JPH06135843A

JPH06135843A - 皮膚用剤

Info

Publication number: JPH06135843A
Application number: JP4307899A
Authority: JP
Inventors: Nobuo Suee; 信夫末柄; Kazuyoshi Yazawa; 一良矢澤
Original assignee: Sagami Chemical Research Institute
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute
Priority date: 1992-10-23
Filing date: 1992-10-23
Publication date: 1994-05-17

Abstract

(57)【要約】【目的】病原微生物等による皮膚障害を防御しうる皮
膚用剤の提供【構成】皮膚表面への付着性を有する微生物の菌体又
は菌体抽出物を含有する皮膚用剤。【効果】表皮細胞への付着性物質が皮膚表面に結合
し、病原微生物の感染・定着を阻止する。このため、皮
膚感染症の予防及び治療など、医薬、化粧料等の分野で
有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、皮膚表面への付着性を
有する微生物、例えばスタフィロコッカス属に属する微
生物の菌体又は菌体抽出物を含有する、種々の皮膚障害
の防御、特に皮膚感染防御を目的とする皮膚用剤に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】細菌、真菌及びウイルス等の病原微生物
の皮膚での感染の防御、特にこれらの病原微生物による
疾患の治療のために、抗菌剤、抗真菌剤或は抗ウイルス
剤等の化学療法剤を含む外用剤等が広く用いられてい
る。しかし、このような従来の外用剤等は、使用に際し
ての副作用及び薬剤耐性菌の出現等の重大な問題が残さ
れている。更に、目的とする効果に関しても、必ずしも
満足すべきものではない。

【０００３】皮膚はヒトの体重の１６％を占める最大の
臓器であり、肝臓の３倍に相当する。三層からなる皮膚
の最外層である表皮は、化学的に比較的安定な角質化細
胞によって覆われており、健全な表皮は細菌やカビ等の
病原微生物からの防御、化学薬品や物理的傷害、更に紫
外線の防御、等に対してバリアーとしての機能を備えて
いる。

【０００４】ヒトの頬など通常の皮膚には共生菌として
多数の微生物が定着し、皮膚フローラ（菌叢）を形成し
ている。皮膚表面での微生物の存在は一つのエコシステ
ムとして把握することができる。すなわち、皮膚菌叢を
構成している微生物の種類及び量は、微生物相互間及び
微生物と皮膚の間での相互作用、拮抗作用等の複雑な関
係を保ちながら維持されている。

【０００５】しかしながら、このようなエコシステムの
バランスが崩れた場合、物理化学的及び生物学的バリア
ーを越えて、皮膚病変をもたらす皮膚病原微生物も多岐
多種にわたる。又、糖尿病等の基礎疾患等、内的原因に
よる皮膚の異常、あるいは外傷を受けた部位での易感
染、メチシリン等耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）をは
じめとする難治性耐性菌感染症もまた重大な問題となっ
ている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】スタフィロコッカス
は、コアグラーゼ陽性黄色ブドウ球菌とコアグラーゼ陰
性菌種（Ｓ．エピデルミデイス等）に分けられる。黄色
ブドウ球菌は正常皮膚あるいは鼻咽頭における通過菌フ
ローラの一つであり、しばしば感染を引き起こす。病院
の医師や看護婦、血液透析者、糖尿病患者、薬剤の静脈
投与、更に乾癬やアトピー性皮膚炎などの患者では皮膚
表面に広く分布している。特に病変部では、この菌によ
る感染が顕著である。

【０００７】病原微生物の毒力は、宿主組織に対する侵
襲性と毒素産生で表される。病原性微生物の侵襲は、組
織の細胞表面への付着によって始まる。この付着あるい
は接着に関して、微生物側及び宿主組織側の両方に表面
物質の特異的関与がある。

【０００８】皮膚病変を起こす微生物を２、３例挙げ
る。黄色ブドウ球菌は化膿性感染を起こす代表的菌種で
ある。本菌が起こす皮膚疾患としては、ひょう疽、蜂巣
炎、フルンケル（▲せつ▼）、毛嚢炎、カルブンケル
（▲よう▼）、創傷感染、化膿性汗腺炎、膿痂疹、ブド
ウ球菌性熱傷様皮膚症候群、等がある。その他に腎盂
炎、中耳炎や乳腺炎等の起炎菌でもある。黄色ブドウ球
菌は、常在菌叢構成菌としてあるいは通過菌フローラの
一つとして見られる菌種で、通常は病原性を発現しない
が、本菌の病原発現条件が整った場合、上述のように重
篤な病状を呈する疾患の起因菌となる。

【０００９】▲てん▼風は、慢性の浅在性皮膚真菌症
で、淡褐色斑あるいは淡脱色素斑が形成され、粃糠様の
落屑を伴う。この疾患の原因菌はマラセチア・フルフル
(Malassezia furfur )で、この菌は又、毛包炎、間擦
疹、脂漏性皮膚炎、乾癬、アトピー性皮膚炎等の発症に
関与するという報告がある。本菌は、背、頭、胸、上
腕、下腿、手等の健常部皮膚から特に脂漏部から高率に
分離される。本菌感染による臨床症状としては、淡褐色
斑あるいは脱色素斑が多発し、浮腫、発赤や▲そう▼痒
を伴うこともあり、特に美容上の大きな問題である。

【００１０】カンジダ菌や緑膿菌のような日和見感染菌
は、病原性菌の毒力と宿主の感染抵抗力のバランスの障
害によって感染発症する。癌や糖尿病、腎不全、免疫不
全症等の基礎疾患を有する患者あるいは抗癌剤、免疫抑
制剤やステロイド剤の投与及び放射線照射等による生体
の免疫抵抗力の低下によって真菌感染が著しく増加し、
深刻な臨床上の課題である。

【００１１】このような感染症には、日和見感染症を始
めとして薬剤耐性菌の出現等、治療及び予防上のより複
雑な問題があり、有効且つ安全な方法が求められてい
る。

【００１２】本発明の目的は、上記のような皮膚障害の
防御、特に病原微生物の付着を阻止することによって微
生物感染症の予防あるいは治療に有用な効果をもたらし
得る皮膚用剤を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的のために研究の結果、皮膚表面に対する付着能を有す
る微生物又はその抽出物が、皮膚表面への黄色ブドウ球
菌等の病原微生物の付着、定着を阻止することを見出し
たことにより本発明に至ったものである。

【００１４】本発明に用いられる微生物としては、菌
属、菌種あるいは菌株等に限定されるものではなく、皮
膚表面に対する付着能を有しており、微生物自体又は抽
出物が他の病原性細菌、真菌等の微生物等の皮膚表面へ
の付着を阻止するものであれば、いずれも本発明に用い
ることができる。例えば、ヒトの頬での正常常在性菌で
あるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌はその好例であり、そ
の新規菌株スタフィロコッカス属菌株ＳＣＲＣ−７６３
１（ Staphylococcus sp. SCRC-7631 ）は工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第号とし
て寄託されている。

【００１５】以下に該菌株の分離方法及び菌学的性質を
示す。

【００１６】分離方法滅菌した生理的食塩水を含ませた市販の滅菌綿棒で健常
者の顔面皮膚を軽く擦って常在菌を綿棒に採取する。こ
れを滅菌生理的食塩水等の適切な分散液中に攪∬により
分散する。必要により１０倍段階希釈し、希釈された液
の一部を例えばトリプテイックソイ寒天平板培地（デイフ
コラボラトリー、Ｕ．Ｓ．Ａ．）上に均一に塗布す
る。或は、ブドウ球菌（ Staphylococcus ）の選択培地
であるところのマンニット食塩寒天平板培地（栄研化学
（株））を用いれば、ブドウ球菌を選択的に確実に分離
することができる。この平板培地を３７Ｃの恒温器内で
２４〜４８時間好気的に培養して菌集落（コロニー）を
作らせる。発現した単一のコロニーの一部を同種の平板
培地に薄く塗布し同様に培養して再び単一のコロニーを
得る。同様の操作を繰り返して純粋な菌株を得る。

【００１７】上記の分離方法にしたがってマンニット食
塩寒天平板培地を用いて顔面皮膚から分離したブドウ球
菌（コアグラーゼ陰性 Staphylococcus sp. ）の菌学的
性質を示す（表１）。

【００１８】

【表１】表１グラム染色性＋菌の形態球形偏性好気性ー通性嫌気性＋トリプテイックソイ寒天培地での集落白色、不透明マンニット食塩寒天培地での生育＋マンニット食塩寒天培地での集落白色、不透明マンニトット分解性ーカタラーゼ＋コアグラーゼーヒト頬表皮細胞への付着性＋

【００１９】本発明の実施に当たっては、皮膚表面への
付着性を有する微生物、例えばヒト頬の常在性コアグラ
ーゼ陰性ブドウ球菌を常法により、例えば液体培地或は
寒天平板培地で培養し、菌体を遠心分離法で集め、洗浄
し、菌懸濁液あるいは乾燥して菌体粉末を得る。

【００２０】この際に用いられる培地は特に限定される
ものではなく、寒天平板培地として例を挙げれば、表２
に示す培地、液体培地の例としては表３に示すＧＡＭ液
体培地を調製することができる。

【００２１】

【表２】

【００２２】

【表３】表３（ＧＡＭブイヨン「ニッスイ」の組成１リットル分５９．０ｇ）ペプトン１０．０ｇダイズペプトン３．０ｇプロテオーゼペプトン１０．０ｇ消化血清末１３．５ｇ酵母エキス５．０ｇ肉エキス２．０ｇ肝臓エキス末１．２ｇブドウ糖３．０ｇリン酸二水素カリウム２．５ｇ塩化ナトリウム３．０ｇ溶性デンプン５．０ｇＬ−システイン塩酸塩０．３ｇチオグリコール酸ナトリウム０．３ｇｐＨ７．３±０．１（１１５Ｃで１５分間高圧蒸気滅菌）

【００２３】（培養法）皮膚表面への付着性を有する微
生物（例えばコアグラーゼ陰性 Staphylococcus sp.）
を滅菌ＧＡＭ液体培地３ｍｌに接種し３７Ｃにて１０〜
１６時間好気的に静置培養（前培養）し、約１０⁹個／
ｍｌの培養液を得る。

【００２４】この菌液１ｍｌを滅菌ＧＡＭ液体培地１リ
ットルに接種、あるいは、この菌液を寒天平板上に塗
布、３７Ｃで１０〜４８時間培養する。液体培地での培
養は、培養の際攪∬又は振とうすれば更に良好な増殖が
得られる。

【００２５】（集菌、洗浄及び乾燥法）上述のようにし
て得られた培養液を８０００〜１２０００ｒｐｍにて遠
心分離操作を行い、菌体（沈澱物）を得、同様な操作に
より菌体を生理的食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）で２回
洗浄する。又は、寒天平板上の菌体を生理的食塩水に懸
濁し、同様に２回洗浄する。洗浄した菌体を適宜凍結乾
燥法等により乾燥し菌体粉末を得る。得られた菌体は生
菌体であっても、適宜処理による死菌体であってもよ
い。

【００２６】（付着阻害物質の単離法）寒天平板培地上
に良好な増殖を示した表皮付着性菌体を生理的食塩水に
懸濁し、３０００〜１００００ｒｐｍ、１５分間の遠心
分離にて集菌及び生理的食塩水で洗浄する。菌体をリン
酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）に懸濁して菌体濃度を適
宜調整後、リゾチームを１ｍｇ／ｍｌになるように添加
する。更に必要によってリゾスタフィンを適宜添加して
もよい。又、該菌体は生菌体であっても、適宜処理によ
る死菌体であってもよい。

【００２７】この懸濁液を攪∬しながら３７Ｃで１０〜
１６時間反応後、１００００ｒｐｍ１５分間の遠心分離
により上清を得る。得られた上清を蒸留水に対して透析
し、透析内液を凍結乾燥等によって乾燥粉末を得る。

【００２８】（表皮細胞への菌体の付着実験法）ヒトの
頬に両面粘着テープの片面を強く押しつけて表皮の角質
化細胞をテープ面上に剥離採取する。このテープを適当
な大きさ（５ｍｍ角）に切り、細胞の付いていない側を
スライドガラスに貼付けて固定する。

【００２９】前述のようにして得た菌液の濃度を生理的
食塩水あるいはＰＢＳを用いて適宜調整し（ＯＤ₆₆₀＝
１〜１０）、この菌液をスライドガラスに固定した表皮
細胞上に重層する。

【００３０】室温（２５Ｃ）で１０〜２０分間放置後、
生理的食塩水又はＰＢＳで表皮細胞を洗浄して非付着菌
を除去する。次いでクリスタルバイオレット染色液をこ
れに重層して染色した付着菌を計数し、表皮細胞一個当
り（７．４ｘ１０^ー6ｃｍ²）又は一定面積当りの付着菌
数を算出する。

【００３１】（付着阻害実験法）（１）前述の方法で付着性菌体から単離した物質を付着
菌懸濁液に添加し、この菌液を付着実験法にしたがって
付着菌数を計数する。（２）前述の方法で付着性菌体から単離した物質を生理
的食塩水又はＰＢＳに溶解し、これを表皮細胞上に重層
して室温（２５Ｃ）にて１０〜２０分間放置後、生理的
食塩水又はＰＢＳで表皮細胞を洗浄する。次いで、付着
実験法にしたがって付着菌数を計数する。付着阻害率は
次式で表される。付着阻害率（％）＝（１ー処理したときの付着菌数／無
処理での付着菌数）ｘ１００

【００３２】

【実施例】

実施例１（付着阻害物質の単離）前述（表２）の寒天平板培地（内径９ｃｍのペトリデイ
シュ）にコアグラーゼ陰性 Staphylococcus sp. ＳＣＲ
Ｃ−７６３１のＧＡＭ液体培養液０．１ｍｌを均一に塗
布し、３７Ｃで４０時間好気的に培養した。

【００３３】菌体を寒天平板１枚当り１０ｍｌのＰＢＳ
に懸濁した。この懸濁液を３０００ｒｐｍで２０分間遠
心分離操作により集菌した。菌体を同条件での遠心分離
により２回洗浄した後、寒天平板１枚当り５ｍｌのＰＢ
Ｓに懸濁、これに５ｍｇのリゾチームを添加した。

【００３４】この懸濁液を３７Ｃで１０時間攪∬した。
次いでこれを１００００ｒｐｍで１５分間の遠心分離操
作を行い、上清を得、この上清を０．４５μｍのメンブ
レンフィルターで濾過、濾液を蒸留水に対して透析し
た。透析内液を凍結乾燥し寒天平板１枚当り４５ｍｇの
乾燥粉末を得た。

【００３５】実施例２（表皮細胞への菌体の付着実験例）前述の方法にしたがって得たコアグラーゼ陰性 Staphyl
ococcus sp. 菌体の生理的食塩水懸濁液の濃度をＯＤ
₆₀₀１０に調整した。

【００３６】この菌液をヒト頬表皮角質化細胞上に重層
して室温（２５Ｃ）にて２０分間放置後、表皮角質化細
胞を生理的食塩水で洗浄した。次いでクリスタルバイオ
レット染色液で染色し１０〜２０個の表皮細胞の付着菌
数を顕微鏡下で計数し、１細胞当りの付着菌数を算出し
た（表４）。対照は菌懸濁液を重層しない表皮細胞を同
様に染色し顕微鏡下で観察した。

【００３７】

【表４】表４表皮細胞当りの付着菌数（平均）菌懸濁液を重層３３１．５対照０

【００３８】実施例３（付着阻害実験例）黄色ブドウ球菌（Ｓ．アウレウスＩＦＯ１２７３２）
を前記（表３）のＧＡＭ液体培地に接種、３７Ｃで１６
時間培養した後、３０００ｒｐｍ１５分間の遠心分離に
より集菌した。これを生理的食塩水で１回洗浄してから
ＰＢＳに懸濁して菌濃度をＯＤ₆₀₀１０に調整した。

【００３９】実施例１で付着性菌体から調製した乾燥粉
末標品を上記Ｓ．アウレウス菌体懸濁液に添加（１％ｗ
／ｖ）し、実施例２に示した付着実験法にしたがって、
ヒト頬表皮角質化細胞への付着性を検討した。

【００４０】Ｓ．アウレウス菌体は頬表皮細胞及び粘着
テープ表面に対しても同じように付着した。付着性菌体
から単離した標品を添加した場合、表皮細胞及び粘着テ
ープ表面への付着性は両方とも顕著な阻害を受けた。結
果を表５に示した。

【００４１】

【表５】表５付着菌数（平均）付着阻害率（6.25x10^-6cm²当り）（％）対照表皮細胞８６．１テープ８２．３処理（添加）表皮細胞４．７９４．５テープ２．２９７．３

【００４２】実施例４（付着阻害実験例）ヒト頬炎症部皮表からの新鮮分離株コアグラーゼ陽性 S
taphylococcus sp. ＳＡ−１とＳＡ−３をＧＡＭ液体培
地で培養、集菌、洗浄後、ＰＢＳ懸濁液を調製した。

【００４３】実施例２にしたがって、この菌液に実施例
１で得た標品を添加（１％ｗ／ｖ）し、該供試菌株の頬
表皮細胞への付着性を検討した。表６に示したように、
実施例１で得た標品の添加によって顕著な付着阻害が観
察された。

【００４４】

【表６】表６付着菌数（平均）付着阻害率（1x10^-6cm²当り）（％）対照（非添加）ＳＡ−１２０．９ＳＡ−３１５．６処理（添加）ＳＡ−１１．４９３．３ＳＡ−２１．１９３．０

【００４５】実施例５（付着阻害実験例）ヒト頬炎症部皮表からの新鮮分離株コアグラーゼ陽性 S
taphylococcus sp. ＳＡ−１をＧＡＭ液体培地で培養、
集菌、洗浄後、ＰＢＳ懸濁液を調製した。

【００４６】実施例１で得た標品をＰＢＳに溶解（１％
ｗ／ｖ）し、これをヒト頬表皮角質化細胞に重層、室温
（２５Ｃ）で１５分間放置後ＰＢＳで洗浄した。次い
で、実施例２にしたがって付着実験を行った。結果を表
７に示した。表皮細胞を菌体標品で処理することによっ
て、ＳＡ−１株の付着性は著しく阻害された。

【００４７】

【表７】表７付着菌数（平均）付着阻害率（1x10^-6cm²当り）（％）対照１８．４処理４．５７５．４

【００４８】実施例６（処方例）実施例１で得た標品を含有する軟膏処方例を表８に示
す。

【００４９】

【表８】表８実施例１で得た標品１〜１０％基剤９０〜９９

【００５０】実施例７（処方例）実施例１で得た標品を含有する皮膚用剤処方例を表９に
示す。

【００５１】

【表９】表９実施例１で得た標品１．０％ステアリルアルコール７．０スクワラン５．０還元ラノリン２．０ポリオキシエチレンセチルエーテル５．０プロピレングリコール５．０精製水７５．０

【００５２】本皮膚用剤の処方例を実施例６及び７に挙
げたが、それらは例示であり必要に応じて適宜変更する
ことができ、例示に限定されるものではない。必要に応
じて、保湿剤、界面活性剤、酸化防止剤、潤沢剤、防腐
剤、色素、香料、その他の成分を添加配合することがで
き、本皮膚用剤の剤型としては、粉剤、液剤、乳剤、ク
リーム剤、軟膏等を適宜選択することができる。

【００５３】

【発明の効果】効果が高い皮膚感染防御を目的とする皮
膚用剤を製造できる。本皮膚用剤の使用によって、病院
の医師や看護婦、血液透析者、糖尿病、腎不全等の基礎
疾患患者、薬剤の静脈投与、乾癬やアトピー性皮膚炎等
の患者、更には老化、過労、制癌剤や免疫抑制剤、ステ
ロイド剤等の投与、免疫不全症、放射線照射等、生体の
免疫力の低下に伴って起こる重篤な皮膚感染症の特に予
防効果及び治療効果を期待できる。

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【手続補正書】

【提出日】平成４年１１月２７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１４】本発明に用いられる微生物としては、菌
属、菌種あるいは菌株等に限定されるものではなく、皮
膚表面に対する付着能を有しており、微生物自体又は抽
出物が他の病原性細菌、真菌等の微生物等の皮膚表面へ
の付着を阻止するものであれば、いずれも本発明に用い
ることができる。例えば、ヒトの頬での正常常在性菌で
あるコアグラーゼ陰性ブドウ球菌はその好例であり、そ
の新規菌株スタフィロコッカス属菌株ＳＣＲＣ−７６３
１（ Staphylococcus sp. SCRC-7631 ）は工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第１３２１７号として
寄託されている。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】皮膚表面への付着性を有する微生物の菌体
又は菌体抽出物を含有する皮膚用剤。
【請求項２】皮膚感染防御を目的とする請求項１に記載
の皮膚用剤。
【請求項３】微生物がスタフィロコッカス属に属する微
生物である請求項１又は請求項２に記載の皮膚用剤。
【請求項４】スタフィロコッカス属に属する微生物がス
タフィロコッカスｓｐ．ＳＣＲＣ−７６３１である請
求項３に記載の皮膚用剤。