JPH06135979A - 新規物質ｎｋ３７４２００、その製造法及びその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】免疫増強活性、殺虫活性を有する新規物質ＮＫ
３７４２００を提供する。 【構成】物質ＮＫ３７４２００はタラロミセス ｓｐ
ＮＫ３７４２００株（微工研菌寄第１２９７４号）の培
養によって得られ、ＮＫ３７４２００は分子式Ｃ₁₂Ｈ₁₇
Ｎ₇Ｏ₃ 、分子量３０７を持つ化合物である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規物質ＮＫ３７４２０
０、その製造法及びその用途に関する。本発明の物質は
リンパ球幼若化反応増強作用、殺虫作用を有し、免疫増
強剤、殺虫剤などとして使用される生物活性物質として
期待される。

【０００２】

【従来の技術】従来、免疫増強剤としては、ベスタチ
ン、レバミゾール等の免疫増強剤等が知られている。
又、殺虫剤としてミルベマイシン、ポリナクチン等が知
られている。

【０００３】しかし、これらは毒性や活性の面の問題か
ら、これらの用途に適する新規化合物の発明が待たれて
いる。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは微
生物の代謝産物について、種々検索した結果、糸状菌に
属する一菌株がリンパ球幼若化反応増強作用及び殺虫活
性を有する新規物質ＮＫ３７４２００を産生する事を見
出した。

【０００５】本発明は、上記知見に基づいて完成された
ものである。上記新規物質ＮＫ３７４２００は、タラロ
ミセス属に属するＮＫ３７４２００生産菌を培養し、生
成蓄積せしめ、この培養物より物質ＮＫ３７４２００を
採取する事により得られる。

【０００６】物質ＮＫ３７４２００の生産菌の代表的な
ものとして土壌より分離したＮＫ３７４２００株（微工
研菌寄第１２９７４号ＦＥＲＭ Ｐ−１２９７４）が挙
げられる。

【０００７】以下にＮＫ３７４２００株の菌学的性状を
示す。バレイショ・ブドウ糖寒天培地（２５℃）の生育
は良く、１０日間で、集落の経は、45.0mmに達する。集
落の表面は、気生菌糸が着生し、培養日数に従い、黄色
を呈し、中央に子のう果を多数形成する。分生子構造は
少数で、集落の形状に影響を与えない。表面は、褐色〜
淡褐色を呈する。

【０００８】麦芽エキス寒天培地（２５℃）の生育もよ
く、１０日間で、集落の径は、43.0mmに達する。集落の
形状は、バレイショ・ブドウ糖寒天培地と似ている。ツ
アペック寒天培地（２５℃）の生育は悪く、１０日間
で、集落の径は、23.5mmに達する。集落の表面は、気生
菌糸が着生し、培養日数に従い、淡黄色を呈するが、子
のう果の形成は見られない。

【０００９】オートミール寒天培地（２５℃）の生育は
良く、１０日間で、集落の径は、48.0mmに達する。集落
の表面は、気生菌糸が着生し、培養日数に従い、淡褐色
を呈し、子のう果を形成する。コーンミール寒天培地
（２５℃）の生育は良く、１０日間で、集落の径は、4
7.5mmに達する。集落の表面は、気生菌糸が薄く着生
し、栄養菌糸が潜在するため白色〜クリーム色を呈し、
少数の子のう果と分生子構造を形成する。

【００１０】本菌は、麦芽エキス寒天培地上で球形、閉
鎖形、黄色の菌糸に包まれた子のう果が多数形成する。
子のうは、８胞子、球形〜亜球形、直径約８〜９μｍで
消失性である。子のう胞子は、楕円形、約 3.5〜4.5μ
ｍで表面全体に刺状突起を有する。分生子は、卵形（約
3X2.4 μｍ）フィライドは、ペン先型（約12.0X2.1μ
ｍ）で数本（2〜6 本）が輪生体をなす。また、生育温
度は１０〜３７℃で至適温度は２５℃前後である。生育
ｐＨは、２〜１０で至適ｐＨは６．０前後である。

【００１１】以上の菌学的性質より本菌は、Ｇｅｎｕｓ
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ＆ Ｔｅｌｅｏｍｏｒｐｈ
ｉｃ ｓｔａｔｅｓ ；Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ＆
Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ（１９７９年Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，ＪｈｏｎＩ．Ｐｉｔｔ著）に従い、真
生菌類、子のう菌亜門、不整子のう菌亜網のＴａｌａｒ
ｏｍｙｃｅｓ属（分生子世代；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ）に属する一菌株であることが明らかになり本菌株を
Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＮＫ３７４２００株と
命名した。

【００１２】本発明に用いるタラロミセス属に属する菌
株は、他のタラロミセス属の菌株と同様、その性状が変
化しやすく、例えば紫外線、エックス線及び薬品などを
用いる人工的な変異手段で容易に変異しうるものであ
り、どのような変異株であっても本発明の対象とする生
理活性物質ＮＫ３７４２００生産能を有するものはすべ
て本発明に使用することができる。

【００１３】本発明によるＮＫ３７４２００の生産には
上記のＮＫ３７４２００株による醗酵が実施される。本
菌株の培養は２０〜３７℃好ましくは２０〜２７℃の温
度範囲で通常の糸状菌の培養に適切な水溶性栄養源を含
む培地中にて通気条件下で実施される。

【００１４】本培養の目的に供される培地としては糸状
菌が利用できる栄養源を含めばよく、培地組成としてグ
ルコース、フルクトース、シュクロースなどの糖類、澱
粉及びグリセリンなどの炭素源、カゼイン、ポリペプト
ン、大豆ミール、綿実ミール、肉エキス、乾燥酵母、コ
ーンスティープリカーなどの有機態窒素もしくは硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウムなどの無機態窒素などの
窒素源が単独ないしは併合して用いることができる。

【００１５】さらに塩化ナトリウム、炭酸カルシウム、
硫酸鉄、硫酸マグネシウム、硫酸亜鉛、各種ビタミンな
どを生育促進及び調節の目的で利用することも可能であ
り、必要に応じてシリコーン、植物油あるいは合成消泡
剤を培地に添加し発泡を防ぐことも可能である。

【００１６】物質ＮＫ３７４２００を生産する場合、寒
天斜面培地より１白金耳胞子をかきとり振とうフラスコ
に移植し２〜５日、約２０〜２７℃で培養し種菌とす
る。本培養のスケールに応じて種培養を繰り返し種菌を
大量に得ることもできる。本培養に際してはこのように
して得られた種菌を一定量醗酵容器に接種し、約２０〜
３５℃好ましくは約２０〜２７℃で３〜６日間通気攪拌
する。

【００１７】得られた培養液を遠心分離またはろ過など
の手段により菌体と培養ろ液とに分け、ろ液を陽イオン
交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフ
ィーに順次かけた後、ダウエックス１×２（商品名）な
どを用いて脱塩を行うことができる。脱塩した水溶液
は、減圧下で濃縮できる。

【００１８】更に、物質ＮＫ３７４２００を精製するた
めには通常の水溶性低分子物質の精製手段を適用でき
る。たとえば濃縮液は、水を溶離液とするセファデック
スＧ−１０、カラムクロマトグラフィーを行い、さらに
活性炭カラムクロマトグラフィーに共し、水洗後濃度勾
配法（水→２Ｎアンモニア水）で溶出し活性画分を得
る。それを乾固し、粗物質を得る。

【００１９】得られた粗物質をメロタノール水に溶解
し、セファデックスＬＨ−２０カラムクロマトグラフィ
ーにて精製し、活性画分を減圧下で濃縮し、濃縮液を凍
結乾燥すれば淡褐色粉末ＮＫ３７４２００を得る。

【００２０】このようにして得られた物質ＮＫ３７４２
００はそれぞれ下記に示すような物理化学的性状を有す
る。 ＮＫ３７４２００ １）外観；淡褐色粉末 ２）分子量；ＨＲＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ ３０８．１４
７２（Ｍ＋Ｈ）⁺ ３）分子式；Ｃ₁₂Ｈ₁₇Ｎ₇Ｏ₃ ４）溶解性；水に易溶、メタノール、アセトン、酢酸エ
チル、クロロホルム、エチルエーテルに不溶 ５）シリカゲル薄層（メルク社Art.5715）クロマトグラ
フィーによるＲｆ値；イソプロパノール：水（８：２）
の展開溶媒で0.15をしめす。 ６）紫外部吸収スペクトル；水中で測定したスペクトル
を図１に示す。 ７）赤外部吸収スペクトル；臭化カリウム錠剤で測定し
たスペクトルを図２に示す。 ８）水素核磁気共鳴スペクトル；重ＤＭＳＯ中で測定し
たスペクトルを図３に示す。 ９）炭素核磁気共鳴スペクトル；重ＤＭＳＯ中で測定し
たスペクトルを図４に示す。 １０）呈色反応；リンモデブリン酸−硫酸、ライドンス
ミス、ニンヒドリンに陽性

【００２１】

【作用】

１．リンパ球幼若化反応における免疫調節活性 培養には、20% 牛胎児血清 25mM Ｈｅｐｅｓ ｂｕｆｆ
ｅｒ，100 μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び 100単
位／ｍｌのペニシリンＧを添加したＲＰＭＩ 1640 倍地
を用いた。培養は96穴の平底マイクロプレート（ＣＯＳ
ＴＡＲ）で行った。マイトジェンは、リポポリサッカラ
イド（ＬＰＳ）とコンカナバリンＡ（Con Ａ）をそれぞ
れ最終濃度１００、５μｇ／ｍｌで用いた。脾臓細胞
は、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌性、＞２０周齢）から脾臓
を取り出し単細胞浮遊液を作り、ハイパーショック（ｈ
ｙｐｅｒ ｓｈｏｃｋ）で赤血球を除去し、ＬＰＳ用に
はこれをそのまま用いて調整し、Ｃｏｎ Ａ用にはＴ細
胞分離用Ｎｙｌｏｎ Ｆｉｂｅｒ（和光純薬）を通して
調整した。各ウエルに２×１０⁵ 個の脾細胞と、それぞ
れの希釈濃度の被験化合物を加え総量0.2ml とし、これ
を７２時間培養した。培養終了の８時間前にウエル当た
り３７ＫＢｑの〔³H〕−チミジンを添加し、その細胞内
への取り込み量を測定した。効果の判定は、それぞれの
被験化合物添加群の対象に対する〔³H〕−チミジンの取
り込み量の比率によった（日本免疫学会編、免疫実験操
作法、第2267〜2276頁）。ＮＫ３７４２００のマウスの
リンパ球幼若化に対する作用を表１に示した。

【００２２】

【表１】

【００２３】ＮＫ３７４２００は、ＬＰＳによるリンパ
球の幼若化反応を低濃度で増強し、特に１．０μｇ／ｍ
ｌではその作用を強く示した。

【００２４】２．殺虫活性 本発明物質のチカイエカに対する殺虫活性を検討した。
６穴マイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ社製・直径１５ｍ
ｍ）に井戸水を１０ｍｌ入れサンプルを１０μｌ添加し
てチカイエカ３令幼虫を１０頭放飼した。生死の判定を
５日後に行った。この結果ＮＫ３７４２００は、1.0ppm
の濃度で殺虫率９０％である事が判った。この様に物質
ＮＫ３７４２００は、チカイエカに対して明らかに殺虫
作用を示す。

【００２５】３．急性毒性 マウスに対する物質ＮＫ３７４２００の急性毒性値（Ｌ
Ｄ₅₀）は静脈内投与（ｉｖ）に於いて、400mg/Kgの値を
示した。

【００２６】

【発明の効果】上記のように、物質ＮＫ３７４２００
は、リンパ球幼若化反応増強作用、殺虫作用を有するの
で、免疫調節剤、殺虫剤などの医薬または農薬として使
用できる。

【００２７】医薬品として使用する場合の製剤化および
投与方法は従来公知の種々の方法が適用できる。すなわ
ち、投与方法として注射、経口、直腸投与などが可能で
ある。製剤形態としては注射剤、粉末剤、顆粒剤、錠
剤、座剤などの形態がとり得る。

【００２８】製剤化の際に物質ＮＫ３７４２００に悪影
響を与えない限り、医薬用に用いられる種々の補助剤、
すなわち、担体やその他の助剤、例えば安定財、防腐
剤、無痛化剤、乳化剤が必要に応じて使用されうる。製
剤に於いて、物質ＮＫ３７４２００の含量は製剤形態等
により広範囲にかえることが可能であり、一般には物質
ＮＫ３７４２００を0.01〜100%（重量）、好ましくは0.
10〜70% （重量）含有し、残りは通常医薬用に使用され
る担体その他補助剤からなる。

【００２９】物質ＮＫ３７４２００の投与量は症状等に
より異なるが、成人１人１日当たり0.01〜800mg 程度で
ある。連投を必要とする場合には１日当たり使用量を抑
えることが望ましい。

【００３０】物質ＮＫ３７４２００を農薬として使用す
る場合、製剤化にあたっては何ら特別の条件を必要とし
ない。すなわち、農薬製造分野に於いて一般的に行われ
ている方法により、粉剤、粒剤、乳剤、油剤、マイクロ
カプセル剤などの任意の製剤形態にして使用できる。ま
た、製剤化の際には補助剤として担体（希釈剤）及びそ
の他の補助剤、たとえば展開剤、乳化剤、固着剤などを
使用することができる。

【００３１】物質ＮＫ３７４２００の農薬としての使用
量は剤形、施用する方法等によって変わるが、通常10ア
ール当たり有効成分量で10〜300g、好ましくは15〜200g
が使用される。以下本発明の化合物の製法を実施例によ
り示す。

【００３２】

【実施例】

実施例 １ （１）醗酵 シュクロース2.0%、ブドウ糖1.0%、大豆粉2.0%、リン酸
１カリウム0.1%、硫酸マグネシウム0.05% 、微量金属塩
よりなる培地をpH6.2 に調節した。その100mlを500ml
のエルレンマイヤーフラスコに分注し、滅菌後タラロミ
セス・エスピーＮＫ３７４２００株を１白金耳接種して
２７℃、７２時間回転式振とう機上で培養し本培養の種
菌とした。

【００３３】本培養は500ml のエルレンマイヤーフラス
コにシュクロース2.0%、ブドウ糖1.0%、大豆粉1.5%、リ
ン酸１カリウム0.05% 、硫酸マグネシウム0.05% 、微量
金属塩よりなる培地（pH6.2 ）100ml を仕込み滅菌した
後、種菌0.5ml を移植した。毎分２１０回転で攪拌しな
がら４日間培養した。500ml のエルレンマイヤーフラス
コ ４０リットルから得られた培養液に塩酸を加えてpH
2.0 としフィルタープレスを用いてろ過を行い、ろ液と
菌体を分離した。

【００３４】（２）精製 得られたろ液４２リットルをダウエックス５０Ｗ Ｈ⁺
型（カラム体積：２リットル）に吸着後水洗いし、１Ｎ
アンモニア水で溶出した。溶出液の活性画分約８リット
ルをダウエックス１×２ ＯＨ^- 型（カラム体積：400m
l ）に吸着後水洗いし濃度勾配法（水→１Ｎ塩酸）で溶
出し活性画分380ml を得た。この画分をダウエックス５
０Ｗ×８Ｈ⁺ 型（100 〜200 メッシュ カラム体積：20
0ml ）に吸着させ水洗にて塩素イオンを除去後濃度勾配
法（水→１Ｎアンモニア水）で溶出し活性画分340ml 得
た。活性画分を減圧下で20mlまで濃縮した。

【００３５】次にこの物質を水を溶離液とするセファデ
ックスＧ−１０カラムクロマトグラフィーに供し溶出液
の活性画分350ml を得た。得られた活性画分をさらに活
性炭カラムクロマトグラフィーに供し水洗後濃度勾配法
（水→２Ｎアンモニア水）で溶出液の活性画分420ml を
得た。減圧下で濃縮乾固し、粗物質1.2gを得た。

【００３６】得られた粗物質を５mlの50％メタノール水
に溶解し、同溶媒で平衡化したセファデックスＬＨ−２
０カラムクロマトグラフィーにて精製した。活性画分の
108ml を減圧下で10mlまで濃縮し、濃縮液を凍結乾燥後
830mg の淡褐色粉末を得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＫ３７４２００の水中で測定した紫外部吸収
スペクトル

【図２】ＮＫ３７４２００の臭化カリウム錠剤で測定し
た赤外部吸収スペクトル（１ｍｇ／ＫＢｒ１００ｍｇ）

【図３】ＮＫ３７４２００の重ＤＭＳＯ中で測定した水
素核磁気共鳴スペクトル

【図４】ＮＫ３７４２００の重ＤＭＳＯ中で測定した炭
素核磁気共鳴スペクトル

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の理化学的性質を示す物質ＮＫ３７４
   ２００又はその塩ＮＫ３７４２００ １）外観；淡褐色粉末 ２）分子量；ＨＲＦＡＢ−ＭＳ ｍ／ｚ ３０８．１４
   ７１（Ｍ＋Ｈ）⁺ ３）分子式；Ｃ₁₂Ｈ₁₇Ｎ₇Ｏ₃ ４）水に易溶、メタノール、アセトン、酢酸エチル、ク
   ロロホルム、エチルエーテルに不溶 ５）シリカゲル薄層クロマトグラフィーによるＲｆ値；
   イソプロパノール：水（８：２）の展開溶媒で 0.15 を
   示す。 ６）紫外部吸収スペクトル；水中で測定したスペクトル
   を図１に示す。 ７）赤外部吸収スペクトル；臭化カリウム錠剤で測定し
   たスペクトルを図２に示す。 ８）水素核磁気共鳴スペクトル；重ＤＭＳＯ中で測定し
   たスペクトルを図３に示す。 ９）炭素核磁気共鳴スペクトル；重ＤＭＳＯ中で測定し
   たスペクトルを図４に示す。 １０）呈色反応；リンモリブデン酸−硫酸、ライドンス
   ミス、ニンヒドリンに陽性
2. 【請求項２】タラロミセス属に属し、物質ＮＫ３７４２
   ００を生産する能力を有する微生物を、培地に培養し、
   培養物中に物質ＮＫ３７４２００を生産蓄積せしめ、こ
   れを採取する事を特徴とする物質ＮＫ３７４２００の製
   造法。
3. 【請求項３】物質ＮＫ３７４２００を有効成分とする免
   疫増強剤、あるいは殺虫剤。
4. 【請求項４】タラロミセス ｓｐ ＮＫ３７４２００株