JPH06121693A

JPH06121693A - 高重合度オリゴ糖の製造法

Info

Publication number: JPH06121693A
Application number: JP5196373A
Authority: JP
Inventors: Masao Karube; 征夫軽部; Takashi Morita; 高志森田
Original assignee: Akebono Research and Development Centre Ltd
Current assignee: Akebono Research and Development Centre Ltd
Priority date: 1992-08-25
Filing date: 1993-08-06
Publication date: 1994-05-06
Also published as: US5580762A; WO2004099429A1

Abstract

(57)【要約】【目的】多糖類を原料として重合度の高いオリゴ糖を
製造する。【構成】澱粉等の多糖類と、この多糖類を構成する糖
同士の結合を切断する加水分解酵素、例えばα−アミラ
ーゼとを、エタノール等の親水性有機溶媒と水との混合
物中で共存させ、前記多糖類を酵素反応により加水分解
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、高重合度オリゴ糖の製
造法に関し、詳しくは、多糖類を原料として重合度の高
いオリゴ糖を製造する方法を提供するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、糖質が生理機能と関わりがあるこ
とが知られるようになり、研究が活発に行われている。
また、低齲蝕性のものや、腸内細菌叢を正常化する働き
をするもの、静菌作用を有するもの、あるいはサイクロ
デキストリンのように包接作用を有するものなど、種々
の作用を有するオリゴ糖が知られるようになり、食品工
業等に貢献している。

【０００３】オリゴ糖は、直接醗酵生産物として得られ
るものもあるが、通常は多糖類の分解によって製造され
るものが多い。従来、多糖類の分解は、水系での酵素分
解、酸加水分解が行われている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の水系で
の酵素分解では、得られるオリゴ糖は２〜６量体程度、
特に２、３量体の低分子のものが多く、これ以上、特に
１０量体以上の高重合度のオリゴ糖の収率は低く、その
効率的な生産は一般に困難である。

【０００５】低重合度のオリゴ糖は、低カロリー甘味料
や抗齲蝕性甘味料等に利用されている。一方、高重合度
のものはビフィズス菌などの有用な腸内細菌を増加させ
る働きがあるとされているが、高重合度オリゴ糖を得る
のが困難であるために、研究は進んでいない。したがっ
て、高重合度オリゴ糖及びその生産法が強く望まれてい
る。

【０００６】また、澱粉工業において、グルコースやマ
ルトースの収率向上のためにプルラナーゼが各種アミラ
ーゼと併用されている。しかし、高重合度オリゴ糖の生
産にプルラナーゼを使用することは知られていない。

【０００７】本発明は、上記観点からなされたものであ
り、高重合度オリゴ糖を効率よく製造することを目的と
したものであり、多糖類を原料として、酵素分解により
高重合度オリゴ糖を得る方法を提供することを課題とす
る。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために種々研究を重ねた結果、酵素分解の反応
系に親水性有機溶媒を使用することにより、高重合度の
オリゴ糖が生成されることを見出し、本発明に至った。

【０００９】すなわち本発明は、多糖類を、この多糖類
を構成する糖同士の結合を切断する加水分解酵素を用い
て分解することによりオリゴ糖を製造する方法におい
て、多糖類と前記加水分解酵素とを、親水性有機溶媒と
水との混合物中で共存させることを特徴とする高重合度
オリゴ糖の製造法である。

【００１０】尚、本発明においては、高重合度オリゴ糖
とは、主として５〜２０量体程度のものをいう。以下、
本発明を詳細に説明する。

【００１１】上述したように、本発明の高重合度オリゴ
糖の製造法は、多糖類を原料として、親水性有機溶媒と
水との混合系で酵素分解を行うことからなる。ここで、
原料となる多糖類としては、例えば、澱粉、セルロー
ス、キチン、キトサン、デキストラン、アガー、キシラ
ン等が挙げられる。

【００１２】酵素分解に用いる酵素は、上記多糖類の構
成糖同士の結合を切断する酵素が用いられ、例えば上記
多糖類に対して、各々アミラーゼ、プルラナーゼ、セル
ラーゼ、キチナーゼ、キトサナーゼ、デキストラナー
ゼ、アガラーゼ、キシラナーゼが使用される。これらの
酵素には、多糖類の内部をランダムに切断するエンド
型、末端から切断していくエキソ型等があるが、本発明
にはエンド型が好ましい。また、得られるオリゴ糖に側
鎖がない方が望ましい場合には、前もってイソアミラー
ゼのような枝切り酵素で分岐結合を切断しておくとよ
い。

【００１３】また、酵素反応は液相で行ってもよいが、
酵素を不溶性担体に結合したいわゆる固定化酵素を用い
て行ってもよい。本発明においては、固定化法は特に問
わない。

【００１４】酵素反応に使用する親水性有機溶媒として
は、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノー
ル、ペンタノール、ヘキサノール等の極性プロトン性溶
媒であるアルコール類の他、アセトン、ジオキサン、テ
トラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルスルホキ
シド、ジメチルホルムアミド等の極性非プロトン性溶媒
等が挙げられ、これらの親水性有機溶媒と水との混合系
で酵素反応を行う。澱粉をα−アミラーゼで分解する場
合には、エタノールが特に好ましく、３０〜９０（v/
v）％が好ましい。また、エタノール濃度が高い場合に
は、澱粉濃度は、反応液に対して２０（W/v）％以下で
あることが、収率の点から好ましい。

【００１５】使用する加水分解酵素、親水性有機溶媒と
その濃度は、原料に用いる多糖類や得ようとするオリゴ
糖の重合度により適宜設定する。例えば、多糖類が澱粉
である場合には、加水分解酵素としてアミラーゼ、親水
性有機溶媒としてエタノールが挙げられる。この場合、
エタノール濃度を高くすると重合度の高いオリゴ糖が得
られる一方、全体の収率は低下する傾向にあるが、加水
分解酵素としてアミラーゼに加えてプルラナーゼを併用
すると、高い収率で重合度の高いオリゴ糖を得ることが
できる。

【００１６】酵素反応は、用いる酵素の至適条件下で行
うのが好ましいが、得られるオリゴ糖の重合度を高くす
るために、穏やかな条件下で反応を行ってもよい。至適
条件としては、例えば澱粉をα−アミラーゼで分解する
場合には５０℃、ｐＨ６．０〜７．０が挙げられる。

【００１７】反応条件、特に反応時間、原料基質に対す
る酵素量等を変化させることにより、得ようとするオリ
ゴ糖の重合度を調整する。予め、ＨＰＬＣ（高速液体ク
ロマトグラフィー）等により、反応生成物を分析し、条
件を決定しておくとよい。

【００１８】反応生成物の中から希望の重合度のものを
得るには、ゲル濾過法やＨＰＬＣを用いて分取する。ま
た、エタノール濃度が６０％（V/V）以上の反応系で
は、生成した高重合度オリゴ糖は、ほとんどが沈澱物と
して得られるので、これを遠心分離等により集積するこ
とができる。さらに、適当な濃度に溶解してから必要に
応じてゲル濾過等で精製する。

【００１９】

【作用】例えばα−アミラーゼは、澱粉のα−１，４グ
ルコシド結合をランダムに切断するエンド型の加水分解
酵素である。しかし、反応系の水の濃度が減少すると反
応の平衡が逆方向の転移又は合成に変化する。すなわ
ち、高濃度の親水性有機溶媒系でこのような酵素反応を
行わせることにより、反応の平衡をシフトさせ、水系で
は得られない高重合度のオリゴ糖を得ることができるよ
うになる。このような作用により、澱粉以外の多糖類
と、これを加水分解する酵素を使用した場合にも本発明
は適用できると考えられる。

【００２０】尚、本発明においては、反応を有機溶媒系
で行うことにより、雑菌等による汚染の心配がないの
で、滅菌処理操作、設備が不要である。

【００２１】

【実施例】以下に、本発明の実施例を、澱粉からのグル
コオリゴ糖の製造を例として説明する。尚、実施例２以
下において使用した固定化酵素は、緩衝液３０ｍｌに対
し、湿潤重量で１０ｇのキトパール（CHITOPEARL BCW-3
510 : 富士紡績（株）製）に、過剰量の酵素溶液（原
液）を加え、室温で１時間緩やかに撹拌した後、４℃で
１中夜以上静置することにより固定化したものを、反応
液１０ｍｌに対し、０．６〜１．０ｇ（湿潤重量）使用
した。酵素反応は、いずれも静置で行った。

【００２２】また、以下のエタノールの濃度はＶ／Ｖ％
であり、いずれも５０ｍＭリン酸緩衝液との混合物であ
る。反応生成物の分析は、反応後に９０℃で１０分間加
熱して酵素を失活させた後、ＨＰＬＣにより行い、得ら
れた反応生成物の総量（未反応基質を除く）に対する各
重合度のオリゴ糖の割合を算出した。

【００２３】ＨＰＬＣは、島津製作所製LC-6AD、RID-6A
を用い、カラムは、TSKgel AMIDE80、又はAsahipak NH2
P-50を使用した。

【００２４】

【実施例１】始めに、固定化されていない酵素を使用し
た例を説明する。１０(W/V)％小麦澱粉を、エタノール
０、３０、４０、５０、６０％溶液（ｐＨ７．０）に懸
濁し、０．２４ＫＮＵ（キロノボユニット：１ＫＮＵ
は、１時間に５．２５ｇの澱粉を分解する酵素量）のα
−アミラーゼ（ＢＡＮ２４０Ｌ (Bacillus subtilis由
来)：ノボインダストリー製）１００μｌを加え、５０
℃で９６時間反応を行った。

【００２５】反応後の上清中に含まれるオリゴ糖の濃度
を測定し、これらの総量に対する割合を表１及び図１に
示す。

【００２６】

【表１】

【００２７】この結果から、エタノールを反応系に加え
ると、水のみの系と比べて５量体以上のオリゴ糖の量比
が高くなることがわかる。また、エタノール濃度が高く
なると原料に対するオリゴ糖の総量（収率）が著しく低
下したが、これは重合度が高くなるとエタノールで沈澱
するためであることが後の実験によりわかった。

【００２８】

【実施例２】次に、固定化酵素を用いた例を説明する。
緩衝液３０ｍｌに対し、固定化したＢＡＮ２４０Ｌを用
い、実施例１と同様に１０(W/V)％小麦澱粉の分解を行
った（反応時間１２０時間）。反応生成物の分析は、水
のみの場合は反応上清について、エタノール６０、７
０、８０％の場合は、反応液中の沈澱物を温水に溶解し
たものについて、エタノール５０％の場合は、上清及び
沈澱の両方について行った。結果を表２及び図２に示
す。

【００２９】

【表２】

【００３０】この結果から、高濃度エタノール中では、
反応生成物における高重合度オリゴ糖の比率が高く、し
かも収率もよいことがわかる。

【００３１】

【実施例３】固定化したα−アミラーゼ（Bacillus sub
tilis由来、和光純薬工業（株）製：化学用 015-0373
1）を、反応液１０ｍｌに対して０．８ｇ使用し、実施
例２と同様に反応を行い（７０時間）、重合度１〜１６
の生成物を分析した。結果を表３及び図３に示す。

【００３２】

【表３】

【００３３】この結果から明らかなように、エタノール
濃度が高くなるほど高重合度オリゴ糖が生成し、それら
は反応液中に沈澱物として得られることがわかる。

【００３４】

【実施例４】次に、異なる酵素を固定化したものを用い
て分解生成物の比較を行った。Aspergillus orizae由来
のα−アミラーゼ（ノボインダストリー製：ファンガミ
ル８００Ｌ）、及びBacillus licheniformis由来のα−
アミラーゼ（ノボインダストリー製：ターマミル１２０
Ｌ）を、反応液１０ｍｌに対して０．８ｇ使用し、上記
実施例と同様に酵素分解し（７０時間）、上清及び沈澱
物中の反応物の分析を行った。結果を表４及び図４
（Ａ：ファンガミル、Ｂ：ターマミル）に示す。

【００３５】

【表４】

【００３６】その結果、いずれの酵素を用いても、反応
液にエタノールを加えると高重合度のオリゴ糖が得られ
た。

【００３７】

【実施例５】さらに高濃度エタノール中で反応を行っ
た。酵素は固定化したターマミル１２０Ｌを、反応液１
０ｍｌに対して０．８ｇ使用し、上記と同様に反応を行
い、沈澱物の分析を行った。尚、反応液のｐＨは６．０
とし、１９０時間反応を行った。結果を表５及び図５に
示す。

【００３８】

【表５】

【００３９】この結果から、９０％程度の高濃度のエタ
ノール中においても、水系では得られないような高重合
度のオリゴ糖が得られることがわかった。

【００４０】

【実施例６】次に、基質濃度を変えて反応生成物の解析
を行った。基質は、小麦澱粉１０、２０、３０（W/V）
％となるように９０％エタノール（ｐＨ６．０）に懸濁
したものを使用し、固定化したターマミル１２０Ｌを、
反応液１０ｍｌに対して０．８ｇ加え、５０℃で２４時
間反応を行った。反応後の沈澱物中の生成物を解析した
結果を、表６及び図６に示す。

【００４１】

【表６】

【００４２】この結果から、生成物中の高重合度オリゴ
糖の比率は、基質濃度にほとんど影響されないが、基質
濃度が高すぎると収率が低下することがわかる。本実施
例のようにエタノール濃度が高い場合には、基質澱粉濃
度は２０（W/V）％以下であることが収率の点で好まし
い。

【００４３】

【実施例７】さらに、基質澱粉の種類を変えて、酵素分
解を行った。２０（W/V）％可溶性澱粉、小麦澱粉、ト
ウモロコシ澱粉、ポテト澱粉、サツマイモ澱粉の９０％
エタノール懸濁液（ｐＨ６．０）に、固定化したターマ
ミル１２０Ｌを、反応液１０ｍｌに対して０．８ｇ加
え、５０℃で２４０時間反応を行った。沈澱中の生成物
を分析した結果を表７及び図７に示す。

【００４４】

【表７】

【００４５】この結果から、澱粉の種類に拘らず、反応
液にエタノールを加えると、高重合度のオリゴ糖が得ら
れることがわかる。

【００４６】

【実施例８】次に、加水分解酵素としてα−アミラーゼ
とプルナーゼを併用し、エタノール存在下で澱粉から高
重合度オリゴ糖を製造した例を説明する。

【００４７】１０(W/V)％ポテト澱粉を、エタノール８
５％（V/V）溶液（ｐＨ７．０）に懸濁し、各々別に固
定化したターマミル１２０Ｌ及びプルラナーゼ「アマ
ノ」（天野製薬（株）：Klebsiella pneumoniae由来）
を、各々反応液１０ｍｌに対して０．４ｇづつ使用し、
５０℃で反応を行った。沈殿中に含まれるオリゴ糖の濃
度を測定し、これらの総量に対する割合を図８に示す。
１８０時間反応後のオリゴ糖の収率（重合度２０まで、
以下同じ）は６１．１％であった。また、同様の条件で
反応系におけるポテト澱粉の濃度を変化させて反応を行
った結果を図９に示す。１８０時間反応後の収率は、澱
粉濃度２０％では５２．６％、澱粉濃度３０％では６
６．５％であった。

【００４８】一方、加水分解酵素として固定化したター
マミル１２０Ｌのみを反応液１０ｍｌに対して０．８ｇ
使用して上記と同様に反応を行った結果を図１０に示
す。１８０時間反応後の収率は、７．５％であった。

【００４９】実施例２、３に示したように、α−アミラ
ーゼのみを使用した場合は、エタノール濃度が高くなる
ほど高重合度オリゴ糖の割合が高くなる一方、全体的な
収率が低下するが、プルラナーゼを併用すると、高いエ
タノール濃度においても高い収率が得られ、重合度、収
率ともに向上させることが可能であることがわかる。

【００５０】さらに、実施例６に示したように、高エタ
ノール濃度では基質濃度が高いと収率が低下するが、プ
ルラナーゼを併用すると基質濃度を３０％と高くして
も、高収率を維持できることが明らかである。

【００５１】

【発明の効果】本発明は、多糖類を親水性有機溶媒と水
との混合系で酵素分解を行うこととしたことにより、高
重度オリゴ糖を効率よく製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】反応生成物総量に対する各重合度のオリゴ糖
の割合を示した図。

【図２】反応生成物総量に対する各重合度のオリゴ糖
の割合を示した図。

【図３】反応生成物総量に対する各重合度のオリゴ糖
の割合を示した図。

【図４】反応生成物総量に対する各重合度のオリゴ糖
の割合を示した図。

【図５】反応生成物総量に対する各重合度のオリゴ糖
の割合を示した図。

【図６】反応生成物総量に対する各重合度のオリゴ糖
の割合を示した図。

【図７】反応生成物総量に対する各重合度のオリゴ糖
の割合を示した図。

【図８】反応生成物総量に対する各重合度のオリゴ糖
の割合を示した図。

【図９】反応生成物総量に対する各重合度のオリゴ糖
の割合を示した図。

【図１０】反応生成物総量に対する各重合度のオリゴ
糖の割合を示した図。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】多糖類を、この多糖類を構成する糖同士
の結合を切断する加水分解酵素を用いて分解することに
よりオリゴ糖を製造する方法において、多糖類と前記加
水分解酵素とを、親水性有機溶媒と水との混合物中で共
存させることを特徴とする高重合度オリゴ糖の製造法。
【請求項２】前記多糖類が澱粉であり、前記加水分解
酵素がアミラーゼであり、前記親水性有機溶媒がエタノ
ールである請求項１記載の高重合度オリゴ糖の製造法。
【請求項３】前記加水分解酵素としてさらにプルラナ
ーゼを併用することを特徴とする請求項２記載の高重合
度オリゴ糖の製造法。
【請求項４】前記親水性有機溶媒の濃度が、３０〜９
０（V/V）％である請求項１〜３のいずれか一項に記載
の高重合度オリゴ糖の製造法。