JPH05238948A - 高純度ラクトフェリシンの大量製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 広範囲の微生物に対して抗生物質とほぼ同等
の抗菌作用を有するラクトフェリシンを少なくとも９０
％の純度で、かつ少なくともグラム単位の量で製造する
方法を提供する。 【構成】 牛ラクトフェリンの酵素分解物であって、抗
菌性ペプチド（ラクトフェリシン）を含有するペプチド
混合物をブチル基を有するクロマトグラフ用担体または
陽イオン交換クロマトグラフ用担体に吸着させ、この担
体を洗浄し、抗菌性ペプチドを溶出し、溶出液を脱塩す
ることを特徴とする高純度ラクトフェリシンの大量製造
法。 【効果】 人および動物に有害な化学薬品（例えば有機
溶媒等）を使用しないので、安全に大量の高純度ラクト
フェリシンを製造することができ、複雑な装置等を使用
せずに簡便に高純度のラクトフェリシンを製造すること
ができ、更に所望の製造量に合わせて容易に規模を増減
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、広範囲の微生物に対
して抗菌作用を有するペプチドを、少なくとも９０％
（重量。以下特に断りのない限り同じ）の純度で、かつ
少なくともグラム単位の量で大規模に製造する方法に関
するものである。この発明の方法により製造される抗菌
性ペプチド（以下ラクトフェリシンと記載する）は、こ
の発明の発明者等が発見した２５アミノ酸残基からなる
新規なペプチドであり、ラクトフェリンの酵素加水分解
物中に存在し、広範囲の微生物に対して公知の抗生物質
（例えば、アミノベンジルペニシリン等）とほぼ同等の
抗菌作用を有し、極めて有用な物質である。

【０００２】なお、『ラクトフェリシン』は、本願出願
人が商標登録出願中の商標である。

【０００３】

【従来の技術】ラクトフェリンは、哺乳動物の乳汁、唾
液、涙、精液、種々の粘液等に存在する非ヘム、鉄結合
糖蛋白質であり、鉄吸着、細胞増殖促進、免疫調整作
用、および抗菌作用を有する多機能蛋白質である。牛ラ
クトフェリンは、乳業工場で日常的に取扱う生脱脂乳ま
たはチーズ・ホエーから容易に、かつ大量に得ることが
でき、商品として直ちに利用することができる。

【０００４】ラクトフェリシンは、この発明の発明者等
により牛ラクトフェリンの酵素加水分解物中から初めて
単離された新規なペプチドである（特願平２−２３８３
６４号。以下先願と記載する）。先願において牛ラクト
フェリンから単離されたラクトフェリシンは、例えばＰ
ｈｅ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌ
ｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−
Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅのア
ミノ酸配列を有している。ラクトフェリシンは、人およ
び動物の各種疾病の原因となるグラム陽性およびグラム
陰性の細菌、酵母等広範囲の微生物に対して低濃度で抗
菌作用を有する極めて有用な物質である。臨床上使用さ
れている抗生物質を含む他の大部分の抗菌剤は、人およ
び動物にとって異物である化学物質であるが、ラクトフ
ェリシンは、化学物質および化学的に合成されたアミノ
酸誘導体を含まない天然のペプチドであるから、人およ
び動物に対して健康的であり、かつ安全である。何故な
らば、ラクトフェリシンは、通常摂取している牛乳に含
まれるラクトフェリンの胃ペプシン分解により人の胃の
中で自然に生成されるからである。従って、ラクトフェ
リシンは安全な、かつ有効な抗菌剤として例えば、点眼
剤、口腔剤、化粧品、皮膚剤、臨床用食品、ペット用製
品等の多種多様な商品に利用でき、極めて大きな価値を
有している。

【０００５】上記のような多種多様な用途にラクトフェ
リシンを利用する場合、粗製ラクトフェリシンよりも少
なくとも９０％の純度を有するラクトフェリシン（以下
高純度ラクトフェリシンと記載する）が望ましい。何故
ならば高純度ラクトフェリシンは少量で所望の効果が得
られるので、粗製ラクトフェリシンを使用した場合より
も味、色調、匂い、組織、抗原性等の望ましくない影響
を最終製品に付与しないからである。更に、上記の望ま
しくない影響は粗製ラクトフェリシンに含まれているラ
クトフェリシン以外の成分によっても、もたらされる。

【０００６】ラクトフェリシンそのものが新規な物質で
あることから、高純度ラクトフェリシンの大規模な製造
法は、従来全く知られていない。僅かにこの発明の発明
者等が開発した逆相高速液体クロマトグラフ法による分
析的規模（ミリグラム単位の量）の精製方法が先願に開
示されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、そのよ
うな分析的規模の精製方法は、ラクトフェリシンの純度
測定には適しているものの、商業的規模で大量に高純度
ラクトフェリシンを製造する方法としては望ましくな
い。この発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされた
ものであり、少なくとも９０％の純度を有する高純度ラ
クトフェリシンを、少なくともグラム単位の量で大規模
に、しかも安全かつ簡便に製造するための新しい製造方
法を提供することを目的としている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、牛ラクトフェリンの酵素分解物
であって、抗菌性ペプチドを含有するペプチド混合物を
疎水性基を有するクロマトグラフ用担体または陽イオン
交換クロマトグラフ用担体に吸着させ、この担体を洗浄
し、抗菌性ペプチドを溶出し、溶出液を脱塩することを
特徴とする高純度ラクトフェリシンの大量製造法を提供
する。

【０００９】この発明の方法に使用する出発物質（ラク
トフェリシンを含有するペプチド混合物。以下同じ）
は、ラクトフェリシンを含有する如何なるペプチド混合
物であってもよく、例えば粗製牛ラクトフェリンまたは
牛ラクトフェリンを含有する牛乳蛋白質の混合物の酵素
加水分解物等であり、望ましくは純粋の牛ラクトフェリ
ンを酵素で加水分解したペプチド混合物である。

【００１０】ラクトフェリンの加水分解に使用する酵素
は、牛ラクトフェリンを分解してラクトフェリシンを生
成するプロテアーゼであれば、どのようなプロテアーゼ
であってもよいが、ペプシンが望ましい。出発物質を、
水または塩溶液（望ましくは水）に溶解し、pHを5.5 か
ら7.5 、望ましくは6.0 〜7.0 に調整し、不溶物がある
場合は遠心または濾過により除去する。出発物質調製の
望ましい態様を示せば、次のとおりである。

【００１１】脱脂乳またはホエーから単離した牛ラクト
フェリンを蒸留水に５％（W/V ）の濃度で溶解し、１規
定塩酸水溶液でpHを3.0 に調整する。ペプシンを基質に
対して約３％の割合で添加し、３７℃で４時間保持して
加水分解し、のち８０℃で１５分間加熱して反応を停止
させる（必ずしも反応を停止させなくてもよい）。次い
で１規定水酸化ナトリウム水溶液でpHを7.0 に調整し、
不溶物がある場合は遠心するか、または濾過するかの方
法によりそれらを除去する。得られたペプチド混合物を
含有する溶液をそのままラクトフェリシンの製造に利用
することもでき、常法により凍結乾燥または噴霧乾燥し
て粉末として保存することもできる。ラクトフェリシン
を含有する粉末のペプチド混合物は水または塩溶液に溶
解してラクトフェリシンの製造に利用することができ
る。

【００１２】ラクトフェリシンは次の２つの方法により
製造することができるが、第１の方法がより望ましい。
すなわち、この第１の方法は、ラクトフェリシンを含有
するペプチド混合物の溶液を疎水性基を有するクロマト
グラフ用担体（以下疎水性担体と記載する）に吸着さ
せ、疎水性担体を洗浄して非吸着ペプチドを除去し、ラ
クトフェリシンを一定のpH（例えばブチル基を有する疎
水性担体の場合、望ましくはpH4.8 〜5.2 ）で溶出し、
得られた溶出液を脱塩する。使用する疎水性担体として
は、ブチル基を有する例えばブチル・トヨパール（商
標。東ソー社製）、ブチル・セファロース（商標。ファ
ルマシア社製）等が望ましく、特にブチル・トヨパール
が望ましい。その他例えば、ヘキシル基、オクチル基、
フェニル基またはオクチルアミン基を有する疎水性担体
も同様にこの発明の方法に使用できることはいうまでも
ないことである。

【００１３】疎水性担体を水洗し、水で平衡化するが、
この工程は攪拌子付きタンク内、クロマトグラフ用カラ
ム内、またはこれらを組合わせて行う。望ましい態様
は、疎水性担体と出発原料との吸着を攪拌子付きタンク
内で行って液を集め、疎水性担体をクロマトグラフ用カ
ラムに充填し、集めた液を再度カラム中の疎水性担体に
吸着させる。出発物質を疎水性担体に吸着させ、のち疎
水性担体を水で洗浄し、疎水性担体に吸着していないペ
プチドを除去する。この工程で得られた疎水性担体に吸
着していないペプチドは、栄養価の高い副産物として利
用することができる。疎水性担体の洗浄を、蛋白質の存
在を示す洗浄水の２８０nmにおける吸光値が0.06以下に
なるまで継続する。

【００１４】水で疎水性担体を洗浄後、緩衝液を通液す
る。疎水性担体の洗浄を緩衝液で行うこともできる。次
いで稀酸水溶液を通液して疎水性担体から吸着している
ラクトフェリシンを溶出する。ラクトフェリシンは、一
定のpH例えばブチル基を有する疎水性担体の場合4.5 か
ら5.5 、望ましくは4.8 から5.2 に調整された緩衝液に
よっても選択的に溶出することができる。疎水性担体に
吸着されている成分は、より高い酸濃度の緩衝液により
溶出され、この中に若干のラクトフェリシンが含有され
ているので高い純度を要しないラクトフェリシン含有製
品に利用することができる。全ての吸着物を除去した疎
水性担体を水で充分洗浄し、再利用することができる。

【００１５】使用する酸は、塩酸、硫酸、リン酸、酢
酸、クエン酸等であり、塩酸が特に望ましい。酸の最終
濃度は１〜３０ミリモル、望ましくは１０ミリモルであ
る。使用する緩衝液は、第一リン酸ナトリウム−第二リ
ン酸ナトリウム、第一リン酸カリウム−第二リン酸カリ
ウム、第一リン酸ナトリウム−第二リン酸カリウム、第
一リン酸カリウム−第二リン酸ナトリウム、クエン酸−
第二リン酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナトリウム等であ
り、クエン酸−第二リン酸ナトリウムが望ましい。緩衝
液の濃度は、２０〜２００ミリモルであり、１００〜２
００ミリモルが望ましい。また緩衝液のpHは、例えばブ
チル基を有する疎水性担体の場合6.5 から7.5 であり、
7.0 が望ましい。

【００１６】次いで溶出液は後述する方法により脱塩さ
れる。ラクトフェリシンを製造する第２の方法は、次の
とおりである。ラクトフェリシンを含有するペプチド混
合物の溶液を陽イオン交換クロマトグラフ用担体（以下
陽イオン担体と記載し、この陽イオン担体と上記疎水性
担体とをまとめて担体と記載することがある）に吸着さ
せ、陽イオン担体を洗浄して非吸着ペプチドを除去し、
ラクトフェリシンを塩溶液で溶出し、溶出液を脱塩す
る。使用する陽イオン担体としては、カルボキシメチル
基を有する例えばカルボキシメチル・トヨパール（商
標。東ソー社製）、カルボキシメチル・セファロース
（商標。ファルマシア社製）、カルボキシメチル・バイ
オ・ゲルＡアガロース（商標。バイオラッド・ラボラト
リー社製）、カルボキシメチル・セルロース（バイオラ
ッド・ラボラトリー社製）等が望ましく、特にカルボキ
シメチル・トヨパール（商標。東ソー社製）が望まし
い。陽イオン担体を緩衝液で洗浄し、緩衝液で平衡化す
る。

【００１７】出発物質を陽イオン担体に吸着させた後、
陽イオン担体を緩衝液で充分洗浄し、陽イオン担体に吸
着していないペプチドを除去する。陽イオン担体に吸着
していないペプチドは、栄養価の高い副産物として利用
することができる。陽イオン担体の洗浄は、蛋白質の存
在を示す洗浄緩衝液の２８０nmにおける吸光値が0.06以
下になるまで継続する。

【００１８】次いで塩を含む緩衝液を通液して吸着して
いるラクトフェリシンを陽イオン担体から溶出する。ラ
クトフェリシンは、例えばカルボキシメチル基を有する
陽イオン担体の場合１モルから４モルの最終塩濃度、望
ましくは２モル〜４モルに調整した緩衝液により選択的
に溶出することができる。使用する塩は、酢酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、塩化カリウム、塩化ナトリウ
ム等であり、酢酸アンモニウム、または塩化アンモニウ
ムが望ましい。酢酸アンモニウムおよび塩化アンモウニ
ウムは水に溶解して、塩化カリウムおよび塩化ナトリウ
ムは後述する緩衝液に溶解して、それぞれ使用する。

【００１９】使用する緩衝液は、第一リン酸ナトリウム
−第二リン酸ナトリウム、第一リン酸カリウム−第二リ
ン酸カリウム、第一リン酸ナトリウム−第二リン酸カリ
ウム、第一リン酸カリウム−第二リン酸ナトリウム、ク
エン酸−第二リン酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナトリウ
ム、グリシン−水酸化ナトリウム等であり、第一リン酸
ナトリウム−第二リン酸ナトリウム、第一リン酸カリウ
ム−第二リン酸カリウムが望ましい。緩衝液の最終濃度
は、例えばカルボキシメチル基を有する陽イオン担体の
場合１０〜２００ミリモルである。その他の態様は上記
第１の方法と実質的に同一である。

【００２０】次いで溶出液を後述する方法により脱塩す
る。溶出液の脱塩は、次の２つの方法により行うことが
できるが、第１の方法が望ましい。すなわち、この第１
の方法は、ラクトフェリシンを含有する溶出液のpHを７
〜８に調整し、上記疎水性担体に吸着させ、水で洗浄し
て塩を除去する。次いで稀酸水溶液でラクトフェリシン
を溶出し、最終製品を得る。疎水性担体を、水で充分洗
浄し、再利用することができる。

【００２１】第２の方法は、ラクトフェリシンを含有す
る溶出液を公知の方法（例えば電気透析法、限外濾過法
等）で脱塩する方法である。これらの方法を実施する場
合、例えば分子量分画３０００以下の半透膜またはホロ
ファイバー・フィルター・カートリッジを使用するのが
望ましい。これらは、塩を透過して除去し、ラクトフェ
リシン透過しない性質を有している。

【００２２】脱塩されたラクトフェリシン溶液は、必要
に応じて常法（例えば、真空乾燥、凍結乾燥、噴霧乾燥
等）により粉末にすることもできる。この発明の方法に
おいて、得られるラクトフェリシンの量は出発物質に含
まれているラクトフェリシンの量および使用する担体の
量にのみ依存している。この発明の方法においては、１
００mlの担体を用いて約0.3 〜0.5 ｇのラクトフェリシ
ンが得られ、収量および純度が低下することなく、かつ
担体を再利用できるので、所望の規模（例えば数１００
ｇまたは数１００kg）に極めて容易にスケール・アップ
することができる。

【００２３】以上のようにして得られたラクトフェリシ
ンは、少なくとも９０％の純度を有し、先願に開示され
たて分析規模の方法により製造されたラクトフェリシン
と同様広範囲の微生物に対して抗菌作用を有している。
次に試験例を示してこの発明の方法をさらに詳しく説明
する。 （試験例１）この試験は、この発明の方法により製造し
たラクトフェリシンの純度を調べるために行った。

【００２４】実施例１と同一の方法により調製した試料
を逆相高速液体クロマトグラフ法により分画した。ＴＳ
Ｋ−ＧＥＬ １２０Ｔ（6.0 ×１５０mm。東ソー社製）
カラムに試料溶液を通液し、溶出液Ａ（0.05％トリフル
オロ酢酸）：溶出液Ｂ（９０％アセトニトリルの0.05％
トリフルオロ酢酸液）８０：２０の混合液を１０分間0.
8ml ／分の流速で通液し、３０分を要して両溶出液の比
率を４０：６０までリニア・グラジエントで変更して同
じ流速で通液した。溶出液の２８０nmにおける吸光度を
連続的に測定してプリンタで記録し、溶出したペプチド
の相対的濃度を記録されたペプチドのピークから算出し
て試験した。

【００２５】この試験の結果は、図１に示したとおりで
ある。図１の縦軸は吸光度を、横軸は時間（分）を、そ
れぞれ示している。図１から明らかなようにラクトフェ
リシンは約２２分前後に、尖鋭なピークとして溶出さ
れ、ラクトフェリシンのピークの前後にわずかに不純物
がみとめられ、この試料のラクトフェリシン濃度は、９
０％であった。この結果からこの発明の方法により高純
度ラクトフェリシンを製造し得ることが確認された。 （試験例２）この試験は、この発明の方法において使用
する洗浄用緩衝液、洗浄用緩衝液のpH、溶出用緩衝液お
よび溶出用緩衝液のpHの条件を決定するために行った。

【００２６】参考例と同一の方法により製造した出発物
質2.0 ｇを５％（W/V ）の濃度で水に溶解した。これと
は別にブチル・トヨパール（商標。東ソー社製）６５０
Ｍを水で洗浄し、平衡化した。疎水性担体5.0ml に出発
物質１００mgの割合で、上記溶液を疎水性担体に吸着さ
せ、表１に示す洗浄用緩衝液および溶出用緩衝液の組合
わせで疎水性担体を洗浄し、のちラクトフェリシンを溶
出し、ラクトフェリシンの収量および純度を次の方法に
より測定して試験した。 １）ラクトフェリシンの収量 ラクトフェリシンの収量は、次式により算出した。

【００２７】Ｙ＝Ａ／2.203 ×Ｖ ここでＹは、ラクトフェリシンの収量、Ａは溶出された
ラクトフェリシン溶液の２８０nmにおける吸光度、Ｖは
溶出されたラクトフェリシン溶液の総容量、2.203 は純
ラクトフェリシン標準溶液（1.00mg／ml）の吸光度、を
それぞれ示す。 ２）ラクトフェリシンの純度 試験例１と同一の逆相高速液体クロマトグラフ法により
測定した。

【００２８】表１から明らかなようにラクトフェリシン
の最高の収量および純度は溶出用緩衝液のpHを4.8 から
5.2 、望ましくは5.0 に調整したときに得られた。また
pH7.0 のマッキルベイン緩衝液、第一リン酸ナトリウム
−第二リン酸ナトリウム、第一リン酸カリウム−第二リ
ン酸カリウム、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液もこの発明
に使用できる。

【００２９】なお、表１に示した緩衝液以外の緩衝液に
ついてもほぼ同様な結果が得られた。

【００３０】

【表１】

【００３１】（試験例３）この試験は、この発明の方法
において脱着に使用する酸溶液について調べるために行
った。参考例と同一の方法により製造した出発物質（ラ
クトフェリシンを含有するペプチド混合物）2.0 ｇを５
％（W/V ）の濃度で水に溶解した。これとは別にブチル
・トヨパール（商標。東ソー社製）６５０Ｍをマッキル
ベイン緩衝液（0.1 モル酢酸と0.2 モル第二リン酸ナト
リウムとを１７７：８２４の比率で混合。pH7.0 ）で洗
浄し、平衡化した。純粋のラクトフェリシン４mgをマッ
キルベイン緩衝液に溶解し、疎水性担体5.0ml に吸着さ
せ、水で洗浄し、のち表２に示す酸溶液１５mlでラクト
フェリシンを溶出し、ラクトフェリシンの回収率を次式
により算出して試験した。

【００３２】 Ｒ（％）＝１００×（Ａ／2.203 ×Ｖ）／４ ここでＲは百分率で表したラクトフェリシンの回収率、
Ａは溶出されたラクトフェリシン溶液の２８０nmにおけ
る吸光度、Ｖは溶出されたラクトフェリシン溶液の総容
量、2.203 は純ラクトフェリシン標準溶液（1.00mg/ml
）の吸光度、４は最初に疎水性担体に吸着させたラク
トフェリシンの量、をそれぞれ示す。

【００３３】この試験の結果は、表２に示したとおりで
ある。ラクトフェリシンは酸濃度１〜３０ミリモルで溶
出され、１０ミリモル以上で高い回収率を示したが、最
終製品中に含有される酸の量を少なくするためには、１
０ミリモルの濃度が望ましいことが明らかとなった。ま
たこの発明の方法においては塩酸、硫酸、リン酸、酢
酸、クエン酸が使用し得ることが判明した。なお、脱塩
の場合にもほぼ同様の結果が得られた。

【００３４】

【表２】

【００３５】（試験例４）この試験は、陽イオン担体か
らのラクトフェリシン溶出液の塩類およびその濃度を調
べるために行った。カルボキシメチル・トヨパール（商
標。東ソー社製）６５０Ｓを用いたこと、１０ミリモル
第一リン酸カリウム−第二リン酸カリウム緩衝液（pH7.
8 ）で陽イオン担体を洗浄して平衡化したこと、同じ緩
衝液に溶解したラクトフェリシンを陽イオン担体に吸着
させたこと、および表３に示す塩溶液１５mlでラクトフ
ェリシンを溶出したことを除き、試験例３と同一の方法
により試験を行った。

【００３６】この試験の結果は表３に示したとおりであ
る。表３から明らかなようにラクトフェリシンは１〜４
モルの塩溶液で溶出されたが、２モル以上の濃度で高い
回収率が得られた。試験した酢酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、塩化ナトリウム、および塩化カリウムのい
ずれもラクトフェリシンの溶出に使用できることが判明
した。

【００３７】

【表３】

【００３８】（参考例）脱脂乳から分離した牛ラクトフ
ェリン（森永乳業社製。純度約９０％）2.0kgを５％（W
/V)の濃度で蒸溜水に溶解し、１規定塩酸を添加してpH
を3.0 に調整した。結晶ペプシン（ディフコ社製）を基
質の３％の割合で添加し、３７℃で４時間加水分解し、
のち８０℃に１５分間加熱してペプシンを失活させ、１
規定水酸化ナトリウムを添加してpHを7.0 に調整し、不
溶物を瀘過して除去し、噴霧乾燥し、ラクトフェリシン
を約４％含有する粉末状のペプチド混合物約1.9kg を得
た。 次に実施例を示してこの発明をさらに詳細かつ具
体的に説明するが、この発明は以下の実施例に限定され
るものではない。

【００３９】

【実施例】

実施例１ 参考例と同一の方法により製造した出発物質５０ｇを５
％（W/V ）の濃度で蒸溜水に溶解した。約４００mlのカ
ルボキシメチル・トヨパール（商標。東ソー社製）６５
０Ｓを１００ミリモル第一リン酸ナトリウム−第二リン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.8 ）で充分洗浄して平衡化し
た。攪拌機付き容器内で出発物質の水溶液を陽イオン担
体に吸着させ、液を分離し、陽イオン担体をカラム（長
さ１０cm、直径８cm）に充填し、分離した液を再度カラ
ムに通液し、のち洗浄液の２８０nmにおける吸光度が0.
06以下になるまで２０ml/ 分の流速で上記緩衝液を用い
てカラムを充分洗浄した。次いで２モル酢酸アンモニウ
ム（pH7.8 ）をカラムに通液し、ラクトフェリシンを溶
出し、約５００mlのブチル・トヨパール（商標。東ソー
社製）６５０Ｍを充填したカラム（長さ１０cm、直径８
cm）に溶出液を通液し、疎水性担体を５０００mlの水で
洗浄して緩衝液の塩を除去し、のち１０ミリモル塩酸を
カラムに通液してラクトフェリシンを溶出し、凍結乾燥
し、粉末状のラクトフェリシン約1.4gを得た。得られた
ラクトフェリシンを試験例１と同一の方法により試験し
た結果、純度は９２％であった。 実施例２ 参考例と同一の方法により製造した出発物質２５６ｇを
５％（W/V ）の濃度で蒸溜水に溶解した。約１０００ml
のブチル・トヨパール（商標。東ソー社製）６５０Ｍを
水で充分洗浄して平衡化した。攪拌機付きタンク内で出
発物質を疎水性担体に吸着させ、液を分離し、疎水性担
体をカラム（長さ２２cm、直径８cm）に充填し、分離し
た液を再度カラムに通液し、のち洗浄液の２８０nmにお
ける吸光度が0.06以下になるまで１００ml/ 分の流速で
水を用いてカラムを充分洗浄した。次いで１０ミリモル
塩酸をカラムに通液し、ラクトフェリシンを溶出し、等
量のマッキルベイン緩衝液（0.1 モル酢酸１７７：0.2
モル第一リン酸ナトリウム８２４の混合物。pH7.0 ）と
混合し、疎水性担体に吸着させ、２０００mlの同じ緩衝
液で洗浄し、３０００mlのマッキルベイン緩衝液（0.1
モル酢酸４８５：0.2 モル第一リン酸ナトリウム５１５
の混合物。pH5.0 ）でラクトフェリシンを溶出した。疎
水性担体を１０ミリモル塩酸および水で再生し、１規定
水酸化ナトリウム溶液で溶出液のpHを7.0 に調整し、再
生したカラムに溶出液を通液し、１０ｌの水で洗浄して
緩衝液の塩を除去し、のち１０ミリモル塩酸をカラムに
通液してラクトフェリシンを溶出し、凍結乾燥し、粉末
状のラクトフェリシン約3.5gを得た。得られたラクトフ
ェリシンを試験例１と同一の方法により試験した結果、
純度は９８％であった。 実施例３ 参考例と同一の方法により製造した出発物質２３３ｇを
５％（w/V ）の濃度で蒸溜水に溶解したこと、約１１０
０mlのブチル・トヨパール（商標。東ソー社製）６５０
Ｍを用いたこと、および脱塩に限外透析装置（ロミコン
社製、モデル1.0 −４３−ＰＭ１、分子量分画１０００
のホロファイバー・フィルター・カートリッジ装着）を
用いたことを除き、実施例２と同一の方法により粉末状
のラクトフェリシン約1.6 ｇを得た。得られたラクトフ
ェリシンを試験例１と同一の方法により試験した結果、
純度は９８％であった。 実施例４ 参考例と同一の方法により製造した出発物質６００ｇを
５％（W/V ）の濃度で蒸溜水に溶解した。約３０００ml
のブチル・トヨパール（商標。東ソー社製）６５０Ｍを
水で充分洗浄して平衡化した。攪拌機付きタンク内で出
発物質を疎水性担体に吸着させ、液を分離し、疎水性担
体をカラム（長さ１０cm、直径２０cm）に充填し、分離
した液を再度カラムに通液し、のち洗浄液の２８０nmに
おける吸光度が0.06以下になるまで４００ml/ 分の流速
で水を用いてカラムを充分洗浄した。次いで１０ミリモ
ル塩酸をカラムに通液し、ラクトフェリシンを溶出し、
等量のマッキルベイン緩衝液（0.1 モル酢酸１７７：0.
2 モル第一リン酸ナトリウム８２３の混合物。pH7.0 ）
と混合し、疎水性担体に吸着させ、６ｌの同じ緩衝液で
洗浄し、９ｌのマッキンベイン緩衝液（0.1 モル酢酸４
８５：0.2 モル第一リン酸ナトリウム５１５の混合物。
pH5.0 ）でラクトフェリシンを溶出した。疎水性担体を
１０ミリモル塩酸および水で再生し、１規定水酸化ナト
リウム溶液で溶出液のpHを7.0 に調整し、再生したカラ
ムに溶出液を通液し、３０ｌの水で洗浄して緩衝液の塩
を除去し、のち１０ミリモル塩酸をカラムに通液してラ
クトフェリシンを溶出し、凍結乾燥し、粉末状のラクト
フェリシン約10.5ｇを得た。得られたラクトフェリシン
を試験例１と同一の方法により試験した結果、純度は９
９％であった。

【００４０】

【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って次のような効果が得られる。 （１）人および動物に有害な化学薬品（例えば有機溶媒
等）を使用しないので、安全に大量の高純度ラクトフェ
リシンを製造することができる。 （２）複雑な装置等を使用せずに簡便に高純度のラクト
フェリシンを製造することができる。 （３）所望の製造量に合わせて容易に規模を増減でき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明の方法により製造したラクトフェリシ
ンの分析例を示す高速液体クロマトグラムである。

フロントページの続き (72)発明者 高瀬 光徳 埼玉県大宮市南中丸138−10 (72)発明者 ウェイン ベラミー 神奈川県座間市東原３−22−６ ヴィラさ がみ野ウェストＣ−５ (72)発明者 萩原 朋之 神奈川県横浜市旭区希望ケ丘118 森永希 望ケ丘寮 (72)発明者 松熊 宏幸 神奈川県横浜市旭区希望ケ丘118 森永希 望ケ丘寮

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 牛ラクトフェリンの酵素分解物であっ
   て、抗菌性ペプチドを含有するペプチド混合物を疎水性
   基を有するクロマトグラフ用担体または陽イオン交換ク
   ロマトグラフ用担体に吸着させ、この担体を洗浄し、抗
   菌性ペプチドを溶出し、溶出液を脱塩することを特徴と
   する高純度ラクトフェリシンの大量製造法。
2. 【請求項２】 疎水性基を有するクロマトグラフ用担体
   が、ブチル・トヨパール（商標）またはブチル・セファ
   ロース（商標）である請求項１記載の高純度ラクトフェ
   リシンの大量製造法。
3. 【請求項３】 ラクトフェリシンを吸着した疎水性基を
   有するクロマトグラフ用担体を、水または緩衝液で洗浄
   し、稀酸または緩衝液で溶出する請求項１または請求項
   ２記載の高純度ラクトフェリシンの大量製造法。
4. 【請求項４】 陽イオン交換クロマトグラフ用担体が、
   カルボキシメチル・トヨパール（商標）、カルボキシメ
   チル・セファロース（商標）、カルボキシメチル・バイ
   オ・ゲルＡアガロース（商標）、およびカルボキシメチ
   ル・セルロースからなる群より選択される請求項１記載
   の高純度ラクトフェリシンの大量製造法。
5. 【請求項５】 ラクトフェリシンを吸着した陽イオン交
   換クロマトグラフ用担体を、２モル以上の濃度の塩化ア
   ンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化ナトリウム、およ
   び塩化カリウムからなる群より選択される塩を含む緩衝
   液で溶出する請求項１または請求項４記載の高純度ラク
   トフェリシンの大量製造法。
6. 【請求項６】 脱塩を、電気透析、分子量分画３０００
   以下の半透膜または分子量分画３０００以下のホロファ
   イバー・フィルターにより行う請求項１ないし請求項５
   記載の高純度ラクトフェリシンの大量製造法。
7. 【請求項７】 脱塩を、疎水性基を有するクロマトグラ
   フ用担体に溶出液を吸着させ、水で洗浄し、次いで稀酸
   水溶液で抗菌性ペプチドを溶出することにより行う請求
   項１ないし請求項５記載の高純度ラクトフェリシンの大
   量製造法。