JPH059411B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は胸腺抽出物画分を含有する医薬組成物
に関する。 従来の技術 身体の免疫器官は胸腺により調節されること、
かつこのような機能は胸腺の無細胞蛋白質抽出物
によつても営なまれ得ることは知られている。従
つて近年、胸腺組織抽出物の製造、用途及び作用
様式の多数の研究がなされて来た（例えばオソバ
（B.D.Osoba）及びミラー（J.F.A.P.Miller）、ネ
イチヤー（Nature）199巻（1963年）；ゴールド
スタイン（A.L.Goldstein）及びホワイト（A.
Whit）、Contemp.Topics in Immunoliology
1973339；ビル（C.Birr）及びストーレンヴエル
ク（U.Stollenverk）、アンゲヴアンドテヒエミイ
（Angew.Chemie）91巻（1979年）422頁；アンゲ
ヴアンドデヒエミイ、インターナシヨナル エデ
イシヨン イン イングリツシユ（Angew.
Chemie.Int.Ed.Englisch）18巻（1979年）394頁）
参照）。すなわち例えば、子ウシの胸腺の無細胞
蛋白質抽出物、例えばチモシンフラクシヨンNo.５
の表示の標準製剤は様々の範囲で免疫不全症候
群、例えば移植組織の低減した拒絶、増加した感
染感受性、加速された老化及び高められた腫瘍確
率を抑制することが判明した。最近、白血病又は
その他の癌患者にチモシンフラクシヨンNo.５を臨
床的に使用し、特に肺癌の場合にはすでに治療効
果に結びついたことも報告された（クレチエン
（P.B.Chretien）等著、J.D.Cancertreat.
Report62（1978）1787〜1790）。 1977年にゴールドスタイン（A.L.Goldstein）
等（J.Proc.Nat1.Acad.Sci.USA74（1977）725）
は、チモシン−ポリペプチド混合物から酸性の成
分を純粋な形で分離することに成功し、それをチ
モシン−α1と表示し、それについてのペプチド
配列も示した。チモシン−α1は28個のアミノ酸、
分子量3107を有する。チモシン−α1は胸腺から
極めて煩雑に単離されるので、すでにその完全合
成への方法も提案された（ジヤーナル オブ ア
メリカン ケミカルソサエテイ（Journal of
American Chemical Society）101，１（1979）
253〜254；西ドイツ国特許公開公報（DE−OS）
第2919592号明細書）。 チモシン−α1は分子量3107及び28個のアミノ
酸を有する比較的に大きなポリペプチドであり、
その合成の困難さは報告されている；チモシン−
α1の代りにチモシン−α1−断片を免疫治療に使
用することも公知であり、これはそのより低い分
子量に依りより簡単に、より高い収率で、かつよ
り良好な純度で製造される（西ドイル国特許公開
公報（DE−OS）第3100974号明細書参照）が、
免疫調整作用又は免疫刺激作用をより少ない範囲
しか示さない。 発明が解決しようとする問題点 ところで、胸腺組織−抽出物の２種類の一定の
画分、つまり低分子蛋白質及び／又はオリゴペプ
チドより成る画分及び臓器特異性のオリゴペプチ
ドと結合しているリボフラビンを含有する黄色画
分よりなる混合物は優れた免疫学的特性を有し、
この特性はチモシンフラクシヨンNo.５のそれ又は
チモシン−α1のそれと比較可能であり、かつこ
の特性は作用強度において一部分はむしろ凌駕す
ることが判明した。従つて本発明による医薬組成
物は免疫不全症候群、例えばＴ−細胞不全症状、
加速された老化、高められた腫瘍形成確率及び特
に癌の治療に好適である。 問題点を解決するための手段 従つて本発明の目的は、胸腺抽出物の分別によ
つて得られる、低分子蛋白質及び／又はオリゴペ
プチドよりなる画分及び臓器特異性のオリゴペプ
チドと会合しているリボフラビンを含有する黄色
画分を含有する又はこれらの画分より成ることを
特徴とする医薬組成物である。その有利な実施態
様は特許請求の範囲２〜５及び実施例から引用さ
れる。 殊に低分子蛋白質及びオリゴペプチドの分子量
は＜2000ダルトンである。臓器特異性のオリゴペ
プチドと会合されたリボフラビンを含有する抽出
物画分において、“会合（Assoziation）”とは、
例えば補酵素／補欠分子族系で存在するような結
合と解されうる。 抽出物を取得するための出発臓器は胸腺であ
り、この際臓器供与体としては特に屠殺動物、殊
に子ウシがこれに該当する。 意外にも、２種類の抽出物画分の各個々、すな
わち低分子蛋白質及び／又はオリゴペプチドより
なる画分子又は臓器特異性のオリゴペプチドと会
合しているリボフラビンを含有する黄色画分は、
本発明による組成物とは異なる作用及び／又は実
際にそれよりも弱い作用を示すことが判明した；
２つの成分の相乗的に作用する組合せがはじめて
本発明による効果を示すのである。 本発明による組成物については、公知のチモシ
ン−フラクシヨンNo.５のそれよりも良好である優
れた免疫刺激作用が判明した。その製剤は免疫刺
激作用を有し、かつその際、癌細胞に対する有効
性を示すばかりでなく、エイズ（Aids）及び重
症のヘルペスにおいても著しく有効であると立証
された。これは例えばＴ−サプレツサー細胞（細
胞障害性の亜集団）がペルパー（Helfer）細胞
に比べて強く高められることから明らかである。 分別のための出発物質として使用される胸腺抽
出物は自体公知の方法で胸腺の抽出により得るこ
とができる（オソバ（B.D.Osoba）及びミラー
（J.F.A.P.Miller）著、ネイチヤー（Nature）199
巻（1963年）653；イエガー（K.H.Jaeger）等
著、Pharm.Res.Communication16巻（1984年）
No.６、559参照）。 本発明による組成物の製造は、例えば次の方法
で行なうことができる： 機械的に砕壊した臓器から外来のプロテアーゼ
（蛋白質分解酵素）、例えばパンクレアチン製剤又
は同様にパパインの存在で水での抽出により得ら
れる、中間貯蔵のために場合により水溶液、ペー
スト状物として又は噴霧乾燥されて存在する抽出
物を、攪拌下に水中に溶かし、この水溶液を場合
により混濁物質の濾別後に、フエノールで抽出
し；相分離（水相は廃棄する）後に、フエノール
相にエタノールを混ぜ、この際低分子蛋白質及
び／又はオリゴペプチドよりなる画分（以後常に
ペプチド画分として表示する）が沈殿するからこ
れを濾別し、沈殿濾液から黄色画分をカラムクロ
マトグラフイーにより単離することができる。こ
の際得られる画分から、臓器特異性のオリゴペプ
チドと会合しているリボフラビンを含有する黄色
画分（以後常に黄色画分又は黄色物質として表示
する）を分離し、かつ合一し；残りの画分は廃棄
する。こうして得られる黄色画分を更にクロマト
グラフイー（閉鎖クロマトグラフイー）により、
例えば調製用セフアデツクス（Sephadex ）
LH−20−カラムで、溶離剤として水（トリフル
オルエタノール１％）を用いて分離することがで
き；この場合には殊にこの第２のクロマトグラフ
イー分離で得られる主画分、及び特に黄色成分
（リボフラビン／オリゴペプチド）を含有する画
分を本発明による医薬組成物の黄色画分（黄色物
質）として使用する。 個々の方法工程は自体公知の方法で実施するこ
とができる。クロマトグラフイー分離は閉鎖クロ
マトグラフイー（分子篩−効果）に常用の条件下
で、かつ適当な常用の填料（例えば珪酸ゲル、セ
フアデツクス（Sephadex ））及び溶離剤（例え
ば水／トリフルオルエタノール１％）を用いて実
施することができる。フエノール−沈殿濾液の第
１カラムクロマトグラフイーは殊に酸化アルミニ
ウムカラムで、かつ溶離剤として水を用いて実施
する。 抽出物の溶解用及び溶離用の水としては、殊に
菌の少ない濾過した水、無菌水又は蒸留水を使用
する。個々の方法工程は有利に不活性気体雰囲気
下、例えば窒素ガス下で実施され、濾過は殊に滅
菌濾過の条件下で実施される。 真空中のペプチド画分の乾燥及び真空中の回転
蒸発器での黄色画分の注意深い蒸発濃縮により、
又は凍結乾燥により、結晶化した乾燥生成物が得
られる；この際乾燥は両方の場合とも≦60℃の温
度で実施されねばならない。 しかしペプチド画分及び黄色画分は水溶液とし
て又は濃縮物として、場合によりその他の医薬助
剤及び／又は賦形剤及び／又は作用物質の添加後
に、直接使用することもできる；製造に依り溶液
はなお少量のフエノールを含有するがこれは障害
にはならない。特に濃縮物の製造の際には、しか
し溶液においても、安定剤、例えば更に、水性濃
縮物又は溶液に対して約0.3〜1.0重量％、特に0.5
重量％の濃度までのフエノールを添加することが
同様に有利であり得る。しかし溶液から、例えば
中間貯蔵後に、乾燥物質を、例えば凍結乾燥によ
り単離することもでき、次いでこれをそのものと
して、又はその他の作用物質及び／又は医薬助剤
及び賦形剤と共に適用することができる。 一般に低分子蛋白及び／又はオリゴペプチドよ
りなる画分（ペプチド画分）の黄色画分に対する
量比は、この２つの成分が臓器抽出及びそれに続
く抽出物からの分離の際に得られる割合に相当す
る；しかし若干の場合、例えば特殊な適用には、
一方の成分又は他の成分を過剰で又は抽出から直
接得られる量比とは別の割合で適用することも有
利であり得る。 医薬助剤及び賦形剤としては全てこのような適
用目的に適当な助剤及び賦形剤を使用することが
でき、この際その選択は、特に所定の固体又は液
状の適用形態（錠剤、糖衣錠、カプセル剤、シロ
ツプ、溶液、注射用溶液等）により適応させる。
１種又は数種のその他の、適応症の範囲で適当な
作用物質との本発明による抽出物混合物を使用す
ることもできる。 １ml中本発明による牛胸腺抽出物からの蛋白質
不含乾燥物質11mgを含有する溶液２mlを充填した
アンプル１〜２本／１日が筋肉又は皮下注射によ
り、即ち22〜44mg／dayで週３回適用される。 治療期間は４〜８週間である。 本発明を、有利な実施態様に関連する次の実施
例につき詳説するが、本発明はこれに限定される
ものではない。他の記載のない限り、前記及び後
記のパーセントの記載は重量％に、温度の記載は
℃に依る。 実施例 例 １ ａ フエノールとして、DAB7の純度基準に相応
する化学的に純粋なフエノールを使用する；エ
タノールとしては無水の、かつメチルエチルケ
トンで変性されたエタノールを使用する。 砕壊した子ウシ胸腺から得られる抽出物を攪拌
下に水（濾過して菌を少なくした）中に約20重量
％の濃度で（乾燥残渣に対して）溶かす。この水
溶液をフエノール（１重量％）と共に保存する。
１〜10日間の中間貯蔵の後に、水溶液を濾過によ
つて澄明にし、濾別された懸濁物質は廃棄する。 澄明濾液にフエノールを混ぜ、約５分間攪拌す
る；相分離の後（約２〜５時間）、上層の水相
（フエノール約７重量％）を溜去し、かつフエノ
ール相を、濾過して細菌を少なくした水で５回
（そのつど５分間攪拌する）洗浄し、次いで鉱物
質を除去した水で１回洗浄する。この際洗浄水中
に溶解するフエノール量は絶えず補給する。洗浄
されたフエノール相を攪拌下にエタノール中に装
入し、この際ペプチドが沈殿する。濾過後に濾板
上に得られる残渣（ペプチド画分）をエタノール
で、洗浄アルコール中のフエノール含量が約１重
量％になるまで、洗浄する。濾過残渣を濾過器上
で前乾燥（真空、濾過した菌を少なくした空気）
後に最高60℃で真空中乾燥する。 ｂ 例1aにより得られるペプチド画分（以後
101／83と表示する）の物理的−化学的特徴付
け 実験順序及び結果 1.1 元素分析： 炭素、水素及び窒素の元素を酸素流中での燃焼
及び引続いて一酸化窒素の還元により二酸化炭
素、窒素及び水としてガスクロマトグラフイーに
より測定した。硫黄測定は硫酸塩として過塩素酸
バリウムでの滴定により行なつた。 101／83：C46.52％ H6.92％ N14.3％ S0.83％ 1.2 アミノ酸分析： 1.2.1 遊離アミノ酸の含量：試料101／83をスタ
イン（Stein）及びモア（Moore）の方法によ
り、自動アミノ酸−分析器（バイオトロニツク
社製（Firma Biotronik））を用いて、各前処
理なしに、定量的に遊離アミノ酸含量について
検査した。秤量した使用を分析器の一定量の出
発緩衝液中に溶解し、一定部分を装置中に注入
した。 ペプチド画分（101／83）１mgは、次の遊離ア
ミノ酸（ｎモル）：システインスルホン酸56.0、
アスパラギン酸21.6、セリン5.4、グルタミン酸
6.0、プロリン11.6、ヒスチジン17.8、アルギニン
約20を、明確に同定できないアミノ酸187及び
17.8nモルと共に含有する。 1.2.2 アミノ酸の総含量：秤量した物質101／83
を封管中で濃塩酸／水（１：１）中で120℃で
24時間完全に加水分解し、真空中で蒸発濃縮
し、残渣を分析器の一定量の出発緩衝液（PH
1.8）中に溶かし、一定部分を装置に注入した。 物質101／83（胸腺からのペプチド画分）104μ
ｇは、総合して次のものより成る（ｎモル）：シ
ステインスルホン酸13.55（2.29μｇ）、アスパラギ
ン酸60.95（8.11μｇ）、スレオニン18.1（2.16μｇ）
、
セリン22.6（2.38μｇ）、グルタミン酸61.1（8.99μ
ｇ）、プロリン90.3（10.4μｇ）、グリシン148.1
（11.12μｇ）、アラニン49.15（4.38μｇ）、バリン
37.0（4.33μｇ）、イソロイシン25.8（3.38μｇ）、ロ
イシン36.95（4.85μｇ）、チロシン4.4（0.797μｇ）
、
フエニルアラニン17.55（2.9μｇ）、リジン36.1
（5.27μｇ）、ヒスチジン12.65（1.96μｇ）、アルギ
ニ
ン34.48（6.0μｇ）。 従つて胸腺からのペプチド画分は、加水分解可
能なアミノ酸（ペプチド性物質；HPLCによりヌ
クレオチドを定性的に立証した）約76％に相当す
る。結果を第１図に示す。 2.1 ポリアクリルアミド−電気泳動： 300×150×１mmの大きさの分離ゲルを注型し
た。架橋度10−、15−及び20％のゲルを使用し
た。分離はドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の存
在で行なつた。 このゲルの特別製造のために次の基準溶液を使
用した： 下部トリス−緩衝液： トリス36.34、濃HCl5ml及び10％のSDS−
溶液８mlをH₂Ｏで200mlに充す（PH＝8.8）。 上部トリス−緩衝液： トリス6.06ｇ、濃HCl4ml及び10％のSDS
−溶液をH₂Ｏで100mlに充す。 電気泳動−緩衝液： 槽−緩衝液250ml及び10％のSDS−溶液10
mlを1000mlに充す。 槽−緩衝液： トリス12.0及びグリシン57.6ｇをH₂Ｏで
1000mlに充す。 アクリルアミド−溶液： アクリルアミド30ｇ及びＮ，N′−メチレ
ン−ビス−アクリルアミド0.8ｇをH₂Ｏで
100mlに充す。 過硫酸アンモニウム： 水中の10％新製溶液。 変性−緩衝液 グリセリン20％、SDS3％、メルカプトエ
タノール３％を有する電気泳動−緩衝液＋ブ
ロムフエノールブルー。 固定浴：12.5％のTCA 染浴： MeOH500ml、H₂O500ml及びAcOH140
ml中のクーマシーブルー2.75ｇ 脱色浴： MeOH100ml及びAcOH150mlをH₂Ｏ
で2000mlに充す。 分離ゲル 出発ゲル （10％） H₂Ｏ 8.33ml 3.25ml 上部トリス−緩衝液 5.00 − 下部トリス−緩衝液 − 1.25 アクリルアミド−溶液： 6.67 0.55 テトラメチルエチレンジアミン 0.02 0.01 （TEMED） 硫酸アンモニウム 0.01 0.02 実 施 塗布される試料の濃度： 101／83：7.5mg／60μ 試料を変性−緩衝液50μ及びブロムフエノー
ルブルー−溶液10μ各々中に装入した。各20μ
を塗布した。 電気泳動分離のために先ず45分間13mA（最高
400V）で試料を収集ゲル領域（出発帯域）中で
濃縮し、かつ３時間一定の50mA（８℃冷却）で
電気泳動にかけた。 展開のためにゲルを引続きサンドイツチ−室に
装入し、45分間22℃で染浴中で処理した。過剰の
染料を脱色浴中で浴液を数回取り替えながら８時
間で除去した。 結果：ペプチド製剤について予想されるよう
に、101／83は10％架橋化のポリアクリルアミド
−SDS−ゲルにおいては電気泳動的には個々の成
分に分離することはできない；このことは低分子
ペプチドの含量を示す。 2.2 濾紙電気泳動 物質101／83を濾紙電気泳動法により検査する
実験においては、この物質は高圧電場におけるこ
の条件下では分離不可能であり、ニンヒドリンで
呈色可能な、混合ペプチドに特有の広巾ににじん
だ帯域を形成することが立証された。 緩衝液：PH1.9；組成（ml）：氷酢酸15／蟻酸５／
水80（容積部）。 濾紙：Machery、Nagel＆Co.、MN−クロマト
グラフイー紙、No.214（23×58cm）。 物質試料は水／１％トリフルオルエタノール中
に溶解されて、出発地点に塗布された。 分離は1000V／２時間（０℃）で行なわれた。 展開：電気泳動濾紙を100℃で乾燥し、かつニン
ヒドリン−溶液を噴霧した後に、分離結果を100
℃／10分間に加熱することによつて可視化した。 ３ 末端基測定： ２−次元の、クロマトグラフイーによる分離に
おける前記の微量法で、アミノ酸、ペプチド及び
蛋白質のＮ−末端をピコ−モル範囲（10^-12Ｍ）
で立証することができる塩化ダンシルを用いる末
端基標識化法を適用した。 ダンシル化：試験すべき物質の最少量を0.05モ
ルのNaHCO₃−緩衝液中で、塩化ダンシルと反
応させ、引続き酸性加水分解した。 加水分解物を超薄−ポリアミド板上で２−次元
クロマトグラフイーにより検査する： １次元、蟻酸48％ ２次元、氷酢酸／トリオール（１：４、ｖ、ｖ）。 Ｎ−末端の標識されたアミノ酸はポリアミド板
上でUV−光におけるその螢光により確認され、
写真に取られる。確認はダンシル化されたアミノ
酸の略図式（Kartierungs schema）により行な
つた。 （ラツチユ（H.Laatsch）、J.
Chromatography173巻（1978年）第398〜402
頁）。 結 果： 主標識化：Asp、Glu、Gly、Ala、pro、
（Hauptma−Arg、His、NH₄ 、CySO₃Ｈ、Ser。
rketrung） 裏標識化：Val、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys。
（Hintergrendmarkierung） ４ ゲルクロマトグラフイー： 胸腺からのペプチド画分（試料出発番号101／
83）1.455mgを、溶離剤として水（トリフルオル
エタノール１％）を用いてクロマトグラフイーカ
ラム（３×230cm）、セフアデツクス（Sephadex）
LH20上で分離した。 分別：20ml／ガラス管25分間 流速：0.8ml／分間 ２−経路−検出： 1.UV（280nm）、2.屈折計
法（Empf.32） 結 果： 10主画分： （９−14）、（20）、（23）、（26）、
（28）、（30−31）、（50−55）、（60−64）、
（67−70）、（134−148）； ８副画分： （15−19）、（21−22）、（24−25）、
（27）、（29）、（32−49）、（56−59）、（65−
66）。 ガラス管70及び134の間では、クロマトグラム
は基線にそつて流れる：このガラス管は廃棄し
た。 付加的に挙げた薄層−クロマトグラフイーで、
ゲルクロマトグラフイーの際に得られた主画分の
試料を塗布した。 薄層クロマトグラフイー（DC）−プレート：珪酸
ゲルF₂₅₄（20×20cm；メルク（Merck）），層厚
0.250mm。 展開剤：酢酸エステル15／ピリミジン20／酢酸
６／水11（容積部）。 第２図はゲルクロマトグラフイーによる分離を
示す。 検査結果の評価 １ アミノ酸−分析 前文：検査物質の酸性全加水分解の前後におけ
るアミノ酸分析の定量的データの総括の際に、最
低ピーク及び分析器による自動評価の際に関係付
け得なかつたピークは考慮しなかつた。 遊離アミノ酸が、ペプチド製剤について予想さ
れる様に、最低の随伴物質としてのみ立証される
ことは注目される。遊離アミノ酸の確認は疑いが
なくは無い、それというのも分離経過で個々のピ
ークは、ペプチドの分離モデルへの付着体
（Aufsetzer）としてのみ立証されるからである。
しかしながら、特により高い試料濃度（１mg／
500μ）において再現可能なピーク−モデルが
得られ、これは製剤101／83そのものの確認ばか
りでなく、その標準化も例えば23.73（アスパラギ
ン酸）及び83.81（ヒスチジン）におけるピーク、
並びに9.56、57.15及び71.15における特異的ピー
ク（この場合特異的ペプチド分離が重量である）
により容易に可能である。 2.1 ポリアクリルアミド−電気泳動 ゲル電気泳動における反応に依り、101／83は
もつぱら最高15アミノ酸／配列の査定鎖長を有す
る低分子ペプチドから成ることが推論できる。酵
素的部分加水分解なしの胸腺組織からの１抽出生
成物のみがこの電気泳動法において僅かに分離で
きる。 しかしながら、101／83が胸腺からの黄色画分
よりもペプチドに富んでいることがこの技術にお
いて認められるという簡単な所見が重要である
（例２）。 2.2 濾紙電気泳動： 胸腺からの黄色画分の分離モデルとペプチド画
分101／83のそれとの比較は、後者の場合におい
ては、その多官能のイオン性のために、電気的高
圧電場におけるクロマトグラフイーによる前分離
なしでは細分化されず、かつ不連続のペプチド帯
として描かれる複合ペプチド混合物が存在するこ
とを明らかに示している。 ３ 末端基測定： 適用技術においては、PH10.5でプロトン化され
ていない全ての窒素官能が、把捉され；すなわち
ペプチド−及び蛋白質−末端基ばかりでなく、場
合により遊離して存在するアミノ酸もこの技術に
おいて標識される。 グリシン及びアラニンは、遊離アミノ酸として
製剤中に含有されていないので、この２種は
101／83におけるペプチドの主なる末端基である
ことは明らかとなる。 遊離アミノ酸の分析でのアスパラギン酸及びシ
ステインスルホン酸、並びにアルギニン及びヒス
チジンの高含量は、末端基測定の場合にもそれが
認められ、従つてこれらのアミノ酸はＮ−末端ペ
プチド結合に由来し得ない。 グルタミン酸、プロリン及びセリンは、末端基
測定では著しく存在し、従つてこれらのアミノ酸
はペプチド末端基として見なすこともできる。そ
れというのもこれらはアミノ酸分析によれば極め
て少量でのみ製剤101／83中に遊離して存在する
からである。 ４ ゲルクロマトグラフイー挙動 胸腺からのペプチド画分101／83はセフアデツ
クス（Sephadex）LH20での分離の際に黄色画
分69／83とは著しく異なる（例２参照）。主画分
２〜６の280nmにおける紫外線（UV）吸収はオ
リゴヌクレオチド含量にのみ起因され得る。それ
というのも製剤101／83はそのアミノ酸組成によ
ればUV−吸収性アミノ酸（Tyr、Phe、His）を
合計して６重量％含有するにすぎないからであ
る。 これはセルロース薄層上の電気泳動所見及び
HPLCに依る定性検査により確認される。水中に
おけるセフアデツクスLH20のカラムクロマトグ
ラフイー分離により、製剤のオリゴヌクレオチド
含量はペプチド成分（画分６）から分離され得る
ことは重要である。画分７〜10中に総括され、主
内容物からすつかり分離される製剤101／83の成
分は、遊離アミノ酸及びモノヌクレオシドの分子
容量の物質のみを含有し得ることが、溶離図（第
２図）から最終的に推察される。このことは付加
的な電気泳動検査並びに薄層クロマトグラフイー
検査により確認される。 101／83よりなるゲルクロマトグラフイー画分
６は製剤のペプチド誘導画分とみなされる。 本発明により医薬組成物にはペプチド画分とし
てゲルクロマトグラフイー（例1b、Ｉ、４）の
際に得られる主画分又はペプチド誘導画分（画分
６）のみを使用することが有利であり得る。 例 ２ ａ 黄色画分の取得 例1aにより得られるペプチド画分の濾液を真
空中（傾斜管高速回転蒸発器）でその容量の約50
％まで蒸発させ（洗浄アルコール濾液は容量の約
20％に）、この際温度は60℃を越えてはならない。 そうして得られる濃縮混合物を酸化アルミニウ
ムカラム上に施こす（Aluminiumoxid Woelm
Ａ Super Ｉ、W200型、ヴエルム社製（Fa.
Woelm）、エシユヴエーゲ（Eschwege）；カラム
の充填は、カラムに先ずエタノールを充たし、次
いで酸化アルミニウムを添加するようにして行な
う；12時間の固定時間後にカラムは使用準備完了
である）。濃縮混合物をクロマトグラフイーカラ
ムに装入した後にエタノールで後洗浄する；溶離
は蒸留水で圧力下に行なわれる（濾過して細菌を
少なくした圧縮空気）。溶離液を溶離終了後に真
空中で容量の約20％まで濃縮し（傾斜管蒸発器）、
こうして得られる濃縮物から次いで回転蒸発器中
での蒸発濃縮により結晶化された乾燥生成物（黄
色画分）を得る。 ｂ 例2aにより得られる画分（以降69／83とし
て表示される）の物理的−化学的特徴付け ：実験順序及び結果 1.1 閉鎖クロマトグラフイーによるフラビンの
分取分離 ゲル床寸法3.5×240cmの調製用セフアデツクス
（Sephadex LE20−カラムで、溶離剤としての
水（１％トルフルオルエタノール）5.007ｇ中で、
黄色画分（黄色物質）16ｇを分子篩効果の利用下
に閉鎖クロマトグラフイーにより分離した。この
ために各２×５ｇ及び１×６ｇの少量を、そのつ
ど蒸留水（１％トリフルオルエタノール）５ml中
に完全に溶かし、ゲル床上に施こした。画分19
ml／ガラス管／25分間を採取し、ゲルクロマトグ
ラフイー分離経過を連続的に、１）280nmにおけ
るUV−吸収測定（LKB社製流動光度計Uvicond
）及び２）クロマトグラフイー溶離液の密度
変化の測定による流動屈折計法（ウオータース−
リフラクトメーター（Waters−
Refraktometer）、R4；Daempfung64）により記
録した。 代表的な分取分離経過は第３図（溶離略図）か
ら判る。分離経過中に強く黄色に呈色した成分が
はつきりした境界をつけた帯域として分離カラム
を通つて移動し、ガラス管No.80〜100の範囲で採
取し、凍結乾燥させ、かつ秤量した。 結 果： 69／83（16ｇ）から合計して黄色成分224mg
（1.4重量％）が得られ、これを次に分析的かつ天
然物化学的に検査する。 元素分析 Ｃ％ Ｈ％ Ｎ％ 黄色成分 52.41 6.27 14.87 リポフラビン 52.59 5.79 15.34 1.2 69／83のゲルクロマトグラフイー分離から
の凍結乾燥された画分の取得 69／83（5.007ｇ）の分取分離後に、分離した成
分の濃度及びUV−吸収に基づき、18画分を一緒
にした。 このために相応するガラス管の内容物を前もつ
て秤量した丸底フラスコ中にあけ、ガラス管を蒸
留水で３回後洗浄し、合一したガラス管に相応し
て画分を標識した。 水性画分を回転下で真空中−78℃で凍結させ、
引続き凍結乾燥させた（凍結乾燥機、ヘレウス−
レイボルド（Haereus−Leybold）、G2）。 凍結乾燥した画分をそのつど丸底フラスコ中で
秤量し、空気−及び湿気を通さないよう閉鎖し
（パラフイルム）、かつ冷蔵庫中＋４℃でその他の
実験のために貯蔵した。 結 果： 69／83（5.007ｇ）から次の画分が得られた：

【表】 凍結乾燥画分の総量は5.002ｇ（99.9％）であ
つた。 1.3a 69／83の主要画分の元素分析

【表】 1.3b 69／83の主画分のアミノ酸分析遊離アミノ
酸の含量： 遊離アミノ酸の含量測定のために40μｇ〜２mg
を秤量し、各前処理なしに出発緩衝液（PH1.8）
中に入れ、かつ自動分析器を用いて、いかなる末
端基標識化（1.3c参照）が画分中の一緒に移行し
たペプチド会合の遊離アミノ酸含量に帰されるべ
きか、及びいかなる画分成分がペプチド性である
かを知り得るために実験した。 結 果： 画分（20〜31）1.411mgは遊離アミノ酸につい
て、システインスルホン酸52.7（ｎモル）、アスパ
ラギン酸15.4、スレオニン5.9、セリン7.7、グリ
シン5.1、リジン1.8及びNH₄ ⁺11.3を含有する。調
査したデータから、画分の約１重量％が遊離アミ
ノ酸であることが判る。 画分（32〜59）195μｇは遊離アミノ酸につい
て、システインスルホン酸52.1（ｎモル）、アスパ
ラギン酸6.6、イソロイシン20.7、ロイシン25.1及
びフエニルアラニン49.9を含有する。含量測定か
ら、画分の約８重量％が遊離アミノ酸であること
が判る。 画分（60〜65）204mgは遊離アミノ酸について、
ロイシン2.5（ｎモル）、フエニルアラニン108.2、
ヒスチジン54.4及びアルギニン27.3を含有する。
末端基測定に依れば（1.3c参照）、保留時間73.6
におけるピークはリジンに関係しなかつた；ヒス
チジン及びアルギニルの含有も不確かである。そ
れというのもピークの形態はこれらのアミノ酸に
ついて特徴的ではないからである。これらの制限
下で、画分の約16重量％は遊離アミノ酸であるこ
とが判る。 画分（66〜81）200μｇは遊離アミノ酸につい
て、チロシン4.0（ｎモル）、フエニルアラニン
91.9、NH₄ ⁺17、ヒスチジン4.2及びアルギニン3.1
を含有する。これから画分の約1.9重量％は遊離
アミノ酸であることが判る。 画分（82〜98）40μｇは遊離アミノ酸について
システインスルホン酸4.9（ｎモル）及びヒスチジ
ン1.5を含有する。これから画分の約2.8重量％は
遊離アミノ酸であることが判る。 画分（99〜102）1.995mgは遊離アミノ酸につい
て、ロイシン8.6（ｎモル）、チロシン1.7及びヒス
チジン10.4を含有する。これから画分の約0.2重
量％は遊離アミノ酸であることが判る。 画分（103〜110）2.319mgは遊離アミノ酸につ
いて、システインスルホン酸1.3（ｎモル）、シス
テイン1.9、ロイシン4.5、フエニルアラニン2.1及
びヒスチジン5.9を含有する。このことから0.1重
量％よりも少ない画分が遊離アミノ酸であること
が判る。 アミノ酸の総含量、ゲルクロマトグラフイーに
より得られた画分のペプチド成分の測定： 主画分（20〜31）〜（103〜110）から各約40μ
ｇの秤量分を溶封アンプル中で24時間120℃で6N
HCl中で完全加水分解し、真空中蒸発乾固し、出
発緩衝液（PH1.8）中に入れ、自動分析器を用い
てアミノ酸の含量について定量的に実験した。調
査したアミノ酸の総含量から画分含量の引算によ
りペプチド含量の遊離アミノ酸を算出した。 その結果を次の表にまとめる：

【表】

【表】 ＊＝黄色成分
副画分（118〜121）〜（252〜265）の定性アミ
ノ酸分析 前記の方法論で、試料約40μｇを完全加水分解
後に定性的にアミノ酸の含量について、末端基測
定（1.3c参照）との関係を確立し得るために、実
験した。 結 果： 69／83のゲルクロマトグラフイー分離の、量成
分からは重要ではない後者の画分は、ペプチド及
びアミノ酸を約10〜20重量％含有するにすぎず、
後者の画分ほど減少する傾向がある。付随する元
素分析（1.3a参照）によれば、ヌクレオチド−断
片の含量は除外すべきではない。 1.3c 主画分の末端基測定 ピコ−モル範囲（10^-12Ｍ）のアミノ酸、ペプ
チド及び蛋白質のＮ−末端を前記の微量法におけ
る２−次元の、クロマトグラフイー分離で立証す
る塩化ダンシルを用いる末端基標識化の方法を適
用した。 ダンシル化：試験すべき物質約5μｇを0.05モルの
NaHCO₃−緩衝液中で塩化ダンシルと反応させ、
引続き溶封した毛細管中で４時間6NHCl中で120
℃で完全加水分解した。加水分解物を真空中乾燥
し、水中に入れ、２−次元クロマトグラフイーに
より微細−ポリアミド板上で実験した： １ 次元、48％蟻酸： ２ 次元、氷酢酸／トリオール（１：４；ｖ、
ｖ）。 Ｎ−末端に標識したアミノ酸をその螢光により
UV−光中でポリアミド板上で確認し、写真に取
つた。等位化はダンシル化アミノ酸の略図式によ
り行なつた（例1b、、３参照）。 結 果： 画分（20〜31）、主標識化：His； 裏標識化（痕跡で）：Ser、Asp、Gly。 画分（32〜59）、主標識化： Gly、His、His、
Arg、Leu； 裏標識化： Asp、Ser、Ala、Val、Pro、
Ile、Phe、Tyr、Lys。 画分（60〜65）、主標識化： Phe、Asp、
Tyr、Ile、Leu、NH₄ ⁺、Gly、His、Arg
（左下四分円の縁の広汎性の斑点は等位化
すべきでない）； 裏標識化：CySO₃Ｈ、Ala、Val、Lys（痕跡）。 画分（66〜81）、主標識化： Phe、Tyr、
NH₄ ⁺、Gly、Asp； 裏標識化： His、Ser、Thr、Ala、Val、
Ile、Leu。 画分（82〜98）、主標識化：Tyr； 裏標識化： Phe、Ile、Leu、Val、Ala、
NH₄ ⁺、Gly。 画分（99〜102）、主標識化： His、His^*、
Tyr； 裏標識化：Glu、Leu、Phe。 画分（103〜110）、主標識化：Gly； 裏標識化：Asp。 ２ フラビン成分の精製のための、1.1で得られ
た黄色成分の分析用かつ分取用HPLC 後記のHPLC−実験のために、水溶液中で強く
螢光を呈する69／83からの黄色成分合計して224
mgを使用する。この富化されたフラビン成分の元
素分析により、リボフラビンへの凝いが強くなつ
たので（１参照）、HPLC−分析の比較目的のた
めに市販の“生化学目的のためのリボフラビン”
（メルク（Merck））を関連させた。 分離カラム： 分析用C₁₈−逆相珪酸ゲルカラム（４×250mm；
粒度：5μ）： 溶離系： 水中メタノール25％、10分間；更に25分間メタ
ノール50％までの上昇性勾配、引続き純メタノー
ルでの12.5分間の洗浄相を行なう。次いでカラム
を初条件で平衡させる。 分析的HPLC： １により富化された（ｃ＝9.25μｇ／μ） 黄色成分46.25μｇ／メタノール：水（１：１） 5μを分離カラム内に噴霧し、流速１ml／分間
で前記の勾配系で溶離させた。記録計の紙送りは
１cm／分間であつた。検出はUV−範囲
（210nm）及び螢光範囲（励起265nm、発光
530nm）で行なつた。結果を第４図に示す。 技術的に同じ経過で、同様の分析用HPLC−カ
ラムに、メタノール：水（１：１）5μ中に溶
かした69／83（元来の物質）1.205mgを噴霧した。
結果を第５図に示す。 もう１つの、技術的に同様の実験経過で、同様
の分析用分離カラム上に水中に溶かした（ｃ＝
714μｇ／ml）リボフラビン（メルク）3μを装
入した。 分析的比較の結果： セフアデツクスLH20で、富化された黄色成分
中、並びに元来物質69／83中には、螢光性物質が
含有されており、これは分析用HPLC−カラムか
ら正確に21分間の純粋なリボフラビン（メルク）
と同じ滞留時間で出て来る。 純粋なリボフラビンのそれに関連して螢光曲線
に依る濃度算出は、セフアデツクスLH20で富化
された成分についてはリボフラビン約0.6％の含
量を明らかにした。 分取HPLC： 寸法28×250mm、C₁₈−逆相珪酸ゲル、粒度：5μ
の分取カラムで、１により富化された、水
（5NNH₄OH5滴）4.2ml中に溶解した黄色成分
129.7mgを、メタノール／水（18：82）よりなる
イソクラテツク混合物で分離した。流速は130バ
ールで26ml／分間であり、UV−検出は254nmで
あり、記録計の紙送りは30cm／時間であつた。 分離結果を第６図に記載する。４つの画分で２
つのピークがとらえられた：画分１は最初の無色
のピークを含有し、画分２，３及び４における第
２ピークは黄色螢光を呈する。 これらの総括された画分は、凍結乾燥後に精製
フラビン成分3.3mgを生成した。 純度対照： 分取HPLCにより得られたフラビン成分の３つ
の画分を、前記のカラムでの分析用HPLCに依り
実験し、この際次の、時間的に延長された勾配を
使用した：10分間水中メタノール25％で、次いで
35分間で水中メタノール60％まで上昇させ、引続
き10分間メタノール100％で後洗浄。その他の全
てのパラメーターは前記したものと同一であつ
た。 結 果： 全３種の分離経過はUV−及び螢光−曲線下で
純粋なリボフラビンと同じピーク面の相関を示
す。螢光−曲線の下降肩部に２つの小さい螢光−
ピークが認められ、これは同様に純粋なリボフラ
ビン（メルク）にも認められた。 調製用HPLC−分離の無色の画分１について完
全加水分解後に定量的アミノ酸分析が行なわれ
た。 フラビン成分と会合したペプチド55μｇは次の
アミノ酸（ｎモル）を含有する：グルタミン酸
2.8、プロリン48.9、グリシン3.1、アラニン1.6、
バリン2.1、イソロイシン14.4、チロシン8.0、フ
エニルアラニン1.2、リジン1.5、NH₄ ⁺14.9及びア
ルギニン3.8。この結果は第７図から判明する。 ３ 69／83から単離されたフラビン成分の天然物
−分析実験 69／83から単離されたフラビン成分の分取
HPLC精製の画分３を天然物−分析的構造立証の
ために使用した。 核共鳴−スペクトル： 69／83からのフラビン成分の分取HPLC分離か
らの画分３の360MHz¹Ｈ−NMR−スペクトルを
D₂Ｏ中で記録した。 結 果： 核共鳴−スペクトルはフボフラビンに特有の全
ての構造元素を示す：イソアロキサジン−環のメ
チルプロトンのシグナルは2.46ppm及び2.58ppm
であり、リビツト−部分については3.75ppm、
3.85〜4.05ppm及び4.35〜4.46ppmであり、並び
に芳香族プロトンについては7.83〜7.92ppmであ
る。 リボフラビンについてはD₂Ｏ中で14個の非交
換性のプロトンが予想された。14個の非交換性の
プロトンが実測された。 質量スペクトル分析的同定： 69／83からセフアデツクスLH−20での閉鎖ク
ロマトグラフイーにより富化されたフラビン成分
の分取HPLC−精製の画分３はリボフラビン（メ
ルク）に比較して次の結果をもたらした： 純粋なリボフラビン（溶剤水）は、最高シグナ
ルとして376ｍ／Ｚでの分子イオン及び399ｍ／Ｚ
での（Ｍ＋Na）⁺−イオンを有する明確な電場−
放出−質量スペクトルを明らかにした。69／83か
らのフラビン成分の付属する電場−放出−質量ス
ペクトルも同様に（Ｍ＋Ｈ）⁺−イオンについて
377で強いシグナルを示し、かつ更に強いシグナ
ルを（Ｍ＋Na）⁺−イオン関して399で示す（溶剤
水）。従つて真正のリボフラビン（メルク）と比
較して、分取HPLCにより単離されたリボフラビ
ンは高められた量のアルカリ塩を含有する。 分取HPLCにより69／83から単離されたリボフ
ラビンとリボフラビン（メルク）との直接的比較
のTAB−質量スペクトル（高速原子衝撃（fast
atom bombardment））は両方の化合物の同一性
を示すが、胸腺から得られるリボフラビンにおい
ては付加的なシグナルを367ｍ／Ｚで、かつその
グリシン−付加ピークを459ｍ／Ｚで示す。この
ことから、69／83から分取HPLCにより単離され
たリボフラビンは分子量366を有する混合物を含
有することが判る。24〜26mAのより高い熱電力
で367の未知物質の分子ピークが同様に電場−放
出−質量スペクトルで立証される。 実験結果の評価 1.3bから、分離可能なフラビン成分はペプチ
ドを17重量％含有することが判る。このことか
らこの成分のペプチド含量が化学的にそれと結
合して存在するのか、又は親油性相互作用の理
由から螢光体と会合して現われるのかという問
題が生じる。 逆相−珪酸ゲル（C₁₈；5μ）での分析用HPLC
により疑なく立証され得るように、螢光物質は真
正リボフラビン（メルク）と同様に滞留時間21分
間で溶離する；この特性は、螢光性物質が元来の
製剤69／83中で直接分析用HPLCにより立証され
たか、又はセフアデツクスLH−20で富化された
フラビン成分からか、には無関係であると証明し
た。このことから、ペプチド−混合物はフラビン
成分と化学的に結合され得いないという結論が導
かれる。それというのもさもなくばフラビン成分
は真正リボフラビンとは異なつてHPLC−系で現
われなければならないからである。更に、フラビ
ン成分と会合したペプチドはフラビン成分と極め
て安定した会合で存在するにちがいないことも認
められる。それというのも分析用HPLCで螢光−
ピークのすぐ隣りに、このUV−吸収成分の前後
で溶離されるからである（これについては実験の
第４図参照）。 フラビン成分中のペプチド部分は、セフアデツ
クスLH−20富化後に存在したように、分取
HPLCに依りフラビンから基線−分離で驚異的に
効果的に分離された。分離されたペプチドのアミ
ノ酸分析は、プロリン、イソロイシン、チロシン
及びフエニルアラニンの含量により、明らかに高
い親油性を示し、従つてフラビンとの狭い相互作
用が明らかである。 例 ３： 医薬組成物（注射用溶液）の製造 １ml当りの組成： 臓器抽出画分 10.00mg （例１及び２より得られる２種の画分の混合物） フエノール（DAB7） 4.55mg NaCl 5.00mg 注射用水 全量1.00ml 使用量：2.2（各２mlずつ1000アンプルに十分） 内容物を水1.5中に溶かし、次いで１％の
NaOHでPH値5.80に調整し、水2.2まで充填す
る。得られる溶液を滅菌し（0.2μm膜濾過器）、
次いで２ml−アンプル中に窒素ガス下で充填す
る。 例 ４ 免疫刺激もしくは免疫調整特性の立証のため
に、得られる本発明による組成物（例1aにより
得られるペプチド画分及び例2aにより得られる
黄色画分の混合物）を滅菌濾過及び凍結乾燥後
に、ヒトの健康な提供者のヘパリン処理された完
全血液中のＴ−リンパ球及びＴ−細胞亜集団のそ
の免疫生物学的活性について実験した。比較物質
としては滅菌濾過し、かつ凍結乾燥させた胸腺−
画分No.５を用いた。 ａ 健康な提供者からの血液試料の取得： この血液製剤のために11人の健康な試料提供者
が必要であつた。蝶形カニユーレ（Schme−
tterlingkanu¨le）を用いて、腕静脈から血液各10
mlを採取し、この際、その量は、吸引せずにシリ
コンホースを通つてカニユーレからヘパリン処理
試験管中に導入した。この処理は、機械的負荷の
際に特異的レセプターの１部分を失なわせること
のできるＴ−リンパ球の表面−マーカーの保護作
用をする。 ｂ 培養バツチ： 各提供者のヘパリン処理完全血液10mlを各々
2.5mlに四分し、培養フラスコ中でRPMI1640−
媒体を充填して各々10mlにした（このRPMI−媒
体は、等張NaHCO₃−溶液でPH7.2に緩衝されて
いる）。この培養フラスコを弛るく閉じ、その他
の添加物を加えずに（牛胎児血清なし、熱脱ナト
リウムアルブミンなし）、無菌条件下にCO₂−恒
温装置中37℃で24時間恒温保持した。 ｃ 血球計算法用の完全血液培養バツチの準備： 完全血液中のＴ−リンパ球及び−亜集団の螢光
性の、マーカー特異性抗体（OKT−血清、オル
ト診断系：Ortho Diagnostic System）での直
接標識付け。各々の完全血液培養バツチから
OKT−血清での５標識付けのために各々100μ
を取り出し、５個のオルムトン（Orthomune ）
OKT−血清各10μと共に30分間恒温保持した。
引続き溶解試薬（Lysereagenz）（Ortho診断系）
で２ml／試料まで充填し、赤血球の破壊のために
５〜10分間恒温保持し（不透明な濁り）、直接サ
イトフルオログラフ（Cytoflu−orograph）
（Ortho）で測定した。 螢光性のマーカー特異性抗体（OKT−血清）
での直接標識付けのためのＴ−リンパ球及び−亜
集団の単離： 完全血液培養バツチを遠心分離し、血漿を捨て
る。沈殿をフイコルーグラデイエント（Ficoll−
gradienten）中、20℃で40分間遠心し、分離され
たリンパ球分を単離する。おそらく付着する残留
−赤血球を溶解試薬により除去し、リンパ球を数
回のPBS中への再懸濁及び遠心分離により洗浄
する。 PBS中への新たな再懸濁の後に、リンパ球を
細胞10⁷個／mlに調節し、これからの試料100μ
にオルトムン OKT−血清各10μを加え、氷浴
中に30分保持し、この際、各々10分後に振出す
る。 次の螢光性のモノクロナール抗体を使用した： OKT−３、末梢Ｔ−リンパ球に対し特異性； OKT−３、Ｔヘルパー亜集団に対し特異性； OKT−６、 胸腺細胞（未成熟Ｔ−細胞）に対
し特異性； OKT−８、 サプレツサー（細胞毒性）Ｔ−亜
集団に対し特異性； OKT−11、 末梢Ｔ−細胞上のＥ−レセプター
に対し特異性。 各試料提供者の対照−及びテスト培養物を
各々、特異性のOKT−血清での標識付けに相応
して５個の測定バツチに細分した。 モノクロナール抗体での標識付けのための30分
の恒温保持時間の経過の後に、非特異性の螢光を
さけるために、遠心分離及びPBSでの２回洗浄
により過剰のOKT−血清を除く。残留沈殿物を
PBS1〜２ml中に再懸濁させると、全量中に細胞
約10⁶個が残留する。 ｄ サイトフルオログラフ（オルト診断系）を用
いる貫流細胞計測（Durchflusscytometrie）；
測定試料と同じ非標識対照試料の１つで測定し
た狭角拡散光を用いて、サイトフルオログラフ
での測定窓をヒストグラムのリンパ球に対して
特異的な部分に適合させ、この際自己発光分を
電気的に除去する。各測定試料から、細胞25〜
30000個／30秒を緑色螢光（それぞれ標識され
たＴ−細胞群に対して特異的）及び狭角拡散光
（すべてのリンパ球に対して特異的）を用いて
評価する。測定値を電気的に蓄積し、全−リン
パ球数の百分率として示す。 ｅ 結果： 次の第２表〜第４表に、本発明による組成物で
得られた結果をまとめ、第５表〜第７表には、チ
モシン−フラクシヨンNo.５を用いて得られた結果
をまとめた。第８表は、比較定量評価を示してい
る。 これら測定結果は、表に記載の種々の濃度での
完全血液培養物から得られた。測定データは、そ
れぞれ、作用物質添加されていないそれぞれの当
該対照培養物と関係付けられている。第２表及び
第５表の記載は、所定の作用物質適用の影響下に
おける末梢ヒトＴ−細胞（OKT−３陽性）並び
にそのヘルパー及びサプレツサーＴ−細胞の亜集
団（OKT−４及びOKT−８陽性）、未成熟胸腺
細胞（OKT−６陽性）及びＴ−リンパ球上のＥ
−レセプター（OKT−11陽性）の割合（％）を
意味する。 すべての表中に、完全血液中のリンパ球ｏ又は
完全血液培養物から単離されたリンパ球ｉの測定
データが、螢光性抗体での直接標識付けにより得
られたか否かが記載されている。 測定データの評価は、第２表もしくは第５表に
関連している第３表及び第６表に示されている。 ａ 作用物質の添加なしで、同じＴ−細胞対照群
と比べた作用物質用量の影響下におけるそれぞ
れのＴ−細胞群の差（差＝％−変化）及び ｂ 対照値（これを100％とする）に対する測定
値の％−割合ｖ を計算した。 測定データの統計は、第４表及び第７表に示さ
れている。完全血液ｏ中で直接又はリンパ球の単
離ｉの後のOKT−血清でのＴ−細胞−標識付け
の方式により解読して、個々の測定Ｍの数ｎを用
いて、その平均値からの個々の測定の標準偏差
Ｓを次式により計算した： 更に、各提供者に関して、異なる日の供血と関
連して測定データの生物学的及び方法的な分散幅
を示す変動係数CVを、確認した： CV（％）＝Ｓ／Ｍ・100

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 ｆ 評価 完全血液ｏ中での直接のＴ−リンパ球の標識付
けは、変動係数CVで表現される測定データの拡
散幅にあまり影響しない。 しかしながら、OKT−６での標識付け（未完
熟胸腺細胞に対して特異性）に基づく測定データ
の高い分散幅が目立つ。ここで、CVは40〜100％
の幅で存在する。OKT−血清での標識付けの品
質をその都度測定された分散幅で評価する際に
は、一連の増加性のCVがOKT−11（Ｔ−細胞上
のＥ−レセプターに対して特異性）＜OKT−３
（全Ｔ−細胞に対して特異性）＜OKT−４（Ｔ−ヘ
ルパー細胞に対して特異性）＜OKT−８（Ｔ−サ
プレツサー細胞に対して特異性）に関して得られ
る。自然の細胞（対照培養物）における分散幅は
７〜20％の範囲内にあり、作用物質添加物を有す
る培養物からの細胞では、時折り、２倍も高い。 同じ試料提供者は、同じ細胞標識付け法及び特
異性OKT−血清の同じバツチで使用の際には、
異なる日の採血において、著るしい測定偏差を示
す。しかしながら、この人に関連する偏差は、
各々のＴ−細胞型が全試料提供者にわたる全測定
系列内で平均して示す分散幅内に存在する。統計
的評価に関する信頼できる値は、対照値（100％）
に対する測定値の平均された割合ｖ（％）、当該
標準偏差Ｓ及びこれから誘導される分散幅（CA
％）に基つき得られる。 本発明による組成物で、OKT−８陽性細胞の
増加の明確な作用は、殊にＴ−細胞の単離の後の
直接標識付けの際（ｖ＝対照値の131.8％）で、
既に２mg／10ml（培養物バツチ）の濃度で明白で
ある。Ｔ−サプレツサー細胞（細胞毒性亜集団）
を増加する方向の本発明の製剤のこの優れた作用
は、すべての試料提供者（ｎ＝21）にわたり、か
つＴ−細胞標識付けの２つの方法（完全血液中で
直接又は単離の後）を平均する際にも統計的意義
が存在する（ｖ＝120％）。健康な提供者の血液
試料で、各々の作用物質の影響なしに得た測定値
OKT−４／OKT−８の商は、正常の場合は1.5の大きさで あり、これからの偏差は、免疫平衡の移動を明白
に信号化する。 本発明の組成物は、チモシン−フラクシヨンNo.
５のOKT−８陽性Ｔ−サプレツサー細胞（細胞
毒性亜集団）の増加（v127％）に関して、完
全血液培養物中でのその作用で優れていることが
判明した。本発明による製剤の１部成分としての
ペプチド画分は、製剤に関連するＴ−細胞亜集団
への作用プロフイルを示し、この製剤の他の成分
即ち黄色画分は、完全血液培養物に対する測定可
能な影響を有するが、これはＴ−細胞型に関連し
ては顕著に現われない。従つて、この成分の存在
により、この製剤を他の胸腺製剤例えばチモシン
−フラクシヨンNo.５と比べてその試験管内作用を
明らかに増強する相乗作用添加物が重要になる。 前記の評価から、対照培養物中のOKT−４／
OKT−８−割合が異常（≠1.5）と認められた試
料提供者を排除すると、17測定ｎを基礎とする本
発明の製剤の終極的な評価にとつて、対照培養物
に対する150％のOKT−陽性細胞の平均割合が、
僅かに16％の分散幅で得られる。このことは、分
散幅が、健康な提供者血液の対照培養物で全測定
パラメータにわたり、完全血液中での直接標識付
けでも単離されたＴ−細胞での直接標識付けでも
平均して見出すことのできる正常限界値内に存在
するので、極めて重要な所見である。 試験管内系（完全血液培養物）中で、Ｔ−リン
パ球の亜集団にとつて典型的であり、モノクロナ
ール抗体を用いる貫流細胞計測で検出された表面
特性の出現（Auspra¨gung）に対する明白な作用
効果が明らかになつた。殊に、サプレツサー細胞
もしくは細胞毒性Ｔ−細胞に特徴的である
（OKT−８−陽性細胞）この特徴の増加が明らか
であつた。この作用効果はいくつかの個体（レス
ポンダー：Responderと称される）でも、統計的
に、参照物質チモシン−フラクシヨンNo.５におけ
るより大きかつた。 すべての（健康な）試料提供者は、全Ｔ−リン
パ球状態（場合による低下は、Ｂ−リンパ球を増
加する気付かない（潜伏）感染によりＢ−リンパ
球が増加している）の、並びに殊にヘルパー／イ
ンデユサー（OKT−４−陽性）及びサプレツサ
ー／細胞毒性（OKT−８−陽性）Ｔ−細胞の正
常と称すべきプロフイルを有する。 得られた結果から、本発明の製剤は、亜集団殊
にサプレツサー／細胞毒性（OKT8−陽性）細胞
で異常状態を有する患者において臨床使用するこ
とができることが明らかである。このような所見
は、特に、自己免疫病として記載されている、殆
どん例外なくOKT−８−陽性亜集団の減少が起
こつているいくつかの結合組織疾病（リウマチ性
関節炎、紅斑性狼瘡、強皮症、シオグレン症候群
等）に公知である。これらの場合には、試験管内
系でも、OKT8−陽性細胞の数の増加に関する優
れた作用効果を期待すべきであり、この際、作用
物質用量も僅かに保持されるべきである。前記の
リウマチ性同型団の患者へのこの製剤の適用の際
には、使用の前又はその間に、末梢リンパ球での
細胞免疫体質をOKT−血清で検査すべきである。 本発明による組成物の適用の方式及び量は殊に
疾病の種類及び重症度及び一般的所見及び患者の
敏感性に依り決まる。

【図面の簡単な説明】

第１図は胸腺からのペプチド画分（101／83）
の定量的遊離アミノ酸含量を示す図であり、第２
図は胸腺からのペプチド画分（101／83）のゲル
クロマトグラフイーによる溶離を示すクロマトグ
ラムであり、第３図は黄色画分のゲルクロマトグ
ラフイーによる分取分離を示す図であり、第４図
は69／83からの黄色成分の分析用HPLCによる検
出を示す図であり、第５図は69／83元来物質の分
析用HPLCによる検出を示す図であり、第６図は
黄色成分の分取HPLCによる分離を示す図であ
り、第７図は分取HPLCにより得られたフラビン
成分の３種の画分を分析用HPLCによる分離を示
す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ａ）最大15個のアミノ酸の鎖長を有し、その
   末端基が主としてグリシン及びアラニンであり、
   2000Dより小さい分子量を有する低分子蛋白質及
   び／又はオリゴペプチドからなる画分子及びｂ）
   臓器特異性のオリゴペプチドと会合しているリボ
   フラビンを含有する黄色画分を含有し、ここで画
   分ａ）は、プロテアーゼ含有水を用いる胸腺の抽
   出、この水を用いて得られた抽出物のフエノール
   による抽出、フエノール相からのエタノールを用
   いる沈澱により得たものであり、画分ｂ）は、画
   分ａ）の濾液をAl₂O₃カラムに通し、溶離液とし
   て水を用いるクロマトグラフイにかけ、この溶離
   液から蒸発濃縮により得たものであることを特徴
   とする、胸腺抽出物より成る免疫不全症候群治療
   用医薬組成物。 ２ 低分子蛋白質及び／又はオリゴペプチドより
   成る画分ａ）は、遊離又は結合形のアミノ酸、シ
   ステインスルホン酸、アルパラギン酸、スレオニ
   ン、セリン、グルタミン酸、プロリン、グリシ
   ン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシ
   ン、チロシン、フエニルアラニン、リジン、ヒス
   チジン及びアルギニン及び加水分解可能なアミノ
   酸少なくとも75重量％を含有する、特許請求の範
   囲第１項記載の医薬組成物。