JPH0531744B2 - - Google Patents
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- JPH0531744B2 JPH0531744B2 JP28161684A JP28161684A JPH0531744B2 JP H0531744 B2 JPH0531744 B2 JP H0531744B2 JP 28161684 A JP28161684 A JP 28161684A JP 28161684 A JP28161684 A JP 28161684A JP H0531744 B2 JPH0531744 B2 JP H0531744B2
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-
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Description
本発明は、被検液中のエンドトキシンの測定方
法に関する。 エンドトキシンは、発熱性物質（パイロジエ
ン）の代表的なものであり、エンドトキシンが混
入した血液、輸液、注射液が生体内に注入される
と強い発熱やシヨツクなどの重篤な副作用を引き
起すことが知られている。このため、注射液等の
医薬品製造工程に於ては、原料水、洗浄水中のエ
ンドトキシン量を測定し、その混入を防ぐことが
必要不可欠になつている。また、超純水製造膜の
機能検査あるいは半導体製造用洗浄水の水質検査
として、エンドトキシンの測定が広く行なわれる
ようになつている。 近年、エンドトキシンの測定法として、リムル
ス・アメーボサイト・ライセート（カブトガニ血
球抽出成分、以下LALと略す。）がエンドトキシ
ンと反応してゲ化することが見出され、これを応
用したエンドトキシンの測定法が開発されてい
る。この測定法は、試験管内で被検液とLAL試
薬を混合し、一定温度で一定時間放置した後、反
応試験管を傾斜あるいは転倒し、試料がゲル化し
ているか否かを目視で観察して濃度既知のエンド
トキシン検体とLAL試薬との同様の反応結果と
の比較から、被検液中のエンドトキシン陽性
（＋）あるいは陰性（−）を半定量的に捉えるも
のである。しかしながら、この判定方法は熟練を
要すると共に、＋−判定基準が測定者の主観に依
存するため、判定に個人差が大きく出ること、判
定限界が0.05ng／ml程度で低濃度エンドトキシン
の検出ができないこと等の欠点があつた。 一方、合成基質として発色性ペプチド誘導体を
用い、該基質がLALと試料中のエンドトキシン
とにより水解されて発色する呈色度を比色定量す
ることによりエンドトキシン濃度を定量する測定
法も開発されているが、測定範囲が数pg／mlか
ら100pg／mlと狭いこと、測定操作が極めて繁雑
であること等の理由により、未だ日常検査に導入
されるまでには到つていない。 本発明者らは、上述した如き従来の欠点を解決
すべく鋭意研究を重ねた結果、被検液中のエンド
トキシンによるLALのゲル化を客観的基準で低
濃度まで検出することができ、低濃度から高濃度
迄の広い範囲にわたるエンドトキシン濃度の定量
を精度よく且つ極めて容易に実施し得る測定方法
を提供する本発明に到達した。 即ち、本発明は、エンドトキシンゲル化試薬と
被検液とを混合した試料液を保持するキユベツト
に光線を照射し、時間ｔに於ける試料液からの透
過光量Ｉ(t)と反応の進行により減少を開始する以
前の該試料液からの透過光量の初期値I0との比率
を求め、該比率が、Ｉ(t)／I0でみたとき75％以上
97％以下の範囲にある任意に設定された一定値に
到達した時点を前記試料液のゲル化時点と判定
し、前記試料液の混合時点から該ゲル化判定時点
までを前記試料液のゲル化時間として求め、該ゲ
ル化時間をエンドトキシン濃度測定の際の指標と
して使用することを特徴とするエンドトキシンの
測定方法の発明である。 本発明では、試料の透過光を測定するため、例
えば第１図に示す光学系を使用することができ
る。即ち、測定用キユベツト１（通常、内径６mm
から内径12mmの範囲のものを使用。）内に保持さ
れた、被検液とLAL試薬とを混合した試料液２
（通常、被検液0.1mlとLAL試薬0.1ml、或いは
LAL試薬の凍乾品と被検液0.2mlとから成る。）に
対し、光源５からの光線が絞り３を通して照射さ
れる。試料液２を通過した光線は、絞り４を通り
光電検出器６で透過光量に対応する電気量に変換
される。こで光源５は、例えばLED（発光ダイオ
ード）、タングステンランプ等の発光素子であり、
光電検出器６は、例えばフオトダイオード、光電
セル等の受光素子でよい。光電検出器６で検知さ
れた透過光量Ｉ(t)は、被検液とLAL試薬とを混
合した後の反応時間ｔに対して、第２図に示す様
な経時変化を示す。即ち、反応初期の透過光量が
ほぼ一定の初値I0を示すａの段階、次いで透過光
量Ｉ(t)が急激に減少するｂの段階、最後にＩ(t)が
ほとんど変動のない値を示すｃの段階、以上３つ
の段階を経て試料はゲル化する。本発明者等は、
このｂの段階が試料内でゲル化が急速に進行して
いる状態であること、また、ｃの段階に到つた試
料液が従来の目視測定でゲル化反応陽性と判定さ
れる状態であること、更に反応開始からｂの段階
およびｃの段階へ到達する迄の所要時間が被検液
中のエンドトキシン濃度に相関することを実験的
に見出し、広い測定範囲にわたり良好な精度を有
しかつ日常検査への適用が可能な本発明のエンド
トキシンの測定方法を完成するに到つた。 本発明は、試料液が元々有している濁りや着色
に由来する透過光量の差を補正するため、透過光
量Ｉ(t)と反応の進行により減少を開始する以前の
透過光量の初期値I0との比率Ｒ(t)を測定する点に
特徴を有する。即ち、Ｒ(t)＝〔Ｉ(t)／I0〕×100
〔％〕により求めた該比率Ｒ(t)は、第３図に示す
様にＩ(t)と相似な挙動を示すが、本発明では、ゲ
ル化反応の進行の段階ｂに相当する、Ｒ(t)が75％
以上97％以下の範囲に闘値Rthを設定し、Ｒ(t)が
Rthに到達した時点を試料液のゲル化時点と判定
する。又、試料液の混合時点からゲル化判定時点
に到達する迄の反応時間をゲル化時間TGとして
検知しこれを定量に使用する。 尚、RfはＩ(t)が殆ど変動のない一定値を示す
ｃの段階に於けるＲ(t)を示す。 本発明に於ける透過光量の初期値I0としては、
透過光量Ｉ(t)の最大値でも、初期段階一定時間内
での透過光量Ｉ(t)の平均値でも、初期段階一定時
間内での任意の点tsでの透過光量Ｉ（ts）でも、ま
た、初期段階一定時間内での透過光量Ｉ(t)の最小
値でも、いずれにてもよい。 第４図は、エンドトキシン濃度とＲ(t)の関係を
試料液の混合時点からの経過時間をパラメーター
としてプロツトしたものである。使用した試薬及
び測定方法は下記の通りである。 LAL試薬：Associates of Cape Cod社製 FDAリフアレンスによる目視ゲル
化転倒法感度0.05ng／ml エンドトキシン：Escherichia coli UKT−Ｂ
株（阪大微研）より精製。 FDAリフアレンスにて含量検
定。 測定方法：上記LAL試薬およびエンドトキシ
ンを夫々注射用蒸留水（大塚製薬(株)
製）で溶解し、各々0.1mlずつを直径
10mmの試験管内で撹拌混合し透過光量
の変化を測定。 図中Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆは各々経過時間５
分、10分、20分、35分、60分、120分を示してい
る。 第４図より、測定したすべての濃度でＲ(t)はゲ
ル化に伴つて低下し、高濃度試料ほど早く低下を
開始していることが判る。又、Ｒ(t)が時間の経過
に対して殆んど低下を示さなくなる最終値Rfは
濃度変化に対応する顕著な差を示さず、エンドト
キシン量の指標として適当でないことはこの図か
らも明らかである。これに対し、Ｒ(t)がRfに到
達する以前の値であるRth（例えば第４図に於て
はＲ(t)＝95％をRthとして破線を引いてある。）
に到達したことを検出することにより、広い濃度
範囲にわたり試料液のゲル化の判定ができ、ま
た、Rthに達するまでの反応時間をゲル化時間TG
として測定することにより、広範囲のエンドトキ
シン濃度が定量できることが判る。Ｒ(t)がRfに
到達するまでの時間は用いるLAL試薬の感度、
キユベツトの形状等によつて異なるので、本発明
に於ては、これらの点を考慮して、Ｒ(t)の値につ
いてＲ（ｏ）からRfの間で広い濃度範囲にわたり
確実にゲル化を検出できる75％以上97％以下の範
囲に於てゲル化検知の闘値Rthを設定することと
した。Rthを75％よりも小さくした場合、例えば
Rth＝70％とした場合にはゲル化を検出できず、
検量線が得られないが、或いは検量関係が得られ
る濃度範囲が例えばエンドトキシン濃度0.1〜
10ng／mlと非常に狭められる。一方、Rthを97％
よりも大きくとつた場合には、LAL試薬と被検
液とを混合した直後の試料液内の揺動（対流）や
気泡の動きによるＲ(t)の変動を誤つてゲル化と判
定してしまう可能性がある。従つてこのようなノ
イズによる誤検出を防止するためのノイズ余裕度
として３％が必要である。 即ち、本発明に於てはRthを75％以上、97％以
下、より好ましくは80％以上、95％以下の範囲の
一定値に設定することが必須構成要件である。 第５図は、同一被検液について、Rth＝95％を
設定し本発明の方法によりゲル化を判定した結果
と、従来の目視ゲル化転倒法によりゲル化を判定
した結果を比較したものである。より詳しく述べ
れば、本発明の方法により得られるゲル化時間が
短いほど検体中のエンドトキシン濃度は高いこと
になるので、該ゲル化時間がある一定時間Tm
（第５図ではTm＝25分）より短い場合には陽性、
該ゲル化時間がTmより長い場合には陰性とし
て、従来の目視ゲル化転倒法による判定結果との
相関図を作成したのが第５図である。尚、本発明
の方法に於て使用した試薬及び測定方法は、第４
図に於けるそれと同じである。第５図より明らか
な如く、両法の判定結果はよく一致している。従
来のゲル化転倒法は60分後の試料液のゲル化状態
について陽性（＋）あるいは陰性（−）の２値判
定を行うのみであるため、本発明による判定も一
定の測定時間Tm内に自動判定陽性（AMJ＋）
あるいは自動判定陰性（AMJ−）の２値判定を
行うようにした。従来法ではＲ(t)がRfに到達し
た試料液のみを陽性（＋）と判定できるのに対
し、本発明によればR到達以前の早い段階で陽
性判定を行なうことができる。即ち、本実施例に
於ては、Tm＝25分であり、従来法の半分以下の
測定時間で同一の判定結果を得ることができた。
しかも、判定に際しては熟練を必要とせず、個人
差の無い客観的な結果を得ることができる。又、
Tmを延長することで、従来法では判定不可能で
あつた低濃度でのゲル化を検出することもでき
る。 本発明は又、従来の測定範囲では実現不可能で
あつた広い測定範囲にわたる高精度の定量を可能
とするものであり、検出感度及び測定範囲は使用
するLAL試薬の感度により異なるが、いずれの
場合も従来法である目視ゲル化転倒法で得られる
感度よりもはるかに高く、又合成基質を用いる比
色法の測定範囲よりもはるかに広いダイナミツク
レンジである。 以上述べた如く本発明は、試料液の透過光量の
測定を独自の構成によつて行うことにより客観的
で感度の良い迅連なエンドトキシンの測定方法を
提供するものであると同時に、従来の測定法では
実現不可能であつた広い測定範囲にわたる高精度
の定量を簡便な操作で実現得る優れたエンドトキ
シンの測定方法を提供するものであり、斯業に貢
献するところ極めて大である。 以下に実施例を挙げて本発明の用効果について
更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に
より何ら限定されるものではなく、本発明の範囲
内で各種の具体例に応用することができるもので
あることは言うまでもない。 実施例 １ 以下の測定条件により、エンドトキシン濃度の
測定を行つた。 LAL試薬；Associates of Cape Cod社製 FDAリフアレンスによる目視ゲル
化転倒法感度0.05ng／ml エンドトキシンEscherichia coli UKT−Ｂ株
（阪大微研）より精製。 FDAリフアレンスにて含量検
定。 測定方法；上記LAL試薬およびエンドトキシ
ンを夫々注射用蒸留水（大塚製薬(株)
製）で溶解し、各々0.1mlずつを直径
10mmの試験管内で撹拌混合し透過光量
の変化を測定。 第６図に、Rth＝95％に設定した本実施例に於
けるゲル化時間とエンドトキシン濃度との検量関
係を示す。第６図より明らかな如く、本実施例に
於ては0.0005ng／mlから100g／ml迄、非常に広い
範囲で良好な検量関係が得られた。これは同一試
薬を使つて目視ゲル化転倒法で得られる検出感度
の100倍の感度であり、また、合成基質を用いる
比色法の測定範囲の1000倍以上のダイナミツクレ
ンジである。 尚、本実施例に於て、Rth＝70％とした場合に
は、ゲル化を検出できず、検量線が得られない。 実施例 ２ 実施例１と同じ測定条件で、実施例１の範囲内
でエンドトキシン濃度の異なる６種の試料液につ
いて、繰り返し数16でゲル化時間を測定した。ゲ
ル化時間TG、及び第６図の検量線を使つて換算
した濃度値の再現性を表１に示す。表１より明ら
かな如く、本法によりTGのCV値で4.5％以内、濃
度値のCV値で15％以内という極めて良好な結果
が得られた。このように広範囲なエンドトキシン
濃度範囲にわたり、上述した高精度の定量測定を
行なうことは、本発明に係る技術開示以前に於て
は実現不可能であつたが、本発明の方法により初
めて、しかも、目視ゲル化転倒と同様の簡便な測
定操作により実現できるようになつた。
法に関する。 エンドトキシンは、発熱性物質（パイロジエ
ン）の代表的なものであり、エンドトキシンが混
入した血液、輸液、注射液が生体内に注入される
と強い発熱やシヨツクなどの重篤な副作用を引き
起すことが知られている。このため、注射液等の
医薬品製造工程に於ては、原料水、洗浄水中のエ
ンドトキシン量を測定し、その混入を防ぐことが
必要不可欠になつている。また、超純水製造膜の
機能検査あるいは半導体製造用洗浄水の水質検査
として、エンドトキシンの測定が広く行なわれる
ようになつている。 近年、エンドトキシンの測定法として、リムル
ス・アメーボサイト・ライセート（カブトガニ血
球抽出成分、以下LALと略す。）がエンドトキシ
ンと反応してゲ化することが見出され、これを応
用したエンドトキシンの測定法が開発されてい
る。この測定法は、試験管内で被検液とLAL試
薬を混合し、一定温度で一定時間放置した後、反
応試験管を傾斜あるいは転倒し、試料がゲル化し
ているか否かを目視で観察して濃度既知のエンド
トキシン検体とLAL試薬との同様の反応結果と
の比較から、被検液中のエンドトキシン陽性
（＋）あるいは陰性（−）を半定量的に捉えるも
のである。しかしながら、この判定方法は熟練を
要すると共に、＋−判定基準が測定者の主観に依
存するため、判定に個人差が大きく出ること、判
定限界が0.05ng／ml程度で低濃度エンドトキシン
の検出ができないこと等の欠点があつた。 一方、合成基質として発色性ペプチド誘導体を
用い、該基質がLALと試料中のエンドトキシン
とにより水解されて発色する呈色度を比色定量す
ることによりエンドトキシン濃度を定量する測定
法も開発されているが、測定範囲が数pg／mlか
ら100pg／mlと狭いこと、測定操作が極めて繁雑
であること等の理由により、未だ日常検査に導入
されるまでには到つていない。 本発明者らは、上述した如き従来の欠点を解決
すべく鋭意研究を重ねた結果、被検液中のエンド
トキシンによるLALのゲル化を客観的基準で低
濃度まで検出することができ、低濃度から高濃度
迄の広い範囲にわたるエンドトキシン濃度の定量
を精度よく且つ極めて容易に実施し得る測定方法
を提供する本発明に到達した。 即ち、本発明は、エンドトキシンゲル化試薬と
被検液とを混合した試料液を保持するキユベツト
に光線を照射し、時間ｔに於ける試料液からの透
過光量Ｉ(t)と反応の進行により減少を開始する以
前の該試料液からの透過光量の初期値I0との比率
を求め、該比率が、Ｉ(t)／I0でみたとき75％以上
97％以下の範囲にある任意に設定された一定値に
到達した時点を前記試料液のゲル化時点と判定
し、前記試料液の混合時点から該ゲル化判定時点
までを前記試料液のゲル化時間として求め、該ゲ
ル化時間をエンドトキシン濃度測定の際の指標と
して使用することを特徴とするエンドトキシンの
測定方法の発明である。 本発明では、試料の透過光を測定するため、例
えば第１図に示す光学系を使用することができ
る。即ち、測定用キユベツト１（通常、内径６mm
から内径12mmの範囲のものを使用。）内に保持さ
れた、被検液とLAL試薬とを混合した試料液２
（通常、被検液0.1mlとLAL試薬0.1ml、或いは
LAL試薬の凍乾品と被検液0.2mlとから成る。）に
対し、光源５からの光線が絞り３を通して照射さ
れる。試料液２を通過した光線は、絞り４を通り
光電検出器６で透過光量に対応する電気量に変換
される。こで光源５は、例えばLED（発光ダイオ
ード）、タングステンランプ等の発光素子であり、
光電検出器６は、例えばフオトダイオード、光電
セル等の受光素子でよい。光電検出器６で検知さ
れた透過光量Ｉ(t)は、被検液とLAL試薬とを混
合した後の反応時間ｔに対して、第２図に示す様
な経時変化を示す。即ち、反応初期の透過光量が
ほぼ一定の初値I0を示すａの段階、次いで透過光
量Ｉ(t)が急激に減少するｂの段階、最後にＩ(t)が
ほとんど変動のない値を示すｃの段階、以上３つ
の段階を経て試料はゲル化する。本発明者等は、
このｂの段階が試料内でゲル化が急速に進行して
いる状態であること、また、ｃの段階に到つた試
料液が従来の目視測定でゲル化反応陽性と判定さ
れる状態であること、更に反応開始からｂの段階
およびｃの段階へ到達する迄の所要時間が被検液
中のエンドトキシン濃度に相関することを実験的
に見出し、広い測定範囲にわたり良好な精度を有
しかつ日常検査への適用が可能な本発明のエンド
トキシンの測定方法を完成するに到つた。 本発明は、試料液が元々有している濁りや着色
に由来する透過光量の差を補正するため、透過光
量Ｉ(t)と反応の進行により減少を開始する以前の
透過光量の初期値I0との比率Ｒ(t)を測定する点に
特徴を有する。即ち、Ｒ(t)＝〔Ｉ(t)／I0〕×100
〔％〕により求めた該比率Ｒ(t)は、第３図に示す
様にＩ(t)と相似な挙動を示すが、本発明では、ゲ
ル化反応の進行の段階ｂに相当する、Ｒ(t)が75％
以上97％以下の範囲に闘値Rthを設定し、Ｒ(t)が
Rthに到達した時点を試料液のゲル化時点と判定
する。又、試料液の混合時点からゲル化判定時点
に到達する迄の反応時間をゲル化時間TGとして
検知しこれを定量に使用する。 尚、RfはＩ(t)が殆ど変動のない一定値を示す
ｃの段階に於けるＲ(t)を示す。 本発明に於ける透過光量の初期値I0としては、
透過光量Ｉ(t)の最大値でも、初期段階一定時間内
での透過光量Ｉ(t)の平均値でも、初期段階一定時
間内での任意の点tsでの透過光量Ｉ（ts）でも、ま
た、初期段階一定時間内での透過光量Ｉ(t)の最小
値でも、いずれにてもよい。 第４図は、エンドトキシン濃度とＲ(t)の関係を
試料液の混合時点からの経過時間をパラメーター
としてプロツトしたものである。使用した試薬及
び測定方法は下記の通りである。 LAL試薬：Associates of Cape Cod社製 FDAリフアレンスによる目視ゲル
化転倒法感度0.05ng／ml エンドトキシン：Escherichia coli UKT−Ｂ
株（阪大微研）より精製。 FDAリフアレンスにて含量検
定。 測定方法：上記LAL試薬およびエンドトキシ
ンを夫々注射用蒸留水（大塚製薬(株)
製）で溶解し、各々0.1mlずつを直径
10mmの試験管内で撹拌混合し透過光量
の変化を測定。 図中Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆは各々経過時間５
分、10分、20分、35分、60分、120分を示してい
る。 第４図より、測定したすべての濃度でＲ(t)はゲ
ル化に伴つて低下し、高濃度試料ほど早く低下を
開始していることが判る。又、Ｒ(t)が時間の経過
に対して殆んど低下を示さなくなる最終値Rfは
濃度変化に対応する顕著な差を示さず、エンドト
キシン量の指標として適当でないことはこの図か
らも明らかである。これに対し、Ｒ(t)がRfに到
達する以前の値であるRth（例えば第４図に於て
はＲ(t)＝95％をRthとして破線を引いてある。）
に到達したことを検出することにより、広い濃度
範囲にわたり試料液のゲル化の判定ができ、ま
た、Rthに達するまでの反応時間をゲル化時間TG
として測定することにより、広範囲のエンドトキ
シン濃度が定量できることが判る。Ｒ(t)がRfに
到達するまでの時間は用いるLAL試薬の感度、
キユベツトの形状等によつて異なるので、本発明
に於ては、これらの点を考慮して、Ｒ(t)の値につ
いてＲ（ｏ）からRfの間で広い濃度範囲にわたり
確実にゲル化を検出できる75％以上97％以下の範
囲に於てゲル化検知の闘値Rthを設定することと
した。Rthを75％よりも小さくした場合、例えば
Rth＝70％とした場合にはゲル化を検出できず、
検量線が得られないが、或いは検量関係が得られ
る濃度範囲が例えばエンドトキシン濃度0.1〜
10ng／mlと非常に狭められる。一方、Rthを97％
よりも大きくとつた場合には、LAL試薬と被検
液とを混合した直後の試料液内の揺動（対流）や
気泡の動きによるＲ(t)の変動を誤つてゲル化と判
定してしまう可能性がある。従つてこのようなノ
イズによる誤検出を防止するためのノイズ余裕度
として３％が必要である。 即ち、本発明に於てはRthを75％以上、97％以
下、より好ましくは80％以上、95％以下の範囲の
一定値に設定することが必須構成要件である。 第５図は、同一被検液について、Rth＝95％を
設定し本発明の方法によりゲル化を判定した結果
と、従来の目視ゲル化転倒法によりゲル化を判定
した結果を比較したものである。より詳しく述べ
れば、本発明の方法により得られるゲル化時間が
短いほど検体中のエンドトキシン濃度は高いこと
になるので、該ゲル化時間がある一定時間Tm
（第５図ではTm＝25分）より短い場合には陽性、
該ゲル化時間がTmより長い場合には陰性とし
て、従来の目視ゲル化転倒法による判定結果との
相関図を作成したのが第５図である。尚、本発明
の方法に於て使用した試薬及び測定方法は、第４
図に於けるそれと同じである。第５図より明らか
な如く、両法の判定結果はよく一致している。従
来のゲル化転倒法は60分後の試料液のゲル化状態
について陽性（＋）あるいは陰性（−）の２値判
定を行うのみであるため、本発明による判定も一
定の測定時間Tm内に自動判定陽性（AMJ＋）
あるいは自動判定陰性（AMJ−）の２値判定を
行うようにした。従来法ではＲ(t)がRfに到達し
た試料液のみを陽性（＋）と判定できるのに対
し、本発明によればR到達以前の早い段階で陽
性判定を行なうことができる。即ち、本実施例に
於ては、Tm＝25分であり、従来法の半分以下の
測定時間で同一の判定結果を得ることができた。
しかも、判定に際しては熟練を必要とせず、個人
差の無い客観的な結果を得ることができる。又、
Tmを延長することで、従来法では判定不可能で
あつた低濃度でのゲル化を検出することもでき
る。 本発明は又、従来の測定範囲では実現不可能で
あつた広い測定範囲にわたる高精度の定量を可能
とするものであり、検出感度及び測定範囲は使用
するLAL試薬の感度により異なるが、いずれの
場合も従来法である目視ゲル化転倒法で得られる
感度よりもはるかに高く、又合成基質を用いる比
色法の測定範囲よりもはるかに広いダイナミツク
レンジである。 以上述べた如く本発明は、試料液の透過光量の
測定を独自の構成によつて行うことにより客観的
で感度の良い迅連なエンドトキシンの測定方法を
提供するものであると同時に、従来の測定法では
実現不可能であつた広い測定範囲にわたる高精度
の定量を簡便な操作で実現得る優れたエンドトキ
シンの測定方法を提供するものであり、斯業に貢
献するところ極めて大である。 以下に実施例を挙げて本発明の用効果について
更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に
より何ら限定されるものではなく、本発明の範囲
内で各種の具体例に応用することができるもので
あることは言うまでもない。 実施例 １ 以下の測定条件により、エンドトキシン濃度の
測定を行つた。 LAL試薬；Associates of Cape Cod社製 FDAリフアレンスによる目視ゲル
化転倒法感度0.05ng／ml エンドトキシンEscherichia coli UKT−Ｂ株
（阪大微研）より精製。 FDAリフアレンスにて含量検
定。 測定方法；上記LAL試薬およびエンドトキシ
ンを夫々注射用蒸留水（大塚製薬(株)
製）で溶解し、各々0.1mlずつを直径
10mmの試験管内で撹拌混合し透過光量
の変化を測定。 第６図に、Rth＝95％に設定した本実施例に於
けるゲル化時間とエンドトキシン濃度との検量関
係を示す。第６図より明らかな如く、本実施例に
於ては0.0005ng／mlから100g／ml迄、非常に広い
範囲で良好な検量関係が得られた。これは同一試
薬を使つて目視ゲル化転倒法で得られる検出感度
の100倍の感度であり、また、合成基質を用いる
比色法の測定範囲の1000倍以上のダイナミツクレ
ンジである。 尚、本実施例に於て、Rth＝70％とした場合に
は、ゲル化を検出できず、検量線が得られない。 実施例 ２ 実施例１と同じ測定条件で、実施例１の範囲内
でエンドトキシン濃度の異なる６種の試料液につ
いて、繰り返し数16でゲル化時間を測定した。ゲ
ル化時間TG、及び第６図の検量線を使つて換算
した濃度値の再現性を表１に示す。表１より明ら
かな如く、本法によりTGのCV値で4.5％以内、濃
度値のCV値で15％以内という極めて良好な結果
が得られた。このように広範囲なエンドトキシン
濃度範囲にわたり、上述した高精度の定量測定を
行なうことは、本発明に係る技術開示以前に於て
は実現不可能であつたが、本発明の方法により初
めて、しかも、目視ゲル化転倒と同様の簡便な測
定操作により実現できるようになつた。
【表】
【表】
実施例 ３
以下の測定条件によりエンドトキシン濃度の測
定を行つた。 LAL試薬；Associates of Cape Cod社製 FDAリフアレンスによる目視ゲル
化転倒法感度0.01ng／ml エンドトキシン；実施例１に同じ 測定方法；実施例１に同じ 第７図にRth＝95％に設定した本実施例に於け
るゲル化時間とエンドトキシン濃度との検量関係
を示す。第７図より明らかな如く、本実施例に於
てはエンドトキシン濃度0.0001ng／mlから100g／
ml迄、検量関係が認められた。これは、同一試薬
を使つて目視ゲル化転倒法で得られる検出感度の
100倍の感度であり、又、合成基質を用いる比色
法の10000倍程度の測定範囲のダイナミツクレン
ジである。 尚、本実施例に於ても、Rth＝70％とした場合
にはゲル化を検出できず、検量線が得られない。 実施例 ４ 以下の測定条件によりエンドトキシン濃度の測
定を行つた。 LAL試薬；Associates of Cape Cod社製 FDAリフアレンスによる目視ゲル
化転倒法感度0.1ng／ml エンドトキシン；実施例１に同じ 測定方法；上記エンドトキシンを注射用蒸留水
（大塚製薬(株)製）で溶解したものを被
検液とする。直径12mmの試験管に凍結
乾燥されたLAL試薬と被検液0.2mlを
加えて撹拌溶解し透過光量の変化を測
定。 第８図にRth＝85％に設定した本実施例に於け
るゲル化時間とエンドトキシン濃度との検量関係
を示す。第８図より明らかな如く、本実施例に於
てはエンドトキシン濃度0.02ng／mlから100ng／
ml迄の範囲で検量関係が認められた。これは、同
一試薬による目視ゲル化転倒法の５倍の検出感度
であり、合成基質を用いる比色法の50倍程度の測
定範囲のダイナミツクレンジである。 尚、本実施例に於て、Rth＝70％とした場合に
は、検量関係が得られる濃度範囲が、エンドトキ
シン濃度0.1〜10ng／mlと非常に狭められる。 実験例 １ エンドトキシンゲル化試薬の製造ロツトが異な
る場合の、Rthと反応時間との関係について検討
を行つた。 （エンドトキシンゲル化試薬） LAL−Ａ：Associates of Cape Cod社製、
FDAリフアレンスによる目視ゲル化転倒法感度
0.025ng／ml。 LAL−Ｂ：Associates of Cape Cod社製、
（LAL−Ａとはロツトが異なる。）、FDAリフアレ
ンスによる目視ゲル化転倒法感度0.025ng／ml。 LAL−Ｃ：Haemachem社製、FDAリフアレ
ンスによる目視ゲル化転倒法感度0.025ng／ml。 （エンドトキシン） 実施例１に同じ （被検液） 上記エンドトキシンを注射用蒸留水（大塚製薬
(株)製）で溶解して、エンドトキシン濃度が2ng／
ml及び0.01ng／mlの溶液を調製して被検液とし
た。 （操作法） 所定のエンドトキシンゲル化試薬0.1mlと、所
定の被検液0.1mlとを直径10mmの試験管内で撹拌
混合し透過光量の変化を測定した。 （結 果） 得られた結果を第９図に示す。尚、第９図中の
各記号の説明は、表２に記載の通りである。
定を行つた。 LAL試薬；Associates of Cape Cod社製 FDAリフアレンスによる目視ゲル
化転倒法感度0.01ng／ml エンドトキシン；実施例１に同じ 測定方法；実施例１に同じ 第７図にRth＝95％に設定した本実施例に於け
るゲル化時間とエンドトキシン濃度との検量関係
を示す。第７図より明らかな如く、本実施例に於
てはエンドトキシン濃度0.0001ng／mlから100g／
ml迄、検量関係が認められた。これは、同一試薬
を使つて目視ゲル化転倒法で得られる検出感度の
100倍の感度であり、又、合成基質を用いる比色
法の10000倍程度の測定範囲のダイナミツクレン
ジである。 尚、本実施例に於ても、Rth＝70％とした場合
にはゲル化を検出できず、検量線が得られない。 実施例 ４ 以下の測定条件によりエンドトキシン濃度の測
定を行つた。 LAL試薬；Associates of Cape Cod社製 FDAリフアレンスによる目視ゲル
化転倒法感度0.1ng／ml エンドトキシン；実施例１に同じ 測定方法；上記エンドトキシンを注射用蒸留水
（大塚製薬(株)製）で溶解したものを被
検液とする。直径12mmの試験管に凍結
乾燥されたLAL試薬と被検液0.2mlを
加えて撹拌溶解し透過光量の変化を測
定。 第８図にRth＝85％に設定した本実施例に於け
るゲル化時間とエンドトキシン濃度との検量関係
を示す。第８図より明らかな如く、本実施例に於
てはエンドトキシン濃度0.02ng／mlから100ng／
ml迄の範囲で検量関係が認められた。これは、同
一試薬による目視ゲル化転倒法の５倍の検出感度
であり、合成基質を用いる比色法の50倍程度の測
定範囲のダイナミツクレンジである。 尚、本実施例に於て、Rth＝70％とした場合に
は、検量関係が得られる濃度範囲が、エンドトキ
シン濃度0.1〜10ng／mlと非常に狭められる。 実験例 １ エンドトキシンゲル化試薬の製造ロツトが異な
る場合の、Rthと反応時間との関係について検討
を行つた。 （エンドトキシンゲル化試薬） LAL−Ａ：Associates of Cape Cod社製、
FDAリフアレンスによる目視ゲル化転倒法感度
0.025ng／ml。 LAL−Ｂ：Associates of Cape Cod社製、
（LAL−Ａとはロツトが異なる。）、FDAリフアレ
ンスによる目視ゲル化転倒法感度0.025ng／ml。 LAL−Ｃ：Haemachem社製、FDAリフアレ
ンスによる目視ゲル化転倒法感度0.025ng／ml。 （エンドトキシン） 実施例１に同じ （被検液） 上記エンドトキシンを注射用蒸留水（大塚製薬
(株)製）で溶解して、エンドトキシン濃度が2ng／
ml及び0.01ng／mlの溶液を調製して被検液とし
た。 （操作法） 所定のエンドトキシンゲル化試薬0.1mlと、所
定の被検液0.1mlとを直径10mmの試験管内で撹拌
混合し透過光量の変化を測定した。 （結 果） 得られた結果を第９図に示す。尚、第９図中の
各記号の説明は、表２に記載の通りである。
【表】
【表】
第９図の結果から、Ｒ(t)と反応時間（分）と
の関係を示すグラフは、エンドトキシンゲル化試
薬のロツトにより異なること、LAL−Ａのエ
ンドトキシンゲル化試薬を用いた測定に於いて
は、Rthは97〜85％の範囲内でしか設定できない
が、LAL−ＢやLAL−Ｃのエンドトキシンゲル
化試薬を用いた場合には、約97％〜75％の範囲内
の何れにRthを設定した場合でもエンドトキシン
の測定を行うことができること、等が判る。
の関係を示すグラフは、エンドトキシンゲル化試
薬のロツトにより異なること、LAL−Ａのエ
ンドトキシンゲル化試薬を用いた測定に於いて
は、Rthは97〜85％の範囲内でしか設定できない
が、LAL−ＢやLAL−Ｃのエンドトキシンゲル
化試薬を用いた場合には、約97％〜75％の範囲内
の何れにRthを設定した場合でもエンドトキシン
の測定を行うことができること、等が判る。
第１図は試料液透過光量を測定するための光学
的系原理図、第２図は試料液透過光量Ｉ(t)の経時
変化特性図、第３図は試料液透過光量Ｉ(t)と、反
応の進行により減少を開始する以前の透過光量の
初期値I0との比率Ｒ(t)の経時変化持性図、第４図
はエンドトキシン濃度とＲ(t)の時間変化特性図、
第５図は本発明によるゲル化判定結果と従来法
（目視ゲル化転倒法）による判定結果との相関図、
第６図、第７図及び第８図は夫々、実施例１、実
施例３及び実施例４に於けるエンドトキシン濃度
とゲル化時間との検量関係図である。第９図は、
実験例１で得られた、各種ロツトのエンドトキシ
ンゲル化試薬にエンドトキシンを反応させた場合
のＲ(t)と反応時間との関係を示すグラフである。 １……測定用キユベツト、２……試料液、３，
４……絞り、５……光源、６……光電検出器。
的系原理図、第２図は試料液透過光量Ｉ(t)の経時
変化特性図、第３図は試料液透過光量Ｉ(t)と、反
応の進行により減少を開始する以前の透過光量の
初期値I0との比率Ｒ(t)の経時変化持性図、第４図
はエンドトキシン濃度とＲ(t)の時間変化特性図、
第５図は本発明によるゲル化判定結果と従来法
（目視ゲル化転倒法）による判定結果との相関図、
第６図、第７図及び第８図は夫々、実施例１、実
施例３及び実施例４に於けるエンドトキシン濃度
とゲル化時間との検量関係図である。第９図は、
実験例１で得られた、各種ロツトのエンドトキシ
ンゲル化試薬にエンドトキシンを反応させた場合
のＲ(t)と反応時間との関係を示すグラフである。 １……測定用キユベツト、２……試料液、３，
４……絞り、５……光源、６……光電検出器。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ エンドトキシンゲル化試薬と被検液とを混合
した試料液を保持するキユベツトに光線を照射
し、時間ｔに於ける試料液からの透過光量Ｉ(t)と
反応の進行により減少を開始する以前の該試料液
からの透過光量の初期値I0との比率を求め、該比
率が、Ｉ(t)／I0でみたとき75％以上97％以下の範
囲にある任意に設定された一定値に到達した時点
を前記試料液のゲル化時点と判定し、前記試料液
の混合時点から該ゲル化判定時点までを前記試料
液のゲル化時間として求め、該ゲル化時間をエン
ドトキシン濃度測定の際の指標として使用するこ
とを特徴とするエンドトキシンの測定方法。 ２ 該ゲル化時間を、予め求めたエンドトキシン
濃度と該ゲル化時間との関係を示す検量線に当て
はめることにより被検液中のエンドトキシン濃度
を求める特許請求の範囲第１項に記載のエンドト
キシンの測定方法。 ３ 透過光量の初期値I0が、透過光量Ｉ(t)の最大
値である特許請求の範囲第１項又は第２項に記載
のエンドトキシンの測定方法。 ４ 透過光量の初期値I0が、初期段階一定時間内
での透過光量Ｉ(t)の平均値である特許請求の範囲
第１項又は第２項に記載のエンドトキシンの測定
方法。 ５ 透過光量の初期値I0が、初期段階一定時間内
での任意の特定の時点tsでの透過光量Ｉ（ts）であ
る特許請求の範囲第１項又は第２項に記載のエン
ドトキシンの測定方法。 ６ 透過光量の初期値I0が、初期段階一定時間内
での透過光量Ｉ(t)の最小値である特許請求の範囲
第１項又は第２項に記載のエンドトキシンの測定
方法。 ７ 試料液を保持するキユベツトが内径６mmから
内径12mmの範囲にある円筒試験管である特許請求
の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載のエンド
トキシンの測定方法。 ８ 試料液が、エンドトキシンゲル化試薬0.1ml
と被検液0.1ml、あるいはエンドトキシンゲル化
試薬の凍結乾燥品と被検液0.2mlからなる特許請
求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載のエン
ドトキシンの測定方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28161684A JPS61159162A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | エンドトキシンの測定方法 |
| EP89114580A EP0347951B1 (en) | 1984-06-27 | 1985-06-25 | Apparatus for measuring endotoxin |
| DE89114580T DE3587510T2 (de) | 1984-06-27 | 1985-06-25 | Gerät zur Messung von Endotoxin. |
| EP85107877A EP0173021B1 (en) | 1984-06-27 | 1985-06-25 | Process for measuring endotoxin |
| AT89114580T ATE92630T1 (de) | 1984-06-27 | 1985-06-25 | Geraet zur messung von endotoxin. |
| DE8585107877T DE3586075D1 (de) | 1984-06-27 | 1985-06-25 | Verfahren zur bestimmung von endotoxin. |
| AT85107877T ATE76507T1 (de) | 1984-06-27 | 1985-06-25 | Verfahren zur bestimmung von endotoxin. |
| US06/748,805 US4740460A (en) | 1984-06-27 | 1985-06-26 | Process for measuring endotoxin and apparatus used therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28161684A JPS61159162A (ja) | 1984-12-28 | 1984-12-28 | エンドトキシンの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61159162A JPS61159162A (ja) | 1986-07-18 |
| JPH0531744B2 true JPH0531744B2 (ja) | 1993-05-13 |
Family
ID=17641611
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28161684A Granted JPS61159162A (ja) | 1984-06-27 | 1984-12-28 | エンドトキシンの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61159162A (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4936682A (en) * | 1987-08-11 | 1990-06-26 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Instrument for independently and kinetically measuring light transpassion through a plurality of samples |
| WO1995014932A1 (fr) * | 1993-11-22 | 1995-06-01 | Seikagaku Corporation | Procede de dosage d'une substance reagissant avec un reactif de limulus |
| US20100129260A1 (en) * | 2007-05-01 | 2010-05-27 | Yoshiaki Shirasawa | Gelation measuring apparatus and sample cell |
| EP2261642A4 (en) * | 2008-03-19 | 2011-10-26 | Toru Obata | DEVICE FOR DETECTING HORIZONTAL FORMATION |
| JP5312834B2 (ja) * | 2008-03-31 | 2013-10-09 | シスメックス株式会社 | 血液凝固分析装置、血液凝固分析方法、及び、コンピュータプログラム |
| WO2009122993A1 (ja) | 2008-03-31 | 2009-10-08 | シスメックス株式会社 | 血液凝固分析装置、血液凝固分析方法、及びコンピュータプログラム |
| JP5489680B2 (ja) * | 2009-12-02 | 2014-05-14 | 興和株式会社 | 生物由来の生理活性物質の測定方法、それを実行するためのプログラム及び、生物由来の生理活性物質の測定装置 |
| JP5421622B2 (ja) * | 2009-03-13 | 2014-02-19 | 興和株式会社 | 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
| WO2010104180A1 (ja) * | 2009-03-13 | 2010-09-16 | 興和株式会社 | 生物由来の生理活性物質の測定方法、それを実行するためのプログラム及び、生物由来の生理活性物質の測定装置 |
-
1984
- 1984-12-28 JP JP28161684A patent/JPS61159162A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS61159162A (ja) | 1986-07-18 |
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