイ
ブリッド形成する、オリゴヌクレオチド。