JPH05505616A - 天然のコンホメーションを保持している精製ｇｐ１２０組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 天然のコンホメーションを保持している精製ａｐ１２０組成物技術分野 本発明は、一般に、タンパク質の精製の分野に関し、より詳しくはワクチンの生 産において有用な旧Ｖ−１由来抗原の精製に関する。

前景 ）１１Ｖ−１に対するワクチンをつくる試みは、ＨＩＶ−１に対して血清陽性で あるヒトの免疫応答に類似するかまたは同等の免疫応答を動物において達成する という基準により判断すると、制限された成功に直面する。従来達成されていな い主要な目標は、感染した個体からのヒト血清中に認められるレベルと複雑性の 両方に達する力価において、試験管内でウィルス中和性である抗体（すなわち、 複数の単離物を中和する能力）の生産であった。ヒトの中和性抗体はすべて、エ ンベロープタンパク質、ｇｐ１６０　、またはその構成部分（ｇｐ１２０または ｇｐ４１）にマツピングされ、よって大部分のワクチンの努力はエンベロープタ ンパク質関連抗原の開発に集中している。

このような抗原の５つの型が開発された：（１）Ｈｒｖ惑染した組織培養細胞か ら誘導された精製ｇｐ１２０　（本明細書中では「ウィルス由来ｇｐ１２０　Ｊ と呼称する）；　（２）＆ｌｌ換えウィルス、例えば、ワクシニアまたはバキエ ロウイルスに感染した細胞中で作られるｇＰ１２０（「生ウイルスベクター由来 ｇｐ１２０およびｇｐ１６０　Ｊと呼称する）；（３）哺乳動物細胞の中で作ら れた組換えｇｐ１２０　（ｒ組換え哺乳動物ｇｐ１２０　Ｊ　、時には不正確に 組換え生来ｇｐ１２０と呼称する）；　（４）ｇｐｔ２ｏおよびｇｐ４１の全部 または種々の部分を表す、組換え変性ポリペプチド（「岨換え変性抗原」）；お よび（５）　ｇｐ１２０およびｇｐ４１の小セグメントを表すペプチド（「ペプ チド」）。

免疫原性実験はこれらの型の抗原のすべてに関して完結され、かなり均一な結果 が得られている。一般に、抗原は様々な種においてアジュバント添加すると高度 に抗原性である。それらはＨＩＶ−１の相同性単離物を中和することができる抗 体を産生じたが、非相同性単離物を貧弱に中和するかあるいは全く中和しない、 中和のレベルは、また、感染したヒトにおいて見いだされる中和力価レベルに（ 一般に）到達しなかった。

例えば、ウィルスから精製されたまたは遺伝子操作された哺乳動物細胞により産 生された完全にグリコジル化された天然のｇｐ１２０、酵母中で産生された非グ リコジル化ｇｐ１２０　、およびＥ、コリ中で産生されたｇｐ１２０の断片は、 すべて、実験動物においてＩＩＩＶ−１中和性抗体を惹起せしめることができる 。大部分について、ウィルス粒子または組換えｇｐ１２０抗原で免疫処１した動 物の応答は、ｇｐ１２０抗原が由来するウィルス単ｗｉ物のみを中和する際に有 効である。１つの例外はＢｅｒｍａｎら（下の参考文献１）の研究であり、遺伝 子操作したチャイニーズハムスター卵巣細胞により分泌された精製された組換え 旧Ｌｌ　ｇｐ１２０がチンパンジーにおいて群特異的中和性抗体を惹起したこと を示す研究である。

）１１Ｖ−１ワクチンを調製する時にとくに困難であった他の要因は配列多様性 である。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２は、エンベロープのｇｐ１２０部分におい て最も顕著である非常に高レベルの配列多様性を有することによって特徴づけら れる。この配列多様性は、超可変領域として知られる領域に密集する０種々のＨ ＩＶ単離物から誘導された抗原物質を含むワクチンカクテルを使用して、広範囲 の感染源に対する保護を提供することを、多数のグループが提案している。

従って、ＨＩＶ−１ウィルス粒子上に提示されるとき、ｇｐ１２０の免疫学的お よび他のタンパク譬／タンパク質結合特性を有する抗原物質が必要とされている 。特に、好ましくは、種々の野外単離物に対して中和抗体を誘発する単一の根本 材料を使用して、中和抗体を誘発することができる抗原物質が非常に望ましい。

関連文献 次の刊行物はすべて、上述の５つの型のワクチン候補に関する：（１）　Ｂｅｒ ｍａｎら、”Ｈｕｍａｎ　ｆｓｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ　Ｔｙ ｐｅ　Ｉ　ＣｈａｔＩｅｎｇｅ　ｏｒ　Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ　ｆｓｕｎｉｚ ｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ　Ｅｎｖｅｌｏｐｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏ ｔｅｉｎ　ｇｐ１２０．　”　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ （１９８８）８５：５２００−５２０４；（２）　Ｂｅｒｖａｎら、”Ｅｘｐｒ ｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｘｔ ｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｕ＋ｗａｎ　ｆｍｕｎ ｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　ＩＥｎｖｅｌｏｐｅ　Ｇｌｙ ｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ｇｐ１６０．”Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ　（１ ９８９）６３：３４８９−３４９８； （３）　Ｎａｒａら、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｅｎｖｅｌｏｐｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏ ｔｅｔｎｓ　ｆｒｏｍ　［ｆｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉ ｒｕｓ　Ｔｙｐｅ　Ｉ　Ｖａｒｉａｎｃｅ　Ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｉｎｄｉｖｉｄｕ ａｌ。

Ｔｙｐｅ−５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ ｓ＋”　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ　（１９８８）録：　２６２２−２ ６２８　；（４）　Ａｒｔｈｕｒら、”Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎ ｓｅｓ　ｉｎ　Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ　Ｉｎ。

ｃｕｌａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｈｕｍａｎ　Ｉ＋ｗｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ 　Ｖｉｒｕｓ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ（ｇｐ１２０）Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｖａ ｃｃｉｎｅ、”　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、［ｌ５Ａ（１９８７ ）８４：８５８３−８５８７；（５）　Ｅｖａｎｓ　ら、’Ａｎ　Ｅｎｇｉｎｅ ｅｒｅｄ　Ｐｏ１ｉｏ　Ｖｉｒｕｓ　Ｃｈｉ＋５ａｅｒａ　Ｅｌｉｃｉｔｓ　Ｂ ｒｏａｄｌｙ　Ｒｅａｃｔｉｖｅ　ＨＩＶ−Ｉ　Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　Ａ ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、″　Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）影巴：　３８５−３８８゜ （６）　Ｂａｒｒｅｔｔ　ら、Ｌａｒｇｅ−５ｃａｌｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉ。

ｎ　ｏｆ　ａ　Ｖａｃｃｉｎｉａ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ　 ）ｌｒＶ−１ｇｐ１６０　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ　ｉｔｓ　ｆａ＋ｕｎ ｏｇｅｎｉｃｉｔｙ、’　ＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　 Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ並（１９８９）互：　１５９−１７１；（７）Ｅａｒｌら 、“ｌ５ｏｌａｔｅ−ａｎｄ　Ｇｒｏｕｐ−５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｉｍｓ＋ｕｎｅ 　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅｔｏ　ｔｈｅ　Ｅｎｖｅｌｏｐｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　 ｆｌｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ　Ｉｎｄｕｃｅ ｄ　ｂｙ　ａ　Ｌｉｖｅ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｖａｃｃｉｎｉａ　Ｖｉｒ ｕｓ　ｉｎ　Ｍａｃａｑｕｅｓ、”　ＡＩＤＳＲｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｈｕ ｎａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９８９）５　：　２３−３２；（８）　 Ｐｕｔｎｅｙら、”ＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ−Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　Ａ ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔ。

ａｎ　Ｅ、ｃｏｌｉ−ｐｒｄｕｃｅｄ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｖｉ ｒｕｓ　Ｅｎｖｅｌｏｐｅ＋　”　５ｃｉｅｎｃｅ（１９８６）階３４　：　１ ３９２−１３９５；（９）　Ｓｔｅｉｍｅｒ　ら、”Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　 Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　Ｈｕｍａｎ　ｆｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｅｎｖ ｅｌｏｐｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｐ１２０　Ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｉｎ 　Ｙｅａｓｔ　ｉｓ　ｔｈｅＴａｒｇｅｔ　ｏｆ　Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　 Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、”Ｖａｃｃｉｎｅｓ　８７（１９８７）２３６−２４１ ； （１０）　Ｓｔｅｉｍｅｒ　ら、−Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｎｖ　ａｎｄ　 ＬＬ！Ｌ　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅｓｉｎ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ　Ｈ ＩＶ−１−Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’”　Ｖａｃｃｉ ｎｅｓ　８旦（１９８８）　３４７−３５５　； （１１）Ｈｏら、”Ｈｕｍａｎ　ｌ５ｎｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕ ｓ　ＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ　５ ｅｖｅｒａｌ　Ｃｏｎ５ｅｒｖｅｄ　Ｄｏｍａｉｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｅｎｖｅ ｌ。

ｐｅ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ、　”　Ｊｏｕｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏ 　（１９８７）６１：２０２４−２０２８；および （１２）　Ｐａ１ｋｅｒら、“Ｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｎｅｕｔｒａｌｉ ｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｕｗａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ 　Ｖｉｒｕｓ　ｗＨｈ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　ｅｎｖ−Ｅｎｃｏｄｅｄ 　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　”　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ（１９８８）８５１９３２−１９３６゜発明の要約 本発明の目的は、天然のウィルス■ＩＶ　ｇｐ１２０と実質的に同じタンパク質 ／タンパク譬結合特性を有する糖ペプチドを提供するような［Ｖ　ｇｐ１２０の 精製方法を提供することである。

本発明の目的はまた、精製された全長の（組換え体ならば非融合の）　ＨＩＶ　 ｇｐ１２０　ｍタンパク質を含んで成り、その分子の大部分がＦＢＩＶウィルス 上に提示されるｇｐ１２０と実質的に同じのタンパク質／タンパク質相互作用特 性を有する、組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、多数の旧ｖ　＊＊＊による感染を中和することができる抗 体の形成を刺激する方法を提供することである。

本発明の更に他の目的は、哺乳動物被検体に投与した時、種々の源からＨＩｖウ ィルスによる感染に対するその被検体の感受性を減少させるワクチン組成物を提 供することである。

本発明の更なる目的は、旧Ｖ−１に感染しだ哺乳動物被検体に投与した時に治療 効果を有するワクチン組成物を提供することである。

本発明のこれらおよび他の目的は、以後一層明らかとなるように、１つの実施Ｂ 様では、全長の非融合のグリコジル化ｇｐ１２０タンパク質を含有する媒質から ａｐ１２０を精製する方法であって、（１）イオン交換クロマトグラフィー、（ ２）疎水的相互作用クロマトグラフィー、および（３）サイズ排除濾過（サイズ 排除クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィー）を使ってｇｐ１２ ０含有媒質を順次分画し、各段階においてＣＤ４ペプチドに対して特異的結合親 和力を示す両分を集めることを含んで成る方法により達成される。これらの技術 から精製段階を選択しそしてアフィニティークロマトグラフィーおよび逆相ｆｌ ＰＬｃを回避することによって、変性されていないか、あるいは苛酷な溶媒条件 、例えば、ｇｐ１２０に対して高い特異的親和力を有する抗体または他の結合性 分子を使用するアフィニティークロマトグラフィーにおいて起こるであろう溶媒 条件に暴露されていない、精製８１１１２０分子を得ることが可能である０本発 明のｇｐ１２０は、コンホメーション保持されたｇｐ１２０と呼び、ウィルス粒 子により提示されたとき、従来入手可能であったよりも天然のｇｐ１２０に一層 宏接に類似するＣＤ４　レセプターへの結合特性を保持している。

よって、本発明の他の実施態様は、ｇｐ１２０の大部分がコンホメーション保持 されたｇｐ１２０である、ｇｐｉ２ｏを含んで成る組成物である。

本発明の追加の実施態様は、免疫学的方法、例えば、抗１（ＩＶ抗体についての イムノアンセイ、抗ＨＩＶ抗血清の生産およびワクチンにおける、改良されたａ ｐ１２０　Ｍ酸物の利用を包含する。

図面の説明 本発明は、本明細書の部分である図面と組み合わせて次の特定の実施！！様の説 明を参照することによって、より一層理解されるであろう。

第１図は、組換えＨＩＶ−１ｇｐ１２０　（ｒｇｐ１２０）の生産のための例示 的発現プラスミドの略図である。

第２図は、指摘した定常（Ｃ）および可変（Ｄ）　領域をもつ種々のＦＩＩＶ− １単離物についての整列されたアミノ酸配列の表である。　ＨＸＢ２配列につい ての潜在的Ｎ−結合グリコシル化部位のみを［］により示す；システィン残基は この図面においてそれらの上に＊を有する。この配列データは、Ｈｕｍａｎ　Ｒ ｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　ＡＴ口Ｓ　１９８８．Ａ　Ｃｏｗｐｉｌａｔ ｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　ａｎｄ 　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ１ｄ　５ｅｑｕｓｎｃｅｓ、Ｇｅｒａｌｄ　Ｍｙｅｒｓ　ら 、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　 Ｇｒｏｕｐ発行、Ｔ−１０、メイルストップに７１０．ロスアラモスナショナル ラボラトリーズ、ロスアラモス、ニューメキシコ、８７５４５　、同し発行元に より発行された１９８９年版も存在する。

第３Ａ図は、精製段階においてフェニルＨＩＣカラムを使って得られた生成物画 分を示すグラフである。

第３Ｂ図は、精製段階においてエーテルＨＩＣカラムを使って得られた生成物画 分を示すグラフである。

第３Ｃ図は、精製段階においてゲル濾過クロマトグラフィーを使って得られた生 成物画分を示すグラフである。

第４図は、ゲル濾過ＨＰＬＣを使ったＣＤ４−ｇｐ１２０複合体の形成を示すグ ラフである。

第５図は、０．５．６，７．８および９回のｇｐ１２０での免疫処置後に分析し た、ヒビ２９６４血清からのＨＩＶ−ＺＲ６中和データを示すグラフである。

第６図は、実施例６の免疫処理ヒヒ２９５８およびｇｐ１２０免疫処置ヒヒ２９ ６４からの全血清試料の中和力価を示す１組のグラフである。

第７図は、霊長類の中断された免疫処置計画の略図である。

特定の実施態様の説明 精製の一般原理 本発明は、一部分、従来の精製技術からアフィニティークロマトグラフィーを排 除すると、より優れたＣＤ４結合特性をもつｇｐ１２０　＄１１ペプチドが生成 することを実証した本発明者らの実験室における研究から端を発した。アフィニ ティー精製は、従来、高純度が要求されるワクチンに使用するｇｐ１２０の精製 において必須であると考えられていた。

アフィニティークロマトグラフィーおよび他の型のアフィニティー分離技術は、 あるタンパク質が見い出される媒質中に存在する他の分子からそのタンパク質を 分離するために、抗体とタンパク質との間（またはレクチンと環タンパク質との 間）の強力で且つ特異的な結合相互作用に鯨る。次いで、適当な技術、例えば、 溶出媒質のイオン強度またはｐＨの変化を使用してタンパク質から抗体を解離さ せ、こうして抗体が取り付けられたカラムまたは他の支持材料から他の汚染タン パク質を洗浄除去した後、精製されたタンパク質を得ることができる。アフィニ ティークロマトグラフィーは生化学分野において２０年以上の間利用されている が、その使用は１９７０年代の初期に高特異性のモノクローナル抗体の出現と共 に急激に増加した。この技術の概観については、Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、酋■江 旺」旦堕聾１ｓｔｒ　：Ａ　１ｉｃａｔｉｏｎｓ　ｔｏ　Ｂｉｏｃｈｅｓｉｓｔ ｒ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　＋第２版、　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅ ｌｌａｎ　＆　Ｃｏ、、サンフランシスコ、　１９８２．ｐｐ、２５７−２６２ を参照のこと。

しかしながら、本発明者らは、ｇｐ１２０分子の精製にアフィニティークロマト グラフィーを使用すると、明らかなコンホメーション変化が結合／除去の２段階 法において起こり、その結果生ずるｇｐ１２０タンパク質は精製されるが、抗体 形成を誘発することまたはタンパク質／タンパク質結合相互作用、例えばＣＤ４ 分子との結合を行うことについてウィルスｇｐ１２０分子と同じエピトープを提 示しないことを発見した。こうして、アフィニティー精製されたａｐ１２０は、 ウィルス粒子により提示されると、このように精製されたタンパク質を、例えば 効率的なワクチンにおいて望ましい程度の中和抗体の誘発に使用できるようにす るのに十分な程はｇｐ１２０に類似しない。

認識されるように、特定の性質、例えば、ＣＤ４へ結合する能力または無能力を 有するとしてｇｐ１２０の特定組成物を論することは、全体としての組成物であ って、分子レベルで組成物中の各ｇｐ１２０分子それぞれの性質を意味するので はない。例えば、発表された技術を使って精製されたｇｐ１２０の組成物は、Ｉ （ＩＶ−１ウイルス上に提示されると、天然ｇｐ１２０のＣＤ４結合能力の例え ば１０％を有するとして、ｇｐ１２０の組成物を言及することができる。このこ とは、各分子の結合親和力は９０％減少されているが、幾つかの分子はそれらの もとのコンホメーションおよび結合親和性を保持し、分子の大部分は何らかの方 法で変更されており（例えば、コンホメーションが変化している）、その結果そ れらはそれらの結合親和力の全部または一部分を損失している可能性が多いこと を意味し得る。従って、異なる性質を有する種々のａｐ１２０分子がｇｐ１２０ 組成物中に存在するようであり、そして天然の結合特性を保持する際の精製技術 の有効性は全体としての組成物の結合特性により最もよく判断される。

本発明者らは、旧Ｖ　ｇｐ１２０を精製して、天然のウィルスＨＩＶ　ｇｐ１２ ０と実質的に同じタンパク質／タンパク質結合特性（特にＣＯ２結合）を有する 糖ペプチド組成物を提供できることを発見した。本発明の組成物では、分子の５ ０％以上、好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上がＣＤ４分子への 結合を可能にするコンホメーションを有するが、これに対して、いくつかの発表 された技術により生成された未精製の組成物では、その比率はｇｐ１２０の約１ ０％以下である。

本発明の方法は、ｇｐ１２０源、例えば、８２１２０分子がその中に分泌されて いる細胞培地または細胞もしくはウィルス溶解物を使って開始する０本発明は、 細胞培地中に分泌された全長の非融合のグリコジル化組換えｇｐ１２０タンパク 質を、天然のコンホメーシヨンを保持している純粋な形態で提供するために、お よび精製するために、特に有用である。ここで「組換えｇｐ１２０タンパク質」 とは、トランスフェクション、染色体挿入、プラスミドの保持、またはタンパク 質を発現する他の手段の結果として、細胞が適当なｇｐ１２０遺伝子を含有する かどうかにかかわらず、非ＨＩＶ　ｉ染細胞により生産されるタンパク質を意味 する。しかしながら、ウィルス源からのｇｐ１２０　も使用することができる。

ｇｐ１２０を含有するもとの粗組酸物の調製は本発明のより広い観点の一部分で はない。なぜなら、ｇｐ１２０は組換えおよびウィルス源の両方から以前に調製 されているからである。従って、ｇ１１１２０源の説明は、本発明の好ましい実 施態様を説明する本明細書の後の章まで延長する。

アフィニティークロマトグラフィー（および逆相ＨＰＬＣまたは有機溶媒を使用 する他の技術）を、８２１２０分子の所望のコンホメーションを破壊しない分離 技術で置き換えることが必要である。驚くべきことに、疎水的相互作用クロマト グラフィー（ＨＩＣ）は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマ トグラフィーと組み合わせて使用すると、所望の精製を提供することが発見され た。この発見は予期せざることであった。なぜなら、ｇｐ１２０は２２個の既知 のグリコジル化部位をもつ糖タンパク質であって高度に親水性（疎水性というよ りも）であると予想されるからである。ｇｐ１２０は、ＨＩＣ精製段階を使って 汚染物からの良好な分離を可能にするのに十分な少な（とも１つの疎水性領域を 有することが発見された。例えば、はぼ１０倍の精製がフェニルＨＩＣカラムに より達成された。

第３Ａ図は、ｇｐ１２０がこのカラムから溶出する最後の百分であったことを示 す、アミノ酸配列中に疎水性領域が存在することは従来知られている（疎水性プ ロットから）が、ＨＩＣを使用してｇｐ１２０を他のタンパク質から分離するこ とを可能にするのに十分な疎水性がグリコジル化後に保持されることは知られて ぃながったし示唆されていなかった。

精製方法の各段階を下に詳細に記載する。一般に、精製方法は、典型的には水お よび他の小さい分子を除去することにより、細胞培地または他のｇｐ１２０源を 濃縮してｇｐ１２０の濃度を増加させ、；濃縮された細胞培地をイオン交換材料 により分画し、そしてＣＤ４ペプチドに対する特異的結合親和力を示す画分を集 め；この第１分画を疎水的相互作用クロマトグラフィー（好ましくは２つのＨＩ Ｃ段階）により分画して、適切なＣＯ２結合親和力を示す第２画分を提供し；そ して第２分画をサイズ排除濾過またはクロマトグラフィーにより分画して所望の 精製されたタンパク質を提供することを含んで成る。

この説明は、一般に、細胞培地が最も普通の源であるので、細胞培地をｇｐ１２ ０　ａと呼ぶ。しかしながら、ｇｐｉ２ｏの他の源を細胞培地と互換的に使用す ることができる。

濃縮段階は、種々の源から多数のタンパク質を精製する、すなわち、細胞培地か ら水および他の小さい分子を除去することによって次の精製段階を比較的少量の 材料上で実施できるようにするのに使用される通常の最初の段階である。従って 、種々のサイズ分画技術のいずれも使用することができる。透析および限外濾過 が好ましい技術である。最初の濃縮段階は、単に水または他の小分子、例えば１ ．０００以下の分子量を有する分子を除去することができるか、あるいは８２１ ２０分子より小さい分子の一部または実質的に全部を除去する技術を使用するこ とができる。例えば、種々のカットオフ値、例えば１０，０００．２０，０００ ．３０，０００．５０，０００または１００，０００の分子量カットオフ値を有 する膜を使って限外濾過を実施することができる。

１０．０００〜５０，０００の範囲、好ましくは約３０，０００の分子量カット オフが好ましい。

細胞培地を４縮して小分子を排除した後、カットオフサイズより大きい分子を含 有する濃縮された細胞培地をイオン交換材料により分画する。異なる源からのペ プチドは、電荷が異なるために、イオン交換分画時に異なって挙動することがあ る。例えば、ＨＩＶ−ＳＦ２単離物から本来分離された遺伝１！ｙＪ質を使って 得られたｇｐ１２０はＩＩＥＡＥセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　）カラム 上にＯ、ｌ　ＭＮａＣ１中ｐＨ８において保持されないが、単離物ＨＩＶ−ＨＴ ＬＶ−，Ｉ［［Ｂからのｇｐ１２０は同一条件下でカラムに結合し、そして０． １〜０　、　５　ＭＮａＣｌの塩勾配で溶出させることができる。しかしながら 、特定の８２１２０分子がカラムへ付くかどうか重要ではない。なぜなら、溶離 を包含するイオン交換工程は免疫学的または他のタンパクｆ／タンパク質結合特 性に悪影響を及ぼさないように思えるからである。

イオン交換段階は単一段階であるかまたは２以上の段階に分割することができる 。アニオン交換樹脂での処理は少なくとも１つの副段階に（あるいは唯一のイオ ン交換段階として）好ましい。アニオン交換体は、典型的には芳香族または脂肪 族アミノ基を含み、そしてＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ　（これはジエチルアミ ノエチル置換デキストランである）、またはＡＧ−３（これはエポキシアミン樹 脂上に第３７ミノ置換基を有する）を包含する。これらの弱塩基性物質の代替物 として、完全な正電荷を示す第四アンモニウムイオンおよび他の交換体、例えば Ｑ−３ＥＰＨＡＲＯ５Ｅ−１４Ｐ　Ｃセファロースカラムに結合した第四アンモ ニウムイオンを有するＰｈａｒｍａｃ＋ａの製品）を使用することができる。

アニオン交換段階には、典型的にはｐＨ７〜９範囲、好ましくは約１）Ｈ８の緩 衝液が使われる。典型的な緩衝液の例は、０．０２ＭＴｒｉＳである。イオン強 度は通常約０．０５〜０．　２Ｍ　（ＮａＣ１として表示）の範囲、好ましくは 約０．１Ｍである。制御すべき他の条件としては、温度（例えば、約０〜２５° Ｃ）、カラムに適用する物質の紀伝導度（例えば、約１５＋ｗＳ−ＣＩ）　、お よびタンパク質負荷容量／樹脂容量の比（例えば、約１５〜２０ｇ／Ｌ）が挙げ られる。これらの値はＤＥＡＥ−５ＥＰＨＡＤＥＸカラムについて好ましい値で あり、製造業者の指示に従い他のカラム材料について変化させることができる。

あるいは、細胞培地は、弱または強酸性交換基、例えばそれぞれカルボン酸また はスルホン酸の基を使ったカチオン交換クロマトグラフィーにより、精製するこ とができるが、このような分離はアニオン交換体の使用より好ましくない。典型 的な強酸性系、例えばスルホプロピルイオン交換樹脂、例えば５Ｐ−３ＥＰＨＡ ＤＥＸを使用することができる、　ｇｐ１２０を含有する細胞培地を添加し、そ して典型的にはｐＨ約６〜約８の範囲、好ましくはｐｔｔ約７において溶離する 。他の条件はアニオン交換カラムについて使用条件に類領する。

所望のａｐ１２０分子を含有する画分は、ｇｐ１２０を同定する多数の既知技術 、例えば抗体による認識、ＣＤ４ペプチドによる結合、またはＳＤＳゲル電気泳 動のいずれによっても同定することができる。ｇｐ１２０分子を含有する両分は 、各百分から取ったアリコートにおいて分析を行うことによって同定することが できる。分画パターンを確立した後、試験しないで両分を集めることができるよ うにイオン交換操作を十分に反復する。本発明の各新規段階をこの方法に組み込 むとき、ＣＤ４結合を、その各段階についてチェックし、そしてＣＤ４結合を使 用して、本明細書中に記載する特定の好ましい条件からの任意の変更（例えば、 カラム支持材料、温度、緩衝液などを変える）が本発明の範囲内のｇｐ１２０　 ｍ酸物を提供するかどうかを確かめることができる。ＣＤ４とｇｐ１２０との間 の結合の測定についての追加の詳細を、本明細書の後の節に記載する。

ｇｐ１２０について最も明確な試験はＣＤ４ペプチドの結合である。ＣＤ４ペプ チドへの結合は、典型的には、下の実施例に記載するような放射性免疫沈澱また はゲル濾過ＨＰＬＣにより確かめることができる。　ｇｐ１２０物質を含有する 両分を、個々にまたは画分を一緒にした後に精製し、後の精製段階に使用するプ ールした材料を提供することができる。

特定の両分中のＣＤ４ペプチドに結合するａｐ１２０分子の能力について一般に 言及するが、このような言語の使用はＣＤ４ペプチドについての実際の結合アン セイを各段階において実施することを意味しない。むしろ、この言語は、この段 階か異なる段階についてかいずれにせよ、ＣＤ４ペプチドに結合するｇｐ１２０ の能力が分離技術のいずれかの段階において損失されないようにその状態が維持 されることを指摘するために用いられる。

次の精製段階は疎水的相互作用クロマトグラフィーを包含し、この場合、カラム を通る分子の通過はカラム支持材料（または支持材料に結合した物質）と分画さ れている分子との間の疎水的相互作用により遅延される。このような分画方法の 典型的な例は、疎水性カラムを使う高性能液体クロマトグラフィー法である。典 型的なカラムはエーテルＨＩＣカラムまたはフェニルＨＩＣカラムである。エー テルＨＩＣカラムはカラム支持体にエーテル結合により結合した脂肪族基を含有 し、フェニルＨＩＣカラムは支持体に結合したフェニル基を含有する。ＨＩＣ技 術の当業者が理解するように、カラムへの試料の添加および溶離は、該カラムに 使用する樹脂表面に、分離されている物質を「粘着（ｓｔｉｃｋ　）　Ｊさせる のに十分なイオン強度（ある分子にはゼロであってもよい）を有する溶液を使っ て行われる。溶離液のイオン強度を下げる（すなわち、溶離液中の塩濃度を下げ る）と、疎水性物質がカラムにより保持される傾向が減少する。

典型的なｇｐ１２０の精製では、イオン交換クロマトグラフィーにより得られた 画分を硫酸アンモニウム中３５〜４５％、好ましくは約４０％飽和にし、そして 不溶物を遠心により除去した後、上清をＨ■Ｃカラムに適用する。例えば、４０ ％飽和硫酸アンモニウムでイオン交換クロマトグラフィー画分を処理することは 、該方法のこの時点で多少の汚染タンパク質を沈澱させるのに有用であるが、そ れは要求されない。ｇｐ１２０分子それ自体は、今日まで試験した単離物の全て の株および突然変異体について、４０％飽和硫酸アンモニウム中で沈澱しない。

他の単離物からのｇｐ１２０が万一４０％硫酸アンモニウムで沈澱するならば、 ａｐ１２０を沈澱させるのに必要なものより低いがｇｐ１２０をＨＩＣカラムに 結合させるイオン強度を与える程十分に高い濃度を選択することができる。必要 に応じて、他の塩を硫酸アンモニウムの代わりに使用することができる。この節 において説明する塩濃度は例示であり、この分野で知られているように、流速、 温度および溶出時間を変化させることによって他の塩および塩濃度を使用するこ とができる。硫酸アンモニウムは、高濃度で存在するとタンパク質構造を安定化 するので、好ましい。

種々の疎水的相互作用クロマトグラフィーを使用することができ、そして本発明 は特定の樹脂に限定されない。典型的なＨＩＣカラムの例としては、ブチル（ｂ ｕｔｙｌ　Ｆｏｙｏ　Ｐｅｒｌ、Ｔｏｙｏ　５ｏｄａ　）　、、オクチル（ｏｃ ｔｙｌ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）およびフェニル（Ｐｈｅ ｎｙ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）が挙げられる。イオン交換 クロマトグラフィーと同様、疎水的相互作用に基づく分離はタンパク質のコンホ メーションに悪影響を及ぼすとは思われない。

それらのカラムを使用する条件は、当業界において知られているように特定のカ ラムによって変化する。典型的な条件としては次のものが挙げられる：ｐＦＩ約 ５〜約７（例えば、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０）；約０．　０５〜 ２．　０Ｍ　（ＮａＣ１として表示）、好ましくは０．１Ｍのイオン強度；およ び４０％硫酸アンモニウム（または前述のような種々の初期濃度）から０％硫酸 アンモニウムまで減少する勾配を使った溶出。

単−ＨＩＣ段階を使用することができるが、少なくとも２つのＨＩＣ副段階が好 ましく、好ましくは異なるＨＩＣ支持体（例えば、フェニルＨＴＣカラム上での 分離に次いでエーテルＨＩＣカラム上での分離）を使用する。しかしながら、同 一カラム（例えば、フェニルＨＩＣカラム）上での２回の分離を使用することが できる。既知の技術を使って条件を調節して、所望の活性を有するタンパク質の ピークをイオン交換クロマトグラフィーにより精製された百分中になお存在する 別のタンパク質含有ピークから分離するのに備えることができる。上記と同様、 所望の活性を含有する画分を集め、そしてそのような活性を含まない両分から分 離する。

疎水的相互作用クロマトグラフィーから得られた所望の活性を含有する画分を、 ゲル濾過（ゲル浸透クロマトグラフィーとしても知られており、ゲル濾過ＨＰＬ Ｃ技術を包含する）にかける、純度がＨＩＣ後十分である場合、最後のＨＩＣカ ラムからの溶出液をゲル濾過カラムに直接適用することができる。純度はゲル電 気泳動およびクーマシーブルー染色により測定され、そして少なくとも５％、で あるべきである。しかしながら、所望のレベルの純度がこの段階で達成されない 場合、ＨＩＣ溶出液をゲル濾過前にイオン交換クロマトグラフィーにかけること によって本発明の方法を実施することができる。非効率的な発現系を使用した結 果初期の細胞培地が他のタンパク質と比較して比較的少量のｇ９１２０を含有す る場合、この膜支持体を使用するＨＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーは、高 い効能のアニオン交換樹脂を用いるイオン交換または中圧クロマトグラフィー、 例えばＰｈａｒｍａｃｉａのＱ−セファロース高性能クロマトグラフィーがこの 段階において必要である場合、特に好ましい。

精製工程のこの時点において（すなわち、ＨＩＣおよび、必要ならば第２イオン 交換段階後）、除去され得る不純物は大部分が低分子量不純物である。同じく、 使用する特定の材料および条件は特に制限されない。デキストラン、ポリアクリ ルアミドまたはアガロースゲルはすべて使用することができる。ＩＯＫ〜５００ Ｋ、好ましくは５０に〜２００にの分子量分画範囲を典型的には選択する。

ＨＰＬＣとともに使われる特に好ましいカラムは５ＵＰＥＲＤＥＸ　２００　（ Ｐｈａｒ＋＋ａｃｉａ　）である。それの使用条件は、典型的には０、ＩＭのリ ン酸ナトリウム、ｐＨ６，７である。ゲル排除クロマトグラフィーは、中和抗体 の形成の誘発に必要な１ビトーブの提示に悪影響を及ぼすとは思われない。

プロティンＧのアフィニティー精製は、末法の任意の段階において、例えばイオ ン交換クロマトグラフィー後およびＨＩＣ前に実施して、当業界において知られ ているようにＩｇＧ汚染を減少または排除することができる。プロティンＧのア フィニティー精製を実施する適当な方法は当業界において知られており、そして アフィニティーカラム、例えばプロティンＧセファロースファーストフロー（Ｆ ａｓｔ　Ｆｌｏｗ　）　、Ｐｈａｒｍａｃｉａなどの使用を包含する。非限定的 例により、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７を使用することができるが、 任意の常用の緩衝液を使用することができる。

前述の精製段階のすべてにおいて、分離段階により生成した画分の収集および取 り扱いの間を包含する、変性を最小にするように条件を維持すべきである。した がって、すべての溶液のｐＨは約４〜約９、好ましくは５〜８の範囲であるべき である。イオン強度は、前述したようにより高いことがある硫酸アンモニウムを 除外して、０゜０２〜０．　５Ｍ　（ＮａＣ１当量）、好ましくは０．０５〜０ ．３Ｍであるべきである。温度は０〜２５°Ｃ１好ましくは２〜８°Ｃであるべ きである。洗浄剤および有機溶媒は完全に回避すべきである。

上記段階のいずれかにより得られた画分は、所望により限外濾過または他の４ｖ Ｍ技術により濃縮して溶媒および他の小分子を除去することができる。このよう な限外濾過は、一般に、ｇｐ１２０　ピークが数百分にわたって広がる時に起こ り得るように、分画工程がｇｐ１２０含有画分を希釈することがない限り、要求 されない。

要約すると、前述の精製手順は、ＣＤ４結合が低下しないことを保証するために 各新規段階後に試験することによって達せられた。タンパク質を変性条件、例え ば逆相および免疫アフィニティークロマトグラブイ−に暴露しＪ）る段階は回避 された。精製の多くは、硫酸アンモニウムの存在下での２つの異なる疎水性樹脂 へのｇｐ１２０の強い結合を活用するごとによって達成された。さらに、精製さ れたタンパク質は、０．ＩＭＮａＣＩ中で中性ｐａｌにおいて疎水的様式で、名 目上のゲルｉｔ過樹脂である５ｕｐｅｒｏｓｅ”　１２に強く結合した。この挙 動は、炭水化物の親水性およびｇｐ１２０が５０重量％以上炭水化物であるとい う事実から見て幾分驚くべきことであった。

生産手順は、ここに記載するように、４０Ｌスケール（４０Ｌの培養上清を使用 して出発する）で反復して実施した。この手順は、０．４Ｌから少なくとも２０ ０Ｌの細胞培養上清の範囲の適当な大きさのカラムを使用する、より小スケール およびより大スケールでも使用した。生産物の収率および純度はこの範囲のスケ ールに渡りほぼ一定であった。最近、細胞の生産は連続懸濁培養において実施さ れている。この改良はｇｐ１２０の大量生産を容易にする。出発材料として回転 瓶または連続培養上清を使った時、ロフト間での生産物の挙動の有意な差は検出 されなかった。

実際の精製方法の詳細な説明は下の実施例に記載する０本発明はその特定の実施 例に限定されないが、その実施例は本発明の範囲内に含まれる完全な分離のため の特定のパラメーターを示すことによって追加の手引を提供する。

精製方法により生成されたｇｐ１２０の特徴本発明の方法により生成されたａｐ １２０　糖タンパク質は、クーマシーブルー染色を使用するＳＤＳゲル電気泳動 により評価すると純粋であり、そしてＣＤ４結合アッセイにおいて完全な活性を 保持する。

はぼ９５％の純度のレベルが推定される。ここで純度とは他のタンパク質の不存 在を意味する。なぜなら、純粋なｇｐ１２０は、異なるｇｐ１２０分子で炭水化 物含量に差があるために、不拘ｉｒｍ酸物であるからである０本発明の精製方法 の生産物は、ウィルス源から得られるｇｐ１２０の天然のコンホメーションと区 別することができないように思われる。精製されたｇｐ１２０が本発明において 得られる物質のコンホメーションを有するかどうかを決定するために使用できる アッセイの特定の例は、下の実施例に記載されている。一般に、これらの試験は 、ＣＤ４結合、ゲル濾過ＨＰＬＣ（＃化条件下と還元条件下の両方）、およびｇ ｐ１２０特異的抗血清との反応を包含する。

他の研究者らは、ここに特定する以外の種々の技術により精製された組換えｇｐ １２０がＣＤ４　レセプターへの結合親和力の減少を示すことを報告している。

この結合親和力の減少の理由は確実には知られていないが、それは精製の間の分 子のコンホメーションの変化を表すと思われる１例えば、本発明者らがｇｐ１２ ０について最初に試みた１つの精製計画はアフィニティークロマトグラフィーお よび逆相ＨＰＬＣを使用した。その手順により精製された物質はほぼ８０％の純 度であり、そしてｇｐ１２０に特異的なモノクローナル抗体を使ったＥＬＩＳＡ アンセイにおいて期待した反応性レベルを示した。しかしながら、試験管内で測 定したＣＤ４　レセプターに対する結合活性はほぼ１／１０に下落した。本発明 の系は、従来入手可能なａｐ１２０と同程度の高さであるかあるいはそれより高 い純度であると同時に完全なＣＤ４結合活性を保持しているｇｐ１２０を提供す る。さらに、この精製技術は種当な収率の生産物を提供し、そしてａｐ１２０の 大量生産（数１００１ｇまたはそれ以上の範囲における）に適当である。アフィ ニティークロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＣのいずれも必要とせず、従って それらの精製に関連するコンホメーション変化（高イオン強度および有機溶媒と の接触により引き起こされる）を排除する。完全な活性はＥＬＩＳＡおよびＣＤ ４　レセプター結合アッセイにおいて観測された。精製された物質は、本明細書 中「コンホメーション保持されたｇｐ１２０の天然コンホメーション」と表示し 、ウィルス粒子上に提示されるとｇｐ１２０と識別不可能であるように見える。

例えば、ＨＩＶ−３Ｆ２から望まれるコンフォメーション保持したｍ換えｇｐ１ ２０は、うイルスの）ＩＩＶ−５Ｆ２　ｇｐ１２０と識別不可能であった。該タ ンパク質はＳＤＳゲル上で非常によく似た移動度を有した。それらは、アッセイ したすべての血清に関して、免疫沈澱、ウェスタンプロット、および面相捕捉ア ッセイにおいて同等の免疫反応性を示した。

精製されたタンパク質は還元または非還元ＳＤＳゲルにおいて１２０にの分子量 を示した；よってポリペプチド鎖は完全である。中性ｐＨの非変性緩衝液中での ゲル濾過ＨＰＬＣは１３０にの分子量推定値を与え、精製されたタンパク質がこ れらの条件下では凝集する傾向が少ないことを示した。このタンパク質は、いく つかのカラム上での挙動により明らかなように、驚くべき疎水性の性質を有した 。

ＣＤ４への組換えｇｐ１２０の結合をゲル濾過ＨＰＬＣアッセイにおいて直接研 究した。ウィルスｇｐ１２０と同様、ｇｐ１２０はＣＤ４に高親和力および１： １の化学量論で結合した。このアッセイにより測定すると、精製されたａｐ１２ ０分子の少なくとも９０％がＣＤ４に結合することができた。最後に、精製され たタンパク質はＣＤ４についてＨ６゜９ｎＭのに４を有する。この値はウィルス のｇｐ１２０および他の精製された調製物のＣＤ４　レセプターへの結合につい て測定された親和力の範囲内にある（Ｓｗｉ　ｔｈ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９ ８７）２３１：　１７０４およびＬａ５ｋｙら、釦旦（１９８７）剋：９７５参 照）。

精製のためのｇｐ１２０源 本発明の広い局面は、ｇｐｔ２ｏ分子を含有する源媒質を調製する段階を包含す る。組換え技術によるｇｐ１２０の調製はどこかに記載されており、例えば本明 細書の前景の項目において挙げた刊行物およびそれらの中に引用された刊行物中 に記載されている０本発明の技術は、異なるａｐ１２０分子を生産する異なるＨ ＩＶ単離物からの遺伝物質を含有する、種々の細胞系からのｇｐ１２０順化培地 に適用された。

非組換え源からのｇｐ１２０を使用することもできる（例えば、ウィルスに感染 した細胞系）。ｇｐ１２０の特定の源を下の実施例において同定し、そしてｇρ １２０の発現のための細胞培養の一般的説明を下記に記載するが、本発明はこの ような源に限定されない。

ＳＦ２−ｇｐ１２０は、本発明の精製方法を開発するためのモデルとして働いた 。幾つかの他のクローン化ｇｐ１２０遺伝子は、■ＩＶ−１の他の単離物並びに ｇｐ１２０遺伝子の試験管内突然変異誘発により作られた幾つかの変形について 入手可能である。例えば、１５の異なるＨＩＶ−１単離物（ＳＦ２．ＨＸＢ２． ＢＲＵ、ＭＮ、ＳＣ，ＮＹ５．ＣＤＣ４、ＷＭＪ２．ＲＦ、ＭＡＬ、ＥＬＩ、Ｚ ９６．Ｚ３．Ｚ３２１゜およびＪＹＩ）からのクローン化遺伝子によりコードさ れるアミノ酸の完全配列は、Ｍｙｅｒｓ　ら、Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕ ｓｅｓ　ａｎｄ　Ａｉｄｓ、１９９０（１９９０）、Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ、Ｎ ｅｉ＊　Ｍｅｘｃｏ：Ｌｏｓ　Ａｌａｓｏｓ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙに報告されており、その開示全体をここに引用によって加える。、７つ の配列（それらのうちの６つは９０１０２５６８に示されるものと異なる）は、 ｌ’１ｏｄｒｏ−ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　（１９８７）６１：５７０−５７８に 示されている。

５ｒｉｎｉｖａｓａｎら、Ｇｅｎｅｒ（１９８７）５２ニア１−８２は、ザイー ルにおいて単離された追加の旧Ｖ−１単難物の配列を報告している。これらの刊 行物の両者もここに引用によって加える。今日までの本発明者らの経験は、配列 およびアミノ酸組成がＳＦ２−ｇｐ１２０とかなり異なることがあるけれども、 本明細書に記載の方法が他の単１Ｗ１１ｆｆからのａｐ１２０タンパク質並びに 該遺伝子の突然変異形に使用できることを示した。

組換え源に加えて、ｇｐ１２０の天然ウィルス源を使用することができる。　！ （ＩＶを保有する細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ ｔｈｅ　Ａ＋ｗｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ ｎ）　（米国メリーランド州ロンクビル）から入手可能である（ＡＴＣＣＣＲＬ ８５４３）　。

この細胞系は米国特許４，５２０．１１３号に記載されている。他のウィルス単 離物は、Ｔｅｒｓｍｅｔｔｅ　ら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　（１９８８）６２：２２ ０６−２０３２およびＰＯｐｏｖｉｃ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２４ ：４９７−５００に記載されている。

組換え源は、生産が容易であり且つ活性ＨＩＶ−１ウィルスによる感染の危険を 回避するので好ましい、全長の組換えｇｐ１２０は、多数の既知発現系のいずれ かを使用して調製することができる。すべてのこのような系は成Ｐｇｐ１２０の アミノ酸のすべてをコードする指令を含有するであろう（例えば、ＳＦＺ中のｅ ｎｖ遺伝子のアミノ酸３０または３１〜５０９）。

ＨＩＶ　ｇｐ１２０核酸配列は、組換えＤＮＡ法により、例えばｍＲＮＡの逆転 写物をスクリーニングすることにより、あるいは任意の細胞からのゲノムライブ ラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。該ＤＮＡは、発表さ れた配列から常用技術およびＤＮＡ合成装置を使ってＤＮＡを合成することによ り得ることができる。

ユニーク制限部位をＤＮＡの調製時に導入することができ、それによってそうで なければ天然源中に存在しない制限部位を含有するベクター中での遺伝子の使用 を促進するため、合成が有利であろう。

さらに、ＤＮＡ中の任意の所望の部位の修飾を、突然変異誘発によりＤＮＡを更 に修飾する必要なしに、合成により導入することができる。

一船に、新規株からの旧Ｖ　ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするＤＮＡは、野 外または実験室単離物から得られたｍＲＮＡからｃ　ＤＮＡライブラリーを作製 し、そして（１）ｃＤＮＡライブラリー中の相同配列を含有するクローンを検出 するために、エンベロープタンパク質の部分をコードする［ｇｌＤＮＡプローブ を用いてスクリーニングし、あるいは（２）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を 使用してｃＤＮＡを増幅し、そして標識ＤＮＡプローブを用いてサブクローニン グおよびスクリーニングすることにより得ることができる。次いで、クローンを 制限酵素分析および核酸配列決定により分析して全長のクローンを同定し、全長 のクローンが該ライブラリーの中に存在しない場合には、適当な断片を種々のク ローンから回収し、そしてクローンに共通の制限部位でそれらを連結して、全長 の分子をコードするクローンを構築する。ＤＮＡプローブは、付随の実施例に記 載する遺伝物質から調製することができる。ＨＩＶ　ｇｐ１２０　ｃ　ＤＮＡの ５′末端から失われている配列は、鋳型としてｍＲＮＡを使用して旧Ｖ　ｇｐ１ ２０配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドの３′伸長（いわゆるプライマー伸 長）により得るすることができ、あるいは相同性配列を既知のｃＤＮＡから供給 することができる。

本発明の方法による精製のためのｇｐ１２０の生産は、特記しない限り、当業者 の技術の範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を使用す るであろう。このような技術は文献中に詳細に記載されている。例えば、Ｍａｎ ｉａｔｉｓ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ　＆　５ａｓｂｒｏｏｋ、　”Ｍ。

Ｉｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ” 第２版（１９８９）；　’ＤＮＡＣＩｏｎｉｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐ ｐｒｏａｃｈ、　’　Ｖｏｌ、　ＩおよびＩＩ　（Ｄ、Ｎ、Ｇｌｏｖｅｒ　＆Ｗ 、１９８５）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ″（Ｍ 、Ｊ、Ｇａ１ｔ　Ｗ、１９８４）　；“Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｉ（ｙｂｒ ｉｄｉｚａｔｉｏｎ″　（Ｂ、Ｄ、Ｈａｓｅｓ　＆　Ｓ、Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓ編 、　１９８５）；”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉ ｏｎ　″　（Ｂ、Ｄ、Ｈａｍｅｓ　！　Ｓ、Ｊ、Ｉ（ｉｇｇｉｎｓ［。

１９８４）；　”Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ″（Ｒ，１Ｆｒｅｓ ｈｎｅｙ　ｇ、１９８６）　；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　Ａｎｄ　 Ｅｎｚｙｓｅｓ　″（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ。

“＾Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　Ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ″（１９８４）を参照のこと。

本発明の方法による精製のための組換えｇｐ１２０の調製に使用する遺伝物質の 説明において、次の用語を下に記載する定義に従い使用する。

「レプリコン」は、生体内の自己ＤＮＡ複製単位として機能する、すなわち、そ れ自身の支配下で複製することができる、遺伝要素（例えば、プラスミド、染色 体、ウィルス）である。

「ベクター」は、他のＤＮＡセグメントを取り付けて、取り付けられたセグメン トの複製を引き起こすことができるレプリコン、例えばプラスミド、ファージま たはコスミドである。

ｒＤＮＡ分子」は、−末鎖形態または二本鎖らせんのデオキシリボヌクレオチド （アデニン、グアニン、チミジンおよび／またはシトシン）の重合形態を言う、 この用語は分子の一次および二次構造のみに対して言及し、それを特定の三次形 態に限定しない、従って、この用語は、特に直鎖状ＤＮＡ分子（例えば、制限断 片）、ウィルス、プラスミドおよび染色体の中に見いだされる二本鎖ＤＮＡを包 含する。特定の二本ｔ［ＤＮＡ分子の構造を論じる際には、配列はＤＮＡの非転 写類（すなわち、ｍＲＮＡに相同的な配列を有する鎖）に沿って５’−３’方向 において配列を与える通常の慣習に従い記載することができる。

ＤＮＡ　ｒコード配列」は、適当なｊｊ！！！ｆｊ配列の支配下に１かれたとき 、生体内で転写されポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード 配列の境界は、５′　（アミノ）末端の開始コドンおよび３′　（カルボキシ） 末端の翻訳終結コドンにより決定される。

コード配列は次のものを包含することができるが、これらに限定されない：原核 生物の配列、真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真植生物（例えば哺乳動物） のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、ウィルスＤＮＡ、および更には合成りＮＡ配 列。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３′側 に位置するであろう。

転写および翻訳調節配列は、ＤＮＡ調節配列、例えばプロモーター、エンハンサ −、ポリアデニル化シグナル、ターミネータ−などであり、これらは宿主細胞に おけるコード配列の発現に備える。

「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼと結合し、そして下流（ ３′方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である 。本発明を定義する目的上、プロモーター配列は３末端では転写開始部位に境を 接しており（包含的に）そｊ７て上流（５′方間）には、バックグラウンドより 上の検出可能なレベルにおいて転写を開始するために必要な最小の数の塩基また は要素を包含する。プロモーター配列内には、転写開始部位（便利には、ヌクレ アーゼＳ１でマツピングすることによって定められる）、並びにＲＮＡポリメラ ーゼ結合の原因となるタンパク質結合領域（共通配列）が見いだされるだろう、 真核プロモーターは、常にではないが、しばしば、ｒＴＡＴＡ、１ボツクスおよ びｒｃＡＴＪボンクスを含む。

コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでこ れがコード配列によりコードされるタンパク質に翻訳される時、細胞中で転写お よび翻訳調節配列の「支配下に」ある。

「シグナル配列」は、コード配列の前に含まれることができる。

この配列は、ポリペプチドのＮ末端にあるシグナルペプチドをコードし、このシ グナルペプチドは宿主細胞と共同してポリペプチドを細胞表面に差し向けるかま たはポリペプチドを媒質中に分泌させ、そしてこのシグナルペプチドはタンパク 質が細胞を離れる前に宿主細胞により切り取られる。シグナル配列は原核生物お よび真核生物に生来ある種々のタンパク質と関連して発見することができる０例 えば、生来の酵母菌タンパク質であるα因子は酵母菌から分泌され、そしてその シグナル配列は媒質中に分泌させようとする異種タンパク質に取り付けることが できる（米国特許第４，５４６，０８２号、ＥＰＯ０１１６２０１号、１９８３ 年１月１２日公開）、さらに、α因子およびその類似体は、種々の酵母菌、例え ばサツカロミセス（ハ胚江二邊匹肛）およびクルイベロミセス（ｕヨ烟銀邊匹組 ）から異種タンパク質を分泌させることが発見されティる（ＥＰｏ　８８３１２ ０６．９号、１９８８年１２月２３日出願、　ＥＰＯＯ３２４２７４号、および ＥＰＯ公開番号０３０１６６９号、１９８９年２月１日公開）。哺乳動物細胞に おける使用例は、第ＶＩＩＩｃ因子軽鎖の発現に使用するｔＰＡシグナルである 。

外因性または異種ＤＮＡが細胞の内側に導入されたとき、細胞はこのようなりＮ Ａにより「形質転換」されている。形質転換するＤＮＡは、細胞のゲノムを構成 する染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合される）でも組み込まれなくてもよ い０例えば、原核生物では、形質転換するＤＮＡはエビソーム要素、例えばプラ スミドまたはウィルスのベクター上に維持され得る。ＢＰＶにより形質転換され た細胞は安定であり、そしてエビソームのままである。真核細胞については、安 定に形質転換された細胞は、形質転換するＤＮＡが染色体の複製を通して娘細胞 により遺伝されるように染色体中に組み込まれるようになる細胞である。この安 定性は、形質転換するＤＮＡを含有する娘細胞の集団から構成された細胞系また はクローンを確立する真核細胞の能力により実証される。「クローン」は、単一 細胞または共通の祖先からのを糸分裂により誘導される細胞の集団である。

「細胞系」は、多数の世代に渡り試験管内で安定に増殖することができる一次細 胞のクローンである。

２つのＤＮＡ配列が、ヌクレオチドの少なくとも約８５％（好ましくは少なくと も約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％）がＤＮＡ配列の定められた長 さにわたって合致するとき、「実質的に相同」である、実質的に相同である配列 は、例えば特定の系について定められたような緊縮条件下で、サザンハイプリダ イゼーション実験において同定することができる。適当なハイブリダイゼータ５ ン条件を定めることは当業者の技量の範囲内である。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ら、前掲；　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ、　Ｉ　＆　Ｉｆ　、前掲Ｈ％ｕ （１６ｉｃ　Ａｃ１ｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、前掲を参照のこと。

ＤＮＡ構成物の「異種」領域は、天然では大分子に関連して見いだされないよう な、より大きいＤＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能なセグメントである。異種領域 が哺乳動物遺伝子をコードするとき、該遺伝子は通常、起源生物のゲノム中では 哺乳動物ゲノムＤＮＡを隣接しないＤＮＡによって隣接されるだろう、異積コー ド配列の他の例は、コード配列それ自体が天然に見いだされない構成物（例えば 、ゲノムコード配列がイントロンを含有するｃＤＮＡ、または生来の遺伝子と異 なるコドンを有する合成配列）である、対立遺伝子変異型または天然に存在する 突然変異の現象は、ここに定義するＤＮＡの異種領域を引き起こさない。

「Ａ」を含んで成る組成物（ここでｒＡ」は単一のタンパク質、ＤＮＡ分子、ベ クターなどである）は「Ｂ」　（ここでｒＢ、は１または複数の汚染タンパク質 、ＤＮＡ分子、ベクターなどである）を実質的に含有しない時には、組成物の中 のタンパク質、ＤＮＡ、ベクター（ＡおよびＢが属する種のカテゴリーに依存す る）の少なくとも約７５％が「Ａ」である。好ましくは、「Ａ」は組成物中にお いてＡ＋Ｂ種の少なくとも約９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％ である。また、汚染物質を実質的に含有しない組成物は、着目の種の活性または 特性を有する単−分子量種（垢タンパク質のポリペプチド部分、例えば、ｇｐ１ ２０に関して）のみを含有することが好ましい。

「抗体」は特異的エピトープに結合する任意の免疫グロブリンであり、抗体およ びその断片を包含する。この用語は、なかでも、ポリクローナル抗体、モノクロ ーナル抗体およびキメラ抗体を包含する。キメラ抗体については、米国特許第４ ，８１６，３９７号および米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと。

それ以上のプロセシング用の大量のＤＮＡのｔｉｌｌ！　（クローニングベクタ ー）または旧Ｖ　ｇｐ１２０遺伝子ポリペプチドの発現（発現ベクター）のため 、旧Ｖ　ｇｐ１２０遺伝子ポリペプチドをコードするＤＮＡの操作を簡素化する のにベクターが使われる。ベクターは、プラスミド、ウィルス（ファージを包含 する）、および組み込み可能なりＮＡ断片、すなわち組換えにより宿主ゲノム中 に組み込まれる断片を含む、クローニングベクターは発現調節配列を含む必要は ない。

しかしながら、発現ベクター中の調節配列は、転写および翻訳ｔＪ４節配列配列 えば、転写プロモーター、適当なリポソーム結合部位をコードする配列、および 転写および翻訳終結のｙ４節配列を含む。発現ベクターは、好ましくはＨＩＶ　 ｇｐ１２０遺伝子の安定な発現を促進するためおよび／または形質転換体を同定 するため選択遺伝子を含むであろう。しかしながら、発現を維持するための選択 遺伝子は、真核宿主細胞を使った同時形質転換方式において別個のベクターによ り供給することができる。

適当なベクターは、一般に、レプリコン（複製開始点、非組込み型ベクターにお いて使用する）および意図する発現宿主と適合性である種から誘導された調節配 列を含有するであろう、用語「複製可能な」ベクターとは、本明細書中で使用す るとき、そのようなレプリコンを含有するベクター並びに宿主ゲノムの中への組 み込みにより複製されるベクターを包含することを意図する。形質転換された宿 主細胞は、ＨＩＶ　ｇｐ１２０遺伝子をコードするＤＮＡを含有するベクターに より形質転換またはトランスフェクションされた細胞である。

発現されたＨＩＶ　ｇｐ１２０は、発現されるペプチド中の適当なプロセシング シグナル、例えば同種または異種シグナル配列の支配下で、培養土清中に分泌さ れるであろう２分泌されたタンパク質のみが完全にグリコジル化され、そして完 全にＣＯ４結合を行うことができる。

Ｆｅｎｎ１ｅら、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　（１９８９）６３：６３９−６４６参照。

宿主細胞のための発現ベクターは、通常、複製開始点、旧Ｖ　ｇｐ１２０遺伝子 コード配列の上流に置かれたプロモーター、並びにリポソーム結合部位、ポリア デニル化部位、および転写停止配列を含む、当業者は、これらの配列のあるもの がある種の宿主中での発現には必要でないことを認識するだろう。微生物と共に 使用する発現ベクターは、宿主により認識される複製開始点、宿主中で８！能す るプロモーター、および選択遺伝子を含有することのみを必要とする。

汎用されるプロモーターは、ポリオーマ、ウシ乳頭腫ウィルス、ＣＭＶ　（ウシ またはヒトのいずれかのサイトメガロウィルス）、ラウス肉腫ウィルス、アデノ ウィルス、およびシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）に由来する。他の調節配列 （例えば、ターミネータ−、ポＩＪ　Ａ、エンハンサ−または増幅配列）を使用 することもできる。

発現ベクターは、ＨＩＶ　ｇｐ１２０遺伝子コード配列が適当な調節配列と共に ベクター中に置かれるように作製され、調節配列に関するコード配列の位１およ び向きは、コード配列が調節配列の「支配」下に転写および翻訳されるようなも のである（すなわち、調節配列のところで該Ｄ　Ｎ　Ａ分子に結合するＲＮＡポ リメラーゼがコード配列を転写する）、調節配列は、ベクター、例えば前述のク ロー・ニングヘクター中への挿入の前に、コード配列に連結せしめることができ る。あるいは、調節配列および適当な制限部位を既に含有する発現ベクターの中 にコード配列を直接クローニングすることができる。

選択した宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、調節配列はＨＩＶ　ｇｐ１２０遺 伝子コード配列に対して同種または異種であることができ、そしてコード配列は イントロンを含有するゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができる。

高等真核細胞をを椎動物または無を椎動物細胞（昆虫を含む）のいずれにせよ使 用することができ、そしてそれらの増殖方法は知られている。例えば、Ｔｉ５ｓ ｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ＋Ａｃａｄｅｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ＫｒｕｓｅおよびＰａ ｔｔｅｒｓｏｎ　Ｗ（１９７３）を参照のこと。

高等真核生物中で旧Ｖ　ｇｐ１２０遺伝子を発現せしめるのに適当な宿主細胞と しては、次のものが揚げられる：ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ 系（ＣＯ５〜７．ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）　ｉベビーハムスター腎臓細胞（ ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣ［１Ｌ１０）　；チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨＦ Ｒ（ＬｌｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、ハＡｓ　（ＵＳＡ）７７　：　４２１ ６　（１９８０）に記載されている）；マウスセルドーリ細胞（ＴＭ４　ｉ　Ｍ ａｔｈｅｒ、Ｊ、Ｐ、＋紅鮭」並皿虹２３：２４３，２５１（１９８０））　； サル腎臓細胞（ＣＶＩ　＾ＴＣＣＣＣＬ　７０）　；アフリカミトリサル腎ｉｕ ｉ胞（ＶＥｌ？０７６、ＡＴＣＣＣ［１Ｌ−１５８７）　；ヒト子宮頚癌細胞（ ＦＩＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＬ　２）　；イヌ腎臓細胞（門ＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣ Ｌ３４）　；バッフアロラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２） 　；ヒト肺細胞（−１３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）　；ヒト肝細胞（）ｌｅｐ　 Ｇ２．ＲＢ８０６５）　；マウス乳癌（間Ｔ　０６０６５２．ＡＴＣＣＣＣＬ　 ５１）　；ラット肝癌細胞（ｌ（ＴＣ，旧：５４、Ｂａｕｍａｎｎ、　Ｍ。

ら、Ｊ、Ｃｅ１ｅ　Ｂｉｏ＋、８５：１−８（１９８０））およびＴＲＩ細胞（ Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ、Ｐ。

ら、Ａｎｎａｌｓ　Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、３８３：４４−６８（１９８２ ））。

哺乳動物組織中で発現される時、組換え旧Ｖ　ｇｐ１２０遺伝子産物がグリコジ ル化のためにより高い分子量を有することがあることは理解されるであろう。し たがって、１２０ｋＤと多少異なる分子量を有する旧Ｖ　ｇｐ１２０の部分的ま たは完全なグリコジル化形態は本発明の範囲内にある。

他の好ましい発現ベクターは真核系において使われるものである。

真核発現系の例は、この分野においてよく知られているワクシニアウィルスを使 用する系である。例えば、Ｍａｃｋｅｔら（１９８４）ＪＪｉｒｏ、４９：８５ ７：’ＤＮＡ　Ｃｒａｎｉｎｇ、’　Ｖｏｌ、ＩＩ、ｐｐ、１９１−２１１＋前 掲、　ＰＣ？公開番号−０８６１０７５９３を参照のこと。酵母発現ベクターは 当業界において周知である。

例えば、米国特許第４．４４６，２３５号、米国特許第４，４４３，５３９号； 米国特許第４，４３０．４２８号；欧州特許公開番号１０３，４０９号；同１０ ０．５６１号；同９６，４９１号を参照のこと。他の好ましい発現系は、チャイ ニーズハムスター卵巣細胞を形質転換するベクターｐＨ５１である。ＰＣＴ公開 番号−０８７１０２０６２号を参照のこと。哺乳動物組織は選択可能なマーカー 、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＰＲ）またはチミジンキナーゼをコー ドするＤＮＡとＨＩＶ　ｇｐ１２０をコードするＤＮＡとで同時形質転換せしめ ることができる。野生型ＤＨＦＲ遺伝子を使用する場合、Ｄ）ＩＦＲ欠損であっ て従ってヒボキサンチン、グリシンおよびチミジンヲ欠＜　ｈ　ｇ　を培地中で の好結果のトランスフェクションのためのマーカーとしてＤＨＦＲコード配列の 使用を可能にするような宿主細胞を選択することは好ましい。この場合において 適当な宿主細胞はＤＩ（ＦＲ活性を欠損するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ Ｏ）！ＩＩ胞系であり、これはｔｌｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、　１９８０ ．　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＬＩＳＡ）７７：４２１６に 記載されているようにして調製されそして増殖される。

選択した発現系および宿主に依存して、ＨＩＶ　ｇｐ１２０は、外因性または異 種のＤＮＡ構成物、例えば前述の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を 、ＨＩＶ　ｇρ１２０タンパク質が発現される条件下で増殖させることによって 生産される。次いで、［Ｖ　ｇｐ１２０を宿主細胞から分離し、そして精製する ０発現系がＨＩＶ　ｇｐ１２０遺伝子を増殖培地中に分泌する場合、前述したよ うに無細胞培地からタンパク質を直接精製することができる。適当な増殖条件お よび初期の粗製物回収法の選択は、当業者の技量の範囲内である。

ＨＩＶ　ｇｐ１２０のコード配列がいったん調製または単離されれば、それを任 意の適当なベクターの中にクローニングし、これにより旧Ｖｇｐ１２０遺伝子コ ード配列を含有しない細胞を実質的に含まない（例えば、他のライブラリークロ ーンを含まない）細胞の組成物中で維持することができる。多数のクローニング ベクターが当業者に既知である。クローニング用の組換えＤＮＡベクターおよび それらが形質転換することができる宿主細胞としては、種々のバクテリオファー ジスベクター（Ｅ、　コリ）　、ｐＢＲ３２２（Ｅ、　コリ）　、ｐＡｃＹｃ１ ７７　（Ｅ。

］　ＩＪ　）　、ｐＫＴ２３０　（ゲノム陰性菌）　、ｐＧＶ１１０６　（ゲノ ム陰性菌）　、ｐＬＡＦＲＩ　（ゲノム陰性菌）　、ｐＭＥ２９０　（非Ｅ、Ｉ Ｉ７グラム陰性菌）　、ｐｉ（Ｖ１４９ＢＤ９　（バシラス）　、ｐＩＪ６１　 （ストレプトマイセス（鉦胆旦」匹弦）〕、ｐＵｃ６　（ストレプトマイセス） 、アクチノファージ、ｆｃ３１　（ストレプトマイセス）　、ＹＩｐＳ　（サツ カロミセス）　、ＹＣｐ１９（サツカロミセス）、およびラン乳頭腫ウィルス（ 哺乳動物細胞）が挙げられる。一般に、１）ＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｖｏｌ、Ｉ ＆ＩＩ、前掲；　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲；　Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ、前掲を 参照のこと。

開裂部位の挿入のための部位特異的突然変異誘発（必要な時）は、所望の突然変 異を示す限定されたミスマツチ以外は、突然変異誘発しようとする一本鎖ファー ジＤＮＡに相補的である合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを使って行 われる。簡単に述べると、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して ファージに相補的な鎖の合成を指令し、そして生した二本鎖ＤＮＡをファージ保 持宿主細菌中に形質転換せしめる。形質転換された細菌の培養物をトップアガー 中に塗抹し、ファージを収容する単一細胞からのプラーク形成を可能にする。

理論的には、新しいプラークの５０％は、−末鎖として、変異形態を有するファ ージを含むであろう；５０％はもとの配列を有するであろう。得られたプラーク を、正確な合致のハイブリダイゼーションを可能にするが、もとの鎖との不一致 がハイブリダイゼーションを防ぐのに十分である温度で、リン酸化された合成プ ライマーとハイブリダイズせしめる０次いで、プローブとハイブリダイズするプ ラークを取り上げ、培養し、そしてＤＮＡを回収する。

タンパク質の中への非天然アミノ酸の部位特異的組り込みのための一般的方法は 、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ　Ｊ、Ｎｏｒｅｎ、５ｐｅｎｃｅｒ　Ｊ、Ａｎｔｈｏ ｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ。

Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｃ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ｐｅｔｅｒ　Ｇ、５ｃｈｕｌｔｚ　（ １９８９年４月）、　５ｃｉｅｎｃｅ、２４４巻、１８２−１８８頁に記載され ている。この方法を使用して、非天然アミノ酸をもつ類似体をつくることができ る。

本発明の精製方法は、哺乳動物細胞の増殖に典型的に使用される、ウシ胎児血清 を含有する細胞培地上で実施することができるけれども、比較的少量のＦｅ２を 含有する細胞培地を使用することが好ましい。例えば、ｇｐ１２０遺伝子を含有 するプラスミド構成物によりトランスフェクトされたＣＯ３細胞をｇｐ１２０　 ｆｉとして使用することができる。このようなｇｐ１２０を一時的に発現する細 胞は、抗生物質、ピルビン酸ナトリウム、グルタミンおよび１％（通常の５〜６ ％の代わりに）のウシ胎児血清を含有するかまたは含有しないダルヘノコ改良必 須培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させることができる。トランスフェクンヨン後様々 な時間間隔からプールした細胞培地を本発明の精製方法にかけることができる。

ｇｐ１２０の発現のために本発明者らが実験的に使用した発現糸は、１９８７年 １２月２４日出願の米国特許出願第１３８．８９４号（その開示をここに引用に よって加える）に詳しく記載されている。使用した特定のベクターはｐｃＭＶ６ ａ１２０−５Ｆ２　（米国特許出願第１３８，８９４号ではｐＣＭＶ６ＡＲＶ１ ２０ｔｐａと呼ばれている）およびＡｄ−ｄｈｆｒと表示する。それらのベクタ ーを使用してＣＨＯ細胞系をトランスフェクトせしめ、ＣＨＯ−Ａ−６ａ１２０ −１４５−０．１−２２と命名されたｇｐ１２０生産者を得た。他の技術により 調製される他のｇｐ１２０産生物を上回る利点は、この細胞系の使用において認 められない。

粗製形態のｇｐ１２０の産生に使用される、特定の方法、細胞系、または遺伝単 離物は任意の他の技術よりも好ましいと思われないことを認識すべきである０本 発明の精製技術は、全長のグリコジル化された非融合ｇｐ１２０を含有する任意 の源から、コンホメーション保持されたａｐ１２０を生産するであろうことが期 待される。下の実施例の項目におけるｇｐ１２０生産に関する特定の実施例は、 多くの場合便宜のためにのみなされた決定から生ずる。特定の遺伝物質、細胞系 、増殖条件などは、発明者らに最も良く知られておりかつ容易に入手可能である ものから選択され、そして本発明者らは特定の文献に記載されているかまたは後 で開発される任意のｇｐ１２０源を本発明の精製方法の実施において等しく良好 に使用できると思う。

ｇｐ１２０／ＣＤ４結合の標準物として使用されるＣＤ４ペプチド源ｇｐ１２０ 組成物が本明細書に記載の結合特性を有するかどうかを試験するために有用であ るＣＤ４分子は、天然源からの分離を包含する種々の方法で、および遺伝子操作 の技術により調製することができる。　ｇｐ１２０分子に結合することができる 可溶性ヒトＣＤ４断片は、ＰＣＴ出願第８９０３２２２号（１９８９年４月２０ 日公開および１９８８年１０月５日出＠）に記載されている。　ｇｐ１２０結合 を示す修飾されたＣＤ４分子は、ＰＣＴ出瀬第８９０２９２２号（１９８９年４ 月６日公開および１９８８年１０月３日出願）に記載されている。下の実施例に おいて使用するＣＤ４の調製において源として使用する細胞系に類似したＣＤ４ 分泌細胞系は、ＥＲＣバイオサービス・コーポレーシテン（ＢｉｏＳｅｒｖｉｃ ｅ　ＣｏｒｐｏｒａｔｉＯｎ）、米国メリーランド州２０８５０ロックビル、ロ フトランドレーン６４９Ａから入手することができ、そしてＡＩＤＳ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　ａｎｄＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｃａ ｔａｌｏｇｕｅ　、　１９９０年１月版、［１，Ｓ、Ｄ、）Ｉ。

Ｈ，Ｓ、のＮａｔｉｏｎａ］　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ発行 に、細胞系ＣＨＯＳＴ４．２として記載されている。ＣＤ４の他の源および精製 技術は、例えば、Ｓｍ１ｔｈ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３８：１７０ ４−１７０７；Ｌａ５ｋｙら、皿（１９８７）５０：９７５−９８５；Ｍａｄｄ ｏｎ　ら、Ｃｅ１ｌ（１９８５）４２：９３−１０４；およびＬｉ　ｔｔｏ＋ａ ｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２５：４５３−４５５に記載されている。細 胞培地からのＣＤ４の精製は、典型的には、固体支持体、例えばセファロース４ ＢにカップリングしたコンカナバリンＡへのＣＤ４　（および他の炭水化物含有 分子）の結合に次いでイオン交換クロマトグラフィーを包含する。ＣＤ４分子特 異的なモノクローナル抗体を使用するアフィニティークロマトグラフィーによる 更なる精製を所望により実施することができる。ｇｐ１２０とは異なり、ＣＤ４ を精製するのにアフィニティークロマトグラフィーを使用する際に問題は全くな い。

本発明のｇｐ１２０の用途 本発明のコンホメーション保持されたｇｐ１２０の重要な用途の１つはワクチン としてであるが、多数の他の利用法もまた存在する。例えば、コンホメーション 保持されたｇｐ１２０は、ＣＤ４分子に対するｇｐ１２０分子上の結合部位がぴ ったり合う抗】ｄ抗体の調製においてとくに有用である。他の用途としては、旧 Ｖ−ｔウィルス粒子の存在についての競争結合アッセイにおける標準物とルでの 用途が挙げられる。事実、本発明のｇｐ１２０　Ｗタンパク質は、従来入手可能 なｇｐ１２０分子が使用されている任意の方法において使用することができるが 、それがウィルス粒子中に天然に見いだされる形態のａｐ１２０とより近似して いるだろう。

本発明のｇｐ１２Ｏｔ＆構成物１つの明らかな有用性は、ＨＩＶポリペプチドに 対する抗ＨＩＶ抗体、特に抗ｇｐ１２０抗体およびウィルスｇｐ１２０について のイムノアッセイにおける有用性である。イムノアッセイの設計はこの分野にお いてかなりの変形を受ける。従って次の説明は単に例示であり、限定的ではない 、しかしながら、一般的には、米国特許第４，７４３，６７８号、米国特許第４ ，６６１，４４５号および米国特許第４，７５３，８７３号並びにＥＰＯ公開第 １８１，１５０号およびＥＰＯ公開第２１６．１９１号を参照のこと。

ウィルスｇｐ１２０についてのイムノアッセイは、例えば、ウィルスのエピトー プに対して向けられたモノクローナル抗体、ウィルスｇｐ１２０のエピトープに 対して向けられたモノクローナル抗体の組み合わせ、ウィルスａｐ１２０のエピ トープに対して向けられたポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体とポ リクローナル抗体との組み合わせを使用することができる。

イムノアッセイのプロトコルは、例えば、組成、直接反応、またはサンドイッチ 型アッセイに基づくことができる。プロトコルはまた、例えば、不均一であって 固体の支持体を使用することができ、あるいは均一であって溶液中の免疫反応を 伴うことができる。大部分のアッセイは標識された抗体またはポリペプチドの使 用を伴った。

標識は、例えば、蛍光性、化学発光性、放射性、または染色性の分子であること ができる。プローブからのシグナルを増幅するアッセイも知られている。そのよ うなアッセイの例は、ビオチンとアビジンを利用するもの、並びに酵素！！識お よび酵素媒介イムノアッセイ、例えばＥｉＳＡアッセイである。

典型的には、抗ＨＩＶ抗体のイムノアッセイは、試験試料、例えば生物学的試料 を選択およびｔｌｉｔ製し、次いでそれを本発明のｇｐ１２０組成物と共に、抗 原−抗体複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートすることを包含する であろう。そのような条件は当業者で公知である。例えば、不均一形式では、ｇ ｐ１２０を固体支持体に結合させ、インキュベーション後の試料とポリペプチド との分離を促進する。使用できる固体支持体の例としては、膜またはマイクロタ イターウェルの形態のニトロセルロース、シートまたはマイクロタイターウェル の形態のポリ塩化ビニル、ビーズまたはマイクロタイタープレートの形態のポリ スチレンラテンジス、Ｉｍ＋ｗｏｂｕｌｏｎ”として知られているポリフッ化ビ ニリデン、ジアゾ化紙、ナイロン膜、活性ビーズ、およびプロティンＡビーズが 挙げられる。最も好ましくは、グイナテック社のＩｍｍｕｌｏｎ”　１マイクロ タイタープレートまたはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌａｓｔｉｃ　Ｂａ１１により 仕上げられた０、２５インチのポリスチレンビーズである５ｐｅｃが不均一形式 において使われる。典型的には、固体支持体を試験試料から分離後に洗浄する。

他方、均一形式では、試験試料を溶液中でｇｐ１２０抗原と共に、当業界で知ら れているように、形成される抗原−抗体複合体を沈澱させるような条件下でイン キュベートする。次いで、沈澱した複合体を例えば遠心により試験試料から分離 する。次いで、抗ＨＩＶ抗体を含む複合体を任意の数の技術により検出する。形 式に依存して、複合体は標識した抗異種間ｒｇで検出することができ、あるいは 、競合形式を使用する場合には、結合した標識競合抗体量を測定することにより 検出することができる。

ウィルスｇｐ１２０ポリペプチドが分析物であるイムノアッセイでは、試験試料 、典型的には生物学試料を、抗原−抗体複合体の形成を可能にする条件下で、抗 ｇｐ１２０抗体と共にインキュベートする０種々の形式、例えば「サンドイッチ 」アンセイを使用することができる。

このサンドインチアンセイでは、固体支持体に結合させた抗体を試験試料と共に インキュベートし、洗浄し、該分析物に対する第２の標識抗体と共にインキュー トし、そして支持体を再び洗浄する。第２抗体が支持体に結合するかどうかを決 定することによって分析物を検出する。競争形式では通常（不均一または均一で あることができる）、試験試料を抗体および標識競争抗原と共に、順次または同 時にインキュベートする。

ワクチンにおいて使用するとき、本発明のａｐ１２０１！タンパク質は、しばし ば「サブユニット」ワクチンと呼ばれる。なぜなら、ｇｐ１２０はＨＩＶウィル スのサブユニットであるからである。それ自体、本発明のｇρ１２０１！タンパ ク質は生産の安全性およびコストの点から従来のワクチンを上回る有意な利点を 有する；しかしながら、サブユニットワクチンは全ウィルスワクチンより免疫原 性がしばしば低く、そして病気の予防においてそれらの完全な効力に到達するた めに、有意な免疫刺激能力をもつアジュバントが必要であると予想される。

しかしながら、今日までに試験した全アジュバントが、本発明のコンホメーシコ ン保持されたｇｐｉｚｏと共に使用すると、多種単離物中和抗体の形成を誘発す る能力を示すので、特定のアジュバントは本発明のより広い面の部分を構成しな い。しかしながら、ある種のアジュバントは、それら自身のもつ有利な性質のた めに好ましい。

現在、米国においてヒトへの使用が認可されている唯一のアジュバントはアルミ ニウム塩（明雰）である、それらのアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポ リオ、狂犬病およびインフルエンザを包含する幾つかのワクチンに有用である。

完全フロイントアジュハンＩ−（ＣＦＡ）は、実験的基準において多数の抗原と ともに好結果に使用されている強力な免疫刺激剤である。ＣＦＡは、鉱油、乳化 剤、例えばＡｒ１ａｃｅｌ　Ａ　、および死ミコバクテリア、例えば、ヒト型結 核菌（ｈ並匝旦肛…ｍ　ｔｕ匡匹虱匹鎚）から構成されている。水性抗原溶液を これらの成分と混合して油中水型乳剤をつくる。しかしながら、ＣＦＡは深刻な 副作用、例えば痛み、膿瘍形成および熱を引き起こし、このためヒトまたは獣医 学用ワクチンにおいてその使用が妨げられる。副作用は主としてＣＦＡのミコバ クテリア成分に対する患者の反応のためである。

不完全フロイドアジュバント（ＩＦＡ）は細菌成分をもたないＣＦＡに類似する 。米国では使用が認可されていないが、ＩＦＡは他国で幾つかの型のワクチンに 利用されている。ＩＦＡはヒトのインフルエンザおよびポリオワクチンで、並び に幾つかの動物ワクチン、例えば、狂犬病、イヌのジステンパーおよび口蹄疫ワ クチンで好結果に使用されている。ＩＦＡ中に使用される油および乳化剤は共に マウスにおいて腫瘍を引き起こすことが実験から明らかになり、ヒトへの使用に は代替アジュバントが良い選択であることを指摘している。

ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）は、ＣＦＡを使って観察されるアジュバント活性 を発生する、ミコバクテリアの細胞壁複合体の最小単位を表す［Ｅｌｌｏｕｚら （１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｓ＋、、５９： １３１７を参照のこと］。ＭＤＰの多数の合成類似体が作製されており、これら は広範囲のアジュバント効力および副作用を示す［Ｃｈｅｄｉｄら（１９７８） 紅互Ａ旦肛■、　２５　：　６３に概説されている〕、ワクチンアジュバントと して特に有用であるだろう３つの類似体は、ＭＤＰのスレオニル誘導体（＋３ｙ ａｒｓ　ら（１９８７）Ｖａｃｃｉｎｅ、５：２２３参照）、ＭＤＰのｎ−ブチ ル誘導体（Ｃｈｅｄｉｄら（１９８２）Ｉｎｆｅｃｔ、ａｎｄ　Ｉｍｎｕｎ、、 ３５：４１７参照〕、およびムラミルトリペプチドの親油性誘導体（Ｇｉｓｌｅ ｒら（１９８１）　Ｉｎｍｕｎ。

ｏｕｎｄｓ＋　Ｙ、ヤマムラおよびＳ、コタニ編、Ｅｘｃｅｒｐｔａ　Ｍｅｄｉ ｃａ、アムステルダム、　ｐ、１６７参照〕である。これらの化合物は、体液性 および細胞性免疫を効果的に刺激し、そして低レベルの毒性を示す。

ＭＤＰの１つの有望な親油性誘導体は、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル− Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２（１，２−ジパルミトイル−５ｎ−グリ セロ−３−（ヒドロキシホスホリルオキシ）〕エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ）で ある、このムラミルペプチドは該分子の疎水性部分と脂性環境との会合を可能に するリン脂質テールを有する一方、ムラミルペプチド部分は水性環境と会合する 。

よって、ＭＴＰ−ＰＥそれ自体は、安定な水中油型乳剤を生成する乳化剤として 作用することができる。

マウスにおける実験では、ＭＴＰ−ＰＥは単純ヘルペス（初］μＬ江旺ｌｅｘ　 ）ウィルスｇｌ）抗原に対する抗）ＩＳＶ　ｇＤ抗体価を刺激するアジュバント として有効であることが示されており、そしてＭＴＰ−ＰＥおよびｇＤが水溶液 よりむしろ油（ＩＦＡ）中で供給された場合、その効力が大幅に改良された。Ｉ ＦＡはヒトへの使用が許可されないので、ＭＴＰ−ＰＥおよび抗原のための他の 油供給系が研究されている。４％スクアレン、０．００８ズＴｗｅｅｎ８０およ びＨ５ＶｇＤの乳剤は、モルモットにおいて非常にすぐれた結果を与えた。この 製荊ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ（低油分）を皮下注射針に通過させて乳化すると非常に 不安定であった。それにもかかわらず、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯはモルモットにおい て高い抗体価、および免疫処置モルモットのＩ（ＳＶチャレンジにおいて優れた 保護を与えた〔５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら（１９８８）Ｊ、１ｍ＊ｕ ｎｏｌｏ　、　１４１：１７２０−１７２７およびＴｅｃｈｎｏｌｏ　１ｃａｌ 　Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｖａｃｃｉｎｅ　［１ｅｖｅｌｏ　ｗｅｎｔ（１９ ８Ｂ）Ｌａｓｋｙら編、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、＋ｐ、４４５−４６ ９を参照のこと〕、　ｌ’１ＴＰ−ＰＥ−ＬＯ製荊は、モルモットにおいて酵母 生産旧Ｖエンベロープタンパク質に対する免疫反応を刺激するのにも有効であっ た。ＥＬＩＳＡ抗体価およびウィルス中和抗体価の両者が、ＭＴＰ−ＰＥ製剤で 高レベルに刺激された。しかしながら、同製剤を大型の動物、例えばヤギおよび ヒトにおいて試験すると、この組成物はそれほど有効でなかった。それにもかか わらず、この系はｇｐ１２０抗原と共に使用される有効なアジュバントを意味す る。

代謝可能な油と乳化剤を含んで成り、油および乳化剤が油滴を有する水中型乳剤 の形態で存在し、実質的に全ての油滴が１ミクロンより小さい直径を有するアジ ュバント組成物は、ワクチンの効能を増加するための有効なアジュバント組成物 であることが実験から実証された。このようなアジュバント組成物は、油滴が有 意に大きい油および乳化剤を含有するアジュバント組成物よりも驚くほど優れて いるアジュバント組成物であることが研究から示された。これらの優れたアジュ バント組成物は別の特許出＠ＥＰＯＯ３９９８４３号刊什物の主題であり、その 開示をここに引用によって加える。

アジュバント製剤は、一般にアジュバントとｇｐ１２０抗原とを混合する前に前 述の成分から調製される。ｇｐ１２０抗原は、動物の組織に接近すると、特異的 抗体の形成を刺激し、そして生体内または試験管内でこのような抗体と特異的に 反応する。そのうえ、抗原はその抗原のためのレセプターをもつＴ−リンパ球の 増殖を刺激し、そしてリンパ球と反応して細胞性免疫と呼ばれる応答の系列を開 始することができる。

本発明のワクチン製剤は有効量のｇｐ１２０抗原を使用するであろう。

すなわち、アジュバントと組み合わせると、被検体に特異的で且つ十分な免疫応 答を生しさせ、旧Ｖウィルスへのその後の暴露からの被検体の保護を付与するで あろう量の抗原を含む。

１つの好ましいアジュバント製剤は、ＭＦ−５９と称し、０．４０μｇ／ｄのＭ ＴＰ−ＰＥを含有するＭＴＰ−ＰＥ溶液中の０．５χＴｗｅｅｎ−８０，０，５ χ５ｐａｎ、Ｓ、ＯＺスクアレンからなる。この乳剤酸物を微流動化装置（Ｍｉ ｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）に１０，０ＯＯｐｓｉで０°Ｃにおいて１０回通過 させる。生じた物質を０．２ミクロンのフィルターに通過させ、４℃においてア ルゴン雰囲気下で貯蔵する。

ワクチンとして使用できる各ｇｐ１２０製剤について特別の手引を提供するよう な単一投与量を指定することはできない。抗原のを動量はその固をの活性および 純度の関数であり、単離物毎に変化するであろう。ワクチン製剤の成分の初期比 率についての手引は実施例の項目から得られ、この実施例の項目は中和抗体の刺 激に有効であることが証明された種々の製剤を示す、これらの比率は、当業者に おいて公知であるように、天然のコンホメーション保持されたｇｐ１２０の個々 の調製物について調整されるであろう。

本発明のワクチン組成物はＨＩＶ−１感染の予防に有用である。ＨＩＶ−１に苦 しむことがある全ての動物はこの方法で処置することができるが、本発明は、も ちろん特にヒトへの本発明のワクチンの予防的および治療的利用に向けられる。

しばしば、所望の予防または治療効果を引き起こすのに複数の投与が要求される ；正確なプロトコル（投与量および頻度）は標準臨床的手順により確立すること ができる。ワクチン組成物は、ワクチンを動物中に導入する任意の常法、通常は 注射により投与される。経口投与のために、ワクチン組成物は他のタンパク様物 質、例えばインスリンの経口投与に使われるものと同様な形式で投与することが できる。前述したように、予防および治療に使用する正確な量および製剤は、抗 原の固有の純度および活性、追加の成分または担体、投与方法などの状況に応じ て変化することがある。非限定的例示により、投与されるワクチンの用量は、典 型的にはｇｐ１２０抗原に関して、約０．１■／投与の最小量、より典型的には 約１■／投与の最小量、およびしばしば約１０■／投与の最小量であろう、最大 量は典型的には重要でない。しかしながら、通常、用量は約１０■／投与以下、 典型的には５００■／投与以下、しばしば２５０Ｉ１ｇ／投与以下であろう。こ れらの用量は、該用量を担持するのに十分な容量の任意の適当な医薬賦形剤また は担体の中に懸濁させることができる。一般に、最終容量は、担体、アジュバン トなどを包含して、少なくとも０．１ｙｄ、典型的には少なくとも約０．２ｉで あろう。上限は実際に投与すべき量により左右され、一般に約０．５ｉ〜約１． ＯＮ１以下である。

上記から、本発明は、動物におけるＨＩＶ−１感染の予防のための本発明のワク チン組成物の使用方法、およびＩＩＩＶ−１に既に感染した動物の治療的処１の ための本発明のワクチン組成物の使用方法を包含する。動物は、哺乳動物、例え ば霊長類、例えばチンパンジー、ヒトおよびヒトを包含する。

本発明をここで全体的に説明したが、本発明は次の詳細な実施例を参照すること によってより良く理解されるであろう、これらの実施例は例示のみを目的とし、 そして特記しない限り、本発明を限定するものと見なすべきでない。

２五班上 哺乳動物細胞中での旧Ｖ　ｇｐ１２０の突然変異誘発および発現１１１Ｖ−５Ｆ ２のｇｐ１６０をコードするエンベロープ遺伝子を、ｇｐ１２０天然ｇｐ４１プ ロセシング部位のＡｒｇ５０９の後ろに停止コドンを導入することによって、ｇ ｐ１２０配列の発現のために操作した。この遺伝子の５′末端を修飾して、Ｇ１ ｕ３１をコードする配列の５′側にＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を挿入 し、こうして天然のシグナル配列を他のシグナル配列で置換して、哺乳動物細胞 からの改良された分泌について試験することができるようにした。哺乳動物細胞 中で分泌塘タンパク質としてａｐ１２０を生産するために、ＨＩＶシグナル配列 および５′非翻訳配列を、ｔＰＡシグナルＤＮＡの３′末端付近にＮｈｅ１部位 を配置してＡｌａ　Ｓｅｒをコードするように突然変異誘発したヒ）１−ＰＡの ものと置き換えた。得られた遺伝子構成物を１系列のプロモーターに融合せしめ た。ＣＯ３−７細胞中へ発現ベクターをトランスフェクションせしめそして分泌 されたｇｐ１２０のレベルをヤギ捕捉ＥＬＩＳＡ（下に記載する）およびウェス タンプロットにより比較した後、ｇｐ１２０の一時的発現を評価した。発現の最 高レベルは、ＣＭＶ　ＩＥ−１プロモーターを使った時に見られ、ＳＶ４０の初 期プロモーターを使った時より少なくとも５０倍高かった。永久細胞系の作製の ために、発現プラスミドｐＣＭＶ６ａＳＦ２−１２０　（第１図）を叱発現プラ スミドと共に、ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞（ｄｇ４４　；下記参照）中へリン酸カル シウム共沈法により同時トランスフェクトせしめた。

生じた細胞系を、クローンをｇｐ１２０ヤギ−捕捉ＥＬＩＳＡでスクリーニング することによって特徴づけた。最大発現細胞系をプール中のメトトレキセートの 中で増幅させた。クローンを０．１−ｉレベルで単離した。標準として精製タン パク質を使用して、細胞系はＴフラスコレベルにおいて５■／リツトルの範囲で ｇｐ１２０を分泌することが示された。

ｇｐ１２０遺伝子の発現に使用した細胞は、本来、チロン・コーポレーションの Ｌｅｓｌｉｅ　Ｒａ１ｌ博士から１９８５年９月にほぼ１００継代において入手 した。これらの細胞は、ニューヨークのコロンビア大学Ｇａ１ｌＵｒｌａｕｂ博 士およびＬａｗｒｅｎｃｅ　Ｃｈａｓｉｎ博士により最初に単離され、そしてＩ Ｊｒｌａｕｂら、Ｃｅ１１（１９８３）３３：４５に記載されている。これらの 細胞をＤＧ４４を命名した。それらは、二重欠失によりジヒドロ葉酸レダクター ゼ欠損（ｄｈｆｒ−）にしたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）Ｋ−１細胞 から誘導した。

ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞を次の培地中で連続培養した：１０％透析済ウシ胎つ血清 、２００■／ｄのストレプトマイシンが補足されたＨａｍｓ　Ｆ−１２培地。こ の培地および血清はカリフォルニア州すンフランシスコのカリフォルニア大学、 サンフランシスコ・セルカルチャー・フプシリティ（Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃ ｏ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（Ｓｉｇ■ａ　Ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃｏ、ミズーリ州セントルイス）により供給された。

細胞は週２回Ｔ−７５フラスコ中で１：１０分割で継代培養することによって維 持した。

貯蔵のために、細胞のアリコートをウシ胎児血清（Ｆｅ２）、１０％ジメチルス ルホキシド（ＤＭＳ○）の中で凍結し、そして液体窒素の気相中で一８０ＲＣに おいて貯蔵した。この目的で、Ｔ−７５フラスコの細胞を集密まで増殖させた（ 約１０？細胞／Ｔ−７５フラスコ）、ｉＢ胞をトリプシン処理し、遠心し、そし て水冷ＦＣ５中ｌＯ％ＤＭＳＯに約５Ｘ１０”細胞／ｄの濃度で再懸濁した。１ ｉアリコートを凍結保存用バイアルに移した。細胞を必要とするとき、アリコー トを３７ＲＣ水浴中で解凍し、そして連続培養および継代のために細胞をＴ−７ ５中に接種した。

ＨＩＶ−１エンベロープ関連抗原を検出するため上述のように使う２つのアッセ イを次の方法で実施した０両アッセイには、精製されたＣＨＯ由来ｇｐ１２０を 標準として、２００ｎｇ／Ｍ１１〜０．　１９５ｎｍ／ｄの倍々希釈で使用した 。

（ａ）ヤギ　ＥＬＩＳＡ：このアッセイのための捕捉試薬は、下に記載する精製 ｅｎｖ−２−３（ＳＦ２）　（）ＩＩＶ−３Ｆ２ウイルス単離吻のｇｐ１２０の アミノ酸配列に相当する酵母中で生産された非グリコジル化ポリペプチド）で高 度免疫処置したヤギからのプロティンＡ−セファロース−アフィニティー精製免 疫グロブリンであった。捕捉された抗原の検出に使用した試薬は、同一抗原に対 してウサギ中で惹起せしめたポリクローナル抗血清であった。プレートを５■／ Ｉ１１のｅｎｖ−２−３（ＳＦ２）に対するヤギ免疫グロブリンでコーティング し、ウィルス溶解物または哺乳動物由来ｇｐＬ２０抗原の希釈液とインキュベー トし、次いで補足された抗原を１／１００に希釈したｅｎｖ−２−３（ＳＦ２） に対するウサギポリクローナル抗血清、次いで接合体およびＡＢＴＳ基質により 検出した。

（ｂ）ヒト　ＥＬｒＳＡ：このアッセイは前述の「ヤギ捕捉ＥＬＩＳＡ、と同一 であるが、ただし捕捉試薬はＩＩＩＶ−，１血清陽性血液提供者から入手したヒ ト血清からのプロティンＡ−セファロース−精製免疫グロブリンであった。

１１鍔ｌ 細胞の生産 実施例１に記載のように得られた１つの細胞系、Ｃｌ０−Ａ−６ａ１２０−１４ ５−０．１−２２を、回転瓶中での低血清および無メトトレキセート培地中での 生産のために選択した０回転瓶培養物（８５０ｃｄ　）を確立し、そして６％ウ シ胎児血清（Ｆｅ２）が補足された培地（ダルベツコ改良イーグル培地およびハ ムＦ−１２，１：　１）中で集密まで増殖させた。生産のために、補足物を１％ ＦＣ３および０．０３％ＨＢ−ＣＨＯ（Ｈａｎａ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ、カリフ ォルニア州）に切り替えた。順化培地（２００ｄ）を２４〜４８毎に集め、２〜 ８℃で貯蔵し、プールし、そして０．４５ミクロンのカプセルフィルター（Ｇｅ ｌ■ａｎ）を通して濾過することによって清浄した。細胞は２回の生産実験の各 々において２力月以上維持され、ｇｐ１２０の生産の明白な低下はなかった０発 現レベルは５〜２０ｍｇ／４１！であった。

スｍ 精製 （１）１互。実施例２からの細胞培養上清（４０リツトル）の濃縮は、行きどま り濾過（０，４５ミクロンのカプセルフィルター、Ｇｅｌｍａｎ）および３０に カットオフの中空繊維限外濾過器（ＡＧＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１ｔｌＦＰ−３ ０−Ｃ−６；６ｆｔ”および０．５　ｍｓの繊維内径）を使用し容量形ポンプ（ Ｗａｕｋｅｓｈａ　＃１８）により駆動される交差流限外濾過を使用して実施し た。透過速度は、はぼ１２す７）ル／分の再循環速度および２６ｐｓｉの圧力に おいてほぼ１５０ｄ／分であった。保持液容量が１〜２リツトルに到達するまで 濾過を続けた。

濾過工程は低温室内で２〜８°Ｃにおいて実施した。限外濾過濃縮物は褐色の透 明な液体であった。

（２）ＤＥＡＥクロマトグラフィー、ＤＥＡＥセファデックスＡジス０　（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）を詰めたイオン交換カラム（直径１１　、　４ＣＩＩＸ　１５ Ｃ１１）を緩衝液（０，０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ、ｐＨ８゜０、Ｏ，ＬＭ’　Ｎ ａＣ目中平衝化し、次いで３５Ｗｌ／分の流速で室温においてｆＡ縮物をカラム に適用した。限外濾過′ａ縮物を２リツトルの体積にし、そして塩化ナトリウム （４Ｍ原溶液〕の添加により１．４■Ｓの伝導度にした。生Ｍ物を含有する未吸 着の画分を２５ｄ画分でｌ５ｃｏ　Ｆｏｘｙ”フラクションコレクターにより集 めた。血清アルブミン、他のタンパク質および褐色物質の大半ばカラムに結合し 、そしてＬＭ　ＮａＣ１の段階的勾配で溶出された。これらの百分は少ないが、 可変量の生産物を含有した；結合画分からの生産物の回収は試みなかった。ＤＥ ＡＥセファデックスＡジス０樹脂を各使用後廃棄した。素通り画分はＥＬＩＳＡ アンセイにより大半の生産物を含有することが示された。この段階では、ＳＤＳ ゲル上の拡散ｇｐ１２０ハンドを位置づけることは困難であった。

（３）フェニル　・　クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ画分を、固体の硫酸アンモ ニウムの添加により、硫酸アンモニウム中４０％飽和にした。よく混合した後、 少量の沈澱物を遠心により除去した。ＴＳＫフェニル−５ＰＷ　ＨＩＣカラム（ 直径５，５ｃｗＸ２０Ｃ１１）を少なくとも２容積の水でＧｌｌｓｏｎ分取用Ｈ ＰＬＣにより洗浄した０次いで、カラムを２以上の容積の緩衝液Ａ（０，０２Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐ）１５．０．４０％飽和ｇ酸アンモニウム）で平衡化した。

カラムの平衡は流出液の伝導度測定により確かめた。

硫酸アンモニウムの添加後の上清両分をポンプＡを通して３０ｄ／分で供給する ことによってカラムに適用し、次いでカラムをヘースラインが安定化するまで（ 通常約１５〜２０分）緩衝液Ａで洗浄した。勾配をかけて４０分間に渡り０．０ ２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐ）１５゜０にして生産物を溶出させた。ＯＤピークの下 の画分をＳＤＳゲル電気泳動によりＰｈａｒｍａｃｉａのＰｈａｓｔ’システム を使ってアッセイし、生産物を位置決定した。この純度段階において、ｇｐを次 の段階のクロマトグラフィーのためにプールした（第３Ａ図参照）。

（ｄ）エーテル　、　クロマトグーフィー、第２のＨＩＣ段階を、ＴＳＫエーテ ル−５ＰＷ　ＨＰＬＣカラム（直径５．５ＣＩＸ２０（３）上で、フェニルＨＩ Ｃカラムについて使用したのと同一の手順に従い実施した。このカラムを少なく とも２カラム容積の水で洗浄し、次いで緩衝液Ａ（４０％飽和硫酸アンモニウム 、０゜０２Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０）で平衡化した。フェニルカラムから の生産物プールを硫酸アンモニウムの添加により１６５Ｓ／Ｃ１ｌの伝導度にし 、次いで１２．　ＯＯＯｒｐｍにおいて１０分間遠心した。

この試料を負荷し、そして１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂまでの４０分 間の勾配を使って前述したように溶離した。生産物を含有する両分（第３Ｂ図参 照）をＰｈａｓｔ”系のＳＤＳゲル電気泳動により位置決定し、次いでゲル濾過 クロマトグラフィーのためにプールした。エーテルカラムからのｇｐ１２０ピー クは主としてｇｐ１２０であり、少量の低分子量汚染物を含んだ、これらの汚染 物はゲル濾過クロマトグラフィー（下）により分離された。

（５）ル　′クロマトグーフィー。エーテルＨＩＣｉ１分を限外濾過膜（Ａｍｉ ｃｏｎ　ＹＭ−３０）で濃縮して、０．６の吸光係数＝１■／ｄと仮定してＡ− ２８０により測定した時はぼ１０■／ｄのタンパク質濃度にし、次いで少なくと も５容の０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，９に対して透析した。試料をゲル 濾過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ”　２００．Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ、直径１．　 ６ＣＩＩＸ６０Ｃ１１）にカラム容積の４％以下の量で１０■／ｄ以下の総タン パク質濃度で適用し、そして０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，９で溶出させ た。ＩＷｌの両分を集め、ＳＤＳゲル電気泳動にかけ、クーマシー・ブリリアン ト・ブルーＲ３５０によりＰｈａ　ｓ　を系で染色し、そしてデュポンＣＦ−４ ５Ｑカラム上でのゲル濾過）ＩＰＬＣ（展開緩衝液：０．２Ｍリン酸ナトリウム 、ｐＨ６，７、ｌａｆ／分）にかけて２量体を含有する百分を探し、次いでプー ルした。　ｇｐ１２０ピークのリーディング端は純粋なｇｐ１２０を含有したが 、テーリング端をゲル濾過カラム上で再クロマトグラフィーにかけた。生産物の プールをＡｍ１ｃｏｎ　ＹＭ−３０膜で濃縮し、５容のＩ留水に対して透析濾過 し、そして１０ミクロンより低い圧力において少なくとも２日間凍結乾燥した。

（６）罹ｌ猪栗且叉封。表１は、４０リツトルの細胞培養上清を使って出発した 典型的な精製の結果を要約する。これらのデータが示すように、２５０倍の精製 が２０〜２５％の収率で達成される。

生産物はＳＤＳゲルにおいてＨ１２０ＫＤで移動する幅広のバンドとして現れた 。デンシトメトリーは、染色強度の８０〜９０％がｇｐ１２０のバンドに存在す ることを明らかにした。多分これは、ａｐ１２０結合の染色が弱いので、この調 製物の純度の最小評価値を表す。

ＢＳＡと比較してほぼ７／１のクーマシーブリリアントブルーがタンパク質１■ 当りに結合した。ゲルのバンドの出現は、試料を２−メルカプトエタノールまた はジチオスレイトールで前処理することによって変更せず、タンパク質は内部で 切断しないことが示された。

高温における逆相ＨＰＬＣ分析は、また、産生物の純度が９０％を越えることを 示唆した。

ｌ土 Ｓ　Ｆ　２　ｒｇｐ１２０精製表 段Ｗ−’ＪＪＬＬヱ乙Ｌｉ　■蛙匹　■１、培養上清　４０．ＯＬ　５５．　ｇ 　２１０．１ｍｇ０．４％２、ＵＰ濃縮物　３．７６　４４．９　１８０　０． ４３、ＤＥＡＥ　４．７５　８．５５　１４０　１．６４、フェニルｌｌＩｃ　 Ｏ，７２４０，９９６１５０１５５、エーテルｌｌＩｃ　Ｏ，２６００，３５４ １１０３１６、ゲル濾過　０．０２０　０．０５３　４８　９０１隻勇土 （１）　５Ｆ−２ｒｐ１２０とウィルス　１２０　との　虻、精製ｇｐ１２０を ＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動にかけてサイズと純度を評価した。該 タンパク質は、糖タンパク質の幅広の染色バンド特性をもつ１２０にタンパク質 の予測位置で移動した。この幅広のバンドは、他の単離物について記載されてい る、２２個の推定Ｎ−結合グリコシル化部位において予想される炭水化物不均一 性と一致する。ｍ換えｇρ１２０をウィルス粒子中に見いだされるものと比較す るために、ＨｒＶ−ＳＦ２怒染ＨＵＴ−７８細胞の溶解物を調製し、そして旧Ｖ 陽性ヒトおよびｇｐ１２０特異的動物血清を使用するウェスタンプロットにより 検査した。観察されるパターンは保存されたコンホメーシヨンと一致した。

（２）ｑ帽ｙμＬｒ１ｔ定。アミノ末端のアミノ酸配列を自動エドマン分解によ り決定した。観察された配列および推定された配列は次の通りであった： 観察された配列　ＥＫＬＷＶＴＶＹＹＧＶＰＶＷＫ、、。

推定された配列　ＴＥＫＬＷＶＴＶＹＹＧＶＰＶＷＫ、　、。

この配列は、異種シグナルがシグナルペプチドにより該シグナルのセリンの後で 正しくプロセシングされ、そしてタンパク質がいずれの追加のアミノ酸にも融合 しないことを示す、この配列はＨＴＬＶ１１１Ｂ１１離物からのウィルスｇｐ１ ２０上に見いだされるＮ末端スレオニンを欠＜　（Ｒｏｂｙら、ＰＮＡＳ（１９ ８６）８３ニア０２３−７０２７）　、　Ｎ末端アミノ酸配列は、この単離物の ＤＮＡ配列から推定されるＨＩＶ−３Ｆ２工ンベロープ配列と、少なくとも最初 の１５アミノ酸について合致する。

（３）ヱｌム鼠皿五。実施例３に記載のように精製したｇｐ１２Ｑの５つのロッ トにおいてアミノ酸分析を実施した。それらの値の平均は、ＤＮＡ配列から予想 される組成と、１ｌｅ（観察値３３．５対予想値３９）およびｓｅｔ　（観察値 ３２．７対予想値２４）を除く全てのアミノ酸について実験誤差の範囲内で一致 した。ｓ　ｅ　ｔ　４Ｋ　ハ５０ノド内で変動性であり、そしてこれは多分セリ ンに冨んだ汚染物を意味する。

（４）未゛　ゲル２気゛動およびＩ　Ｅ　Ｆ、　ｇｐ１２０の電荷不均質性は、 等電点電気泳動及び未変性ゲル電気泳動において明白であった。

等電点電気泳動は、エンベロープｐＨ５〜７内で複数のハンドの存在を明らかに した。このタンパク質は未変性ポリアクリルアミドゲルでは単一の幅広のハンド として移動した。

（５）立ンに成」１旦」−しＳ工。組換えｇｐ１２０の分子量はＳＤＳの存在下 で１２０にであった。ＳＤＳの不存在下の分子量はゲル濾過ＨＰＬＣにより測定 した。中イオン強度緩衝液中で中性ｐＨでは、精製ｇρ１２０は単一の主ピーク として溶出され、保持容量はＨ１３０にの分子量に相当した。少量の２量体も存 在した；２量体の画分は溶液中で貯蔵すると合計ｇｐ１２０の１０〜２０に増加 した。２量体画分をゲル濾過段階において単離し、そして別々に分析した。この 両分は、還元剤の存在下でＳＤＳゲル電気泳動により分析すると単量体として移 動したが、還元剤（２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトール）の不 存在下では２量体として移動したので、それは多分ジスルフィドド結合により結 合していた。２量体画分のアミノ酸組成は単量体画分のそれと区別できなかった 。２量体画分はまた、放射線免疫沈澱アッセイにより試験するとＣＤ４を結合し た。　ｇｐ１２０ゲル濾過ＨＰＬＣビークは、この分子量のタンパク質について 予想されるより広かった。　ｇｐ１２０について得られた余分のピーク幅は、炭 水化物成分の不均一性に帰することができる。存在する不純物に関してａｐ１２ ０の分子量が高いことは、フェニルＨＩＣ段階後の精製アッセイとしてゲル濾過 ＨＰＬＣの使用を可能にする。それは生産物のプールからａｐ１２０２量体含有 画分を排除するためのゲル濾過段階におけるアッセイとして日常的に使われた。

（６）別虹詰丘、この実施例において使用するＣＤ４は、外部頭載全体をコード する発現プラスミドによりトランスフェクトされたＣＨＯ＄ｉｌｌ胞系から誘導 された組換えの可溶性ＣＤ４であった。結合標準として使用するＣＤ４の生産に ついての詳細は実施例５に記載されている。結合実験はゲル濾過ＨＰＬＣによる 放射線免疫沈澱により実施した。

（ａ）　・　゛　の−　′、（例えば）　ｇｐ１２０を生産する細胞の集密的単 層を、システィンとメチオニンを含まないダルヘノコ改良イーグル培地（ｃ　ｙ 　ｓ　−ｍ　ｅ　ｔ−ＤＭＥ）中で標識した。１００＋Ｃｉ／ｍの各”Ｓ　ｍｅ ｔおよびｃｙｓを有する５ｊｆのｃｙｓ−ｍｅｔ−ＤＭＥを各Ｔ７５フラスコに ６〜８時間の間添加した。

標識された試料を収得し、遠心して細胞を除去し、そして使用するまで一８０Ｃ で貯蔵した。沈澱を行う試料を１×溶解緩衝液〔０゜１Ｍ　ＮａＣｌ　、　０． 　０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ？、５　、１量Ｍ　ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ４０．０ ．５％デオキシコール酸塩、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、１７■／ｄのアプロチニ ン］に調整した。

試料を１／１０容の正常ヤギ血清で４°Ｃにて３０分間予備浄化し、次いでプロ ティンＡセファロース（ＰＡＳ）（１／２容の２０％懸濁液）で４ＲＣにて３０ 分間沈澱させた。高度免疫処置動物またはＨＩＶ陽性ヒト血清試料からの免疫グ ロブリンを、標準技術によりＰＡＳを使用してアフィニティー精製した。血清を 最良のシグナル／ノイズ比について滴定した；大部分の免疫グロブリン画分を５ 〜１０＋ａｇ／試料で使用した。免疫沈澱は４Ｃにおいて１〜１２時間であ−っ だ。すべての試料を実験中同容量に調整した。ＰＡＳをＢＳＡ不含有溶解緩衝液 で洗浄し、次いで０．１２ＭＴｒ　ｉ　ｓ　ｐＨ７で洗浄し、そしてペレットを １ランムリー試料緩衝液中で可溶化し、沸騰させ、そしてゲルに適用した。ゲル をＥｎ’　Ｈａｎｃｅｌｌで処理し、乾燥し、そして蛍光光度測定した。

（ｂ）　・　゛　によるＣＤ４人。ＣＤ４を前述したように３ＳＳでＩｌｌし、 そしてＣＤ４の濃度を、ＣＤ４に対して惹起されたモノクローナル抗体およびポ リクローナルウサギ血清を使用する捕捉ＥＬＩＳＡにより決定した。共沈実験の ために、ＣＤ４を増加する量で固定量のｇｐ１２０　（１■）に添加して飽和量 を決定し、次いで抗ｇｐ１２０抗血清で共沈させた。この量のＣＤ４をａｐ１２ ０滴定実験に使用した。

標識したＣＤ４を前述したように正常血清で予備浄化した。標識成分を予備浄化 した後、ＣＤ４およびｇｐ１２０を４０において１時間の間違合体形成せしめ、 次いで未標識の成分に対する抗体を４ＲＣにおいて１時間の間添加した（Ｌｏｇ ／試料）、０ＫＴ４は０ｒｔｈ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｅｓから購入した。ＰＡＳ を４ＲＣにおいて１時間添加し、そして複合体を浄化し、前述したように電気泳 動用に調製した。

精製前および精製後のｇｐ１２０は、等量の添加したｇｐ１２０に対するバンド 強度が同等であることにより示されるように、このアッセイによるＣＤ４への結 合において両方とも有効であった。酵母中で生産されたｇｐ１２０の非グリコジ ル化類似体（ｅｎｖ２−３；米国特許出願第１３８，８９４号、１９８７年１２ 月２４日出＠）は、このアッセイにおいてＣＤ４に結合することができなかった 。５ｕｐｅｒｄｅｘ”　２００カラムから単離されたｇｐ１２０の２量体形は、 このアッセイにより同じ＜　ＣＤ４に結合した。結合の飽和はグラフで決定した 。１／２飽和レベルから、６．　９量ＭのＫｄが測定された。

（ｃ）ゲル゛ＨＰＬＣによるＣＤ４　人、精製ｇｐ１２０および未標準のＣＤ４ を、０．３Ｍリン酸カリウムｐＨ６，８を含む６〇−中で混合した。混合後、試 料の一部分（４５ｄ）をデュポンＣＦ−４５０ゲル濾過ＨＰＬＣ上に、ウォータ ーズＷＩＳＰ　７１２試料インジエクターを使って注入し、０．４Ｍリン酸カリ ウム、６．８中で１ｉ／分の流速で展開した。光学濃度を２１５０−においてモ ニターし、そしてデータをウォーターズのＭａｘｉｍａ８２０”クロマトグラフ ィーソフトウェアを使って記録した。

ＣＤ４およびｇｐ１２０をゲル濾過ＨＰＬＣカラムに別々に適用したとき、各成 分は予想される溶出時間のところで単一ピークを与えた（第４図参照；トレース ＡはＣＤ４のみ、トレースＢはｇｐ１２０のみである）、成分をクロマトグラフ ィー前に一緒に混合したとき、１６０Ｋに相当する溶出時間に新しいピークが現 れ、そして１２０におよび４０にのところのピークは減少した（第４図；トレー スＣ）。

この結果はＣＤ４とｇｐ１２０との間の１量１複合体の形成の直接的物証を提供 する。　ＣＤ４とｇｐ１２０の比を変えてそして反応体の異なる濃度で追加の実 験を実施した。これらの実験の結果は、ＣＤ４の１分子とｇｐ１２０の１分子と の間の高親和性複合体の存在を支持した。

大旌五呈 ＣＨＯ細胞をＡＤ−ｄｈｆｒと可溶性組換えヒ）ＣＤ４　（完全な外部領域）を コードする発現プラスミドとを用いて同時トランスフェクトせしめた。発現ベク ターは、ＣＤ４をコードする配列（ＵＣ５Ｆのり、Ｌｉｔｔｍａｎ博士から入手 した）をｐ　ＣＭＶ　６　ａ　（ｇｐ１２０コード配列を欠＜ｐｃＭＶ６ａ１２ ０　５Ｆ２）中にクローニングすることによって作製した。可溶性ＣＤ４を分泌 する細胞系を単離したＣＨＯＳ７４．２と表示する得られた細胞系は前述したよ うに一般に入手可能である。クローニングした遺伝子Ｓ７４．２は、経膜境界ま での４つの細胞外領域に相当する３８０アミノ酸をコードする。このタンパク質 の精製工程は２つのカラムを必要とする。まず、ＣＨＯ細胞の上清をＳ、セファ ロースカチオン交換カラム上に負荷し、そしてそれから溶出せしめた。１リンド ルのＣＨＯ上清を再蒸留水で１５リツトルに希釈し、そして０．２ｘＰＢＳ／２ ．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，Ｏ（伝導度３．６　ｏ　ｈｍ−’ｃｍ−’）中で 平衡化した３００ａｆの膨潤樹脂上に３．６リソトル／時の負荷速度で室温にお いて負荷した。二〇カラムを５００１ｄの０．２ＸＰＢＳ／２゜５ｍＭ　ＥＤＴ Ａおよび２００１ｄのＮａＣ１０，２ｘＰＢＳ　１２゜５ｍＭ　ＥＤＴＡで洗浄 した。１リツトルの２００５Ｍ　ＮａＣ１１０，２ｘＰＢＳ　１２．５ｍＭ　Ｅ ＤＴＡを用いて溶出を行った。

次いで、このＳ、セファロースカラムからの溶出液をモノクローナル抗体アフィ ニティーカラム上に流した。この精製に使用したモノクローナル抗体（２５−１ ０−Ｆ５．５ＣＩ　、以後２５−１Ｏ−Ｆ５と呼ぶ）は、ＣＤ４の細胞外領域の アミノ末端半分（最初の２つの免疫クロプリン様ドメイン内）の中のコンホメー ションエピトープを認識する。同一領域内のエピトープに対する特異性をもつ他 の抗体も同しく有効であろう。このＳ、セファロース溶出液を濾過しく０．４５ ミクロン）そして！＋ｄ／分またはそれより小さい流速でアフィニティーカラム 上に負荷した。負荷したカラムを蒸留水（２５×樹脂容量）で洗浄し、そして５ 量Ｍギ酸トリエチルアミンを用いて１０ｄ溶出緩衝液／４■ゲル樹脂で溶出せし めた。ｍＡｂ溶出液のｐＨをＩＭＴｒ　ｉ　ｓ　（ｐＨ８，０）でｐＨ７に調整 した。アフィニティーカラムから溶出された画分を透析し、そして濃縮した０表 １は精製手順の各段階における収率を示す。

種々の百分中の活性ＣＤ４のレベルは、補捉ＥＬＩＳＡにより、補捉試薬として モノクローナル抗体２５−１Ｏ−Ｆ５および検出試薬として精製ＳＴ４．２に対 して惹起されたウサギポリクローナル抗血清を使用して決定した。各カラムがら の画分および洗浄液を最初の上清および既知のＣＤ４標準物と比較した。これに より、どれだけ多くの活性ＣＤ４が各段階において回収されたかを定量すること ができた。それはまた、精製の各段階後の純度の増加を評価することができた。

これは、ＥＬＩＳＡにより決定した活性ＣＤ４の合計量（■）を、Ｐｉｅｒｃｅ タンパク質微量アッセイにより決定したタンパク質の合計ミリグラム数と比較す ることによって行った。これらの技術を使用して、Ｓ、セファロースカラムにつ いての収率は７６％であり、そしてアフィニティーカラムは７４％であり、５６ ％の全体収率が得られた。Ｓ、セファロースカラムは、単独で３１倍精製をもた らし、第１段階直後に９３％ＣＤ４である溶液を与えることに注目すべきである 。アフィニティーカラムはＳ、セファロースカラム溶出液の純度を＄質的に均質 にまで増加させた。

これらの最後の両分の純度を２つの方法で分析した。まず、タンパク質を１２％ ＳＤＳゲル上で展開し、そしてクーマシー・ブリリアント・ブルーで染色した。

この視的分析は、タンパク質が高度に精製されたことを示した；最終生成物の少 なくとも９５％はＣＤ４であった。アミノ酸分析をこのプロトコルに従い精製し たＳｒ１．２試料において実施すると、この物質が高度に精製されたことが示さ れた。

精製Ｓ　Ｔ　４　、　２　（７）ｇｐ１２０結合能力を、ＥＬ　Ｉ　ＳＡおよび ｇｐ１２０　；ｈラムの両者により分析した。Ｓｒ１．２はマイクロタイタープ レート上にコーティングすることができ、そしてｇｐ１２０結合活性を保持する であろう。ＣＤ４の種々のロットのｇｐ１２０結合を試験するために、マイクロ タイタープレートを各ロフトからの様々な濃度のＣＤ４と共ニインキユベートし 、次いで一定濃度のｇｐ１２０を全てのウェルに添加した。結合したｇｐ１２０ を、ｇｐ１２０に対するウサギポリクローナル抗血清（Ｒｂ抗ｅｎｖ２−３血清 ）を使って検出した。プレート上にコーティングされたＳｒ１．２の量が減少す るにつれて、力価決定される強いシグナルが見られた。ｇｐ１２０結合は、精製 ＳＴ４．２をｇρ１２０のアフィニティーカラム上に流すことによって、２つの ロットについて評価した。各両分のＣ０４含量は、前述のＳ７４．２に対するポ リクローナルウサギ抗血清を使った種々の画分のイムノプロット分析により決定 した。これらの結果は、ＣＤ４免疫反応性物質の１００％近くがカラム母材上の ｇｐ１２０に吸着され、そして特定のピークとして溶出されることを示した。

未変性および変性ＳＴ４，２をマイクロタイタープレート上にコーティングし、 そして種々のＣＤ４特異的免疫試薬が該タンパク質の２形態を認識する能力を比 較した。精製Ｓ７４．２で免疫処置することによって調製されたウサギポリクロ ーナル血清は、ＣＤ４の未変性および変性形態の両者を認識した；コンホメーシ ョンエピトープを認識することが知られている０ＫＴ４Ａは、未変性ＣＤ４と明 瞭に反応したが、変性されているタンパク質とは反応しなかった。モノクローナ ル抗体２５ｉ０−Ｆ５は０ＫＴ４Ａに類似した反応性パターンを示した。

精製ＳＴ４．２の調製物を一８０°Ｃおよび４℃において貯蔵し、そして（１） 未変性および変性ＣＤ４の両者を認識するウサギポリクローナル抗血清との免疫 反応性、（２）未変性ＣＤ４とのみ反応する０ＫＴ４Ａおよび２５−１Ｏ−Ｆ５ による認識、並びに（３）　ａｐ１２結合について周期的に試験した。０ＫＴ４ Ａおよび２５−１Ｏ−Ｆ５モノクローナル抗体並びにｇｐ１２０により評価され た活性の有意な低下が４°Ｃでの貯蔵時に観察された。しかしながら、−８０° Ｃで貯蔵した物質は完全な活性を保持した。さらに、精製ＳＴ４．２は反復して 凍結および解凍すると活性を損失することも認められた。

１旌汎旦 免疫処置実験を実施して、コンホメーションが保持される本発明のｇｐ１２０　 ｍ放物を使った中和抗体の生産を、コンホメーションが変わることが知られてい る他のｇｐ１２０分子のものと比較した。酵母中で調製され、変性されておりそ してグリコジル化されていないｇｐ１２０類似体（ｅｎｖ２−３）を比較抗原と して使用した０両者のｇｐ１２０物質は同−遺伝子源であるＩＩＩＩＶ−ＩＳＦ −２単履物から誘導した。抗体産生をヒヒにおいて表２に示す免疫処１スケジュ ールを使用して測定した。

特表平５−５０５６１６　（１８） 免疫原は次の方法で調製した： （１）グループ１および２：１部の抗原（ｇｐ１２０またはｅｎｖ２−３）を２ 部の不完全フロインドアジュバント（ＩＣＦＡ）に添加し、注射器により混合し 、そして５００　ｍ／動物を注射した。

（２）グループ３および４：抗原／ＭＴＰ−ＰＲアジュバントのバイアルを室温 に加温し、１分間渦動撹拌し、そして５００　ｍ／動物を３０分以内に注射した （必要に応じて再混合した）。

（３）グループ５および６：抗原／ミョウバンのバイアルを室温に加温し、１分 間渦動撹拌し、そしてＳＯＯＨ１／動物を３０分以内に注射した（必要に応じて 再混合した）。

免疫処置は実験の開始時並びに実験開始後４，８．１２および２０週ロー実施し た。血液試料を実験の開始時（採血前）および結果を報告する表（下）に示す時 間に採取した。

た動物は、全てのアジュバント群において相同単離物ＨＩＶ−５Ｆ−２に対して 中和活性を示し、そして１つのアジュバント群（ＩＦＡ−ＭＴＰ）においてＨＩ Ｖ−ＭＮに対する中和を示す（７匹の動物のうちの３匹）。

この抗原で）ＩＴＶ−１（ＴＬシー１１１Ｂに対して検出可能な中和を示す動物 は１匹である。

対照的に、ｇｐ１２０で免疫処置した動物のすべてが、４回および５回の免疫処 置後、３つのアジュバント群全てにおいてＨＩＶ−３Ｆ２および旧Ｖ−？ＩＮに 対する中和活性を示す、８匹のｇｐ１２０免疫処置動物のうちの６匹は、ｔｌｌ Ｖ−１１ＴＬＢ［ＴＢに対しても有意な中和活性を有し、そして該動物は３つの アジュバント群全てからのものである。

若い成体（雄／雌）のヒヒ（Ｐａｐｉｏ）を２つのアジュバントの１つの中に配 合した５５■のｇｐ１２０で免疫処置した：水酸化アルミニウム（ミョウバン、 ０．８ｇ／投与）；または不完全フロインドアジユバント＋２５０■のムラミル トリペプチド（ＩＦＡ−ＭＴＰ）、動物をほぼ４週毎に免疫処置し、そして血清 をエンベロープ特異的力価の損失についてモニターした。この標準における各動 物についての抗原特異的応答を要約するデータを表５および表６に記載する。エ ンベロープ特異的力価は各追加免疫後にピークとなり、次いで下降した。ミョウ バンおよびＩ　ＦＡ−ＭＴＰの力価はほぼ１０倍異なることに注目すべきである 。ベースライン力価は休止の６力月後に到達し、次いで動物を１月の間隔で再追 加免疫した。ウィルスの中和におけるエンベロープ抗体の有効性をを測定するた めに、血清を、試験管内中和アッセイにおいて、相同旧Ｖ−３Ｆ２および異種ウ ィルス単ｇｌＩ物の両者に対して試験した。血清は既知の高エンベロープウィル ス中和力価の時点、１０週目（３回の免疫化後）、休止前２３週目（５回の免疫 化後）、および休止後の追加免疫後５７週目（６回の免疫化後）において試験し た。次の２つのウィルス中和（１９８８）、Ｈ，Ｇｉｍｓｂｅｒｇら編、Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　。

ｐ３４７−３５５に記載されている〕および感染性中心阻害アッセイ（Ｎａｒａ ら、ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、Ｈｕｍ、Ｒｅｔｒｏｖ、（１９８７）３：２３８−３０ ２）　、表５に示すように、ＨＩＶ−３Ｆ２およびＨＩＶ−Ｍｎに対して有効な 中和抗体は、両者のアジュバント群において、３回の免疫処置後のみにおいて発 生し、そして力価はそれ以上の追加免疫後に維持されるか、あるいは増加した。

表６において、Ｉ（ＩＶ−Ｂ！ｌｔｌおよびＩＩＩＶ−）ＩＴＬＶＩＩＩＢ特異 的中和抗体は５回および６回の免疫化後に再現的に観察された；６回の免疫処置 後、１（ＩＶ−ＺＲ６に対する力価は観察されなかった。全体的に、相同ＳＦ２ および異種の中和力価は、ミョウバンの動物よりＩＦＡ−ＭＴＰにおいて高かっ た。

６回の免疫処置後最高に応答するｇＰ１２０免疫処置ヒヒから集めた血清を、さ らに、追加の単離物ＨＩＶ−３Ｆ２　、）ＩＩＶ−？ＩＮ、　ＨＩＶ−ＲＦ、　 ＨＩＶ−ＣＧ、１１１Ｖ−ＺＲ６およびＩＩＩＶ−ＮＤＫを中和する能力につい て試験した（表７ａ）。

ＨＩＶ−ＳＦ２中和力価はｐ２４ｇａｇ阻害アッセイにより決定したが、＋（Ｉ Ｖ−ＭＮ中和はＮａｒａらの感染中心プロトコルによりアッセイしたことに注意 すべきである。こうして、これらの２つの単離物の中和における顕著な差は、一 部分、使用した２つの異なるアッセイにより説明することができる。

このデータが実証するように、物質のコンホメーションを保持するｇｌ＋１２０ タンパク質は、天然のコンホメションを保持しない形態よりも、交差中和抗体の 産生においていっそう有望である。

裏胤阻１ ヒヒのＩＦＡ−ＭＴＰ群の反復した免疫処置を実施して、組換えの天然のグリコ ジル化ｇｐ１２０への追加の繰返し暴露がなお広範囲の単Ｈ物の中和において有 効な抗体を生しうるかどうかを決定した。

繰返し免疫処置は、ＨＩＶ−５Ｆ２　、）ＩＩＶＪＮＳＨＩＶ−１２Ｆ、または ＨＩＶ−ＣＣニ対する中和抗体の力価を著しく変更しなかった。しかしながら、 繰返し免疫処置は、アフリカ単離物ＨＩＶ−ＺＲ６およびＨＩＶ−Ｎ［ｌＫに対 する低力価の中和抗体の出現を引き起こした（表７　ｂ　）　、　ＨＩＶ−ＺＲ ６中和の一時的発生は、組換えの天然のグリコジル化ｇｐ１２０で０．５，６゜ ７．８および９回免疫処賀した後に分析したヒヒ２９６４の血清からのライスル 中和データ（第５図）をグラフにすることによって検査した。

実験の血清を含有するウェル中の合胞体形成単位／ｄ　（ｓｆｕ　／ｄ）の数（ Ｖｎ、二重反復実験のウェルの平均）を測定し、そしてこの数をｓｆｕ／ｄのウ ィルス単独（Ｖｏ、８つの複製ウェルの平均）で割ることによって、中和を記録 した。この分数Ｖ　ｎ　／　Ｖ　ｏを血清試料の希釈に対してプロットし、そし てＶｎの９０％の減少、すなわち、Ｖｎ／Ｖｏ＝０．１を可能にする血清希釈を 認めることによって中和を記録した。試料は右の凡例により示し、ここで数は採 血に対応する。採血０は採血前であり、これはウィルス中和を示さない。

採血１２は５回の免疫処置後；採血２２は６回の免疫処置後；採血２４は７回の 免疫処置後；採血２７は８回の免疫処置後；採血２２は９回の免疫処置後である 。

第５図において明らかなように、繰り返し追加免疫は中和曲線の傾斜をシフトし 、こうして中和は採血３２（９回の免疫処置後）に検出された。これらの結果が 実証するように、抗体産生性クローンについて選択した繰返し追加免疫はより広 い特異性を有する。

ス１１１＝ ３頭の個々のヒヒ２９６４および２９５８からのすべての血清試料の分析を、組 み換え変性した、比グリコジル化タンパク質および組み換え自然、グリコジル化 （ｇｐ１２０　）免疫化動物における差を線描写した（第６図）。ヒヒ２９６４ を組み換え自然グリコジル化タンパク質でワクチン接種し、そしてヒヒ２９５８ を組み換え、変性、非グリコジル化タンパク質でワクチン接種した。ＨＩＶ−Ｓ Ｆ２の中和は、Ｈｉｇｗｏｏｄ　ｅｔ　ａｌ、、ＡＩＤＳ、Ｒｅｓ、ａｎｄ　Ｈ ｕｍ、Ｒｅｔｒｏｖ、（１９９０）旦：８５５−８６９に記載されているｐ２５ ｇａｇ阻害アッセイによりアッセイした。すべての他の分離物は感染性癌の阻害 アッセイによりアッセイした。各採血からの血清をＨＩＶ−３Ｆ２　、ＨＩＶ− ＭＮおよび旧Ｖ−１１ＹＬＶＩＩＩＢニ対してウィルス中和活性についてアッセ イした。変性、非グリコジル化タンパク質を使用するそれ以上の促進は抗体また は中和力価を週１０で測定したレベルを越えて増加させず、そしてＦＩＩＶ−Ｈ ＹＬＶＩＩｒＢの検出可能な中和は存在しなかった。　ｇｐ１２０免疫化動物に おいて、ＩＩＩＶ−５Ｆ２　、ＦＩＩＶ−ＭＮおよびＨＩＶ−１１ＴＬＩＩＩＢ 力価は各促進後増加し、最大の増加は休止後に観測された。中和する活性のパタ ーンはすべての３つのウィルス゛について類似するが、応答の大きさは異なった 。　ＨＩＶ−［ＩＴＬＩＩＩＢの中和の出現は他の２つの分離物に関して遅延し た。下の実施例９に記載するヒヒにおける追加の実験において、ＭＦ５９中で配 合した組み換え変性、非グリコジル化タンパク質はＨＩＶＪＮまたはｔｌＩＶ− ＢＲＵの中和活性に対して中和を誘発することができないことをわれわれは実証 した（データは示されていない）　、ｇｐ１２０血清はこれらの３つの分離物な らびにＩＩＩＶ−ＺＲ６を反復した促進後中和した（表８）。

第６図は、変性、非グリコジル化ｇｐ１２０で免疫化したヒヒ２９５８、および 自然、グリコジル化ｇｐＬ２０で免疫化したヒヒ２９６４からのすべての血清試 料の中和力価を示す、１組のグラフである。これらの動物の免疫化は実施例６に 記載されている。

裏施五ｌ ヒヒは次のものと配合した５５■のｇｐ１２０で免疫化した：ムラミルトリペプ チド−ホスファチジルエタノールアミン、１００■、を含有するミクロ流動化乳 濁液（？ＩＦ５９）　；または不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）。ＭＦ ５９の処方は水中の５％のスクアレン、０．５％のＴｉ＊ｅｅｎ−８０，０，５ ％の５ｐａｎ−８５および内因性ＭＴＰ−ＰＥ　０　、　４　ｔｇ／Ｈ１であり 、これをマイクロフラッダイザーで乳化し、そしてアルゴン雰囲気下に使用する まで貯蔵した。次いで、それを抗原と重連により混合し、そして注射した。ヒヒ についての抗原特異的応答を要約するデータを表８に示す、　ｇｐ１２０特異的 力価は、また、この研究において各促進後、ピークとなり、次いで傾斜した。よ り高い力価はＩＦＡより−Ｆ５９を使用して達成された。ウィルスの中和はウィ ルスの相同性または異種の分離物について試験し、週１０．２４および３８、そ れぞれ、３．４および５回の免疫化後において決定した。これらのアッセイの結 果を表８に要約する。この研究において、ＭＰ５９群の動物は、ＩＦＡ群より、 高い力価およびその群において陽性の動物の大きい比率を有した。　ＨＩＶ−３ Ｆ２および）ＩＩＶ−ＭＮに対して有効な中和力価は３回の免疫化後に、そして ＩＩＩＶ−ＨＴＬＩＩＩＢおよびＨＩＶ−Ｚｌｌ１６に対して５回の免疫化後に 観測された。　門Ｆ５９中の組み換え自然、グリコジル化ｇｐ１２０で免疫化し た動物は、５回のみの免疫化後ＨＩＶ−ＢＲＵおよびｌ（ＩジーＺＲ６の中和に おいて有効な抗体で応答した。前の研究において、アフリカの分離物の中和は８ 回（ＨＩＶ−ＮＤＫ）または９回（ＨＩＶ−ＺＲ６）の免疫化後にのみ達成され た。さらに、実施例９においてアジュバントＭＦ５９中の組み換え自然、グリコ ジル化ｇｐ１２０でＨｒｖ−ＺＲ６に対して達成された力価はより高かった。ま た、旧Ｖ−ＢＲＵおよび）ＩＩＶ−ＺＲ６に対してを効な中和性抗体の出現は、 前述の実施例６と対照的に、この研究において同時であった。この結果はアジュ バントまたは免疫化の養生法のためであり、これは実施例６における単一の長い 休止期間と比較して、実施ｇ４９において２つのより短い休止期間を可能とした 。

スｍ史 ヒヒについて前述した手順に類似する手順に従い、４頭のチンパンジー（Ｐａｎ 　ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）を５５■のａｐ１２０＋アジュバント２ＸＭＦ５９ （２頭の動物）、アジュバント単独（１頭の動物）で免疫処置するか、あるいは 免疫処置しないで、この種の霊長類、人間に最も近い生存動物におけるタンパク 質の免疫原性を決定した。実験計画は第７図に記載する。第７図において、陰影 を付したバーは３つの研究の各についての時間線（免疫処１スケジュール）を表 す：実施例６のヒヒ（上部の線）、実施例９のヒヒ（中央の！Ｉ）、および実施 例１０のチンパンジー（下の線）１時間の目盛り（週）はこの図面の下に示され ている。免疫処置は垂直線により示し、上の番号は注射の時開の線上の位置にお いて免疫処置の数を示す、実施例６におけるヒヒは第０．４，８，１２，２１， ５５．５９．６５および８０週において免疫化したが、ただしヒヒ２９６４は第 ８０週の代わりに第８２週に免疫処置した。実施例９におけるヒヒは第０．４， ８．２２および３６週に免疫処置した。チンパンジーは第０．４．８および２８ 週に免疫処置した。２％ＭＦ５９の処方は１０％スクアレン、１％Ｔｗｅｅｒ＋ −８０，１％５ｐａｎ−８５および内因性ＭＴＰ−ＰＥ　（０，４ｇ／ｄ）であ り、これを微流動化装置で乳化し、そしてアルゴン雰囲気下に使用するまで貯蔵 した０次いで、それを振盪により抗原と混合し、そして注射した。動物を１ケ月 の間隔で筋肉内注射し、そして血清を各免疫処置後の採血のエンベロープ特異的 力価およびウィルス中和抗体について分析した０組換えの天然グリコジル化で免 疫処置した２頭のチンパンジーについてのデータを表９に要約する。他方の対照 のチアンパンジーはｇｐｔｚｏ特異的抗体または中和抗体のいずれも発生しなか った（データは示されていない）。組換え天然グリコジル化タンパク質で免疫処 置した両者の動物は免疫処置抗原に対してすぐれた応答を示し、そして両者の動 物はＨＩＶ−３Ｆ２およびＨＩＶ−ＭＮに対して有効なウィルス中和抗体を有す る。チンパンジーの１つからの血清は、また、３回の免疫処置後ＨＩＶ−ＨＴＬ νＩＩＩＢを中和した。チンパンジーを６力月の休止期間後に追加免疫し、そし て血清をこの免疫処置に分析する。［ＩＩＶ−５Ｆ２に対するウィルス中和力価 が十分に高いとき、動物は旧Ｖ−５Ｆ２のチンパンシー力価測定ストックでチャ レンジする。

チンパンジーをチャレンジの２週前に再免疫処置する。異種単ＷＩｉ物に対して 有効な中和抗体の存在を仮定すれば、これらの同一動物において異種ウィルスチ ャレンジに対する可能性も存在する。

本発明を今まで十分に記載したが、多数の変更および改良を添付の請求の範囲の 精神および範囲から逸脱しないで行うことができることは当業者にとって明白で あろう。

生物学的材料の寄託 次の代表的材料は、１９９０年１１月７日に、アメリカン・タイプ・カルチャー ・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏ口、米国メリーランド州ロンクビル）に寄託され、そして指摘の ように命名された。これらの寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認 に関するブダペスト条約の規定に従って維持されるチャイニーズハムスター卵巣 細胞 ＣＨＯ−６ａ１２０−１４５−０．１−２２ＣＲＬ　１０３７９１９９０年３月 ９日 チャイニーズハムスター卵巣細胞 ＣＨＯ−ＤＧ４４　ＣＲＬ　１０３７８１９９０年３月８日 Ｅ、コリ ８８１０１（ｐｃＭＶ６ａ１２０−ＳＦ２）６８２４９１９９０年３月８日 これらの寄託物は当業者にとって単に便宜性のために提供され、そして寄託物が ３５Ｌ１．Ｓ、Ｃ，１１２の下に要求されるという許可ではない、これらのプラ スミドの核酸配列、並びにそれらによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配 列はここに参考として加えられ、そして本明細書の記載と矛盾する場合には照ら し合わせている。寄託物を製造、使用、または販売するためにはライセンスが要 求され、そしてこのようなライセンスはここで許されていない。

浄書（内容に変更な′−１ 浄ＩＦ（内容に変更なし） ｋｌｔＶｌ　ｇ’Ｗ　ｅｏｎｔ’ｄ ｒ：にｕ肛　２−２ Ｎ：ｖ１ＥＮ′ｖＩ：ｏｆＩｔＩｄ Ｆ工ＧＵＲＸ　２−３ ＨＸ’１１ＥＷ　ｃ＋ｓｒ＋ｔ’ｄ ＨＸｆ１ｔ）Ｎ　ｃ＋ｓｎｔ’ｄ ＦｒにｔＪＲＥ　２−６ ”　′：：ｃｕＵ＋　２−７ Ｈ！ＶＩ　Ｄｌ’Ｖ　ａ１ｙＩｔ’ｄ Ｍｎｎ　ＥＮＶ　ｃａｎｔ’ｄ ｎＧＵＲＸ　２−１０ Ｍｒ２−１Ｏｃｏａｔ’５ｌ ｎＧＵｕ　２−１１ ＨＸＶｌＯＮ　ｅｗ＋ｔ’ｄ Ｍ！Ｙ１　０ｆｆ　ｍｔ’１ １４！ＹＩ　ＥＮ′ｌ／　ｃｅ＋＋ｔ’ｄＦ’ＺにＯＲ１２−Ｌ４ １４！ＶＩ　ＥＮＶ　ｃｏｎｔ’ｄ ｒＸＧｔＪＲＸ　２−１５ ＮｒＶＩ　ＥＷ　ａｏｎｔ’＋１ 浄書（内容に変更ない 分 浄書（内容に変更なし） ｒＩＧυＲＥ４ 浄書（内容に変更な１） 週 週 週 浄ｔＦＦ内容に変更なし） Ｆｉｇｕｒｅ乙 浄書（内容に変更なし） 要約書 天然のウィルスＨＩＶ　ｇｐ１２０　と実質的に同じタンパク質／タンパク質結 合特性を有する糖タンパク質を提供するような組換えＨＩＶ　ｇｐ１２０の精製 方法であって、粗ｇｐ１２０を含む組成物を（１）イオン交換クロマトグラフィ ー、（２）疎水的相互作用クロマトグラフィーおよび（３）サイズ排除濾過を順 次使って分画し、そして各段階においてＣＤ４ペプチドに対する特異的結合親和 力を示す両分を収集することを含んで成る精製方法が提供される。該方法は、任 意のアフィニティー精製段階またはタンパク質と有機溶媒との接触を使う任意の 段階の非存在下で行われる。この方法により得られるタンパク質は、ＣＤ４に対 する結合親和力およびＨＩＶ感染性を中和することのできる少なくとも１つの抗 体に対する結合親和力といった、旧ソウィルス上に提示されるｇｐ１２０と実質 的に同しタンパク質／タンパク質相互作用特性を有する、精製された全長の未融 合の組換え旧Ｖ　ｇｐ１２０　塘タンパク質である。

手続補正書Ｃ方式ン 平成４年ｌＯ月１２日

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．ＨＩＶｇｐ１２０を精製して、天然のウイルスＨＩＶｇｐ１２０と実質的に 同じタンパク質／タンパク質結合特性を有する精製されたｇｐ１２０糖ペプチド を調製する方法であって、 ａ．全長のグリコシル化ｇｐ１２０を含有する粗ｇｐ１２０調製物をイオン交換 クロマトグラフィーにより分画して、第１画分収集物を提供し、 ｂ．前記第１収集物から、ＣＤ４ペプチドに対して特異的結合親和力を示す画分 を選択し、これにより第１の分画された物質を生成せしめ、 ｃ．前記第１の分画された物質を疎水的相互作用クロマトグラフィーにより分画 して、第２画分収集物を提供し、ｄ．前記第２収集物から、ＣＤ４ペプチドに対 して特異的結合親和力を示す画分を選択し、これにより第２の分画された物質を 生成せしめ、 ｅ．前記第２の分画された物質をサイズ排除クロマトグラフィーにより分画して 、第３画分収集物を形成せしめ、そしてｆ．前記第３収集物から、ＣＤ４ペプチ ドに対して特異的結合親和力を示す画分を選択し、これにより前記精製されたｇ ｐ１２０を提供する、 ことを含んで成る方法。
2. ２．前記イオン交換クロマトグラフィーが第三アミン交換基を有する固体支持体 上で実施される、請求項１の方法。
3. ３．前記固体支持体がジエチルアミノエチル置換デキストランである、請求項２ の方法。
4. ４．前記クロマトグラフィーがＨＰＬＣである、請求項３の方法。
5. ５．段階（ａ）における分離がｐＨ６〜において実施される、請求項４の方法。
6. ６．前記疎水的相互作用クロマトグラフィーがフェニルまたは脂肪族側基を有す る固体支持体上で実施される、請求項１の方法。
7. ７．前記疎水的相互作用クロマトグラフィーが２つの副段階において実施され、 第１副段階において固体支持体はフェニルアガロースであり、そして第２副段階 において固体支持体は脂肪族エーテルアガロースである、請求項６の方法。
8. ８．副段階が共にＨＰＬＣである、請求項７の方法。
9. ９．段階（ｃ）における前記分離が減少する硫酸アンモニウム勾配を使って実施 され、初期濃度は約４０％飽和である、請求項８の方法。
10. １０．前記ゲル濾過クロマトグラフィーがｇｐ１２０より小さい分子を遅延する ことができる支持体を使用する、請求項１の方法。
11. １１．前記ゲル濾過の支持体が約５０，０００〜２００，０００の分画範囲を有 する、請求項１０の方法。
12. １２．前記ゲル濾過クロマトグラフィーがＨＰＬＣである、請求項１１の方法。
13. １３．次の段階： ａ．全長の非融合のグリコシル化ｇｐ１２０タンパク質を含有する細胞培地を集 め、前記細胞培地は前記ｇｐ１２０を発現する非ＨＩＶ感染細胞と接触している 順化培地であり、そしてｂ．ｇｐ１２０の分子量より小さい分子量を有する分子 を前記培地から除去することによって前記培地を濃縮し、これにより前記粗調製 物として使用される濃縮細胞培地を生成する、を更に含んで成る、請求項１の方 法。
14. １４．前記第２の分画された物質を、段階（ｅ）の前に、強アニオン交換クロマ トグラフィーにかける、請求項１の方法。
15. １５．前記強アニオン交換クロマトグラフィーが、第四アンモニウム交換基を有 する固体支持体を使用する、請求項１４の方法。
16. １６．前記強アニオン交換クロマトグラフィーがｐＨ７〜９において実施される 、請求項１５の方法。
17. １７．ＨＩＶウイルス上に提示されるｇｐ１２０と実質的に同じタンパク質／タ ンパク質相互作用特性を有し、そして他のタンパク質を実質的に含有しない、精 製された全長の非融合組換えＨＩＶｇｐ１２０糖タンパク質。
18. １８．前記特性が、 ａ．ＣＤ４に対する結合親和力； ｂ．ＨＩＶ感染性を中和することができる抗体に対する結合親和力；または ｃ．ｇｐ４１に対する結合親和力 を含んで成る、請求項１７の糖タンパク質。
19. １９．ＣＤ４に対する結合親和力が、ゲル濾過アッセイを使ってＣＤ４に結合す るｇｐ１２０の画分を決定することによって測定される、請求項１８の糖タンパ ク質。
20. ２０．前記抗体がチンパンジーまたはヒトの抗体である、請求項１９の糖タンパ ク質。
21. ２１．前記糖タンパク質が、 ａ．全長のグリコシル化ｇｐ１２０を含有する粗ｇｐ１２０調製物をイオン交換 クロマトグラフィーにより分画して、第１画分収集物を提供し、 ｂ．前記第１収集物から、ＣＤ４ペプチドに対して特異的結合親和力を示す画分 を選択し、これにより第１の分画された物質を生成せしめ、 ｃ．前記第１の分画された物質を疎水的相互作用クロマトグラフィーにより分画 して、第２画分収集物を提供し、ｄ．前記第２収集物から、ＣＤ４ペプチドに対 する特異的結合親和力を示す画分を選択し、これにより第２の分画された物質を 生成せしめ、 ｅ．前記第２の分画された物質をサイズ排除クロマトグラフィーにより分画して 、第３画分収集物を提供し、そしてｆ．前記第３収集物から、ＣＤ４ペプチドに 対する特異的結合親和力を示す画分を選択し、これにより前記精製されたｇｐ１ ２０を調製する、 ことを含んで成る方法により調製される、請求項１７の糖タンパク質。
22. ２２．（１）ＨＩＶウイルス上に提示されるとｇｐ１２０と実質的に同じＣＤ４ 結合特性を有する、精製された全長の非融合ｇｐ１２０糖タンパク質および（２ ）アジュバントを含むワクチン。
23. ２３．前記特性が、 ａ．ＣＤ４に対する結合親和力； ｂ．ＨＩＶ感染性を中和することができる抗体に対する結合親和力；または ｃ．ｇｐ４１に対する結合親和力 を含んで成る、請求項２２のワクチン。
24. ２４．前記ワクチンが、 ａ．全長のグリコシル化ｇｐ１２０を含有する組ｇｐ１２０調製物をイオン交換 クロマトグラフィーにより分画して、第１画分収集物を提供し、 ｂ．前記第１収集物から、ＣＤ４ペプチドに対する特異的結合親和力を示す画分 を選択し、これにより第１の分画された物質を生成せしめ、 ｃ．前記第１の分画された物質を疎水的相互作用クロマトグラフィーにより分画 して、第２画分収集物を提供し、ｄ．前記第２収集物から、ＣＤ４ペプチドに対 する特異的結合親和力を示す画分を選択し、これにより第２の分画された物質を 生成せしめ、 ｅ．前記第２の分画された物質をサイズ排除クロマトグラフィーにより分画して 、第３画分収集物を提供し、そしてｆ．前記第３収集物から、ＣＤ４ペプチドに 対する特異的結合親和力を示す画分を選択し、これにより前記精製されたｇｐ１ ２０を調製する、 ことを含んでなる方法により調製される、請求項２２のワクチン。
25. ２５．抗体を発現することができる系を上記の糖タンパク質と接触させることを 含んで成る、少なくとも１つの哺乳動物種においてＨＩＶウイルス単離物による 感染を中和することができる抗体の形成を刺激する方法。
26. ２６．前記系が試験管内系である、請求項２５の方法。
27. ２７．前記哺乳動物が霊長類である、請求項２５の方法。
28. ２８．全長のグリコシル化組換えｇｐ１２０を精製する方法において、細胞培地 から得られた前記ｇｐ１２０を、ＳＤＳゲル電気泳動により測定した時少なくと も９５％の純度に精製し、ここで前記精製はゲル濾過、イオン交換および疎水的 相互作用クロマトグラフィーから成る群より選択されるクロマトグラフィー技術 を使用し、ただし（１）抗体と前記ｇｐ１２０との間の結合相互作用が前記精製 の間のいずれの時点においても起こらない、 ことを含んで成る改良方法。
29. ２９．有機溶媒と前記ｇｐ１２０との間の接触が前記精製の間のいずれの時点に おいても起こらないという前提を更に有する、請求項２８の方法。
30. ３０．前記精製が（１）カチオン交換クロマトグラフィー、（２）疎水的相互作 用クロマトグラフィー、および（３）ゲル濾過の順次段階を前記細胞培地に適用 することを含んで成る、請求項２８の方法。
31. ３１．前記段階がすべてＨＰＬＣ段階である、請求項３０の方法。
32. ３２．治療的有効量の請求項２２のワクチンを含んで成る、治療によるＨＩＶ− １感染動物の処置に使われる組成物。
33. ３３．有効量の請求項２２のワクチンを含んで成る、動物におけるＨＩＶ−１感 染の予防に使われる組成物。
34. ３４．ＨＩＶ−１感染を減少または排除するために治療を必要とする動物に治療 的有効量の請求項２２または３２の組成物を投与することを含んで成る、治療に よる動物の処置方法。
35. ３５．有効量の請求項２２または３３の組成物を動物に投与することを含んで成 る、動物におけるＨＩＶ−１感染の予防方法。