DE19847064A1 - Pharmakologisches Werkzeug zur Identifizierung und Charakterisierung von Substanzen, welche an Glutamatrezeptoren vom alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-propionat (AMPA)-Typ wirken - Google Patents
Pharmakologisches Werkzeug zur Identifizierung und Charakterisierung von Substanzen, welche an Glutamatrezeptoren vom alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-propionat (AMPA)-Typ wirkenInfo
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Abstract
Beschrieben werden Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ, die eine spezifische Punktmutation an der Stelle aufweisen, die dem L497 des AMPA-Rezeptors GluR1¶fiip¶ der Ratte entspricht, wobei das Leucin an dieser Stelle durch eine aromatische Aminsäure ersetzt wird. Weiterhin werden Nucleinsäuremoleküle, die diese Glutamatrezeptoren codieren, als auch Vektoren und Wirtszellen, die diese Nucleinsäuremoleküle umfassen, beschrieben. Des weiteren umfaßt die Erfindung sowohl Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Glutamatrezeptoren als auch Verfahren zur Blockierung der Densensitisierung von AMPA-Rezeptoren und Verfahren zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Substanzen, welche an Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ wirken. Ferner werden die Verwendung der erfindungsgemäßen Glutamatrezeptoren, der Vektoren, der Wirtszellen und/oder der Verfahren beschrieben.
Description
1. Die Erfindung dient als pharmakologisches Werkzeug zur Identifizierung und
Charakterisierung von Substanzen, welche an Glutamatrezeptoren vom
α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazol-propionat(AMPA)-Typ wirken. Nach
Expremierung eines AMPA-Rezeptormutanten in Zellinien oder in Oozyten
von Xenophus laevis kann die pharmakologische Wirksamkeit einer Substanz
durch elektrophysiologische Messung von Substanz-induzierten, bzw.
Substanz-inhibierten Glutamat-Strömen bestimmt werden.
2. Es handelt sich bei unserer Erfindung um eine spezifische Punktmutation
(L497Y) in dem AMPA-Rezeptor GluR1flip, welche die sonst typische
Desensitisierung des nativen Kanals komplett blockiert. Andere Eigenschaften
des Rezeptors sind durch die Mutation nicht signifikant verändert. AMPA-Re
zeptoren (GluR1-4) gehören zur Familie der ionotropen
Glutamatrezeptoren, welche sich hauptsächlich auf der postsynaptischen Seite
von Nervenzellen des zentralen Nervensystems (ZNS) befinden. Glutamt ist
der wichtigste Neurotransmitter des ZNS und daher spielen AMPA-Ka
nalfunktionen eine zentrale Rolle für die neuronale Kommunikation.
3. Desensitisierung der AMPA-Rezeptoren schützt die postsynaptische Zelle vor
Übererregung nach exzessiver Glutamatausschüttung, wie sie unter anoxischen
oder traumatischen Bedingung im ZNS auftreten könnte. Diese schnelle
Desensitisierung (Zeitkonstante ca. 1-13 ms mit einer Inhibition des Stromes
von 93%-99%) erschwert den experimentellen Zugang zur Messung von
Kanalaktivität und in Folge auch den Zugang zu einfachen pharmakologischen
Untersuchungen.
4. Während bei nativen Rezeptoren die schnelle Desensitisierung eine
Bestimmung der eigentlichen Spitzenantwort fast unmöglich macht, werden bei
einem nicht-desensitisierenden Kanal immer die maximalen Stromantworten in
Relation zur eingesetzten Agonistenkonzentration gemessen, so daß Dosis-Wir
kungskurven leichter und genauer bestimmbar sind. Des weiteren läßt sich
von dem Aktivitätsmuster des Kanals direkt auf die Klassifizierung der zu
testenden Substanz schließen. Antagonisten, partielle Antagonisten und volle
Agonisten lassen sich klar unterscheiden.
5. Desensitisierende Rezeptoren habe in der Regel eine Erholungsphase, die sog.
Resensitisierung. Diese Versuchseinschränkung braucht bei der vorgestellten
Punktmutation nicht berücksichtigt zu werden. Substanzen können beliebig
schnell und zu jedem Zeitpunkt des Versuches appliziert werden, ohne das eine
Abnahme der Aktivität zu befürchten wäre (siehe Abb. C). Der GluR1-Re
zeptor und sein Mutant habe im Vergleich zu anderen AMPA-Rezeptoren
die höchste Affinität, so daß schon bei 100 µM Glutamat von gesättigten
Konzentrationen ausgegangen werden kann (Abb. 1D). Dies erleichtert die
Messung an Froschoozyten, da dort nur submillimolare
Glutamatkonzentrationen eingesetzt werden können.
6. Die Punktmutation wurde auf PCR-Basis nach dem QuickChange
Mutageneseverfahren (Stratagene) hergestellt, anschließend in GluR1-
pCDNA3 oder -pGEMHE Expressionsvektoren überführt. Expremierung kann
damit entweder in Säugetierzellinien oder Froschoozyten erfolgen. Die
Expremierung durch transiente oder permanente Transfektion von HEK-Zellen,
bzw. RNA-Injektion in Oozyten, ist ein etabliertes Verfahren und hat sich
gerade bei der Charakterisierung von Membranproteinen als sehr erfolgreich
erwiesen.
7. GenBank accession number: X17184 GluR1 der Ratte (Hollmann et al., Nature
342, 43, 1989). Die Numerierung der Aminosäuren beginnt am Methionin des
"open reading frame". Die Aminosäure an Position 497 ist von L (Lysin) zu Y
(Thyrosin) mutiert worden. Andere aromatische Aminosäuren an dieser
Position haben den gleichen Effekt und sollen damit in diesem Patent enthalten
sein.
- A) Typische Antwort auf die Applikation von 10 mM L-Glutamat zu einem nativen, homologen GluR1flip Rezeptor. Die Aufnahme wurde in out-side.out- patch-Konfiguration von transient transfizierten HEK-Zellen gemacht. Der schwarze Balken gibt den Zeitraum an, in welchem Glutamat appliziert wurde. Beachten sie die schnelle Desensitisierung in Anwesenheit des Agonisten. Die schwarze Skizze zeigt schematisch die Primärstruktur des Proteins mit den Transmembranregionen (M1, M2, und M3) als senkrechte, kleine Balken.
- B) Typische Antwort auf eine Applikation von 10 mM L-Glutamat des nicht- desensitisierenden AMPA-Kanals GluR1flip(L497Y). Die Aufnahme wurde in out-side.out-patch-Konfiguration von transient transfizierten HEK-Zellen gemacht. Man sieht die vollständige Aktivierung des Kanals während der Applikation des Agonisten. Innerhalb der Skizze ist die Lokalisation der Punktmutation als weißer Strich gekennzeichnet.
- C) Die Abbildung zeigt die Stromspur zur Erstellung einer Glutamat-Dosis-Wir kungskurve vom GluR1flip(L497Y) Rezeptor. Die Ganzzellableitung wurde mit der patch-clamp-Methode von transient transfizierten HEK-Zellen gemacht. Die eingesetzten Konzentrationen sind über den Balken angegeben.
- D) Der Graph zeigt die dosisabhängige Stromantwort des nicht-desensitisierenden AMPA-Kanals GluR1flip(L497Y) auf L-Quisqualat (schwarze Kreise) und L-Glutamat (weiße Quadrate), normalisiert auf die Spitzenantwort. Beachten sie die Genauigkeit der Messung anhand der Fehlerbalken. Die Daten wurden wie in C) dargestellt gewonnen.
Claims (15)
1. Glutamatrezeptor vom AMPA-Typ, der eine spezifische Punktmutation an der
Stelle aufweist, die dem L497 des AMPA-Rezeptors GluR1flip der Ratte
entspricht, wobei das Leucin an dieser Stelle durch eine aromatische
Aminosäure ersetzt ist.
2. Nucleinsäuremolekül, das den Glutamatrezeptor vom AMPA-Typ nach
Anspruch 1 codiert.
3. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 2, das DNA oder RNA ist.
4. Vektor, der eine Nucleinsäure nach einem der Ansprüche 2 oder 3 umfaßt.
5. Vektor nach Anspruch 4, der ein Expressionsvektor ist.
6. Wirtszelle, die ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 2 oder 3 oder einen
Vektor nach Anspruch 4 oder 5 umfaßt.
7. Verfahren zur Herstellung des Glutamatrezeptors nach Anspruch 1, das die
Expression des Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 2 oder 3 in Wirtszellen
umfaßt.
8. Verfahren zur Blockierung der Desensitisierung von AMPA-Rezeptoren,
dadurch gekennzeichnet, daß sie den Schritt umfaßt, eine Aminosäure, die
den L497 des GluR1flip der Ratte entspricht, durch eine aromatische
Aminosäure zu ersetzen.
9. Verfahren zur Identifizierung und/oder Charakterisierung von Substanzen,
welche an Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ wirken, umfassend die
Exprimierung des Glutamatrezeptors nach Anspruch 1.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Glutamatrezeptor vom AMPA-Typ wie
definiert in Anspruch 1 in einer Wirtszelle exprimiert ist.
11. Wirtszelle nach Anspruch 6 und/oder Verfahren nach Anspruch 7 oder 10,
wobei die Wirtszelle eine Säugerzelle oder eine Froschzelle ist.
12. Wirtszelle und/oder Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Säugerzelle eine
Säugerzellinie und die Froschzelle ein Froschoozyt ist.
13. Wirtszelle und/oder Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Säugerzelllinie
eine HEK Zellinie und der Froschoozyt ein Oozyt von Xenopus laevis ist.
14. Verwendung des Glutamatrezeptors nach Anspruch 1, der Vektor nach
Anspruch 4 oder 5, der Wirtszelle nach einem der Ansprüche 6, 10, 11 oder
12, und/oder des Verfahren nach einem der Ansprüche 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder
13 zur Identifikation und/oder Charakterisierung einer Substanz und/oder von
Substanzen, welche an Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ wirkt/wirken.
15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Substanz und/oder die Substanzen
ein Antagonist, ein partieller Antagonist, oder ein Agonist ist/sind.
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Legal Events
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Owner name: MAX-PLANCK-GESELLSCHAFT ZUR FOERDERUNG DER WISSENS |
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