[go: up one dir, main page]

JPH05292991A - ペプチド酸の製造方法 - Google Patents

ペプチド酸の製造方法

Info

Publication number
JPH05292991A
JPH05292991A JP4215196A JP21519692A JPH05292991A JP H05292991 A JPH05292991 A JP H05292991A JP 4215196 A JP4215196 A JP 4215196A JP 21519692 A JP21519692 A JP 21519692A JP H05292991 A JPH05292991 A JP H05292991A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
peptide
enzyme
structural formula
aryl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP4215196A
Other languages
English (en)
Inventor
Eikeren Paul Van
ヴァン アイケレン ポール
West J Blair
ウエスト ブレア ジェイ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bend Research Inc
Original Assignee
Bend Research Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bend Research Inc filed Critical Bend Research Inc
Publication of JPH05292991A publication Critical patent/JPH05292991A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 レニン阻害剤および他のトリペプチドの合成
に有用な特定のペプチド酸の製造方法を提供する。 【構成】 末端カルボキシル封鎖基を有する特定のペプ
チド（ペプチドアシル供与体）を、ほぼ中性のpHにおい
て、パパイン、キモパパイン、フィシンおよびブロメラ
インからなる群から選択されたスルフヒドリルプロテア
ーゼ調製物の存在下に加水分解して、末端カルボキシル
封鎖基を選択的に切断する。 【効果】 ジアステレオマー不純物をほとんど含んでい
ないペプチド酸が高収率で得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素加水分解によって
ペプチド酸を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】次の構造式：
【化３】 （式中のＲ′およびＲ″は種々の置換基を示し、R1, R2
およびR3は後述のものと同一のものを示す) で表される
レニン阻害剤は、心血管系薬として次第に大きな関心が
払われている既知の抗高血圧薬である。グリーンリー
（Greenlee) 「レニン・インヒビタース(Renin Inhibit
ors)、４ファルム. レス.(Pharm.Res.)364 (1987) 」参
照。このために、レニン阻害特性を示すある種のペプチ
ド、並びにその中間体を合成する効果的な方法の開発に
大きな関心が払われている。
【０００３】従来、このようなレニン阻害剤は次の構造
式Ｉ：
【化４】 で表されるアミノ酸またはペプチド誘導体（ペプチドア
ミル供与体）と、
【化５】 で表されるβ−ヒドロキシアミン誘導体とを、カップリ
ング剤の存在下に反応させて、ペプチ結合を形成するこ
とによって製造されている。例えば、欧州特許出願ＥＰ
３１２１５７Ａ２、ＥＰ３０９８４１Ａ２、およびＥＰ
３１００７０Ａ２参照。
【０００４】この特許出願と同時に出願した特許出願に
は、このようなレニン阻害剤を酵素によって合成する方
法が開示されている。従来の合成方法および酵素による
合成方法のいずれにおいても、構造式Ｉ〔化４〕で表さ
れるペプチドアシル供与体は重要な中間体である。
【０００５】構造式Ｉ〔化４〕における置換基は次のよ
うに定義される：R1はROCONH−基、ROCOO −基、ROCOCH
2 −基、RNHCONH −基、RNHCOO−基、RNHCOCH2−基、RS
O2NH−基、またはRSO2CH2 −基を示し；R2はシクロアル
キル基、アリール基またはアラルキル基を示し；R3は水
素原子、アルキル基、シクロアルキル基、４−イミダゾ
イル基、-OH 基、-SR 基、-(CH2)n -SR 基、または-(CH
2)n NH2 基（ただし、ｎは１〜６の整数を示す）を示
し；
【０００６】前記「アルキル基」は置換もしくは未置換
の直鎖または分枝鎖の１〜20個好ましくは１〜６個の炭
素原子を有し、ヘテロ原子を有することのある基であ
り；前記「シロルアルキル基」は環に架橋構造または酸
素原子、窒素原子および硫黄原子からなる群から選択さ
れたヘテロ原子を有することのある３〜６個の炭素原子
を有する環構造、または少なくとも１個の置換基を有す
る置換シクロアルキル基であり、前記置換基は窒素原
子、ハロゲン原子、炭素原子、酸素原子、リン原子およ
び硫黄原子からなる群から選択された原子を有すること
がある。
【０００７】前記「アリール基」は６〜１０個の炭素原
子を有する単環式、二環式または酸素原子、窒素原子お
よび硫黄原子からなる群から選択されたヘテロ原子を有
する複素環式の芳香族基、または少なくとも１種の置換
基を有する置換アリール基であり、前記置換基は窒素原
子、ハロゲン原子、炭素原子、酸素原子、リン原子およ
び硫黄原子からなる群から選択された原子を有すること
がある。前記「アラルキル基」はアルキル基がアリール
基に結合している基である。
【０００８】次の構造式II：
【化６】 で表される化合物は、単に構造式Ｉで表される化合物の
エステル形態のものであり、「Ｒ」置換基が先に規定し
たアルキル基、シクロアルキル基、アリール基またはア
ラルキル基を示す点を除けば構造式Ｉと同じ置換基を有
する。
【０００９】構造式Ｉで表される酸形態の化合物を製造
するには２工程が必要である。第１工程では、以下に示
すように、R1, R2を有するアシル成分ＡとR3を有するア
ミン成分Ｂとをカップリングさせて構造式IIで表される
エステルを形成する。R3を有するアミン成分Ｂがこの成
分自体とカップリングするのを防止するために、そのカ
ルボキシル基を、代表的な例では対応するＲ置換基を有
するエステルを使用することにより、保護する必要があ
る。
【化７】
【００１０】第２工程では、以下に示すように、構造式
IIで表されるエステル形態のカップリング生成物中のカ
ルボキシル基を脱保護（deprotect)して構造式Ｉで表さ
れる遊離酸形態の化合物を生成させる必要がある。
【化８】
【００１１】このような脱保護では、構造式II中のカル
ボキシル封鎖(carboxyl-blocking）基が加水分解によっ
て切断(cleavage)される。しかし、従来の非酵素手段例
えば水または水／溶液混合物中のアルカリ土類水酸化物
を使用することによってこのような切断を行なわせる場
合には、アミン結合の加水分解またはペプチドのラセミ
化が起こって中間体が使いものにならなくなる。ケンプ
(Kemp)「ラセミゼイション・インペプチド・シンセシス
(Racemization in Peptide Synthesis) 、１ザ・ペプチ
ヅ(The Peptides)315 （グロス(Gross) 等編、1979) 」
参照。ロイヤー(Royer) 等は、「101 JACS 3394 (197
9)」中に、ほぼ中性のｐＨで使用すると関係のあるジペ
プチドの有意な切断が起こるために本発明では適当でな
いエキソペプチダーゼカルボキシペプチダーゼＹを使用
してペプチドからカルボキシル封鎖基を酵素切断させる
ことを開示している。
【００１２】ヘルマン(Hermann) 等は「ペプチヅ(Pepti
des)1982、第399 〜402 頁(1983)」中に、微生物サーモ
アクチノマイセス・ブルガリス(Thermoactinomyces Vul
garis)からのエンドペプチダーゼであるサーミターゼを
触媒として使用して、ペプチドの末端エステル基を加水
分解により脱保護することを開示しており、その後にこ
のような酵素はペプチド結合を切断することが示され
た。「デュデク(Dudek)およびヘルマン(Hermann) 、520
J.Chrom.333 (1990)」参照。ブルバヘル(Brubacher)
およびツァーエル(Zaher) は「57 Can.J.Biochem. 1964
(1979)」中に、パパインを触媒として使用した一連のＮ
−保護ジペプチドエステルの切断を開示しており、この
酵素がエステル結合の加水分解による切断に触媒作用を
及ぼすことを示ている。
【００１３】しかし、構造式IIで表されるジペプチドエ
ステルの加水分解についての開示はなく、加水分解の立
体選択性についての開示もない。シェヒター(Schechte
r) およびベルガー(Berger)は「27バイオケミカル・ア
ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ンズ(Biochem Biophys Research Communications) 157
(1967 ) 」において、ジペプチドからヘキサペプチドま
での長さの範囲のジアステレオマーである(diasteromer
ic) アラニンオリゴペプチドの加水分解におけるパパイ
ンの作用についての研究を開示している。本発明におい
ては切断パターンに基づいて酵素は７個のサブ部位(sub
site) （触媒部位の上の４個のサブ部位 (S1からS4で示
す）および触媒部位の下の３個のサブ部位（S1′から
S3′で示す））を含むと推定した。さらに、酵素がアラ
ニンオリゴペプチドエピマーを選択的に切断し、そのサ
ブ部位S1およびS2におけるアラニンの立体配置がＬ型で
あると理論づけた。
【００１４】しかし、反応を酸性条件（ｐＨ3.7 ）で実
施する必要があり、構造式IIで表されるジペプチドエス
テルの加水分解についての開示はなかった。さらに、か
かる加水分解反応を実際の方法としてジアステレオマー
不純物をほとんど含まないＮ−保護ジペプチド酸を製造
するために使用することができるという認識は存在しな
かった。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、レニン阻害
剤および他のポリペプチドの合成における出発物質とし
て有用なペプチド酸を製造する従来技術の方法における
上述の欠点を克服し、ジアステレオマー不純物をほとん
ど含まないペプチド酸を高い収率で製造することができ
る方法を提供する。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明においては、スル
フヒドリルプロテアーゼであるパパイン、キモパパイ
ン、フィシンまたはプロメラインを使用して構造式II
〔化６〕で表されるペプチドから末端カルボキシル封鎖
基を選択的に切断してジアステレオマー不純物を実質的
に含有していない構造式Ｉ〔化４〕で表されるジペプチ
ド酸を製造することができることを見い出した。
【００１７】本発明は、構造式IIで表されるペプチド中
の末端カルボキシエステル基を選択的に切断することに
より、構造式Ｉで表されるペプチド酸を製造する方法あ
提供し、この方法では、前記ペプチドエステルをほぼ中
性のｐＨにおいてパパイン、キモパパイン、フィシンお
よびブロメラインからなる群から選択されたスルフヒド
リルプロテアーゼ調製物の存在下に反応させ、ただし構
造式Ｉ〔化４〕および構造式II〔化６〕中のR, R1, R2
およびR3は上述のものと同一のものを示す、ことを特徴
とする。
【００１８】このようにして製造した場合には、生成し
たペプチド酸はジアステレオマー不純物を実質的に含有
していない、すなわち、構造式Ｉで表される単離された
ペプチド酸は−CH2R3 基を有する炭素がエピマー化して
いる構造式Ｉで表される化合物を0.5 ％未満含有するに
すぎない。このようなプロテアーゼ調製物の使用できる
形態としては、粉末、溶液、担体上に固定されたもの、
酵素を含有する細胞抽出物、および酵素を含有する細胞
がある。これらの形態のものはすべて水、有機溶媒また
は水と有機溶媒との混合物中に溶解または懸濁させるこ
とができる。酵素を含有する細胞の形態の場合には、細
胞は全体細胞または断片化された細胞とすることができ
る。
【００１９】また、プロテアーゼ調製物を、不活性担
体、例えば漂白したか、未漂白か、あるいは焼成した珪
藻土、ポリデキストラン、ポリアクリルアミド、ポリス
チレン、ポリアクリル酸エステル、シリカゲルあるいは
多孔性ガラスビーズの上に固定することも、本発明に係
る脱保護方法を実施するにあたって有利である。焼成し
た珪藻土の市場で入手できる好ましい形態のものは、米
国コロラド州デンバー所在のジョーンス・マンビル (Jo
hns Manville) 社により「セライト(Celite)」（商品
名）として製造および販売されているものである。ポリ
アクリル酸エステルの市場で入手できる好ましい形態の
ものは、「ＸＡＤ−７」および「ＸＡＤ−８」の商品名
で米国ペンシルベニア州フィラデルフィア所在のローム
・アンド・ハス社により製造および販売されているもの
である。ポリスチレンの好ましい形態のものはローム・
アンド・ハス社の「ＸＡＤ−２」（商品名）および「Ｘ
ＡＤ−４」（商品名）である。
【００２０】ポリデキストランの市場で入手できる好ま
しい形態のものは、「セファデックス(Sephadex)」の商
品名でスウェーデン国ファーマシア(Pharmacia) 社によ
り製造および販売されている。ポリアクリルアミドの市
場で入手できる好ましい形態のものは、「パイオゲル(B
iogel)Ｐ」（商品名）シリーズとして米国カリフォルニ
ア州リッチモンド所在のバイオ・ラッド・ラボラトリー
ズ(Bio-Rad Laboratories)社により製造および販売され
ているものである。このような固定化酵素触媒の含水量
は0.5 〜15重量％、好ましくは10重量％である。酵素担
持量は担体重量に対して2.0 〜20重量％、好ましくは5.
0 重量％である。シスタミン、システイン、β−メルカ
プトエタノール、硫化水素またはジオトレイトールを、
固定化酵素調製物に、あるいは溶液または懸濁液に、補
助薬として1.0 〜5.0 重量％、好ましく2.0 重量％の量
で加えることができる。
【００２１】「ほぼ中性のｐＨ」とは、約6.5 〜7.5 の
範囲のｐＨを意味する。Ｄ−エステルジアステレオマー
不純物を含む未反応エステルは、水層のｐＨをジペプチ
ド酸のpKa より大きい値に調整して、水に著しく可溶性
であるジペプチドカルボン酸イオンを生成させることに
より、加水分解の終了時に容易に除去することができ
る。次いで、未反応エステルは酢酸エチル、クロロホル
ムまたは塩化メチレンのような有機溶媒による抽出によ
り除去することができる。所望のジペプチド酸は、水層
のｐＨをpKa より小さい値に調整し、これよよりジペプ
チド酸を沈殿させ、この沈殿を濾過して集めることより
単離することができる。
【００２２】
【実施例】次に本発明を実施例について説明する。ここ
に示す実施例のすべてにおいて、表１および表２に示し
た構造式ＩおよびII（式中のR2およびR3置換基はすべて
(R) と示さない限りＳ型である）で表される種々の特定
の形態のものを参照されたい。実施例を表３および表４
にまとめて示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】
【表２】
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】実施例１ この実施例および実施例２〜４は、本発明に係る脱保護
方法を単相反応において実施できることを示す。構造式
IIp を有するエステル化されたペプチド１ｇをｐＨ7.5
の0.1 Ｍリン酸緩衝液と30容量％のアセトニトリルとの
混合物10mlに溶解し、パパイヤからのパパイン調製物10
0 mgおよびＬ−システイン50mgを加えた。この混合物を
50℃でかきまぜ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）で加水分解したペプチドＩｐについて分析すること
により反応の進行を監視した。反応系のｐＨは0.1 NNaO
H を添加することにより6.5 と7.5 との間に維持した。
【００２８】10時間後に100 ％のIIp が加水分解されて
ＩｐになったことがＨＰＬＣにより検出された。生成物
は以下のようにして単離した。有機溶媒を真空蒸発によ
り除去した。0.1 NNaOH を添加することによりｐＨを７
に調整し、反応生成物を酢酸エチルで３回洗浄した。0.
2 MHC1を添加することにより水相のｐＨを２に調整し、
水相を酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル抽出物を
混合し、生成物が結晶するまで真空下に濃縮した。固体
物質を濾過により採集し、乾燥し、0.7 ｇのＩｐ、すな
わち83％の収率を得た。
【００２９】実施例２ 30容量％のジオキサン中のｐＨ7.5 の0.1 Ｍリン酸緩衝
液中で実施例１をくり返した。反応をＨＰＬＣで監視し
た。反応は10時間後に完了し、ほぼ同一の収率を得た。
【００３０】実施例３ 30容量％のアセトン中のｐＨ7.5 の0.1 Ｍリン酸緩衝液
中で実施例１をくり返した。反応をＨＰＬＣで監視し
た。反応は10時間後に完了し、ほぼ同一の収率を得た。
【００３１】実施例４ 30容量％のテトラヒロフラン中のｐＨ7.5 の0.1 Ｍリン
酸緩衝液中で実施例１をくり返した。反応をＨＰＬＣで
監視した。反応は10時間後に完了し、ほぼ同一の収率を
得た。
【００３２】実施例５ この実施例および実施例６〜８は、本発明方法を二相反
応系で実施できることを示す。二相反応系の利点は、
（１）一層高い濃度のジペプチドを脱保護することがで
きること、および（２）脱保護したジペプチドの単離お
よび精製が単相反応の場合より簡単であることである。
構造式IIｐを有するペプチドエステルを酢酸エチル（Et
OAc)に溶解した25m Ｍ溶液４mlを、実施例１と同じ触媒
調製物および補助薬を実施例１と同じ量で含むｐＨ7.5
の0.1 Ｍリン酸緩衝液１mlに加えた。
【００３３】この混合物を50℃でかきまぜ、有機相をＨ
ＰＬＣによりＩｐの存在について監視した。８時間後
に、出発物質であるエステル（IIp)は検出できなかっ
た。0.2ＭＨＣ１を加えることにより水相のｐＨを２ま
で低下させ、この混合物を10分間激しくかきまぜた。Et
OAc 層を分離し、MgSO4 上で乾燥し、真空下に濃縮し、
280mg のＩｐ結晶、すなわち70％の収率を得た。
【００３４】実施例６ 有機溶媒対緩衝液の比を１：４として実施例５をくり返
し、ほぼ同様な結果を得た。
【００３５】実施例７ 有機溶媒対緩衝液の比を20：１として実施例５をくり返
し、ほぼ同様な結果を得た。
【００３６】実施例８ この実施例は固定化酵素調製物を使用することにより本
発明方法を水不混和性溶媒中で実施することができ、こ
れにより脱保護されたジペプチドの単離および精製が簡
単になり、触媒を濾過により除去することができること
を示す。エステルIIp を水飽和EtOAc に溶解した250mM
溶液５mlを、パパイヤからのパパインをセライト(Celit
e.商品名)(含水量10重量％) 上に５重量％担持させたも
の1.25ｇに加えた。８時間後に出発物質のエステルは検
出できなかった。セライトを濾別し、EtOAc で洗浄し、
一緒にしたEtOAc 洗液をMgSO4 で乾燥し、ついで真空下
に濃縮して0.3gのＩｐ、すなわち62％の収率を得た。
【００３７】実施例９ 10重量％の水を含むアセトニトリルに溶解した250mM II
p 溶液１mlを実施例７で用いたと同じ担持触媒0.25ｇに
加えた。８時間後にエステルが97.7％加水分解している
ことがＨＰＬＣで検出された。
【００３８】実施例１０〜２０ これらの実施例は、多数の異なるペプチド構造物質が本
発明方法によって脱保護されることを示す。加水分解さ
れたペプチド構造物質を表５に示す。ジペプチド酸エス
テル（250 mM) を、実施例７で用いたとほぼ同じ触媒調
製物の存在下に、水飽和EtOAc 中に溶解した。含水量は
10〜15重量％の間で変化した。この混合物を50℃でかき
まぜた。ＨＰＬＣにより測定した反応の進行を示すプロ
ットの初期勾配により特定の初期速度を計算した。それ
ぞれの場合に定量的な加水分解が起こった。
【００３９】
【表５】
【００４０】実施例２１〜２４ これらの実施例は、本発明において触媒として有用な種
々の他のスルフヒドリルエンドペプチダーゼ調製物の有
用性を示す。担持量５重量％の酵素を２重量％のシステ
イン補助薬と共にセライト649 上に固定した。水飽和Et
OAc に溶解した250mM IIp 溶液を250 mg／mlの固定化酵
素と混合した。それぞれの場合にジペプチドエステルは
定量的に加水分解した。他の結果を表６に示す。
【００４１】
【表６】
【００４２】実施例２５〜４１ これらの実施例は本発明方法による位置選択性を示す。
位置選択性とは、構造式IIにおいて、置換基R2を有する
アミノ酸と置換基R3を有するアミノ酸との間の内部ペプ
チド結合を切断することなく、−ＯＲ基を加水分解して
構造式Ｉを与える酵素の能力のことである。IIp の場合
には、完全に位置選択的なプロセスにより、ペプチド切
断生成物が生成せずに化合物Ｉｐのみが生成する。
【００４３】このような位置選択性を示すために水飽和
EtOAc に溶解した250 mMペプチド溶液を、セライト648
上に５重量％担持させた酵素調製物および２重量％のシ
ステイン補助薬に加えた。分析感度は、0.01％の他の切
断生成物を検出することができる感度であった。すべて
の脱保護反応を、ジペプチドエステルの内部切断を指示
する切断生成物Mor −（またはBoc)−Phe −OHの存在に
ついて、ＨＰＬＣにより分析した。これらの分析結果を
表７に示す。位置選択性は、エステル加水分解の規準化
初期速度対切断生成物生成の規準化初期速度の比である
と規定した。切断生成物が全く検出されなかった場合に
は、0.8 μＭ／時間／重量％酵素の速度を計算の上限と
して用いた。
【００４４】
【表７】
【００４５】実施例４２〜４５ これらの実施例は、本発明方法が置換基R3を有するアミ
ノ酸残基がＬ型である構造式IIのジペプチドに対して高
選択性であることを示す。 Boc−Phe −Ala −OMe (化
合物IIa およびIIc)、Boc −Phe −Met −OMe (化合物
IIh およびIIi)、Boc −Phe −Phe −OMe (化合物IIj
および IIk) およびMor −Phe −His −OMe (化合物II
m および IIn) のエピマージペプチドを、250mＭのジペ
プチドエステルを含む水飽和EtOAc 溶液中で、セライト
648（含水量４重量％）上に固定された５重量％のパパ
イン調製物を用いて、カルボキシ脱保護した。このジア
ステレオ選択性はＬ−Ｌジペプチドエステル対Ｌ−Ｄ−
ジペプチドエステルの規準化初期加水分解速度であると
規定した。カルボキシ末端Ｄ−アミノ酸を有するジペプ
チドは、120 時間を超える反応時間の後でも検出可能な
程度には脱保護されなかった。24時間後の 0.8μＭ／時
間／重量％酵素程度の緩徐な反応速度を検出することが
できるという分析技術の選択性に基いて、反応の最小ジ
アステレオ選択性を計算した。加水分解が認められなか
った場合には、 0.8μＭ／時間／重量％酵素の限界値を
用いた。結果を表８に示す。
【００４６】
【表８】
【００４７】本明細書に用いた用語および表現は、説明
のための用語として用いたものであって、これに限定さ
れるものではなく、これらの用語および表現を用いるに
当たって示されかつ説明されている特徴およびその部分
と同等なものを除外する意図は全くなく、本発明の範囲
は特許請求の範囲のみによって規定および限定されるも
のである。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 酵素加水分解によって次の構造式： 【化１】 で表されるペプチド酸を製造するに当り、 次の構造式： 【化２】 で表されるペプチドを、ほぼ中性のｐＨにおいて、パパ
    イン、キモパパイン、フィシンおよびブロメラインから
    なる群から選択されたスルフヒドリルプロテアーゼ調製
    物の存在下に反応させ、 ただし〔化１〕および〔化２〕において、 Ｒはアルキル基、シクロアルキル基、アリール基または
    アラルキル基を示し；R1はROCONH−基、ROCOO −基、RO
    COCH2 −基、RNHCONH −基、RNHCOO−基、RNHCOCH2−
    基、RSO2NH−基、またはRSO2CH2 −基を示し；R2はシク
    ロアルキル基、アリール基またはアラルキル基を示し；
    R3は水素原子、アルキル基、シクロアルキル基、４−イ
    ミダゾイル基、-OH 基、-SR 基、-(CH2)n -SR 基、また
    は-(CH2)n NH2 基（ただし、ｎは１〜６の整数を示す）
    を示し；前記アルキル基は置換もしくは未置換のあるい
    はヘテロ原子を有する直鎖または分枝鎖の１〜20個の炭
    素原子を有する基であり；前記シロルアルキル基は環に
    架橋構造またはヘテロ原子を有することのある３〜６個
    の炭素原子を有する環構造、または置換シクロアルキル
    基であり；前記アリール基は６〜１０個の炭素原子を有
    する単環式、二環式または複素環式の芳香族基、または
    置換アリール基であり；前記アラルキル基はアルキル基
    がアリール基に結合している基であることを特徴とする
    ペプチド酸の製造方法。
  2. 【請求項２】 前記プロテアーゼ調製物が粉末、溶液、
    担体上に固定されたもの、酵素を含有する細胞抽出物、
    および酵素を含有する細胞からなる群から選択された形
    態をしていることを特徴とする請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記プロテアーゼ調製物の前記溶液用の
    溶媒が水、有機溶媒および水と有機溶媒との混合物から
    なる群から選択された溶媒であることを特徴とする請求
    項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記溶媒が10〜40容量％アセトニトリル
    水溶液であることを特徴とする請求項２記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記酵素を含有する細胞が全体細胞であ
    ることを特徴とする請求項２記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記酵素を含有する細胞が部分細胞であ
    ることを特徴とする請求項２記載の方法。
JP4215196A 1991-08-13 1992-08-12 ペプチド酸の製造方法 Pending JPH05292991A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US74431591A 1991-08-13 1991-08-13
US07/744315 1991-08-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH05292991A true JPH05292991A (ja) 1993-11-09

Family

ID=24992256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP4215196A Pending JPH05292991A (ja) 1991-08-13 1992-08-12 ペプチド酸の製造方法

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP0530992A2 (ja)
JP (1) JPH05292991A (ja)
KR (1) KR930004475A (ja)
CA (1) CA2075748A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030032083A1 (en) * 2001-05-23 2003-02-13 Diversa Corporation Peptide synthesis method

Also Published As

Publication number Publication date
KR930004475A (ko) 1993-03-22
EP0530992A3 (ja) 1994-05-04
EP0530992A2 (en) 1993-03-10
CA2075748A1 (en) 1993-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
GB2292149A (en) Peptide inhibitors of pro-interleukin-1beta converting enzyme
US5304470A (en) Process for the enzymatic preparation of protected and unprotected di- and oligopeptides in aqueous solutions
JPH11508452A (ja) ペプチドおよびｎ−カルバモイル保護されたペプチドの新規製造法
EA019536B1 (ru) Синтез пептидов с использованием энзиматической активации и конденсации
EP0149594A2 (en) Enzymatic coupling of n-formyl amino acids and/or peptide residues
Kimura et al. Enzymatic synthesis of the precursor of Leu-enkephalin in water-immiscible organic solvent systems
KR100438879B1 (ko) N-아세틸(L)-4-시아노페닐알라닌Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH및N-아세틸-(L)-p-아미디노페닐알라닌-시클로헥실글리신-β-(3-N-메틸피리디늄)-알라닌Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2의신규제조방법
JPH05292991A (ja) ペプチド酸の製造方法
Krix et al. Protease-catalyzed synthesis of new hydrophobic dipeptides containing non-proteinogenic amino acids
IE52242B1 (en) Preparation of amino protected-l-aspartyl-l-phenylalanine alkyl ester
EP1979370B1 (en) SELECTIVE ENZYMATIC HYDROLYSIS OF C-TERMINAL tert-BUTYL ESTERS OF PEPTIDES
Kuhl et al. On the use of carboxamidomethyl esters in the protease-catalyzed peptide synthesis
JP2641464B2 (ja) 酵素によるペプチド結合の生成反応
US6015877A (en) Compounds for inhibition of proteolysis
Ohno et al. Partial enzymic deprotection in the synthesis of a protected octapeptide bearing a free terminal carboxyl group
JPH05292992A (ja) ペプチドレニン阻害剤を合成する方法
EP0324659A2 (en) Enzymatic process for producing immunomodulating pentapeptides and intermediates for use in the process
EP2167673B1 (en) Process for the conversion of c-terminal peptide esters or acids to amides employing subtilisin in the presence of ammonium salts
Bizzozero et al. Enzyme‐Catalyzed Peptide‐Bond Formation: Elastase‐and δ‐Chymotrypsin‐Assisted Synthesis of Oligopeptides
JP2011500010A (ja) Ｃ末端エステル転換による化学酵素的ペプチド合成
JPH01104192A (ja) ビブリオリシン結合方法
JPH05507403A (ja) ペプチドの製造方法
JPS6022918B2 (ja) Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−ｌ−アスパルチル−ｌ−フェニルアラニンメチル−エステルとフェニルアラニンメチルエステルとの付加化合物の製造方法
JP3005072B2 (ja) セファロスポリン誘導体の製法
JP2764725B2 (ja) 修飾酵素による光学活性ペプチドの製造法