JPH05504046A

JPH05504046A - 農業用化学物質スクリーニング法

Info

Publication number: JPH05504046A
Application number: JP50681789A
Authority: JP
Inventors: フィッツモーリス，レオナ・クレア; ラム，クリストファー・ジョン
Original assignee: シビア・ニユーロサイエンシズ・インコーポレイテツド
Priority date: 1988-05-20
Filing date: 1989-05-18
Publication date: 1993-07-01
Also published as: EP0416032A1; EP0416032A4; WO1989012230A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】農業用化学物質スクリーニング法発明の分野本発明は、一般に農業用化学物質を分析するための方法および組成物に関する。

より詳細には、本発明は形質（ｔｒａｉｔ）特異性植物遺伝子の転写を誘発するのに有用であると思われる農業用化合物を確認するための新規なスクリーニング法に関する。

さらに本発明は、遺伝子転写を調節することにより農業用化学物質に応答する、植物由来の形質特異性核酸配列を確認する方法に関する。最後に本発明は、植物防御遺伝子の選択的誘発を制御する調節要素に関する。

発明の背景農業用化学物質（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ａｇｒｉｃｈｅｍｉｃａＬｓ）は化学工業における何十億ドルもの製品部分の基礎をなす。

農業用化学物質は殺虫薬、除草薬および植物成長調節薬として用いられる。一般に化学系企業は目的とする特性または活性をもつ１種類または数種類を確認するために何＋万もの化学物質をスクリーニングする。これらのスクリーニング法は労力を要し、時間を費やし、かつ極めて経費がかかる。

現在用いられているスクリーニング法には、全植物アッセイ法から補乳動物細胞におけるインビボ試験までのすべてが含まれる。たとえば全植物アッセイ法は除草活性に関して化学物質を試験するために用いられる。実生植物の畑地に種々の化合物を散布し、化学物質の作用を監視する。殺虫活性はたとえば特定の有害昆虫に対して施される種々の化合物の作用を調べることにより確認される。既知の酵素経路に対する殺虫活性が目的の作用を生じると仮定される場合、異種系におけるインビトロアッセイ法が開発される。

植物成長調節薬に関するアッセイ法はよりいっそう時間を費やし、かつ複雑である。たとえばダイズにおける老衰を遅延させつる植物成長調節薬を確認するためには、現在利用しつる方法を用いると、ダイズ植物を成熟するまで成長させ（この過程で３−４力月を要する）、次いで各組の植物に種々の化学物質を作用させる必要がある。これは時間を費やし、経費のかかる方法である。

化学工業は近年、植物の化学的な謎を解明するためにバイオテクノロジーに転向した。このバイオテクノロジーは、植物が外的刺激に対して目的の応答を示すべく誘発される過程への新たな洞察をもたらした。ここに述べるように植物は特定の化合物で処理されると植物防御応答を示すべく誘発される可能性をもつ。同様にここに述べるように、これらの応答を制御する遺伝子調節要素をクローン化し、リポータ−遺伝子に融合させることができる。次いでこの構造体を全植物または植物細胞に移入し、これを用いてこれらの遺伝子調節要素からの転写を誘発しうる農業用化学物質のアッセイ法を開発することができる。

目的の形質または応答を調節する遺伝子調節要素がいったん確認されると、上記アッセイ法を容易に多種多様な形質および応答に拡大することができる。これらの要素を確認する方法をここに記載する。このような方法が可能な形質または応答には、品質を改良し、収穫量を増大させ、または収穫を促進する植物生活過程またはその構造の大部分が含まれる。このような生活過程の例には下記のものが含まれる４発根および植物の繁殖、発芽および休眠、開花、生殖予形成、脱落、結実および成長、植物および器官の大きさ、わき芽の形成、自己剪定、形の形成、分けつ、昆虫および病害に対する抵抗および抑制、環境ストレスの克服、鉱物の取り込み、植物の組成、成熟および収穫量増大を含めた代謝作用、性的表現の修飾、老衰、乾燥、除草剤による損傷に対する防御、ならびに除草剤の吸収および移動の増大。遺伝子転写の変化により仲介されるこれらの過程はすべて、ここに開示および記載する農業用化学物質スクリーニングアッセイ法における定義に従い、利用しうるものである。

適切であれば、これらのスクリーニングアッセイ法は、農業用化学物質工業に著しい時間および経費の節約をもたらす。その後標準的な実生スクリーニング法により試験するための最初の有望な農業用化学物質の選択は数カ月から数日に短縮されるであろう。実際の実生スクリーニング回数は大幅に減少すると思われる。

それに伴う労働および植物成育期間が標準アッセイ法より著しく少ないので、これらのアッセイ法によって可能性のある農業用化学物質工業種を新規化合物につきごく短時間でスクリーンすることができるであろう。これと共に、新たな研究所および温室のための資本的支出、ならびに付随する操作費の著しい節約が実現されるであろう。

先に示唆したように、ある農業用化学物質が特定の形質、たとえば成長またはストレス防御に伴う分子的事象に与える影響を分析するために重要なことは、その形質に付随する遺伝物質（すなわち核酸）を確認および単離し、次いでこの単離された遺伝物質をその農業用化学物質に対する応答が直接にかつ明確に測定される厳密に制御された環境内に置くことである。本発明は目的の形質に付随する遺伝物質を確認および単離するための手段を提供する。本発明はさらに、これらの確認および単離された遺伝物質を用いてそれらの遺伝物質に対する農業用化学物質の作用を、また推定により目的形質に対する作用を評価する方法を提供する。

本発明は、植物に形質特異的に作用する産生蛋白質をコードする遺伝子に付随する植物調節要素に関する幾つかの知見に基づく。第１の知見は、形質特異性遺伝子の転写に関与するＤＮＡ配列を生化学的方法および分子分析法の併用法により確認しつるということである。確認されると、これらの調節要素を植物ゲノムから単離し、解明することができる。第２の知見は、単離された植物遺伝子調節要素を用いて特定の農業用化学物質がこの単離された調節要素に与える作用を、また推定によりその農業用化学物質が形質特異性遺伝子および形質自身に与える作用を評価しつるということである。

本発明はさらに植物防御遺伝子の活性化に関する最近の知見に基づ（。これらの知見の第１は還元型グルタチオン（ＧＳＨ）、すなわち小型の水溶性、無毒性の細胞性代謝産物が、細胞壁のヒドロキシプロリンに冨む糖蛋白室ならびにフェニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（Ｐ　Ａ　Ｌ　）およびカルコンシンターゼ（ＣＨ３）をコードするものを含めた特定の防御遺伝子の転写を刺激するということである。これらの遺伝子の転写活性化によって対応する転写体の顕著な一時的蓄積が起こり、これが蛋白質合成の全体的パターンの実質的変化に関与することが見出された。これは菌類ニリンターに対する応答として見られる変化に近似する。さらに、防御遺伝子コード領域のすぐ上流にある特定のヌクレオチド配列がグルタチオンおよび菌類ニリンターなどの物質による調節を与えうることが見出された。菌類ニリンターおよびＧＳＨなどの簡単な化学物質により／／始動−Ｌうるこれらの特異的プロモーター領域は、病原体および環境ストｌ／スに対する抵抗性が増強されたトランスンエニソク植物を工業的に生産するのに極めて有用である。

図面の簡単な説明以下は図面の簡単な説明である。より詳細な説明は本明細書の実験の部２箇所に示される。図面は下記の１１図からなる実験の部Ｉの図面箪】図はＧＳＨｉ：応答した植物防御遺伝子転写体の蓄積を表す写真である。

篤２図（ＡおよびＢ）はＧＳＨに応答した（Ａ）ＰＡＬおよびＣＨ５転写体ならびに（Ｂ）ＰＡＬ酵素活性の誘発の動力学を表す２種のグラフを示す。

第３図はＧＳＨによる植物防御遺伝子転写体の誘発についての用量応答を表す写真である。

第４図は植物防御遺伝子の転写に対するＧＳＨの作用を表す写真である。

蔦５区（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）は植物における蛋白質合成パターンに対するＧＳＨの作用を表す写真である。

第６図はＧ５５ＧによるＰ　Ａ　Ｌ活性の誘発を示すグラフである。

実験の部■の図面第７図（ＡおよびＢ）は２種類の図からなる−（Ａ）ＣＨ８−ＣＡ　Ｔ　−Ｎ　ＯＳ構造体および欠失突然変異体の構造を示ず。

（Ｂ）ＣＨ３１５プロモーターおよびＣＡ　Ｔ融合ジャンクシ３ンのヌクレオチド配列を示す。

第８図（、へ、Ｂ、ＣおよびＩ））はダイズの懸濁培養細胞から誘導されたプロトプラスト中へエレクトロポレートされたキメラＣＨ５−ＣＡＴ−ＮＯ５遺伝子の発現を表す写真である。

第９図はエレクトロポレートされたＣＨ３−ＣＡＴ−ＮＯ８遺伝子を含むプロトプラストにおけるＣ　Ａ　Ｔ転写体の蓄積と０４八Ｔ活性の相関関係を表す写真である。

蔦１０図は発現の基礎水準に対するＣ　ＨＳ　−ＣＡ　Ｔ　−Ｓ　ＯＳのグルタチオン誘発を、エレクトロポレートされたキメラ構造体の量の関数として表すグラフであるっ第１１図はダイズプロトプラスト中へエレクトロポレートされたＣ　ＨＳ　−ＣＡ　Ｔ　−Ｎ　ＯＳ遺伝子のグルタチオン調節に対する５′欠失の影響を表す薄層クロマトグラフィー分析およびグ本明細書および請求の範囲においてはここで特に下記のとおり定義された句および技術用語を用いるここで用いるギリシャ文字アルファ、ベータ、ガンマなどは時にそれぞれａ、、ｂおよびｇと書かれる。はとんどの場合ギリシャ文字はα、β、γなどと書かれる。

ここで用いるグルタチオンは、γ−Ｌ−グルタミル−し一７ステイニルーグリノンを意味する。

ここで用いるグルタチオンのペプチド同族体は、式γ−Ｌ−グルタミル−し一ンステイニルーＸをもつ物質であり、ここでＸはグリシン以外のアミノ酸である。

ここで用いるホモグルタチオンは、γ−Ｌ−グルタミル−し−システイニル−β −アラニンを意味する。

ここで用いるＣＨ３は、還元型グルタチオンを意味する。

ここで用いるＧ５５Ｇは、酸化型グルタチオンを意味する。

ここで用いるＰ　Ａ　Ｌは、フェニルアラニンアンモニア−リアーゼを意味する。Ｐ　Ａ　Ｌはアミノ酸であるし一フェニルアラニンをトランス−ケイ皮酸およびＮＨ４−に変換するのを触媒する。

これはリグニン、フラボノイド、イソフラボノイド、クマリン類およびヒドロキシケイ皮酸エステルを含めた、フェニルプロパン骨格を基礎とする広範な植物天然産物の合成の最初の反応である。

ここで用いるＣＨ８は、カル＝ンンンターゼを意味する。ＣＨ５は４−フマロイル−ＣｏＡとマコニルー〇ＯＡからの３個の７セ＝−−ト単位との縮合を触媒してナリンゲニンカルコンを与える。この反応はマメ科植物中のイソフラボノイド系ファイトアレキンン抗生物質、および高等植物に遍在するフラボノイド系色素の合成に特異的なフェニルプロパノイド代謝の１支流の最初の工程である（ディクソン（Ｄｉｘｏｎ）ら、１９８３１ハールブｏ　’７り（口ａｈｌｂｒｏｃｋ）ら、１９７９）。

ここで用いる４ＣＬは、４−フマレート　ＣｏＡリガーゼを意味する。４ＣＬは高等植物における多くのフェニルプロパノイド化合物の合成に際して中枢の中間体である千オールエステルを合成する（ダグラス（Ｄｏｕｇ、１ａｓ）ら、１９８７）。

ここで用いるＨＲＧＰは、ヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質を意味する。

ここで用いる外的制御される植物１節要素は、外的刺激に応答して機能性結合型構造遺伝子の転写に影響を与える核酸配列を意味する。外的制御される植物調節配列の例には、植物防御遺伝子プロモーター、エリツタ−調節されるアクチベータードメイン、上流サイレンサードメインなどが含まれる。

ここで用いるエリジター物質は、外的制御される植物調節要素を！・始動Ｉｔ１誘発その他の形で活性化しつる化合物であり、たとえばフェニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）、カル＝ンンンターゼ（ＣＨ３）および・４−クマレー１−　：　Ｃｏ　Ａリガーゼ（４ＣＬ）をコードする植物遺伝子に対するストレス調節されるプロモーター、ならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに冨む糖蛋白質をコードする植物遺伝子に対するプロモーターである。本発明のエリジター物質には下記のものが含まれるが、これらに限定されない、還元型グルタチオン、還元型ホモグルタチオンおよびグルタチオンの池のペプチド同族体の還元型５グリカンエリジター、たとえばヘキサ（ β−Ｄ−グルニビラノシル）−Ｄ−グルノトール（ンヤーブ（Ｓｈａｒｐ）ら、１９８４）　：脂質エリツタ−、タトエハアラキドン酸およびエイコサペンタエン酸、糖蛋白質エリジター、菌類エリジター、ならびに非生物エリジター、たとえば塩化第二水銀ＨｇＣｌ２゜ここで用いる菌類エリジターは、マメ類の病原性菌類コレトトリクム・リンデムチアナム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ）の菌糸体細胞壁から熱により放出される高分子量物質を意味する（ロートン（Ｌａｖｔｏｎ）ら、１９８３）。

ここで用いるマーカーまたはリポータ−遺伝子は、容易にアッセイしつる産生蛋白質をコードする遺伝子を意味する。マーカーまたはリポータ−遺伝子の例はＣＡ、ＴＳＧＵＳ、β−ガラクトシダーゼ、およびホタルのルンフェラーゼ遺伝子である。本発明方法においては、マーカーまたはリポータ−遺伝子を植物遺伝子調節要素−一それらに機能性結合した遺伝子（たとえばＣＡＴＳＧＵＳ、β−ガラクトシダーゼ、またはルンフェラーゼのリポータ−遺伝子）の転写を調節することにより外的刺激に応答するｍ−に機能性結合させる。

ここで用いるＣＡＴは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを意味する。

ここで用いるＮＯＳは、ツバリンシンターゼを意味する。

ここで用いるＧＵＳは、ベーターグルクロニダーゼを意味する。

ここで用いるＩａｃＺは、β−ガラクトシダーゼを意味する。

ここで用いる天然遺伝子は、自然界に存在する遺伝子を意味する。

ここで用いるキメラ遺伝子は、人間の努力により構成されまたは工学的に製造された遺伝子を意味する。

ここで用いるＣＧＣは、キメラ遺伝子カセットを意味する。

〃プロモーター／リポーター遺伝子／ターミネータ−メＩＳ／／キメラ防御遺伝子プロモーター／リポータ−遺伝子／３′ターミネータ−〃、！・プロモーター／植物材料において発現可能な構造遺伝子／ターミネータ−〃などの句は本発明のキメラ遺伝子カセットを意味し、〃キメラ遺伝子カセット／Ｉという句と互換性をもって用いられる。

ここで用いる転写は、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を意味する。

ここで用いるプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始または調節する他の因子の結合に関与するＤＮＡ領域を意味する。

ここで用いる転写開始部位は、ＲＮＡに取り込まれた最初の塩基に対応するＤＮＡの位置を意味する。各図に示したＤＮＡ配列においては、転写開始部位を＋１で表す。

ここで用いるＴＡＴＡボックスは、各真核細胞ＲＮＡポリメラーゼ■転写ユニットの転写開始部位の約２５塩基対上流に見られるコンサーブドＡ−Ｔリツチーセプタマーを意味する。ＴＡＴＡボックスは適正な転写開始のためにＲＮＡポリメラーゼ酵素を位置定めするのに関与すると考えられている。

ここで用いるターミネータ−または３′ターミネータ−は、遺伝子または転写体の３′末端にあり、ＲＮＡポリメラーゼに転写を停止させるＤＮＡ配列を意味する。ターミネータ−の例にはツバリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子の３′フランキング領域、およびオクトビンシンターゼ（ＯＣ３）遺伝子の３−フランキング領域が含まれる。

ここで用いる”　ｍ　ｈ　ｏ　”は、導電率の標準単位を意味する。

ここで用いるＩＶＴは、インビボ翻訳を意味する。

ここで用いる適切な植物材料は、特に植物プロトプラスト、植物細胞、植物カルス、植物組織、成育中の若生植物、未成熟の全植物、および成熟した全植物を含めたものを意味する。

ここで用いる植物プロトプラストは、植物細胞壁をもたない単一の植物細胞を意味する。

ここで用いる植物カルスは、未分化の植物細胞塊を意味する。

本明細書および請求の範囲で用いる／／実質的な配列相同Ｉｌは、ここに開示および特許請求される実際の配列とわずかなかつ重要でない配列変異をもつＤＮＡ、ＲＮＡまたはアミノ酸配列が本発明の配列と均等であり、従って請求の範囲に含まれることを意味する。これに関してｌ−わずかなかつ重要でない配列変異− ｔ（すなわちここに開示されるＤＮＡ、ＲＮＡまたは蛋白質と実質的な配列相同をもつ配列）は本発明に開示および特許請求される配列と機能的に均等である。

機能的に均等な配列は、ここに開示および特許請求される核酸およびアミノ酸組成と実質的に同じ組成のものを産生ずべく実質的に同じ様式で機能するであろう。

本明細書および請求の範囲で用いる、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白質の修飾語としてＩ〆実質的に純粋な・・は、このように表示されたＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白質がそれらのインビボ細胞環境内から人間の努力により分離され、この分離の結果これらの実質的に純粋なりＮＡ、ＲＮＡ。

ポリペプチドまたは蛋白質が、分離されていない不純なりＮＡ。

ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白質とは異なる様式で用いられることを意味する。

ここで用いる作動性結合した、および機能性結合した、は互換性をもって用いられる均等な用語である。両用語とも、結合したＤＮＡ配列（たとえばプロモーター、リポータ−遺伝子、およびターミネータ−配列）が作動性または機能性であること、すなわちそれらの意図する目的に有効であることを意味する。

言い換えると、作動性結合したまたは機能性結合したとは、個々のＤＮＡセグメントが結合したのち、プロモーターにより適宜活性化されるとリポータ−遺伝子が発現することを意味する。

ここで用いるターミネータ−配列は、ＲＮＡポリメラーゼ（すなわち転写として知られる過程においてＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を触媒する酵素）にＤＮＡの転写を停止するように・・指令する一Ｄ　Ｎ　Ａ配列を意味する。本発明方法に有用なターミネータ−配列には、ＮＯＳ遺伝子の３′フランキング領域およびｏＣ８遺伝子の３フランキング領域が含まれるが、これらに限定されない。

ここで用いる停止コドンは、ＲＮＡ中へ転写された際にＲＮＡから蛋白質への転写を停止させるＤＮＡ配列を意味する。

ここで用いる人間の努力により工学的に生産された植物材料は、新規な系統を形成するために伝統的な植物育種法ではな（近代的な遺伝子工学的方法を用いる科学者により作り出された植物材料を意味する。工学的に生産された植物材料は／Ｉ自然界には／Ｉ存在せず、従って天然物ではない。

ここで用いるＬす〕・ター・調節されるアクチベーターＦツインおよび上流ザイＩノンイナードメインは、外的制御さねる植物プロモーター上の２箇所のヌクレオチド配列領域を意味する。。

ここで用いるエリツタ−調節されるアクチベ・−タードメインは、外的制御される植物ブロモ−・ター、たとえばストレス調節される植物遺伝子Ｐ　、Ａ　Ｌ、ＣＨ８，４ＣＩ−５および細胞壁のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝子からのプロモーター上の第１のヌクレオチド配列領域を意味する。

機能により定義すると、これらのニリンター調節されるアクチベータードメインまたは領域は、プロモーターを保有するプロトプラスト、植物細胞、または植物を転写に影響を与える外的ニリンター、たとえば還元型グルタチオン、還元型ホモグルタチオン、グルタチオンのペプチド同族体の還元型、菌類ニリンター調製物などで処理した際に活性化される性質をプロモーターに付与する。ＣＨＳプロモーターの場合、アクチベーター領域はヌクレオチド−２９から−１７３に及び、この領域は同調調節される遺伝子、たとえばＰ　Ａ　Ｌおよび４ＣＬのプロモーター中の類似アクチベーター領域と実質的な配列相同性をもつ。

ここで用いる上流サイレンサードメインは、外的制御される植物プロモーター、たとえばストレス調節される植物遺伝子ＰＡＬ、ＣＨ３，４ＣＬ、および細胞壁のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝子からのプロモーター上の第２のヌクレオチド配列領域を意味する。機能により定義すると、これらのサイレンサードメインは、このドメインを除去して機能アッセイにより活性を分析した場合。エリ、・ター誘発された発現（プロモーター・の残りの部分１；より仲介される）が数倍増強されるはど：れらブ１コモ−クーの活性を一抑制御ゾ’ｉ）→づ一イレン＠、Ｉ−−−ドメインはりブレンづ一囚子の結合部位を含むことが知らｔ＋ている。ＣＨＳ−ｊロモー　ター・の場合、サイ１／ンサー叫・メインまたは領域はヌクｌ／　Ａ−ｆドー１７Ｈ（から−３２６に及び、この領域は同調調節されろ遺伝子、たとえばＰ　ＡＬおよび４ＣＬのプロモーター中の煩似→プ”イ１ノンザー領域と実質的な配列相同性をもつ。

ここに示される各種アミノ酸配列を構成するアミノ酸は下記の３文字または１文字略号に従って識別される。

Ｌ−アスパラギン　＾ｓｎ　ＮＬ−アスパラギン酸　Ａｓｐ　ＤＬ−ノステイン　−Ｃｙｓ　ＣＬ−グルタミン　Ｇｉｎ　ＱＬ−グルタミン酸　Ｇｌｕ　ＥＬ−ヒスチノン　Ｈｉｓ　ＨＬ−メチオニン１１ｅｔＭＬ−フェニルアラニン　Ｐｈｅ　ＦＬ−バリン　Ｖａｌ　Ｖここに示される各種ヌクレオチド配列を構成するヌクレオチドは、当技術分野でルーティンに用いられるそれらの通常の１文字表示（Ａ、Ｇ、Ｔ、ＣまたはＵ）をもつ。

発明の要約本発明は、刺激に応答し、それに作動性結合している構造遺伝子の転写に影響を与える植物遺伝子調節要素を確認する方法を開示する。本発明はさらに、植物形質特異性遺伝子調節要素（たとえばプロモーター）を外的に活性化または不活化し、これによりそれらに作動性結合した天然またはキメラ構造遺伝子の発現または抑制をそれぞれ増大または低下させるために使用しうる物質の確認に有用なスクリーニングアッセイ法を開示する。さらにまた本発明は、外的ニリンターによりノ・始動／Ｌ１誘発その他の形で活性化され、または・・停止！・その他の形で不活化されうる植物遺伝子調節配列（たとえば植物防御遺伝子プロモーター、エリツタ−調節されるアクチベータードメイン、上流サイレンサードメインなど）を開示する。

本発明方法においては、植物遺伝子調節要素をまず確認および単離し、発現を監視しつるリポータ−またはマーカー遺伝子少なくとも１種類に機能性結合させる。これらの調節要素／リポータ−遺伝子構造体またはカセットを細胞内へ形質転換し、この細胞を特定の農業用化学物質に！露した場合、リポータ−遺伝子の発現を監視することによりその農業用化学物質が目的の植物調節要素に対して及ぼす作用を判定することができる。

発明の説明一観点においては本発明は、特定の形質に付随する産生蛋白質をコードする構造遺伝子に機能性結合した植物遺伝子調節要素を確認および単離する方法よりなる。本方法は目的とする特定の形質に付随するｃＤＮＡの確認を可能にする生化学および分子技術の併用である。次いでこれらのｃＤＮＡが、対応する遺伝子調節要素をケノムＤＮＡから単離するためのプローブとして用いられる。

要約すると本発明方法は本質的に下記の工程からなる。まず２タイプの植物組織からＲＮ　Ａを採取する：　（１）目的の形質を示すことが知られている？・タイプ１　／／植物組織および（２）その形質を示さないＩｌタイプ２／ノ植物組織。次いで各ＲＮＡプールをインヒポで翻訳し、翻訳産物を一次元および二次元電気泳動ゲルにおいて検査する。これらの比較分析により得たデータを用いて、目的とする形質特異的様式で制御される構造遺伝子により転写がコードされる産生蛋白質を確認する。目的とする形質特異的な条件下で発現−（または抑制）される候補遺伝子産物が確認されると、適宜な組織より単離されたＲＮＡからＣＤＮＡライブラリーが構成される。次いでこのｃ　Ｄ　Ｎ　、Ａライブラリーを別個に、遺伝子発現が／ｌオンＮ（／／プラス・／）である時点および遺伝子発現がｌ／オフｔｔｃｔｔマイナス／／）である時点からのＲＮＡを用いて〃プラスーマイナス〃方式でスクリーンする。目的とする形質特異的条件下で発現されるｃＤＮＡを確認するためには、／／プラスｌＲＮ　Ａにはハイブリダイズするがｌ・マイナス／ｌＲＮＡにはハイブリダイズしないクローンを選択する。次いでこれらの／／プラス／／またはｌメマイナス〃クローンを解析して、１−Ｄおよび２−Ｄ電気泳動ゲル分析により確認された候補蛋白質の特性をもつ蛋白質をコードするものを確認する。次いで、選ばれたｃＤＮＡを植物ＤＮＡのゲノムライブラリーをスクリーンするためのプローブとして用いて、そのＣＤＮＡに対応する遺伝子に付随する遺伝子調節要素（たとえばプロモーター、エリジター制御されるアクチベータードメイン、上流サイレンサードメインなど）を確認する。これらの遺伝子調節要素が確認および単離されると、制限分析および配列決定によりさらに解析しつる。これらの調節要素をここでは形質特異性植物遺伝子調節要素と呼ぶ。

本発明の他の観点においては、形質特異性プロモーターおよび他の植物遺伝子調節要素を少なくとも１種類のリポータ−またはマーカー遺伝子および少なくとも１種類の転写ターミネータ−に作動性結合させる。こうして調製されたキメラ調節要素／リポータ−遺伝子構造体、すなわちカセットを細胞内へ形質転換し、農業用化学物質を形質特異性植物遺伝子調節要素に与える転写効果につきスクリーンするために用いる。形質転換される細胞は好ましくは細胞培養によりまたは全植物として繁殖させつる植物細胞である。形質転換された細胞調製物を農業用化学物質と接触させ、そしてリポータ−またはマーカー遺伝子産物を直接的（たとえばルシフェラーゼ）または間接的（ＣＡＴ）にアッセイする。リポータ−遺伝子の発現は、その農業用化学物質が形質特異性植物遺伝子調節要素の転写を誘発し、従って天然の植物に施した場合にも同じ調節要素の転写を誘発する可能性があることを示す。従ってその農業用化学物質は目的の形質に影響を与える好適な候補であると考えられる。

他の観点においては本発明は、キメラ遺伝子融合体が植物細胞に導入された場合ターゲット遺伝子のストレス調節による発現を指令する、実質的に純粋な植物防御遺伝子プロモーターからなる。これらのプロモーターには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：フェニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）　、カルコンシンターゼ（ＣＨ３）および４−フマレート・ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）をコードする植物遺伝子のプロモーター、ならびに細胞！のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝子のプロモーター。

他の観点においては、本発明はストレス調節される植物プロモーターの実質的に純粋な機能性ドメインからなる。これらのドメインには下記のものが含まれるが、これらに限定されない、フェニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）、カルコンシンターゼ（ＣＨ３）および４ −フマレート：　ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）をコードする植物遺伝子のプロモーター、ならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝子のプロモーターからの機能性ドメイン。これらの実質的に純粋な機能性ドメインには下記のものが含まれるが、これらに限定されない＝　（１）ＣＨＳプロモーター中のＴＡＴＡボックスとヌクレオチド−１７３位の間に位！するエリツタ−調節されるアクチベーター；および（２）ＣＨＳプロモーター中の一１７３位と一３２６位のヌクレオチド間に位置する上流サイレンサー。（ヌクレオチドの位置は第７図に示すものを意味する。）ＣＨＳプロモーターと同調調節される遺伝子ＰＡＬおよび４ＣＬのプロモーターとの間にはこれら機能性ドメイン内の要素間に実質的な配列相同性があり、さらにＰＡＬおよび４ＣＬプロモーター中の実質的に相同なドメインはＣＨＳプロモーターの場合と同様な相対位置に配置されている。たとえばＰＡＬおよびＣＨＳプロモーターはサイレンサー領域に約７０％の相同性をもち、一方ＣＨ８および４ＣＬプロモーターはＴＡＴＡボックスのすぐ上流の６８塩基対（アクチベータードメイン）上に７０％の相同性をもち、Ｐ　Ａ　Ｌおよび４ＣＬはこの同じ領域に６０％以上の相同性をもつ。エドワーズ（Ｅｄｖａｒｄｓ）ら（１９８５）およびクレイマー（Ｃｒａ、ｍｅｒ）ら（１９８９）参照。

他の観点においては、本発明は第７図にＣＨＳプロモーターの５−フランキング領域中のヌクレオチド配列（２４２から−１９４）および（−７４から−５２）として示す２種類の実質的に純粋な配列からなる。これら２種類の配列要素は下記のものである：（−２４２）　ＡＣＣＡＡＴＴ　ＡＴＴＧＧＴＴＡＣＴＡＡＡＴＴＴＡ　ＡＣＡＧＴＧＡ　ＡＴＧＡＡＴＧＡＡＴＧＡＧＴＴＡＴＡ　（−（−７４）ＣＡＣＧＴＧＡＴＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＣＴＡＣ（−５２）他の観点においては、本発明はｐＣＨＣｌおよびｐＣＨＣ２よりなる群から選ばれるキメラプラスミドからなる。

他の観点においては、本発明は下記よりなるキメラ遺伝子カセット（ＣＧＣ）からなる　（ａ）フェニルプロノくノイド生合成酵素であるフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）、カルコンシンターゼ（ＣＨ３）および４−フマレート・Ｃ０Ａリガーゼ（４ＣＬ）をコードする植物遺伝子のプロモーター、ならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝子のプロモーターよりなる群から選ばれるプロモーター、ここでプロモーターは下記のものに作動性結合している　（ｂ）少なくとも１種類のリポータ−遺伝子、および（Ｃ）少なくとも１種類のターミネーンヨン配列。本発明のこの観点において有用なリポータ−遺伝子にはＣ，ＡＴ、ＧＵＳ、ｌ　ａ　Ｃ２、およびホタルのルシフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない、有用なターミネータ−配列にはＮＯ３遺伝子の３−フランキング領域およびＯＣ８遺伝子の３′フランキング領域が含まれるが、これらに限定されない。

新規な遺伝材料を植物に挿入するための幾つかの直接的方法がこうして得られる。その結果本発明のキメラ遺伝子カセットは、防御能の向上したトランスジェニック植物系統を得たい者にとって極めて有用となろう。たとえばアグロバクテリウム・チュメファンエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉ、ｅｎｓ）の天然遺伝子ベクター系の変形を用いて、タバコ、バレイ／ヨ、ニンジン、アマ、ナス、トマト、トウガラン、ヒマワリおよびアブラナ類（キャベツ）を含めた多数の工学処理による双子葉植物が効果的に作り出された。植物遺伝子工学の技術分野の専門家は過度の経験なしにこれらの方法を用いて、遺伝子構成の一部として本発明のキメラ遺伝子カセットを含む新規な植物系統を作り出すことができる。あるいは当業者はトランスジェニック植物を作り出すためのホーンユ（Ｈｏｒｓｃｈ）ら（１９８５）に記載のリーフディスク形質転換法などの方法、または単子葉植物、トウモロコンを形質転換するために近年用いられているロデスらの方法（Ｒｈ。

ｄｅｓら（１９８８））を用いることができる。（リーフディスク形質転換法は本発明のキメラ遺伝子カセットを含むダイズプロトブラストおよびトランスジェニックタバコ植物を工学的に形成するために効果的に用いられた。）他の観点においては、本発明は外的ニリンター物質を用いて植物防御遺伝子を活性化することよりなる。この目的に有用な外的ニリンター物質には下記のものが含まれるが、これらに限定されない、還元型グルタチオン；還元型ホモグルタチオン、およびグルタチオンの他のペプチド同族体の還元型ニゲリカンエリジター、たとえばヘキサ（β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｄ−グルノトール、脂質エリジター、たとえばアラキドン酸、糖蛋白質ニリンター、菌類ニリンター、および非生物ニリンター、たとえば塩化第二水銀ＨｇＣｌ２゜外的物質により誘発されつる植物防御遺伝子には下記のものが含まれるが、これらに限定されない　フェニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）、カルコンシンターゼ（ＣＨ３）および４−フマレート　ＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）をコードする植物防御遺伝子、ならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝子。

さらに他の観点においては、本発明はストレス調節される植物防御遺伝子の転写を誘発しつる物質を確認するためのスクリーニングアッセイ法からなる。この方法によれば・キメラ遺伝子カセット（ＣＧＣ）を適切な植物（Ｐ）から得た植物材料中へ導入する。またこの方法によればＣＧＣは下記のものからなる。（ａ）アラトリーセット１種類のストレス調節される防御遺伝子プロモーター（フェニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）　、カルコンシンターゼ（ＣＨ３）および４−フマレート：　Ｃｏ　、Ａリガーゼ（４ＣＬ）をコードする遺伝子のプロモーター、ならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに富む糖蛋白質をコードする植物遺伝子のプロモーターよりなる群から選ばれる）、これは下記のものに作動性結合している。（ｂ）少なくとも１種類のリポータ−遺伝子、たとえばＣＡＴ、ＩａｃＺ、ホタルのルシフェラーゼ、またはＧＵＳ　、および（Ｃ）少なくとも１種類の転写ターミネーション配列、たとえばＮＯ３またはＯＣ８遺伝子の３′フランキング領域。ＣＧＣを含む植物材料を次いで、ストレス調節される植物防御遺伝子の転写を誘発しまたは他の形で活性化しつる物質の存在下に培養する。培養された植物材料をリポータ−遺伝子配列の誘発（すなわち存在）につき監視する。リポータ−遺伝子配列の発現を誘発しつる物質は植物防御遺伝子の発現を外的に誘発する候補であると考えられる。これらの物質は応答性プロモーターに作動性結合した植物防御遺伝子およびキメラトランスジエンを外的に誘発し、また植物自身の防御機構を予備活性化するのに有用である。

本発明方法の好ましい形態においては植物材料はトランスジェニック植物全形からなり、プロモーターはＣＨ３および／またはＰＡＬであり、リポータ−遺伝子はＣＡＴ、］　ａ　ｃＺ、ＧＵＳｌまたはホタルのルシフェラーゼであり、ターミネータ−配列はＮＯ５または○Ｃ８遺伝子の３゛フランキング領域である。

本発明の他の種々の観点は後記３種類の実験の部にさらに説明および例示される。実験の部Ｉは下記の所見に関連する　還元型グルタチオン（ＧＳＨ）をマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　Ｌ、　）の懸濁培養細胞に０．０１− １．０ｍＭの濃度で施すと、フェニルプロパノイド生合成酵素であるフェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）　、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）−− リグニン産生（ＰＡＬ）およびファイトアレキンン産生（Ｐ　ＡＬ、ＣＨ３）に関与−一をコードするもの、ならびに細胞壁のヒドロキシプロリンに冨む糖蛋白質をコードするものを含めた防御遺伝子の転写を刺激する。これらの遺伝子の転写が活性化されると対応する転写体が顕著に蓄積し、これによって蛋白質合成の全般的パターンが実質的に変化する。この変化は菌類ニリンターに応答する先の所見に近似する。ＧＳＨは抽出性ＰＡＬ活性を顕著に増大させるのに対し、酸化型グルタチオン、グルタチオンの個々のアミノ酸成分（グルタメート、ノステインおよびグリシン）、ならびに強いＳＨ還元剤、たとえばシスティン、アスコルビン酸およびメルカプトエタノールは不活性である。

外的ＧＳＨが防御遺伝子の活性化および対応する転写体の蓄積に与える影響は先に菌類ニリンターによる処理後に観察されたものと質的に類似するが、本発明の特に予想外の特色はＧＳＨの実質的な量的効果である。たとえばＰ　Ａ　ＬおよびＣＨ５転写体の誘発は最適濃度の菌類ニリンターの場合より数倍増大し、かつより持続的である。さらにＧＳＨ処理後に得られた約２００μｋａｔ／ｋｇ（蛋白質）というＰＡＬ酵素活性は、細胞懸濁培養物または池の誘発系において観察されたもののうち最高である（ロートン（Ｌａｗｔｏｎ）ら、１９８３）。

実験の部Ｉに示されるように、ＧＳＨの効果は遺伝子活性化に対する選択的効果、転写体の蓄積および蛋白質合成のいずれの点においても特異的である。さらに酸化型グルタチオン、混合物グルタメート、エリツタおよびンステイン（グルタチオンを構成する成分アミノ酸七ツマ−）、または他のＳＨ試薬（たとえばアスコルベート、システィンまたはジチオトレイトール）が効果をもたないことは注目すべきである。インビボでＧＳＨは０．０５−１．５ｍＭの濃度において見出される（ビーロースキー（Ｂｉｅｌａｗｓｋｉ）ら、１９８６　：レネンバーグ（Ｒｅｎｎｅｎｂｅｒｇ）、１９８２ニスミス（Ｓｍｉｔｈ）、１９７５　；およびスミスら、１９８５）。従って防御遺伝子に対する作用はＧＳＨの生理的濃度において起こる。

実験の部■は、微生物の攻撃に対する植物防御の活性化の基礎となる機構を解明する試みに関する。その試みの一部として細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子に融合したファイトアレキシン生合成酵素力ルコンンンターゼをコードする防御遺伝子の５′フランキング領域を含むキメラ遺伝子のエリツタ−調節について研究を行った。グルタチオクトロポレートされたこのキメラ遺伝子の迅速かつ著しい、ただし一過性の発現を引き起こした。この応答は懸濁培養細胞における内在力ルコンノンターゼ遺伝子のものと近似していた。

さらに実験の部■に提示したデータは、ＣＨＳコード領域のすぐ上流の４２９ｂｐヌクレオチド配列がエリジター物質、たとえばグルタチオンまたは菌類ニリンターによる調節を与えるのに十分であることを示す。さらに５−欠失の機能分析によれば、プロモーター活性は下記により決定されることが示唆された　（１）丁ＡＴＡボックスとヌクレオチド−１７３位との間に位置するエリジター調節されるアクチベーター、および（２）−１７３と−３２６の間の上流サイレンサー。これらのｃｉｓ−作動性要素は、エリノテーションノグナルの形質導入に際して誘発性防御応答の形成を開始下べく機能する。

プロトプラスト中へエレクトロポレートされたキメラＣＨ３−ＣＡ　Ｔ　−Ｎ　ＯＳ遺伝子の応答は、ニリンター処理細胞の懸濁培養物における内在染色体ＣＨ３遺伝子のものと、誘発の動力学ならびにインデューサーとしてのグルタチオンおよび菌類ニリンターの相対力価に関して近似する。従ってここに記載する全植物系は、植物防御遺伝子の発現を誘発しまたは植物自身の防御機構を予備活性化するために使用しつる外的物質を確認するための簡便な機能アッセイ法を提供する。さらにこの系は防御遺伝子のエリ／ター調節に関与するｃｉｓ−作動性ヌクレオチド配列を分析するために有用である。

実験の部ｍは本発明方法を説明するものであり、（１）遺伝子転写を調節することにより農業用化学物質に応答すると思われる形質特異性核酸配列を確認するための、次いて（２）これら形質特異性核酸配列の転写を誘発するのに有用であると思われる農業用化合物を確認するためのプロトコールを示す。示された例においては、被験植物はトマトであり、被験形質は果実の成熟または成育の増強または遅延である。

当業者は以上の記載および以下の実験の部により、これ以上の詳述なしに本発明を最大限に利用しつると思われる。実験の部に示した材料は特に指示しない限り説明のために示したものであり、従って請求の範囲による本発明の範囲を限定するものと解すべきでない。

レオチド配列を分析するために有用である。

実験の部■は本発明方法を説明するものセあり、（１）遺伝子転写を調節することにより農業用化学物質に応答すると思われる形質特異性核酸配９）を確認するための、次いで（２）これら形質特異性７核酸配列の転写を誘発するのに有用であると思われ＋Ｍ業用化合物を確認するためのプロトコールを示す。示された例においては、被験植物はトマトであり、被験形質は果実の成熟または成育の増強または遅延である。

当業者は以上、の記載および以下の実験の部により、これ以上の詳述・なしに本発明を最大限に利用しうると思われる。実益の部に示した材料は特に指示しない限り説明のために示したものであり、従って請求の範囲による本発明の範囲を限定するものと解すべきでない。

実ｊ区ＩＷ上グルタチオンは植物防御遺伝子（ｐｌａｎｔ　ｄｅｆｅｎｓｅｅｎｅ　に　・に　るはじめにグルタチオン（ｒ−Ｌ−グルタミル−し−ノスティニルーグリシン）は広範囲な代謝プロセスに関与する低分子量チオールである〔マイスター（Ｍｅｉｓｔｅｒ）等、１９８３年〕。

高級植物中のグルタチオンについて提案されている機能には、還元された硫黄の貯蔵と輸送；蛋白質還元剤：葉緑体中のＩｔ、Ｑ□の破壊およびある一定の除草剤と有害生物撲滅剤とを含めた生体異物の解毒がある〔エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）等、１９８６年；およびレン享ンヘルグ（Ｒｅｎｎｅｎｂｅｒｇ）　、１９８２年］。

この例はビーン（ｂｅａｎ）　（フェイズオラス　ブルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）　Ｌ　）の浮遊培養細胞のＧＳＨ（グルタチオンの還元形）による処理がフィトアレキシンとリグニン生合成の防御遺伝子コード化系の転写ならびに遺伝子コード化細胞壁ＨＲＧ　Ｐの刺激を大規模に、選択的に誘導することを示す。

遺伝子表現パターンと蛋白質合成とに対するＧＳＨの効果は菌エリ／ターに対する反応と密接に類似する。

１堰、、ｌ！Ｕ−」０七と寡夫１立　とニリン　−ｆ′ｌコレトドリチウム　リンデムチアニウム（ＣｏｌｌｅｔｏＬｒｉｃｈｕｍ１ｉｒ＋ｄｅｔｈｉａｎｕｗ）の培養菌の供給源、維持および増殖は以前に述べられた通りであった〔ベイレイ（Ｂａｉｌｅｙ）等、１９７１年）。

６０ａｇグルコース当Ｉ’ｄの菌濃度でのエリツタ−は単離された菌糸細胞壁の熱処理によって放出される高分子量両分であった〔ラウトン（Ｌａ＠ｔｏｎ）等、１９５６年〕。

権隻林料フレンチ・ビーン（ｆｒｅｎｃｈ　ｂｅａｎ）　（フエイズオラス　ブルガリス　Ｌ、ＣＶ　カナディアン　ワンダー（Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｗｏｎｄｅｒ）　］細胞培養物を、完全な暗所に維持した以外は、前述の通りに増殖させた。実験は７〜１０日間経過した細胞培養物で実施し、増殖培地は２．５〜２．８ｍｈｏの導電度を示した。これは細胞培養サイクル中のエリジターに対する最大反応期間を表す〔エドワーズ等、１９８５年］。

■皇皿土上立捉ＰＡＬの抽出と分析を前述の通りに実施した〔ラウトン（ｌａｗｔｏｎ）等、１９８３年］。酵素活性の１単位（ｌ　ｋａｔ）は分析条件下で１秒間に生成ｌｌｌ１１モルを形成するために必要な酵素量として定義される。

旦Σ人皇頂上全細胞ＲＮＡを均質化サンプルからフェノール／　０　、　Ｉ　Ｍ　Ｔ　ｒ　ｉ　５−ＨＩＪＩマルジョン（ｐＨ９，０）中に単離し、既述されたように精製した（ラウトン等、１９８３年）。ＲＮＡを２６０ｎｍにおいて分光側光法によって分析した。ＲＮＡの収量は１５０〜２５０μｇ／新鮮組織重量ｇであり、Ａ２６゜／　Ａ　ｚ　ｓ−比は１．８〜２．１の範囲内であった。

インビトロ　苦と二′　−〇″ 全ＲＮ　Ａをメツセージ依存性ウサギ網状赤血球溶解吻を用いてＣｌ５５）メチオニン（アマーンヤム（Ａｍｅｒｓｈａｎ＋）　ｊ　の存在下でインビトロにおいて翻訳した（ラウトン等、１９８３年）。＃Ｉ訳主生成物第一次元でｐＨ範囲３］５〜１０の等電点電気泳動を行い、次に１０％ゲル５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気床電気行動二次元電気泳動によって分画した〔ガレルス（Ｇａｒｒｅｌｓ）、１９７９年］。放射性標識したポリペプチドをフルオログラフィー（ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｔ＋ｙ）によって可視化した〔ボンナー（Ｂｏｎｎｅｒ）等、１９７４年］。

ＲＮＡプロ　ト　バイブ１　トノ　。

全ＲＮＡをグリオキサルによって変性し、１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）中の１．２％アガロースゲルにおける電気泳動によって分画した〔マノクマスター（ＭｃＭａｓ　ｔｅｒ　）等、１９７７年〕。ニトロセルロースブｏ　７ト〔〔トーツス（Ｔｈｏｍａｓ）　、１９８０年〕をｐＰＡＬ５　（エドワーズ等、１９８５年）、ｐＣＨ３５（ライダー（Ｒｙｄｅｒ）等、１９８４年）、ｐＨｙｐ２．１３とｐＨｙｐ４．１　（コルビン（Ｃｏｂｉｎ）等、１９８７年］のインサートのニック翻訳によって、ハイプリント化した。オートラジオグラフィー後に、特定の転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を走査デンシトメトリーによって定量した。

各プロントについて種々な期間暴露させた幾つかのオートラジオダラムを得て、フィルム反応の直線範囲において各サンプルの定量を可能にした。

抜止ヱニｉヱ紋亙［α−”ＰＩＵＴＰの存在下のインビトロで完成させた核の単離と転写体分析は既述された通りに実施した（ラウトン等、１９８７年）。固定化塩基配列はＰＡＬ、ｃＤＮＡ　ｐＰＡＬ５（エドワーズ等、１９８５年）；ＣＨ５，ｃＤＮＡ　ＣＨ３Ｉ　（ライダー等、１９８４年）、ＨＲＧＰ、当量のｃＤＮＡｓ　Ｈｙｐ２．１３とＨｙＰ４．ｌ　［コルビン（Ｃｏｒｂｉｎ）等、１９８７年〕であった。

Ｈｌはエリツリー処理によって影響されない、構成的に転写された遺伝子からの塩基配列を含むｃＤＮＡクローンである。

ＰＡＬ、ＣＨ５およびＨＲＧＰ遺伝子の転写速度の変化をＨ１転写速度を基準として測定した。

鞄−一一見五互生１■ ＰＡＬはリグニンおよびフィトアレキンンを含むフェニルプロパノイド天然生成物のＬ−フェニルアラニンからの生合成の第１反応を触媒する。ＣＨ３はフラボノイド顔料とイソフラボノイドフィトアレキソンとの形成に特異的なフェニルプロパノイト生合成の分枝系路の第１反応を触媒する。ＧＳＨは浮遊培養したビーン細胞における低い基底レヘルからＰＡＬとＣＨ５との写しの広範囲であるが一時的な同調的蓄積を惹起した（第１図および第２図）。これらの写しの最大の蓄積はＧＳＨの添加の約６時間後に観察され、その後に比較的低レヘルに減少する。ＧＳＨはＨＲＧＰ転写体Ｈｙｐ４．１とＨｙｐ２．１３の蓄積も惹起した、この蓄積は菌エリジターによって誘導されることがすでに判明している（第１図）。エリジター処理細胞におけるように、これらのＨＲＧＰ転写体の蓄積はあまり迅速ではないが、ＰＡＬとＣＨＳに関するよりは持続した。ｌＯ〜１００μＭ範囲のＧＳＨ濃度はＰＡＬ、ＣＨ３，Ｈｙｐ２．１３およびＨｙｐ４．１転写体の蓄積を菌エリジターの最適濃度によって観察されるレヘルに匹敵する以上にまで惹起した（第３図）。

藍亙五立止低い基底レヘルからの防御遺伝子転写体の明白な蓄積は、ＧＳＨがこれらの遺伝子の転写を刺激することを示唆した。ＰＡＬ、ＣＨ５およびＨＲＧＰ遺伝子転写に対するＧＳＨの効果を、ＧＳＨ処理後の種々な時間において細胞から単離した核によってインビトロで実施した転写体分析によってモニターした。核の単離およびラン−オフ転写分析の特性化は既述されている（ラウトン、１９８７年）。

ｃＤＮＡクローンＨ１はエリジター処理によって影響されない豊富な転写体に相補的な塩基配列を含む。内部対照としてのＨ１遺伝子の構成転写と比べて、ＧＳＨはＰＡＬ、ＣＨ５およびＨＰＧＰ遺伝子の転写を明白に刺激した（第４図）。

人　のバ　−ン全細胞ＲＮＡの翻訳によってインビトロで合成されたポリペプチド生成物の二次元遺伝子電気泳動分析によって、蛋白質合成の総合パターンに対する影響を調べた（第５図）。この判断基準によると、ＧＳＨは非処理対照細胞に比べて蛋白質合成のパターンに大きな変化を惹起した。このように、ＧＳＨはＰＡＬとＣＨ３のイソポリペプチド（ｉｓｏｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）のセントを含めた多数のポリペプチドの合成を明白に刺激した（第５図）。

蛋白質合成のパターンに対するＧＳＨの効果は菌エリジターによる同等細胞の処理後に観察された効果に近似した。しかし、この他に、ＧＳＨはその表現レヘルが菌エリジターによって殆んと影響されない４種類のポリペプチドの合成を顕著に刺激した（第５図）。ＧＳＨと菌エリジターとを同時に添加すると、蛋白質合成パターンはＧＳＨ単独と同様に変化した。

とＧＳＨ処理は抽出可能なＰＡＬ活性レヘしを顕著にかつ持続的に増加させた（第２図）。活性が最も迅速に増加する相はＣ３Ｈ添加の３〜８時間後に生じ、ＰＡＬ転写体の最大蓄積のタイミングと密接に相関した。同様に、８時間後のＰＡＬ酵素活性の誘導に関する用量−反応はＰＡＬ転写体の蓄積に関する用量−反応とｍイ以し、１０μＭ程度の低いＧＳＨＩ度においても明白な効果を示した（第１表）。ＰＡＬ酵素活性のＧＳＨ刺激はこの糸路を通るフランクス（ｆｌｕｘ）を増加させ、フィトアレキシン最終生成物のフエイズオリンを知覚されうるほとに蓄積させた（データ示さず）。ＧＳＨはフェノール系物質の蓄積の特徴である細胞の存意な褐変（ｂｒｏｗｎｉｎｇ）を惹起した。

旦Σ且皇詩異性抽出可能なＰＡＬ酵素活性の誘導をパラメーターとして誘導して、Ｃ３Ｈ効果の特異性をモニターした。ｃｓｓｃは１ｍＭの濃度ではＰＡＬ活性をごく弱（刺激したにすぎず、Ｏ，ｉｎ　Ｍ以下の濃度では、グルタチオンの酸化形は有意な効果を示さなかった（第６図）。さらに、アスコルベート、ンステインまたはグルタメート／グリシン／ノステインの混合物による細胞の処理は抽出可能なＰＡＬ活性を増加させなかった（第２表）。ジチオスレイトールも同様にＰＡＬ活性を誘導しなかった（データこの例で示されたデータは、外因性ＧＳＨが防御遺伝子の特異的活性化と対応転写体の蓄積とを含めて、浮遊培養ビーン細胞での遺伝子表現と蛋白質合成パターンとを最大に変化させることを実証する。これらの効果は菌エリジターによる処理後に既に観察された効果を質的に類似しているが、特に印象的な特徴はＧＳＨの大規模に量的な効果である。従って、ＰＡＬおよびＣＨ３の転写体の誘導は菌エリジターの最適濃度によるよりも数倍大きくかつ持続的になる。さらに、ＧＳＨ処理後に得られた約２００μｋａｔ／蛋白ｔｂのＰＡＬ酵素活性は細胞浮遊培養またはその他の誘導系で我々が観察した最高の活性である（ラウトン等、１９８３年）。

ＧＳＨの効果は遺伝子活性化、転写体蓄積および蛋白質合成に対する選択的効果と、他の還元剤、構成アミノ酸またはグルタチオン酸化形の効果の欠損との両方に関して特異的である。

インビボでは、ＧＳＨは０．０５〜１．５ｍＭの範囲内の濃度で検出される〔ビラウスキイ（Ｂｉｅｌａｗｓｋｉ）等、１９８６年；レンネンベルグ（Ｒｅｎｎｅｎｂｅｒｇ）　１９８２年；スミス（Ｓｍｉｔｈ）、１９７５年；およびスミス等、１９８５年］、それ故、防御遺伝子に対する効果はＧＳＨの生理的濃度において生ずる。しかし、ビーンおよび大豆を含めた、ある種のマメ科植物では主要な遊離低分子量チオールはＴ−Ｌ　−クルタミルーＬ−システイニル−β−アラニン（ホモグルタチオン）であり、グルタチオンはごく痕跡量である〔プライス、１９５７年］。

２皿夏脱所裏狂夏皿上第１図、ＧＳＨ（１ｍＭ）に反応した防御遺伝子の蓄積。

第２図、　ＧＳＨ（ＩＩＩＭ）に反応した、（Ａ）ＰＡＬおよびＣＨ３の転写体と（Ｂ）ＰＡＬ酵素活性との誘発の動力学。無地印：対照；充実印：Ｃ；ＳＨ処理；ＰＡＬ（無地用と充実用）；ＣＨ５（無地方形と充実方形）、パネル（Ｂ）では、点線はＰＡＬｍＰＮＡレヘルの変化を表す。

第３図　ＧＳＨによる防御遺伝子転写体の誘発に関する用量−反応。Ｅ−Ｃ０Ｈｇグルコース当量／ｌｄの最終濃度におけるニリンター。

第４図、防１ｎ遺伝子の転写に対するＧＳＨの効果、ＧＳＨ処理の１．７５時間後の細胞からまたは同等の非処理対照細胞から核を単離した。

第５図、蛋白質合成パターンに対するＧＳＨの効果。

（Ａ）対照の非処理細胞または（Ｂ）ＧＳＨ（１ｍＭ）；　（Ｃ）菌エリジター（６０ｔ！ｇ／グルコース当量戚）；および（Ｄ）ＧＳＨフ゛ラス菌エリツタ− による処理から４時間後の細胞。パネルＢでの無地矢印はＣ３Ｈと菌エリジターとの両方によって誘発された種を意味する；充実矢印は菌エリジターではなくＧＳＨによって誘発された種を意味する；　“Ｐ”はＰＡＬサブユニットを意味する：　“Ｃ″はＣＨＳサブユニットを意味する。”ＩＥＦ’“は第１次元における等電点電気泳動を意味する；　“ＳＤＳ　ＰＡＧＥ″　；第２次元における５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を意味する。

第６図・Ｇ５５Ｇ：１ｍＭ（充実三角形、先端上向き）；０．１澤Ｍ（充実三角形、先端下向き）　；０．０１ｍＭ　（充実用）；対照（無地方形）によるＰＡＬ活性の誘発、ｃｓｓｃによる誘発を０．１ｍＭＧＳＨ（無地用）による誘導と比較した。

−Ｊし− １肩ｍ−上策土表　抽出可能なＰＡＬ活性レベルに対するＧＳＩ（の効果に関する用量反応エリジターは６０ｕｇグルコース当量／ｄの濃度で供給した。

総ての化合物はＯ，１ｍＭの濃度でテストした。

実１μ針囮−」− エレクトロポレートされた（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ　）原形質体にお６る　パ　−１０モー　−の工ｔンター富はしめに植物の微生物の作用に対して、抗生物質の合成、溶解酵素の刺激、および細胞壁の強化によって反応する〔ダルヴイル〔［］ａｗｖｉ１１）等、１９８４年；ノキソン（１）ｉｘｏｎ）等、１９８３年：ジキソン（Ｄｉｘｏｎ）等、１９８６年；エヘル（Ｅｂｅｌ）　、１９８６年］。これらの防御は菌細胞壁からのグリカンおよび糖蛋白質エリツタ−ならびに培養液または例えばアラキドン酸およびグルタチオンのような代謝産物によっても誘発されうる〔ダルヴイル等、１９８４年；ジキソン等、１９８３年：ジキソン等、１９８６年；エベル等、１９８６年；実験の項Ｉおよびヴインゲート（Ｗｉｎｇａｔｅ）等、１９８８年〕。

エリジター、創傷または感染はこれらの防御の励起に関係する遺伝子の転写を迅速に刺激する実験の項■およびヴインゲート等、１９８８年；チャペル（Ｃｈａｐｐｅｌｌ　）等、１９８４年；クレイマー（Ｃｒａｓｅｒ）等、１９８５年ａ；ソムジノヒ（ＳｏｍＩｌｓ　ｉｃｈ　）等、１９８６年；ラウトン等、１９８７年；およびヘトリック（Ｈｅｄｒｉｃｋ）等、１９８８年〕。

抵抗機構（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）の活性化におけるこの初期の事象を研究するために、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子に融合した防御遺伝子コード化カルソンシンターゼ（ＣＨ３）の５′−フランキング領域（ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）と、ノバリンンンターゼ（ＮＯ５）遺伝子の３′−フランキング領域とを含むキメラ遺伝子のエレクトロボレートされた大豆原形質体における表現を研究した。

ＣＨ５は４−フマロイルＣｏＡと、マロニルＣｏＡからの３アセテ一ト単位との縮合を触媒し、ナリンゲニンカルコンを形成する。これはマメ科植物におけるイソフラボノイドフィトアレキノン抗生物質および高級植物に偏在するフラボノイド顔料の合成に特異的なフェニルプロパノイト代謝の分枝（ｂｒａｎｃｈ）における第１段階である〔ジキソン等、１９８３年、ホールブロック（Ｈａｈ　１ｂｒｏｃｋ）等、１９７９年〕。エリジターは５分間以内にビーン細胞中のＣＨ３転写を刺激し、ＣＨ３ｍＲＮＡの一時的蓄積を生しさせ、これはフィトアレキシン合成の開始と相関して、３〜４時間後に最大レヘルに達した（クレイマー等、１９８５年ａ；ラウトン等、１９８７年：およびライダー等、１９８４年）。

この例は、ビーン病原菌コレ　１チウム　！ンー゛ムチアニ旦（＠ニリンター）の菌糸細胞壁から熱放出される高分子量物質のグルタチオンまたは菌エリジター調製が大豆原形質体にエレクトロポレートされるキメラＣＨＳ　−ＣＡ　Ｔ　− Ｎ　ＯＳ遺Ｊ云子を迅速に顕著に、但し一時的に表現させることを示す。ＣＨ３ −ＣＡＴ−ＮＯ５遺伝子の反応はエリジター処理細胞浮遊培養物中の内因性ＣＨ５遺伝子の反応に密接に類似する。データは、ＣＨＳコード領域の直接上流における４２９ｂｐヌクレオチド配列が例えばグルタチオンまたは菌エリジターのようなニリンター１１ｆｆ譬による調節を受けるために充分であることを示す。５ ′欠損の機能分析によると、誘導可能な防御の形成を開始させるだめの導出シグナルの導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｏｎ）はＴＡＴＡボ、クスと−１７３との間に存在するエリジター調節活性剤および−１７３と−３２６の間にある上流サイレンサーに関係する。

の　・　と　゛プラノＪＬ口ｌ衣ｐＤＯ４００は既述されたカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター構成ＰＤ○４３２と同しである［オウ（０−）等、１９８６年］、但し大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子Ｃアルドン（Ａ　ｌ　ｔｏｎ）等、■９７９年〕がｐＤＯ４３２のルンフェラーゼレポーター遺伝子に替る。ｐｃＨ５１５はりポプローブヘクターｐＳＰ６４にサブローン化された全長ＣＨ３１５遺伝子とフランキング塩基配列とを含む２．１ｋｂ　Ｈｉｎｄ［［ｌヱ五ヱ１土立スブルガリス　ゲノム　フラグメントから成る（ライダー等、１９８７年）、ｐｃＨｃ＋では、ＣＨ３１５の５′−非翻訳配列を含む４２９ｂｐ　Ｉ（ｉｎｆ　ＩフラグメントがｐＤＯ４００の３５Ｓ転写体プロモーターに替る。

ｐＣＨ（ＪはＰＤＯ４００の旧ｎｄｌＩ［／Ｘｂａ　ｆ　Ｃａ　Ｍ　Ｖ３５ＳプロモーターフラグメントをｐＵｃｆｆｉ９の旧ｎｄｌ［［／Ｘｂａ　Ｉポリリンカーフラグメントに替えて、ｐｃＮｌｏｏを形成することによって構成された。

ｐｃＮｌｏｏをＳ　ａ　／　Ｉによって消化し、フレノウ（ｌ［Ｉｅｎｏｗ）　Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼとｄＮＴＰとによって充てんし、その末端がフレノウ充てんによって同様にプラントになったｐＣＨ３１５の４２５ｂｐ　Ｈｉｎｆ　Ｉフラグメントのプラント末端結合に用いた。この構成を変性２重鎖プラスミドのＭ１３逆プライマー〔チェノ（Ｃｈｅｎ）等、１９８５年）によるジデオキシ連鎖停止反応〔サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等、１９７７年）によって塩基配列した。

ｐＣＨ（Ｊを旧ｎｄ［［により消化させ、その後にエキソヌクレアーゼ■と緑豆（ｓｕｎｇ　ｂｅａｎ）ヌクレアーゼ処理を行うことによって、欠失変異体を構成した〔ヘニコノフ（Ｈｅｎｋｏｆｆ）、１９８４年］。

Ｘｂａ　Ｉ消化後に、欠失プロモーターフラグメントを低融点アガロース上で精製し、Ｐｓｔｌ（Ｔｎポリメラーゼ充てん）／ＸｂａＩカントｐｃＮ１００に結合させた。上述のように配列を形成することによって正確な終点を決定した。ネズミ　ヒストンＨ４遺伝子のプロモーター領域からの２３５ｂｐ　ＥｃｏＲＪ　／Ｐｖｕ　ＩＩフラグメント［セイラーーツインズ（Ｓｅｉｌｅｒ−Ｔｕｙｎｓ）等、１９８１年］をＥｃｏＲ［／ＳｍＱ１カットｐｌＢ＋２４（ｐＣＵ誘発ファージミイドヘクター）にクローン化することによって、ｐ　ＨＣＮ　＋を構成した。この構成体をさらにＥｃｏＲＩ　／Ｘｂａ　Ｉによって開裂し、旧ｎｄｌ［［／Ｘｂａ　Ｉ消化ｐｃＮ１００にｐｌＢ＋２４からの全ＥｃｏＲｌ　／旧ｎｄｌ［ｌポリリンカーと共にサブクローン化した。

厘遭］し１１版ビーン（フェイズオラス　ブルガリス　Ｌ）、大豆〔グリシン　マックス（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｗａｘ）　Ｌ　）およびタバコ〔ニュチアナタハクム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）　Ｌ　］細胞の浮遊培養物の起源と維持は上述の通りであったが、この場合には細胞をふるい分け（２５０ミクロンメンシュ）によって回収し、新鮮な維持培地に７日間隔で移した〔クレイマー等、１９８５年ｂ；年上；ノルマン１００−中で暗所の２７°Ｃにおいて４時間振とう（９０ｒｐｍ）することによってインキュベートした〔フロム（Ｆｒｏｓｎ）等、１９８５年］。

原形質体をふるい分けと室温での７０Ｘｇにおける５分間の遠心とによって細胞デブリから分離した。エバンスブルー（Ｅｖａｎｓｂ’１ｕｅ）による染色によって生存度（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を測定し、原形質体を５　ＸＩＯ”／ｄに調節した。原形質体をエレクトロポレーシジン培地（フロム（Ｆｒｏ■）等、１９８５年］中で２回洗浄してかみ用いた。

原形質体単離の３時間後にエレクトロポレーションを既述すれた通りに（フロム等、１９８５年）、２５０Ｖの最適パルスによってｌ（１ｗｓｅｃ間実施した。

他に述べないかぎり、試験梼成体ＤＮＡ３０ｐｇをキャリヤーとしてのウシ胸腺ＤＮＡ５０．ｇと共にエレクトロポレートした。原形質体を０，３Ｍマンニトール含有維持培地６社中で攪拌せずに２７°Ｃにおいて暗所に維持した。第８図パネル（Ａ）に示した実験では、原形質体をエレクトロポレーションの８時間後に分析のために回収した。他のすべての実験では、原形質体をエレクトロポレーション後２１時間インキュベートしてから、−１彰二り上」二りり罠、−」」こデヌ、＋７三り久脇工の菌糸細胞壁から熱放出された菌エリジター調製物（菌エリジター、クレイマー等、１９８５年ｂ）またはグルタチオン（実験の項Ｉおよびヴインゲート等、１９８８年参照）を０．３Ｍマンニトール含有維持培地に加えて、それぞれ６０μｇグルコース当ｉｔ／ｄおよび／　ｍ　Ｍの最終Ｉｆを得た。対照原形質体には等量の０．３Ｍマンニトール含有維持培地を加えた。原形質体を遠心分離によって回収し、抽出物を既述されたように（フロム等、１９８５年）基質〔ｌ４Ｃ）クロラムフェニコールの転化のラジオメトリー測定によってＣＡＴ活性に関して分析した。反応生成物を１Ｎクロマトグラフイーによって分離し、オートラジオグラフィーによって可視化し、ジンチレーンコン計数によって定量した。蛋白質をブラッドフォード処理（ブランドフォード、１９７６年）によって分析した。典型的なＣＡＴ分析は基質の１，０００〜５．０００ｃｐｍのアセチル化生成物への転化を生した、蛋白質５μｇ含をサンプルの３７°Ｃにおける３時間のインキュベーションを含んだ。

且五へ公捉原形質体（３ＸＩＯ’）を０．０１％ＳＤＳ含有０．ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ）１９．０）　１００ｕｆ中に再懸濁した。フェノールとクロロホルムとによる抽出後に、０．３Ｍ酢酸ナトリウム存在下で２倍量の９５％エタノールによって、上清を沈殿させた。ＲＮＡをさらに処理し、既述されたように〔クレイマー等、１９８５年ｂ］ノりン　プロット　ハイブリッド化方法によって分析した。

ハイブリッド化プローブは二ツク翻訳によって標識した大腸菌ＣＡＴ遺伝子配列（アルドン等、１９７９年）を含む０．８ｋｂ　Ｂａｍｔ（ＩフラッグメンＣＨ３７’ロモーター機能を分析するために、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のコード塩基配列と融合したＣＨ３Ｉ５遺伝子の５′− フランキング領域と、ツバリン　ジンダーゼ（ＮＯ３）の３′−フランキング配列とを含むキメラ遺伝子の表１１Ｊ（第７図）を、浮遊培養細胞がら誘導された原形質体へのエレクトロポレーション後に検査した。ＣＨ３１５はビーンゲノム中の６ＣＩ（Ｓ遺伝子であり、主要なニリンター誘発ＣＨ３転写体をコード化する（ライダー等、１９８７年）。

キｌ　ラＣＨ５−ＣＡＴ−ＮＯ５遺伝子構成体ｐｃＨｃｌは転写開始部位から上流の３２６ｂｐと転写リーダー配列の１０３ｂｐがら成るＣＨ３Ｉ５の５′非翻訳ヌクレオチド′配列の４２９ｂｐを含む〔第７図〕。

パセリに関する最近の報告（ダングル等、１９８７年）と同様に、ビーンおよび大豆の原形質体は内因性防御遺伝子によってコード化される転写体の蓄積とフェニルプロパノイド生成物の出現とに関して、それらが誘発された浮遊培養細胞と同様にニリンターに反応する（データ示さず）、シかし、エレクトロポレートされたビーン原形質体はタバコ原形質体と大豆原形質体とに比べて、ＣＨ３−ＣＡＴ−ＮＯ３遺伝子の低い生存度と弱い表現とを示したにすぎない（第８図）。ビーンに密接に相関する後者は、エリジター調節研究の主要な焦点であった。

内因性エリジターと、原形質体調製中に放出される他のストレス要素による誘発を最少にするために（ダングル等、１９８７年；およびミース（Ｍｉｅｔｈ）等、１９８６年）、新たに単離した原形質体をエレクトロポレーションの前３時間と励起（ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ）の前にさらに２１時間インキュベートした。

グルタチオンを添加した後、３時間以内にＣＡＴ活性レベルの明白な増加が観察されたが、非処理対照では、この期間にＣＡＴ活性の有意な変化は無かった（第８Ｂ図）。プローブとして二ツク翻訳したＣＡＴ遺伝子配列を用いたノザン　プロット　ハイブリッド形成は、ＣＡＴ活性のグルタチオン刺激がＣＡＴ転写体の誘発を生じたことを寞証した（第９図）、これによって、ＣＡＴ活性の誘発をＣＨ３−ＣＡＴ−ＮＯ３遺伝子の転写と相関づけることができた。対照的にグルタチオンはＣＡＴ−ＮＯＳレポーター　力セントと融合したネズミ　ヒストーンＨ１遺伝子のプロモーターを含むキメラ遺伝子によってエレクトロポレートされた原形質体におけるＣＡＴ活性を調節しなかった（第８Ｂ図）。

原形質体調製の種々なサンプルを独立的にエレクトロポレートし、誘発した場合に、ＣＨ３−ＣＡＴ−ＮＯ３Ｉｔ伝子の反応は非常に再現可能であった（第８Ｂ図）、キメラ遺伝子３０〜５０μｇによって最適エリジター調節が観察された（第１０図）。多量の構成体のエレクトロポレーションは対照原形質体中に高レベルの表現と、グルタチオンによる対応して弱い調節とを生した。

菌エリジターはキメラ遺伝子の表現をも誘発したが（第８Ｃ図）、浮遊培養細胞中の内因性ＣＨ３遺伝子によると同様に、反応はグルタチオンによるよりも幾らか弱かった（実験の項【とヴインゲート等、１９８８年参照）。

ＣＨ３−ＣＡＴ−ＮＯ５遺伝子はグルタチオン添加の３時間後に最大レベルで一時的に表現されたが、６時間後には比較的低レベルにまで衰退した（第８Ｄ図）。グルタチオンが存在しない場合には、この期間にＣＡＴ活性の誘発は見られなかった。

キメラ遺伝子もタバコ細胞に由来する原形質体中にエレクトロポレートされる場合に、グルタチオンによって調節されたが、この反応は緩慢であり、最大ＣＡＴ活性は６時間後であった。

これらの自動力力学は原形質体が由来する各浮遊培養細胞中の内因性防御遺伝子の表現の動力学に密接に類似した（ライ゛ダー等、１９８４年；グラブ（Ｇｒａｂ）等、１９８５年；バーン（Ｈａｈｎ）とラム（Ｌａｍｂ）未公開観察］。

これらのデータは、ＣＨ３１５の−３２６までの塩基配列がグルタチオンまたは菌ニリンターによる調節を受けるために充分であることを示した。−′３２６から−１７３までの欠損は外部刺激を与える前の大豆原形質体におけるＣＡＴ活性の基底レベルを増加させ、さらにグルタチオンに対する反応を明白に増強させた（第１１図）。これに反して、−１３０までの欠損は基底表現と誘発表環レベルの両方を全プロモーターによって観察されたとほぼ同し各レベルにまで低下させた。−７２までの欠損はグルタチオン処理原形質体における表現を非刺激対照原形質体に観察される基底レベルにまで低下させた。グルタチオン調節を無効にするこの欠損はこの過渡分析における誘発の特異性に関する付加的な内部対照を形成する、これはこの構成体においてＣＨＳプロモーター配列の代りにｍ能的ＴＡＴＡボックスに隣接したヘクター配列が用いられるからである。ＴＡＴＡボックス（−２９〜−２１）を除去する−１９までの欠損は対照とグルタチオン処理の両原形譬体におけるキメラ遺伝子の表現を完全に破壊した。

５′欠損は、菌エリジター調製による誘発に対して同様な相対的効果を示した（データ示さず）。従って、−１７３までの欠損は同様に菌ニリンターに対する反応を増強させたが、この強化誘発はグルタチオンに反応して同し構成体によって得られた誘発よりも幾らか弱かった。グルタチオンに関すると同様に、−１３６および−７２までにさらに欠損すると、菌エリジターに反応も徐々に低下した。

考−一一察本発明のデータは、ＣＨＳプロモーターかエレクトロボレートされた原形質体における例えばグルタチオンおよび菌エリジターのようなニリンターＳＸによって明らかに調節されることを示す。他の過渡表現系におけると同様にＣＨ３−ＣＡＴ−ＮＯ３遺伝子が染色体ＤＮＡ中に挿入されないこと、および我々の実験がプラスミド由来遺伝子の表現をモニターすることが考えられる。しかし、原形質体中にエレクトロボレートされたキメラＣＨ３−ＣＡＴ−ＮＯ３遺伝子の反応は、誘発の動力学と誘発剤としてのグルタチオンおよび菌ニリンターの相対効力とに関して、エリツタ−処理細胞浮遊培養物中の内因性染色体ＣＨ５遺伝子の反応に密接に類似する。従って、ここに述べる原形質体系は防御遺伝子のエリジター調節に関与するｃｉｓ−作用性ヌクレオチド配列を分析するための便利な機能的アッセイを提供する。さらに、キメラプロモーター／遺伝子融合を含む植物細胞遺伝工学的に処理することが現在可能であるので、例えば本発明の外因的に誘発可能な植物防御遺伝子プロモーター／構造遺伝子ターミスイター力セント（ＣＧＣ）のようなキメラ「カセット」は今や多様なを用植物中に導入可能である。一般的に、キャブラン（Ｃａｐｌａｎ）等、１９８４年；ホーシｓ　（Ｈｏｒｓｃｈ）等、１９８５年；およびローデス（Ｒｈｏｄｅｓ）等、１９８８年参照。

複合した５’　ＣＨＳ欠ｔ、！（ｎｅｓｔｅｄ　ｓ’　ＣＨＳ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ）のセットによる初期研究によると、−１７３より下流にニリンター調節アクティベーター要素が存在する。　−１３０までおよび−７２までの５′欠損は基底表現の上昇によるのではな（誘導の抑制によってエリツタ−調節に影響するので、このアクティヘーターはポジティブなｃｉｓ作用性要素であるように思われる。この機能分析はＣＨ３遺伝子におけるＤＮアーゼＩ消化に対して過怒受性の座位パターンと一致する〔エム、エイ、ラウトン（門、＾几ａｗｔｏｎ）とシー、ジヱイ、ラム（Ｃ，Ｊ、Ｌａ＋ｓｂ）　、非公開］。調節蛋白質の結合に関連したクロマチン構造の局部開口を意味するこのような３座位は、対照細胞からではないニリンター処理細胞からの核のプロモーターの近位領域（ｐｒｏｘｉｍａｌ　ｒｅｇｉｏｎ）において検出される。対照的に、上ｆＬ’ｐＨ域の座位は非誘発細胞および励起細胞からの核における顕著なりＮアーゼＩ過感受性を示す。

ＴＡＴＡボ、クスと−１３０との間の塩基配列は例えばグルタチオンまたは菌ニリンターのようなエリジター物質による調節のために必要かつ充分であるので、上流配列は表現を調節するように思われ、−１７３までの配列が存在する場合には最大の誘発が得られる。このことは同しｔｒａｎｓ作用性因子または、下流要素とは異なる−１７３〜−１３０の独立的調節要素と相互作用する多重ｃｉｓ作用性配列の存在を表すと考えられる。この代りに、−１７３〜−１３０のヌクレオチド配列の欠損はこの領域に存在するｔｒａｎｓ作用性因子とｃｉｓ作用性因子との結合の破壊によるのではなく、−１３０より下流での活性剤要素への転写因子の結合を調節するクロマチン構造に対する間接的効果によって遺伝子表現に影響を与えると考えられる。

クロマチン構造の同様な間接的再配列も同様に、−３２６〜＝１７３の欠損によって観察された表現強化の原因になると考えられる。しかし、この表現強化は− ３２６〜−１７３の間に存在する不連続なｃｉｓ−作用性サイレンサー要素（ｓｉｌｅｎｃｅｒ　ｅｌｅｓ＋ｅｎｔ）の除去を表すと考えられる。この領域への核因子の特異的結合が最近検出され、さらにｔｒａｎｓの推定サイレンサー要素と完全なＣＨ５−ＣＡＴ−ＮＯ５遺伝子（ｐｃＨｃｌ）との同時エレクトロポレーシヨンは、おそらく対応ｔｒａｎｓ−作用性リプレノサすの結合との競合によって、表現を顕著に刺激すると考えられる（ラウトン等、１９８８年）、？３［合した５′欠損の機能分析は推定サイレンサーがエリジター調節されるか否かを示唆しないが、ポジティブなエリジター調節要素とネガティブなエリツタ−調節要素との間の相乗的相互作用が迅速で顕著な一過性遺伝子活性化のもっともらしい、「ゲイン（ｇａｉｎ）　」機構を提供すると考えられる。

ＣＨ３の５′フランキング領域における２個の配列要素−２４２〜−１９４と− ７４〜−５２（第７図）は同調的に調節される遺伝子コード化フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）すなわちフェニルプロパノイド生合成の第１酵素のプロモーター中に強度に維持される（クレイマー等、非公開観察）。ＰＡＬプロモーター中に同し様に配列されるこれらのモチーフはサイレンサー機能およびアクティヘーター機能にそれぞれ関係すると考えられる。点突然変異とキメラプロモーターとの分析はサイレンサーとアクティヘーターの塩基配列要素をより正確に定義し、エリジター調節におけるサイレンサーの機能を明確にすると考えられる。実験の項Ｉに開示した研究は、グルタチオンと菌エリジターとが遺伝子表現パターンと蛋白質合成とに対して殆んど同じ質的効果を及ぼすことを示した（ゲインゲート等、１９８８年も参照のこと）、ここで実験した５′欠損はグルタチオンおよび菌ニリンターによるｆｆｌ！ｆＪに対して同様な効果を有するが、ＣＨＳプロモーターをさらに分析して、これらの２種類のエリジターから生ずるソゲナルの変換に同しｃｉｓ作用性要素が関与するのかどうかを知ることはかなり重要であると考えられる。

原形質体中に導入された遺伝子の表現が幾つかの場合に実証されているが、外部原因に反応した適当な調節についての今までの唯一の報告は酸素欠乏によって誘発される、エレクトロボレートされたトウモロコシ原形質体におけるキメラアルコールデヒドロゲナーゼＩ　（ＡＤＨＩ）−ＣＡＴ−ＮＯ３遺伝子の刺激である（ヴアルカー（Ｗａｌｋｅｒ）等、１９８７年）。例えばＡＤＨＩとＣＨＳのようなストレス誘発遺伝子活性化のシグナル変換機構は原形質体の単離および培養中も機能的であると考えられる。ニリンターに対する反応は非常に迅速であるので、微生物認識と防御遺伝子活性化との間のシグナル変換系路はごく少ない段階を含むにすぎないと考えられる。従って、ここで確認された、ｃｉｓ作用性要素と相互作用するｔｒａｎｓ作用性核作用性分因子、植物防御の誘発の基礎をなす反応−結合機構の解明に手がかりを与えると思われる。

区皿立設所１辰少里−■ 第７図、（Ａ）ＣＨ３−ＣＡＴ−ＮＯ３構成体の構造および欠失変異体。（Ｂ）ＣＨＳ１５プロモーターのヌクレオチド配列およびＣＡＴ融合接続。図示した制限部位は次の通りである二Ｂ＝ＢａｍＨＩ　；　Ｈ３＝ｔｌｉｎｄＩ［［；　Ｈｆ　＝Ｈｉｎｆｌ　；　Ｋ＝Ｋｐｎ　ｌ　；Ｒ−ＥｃｏＲＩ　；　Ｘ＝Ｘｂａ　ｌ　；　Ｘ２＝Ｘｈｏ　Ｕ。欠失変異体は矢印によって示す。ＴＡＴＡボックスはアンダーラインを施す。エリツタ−誘導ビーンＰＡＬ遺伝子のプロモーター中に維持された塩基配列はオーバーラインを施す。

第８図、浮遊培養細胞に由来する原形質体にエレクトロボレートされたキメラＣＨ５−ＣＡＴ−ＮＯ５遺伝子の表現。

（Ａ）ビーン、大豆およびタバコ原形質体中の表現の比較；（Ｂ）大豆原形質体中のＣＨ５−ＣＡＴ−ＮＯ３とＨ，−ＣＡＴ−ＮＯＳキメラ遺伝子の表現に対するグルタチオンの効果；（Ｃ）菌細胞壁エリジターとグルタチオンとによる誘発の比較：（Ｄ）大豆およびタバコ原形質体におけるグルタチオン誘発表現の時間経過。

ＣＡＴ−確実な細菌ＣＡＴ酵素、Ｔ＝タバコ；Ｂ−ビーン；Ｓ−大豆；ＳＣ−エレクトロボレートされた遺伝子を含まない大豆原形質体、Ｇ＝グルタチオン処理から３時間後の原形質体；Ｅ＝菌エリジターによる処理から３時間後の原形質体；Ｃ＝同等の非処理対照原形質体。充実矢じりは主要なＣＡＴ生成物３−アセチルクロラムフェニコールを意味する。

第９図、ＣＨ５−ＣＡＴ−ＮＯ３遺伝子を含む、エレクトロボレートされた原形質体におけるＣＡＴ転写体の蓄積とＣＡＴ活性との相関関係。上部バ名ル：　ＣＡＴ配列とハイブリッド形成した、（Ｃ）対照原形質体からまたは（Ｇ）グルタチオン処理から３時間後の等両の全細胞ＲＮＡのノザンブロント。下部パネル：等しい原形質体の抽出物からのＣＡＴ活性。

第１０図、エレクトロボレートされたキメラ構成体の量の関数としての基底レベル表現に比べた、ＣＨ５−ＣＡＴ−ＮＯ３のグルタチオン誘発。

第１１図、大豆原形質体にエレクトロボレートされたＣＨ３−ＣＡＴ−ＮＯ５遺伝子のグルタチオン調節に対する５′−欠失の効果。プラス（＋）：グルタチオン添加から３時間後；マイナス（−）：同等の非処理対照。５′−欠失の構造は第７Ａ図に示す。エラー　バー（ｅｒｒｏｒ　ｂａｒ）は独立レプリケート間の標準偏差を示す。

１眉ｆ本発明の詳細な説明するために、この例は、（１）遺伝子転写を調節することによって農業用化学物質に反応すると思われる特徴−特異的な核酸配列を確認するためのプロトコール；および（２）これらの特徴−特異的な核酸配列の転写を誘発するためにを用な農芸化学用化合物を確認するためのプロトコールを開示する。説明において、試験植物はトマトであり、試験特徴は果実杭底または発生の強化または遅延である。

１、発育ＵＲ１Ｉｉ剤（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｏｕ）に反応するトマトｃＤＮＡ　切し　るル上述したように、下記プロトコールを用いて、果実の成熟または発育を強化または遅延させるための農業用化学物質の特異性の試験に有用な組換え構成体を開発する。

Ａ、　口　と　ＲＮＡｉ　１１１、　標的トマト種から根、葉、幹および果実組織を幾つかの発育段階中に回収した６回収＆ｌｌ織を、ドライアイス中で輸送し、−７０°Ｃで貯蔵する前に液体窒素中で迅速凍結した。

ドライアイスによる初期冷凍はＲＮＡの分解を阻止しない（ｓｋｉｎ）と種子を除き、まだ凍結状態のトマト組織を液体窒素の存在下で微粉状に粉砕した。

３、組織粉末からブロティナーゼに処理と、フェノール／クロロホルム抽出とを用いて全ＲＮＡを抽出した。塩化セシウム勾配とミニゲルとをランして、ＲＮＡの完全性を評価した。ポリＡ゛画分を全ＲＮＡから塩化リチウム沈殿と次にオリゴｄ　（Ｔ）カラム（Ｏｌｉｇｏ　ｄ（Ｔ）　ｃｏｌｕｍｎ）　ヘの通過を実施することによって単離した。

Ｂ、Ｌ　れた　の　切４、トマト組織の種々な発育段階からポリＡ″ＲＮＡを単離しく上述のように）、これに対してインビトロ翻訳処置（ＩＶＴ）を実施した。翻訳混合物はウサギ網状赤血球熔解物、塩、アミノ酸混合物、タレアチンホスフェートおよび”　５ −ｓｅｔから成った。処１はプロメガ　バイオチック（Ｐｒｏｓｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）　、ウィスコンシン州マジソンから提供されたプロトコールに述べられた通りに実施した。

５、次にＩＶＴ翻訳生成物を柵！１！電気泳動法によって、１２．５％１次元（１）ゲル上でランした。このゲルをオートラジオグラフィーフィルムに暴露させ、適当な時間（約２０時間）後に、フィルムを現像した。

６、　種々な翻訳生成物のゲルバンド形成パターンを比較し、相異を記録した。

ｍＲＮＡに対応する次のような翻訳生成＠！Ｉ　：　（１）ある組織には非常に多く含まれるが、他の＆［ｌ織には存在しない（＆ｌＩ織特異性）翻訳生成物；（２）ある発育段階には多く存在するが、他の発育段階には少ないかまたは存在しない（発育的に１Ｊ４１！Ｉｌされる）および／または（３）全ての発育段階に存在する翻訳生成物を確認することが可能である。

約３８．５ＫＤの蛋白質に相当する翻訳生成物は果実の発育が進行するにつれて、豊富に存在することが判明した。従って、これは発育化学物質用のアグリケミカルスクリーンの開発に用いるための可能なマーカー蛋白質とみなされた。

幾つかの蛋白質ハンドはあらゆる組織中に、かつあらゆる発育段階に認められた。このような蛋白質は対照として有用である、すなわちこれらのマーカーは発育のための農薬の投与によって影響されない。

７、　種々なトマト組織と発育段階との間の蛋白質パターンに認められる相異をさらに充分に分析するために、ＴＶＴ翻訳生成物の一部を二次元（２Ｄ）ゲル上でランした。この処置はＩＤＩ白譬帯をそれらの固有の、個々の蛋白質成分に分離した。ＩＤゲルによると同様に、２Ｄゲルパターンを相互に比較し、類似性と差異とを記録した。２Ｄゲルパターンのコンピューター補助分析を用いて、正確で適切な比較を促進した。２Ｄゲル分析は約３８．５ＫＤの蛋白質が果実の発育の後期に現われることを実証し、アグリカルチャー試験スクリーンにおけるマーカーとしてのその可能な使用を支持した。それ故、全組織中に残留した約４４ＫＤ蛋白質の蛋白質を構成対照マーカーとして標識した。

Ｃ，ｃＤＮＡとして　テマーカーを　るためのトマトｃＤＮＡ−イブ−］８、　発育の中間段階にあるトマト果実からポリＡ″ＲＮＡを調製し、（上記のように）評価した。第−鎖ｃＤＮＡ反応（ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　５ｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）はＳｌヌクレアーゼを用いて完成させた。第二鎖合成はＤＮＡポリメラーゼと逆トランスクリプターゼとを用いて完成させた。

９、　二重鎖ｃＤＮＡがＣ−末端を有するようにし、Ｇ−末端ｐＢＲ３２２に挿入して、トマト果実ｃ　ＤＮＡライブラリーを形成した。

Ｄ、″マーカー”ｃ　ＤＮＡクローンのスクリーニング　ｉおよグ車蓋１０、このｃＤＮＡライブラリーを果実の早期および後期発育段階からのＲＮＡによってスクリーニングした。

この示差スクリーニングは、発育の後期に表現されるが早期には表現されない蛋白質を表示するようなりローンを検出するために実施した（これらは“後期″ＲＮＡプローブとハイブリッド形成するが、“早期”ＲＮＡプローブとはハイブリッド形成しない）。

ａ、早期（ビグリーン）組織と後期（３＃中間）組織がら、スクロース勾配分画のためのポリ（Ａ）ＲＮＡをｉＪ製するために充分な量で全ＲＮＡを調製した。

ｂ、ポリ（Ａ）ＲＮＡを選択した。

Ｃ，スクロース勾配上で早期および後期ＲＮＡを分画した。

ｄ、ＲＮＡ画分を勾配を通して翻訳しくＩＶＴ）どの百分が約３８．５蛋白質および約４４ＫＤ蛋白質をコード化するｍＤＮＡに多く含まれるかを決定した。

ｅ３選択された勾配画分からのＲＮＡを”ｐ−ＡＴｐとのポリヌクレオチドキナーゼ反応によって標識した。

ｆ、果実発育の早期または後期段階から分画した、キナーゼ標識ＲＮＡによって、ｃ　ＤＮＡライブラリーを検査した。

ｇ、異なるＲＮＡ調製物には異なるハイブリッド形成を示したクローンを選択しく従って、発育調節を示唆する）、異なるＲＮＡＪ製物に対して充分に等しくハイブリッド形成を示したクローンを選択した（従って、構成表現を示唆する）。

Ｅ、マーカーｃ　ＤＮＡ１１、クローンをインサートサイズと塩基配列相同関係に関して特性化した。

ａ、これらのクローン配列をノザンゲル上でｍＲＮＡ種との相同関係に関してテストした。

ｂ、上記段階４（項ＩＢ、段階４）での研究のために選択した画分中に多く含まれるｍＲＮＡをコード化するｍＲＮＡ種に対して相同関係を有するクローンを確認した。

ｃ、Ｎ準ｍＲＮＡハイプリント形成と選択実験とを用いて、約５０ＫＤの蛋白質コード化クローンを、付加的クローンと同様に確認した。

ｄ、約５０ＫＤ蛋白質をコード化するクローンの塩基配列を決定し、コード化された蛋白質を確認し、この塩基配列をさらに特性化した。

１、ＩＪｕｌに述べたｃＤＮＡマーカープローブを用いて、標準サザンハイブリッド形成とクローニング方法によってそれらのゲノム対応物を単離した０例として、約５０ＫＤ蛋白質コード化発育マーカーｃＤＮＡを用いて、転写が発育によって調節される遺伝子を単離した。

Ｂ、マーカープロモー　− ２、クローン化遺伝子のプロモーターフラグメントをＤＮＡ塩基配列決定によって確認し、親クローンから単離した。

要約すると、開始コドン（ＡＴＧ）から上流の塩基配列を検査して、ＴＡＴＡボンクスツクむことを見出す；可能なプロモーター塩基配列はＡＴＣの約２００塩基対上流程度にまで伸長可能である。

３、　クローン化プロモーターの強度と調節可能性とをテストするために、プロモーターフラグメントを例えばＩａｃ　Ｚ、ＧＵＳ、ホタル　ルシフェラーゼまたはＣＡＴのようなレポーター遺伝子に融合する。これらの表現構成体をベクターに挿入して、適当な条件下で遺伝子表現を誘発する、例えば発育を調節することが知られている物！（すなわち、公知の発育調節剤）を増殖培地に加える。

ａ、プロモーターが実際に発育に関する農業用化学物質によって調節されるならば、プロモーターはそのｍＲＮＡが蛋白質に翻訳されるような、プロモーターの付加レポーター遺伝子の転写を開始することが判明する。

ｂ９例えば、１ａｃＺの存在はＸ−ｇａｌの培地への添加によって検出される。

ｌａｃ　Ｚが存在する場合には、培地はブルーに変化する。

４、　プロモーター領域が適当な調節下にあると考えられる場合には、これらを用いて遺伝子導入植物を製造する。

Ｃ１′　−ベク　− ５、　プロモーター／レポーター遺伝子構成体を適当なベクタ−〔例えば、ＢＩＮ１９またはシンプソン（Ｓｉｍｐｓｏｎ）等に１９８７年４月１４日に発行された米国特許第４．６５８，０８２号に挙げられているヘクターのようなアグロバクテリウム（ＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ）　Ｔ　ｉプラスミドに基づくヘクター〕中に挿入する。

Ｄ、星ｌ紅奥トマトの形質転換は公知の方法によって実施する。

Ｅ、　に　る　“　ｉ　−るための゛　−血士四Ｊ支里プロモーター／レポーター遺伝子のキメラ遺伝子カセント（本明細書の定義の項参照）を含む遺伝子導入植物をレポーター遺伝子の正確な表現すなわち発育調節下でのレポーター遺伝子の表現に関してテストする。レポーター遺伝子の適当な表現を示す植物材料を用いて、遺伝子導入植物分析系を開発する。例えば、このような植物を早期の果実形成期にまで成長させてから、可能な農業用化学物質によって処理する。

レポーター遺伝子の表現を誘発するような化学物質は杭底過程を促進させる農業用化学物質の候補である。

条−１し二り一献次の参考文献を明細書中に引用する。各参考文献の内容は明白にここに参考文献として関係する。

１、アルドン、エフ。ケイ（Ａｌｔｏｎ、Ｎ、に、）とヴアブ２７先ディ（Ｖａｐｎｅｋ、　Ｄ）　、　ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２８２：　８６４〜８６９頁（１９７９）　。

２、ヘイレイ、ジェイ、エイ（Ｂａｉｌｅｙ、Ｊ、Ａ、）とデバーオール。

ビー、ジェイ、（Ｄｅｖｅｒａｌｌ、Ｂ、Ｊ、）、’ビーンハイボコチルス（フェイスオース　ｊ土夏ユ１）とコレクト　Ｉチウム　ユンー゛ムチニウムの生理的系統との間の相互作用におけるフエイズオリンの形成および活性（Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆｐｈａｓｅｏｌｌｉｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｂｅａｎ　ｈｙｐｏｃｏｔｙｌｓ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒａｃｅｓ　ｏｆＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ　Ｉｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ、）　Ｊフィシオル　ブーン乙ニド四−（影狂互Ｐ且工」」１１工うす亙ｏｆ、）　ｒ　：４３５〜４４９頁（１９７１）。

３、ビーラウスキ、ダブリｘ　（ＢｉｅｌａｗｓｋｉＪ、）とジョイ。ケイ、ダブリュー（Ｊｏｙ、に、Ｗ、）、　ｒビサム　サチブウムの組織における還元および酸化されたグルタチオンとグルタチオンリリダクターゼ（Ｒｅｄｕｃｅｄ　ａｎｄ　ｏｘｉｄｉｚｅｄ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ａｎｄｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｉｎ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ｏｆ　Ｐｉｓｕｓ＋　ｓａｔｉｖｕｍ、）工ｉヱ、７　（Ｐｌａｒ＋ｔａ）　１６９　：　２６７〜２７２頁（１９８６）。

４、ポンネル、ダブリュー、エム（ＢｏｎｎｅｒＪ、Ｍ、）とラスケイ。

アール、エイ（Ｌａｓｋｅｙ、Ｒ，Ａ、）、’ポリアクリルアミドゲル中のトリチウム標識蛋白質と核酸のフィルム検出方法（Ａ　ｆｉｌｍ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　＋ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｒｉＬｉｕ＋＊−１ａｂｅｌｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌｓ、）　Ｊヨウル　ジェイ　バイオ　ム（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ）４６　：　８３〜８８頁（１９７４）　。

５、ブランドフォード、エム、エム、（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｍ、Ｍ、）、アナル、ハイオケム、（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ）　７２　：　２４Ｂ〜２５４頁（１９７６）。

６、キャブラン、ニー、（Ｃａｐｌａｎ、＾、）、ヘレラーエストレラ２Ｌ。

（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、　Ｌ、）＋　イネ゛ゾ、　Ｄ、（Ｉｎｅｚ、Ｄ、）、ハンハウテ、イー、（Ｖａｎ　Ｈａｖｔｅ、Ｅ、）＋　ハンモンターグ、エルエム。

（Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ、　ＩＭ、）＋　シェル、ジエイ、　（Ｓｃｈｅｌｌ、Ｊ、）とザムブリスキ、ピー、（Ｚａｍｂｒｉｓｋｉ、Ｐ、）、’植物への遺伝材料の導　−人（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｔｅｒｉａｌ　１ｎｔｏ　Ｐｌａｎｔｓ）　Ｊ　。

ハイオークノロジー　アンド　バイオロジカルフロン−ア二Ｘ　（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　＆　Ｂｉｏｌｏ　ｃａｌ　Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ）、ビー、エイチ、アヘルソン（Ｐ、Ｈ，Ａｂｅｌｓｏｎ）Ｗ集、ジ　アメリカン　アソソエーション　フォア　ジ　アドハンスメント　オブ　サイエンス（Ｔｈｅ　ＡＩＩｅｒｉｃａｎ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ）、ワシントン、　Ｄ、（：、、　１９８４．４８０〜４９３頁。

７、チャイ１　エイチ、ビー、（Ｃｈａｉ、Ｈ，Ｂ、）とドク、エヌ、　（Ｄｏｋｅ。

Ｎ、）、スーパーオキシドアニオン製造（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ａｎｉｏｎｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）　：　Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　１ｎｆｅｓｔａｎｓ　による感染に対するジャガイモの葉の反応（Ａ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｐｏｔａｔｏ　１ｅａｖｅｓ　ｔ。

１ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ＰｈｙｔｏｐｈＬｈｏｒａ　１ｎｆｅｓｔａｎｓ　）　、フイトバソロジー（Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）　７７　：　６４５〜６４９頁（１９８７）　。

８、チャペル、ジエイ、（Ｃｈａｐｐｅｌｌ、Ｊ、）とバールブロック、ケイ。

（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ、に、）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　３１１　：　７６〜７８頁（１９８４）。

９、チェン、ワイ、　（Ｃｈｅｎ、　Ｙ、）とソーハルグ、ビー、　（Ｓｅｅｂｕｒｇ、Ｐ、）＋ＤＮ＾　４：１６５〜１７０頁　（１９８５）。

１０、コルビン、ディー、アール、　（Ｃｏｒｂｉｎ、　Ｄ、Ｒ，）、サウエル、エヌ、　（Ｓａｕｅｒ、　Ｎ、）　とラム、シー、ジェイ、（Ｌａｍｂ＋Ｃ，Ｊ、）＋　傷ついた及び感染した植物におけるヒドロオキシプロライン富化糖蛋白質遺伝子族の示差調節（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｈｉｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ　ｇｌｙｃｏρｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｆａｍｉｌｙ　ｉｎ　ｗｏｕｎｄｅｄａｎｄ　１ｎｆｅｃｔｅｄ　ｏｌａｎｔｓ）、モル、セル、パイオル、　（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　。

Ｂｉｏｌ）　７　：４３３７〜４３４４頁（１９８７）。

１１、　クラマー、ソー、エル、（Ｃｒａｍｅｒ、Ｃ，Ｌ、Ｌ　ヘル、ジエイ、エヌ、（Ｂｅｌｌ、Ｊ、Ｎ、）、ライダー、ティー、ビー、　（Ｒｙｄｅｒ、　Ｔ、　Ｂ、）。

ハイレイ２　ジエイ、ニー、（Ｂａｉｌｅｙ、Ｊ、Ａ、）＋　シュ７チ、ダブ′ すｓ　、（Ｓｃｈｕｃｈ、Ｗ、）、　ポルウェル、ジー、ビー、（Ｂｏｌｗｅｌｌ、Ｇ、Ｐ、）。

ロビンス２　エム、ビー、（Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｍ、Ｐ、）、ジイキソン、アール、ニー、（Ｄｉｘｏｎ、Ｒ，Ａ、）　とラム、シー、ジェイ、（Ｌａｍｂ＋Ｃ，Ｊ、）＋ＥＭＢＯＪ、４　：　２８５〜２８９頁（１９８５ｂ）。

１２、クラマー、シー、エル、（Ｃｒａ＋ｗｅｒ、Ｃ，Ｌ、）＋　ライダー、ティー。

ビー、（Ｒｙｄｅｒ、Ｔ、Ｂ、）、ヘル、ジエイ、エヌ、　（Ｂｅｌｌ、　Ｊ、Ｎ、）とラム、シー、ジエイ、　（Ｌａｍｂ、Ｃ，、Ｊ、）、菌エリジターによる植物遺伝子表現の迅速スイッチング（Ｒａｐｉｄ　ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ｆｕｎｇａｌ　ｅｌｉｃｉｔｏｒ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２７　：　１２４０〜１２４３頁（１９８５ａ　）　。

１３、クラマー、シー、エル、　（Ｃｒａｍｅｒ、Ｃ，Ｌ、）、エドワーズ、ケイ。

（Ｅｄｗａｒｄｓ、に、）、ドロン、エム、　（Ｄｒｏｎ＋　Ｍ、）　＋　リアング、エツクス、　（Ｌｉａｎｇ、Ｘ、）、ジルジン、ニス、エル、　（Ｄｉｌｄｉｎｅ、　Ｓ、Ｌ、）　＋ポルウェル、ジー、ビー、（Ｂｏｌｗｅｌｌ、Ｇ、Ｐ、）、ジイキソン、アール、ニー、　（Ｄｒｘｏｎ、　Ｒ，Ａ、）、ラム、シー、ジェ仁（Ｌａｍｂ、Ｃ，Ｊ、）。

とシュンチ、ダブ゛リュー、　（Ｓｃｈｕｃｈ、　！１１．）　、　フェニルアラニンアンモニアーリサーゼ遺伝子配向と構造（ＰｈｅｎｙＩａＩａｎ：ｎｅＡａｘｏｎ’ｒａ−１ｙｓａｓｅ　Ｇｅｎｅ　０ｒｉｅｎｔａｔｒｏｎ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）、印刷中。

プラント　モレク　ハイオル（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃ　Ｒｉａｌ）、　（１９８９）。

１４、ダングル、ジエイ、エル、（Ｄａｎｇｌ、Ｊ、Ｌ、）、Ａウフエ、ケイ。

ディー、（Ｈａｕｆｆｅ、に、Ｄ、）、リフアルド、ニス、（Ｌｉｐｐｈａｒｄｔ、Ｓ、）。

ハールブロツ先　ケイ、　（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ、　Ｋ、）　とシール、ディー。

（Ｓｃｈｅｅｌ、Ｄ、）、　ＥＭＢＯＪ、　６　：　２５５１〜１５５６頁（１９８７）。

１５、ダービル、ニー、　（Ｄａｒｖｉｌｌ、Ａ、）　とアルバージニイム、ビー。

（Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ、Ｐ、）、アニュ、レブ、プラント　フィシオル。

（Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）　３５　：　２４３〜２７５頁（１９８４）　。

１６、ダビイス、ケイ、アール、（Ｄａｖｉｓ＋に、Ｒ，）＋　グービル、ニー。

ジー、（Ｄａｒｖｉｌｌ、Ａ、Ｇ、）　とアルバージニイム、ビ〜。

（Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ、　Ｐ、）＋　プラント　モル、パイオル（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ）　６　：　２３〜３２頁（＋９８６）。

１７、ダビス、ケイ、アール、　（Ｄａｖｉｓ、　Ｋ、Ｒ，）　とハールブｏ　 ’７り。

ケイ、　（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ、に、）、プラント　フィシオル、（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ、）　８５　：　１２８６〜１２９０頁（１９８７）　。

１８、デコノク、エル、ジェ仁（Ｄｅｋｏｋ、　Ｌ、Ｊ、）　とオースターフイス、エフ、ニー、（Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ、Ｆ、Ａ、）、　ホウレン草の葉のグルタチオンとスルフヒドリルレベルに対するフロストハードニングと塩度との効果（Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｆｒｏｓｔ　ｈａｒｄｅｎｉｎｇａｎｄｓａｌｉｎｉｔｙ　ｏｎ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ａｎｄ　５ｕｌｆｈｙｄｒｙｌ　１ｅｖｅｌｓ　１ｎｓｐｉｎａｃｈ　１ｅａｖｅｓ）、フィシオル、プラント、　（Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ、）５８　：　４７〜５１頁（１９８３）　。

１９、ジイキソン、アール、ニー、　（Ｄｉｘｏｎ、Ｒ，Ａ、）＋　デ仁　ビー。

エム、　（Ｄｅｙ、　Ｐ、Ｍ、）　とラム、シー、ジエイ、（Ｌａｍｂ、Ｃ，Ｊ、）、アドブ、エンチモル、リレート９アリアス　モル、パイオル。

（ａｄｖ、Ｅｎｚｙｌｓｏｌ、Ｒｅ１ａｔ、Ａｒｅａｓ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）５５　：　１〜１３５頁（１９８３）　。

２０、ジイキソン、アール、ニー、　（Ｄｉｘｏｎ、　Ｒ，Ａ、）＋　バイレイ、ジエイ、ニー、（Ｂａｉｌｅｙ、Ｊ、Ａ、）、ヘ）Ｌｔ、ジｘイ、１ヌ。

（Ｂａ１１．Ｊ、Ｎ、）、ポルウェル、ジー、ビー、　（Ｂｏ揃ｅｌｌｌＧ、Ｐ、）＋クラマー、シー、エル、（Ｃｒａ＊ｅｒ＋Ｃ，Ｌ、）＋　：Ｌドヮーズ、ケイ。

（ＥｄｗａｒｄｓＪ、）、ハンダム、エム、　ｘ　−、ｘム、ニス。

（Ｈａｍｄａｎ、ｆｆ、Ａ、Ｍ、ｓ、）＋　ラム、シー、ジェイ、（Ｌａｍｂ、Ｃ，Ｊ、）。

ロビンス５　エム、ビー、（Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｍ、Ｐ、）、ライダー、ティー。

ビー、　（Ｒｙｄｅｒ、　Ｔ、Ｂ、　）とシュｙチ、ダブリｓ−，（Ｓｃｈｕｃｈｉ、）＋フィル、トランス、アール、ツク、ロンドン　ビー、（Ｐｈｉｌ。

Ｔｒａｎｓ、Ｒ，Ｓｏｃ、Ｌｏｎｄｏｎ　Ｂ、）　３１４　：　４１１〜４２６頁（１９８６）　。

２１、ダグラス、シー、　（Ｄｏｕｇｌａｓ、Ｃ，）、ホフマン、エイチ。

（）ｌｏｆｆｍａｎ、Ｈ，）、シュルツ、ダブリュー、（Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｗ、）、とバールプロッタ、ケイ、（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ、に、）　、２種類の４− フマレートの構造とエリジターまたはＵ、Ｖ、光線刺激表現（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｅｌｉｃｉｔｏｒ　ｏｒ　Ｕ、Ｖ、−１ｉｇｈｔ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｗｏ　４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ）　：パセリにおけるＣｏＡ　リガーゼ遺伝子（ＣｏＡ　ｌｉｇａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｐａｒｓｌｅｙ）、　ＥＭＢＯＪ。

６（５）　：　１１８９〜１１９５頁（１９８７）。

２２、ドロン、エム、　（Ｄｒｏｎ、　Ｍ、）　、クローズ、ニス、ディー。

（Ｃ１ｏｕｓｅ、　Ｓ、Ｄ、）、ジイキソン、アール、ニー、（Ｄｉｘｏｎ、Ｒ，Ａ、）＋ロートン、エム、ニー、　（Ｌａｗｔｏｎ、　Ｍ、Ａ、）とラム、シー、ジェイ。

（Ｌａｍｂ、Ｃ，Ｊ、）、エレクトロボレートされた原形質体の植物防御遺伝子プロモーターのエリジター調節（ＥｌｉｃｉｔｏｒＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｐｌａｎｔ　Ｄｅｆｅｎｓｅ　Ｇｅｎｅ　Ｐｒｏｍｏｔｅｒ　１ｎＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ）、ブロク、ナトル、アカド。

サイ、　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ　８５　：　６７３８〜６７４２頁（１９８８）。

（この原稿の一部は実験の項■としてここに含める）２３、エベル、ジエイ、　（Ｅｂｅｌ、　Ｊ、）、　アニュ、レブ、フィトパソールｙ　（Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌ、）　２４　：　２３５〜２６４頁（１９８６）　６２４、エドワーズ、ケイ、　（Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ｋ、）＋　クラマー、シー、エル。

（Ｃｒａｓｅｒ　＋　Ｃ，Ｌ　、　）　、　ポルウェル、ジー、ビー、　（Ｂｏｌｗａｌｌ、Ｇ、Ｐ、）。

ジイキソン、アール、ニー、（Ｄｉｘｏｎ、Ｒ，Ａ、）、シｚ　’７チ、ダブリｓ　−、（ＳｃｈｕｃｈＪ、）とラム、シー、ジエイ、　（Ｌａｓｂ、Ｃ，Ｊ、）、エリジター処理ビーン細胞におけるフェニルアラニンアンモニア−リアーゼｍＲＮＡの迅速過渡誘導（Ｒａｐｉｄ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｅｎｙｌ−ａｌａｎｉｎｅ　ａｍｍｏｎｉａ−１ｙａｓｅ　ｍＲＮＡ　１ｎｅｌｉｃｊｔｏｒ−ｔｒｅａｔｅｄ　ｂｅａｎ　ｃｅｌｌｓ）、ブロク、ナトル、アカド。

サイ、　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　８２　：　６７３１〜６７３５頁（１９８５）　。

２５、エドワーズ、アール。（Ｅｄｗａｒｄｓ、Ｒ，）　とオーウエン、ダブリュー、ジェイ、（Ｏｍｅｒ＋、ＬＪ、）、植物と浮遊培養細胞における除草剤解毒の原因となるトウモロコンのグルタチオン−５−トランスフェラーゼの比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−ｓ−ｔｒａｓｆｅｒａｓｅｓ　ｏｆ　Ｚｅａ　ｗａｙｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ　ａｎｄ　５ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｃｅｌｌｓ）。

プランタ（Ｐｌａｎｔａ）　１６９　：　２０８〜２１５頁（１９８６）。

２６、フロム、エム、イー、（Ｆｒｏｍｓ、Ｍ、Ｅ、）、ティラー、エル、ピ、（Ｔａｙｌｏｒ、Ｌ、Ｐ、）とウォルポット、ブイ、（Ｗａｌｂｏｔ、Ｖ、）。

ブロク、ナトル、アカド、サイ、　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８２　：　５８２４〜５８２８頁（１９８５）。

２７、ギャレルズ、ジェイ、アイ、　（Ｇａｒｒｅｌｓ、　Ｊ、　１．）　＋　クローン細胞ラインによって合成した蛋白質の二次元ゲル電気泳動とコンピューター分析（Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎｄ　ｃｏｍｐｕｔｅｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　５ｙｎｔｈｅｓＬｚｅｄ　ｂｙ　ｃｌｏｎａｌｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ）、ジェイ、パイオル、ケム、　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＊、）２５４　：　７９６１〜７９７７頁（１９７９）　。

２８、グラブ、ディ、（Ｇｒａｂ、Ｄ、）＋　ロイヤル、アール、（Ｌｏｙａｌ、Ｒ，）とエベル、ジェイ、　（Ｅｂｅｌ、　Ｊ、）、アーチ、ハイオケム、バイオフィズ、　（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、）　２４３　：　５２３〜５２９頁（１９８５）。

２９、グリル、イー、　（Ｇｒｉｌｌ、Ｅ、）、ウィンナフカ−。アイ、−エル、（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、ｉ、−Ｌ、）とインク。エム、エイチ、（Ｚｅｎｋ、Ｍ、Ｈ，）。

フィトケラチンズ：高級植物における主要重金属錯化ペプチド（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｌａｔｉｎｓ　：　Ｔｈｅ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ　ｈｅａｖｙ＋ｍｅｔａｌ　ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇｐｅｐｔｉｄｅｓ　ｏｒ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ）、サンエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３０　：６７４〜６７６頁（１９８５）。

３０、ガスチン、ディー、エル、（Ｇｕｓｔｉｎｅ、Ｄ、Ｌ、）、ｐ−り００安患香酸によるラジノクローバーカルスにおけるメジカーピン生合成の誘導のジチオスレイトールによる逆転（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｄｉｃａｒｐｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｌａｄｉｎｏ　ｃｌｏｖｅｒｃａｌｌｕｓ　ｂｙ　ｐ−ｃｈｌｏｒｏｍｅｒｃｕｒｉｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ　ｉｓ　ｒｅｖｅｒｓｅｄ　ｂｙｄｉｔｈｉｏ−ｔｈｒｅｉｔｏｌ、）プラント　フィズイオル、　（ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ、）　８４　：　３〜６頁（１９８７）。

３１、ハールフ′ロック、ケイ、　（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ、　ｌ［、）　とグリスパンチ。

エイチ、（Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ、Ｈ，）、　アニュ、レブ、プラント　フィシオル、　（Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）　３０　：　１０５〜１３０頁（１９７９）。

３２、ハールブロツク、ケイ、（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ、に、）　、ノブロフ、ケイ。

−エイチ、（Ｋｎｏｂｌｏｃｈ、に、−）１．）、クロイザルエル、エフ。

（Ｋｒｅｕｚａｌｅｒ、Ｆ、）、ポノツ、ジエイ、アール、エム、（Ｐｏｔｔｓ。

Ｊ、Ｒ，？１．）　とジェルマン。イー、（Ｗｅｌｌｍａｎｎ、Ｅ、）＋　ヨーロ、ジエイ、ハイオケム、（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　６１　：　１９９〜２０６頁（１９７６）。

３３、ヘトリック、ニス、ニー、（Ｈｅｄｒｉｃｋ、Ｓ、Ａ、）、ヘル、ジェイ。

エヌ、（Ｂｅｉｉ＋Ｊ、Ｎ、）＋　ポーラ−、ティー、　（Ｂｏｌｌｅｒ、Ｔ、）とラム。

ソー、ジエイ、　（Ｌａｍｂ、　Ｃ，Ｊ、）　、プラント　フィズイオル。

（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）８６　：　１Ｂ２〜１８６ＪＶ　（１９８Ｂ）。

３４、ヘニコフ、ニス、（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｓ、）、ジーン（Ｇｅｎｅ）２８　：　３５１〜３５９頁（１９８４）。

３５、ホーシュ、アール、ビー、（Ｈｏｒｓｃｈ、Ｒ，Ｂ、）、　フライ、ジェイ。

イー、（Ｆｒｙ、Ｊ、Ｅ、）、ホフマン７エヌ、エル、（Ｈｏｆｆ＋ｗａｎｎ、Ｎ、Ｌ、）＋アイコノツ、ディー、（Ｅｉｃｏｔｚ、Ｄ、）、ロジャース、ニス、ジー。

（Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、Ｇ、）　とフラレイ２　アール、ティー、（Ｆｒａｌｅｙ、Ｒ，Ｔ、）。

サンエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２７　：　１２２９〜１２３１頁（１９８５）。

３６、ラム、シー、ンエイ、（Ｌａｍｂ、Ｃ，Ｊ、）、　ヘル、ジエイ、エヌ。

（Ｂｅｌｌ、Ｊ、Ｎ、）　、コルビン、ディー、アール、　（Ｃｏｒｂｉｎ、　Ｄ、Ｉｌ、）、　ロートン、エム、ニー、（Ｌａｗｔｏｎ、Ｍ、Ａ、）、メーデ４．工り、シ＋。

（Ｍｅｈｄｙ、Ｍ、Ｃ，）、ライダー、ティー、ビー、（Ｒｙｄｅｒ、Ｔ、Ｂ、）、サウエル、エヌ、　（Ｓａｕｅｒ、　Ｎ、）　とウィルター。エム、エイチ。

（Ｗａｉｔｅｒ、Ｍ、Ｈ，）、　’エリジターと感染に反応した防御遺伝子の活性化（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔ。

ｅｌｉｃｉｔｏｒ　ａｎｄ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）　Ｊ　％　Ｉｉ’ｆｚ　−２）　−ｈ　区−Ｘ−フォアクロ　ププロークション（包江組旦り針■圏紅競ユ虹Ｃｒｏ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　、シー、アルンツエン（Ｃ，Ａｒｎｔｚｅｎ）とシー。

ニー、ライアン（Ｃ，Ａ、Ｒｙａｎ）編集、アラン　アール、リス（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ）、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９８７．４９頁。

３７、ロートン、エム、ニー、（Ｌａｗｔｏｎ、Ｍ、Ａ、）、ジイキソン、アール、ニー、（Ｄｉｘｏｎ、Ｒ，Ａ、）、バールプロ７り、ケイ、　（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ。

Ｋ、）とラム、シー、ジエイ、（Ｌａｓｂ、Ｃ，Ｊ、）、菌感染、創傷および感染症による植物防御遺伝子の転写活性化（Ｔｒａｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｄｅｆｅｕｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｂｙ　ｆｕｎｇａｌ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ。

ｉｎｏｕｎｄｉｎｇ　ａｎｄ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ、）ヨーロ、ジエイ、バイオケム。

（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　１３０　：　１３１〜１３９頁　（１９８３）　。

３８、ロートン、エム、ニー、　（Ｌａｗｔｏｎ、Ｍ、Ａ、）とラム、シー、ジエイ、（Ｌａｍｂ、Ｃ，Ｊ、）、モル、セル、ハイオル、　（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）７：３３５〜３４１頁（１９８７）。

３９、ロートン、エム、ニー、（Ｌａｗｔｏｎ、Ｍ、Ａ、）、クラ−、ケイ。

（Ｋｒａｇｈ、に、）、ジェンキンス、ニス、エム、（Ｊｅｎｋｉｎｓ、Ｓ、Ｍ、）＋ドロン、エム、　（Ｏｒｏｎ、　Ｍ、）＋　クローズ、ニス、ディー。

（Ｃ１ｏｕｓｅ、Ｓ、Ｄ、）、ジイキソン、アール、ニー、（Ｄｉｘｏｎ’、Ｒ，Ａ、）。

とラム、シー、ジエイ、（Ｌａｍｂ、Ｃ，Ｊ、）、ジェイ、セル、ハイオケム、（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｃｈｅｍ、）増刊１２Ｃアブストラクト＃Ｌ７０７゜４０、マルボン、ソー、シー、　（Ｍａｌｂｏｎ、Ｃ，Ｃ，）、ジジージ、ニス。

テ４　、（Ｇｅｏｒｇｅ、Ｓ、Ｔ、）、モツクスハム、シー、ビー、　（Ｍｏｘｈａ＋ａ。

Ｃ，Ｐ、）、分子内ジスルフィド架橋（Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｒｉｄｇｅｓ）　：レセプター活性化の手段（ａｖｅｎｕｅｓ　ｔｏ　ｒｅｃｅｐｔｏｒａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、）　トレンズ　ハイオケム、サイ、　（７ｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｓ、Ｓｃｉ、）　１３７　：　１７２〜１７５頁（１９８７）。

４１、マクマスター、ジー　ケイ、（ＭｃＭａｓｔｅｒ、Ｇ、に、）とカーミカエル、ジー、ジー、（Ｃａｒｓｉｃｈａｅｌ、Ｇ、Ｇ、）、グリオキサルとアクリジンオレンジとを用いたポリアクリルアミドゲルとアガローズゲル上での一重鎖および二重鎖核酸の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆｓｉｎｇｉｅ　−ａｎｄ　ｄｏｕｂｉｅ　−５ｔｒａｎｄｅｄ　ｎｕｃ！ｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｏｎｐｏｌｙａｃｒｙｌａｓｉｄｅ　ａｎｄ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ｇｌｙｏｘａｌ　ａｎｄａｃｒｉｄｉｎｅ　ｏｒａｎｇｅ、）ブロク、ナトル、アカド、サイ、　（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　７４　：　４８３５〜４８３９頁（１９７７）。

４２、マイスター、ニー、　（Ｍｅｉｓｔｅｒ、　Ａ、）　とアンデルフン。エム。

イー、　（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、門、Ｅ、）、グルタチオン、　（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ、）アニュ、レブ、ハイオケム（Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｓ、）　５２　：　７１１〜７６０頁（１９８３）。

４３、ミース、エイチ、　（Ｍｉｅｔｈ、Ｈ，）、スペス、ブイ、　（Ｓｐｅ　ｔｈ　、　Ｖ、　）　とエヘル、ジェイ、（Ｅｂｅｌ、Ｊ、）、　ツエノト、ナトルフォルシュ（Ｚ、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ、）　４１ｃ　：　１９３〜２０１頁（１９８６）。

４４、ムースタ、ビー、（門ｏｅｓｔａ＋Ｐ、）とグリスハツチ、エイチ。

（Ｇｒｉｓｅｂａｃｈ、Ｈ，）、大豆でのフィトアレキシン代謝に対する生物的および非生物的ニリンターの効果、（Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｂｉｏｔｉｃａｎｄ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｅｌｉｃｔｏｒｓ　ｏｎ　ｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ　ｓｅｔａｂｏｌｉｓｍ　１ｎｓｏｙｂｅｓｎ、）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２８６　：　７１０〜７１１頁（１９８０）。

４５、ニートーソテロ、ジエイ、　（Ｎｉｅｔｏ−５ｏｅｔｏ、　Ｊ、）とホー、ティーエイチ、−ディー、（Ｈｏ、Ｔｈ、−Ｄ、）、トウモロコシ相中のグルタチオン代謝に対する熱衝撃の効果、（Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｅａｔ　５ｈｏｃｋｏｎ　ｔｈｅ　５ｅｔａｂｏｌｉｓｓ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｉｎ　ｍａｉｚｅ　ｒｏｏｔｓ、）　プラント　フィシオル、（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）　８２　：　１０３１〜１０３５頁（１９８６）。

４６、ノーマン、ビー、エム、（Ｎｏｒｍａｒ＋、Ｐ、Ｍ、）＋　ウィンゲート、フ゛イ、ビー、エム、（Ｗｉｎｇａｔｅ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、）＋フィソター、エム、ニス。

（Ｆｉｔｔｅｒ、門、Ｓ、）とラム、シー、ジエイ、　（Ｌａｍｂ、　Ｃ，Ｊ、）、　ブランク（ＰｌａｎＬａ）１６７　：　４５２〜４５９頁（１９８６）。

４７、オー、ディー、ダブり二一、　（Ｏｗ、　ｌ）、Ｗ、）、ウッド、ケイ、ブイ、　（Ｗｏｏｄ、　Ｋ、ν、）、デルカ、エム、　（Ｄｅｌｕｃａ、　Ｍ、）　＋　デウｚ　７ト。

ジエイ、アール、（ｄｅＷｅｔ、Ｊ、Ｒ，）、ヘリンスキ、ディー、ディー。

（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ、　Ｄ、Ｄ、）とホーウェル、ニス、エイチ、　（Ｈｏｍｅｌｌ　＋　Ｓ−■、）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２３４　：　８Ｂ６〜８５９頁（１９８６）　。

４８、プライス、シー、ニー、（Ｐｒｉｃｅ＋Ｃ，Ａ、）＋　マメ科植物中の新しいチオール、　（Ａ　ｎｅｗ　ｔｈｉｏｌ　ｉｎ　ｌｅｇｕｍｅｓ、）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　１８０　：　１４８〜１４９頁（１９５７）。

４９、レン享ンヘルグ、エイチ、（Ｒｅｎｎｅｎｂｅｒｇ、Ｈ，）、高級植物におけるグルタチオ／代謝と可能な生物学的役割、　（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ− ｅｔａｂｏｌｉｓ＋ｗ　ａｎｄ　ｐｏｓｓｉｂｌｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｏｌｅｓ　ｉｎ　ｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ、）　フィストケミストリイ（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｌｌｉｓｔｒｙ）２１　：　２７７１〜２７８１頁（１９８２）。

５０、ローデス、シー、ニー、　（Ｒｈｏｄｅｓ、Ｃ，Ａ、）、ピアス、ディー。

ニー、　（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｄ、Ａ、）＋　メトラー、アイ、ジエイ、　（Ｍｅｔｔｌｅｒ。

ｒ、Ｊ、）、？７１．カレンハス、ディ、（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ、Ｄ、）　とデトマー、ジェイ、ジエイ、（Ｄｅｔ麟ｅｒ、Ｊ、Ｊ、）、原形賞体から遺伝的に形質転換したトウモロコシ植物、　（ＧｅｎｅｔｉｃａｌｌｙＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　Ｍａｉｚｅ　Ｐｌａｎｔｓ　ｆｒｏａ＋　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２４０　：　２０４〜２０７頁（１９８８）。

５１、ライダー、ティー、ビー、　（Ｒｙｄｅｒ、　Ｔ、Ｂ、）　、クラマー、シー。

エル、（Ｃｒａｍｅｒ、Ｃ，Ｌ、）＋　ヘル、ジエイ、エヌ、（Ｂｅｌｌ、Ｊ、Ｎ、）、ロビンス、エム、ビー（Ｒｏｂｂｉｎｓ、Ｍ、Ｐ、）、ジイキソン、アール。

ニー、　（Ｄｉｘｏｎ、　Ｒ，Ａ、）　とラム１　シー、ジェイ、　（Ｌａｍｂ、　Ｃ，Ｊ、）、　フィトアレキンン防御反応開始時にフエイズオラスブルガリス細胞においてエリジターはカルコンシンターゼｍＲＮＡを迅速に誘導する。（Ｅｌｉｃｉｔｏｒ　ｒａｐｉｄｌｙ　１ｎｄｕｃｅｓ　ｃｈａｌｃｏｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅｍＲＮＡ　ｉｎ　ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ　ｃｅｌｌｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｏｎｓｅｔ　ｏｆ　ｔｈｅｐｈｙｔｏａｌｅｘｉｎ　ｄｅｆｅｎｓｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ、）ブロク、ナトル、アカド。

サイ、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　８１　：５７２４〜５７２８頁（１９８４）　。

５２、ライダー、ティー、ビー、（Ｒｙｄｅｒ、Ｔ、Ｂ、）、ヘトリンク、ニス。

ニー、（Ｈｅｄｒｉｃｋ、Ｓ、Ａ、）＋　ヘル、ジェイ、エヌ、（Ｂｅ１１．Ｊ、Ｎ、）。

ライアング、エックス、（Ｌｉａｎｇ、Ｘ、）、クローズ、ニス、ディー。

（Ｃ１ｏｕｓｅ、５．０．）　とラム、シー、ジェイ、　（Ｌａｍｂ、Ｃ，Ｊ、）、モル。

ゲン、ゲ２　ノド、　（Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）２１０　：　２１９〜２３３頁（＋９８７）。

５３、サンガー、エフ、（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、）−ニックレン、ニス。

（Ｎｉｃｋｌｅｎ、Ｓ、）とクールセン、ニー、アール、　（Ｃ１ｕｓｅｎ＋　Ａ、Ｒ，）＋ブロク、ナトル、アカド、サイ、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ７４　：　５４６３〜５４６７頁（１９７７）。

５４、　７ヤープ、ジエイ、ケイ、　（Ｓｈａｒｐ、　Ｊ、に、）、マクふイル、エム（ＭｃＮｅｉ！、Ｍ、）、アルバーンニイム、ビー、　（Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｎ、Ｐ、）、　ジェイ、パイオル、ケム、（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　２５０　：　１１３２１〜１１３３６頁（１９８４）。

５５、シラーータインス、ニー、（Ｓｉｌｅｒ−Ｔｕｙｎｓ、Ａ、）　とバーン　スティール、エム、エル、（Ｂｉｒｎｓｔｉｅｌ、６几、）２１４１モル、ハイオル、（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　１５１　：　６０７〜６２５頁（１９８１）。

５６、スミス、アイ、ケイ、　（Ｓｍｉｔｈ、　１．に、）培養タバコ細胞中のスルフェート輸送、（Ｓｕｌｆａｔｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｔｏｂａｃｏ。

ｃｅｌｌｓ、）プラント　フィシオル、（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ）５５　：　３０３〜３０７頁（１９７５）　。

５７、スミス、アイ、ケイ、（Ｓｓｉｔｈ、１．に、）、ケンダル、ニー、シー。

（Ｋｅｎｄａｌｌ、　Ａ、Ｃ，）、キーズ、ニー、ジエイ、　（Ｋｅｙｓ、Ａ、Ｊ、）、ターナ−、ジエイ、シー、　（Ｔｕｒｎｅｒ、　Ｊ、Ｃ，）とり−、ピー、ジェイ。

（Ｌｅａ、Ｐ、Ｊ、）、大麦の葉におけるグルタチオン生合成の調節（ホルデウム　ハルガー　エル、　）　Ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｉｎ　１ｅａｖｅｓ　ｏｆ　ｂａｒｌｅｙ（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　Ｌ、）、　プラント　サイ、（Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、）　４１　：１１〜１７頁（１９８５）。

５８、ソムスイチ、アイ、（Ｓｏ＋＊＋ｍ５ｉｃｈ、１．）、ンｚメルザー、イー。

（Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ、Ｅ、）、ボルマン２　ジェイ、（Ｂｏｌｌｍａｎｎ、Ｊ、）とバールプロ、先ケイ、（Ｈａｈｌｂｒｏｃｋ、に、）、プロ先ナトル、アヵド。

サイ、（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＬＩＳＡ　８３　：　２４２７〜２４３０頁（１９８６）。

５９、ストノセル、ビー、　（Ｓｔｏｓｓｅｌ、Ｐ、）＋大豆胚軸におけるグリセオリン蓄積のスルフヒドリル基による調節、（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｂｙｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　ｇｌｙｃｅｏｌｌｉｎ　ａｃｃｕｍｖｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　５ｏｙｂｅａｎｈｙｐｏｃｏｔｈｌｓ、）ブランク（Ｐｌａｎｔａ）　１６０　：　３１４〜３１９頁（１９８４）。

６０、トーマス、ピー、ニー、（Ｔｈｏｍａｓ、Ｐ、Ａ、）−ニトロセルロースに変換した変性ＲＮＡと小ＤＮＡフラグメントのハイブリッド化。

（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ＲＮＡ　ａｎｄ　ｓｍａｌｌ　ＤＮＡ　ｆｒａｍｅｎｔｓｔｒａｆｅｒｒｅｄ　ｔｏ　ｎ１ｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、）ブロク、ナトル、アヵド。

サイ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ　７７　：　５２０１〜５２０５頁（１９８０）　。

６１、ウォーカー、ジェイ、シー、　（ＷａＩｋｅｒ、　Ｊ、　Ｃ，）　、　ボヮード、イー、ニー、　（Ｈｏｗａｒｄ、　Ｅ、へ、）、デニス、イー、ニス、（Ｄｅｎｎｉｓ　Ｅ。

Ｓ、）　とピーコンク、ダブり二一、ジエイ、　（Ｐｅａｃｏｃｋ、Ｗ、Ｊ、）ブロク、ナトル、アカド、サイ、（Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ８４　：　６６２４〜６６２８頁（１９８７）。

６２、ホワイトヘッド、ア仁エム、（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ、１．Ｍ、）、テ゛イ、ピー、エム、　（Ｄｅｙ、　Ｐ、Ｍ、）　とジイキソン、アー／Ｌ７．　ニー、（Ｄｉｘｏｎ。

Ｒ，Ａ、）、プランタ（Ｐｌａｎｔａ）　１５４　：　１５６〜１６４頁（１，９８２）。

６３、ウィンゲート、ブイ、ビー、エム、　（Ｗｉｎｇａｔｅ、ν、Ｐ、Ｍ、）、ロートン、エム、１−、（Ｌａｗｔｏｎ、Ｍ、Ａ、）とラム、シー、ジエイ。

（Ｌａｍｂ、Ｃ，Ｊ、）、プラントト　フィシオル、（Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）　８７　：２０６〜２１０頁（１９８８）。

詩−−−一詐 ■、シンプソン、アール、ビー（Ｓｉｍｐｓｏｎ、Ｒ，Ｂ、）とマルゴノイアン、エル（Ｍａｒｇｏｓｓｉａｎ、Ｌ）　、米国特許第４，６５８，０８２号、１９８７年４月１４日発行「異種ＤＮＡを含む完全植物の製造方法（Ａ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｉｎｔｕｃｔ　Ｐｌａｎｔｓ　ＣｏｎｔａｉｎｉｎｇＦｏｒｅｉｇｎ　Ｄ　Ｎ　Ａ　）　Ｊ凱血１塁！今までの記述から、本発明が特徴−特異的な植物遺伝子の転写を誘導するために有用な農業用化学物質を確認するための新規なスクリーニング方法を開示することは当業者に明らかであろう。さらに、本発明は遺伝子転写を調節することによって農業用化学物質に反応する植物から特徴−特異的核酸塩基配列を確認する方法を開示する。さらに、本発明は植物防御遺伝子の選択的誘導を制御する調節要素を開示する。このような要素は例えば、遺伝子転写に影響を与える特定の農業用化学物質で処理された時に植物防御反応を示すように誘導される遺伝子導入植物を構成するために用いることができる。

本発明の精神と範囲から逸脱することなく、当業者は本発明を種々な用途および条件に通用するために本発明に種々な変化と修正を加えることができる。これらの変化と修正は、このようなものとして、適当に、公平に次の請求の範囲の同等物の完全な範囲内に含まれるものであり、また含まれるように意図さＦＩＧ、　ＩＦＩＧ、　３峙　閂［ｈｌ０２４１！Ｉ　鱒峙　間（−）ＦＩＧ、　５０　ＦＩＧ、　５ＤＦＩＧ、　９日Ｇ、１１ −＋　−＋　−＋　−＋　−＋ｐｃＨｃ１　ｐＣＨＣ２ｐＣ）ｌｃ３　ｐＣＨＣ４ｐＣＨＣ５補正書の翻訳文提出帯（特許法第１８４条の８）

Claims

【特許請求の範囲】

１．作動的に結合した構造遺伝子の転写を刺激し、これに影響を与えるように応答する植物遺伝子調節要素を確認するスクリーニング方法であって、次の段階：（Ａ）重要な特徴を現在有する第１植物材料からのＲＮＡと、この重要な特徴を現在有さない第２植物材料からのＲＮＡとを単離する段階；（Ｂ）段階（Ａ）からのＲＮＡをインビトロで翻訳する段階；（Ｃ）段階（Ｂ）で得られたインビトロ翻訳生成物の比較から、望ましい特徴に特異的な条件下で表現されたまたは抑制された候補遺伝子生成物を確認する段階；（Ｄ）段階（Ｃ）で確認された候補遺伝子生成物を生じたＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構成する段階；（Ｅ）少なくとも、遺伝子表現がオンであるまたは増加している時からのＲＮＡ（プラスＲＮＡ）と、少なくとも遺伝子表現がオフであるかまたは減少している時からのＲＮＡ（マイナスＲＮＡ）を用いて、プラスーマイナス形式で、段階（Ｄ）からのｃＤＮＡライブラリーを別々にスクリーニングする段階；（Ｆ）プラスＲＮＡプローブとはハイブリッド形成するが、マイナスＲＮＡプローブとはハイブリッド形成しないクローンを確認することによって、段階（Ｃ）の候補遺伝子生成物に対応するｃＤＮＡを確認する段階；（Ｇ）段階（Ｆ）で確認されたクローンを特性化して、段階（Ｃ）で確認された候補遺伝子生成物の特徴を有するクローンを確認する段階；（Ｈ）段階（Ｆ）で確認されたｃＤＮＡクローンをプローブとして用いて、このｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成する遺伝子と結合した遺伝子調節要素を確認するために、植物ＤＮＡのゲノムライブラリーをスクリーニングする段階から成る方法。
２．段階（Ａ）における重要な特徴を定着と植物伝播、発芽と休眠、開花、生殖体製造、器官脱離、結実と果実発達、植物と器官のサイズ、副芽の発生、自己− 剪定、形状の形成、腋芽形成、虫害および疾病に対する抵抗力と治療、環境ストレスの克服、無機物の摂取、植物組成、熟成と収量増加とを含めた代謝効果、性的表現の改良、老化、乾燥、除草剤害に対する保護、および除草剤吸収と転流との増加から成る群から選択される請求項１記載のスクリーニング方法。
３．（Ｃ）において、候補遺伝子生成物を一次元および二次元電気泳動ゲル分析によって確認する請求項１記載のスクリーニング方法。
４．（Ｈ）において、遺伝子調節要素を制限消化分析によってさらに特性化する請求項１記載のスクリーニング方法。
５．遺伝子調節要素を塩基配列決定によってさらに特性化する請求項４記載のスクリーニング方法。
６．特徴−特異的な植物遺伝子調節要素の活性化または不活化に外因的に用いられる物質を確認して、この物質に作動的に結合する生のまたはキメラ構造遺伝子を表現または抑制させるスクリーニング分析法であって、次の段階；（Ａ）植物（Ｐ）からの適当な植物材料中へ、次の要素：（ａ）少なくとも１つの特徴に特異的なプロモーターならびに前記プロモーターが作用的に結合した、（ｂ）少なくとも１種類のレポーター遺伝子および（ｃ）少なくとも１種類の３ ′ターミネター配列から成るキメラ遺伝子カセットを導入する段階；（Ｂ）前記キメラ遺伝子カセットを含む、段階（Ａ）からの適当な植物材料を特徴−特異的な植物遺伝子の転写に影響を与えうる物質と接触させる段階；（Ｃ）段階（Ｂ）からの前記植物材料を前記レポーター遺伝子配列の表現に関してモニターする段階；ならびに（Ｄ）（ａ）レポーター遺伝子の表現を高める物質を外因的に用いて、特徴−特異的植物遺伝子調節要素を活性化することができる：および（ｂ）レポーター遺伝子の表現を減ずる物質を外因的に用いて、特徴−特異的植物遺伝子調節要素を不活化することがてきることを結論する段階から成る分所方法。
７．外因的に用いて、ストレス−調節植物防御遺伝子の転写を活性化または不活化する物質を確認するためのスクリーニング方法であって、次の段階：（Ａ）植物（Ｐ）からの適当な植物材料中へ、次の要素：（ａ）少なくとも１種類のストレス調節プロモーター；ならびに前記プロモーターが作動的に結合した（ｂ）少なくとも１種類のレポーター遺伝子および（ｃ）少なくとも１種類の３ ′ターミネター塩基配列から成るストレス調節プロモーター／レポーター遺伝子／ターミネーターカセットを導入する段階；（Ｂ）前記ストレス調節カセットを含む、段階（Ａ）からの植物材料をストレス−調節植物防御遺伝子の転写に影響を与えるうる物質の存在と接触させる段階；（Ｃ）段階（Ｂ）からの前記植物材料を前記レポーター遺伝子配列の表現に関してモニターする段階；および（Ｄ）（ａ）レポーター遺伝子の表現を高める物質はストレス調節植物遺伝子調節要素を活性化するために外因的に使用可能であること、および（ｂ）レポーター遺伝子の表現を減ずる物質はストレス調節植物遺伝子調節要素を不活化するために外因的に使用可能てあることを結論する段階から成るスクリーニング方法
８．（Ａ）における前記適当な植物材料が植物原形質体、植物細胞、植物カルス、植物組織、発育中の苗木、未成熟全植物および成熟全植物である請求項６または７記載の方法。
９．段階（Ａ）（ａ）に於ける前記プロモーターがフェニルアラニンアンモニアーリアーゼ（ＰＡＬ）、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）および４−クマレート：ＣｏＡリガーゼをコード化するプロモータープラス細胞壁ヒドロキシプロリン冨化糖蛋白質をコード化する植物遺伝子のプロモーターから成る群から選択される請求項６または７記載の方法。
１０．ストレス調節植物防御遺伝子調節要素を活性化または不活化するために外因的に用いることのできる物質を確認するためのスクリーニング方法であって、次の段階：（λ）植物（Ｐ）からの適当な植物材料中に、次の要素：（ａ）フェニルアラニンアンモニアーリアーゼ（ＰＡＬ）、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）、および４ −クマレート：ＣｏＡリがーゼ（４ＣＬ）をコード化するプロモーター、プラス細胞壁ヒドロキシプロリン富化糖蛋白質をコード化する植物遺伝子のプロモーターから成る群から選択される少なくとも１種類のストレス調節プロモーター；前記プロモーターが作動的に結合するための（ｂ）少なくとも１種類のリポーター遺伝子；および（ｃ）少なくとも１種類の３′ターミネーター配列から成るストレス調節プロモーター／レポーター遺伝子／ターミネーターカセットを導入する段階；（Ｂ）前記キメラストレス調節プロモーター／レポーター遺伝子／３′ ターミネーターカセットを含む、段階Ａからの適当な植物材料をストレス調節植物防御遺伝子の転写に影響を与えうる物質と接触させる段階；（Ｃ）段階（Ｂ）からの前記植物材料をレポーター遺伝子配列の表現に関してモニターする段階；および（Ｄ）（ａ）レポーター遺伝子の表現を高める物質はストレス調節植物遺伝子調節要素の活性化に外因的に使用できること、および（ｂ）レポーター遺伝子の表現を減ずる物質はストレス調節植物遺伝子調節要素の不活化に外因的に使用できることと結論をする段階から成る方法。
１１．段階（Ａ）（ｂ）において、前記レポーター遺伝子がクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）およびホタルルシフェラーゼから成る群から選択される請求項６または７または１０のいずれかに記載の方法。
１２．段階（Ａ）（ｃ）において、前記３′ターミネーターがノパリンシンターゼ遺伝子（ＮＯＳ）の３′ブランキング領域とオクトピンシンターゼ遺伝子（ＯＣＳ）の３′ブランキング領域から成る群から選択される請求項６または７または１０のいずれかに記載の方法。
１３．段階（Ａ）（ｃ）において、前記プロモーターがカルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子である請求項６または７に記載の方法。
１４．段階（Ａ）（ｃ）において、前記プロモーターがフェニルアラニンアンモニアーリアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子プロモーターである請求項６または７に記載の方法。