JPH05292983A - 微生物セルロースの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 微生物セルロースの効率的な製造法に関す
る。 【構成】 アセトバクター属に属し微生物セルロースを
生産する能力を有する微生物を静置培養によって微生物
セルロースを生産せしめるに際し、培地中の炭素源濃度
を好ましくは２ｇ／Ｌ以下に制御して培養し、微生物セ
ルロースを増収する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物セルロースの製
造法に関する。

【０００２】さらに詳しくはアセトバクター属に属し、
微生物セルロースを生産する能力を有する微生物によっ
て微生物セルロースを製造する際に、静置培養中の培地
の炭素源濃度を一定濃度以下に維持しながら培養するこ
とを特徴とする効率的な微生物セルロースの製造法に関
する。

【０００３】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】従来
よりアセトバクター属に属する微生物が、高い微生物セ
ルロース生産能を有していることが知られており、該物
質の工業的な製造に用いられている。

【０００４】通常、諸物質を生産する場合には、ヘスト
リンとシュラムによって開発された培地（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ．，第５８巻、第３４５頁（１９５４年））を用
いた場合の生産性が最も高く、多くの研究者がこの培地
を使用してきたが、ヘストリンとシュラムの培地を用い
ても対糖微生物セルロースの収率は、重量で通常５〜１
０％程度であった。

【０００５】そこで、培地組成を改良することにより、
対糖収率を高める試みがなされてきており、例えば、イ
ノシトールやフィチン酸あるいはピロロキノリンキノン
を添加することによって、生産性の向上が見られている
（特開昭６１−２１２２９５）。

【０００６】セルラーゼ製剤をセルラーゼ活性を保持さ
せた形で微量添加することにより、収率が高まった例も
ある（特開昭６３−７４４９０）。

【０００７】また、失活させたセルラーゼ製剤を生産培
地に含有させる方法がある（特開平２−２３８８８
８）。

【０００８】しかし、いずれの方法も収率がそれほど向
上していなかったり、収率は高くても添加物が非常に高
価なため、実用的に使用することは困難であった。

【０００９】一方、培養方法を工夫することにより収率
を高める試みも行われている。

【００１０】例えば、静置培養において、培養中、培地
を連続的あるいは間欠的に添加することにより、微生物
セルロースの生成速度が向上することが見いだされてい
る（特開昭６２−２６５９９０）。

【００１１】しかし、この方法においても、対糖収率は
２５％程度と不十分なものであった。

【００１２】また、通気攪拌培養において、増殖工程と
微生物セルロース蓄積工程を分離し、それぞれの工程に
おける炭素源濃度を制御する方法が提案されているが
（特開昭６３−２０２３９４）、対グルコース収率は最
高でも重量換算で約２０％程度であった。

【００１３】本発明は、アセトバクター属に属する微生
物セルロースを生産する能力を有する微生物を用いて微
生物セルロースを生産する場合に、該物質を効率よく且
つ安価に生産できる製造方法を提供することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、静置培養
での対糖収率が高いことから、静置培養での培養条件に
ついて検討し、微生物セルロースの収率は培地の糖濃度
が低いほど良いこと、培地の糖濃度を低くすればするほ
ど、収率が高くなると考えられるが、実際には、維持す
べき糖濃度の設定や培養中にｐＨが変化し糖の代謝速度
が変化するため、適切な培養は非常に実施が困難である
ことを見いだした。

【００１５】特開昭６２−２６５９９０において、静置
培養の培養期間中、培地を連続的あるいは間欠的に添加
することが提案されているが、対糖収率は２５％程度し
か得られていない。

【００１６】この原因は培地の添加条件が微生物セルロ
ースの生成速度の最大速度以下と設定されており、培養
期間中の培養液の炭素源濃度について考慮されておら
ず、このため単位液量あたりの生産効率は、培地を補添
しない場合よりも向上したが、対糖収率では同等程度の
成績しか到達できていないのが現状である。

【００１７】これらの知見をもとに、静置培養で培地の
糖濃度の影響について鋭意検討し、静置培養で初発培地
炭素源濃度を低くし、培養期間中に適宜糖などの炭素源
を補添して一定濃度以下に炭素源濃度を制御して培養す
ることにより、著しく微生物セルロースの生成収率が向
上することを見いだし、本発明を完成するに至った。

【００１８】すなわち、本発明は、アセトバクター属に
属する微生物セルロースを生産する能力を有する微生物
を、微生物セルロース生産培地に接種し、静置培養して
培地期間中に該物質を生成蓄積し、該物質を採取する方
法において、培地の炭素源濃度を低く維持しながら培養
すること、好ましくは炭素源濃度が２ｇ／Ｌ以下に制御
することを特徴とする微生物セルロースの製造法に関す
る。

【００１９】本発明において使用される微生物は、アセ
トバクター属に属し、微生物セルロース性物質を生産す
る能力を有する微生物であれば、いずれの菌株でもよい
が、例えば、アセトバクター・バストリアヌスＡＴＣＣ
１０２４５やアセトバクターｓｐ．ＤＡ株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１２９２４）などが用いられる。

【００２０】アセトバクターｓｐ．ＤＡは、食酢もろみ
から分離された細菌で、一般的な微生物分類の実験法
（例えば『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会
出版センター）に従い、菌学的性質を検討したところ、
（１）グラム陰性の好気性菌であること、（２）エタノ
ールを酸化し酢酸を生成すること、（３）ｐＨ４．５の
培地で生育可能なこと、（４）酢酸や乳酸を資化可能な
ことから、バージェイズ・マニュアル・オブ・システマ
チック・バクテリオロジー 第１巻 第２６７頁〜第２
７４頁、１９８４年（“Ｂｅｒｇｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ”ｖｏｌ．１，Ｐ．２６７〜２７４１９８４年）に
従い分類同定したところ、アセトバクターに属する微生
物であると分かった。

【００２１】本菌株は工業技術院微生物工業研究所に寄
託し、微工研菌第１２９２４号（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９
２４）として受託された。

【００２２】培地の初発炭素源としては、該微生物が資
化可能なものであれば特に限定はなく、通常ショ糖、グ
ルコース、フラクトースなどが単独あるいは併用して用
いられる。

【００２３】また、これらの炭素源を含有する澱粉加水
分解物、セルロース分解物等も使用できる。

【００２４】これらの炭素源の濃度は、２ｇ／Ｌ以下が
好ましい。

【００２５】培養期間中に補添する炭素源としては、上
記の炭素源も使用できるが、培養中、該微生物の酸化作
用を受けないため培地のｐＨを変動させず、しかも微生
物セルロースへの変換効率が高いことから、グルコン酸
や酢酸も好適に使用される。

【００２６】補添される炭素源は１種類でも２種類以上
を混合して使用してもよい。

【００２７】これらの炭素源の補添は、培地に含まれる
炭素源濃度が２ｇ／Ｌを越えないように適宜添加され
る。

【００２８】このため培養期間中、適宜、糖やグルコン
酸や酢酸の濃度を測定することが望ましい。

【００２９】酢酸を炭素源として使用する場合には、酢
酸が該微生物に対し生育阻害作用を有することから、酢
酸に対して耐性能を有した株、例えば、アセトバクター
ｓｐ．ＤＡ株などを用いることが望ましい。

【００３０】アセトバクターｓｐ．ＤＡ株は、通常の微
生物セルロース生産能を有するアセトバクター属の菌株
では、該物質の生産性が著しく低下する１０ｇ／Ｌ以上
の濃度の酢酸存在下でも旺盛な該物質生産能を示す菌株
であり、本発明の実施に用いると特に良い。

【００３１】炭素源の補添の方法は、連続的でも、間欠
的でもよい。

【００３２】培地に含有される窒素源としては、該微生
物が利用できるものであればよく、硫酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム、硝酸塩などの無機窒素源や酵母エ
キス、ポリペプトン、コーンスチープリカーなどの有機
窒素源が使用される。

【００３３】無機塩としては、リン酸塩、マグネシウム
塩、鉄塩、カルシウム塩などが適宜使用される。

【００３４】また、該微生物が微量栄養源として、ビタ
ミン、核酸、アミノ酸などを要求する場合には、要求す
る栄養源を補添することが必要である。

【００３５】培養方法としては、静置培養によるが、培
養中、添加した炭素源を培地全体に均一に拡散するた
め、補添時に微生物セルロースの生成に影響を与えない
条件で間欠的に攪拌等することが望ましい。

【００３６】培地の初発ｐＨは、３ないし７、望ましく
は５から６の範囲が好ましい。

【００３７】該微生物の増殖にともない、培養中、培地
のｐＨが変化するが、アルカリまたは酸を使用して微生
物セルロースの生成に好適なｐＨ域に維持することが望
ましい。

【００３８】培養温度は、１０ないし４０℃、望ましく
は２５から３５℃である。

【００３９】上記操作によって採取した該物質中に含ま
れる不純物は、水洗、アルカリ洗浄、トルエンなどの有
機溶媒処理、次亜塩素酸ソーダによる処理、ラウリル硫
酸ソーダなどの界面活性剤による処理などを単独または
併用することによって除去される。

【００４０】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明を詳しく説明す
る。

【００４１】

【実施例１】ヘストリン−シュラム培地（ＨＳ培地）
（Ｄ−グルコース２．０ｇ、バクトペプトン（ディフコ
社製）０．５ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）０．５
ｇ、クエン酸０．１１５ｇ、リン酸水素二ナトリウム
０．２７ｇ、蒸留水１００ｍｌ、ｐＨ６．０）１００ｍ
ｌを３００ｍｌ容プラスチックキャップ付き広口三角フ
ラスコに分注し、アセトバクター・バストリアヌスＡＴ
ＣＣ １０２４５を植菌し、３０℃で１９２時間静置培
養をおこなった。

【００４２】培養終了後、培養液表面に生産された微生
物セルロースを濾過により取り出し、１％ＮａＯＨ水溶
液に浸漬し室温で２４時間除蛋白質処理を行い、次いで
１％酢酸溶液に浸漬し、中和処理をおこなった。

【００４３】中和処理後、十分水洗したのち乾燥し、そ
の乾燥物の重量を秤量し、生成微生物セルロース量とし
た。

【００４４】一方、グルコースを全く含まず、それ以外
の培地成分はＨＳ培地の２倍濃度の組成の培地５０ｍｌ
を３００ｍｌ容プラスチックキャップ付き広口三角フラ
スコに分注し、アセトバクター・バストリアヌスＡＴＣ
Ｃ １０２４５を植菌し、３０℃で静置培養をおこなっ
た。

【００４５】培養期間中、グルコース濃度４０％の液を
０．２６ｍｌ／ｈの速度で連続的に供給し、培養開始後
１９２時間目で培養を終了した。

【００４６】培養期間中のグルコース濃度を常法により
測定したところ、１．５ｇ／Ｌ以下に保持されていた。

【００４７】培養終了時の培養液量は１００ｍｌで、添
加されたグルコース量は積算すると約２ｇとなり、上記
の培養開始時からグルコースを添加して培養した場合と
同じであった。

【００４８】培養終了後、培養液表面に生成した微生物
セルロースを含む不溶性の膜を上記と同様の操作で除蛋
白質処理を行い、乾燥後、生成微生物セルロース量を測
定した。

【００４９】生成した微生物セルロースは、培養開始時
にグルコースを添加した場合には、０．２０ｇであった
のに対し、培養期間中グルコースを補添した場合には、
０．２４ｇであったが、消費グルコース量に対する微生
物セルロースの収率は、培養開始時にグルコースを添加
した場合には２０％であったのに対し、培養中グルコー
スを補添した場合には、２８％であった。

【００５０】

【実施例２】実施例１のＨＳ培地の積算グルコース量を
０．４ｇ／Ｌから８０ｇ／Ｌの範囲で図１に示すような
濃度に変えた培地１００ｍｌを３００ｍｌ容プラスチッ
クキャップ付き広口三角フラスコに分注し、アセトバク
ター・バストリアヌスＡＴＣＣ １０２４５を植菌し、
３０℃で１９２時間静置培養をおこなった。

【００５１】一方、実施例１と同様にＨＳ培地のグルコ
ース以外の培地成分を補添するグルコース液量に応じて
高濃度で加えて調製した培地を１００ｍｌから補添する
グルコース液の量を差し引いた量だけ３００ｍｌ容プラ
スチックキャップ付き広口三角フラスコに分注し、アセ
トバクター・バストリアヌスＡＴＣＣ １０２４５を植
菌し、３０℃で静置培養をおこなった。

【００５２】培養期間中、グルコース濃度４０％又は８
０％の液を供給し、１９２時間の培地量が１００ｍｌと
なり、同時に積算グルコース補添量が０．４ｇ／Ｌから
８０ｇ／Ｌの範囲となるような添加速度でグルコース液
を積算グルコース量が低い場合には間欠的に、積算グル
コース量が高い場合には連続的に供給し、培養開始後１
９２時間目で培養を終了した。

【００５３】培養終了後、培養液表面に生成した微生物
セルロースを含む不溶性の膜を実施例１と同様の操作で
除蛋白質処理を行い、乾燥後、生成微生物セルロース量
を測定した。

【００５４】生成した微生物セルロースおよび消費グル
コース量に対する微生物セルロースの収率の関係を図１
に示した。

【００５５】いずれのグルコース濃度でもグルコースを
培養開始時に添加したバッチ培養よりもグルコースを補
添した培養の方が、生成した微生物セルロースおよび消
費グルコース量に対する微生物セルロースの収率はいず
れも高かった。

【００５６】特に補添培養で培養期間中のグルコース濃
度が２ｇ／Ｌ以下となるように維持された積算グルコー
ス濃度が１０ｇ／Ｌとなる培養では、２５％以上の収率
が得られ、従来法では達し得なかった高い成績が得られ
た。

【００５７】

【実施例３】実施例１と同様にグルコースを全く含ま
ず、それ以外の培地成分はＨＳ培地の２倍濃度の組成の
培地５０ｍｌを分注した３００ｍｌ容プラスチックキャ
ップ付き広口三角フラスコ２本に、アセトバクターｓ
ｐ．ＤＡ（ＦＥＲＭ Ｐ−１２９２４）を植菌し、３０
℃で静置培養をおこなった。

【００５８】培養開始後、２本のフラスコへ酢酸濃度４
０％の液を連続的に添加したが、１本は０．２６ｍｌ／
ｈの速度で、他の１本は０．３９ｍｌ／ｈの速度で添加
した。培養は、１９２時間継続した。

【００５９】培養終了時の培養液量は１００ｍｌで、積
算酢酸量は約２ｇであった。

【００６０】培養期間中の酢酸濃度を常法により測定し
たところ、０．２６ｍｌ／ｈの速度では、ほぼ１．８ｇ
／Ｌ以下に保持されていたが、０．３９ｍｌ／ｈの速度
で酢酸を供給した場合には、培養終了時には、４．５ｇ
／Ｌであった。

【００６１】培養終了後、培養液表面に生成した微生物
セルロースを含む不溶性の膜を実施例１と同様の操作で
除蛋白質処理を行い、乾燥後、生成微生物セルロース量
を測定した。

【００６２】生成した微生物セルロースは、０．２６ｍ
ｌ／ｈの添加速度の時には、０．９ｇであったのに対
し、０．３９ｍｌ／ｈの供給速度の時には０．３ｇであ
った。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２において、培地中のグルコース濃度を
変化させ、バッチ培養とグルコース補添培養について、
生成した微生物セルロースの生成量を測定し、消費グル
コース量に対する微生物セルロースの生成収率を表した
図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アセトバクター属に属する微生物セルロ
   ース生産能を有する微生物を、微生物セルロース生産培
   地に接種し、静置培養して培地中に該物質を生成蓄積
   し、該物質を採取する方法において、培地の炭素源濃度
   を培養期間中、低い濃度に維持しながら培養することを
   特徴とする微生物セルロースの製造法。
2. 【請求項２】 請求項１の炭素源濃度が２ｇ／Ｌ以下で
   ある微生物セルロースの製造法。
3. 【請求項３】 請求項１の微生物が新菌株アセトバクタ
   ーｓｐ．ＤＡである微生物セルロースの製造法。