JPH0491142A - 改質したセルロース多孔担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な構造を有する改質セルロース多孔担体
に関する。より詳細に述べると、触媒、酵素、生理活性
物質の担体やイオン交換体、吸着体の原料、及び菌体、
酵母、動植物細胞培養用の各担体、マイクロキャリア等
に好適な構造を持つ改質されたセルロース多孔担体に関
する。

〔従来の技術］ ポリアニオンは、酵素固定、菌体固定、酵母固定、およ
び動植物細胞の固定用マトリクスとして広く使用されて
いる。特に近年、バイオプロセス工学の発展に伴い、ハ
ンドリング性の高い固定化担体の需要が大幅に拡大しつ
つある。

固定手法は主に、ポリアニオンのｍ個アルカリ金属塩を
水溶液とし、固定の対象となる酵素や細胞を添加混合し
た後、多価金属塩、例えばＣａＣｌ２Ａ１．ＧＥ、の架
橋固定他剤水溶液中でゲル化させ包括固定するものであ
る。

別法として、多価金属塩の代わりにポリカチオンを用い
てポリアニオンとの間にポリイオンコンプレックスを形
成し不溶ゲル化させ包括固定する手法も報告されている
。

例えば、特公昭５９−９１５４号公報に記載されている
方法によれば、ワイン酵母の水分７５％を含む湿潤体約
２４ｇを約１，５％のアルギン酸ナトリウム、カリウム
又はアンモニウム塩の水溶液約３６ｇ中に！！！濁させ
る。この懸濁液を架橋液である０、０５ｍｏｌ／ｌのＡ
！塩液中にノズルを通して滴下すると径約１閣のアルギ
ン酸塩固定化酵母包括体粒子ゲル２２ｇが得られる。

また、特開昭６３−７９５８７号公報に記載されている
方法によれば、カチオンポリマーとアニオンポリマーと
を、該ポリマー中のカチオン席とアニオン席の濃度比が
０．５〜１．５の範囲で水溶液中で反応させることによ
り、肝実質細胞等の長期培養に適した基材を得る。

特開平１−２１８５８５号公報には、壁付着性細胞を培
養槽中で培養する際、予め播種時にポリアクリル酸ナト
リウム０．００１〜０．０１重量％、キトサン０．０１
〜０．０５重量％とから成る凝集剤を添加し、細胞を凝
集固定する方法が開示されている。

一方、両手法を組合わせた技術も報告されている。特開
昭５９−７４９８４号公報に記載されている方法におい
ては、アルギン酸ナトリウムの水溶液に酵素もしくは微
生物、およびポリアルキレンイミン、キトサンあるいは
これらの中和塩等の水溶性の多カチオン性高分子化合物
を添加混合し、次いでこれをカルシウムイオンまたはア
ルミニウムイオンを含有する水溶液と接触させてゲル化
させ、所望により得られたゲルを多官能性の架橋剤と反
応させて表面処理を行ない、固定化酵素もしくは固定化
微生物を得ている。

しかしながら、これらの固定化ゲルは、形状の制御が難
しい、初期強度が低いうえに経時的に強度低下する等の
欠点がある。

形状の制御を容易にする対策としては、特開昭５８−１
３３９１号公報に合成繊維、天然の繊維、布、金網、セ
ルロース膜、ラシヒリング等の支持体を導入することが
提案され、また、特開昭６３−２０９５８２号公報には
、付着性動物細胞をアルギン酸カルシウムゲル粒子中に
包括固定する際に該細胞と共に固体微粒子を含有させる
ことが提案されている。

強度を向上させる対策としては、ポリアニオン水溶液に
あらかじめ、重合性モノマーを混合しておき、成型後に
重合し補強してゲル自体の強度を上げる方法（特開昭６
１−１２４３８５号公報、特公平１−９０７３号公報、
特開昭６１−２１６６８８号公報）が提案されている。

その他、固定化ゲルを使用する培養液中のリン源をグル
コース−１−リン酸に変更することにより固定化ゲルの
経時的強度低下を防ぐ方法（特開平１−２２２７７２号
公報）が知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

ポリアニオンにて動植物細胞を包括固定する場合を例に
とると、動植物細胞は固定化ゲルの分子の網目で完全に
おおわれてしまうため、外部の培養液から培地成分・酸
素を取り込むことおよび老廃物を外部に放出することを
阻害される。その結果、細胞生育・増殖に支障をきたす
、従って、ゲル内部への培養液の流出入を改善するため
に、通常ゲル分子の網目間隔を広げる。すなわち、ゲル
中のポリアニオン濃度を下げるが、この場合、ゲル強度
が低下するので実用上満足できる手段ではない。

特に培養液の粘度が高い場合には、流出入抵抗の小さい
大孔径多孔担体が適しており、その登場が望まれていた
。

本発明者は、従来の問題点を解決し、膜で隔てられた径
が約２ｉｍより大きい多数の空胞を有し、該空砲は隣接
した空砲との間を隔てる膜の開口部によりたがいに連通
した連続孔構造を形成していることを特徴とする改質さ
れたセルロース多孔体を開発し、さきに特許出願を行っ
た（特願平１−２７５９２号）。

ところで、均一充填カラムが求められる場合、通常は担
体に粒子が用いられるが、糸状やフィルム状の多孔体で
外部表面積のみならず、内部表面積をも使える有効表面
積の大きなものであれば、使用条件により連続体として
の特徴を生かしたハンドリング性良好な分離吸着担体に
なる。

また、付着性細胞の大量培養に用いられる細胞培養担体
は、マイクロキャリアと呼ばれ、従来、粒子の表面に細
胞を付着させることにより培養濃度を１０６セル／ｄま
で向上させてきたが、粒子内部に細胞が侵入付着可能な
大孔径多孔粒子があれば、粒子内部に細胞を保持するこ
とによってマイクロキャリア同志の衝突による細胞の表
面からの脱落という問題を解決できると共に有効付着表
面積の飛躍的な増大により培養濃度を更に向上させるマ
イクロキャリアを得ることができる。しかしながら、セ
ルロース表面には細胞が付着しにくいため、効果的なマ
イクロキャリアを得るためには、細胞付着と増殖に適す
る改質が望まれていた。

例えば、動物の生体を構成する組織において、細胞外マ
トリクスは、主にコラーゲンとグリコサミノグリカンで
構築されているが、グリコサミノグリカンはアミノ基を
含んでいるものの一種のポリアニオンであり、細胞付着
と増殖に好ましい影響をもたらしている。しかるに、従
来の固定化担体におけるポリアニオンゲルでは、強度、
外液の流出入抵抗、形状制御等における問題点があった
。

本発明の目的は、上記事実に着目し、従来のセルロース
多孔担体をポリアニオンで改質することにより、また、
必要に応じてさらに、ポリカチオンまたは多価金属イオ
ンで処理することにより、各種の担体その他多くの用途
において、より好適な特性を付与せしめたセルロース多
孔担体を提供するにある。

〔課題を解決するための手段］ 本発明が提供する改質セルロース多孔体は、膜で隔てら
れた径が約２μより大きい多数の空胞を有し、該空胞は
隣接した空胞間を隔てる膜の開口部によりたがいに連通
した連続孔構造を形成して成ることを特徴とする。上記
のように、ポリアニリンまたはその塩で処理されたセル
ロースは、必要に応じて、さらにポリカチオンまたは多
価金属イオン処理を施してポリイオンコンプレックス化
または多価金属塩化されていることが好ましい。

本発明の改質セルロース多孔担体は、セルロース溶液ま
たはセルロース誘導体溶液からセルロース多孔体を製造
する方法において、その製造工程の途中において、セル
ロース溶液またはセルロース誘導体溶液中にポリアニオ
ンをブレンドまたは含浸することによって製造すること
ができ、または−旦セルロース多孔体を形成した後にポ
リアニオンをコートもしくは含浸したりまたはポリアニ
オンで化学的に修飾することによって製造できる。

セルロース多孔体自体は、特開昭６４−４３５３０号公
報記載の方法、すなわち、セルロース溶液を望みの形状
に成形しつつ溶液の固化温度以下に冷却して凍結させ、
次いで溶媒を抽出除去するかもしくは溶解能力を失わせ
ることを特徴とする方法、またはセルロース誘導体溶液
を望みの形状に成形しつつ溶液の固化温度以下に冷却し
て凍結させ、次いで、溶媒を抽出除去するかもしくは溶
解能力の失活とセルロースの再生を同時または逐次的に
行なうことを特徴とする方法によって製造される。

上記セルロース多孔体の製造方法の要点は、セルロース
溶液あるいはセルロース誘導体溶液が凍結固化する際、
溶媒またはその構成成分（以下、「溶媒等」と記す）の
微結晶が多数形成され、溶解していたセルロースあるい
はセルロース誘導体が溶媒微結晶間隙に濃縮分離する一
種の相分離現象を多孔化手段として応用した、新規な方
法によって、従来得られなかった孔径が約２μｍより大
きいセルロース多孔体の提供に成功したことにある。

該セルロース多孔体の好ましい態様の一つとしては、連
通した空胞の連続孔が表面から垂直に内部に達する構造
であることを特徴とするものがある。

該セルロース多孔体の空胞の大きさは、径が約２μより
大きく、好ましくはその大部分が５ｐ以上、更に好まし
くは１０ｎ以上である。これより小さいときは、セルロ
ース多孔体中での流体や物質の自由な移動が実現されず
、その用途は制約される。空胞の大きさの上限は、特に
制限されるものではなく、使用目的や担体の強度等から
選ばれるが、通常約５００ｐｍ以下、好ましくは２００
１ｍ以下である。

空胞隔膜の厚みや構造に関しては、各空胞を互いに連結
するための連結口が開口されていることの他は特に制限
されるものではないが、該開口の大きさは、空砲の径に
比べ余り小さすぎないことが好ましく、およそ空胞径の
１／３０程度以上が望ましい。開口があまりに大きすぎ
ると粒子構造体の強度が不足して使用時の破壊につなが
り好ましくないため、空胞径の約３７４程度以下、特に
約２７３程度以下であることが望ましい。また、空胞隔
膜の厚さはセルロースまたはその誘導体の溶液の濃度、
空胞径等によって異なるが、空胞径の１７４以下、好ま
しくは１／１０以下であり、場合によっては１／３０以
下のものさえ可能である。

隔膜には上記の大口径の開口部の他に、更に微細な孔構
造がみられることもあるが、特に発明の目的を害さぬか
ぎり、むしろ望ましい実に１１！様である。

本発明の改質セルロース多孔担体の代表的用途は細胞培
養用多孔担体である。改質セルロース多孔体を細胞培養
用多孔担体として使用する場合、空胞の大きさは上述の
ように径が約２ｍより大、好ましくは５ｎ以上、さらに
好ましくは１０ｐｍ以上である。空胞の径が約２μｍよ
り小さいと多孔担体中での細胞や培養液の自由な移動が
実現できない。

空胞の大きさの上限は、特に制限されるものではないが
、現状のマイクロキャリアよりも有効表面積を大きくす
るため、２００趨以下に設定され、通常１００ｎ以下、
好ましくはその大部分が５０１ｔｍ以下、更に好ましく
は３０１１ｍ以下である。

細胞培養用多孔担体として使用する場合、空胞の開口の
大きさは、空胞の径に比べ余り小さすぎないことが好ま
しく、細胞の侵入を可能にするため１ｉ！ｍ以上または
、空胞径の１ノ３０程度以上が望ましい。開口があまり
に大きすぎると粒子構造体の強度が不足して使用時の破
壊につながり好ましくないため、空胞径の約３７４程度
以下、特に約２７３程度以下であることが望ましい。

隔膜には上記の大口径の開口部の他に、更に微細な孔構
造がみられることもあるが、培養液の流通を促進するた
めむしろ望ましい、細胞培養用多孔担体の空胞を隔てる
膜の厚さは前述のように空胞径の１／４以下、または５
ｐ以下、好ましくは３−以下、更に好ましくは１１１ｍ
以下である。

本発明の改質セルロース多孔担体からなる細胞培養用多
孔担体は培養担体の内部にも細胞接着に有効な表面積を
持ちかつ内部に細胞が自由に侵入できるような表面から
内部に連通した連続孔構造を持つことを特徴としている
。

多孔担体を構成する膜は、実質的にセルロースおよびポ
リアニオンより形成されている。ここでセルロースは、
バルブ、リンター、故紙、細菌産生セルロース、再生セ
ルロースなどのいずれ芒かを原料とするものであり、特
に制限されるものではない。

多孔担体を形成するセルロースはこれら原料を後述の方
法で溶解し、再析出または再生させたものであって、平
均重合度は特に制限されるものではない、平均重合度は
通常１００〜１０００程度のものが好ましいが、細菌産
生セルロースのように更に高重合度のものでも、特に発
明の目的を害さぬかぎり、むしろ望ましい実施態様であ
る。

多孔担体を形成するセルロース中にヘミセルロースある
いは、セルロース加水分解物及び酸化分解物の少量が混
在していても、それが本発明の目的を損なわないかぎり
許される。

ポリアニオンとしては、多糖類系、ポリアミノ酸系、合
成高分子系ポリアニオン等が挙げられる。

それらの具体例としては、アルギン酸、硫酸セルロース
、カルボキシメチルセルロース、デキストラン硫酸、ペ
クチン、ペクチン酸等の多糖類、その他グリコサミノグ
リカンとしてヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デル
マタン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケラタン硫酸、
ケラタンポリ硫酸等のグリコサミノグリカンに属する多
１／Ｒ類、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸等の
ポリアミノ酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポ
リイタコン酸、ポリマレイン酸、ポリスチレンスルホン
酸等またはそれらを構成するモノマーと他のビニルモノ
マーとの共重合体等の合成高分子があるが、これらに限
定されるものではなく、適当なポリマーにカルボキシル
基、スルホン酸基等のアニオン基を導入したものでも良
い。上記ポリアニオンは、塩や誘導体の形態であっても
目的によっては望ましい場合もある。

多孔担体の形状や大きさも特に限定されるものではない
。代表的な形状は粒子状、糸状およびフィルム状である
。さらに、チューブ状、ハニカム状その他の任意の形態
にすることもできることは容易に理解されよう。

多孔担体が粒子の場合、形状は通常、球形、長球形、な
いしは偏平球形から選ばれるが、特殊なものとしては、
円柱形、円筒形、鞍形なと充填効果を高める形状とする
ことも許される。大きさも用途によって任意に選定され
て良く、通常５〜５００−径、場合によっては５閣径以
上のものさえ可能である。

多孔担体が糸の場合、断面形状は通常、円形、三角形、
六角形等の多角形、偏平多角形、偏平円形、中空状、田
型状のものから選ばれるが、この範囲に限定されるもの
ではない、糸径も用途によって任意に選定されて良く、
通常５〜５００ｉｎａ径、場合によっては５舗径以上の
ものさえ可能である。

糸径は糸長方向に均一である必要はなく、糸長も任意で
あることは言うまでもない。

多孔担体がフィルムの場合、膜厚は用途によって任意に
選定されて良く、通常５〜５００ｊ２１１厚、場合によ
っては５ｍ以上のものさえ可能である。膜厚は均一であ
る必要はなく、使用目的に応じてむしろ凹凸をつけるこ
とも好ましい実施態様となり得る。

上記の多孔担体の製造方法においては、製造時にセルロ
ース溶液あるいはセルロース誘導体溶液には多孔化材な
どの異物を入れる必要がないため、微小な均一径の液滴
、膜厚均一な液膜等を容易に作ることができ、粒径、糸
径、フィルム厚等のコントロールを任意に行なうことが
できる。空胞の径と形状は基本的に溶液中の溶媒等が凍
結固化する際に形成する溶媒等の結晶の大きさと形状に
より決まる。従って、セルロース溶液の種類あるいはセ
ルロース誘導体溶液の種類と、温度などの凍結固化条件
を変化させることにより空胞の形状及び孔径を調整する
ことができる。

用いるセルロース溶液には、例えば、銅アンモニア（Ｃ
ｕｏｘａｉ＋）、銅エチレンジアミン（ＣＨＤ）、カド
キセン、酒石酸鉄ナトリウム（ＩＪＮＮ）、ニッケルエ
チレンジアミン（Ｎｉｏｘｅｎ）、ニッケルアンモニア
（Ｎｉｏｘａｓ）、コバルトエチレンジアミン（Ｃｏｏ
ｘｅｎ）、亜鉛エチレンジアミン（Ｚｔｎｃｏｘｅｎ）
等の金属錯体の水溶液にセルロースを溶解した溶液、ジ
メチルアセトアミド／塩化リチウム系溶媒にセルロース
を溶解した溶液、Ｎ−メチルモルフォリンオキサイド、
トリエチルアミンオキサイド、シクロへキシルジメチル
アミン等の各種アミン系溶媒にセルロースを溶解した溶
液、チオシアン酸アンモン、ヨウ化ナトリウム、硝酸ナ
トリウム、千オシアン酸ナトリウム、ヨウ化アンモニウ
ム等の塩とアンモニアを組み合わせた溶媒にセルロース
を溶解した溶液、特開昭６０−４２４３８号公報に示さ
れるアルカリ水溶液にセルロースを溶解した溶液などが
あるが、これらに限定されるものではない。

用いるセルロース誘導体溶液には、ジメチルスルホキサ
イド中でパラホルムアルデヒドをセルロースに反応させ
セルロースの一部をメチロール化して溶解した溶液、ジ
メチルホルムアミド中で四酸化二窒素をセルロースに反
応させてセルロースナイトライドエステル化して溶解し
た溶液、ジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ）中で各種
アミンと二酸化イオウをセルロースに反応させて溶解し
た溶液、セルロースザントゲン酸ソーダ溶液（ビスコー
ス）、およびセルロースアセテートのアセトン溶液など
があるがこれらに限定されるものではない。

セルロース多孔担体の形状は任意にコントロールできる
。また、粒子、糸、フィルム化等の成形方法も任意に選
ぶことができる０例えば、セルロース多孔粒子の形状と
粒径はセルロース溶液あるイハセルロース誘導体溶液の
種類、セルロース濃度、溶液の粘度などでコントロール
できるし、また溶液を液滴にする方法によっても任意に
粒子の形状と大きさをコントロールできる。液滴にする
方法には溶液を気体中に噴霧するスプレーノズル法、流
動体中への溶液吐出法、エマルジョン分散法などがある
が、これらに限定されるものではない。

なお、好ましい方法ではないが、通常の紡糸や成膜同様
ノズルやグイから押し出し繊維またはフィルム状に成型
した後、適当な工程で粒状に切断、細化することも可能
である。

糸、フィルム、ハニカム、中空糸、チューブ等への成形
法としては、通常のノズルやダイからの押出し法、型枠
への注入法等があるが、これらに限定されるものではな
い、また、適当な工程で延伸、展伸、切断することも可
能である。

凍結は、液滴を任意の温度に調節した媒体中に導入する
ことによっておこなう。セルロース溶液あるいはセルロ
ース誘導体溶液と非反応性かつ非混和性の液体あるいは
気体中であれば真球の形状で凍結する。また、Ｍ溶液と
混和性の液体中であれば、いびつな形状で凍結するし、
反応性の気体あるいは液体中であれば、粒子の表面部分
だけを反応・改質したうえ凍結することができる。例え
ば、セルロース溶液あるいはセルロース誘導体溶液と混
和性の液体あるいは気体中で凍結させると、凍結温度に
達する前に、接触界面にのみ該液体あるいは気体が浸透
するため、表面を覆う膜状にセルロースが析出する。結
果として、表層のみ膜で覆われたセルロース多孔担体が
得られる。

この方法において凍結を実施するに際し、凍結温度は溶
媒等が凍結する温度より低ければ、特に制限されるもの
ではない。しかしながら、多孔体の空胞径を決定する溶
媒等の結晶の成長の点で重要であり、溶媒等の種類及び
目的とする空胞径から選択される。余りにも低い温度は
、凍結に際し結晶を形成することなく、セルロース溶液
が溶液構造に近い状態のまま凍結されてしまい、通常の
湿式凝固したと同様のゲル構造となり、好ましくない場
合が多い。但し、凍結温度の適切な設定により、多孔体
表面のみゲル構造とし、内部を多孔構造にすることが可
能であり、且つ表面を部分的にゲル被膜で覆い部分的に
粒子内部への連結口を残すこともできる。この様な構造
を持つ多孔粒子は、圧縮時の変形に対し特に高い抵抗力
を持つ。

一般には、凍結温度は、溶媒等の凍結温度よりも４０℃
以上低くは設定されないことが好ましく、通常は凍結温
度よりも０〜２０℃低い範囲に選ばれることが多い。

上記方法において、凍結されたセルロース溶液あるいは
セルロース誘導体溶液は、次いで、セルロースあるいは
セルロース誘導体を溶解している溶媒を抽出除去するか
、その溶解能を低めて、（以下、これらの処理を総称し
て「溶媒除去等」という）、固化されたセルロース多孔
担体とする。

要するに、通常のセルロース溶液、セルロース誘導体溶
液の湿式成形時に用いられる稀釈析出もしくは沈殿、溶
媒抽出、または酸アルカリ中和反応などの凝固方法がそ
のまま適用できる。

溶媒除去等の条件は特に制限されるものではない０通常
は、凍結体を素早く任意の凝固浴または再生浴中に投入
すれば足りるが、凝固浴または再生浴も溶液の凍結温度
以下にすることが好ましく推奨される。

但し、セルロース誘導体の場合はセルロース再生工程が
必要であり、この再生は溶媒除去等と同時または逐次的
に（すなわち、溶媒除去等を行った後に）行なう。再生
自体は常法によって行うことができる。

溶媒除去等を済ませたセルロース多孔担体、または、溶
媒除去等と再生工程を経たセルロース多孔担体は、次い
で水または他の洗浄剤により洗浄され、必要があれば乾
燥や液置換等を施された後、後処理に供される。洗浄や
乾燥の条件についても特に制限されるものではなく、用
途に応した条件が任意に選ばれて良い。

次に、セルロース多孔担体の改質について説明する０本
発明の改質セルロース多孔担体は、セルロース溶液また
はセルロース誘導体溶液からセルロース多孔担体を製造
する方法において、多孔体の製造工程の途中で、あるい
は、後工程において、セルロースを改質することによっ
て得られる。改質には、セルロース溶液またはセルロー
ス誘導体溶液段階で、ポリアニオンをブレンドしたり、
後工程で一般的な手法で、ポリアニオンをコーティング
もしくは含浸したり、またはポリアニオンで化学的に修
飾、すなわち、架橋したり、グラフトする方法とがある
が、これらに限定されるものでない。また、用途に応じ
ては、処理を組み合わせることが好ましいこともある。

ブレンドするポリアニオンは溶解していなくともセルロ
ース多孔担体に比べ微細であれば、混合状態でも良い。

均一に溶解させるためには、前述列挙したセルロース溶
液またはセルロース誘導体溶液から相溶性の良いものを
選び、目的物質であるポリアニオンを溶解させる。

コーティングは湿潤あるいは乾燥セルロース多孔担体に
ポリアニオンを付与することによって行なわれる。まず
、ポリアニオンの溶液を調製するが、ポリアニオンの溶
媒はポリアニオンを均一に分散あるいは溶解せしめ、セ
ルロース多孔担体へのポリアニオンの含浸または塗布を
容易にするものであり、除去のしやすさまで考慮して選
択する。

ポリアニオンのコーティングは次のように行なうことが
できる。まず、ポリアニオンを溶媒（以下、「コーティ
ング溶媒」という）に分散あるいは溶解させ、得られる
ポリアニオン溶液または分散液を膜に含浸、塗布その他
の方法でセルロース多孔担体に付与することによって行
なわれる０次いで、均一なコーテイング膜を形成せしめ
るために、遠心除去、吸引等の方法によって過剰の高分
子溶液を多孔担体から除去する。この液切り操作が適切
に行なわれないと、性能のバラツキや使用時におけるポ
リアニオン脱落の原因となるコーティング層の厚み斑を
往しる恐れがある。液切りを行なった後、コーティング
溶媒を除去すること等によってポリアニオンの固定を行
なう。コーティング溶媒の除去は、溶媒が揮発性の場合
は凍結乾燥、真空乾燥、通風乾燥、加熱乾燥等の通常の
方法によって行なわれる。コーティング溶媒が比較的高
沸点の場合は、必要に応じてポリアニオンを含まない溶
媒で洗浄した後、溶媒と相溶性の良い揮発性有機溶媒で
洗浄し上記と同様に乾燥する。

なお、コーティング層の均一性を高めるためには、膜面
へのポリアニオン溶液の付与、液切り、ポリアニオンの
固定までの処理を繰り返すことが好ましい。さらに、熱
処理まで含めて繰り返すことはより強固なコーティング
を得るために有効である。

以上のようにポリアニオンで改質したセルロース多孔担
体に、必要に応じて、さらに後処理を施すことにより更
に好ましく改質することも本発明の一つの特徴である。

より詳しく述べると、多価金属イオンやポリカチオンで
後処理することにより、ポリカチオン化または多価金属
イオン化してポリアニオンを架橋不溶化するとともに、
荷電の緩和調整、微生物・細胞等の付着・増殖性向上を
達成する。

多価金属イオンとしては、２価以上の金属イオンが全て
含まれるが、例をあげると、マグネシウム、カルシウム
、ストロンチウム、バリウム、アルミニウム、チタン、
マンガン、鉄、ニッケル、銅、亜鉛等のイオンである。

ポリカチオンとしては、１級〜４級のアミノ基、ホスホ
ニウム基等のカチオン基を有するポリマーが用いられ、
その具体例としては、部分脱アセチル化キチン、キトサ
ン、ポリリシン、ポリヒドロキシリシン、ポリアルギニ
ン、ポリヒスチジン、ポリエチレンイミン等が挙げられ
る。

さらに、これらの改質後、セルロース、ポリアニオン、
ポリカチオン相互間の結合を更に強固にしたり、新たな
機能を持たせるため、共有結合性の分子間架橋を導入す
ることもできる。

セルロース多孔担体に分子間架橋を形成するには、セル
ロースの水酸基と反応結合し得る官能基を２以上もつも
のならば架橋剤として使用できる。

例として、二官能性有機物質が挙げられる。その例とし
ては、アルカリ性反応物質存在下で比較的容品に反応す
るＸ−Ｒ−Ｚ形〔式中、Ｒは炭素原子を含有する脂肪族
残基を表し、ＸおよびＺは各ハロゲンまたはエポキシ等
であり、それらは脂肪族残基の炭素原子と各々結合して
オキシラン基（ＣＨｔ−ＣＨ−）等を形成する。）があ
る。上記反応にＹ 適する二官能性化合物の例には、エピクロロヒドリン、
ジクロロヒドリン、１．２−．３．４−ジェポキシブタ
ン、ビスエポキシ、プロピルエーテル、エチレングリコ
ール−ビス−エポキシ・プロピルエーテルおよび１．４
−ブタンジオールービスーエボキシブロビルエーテル及
び密接に関係ある化合物類があるが、特にこれらに限定
されるものではない。

また、このような二官能性物質を用いて酵素固定を行な
ったり、イオン交換基等の官能基を導入することもでき
る０例えば、アルカリ性反応化合物の存在下−船底Ｘ−
Ｒ−Ｙの化合物〔ＸはセルロースのＯＨと反応結合する
官能基、Ｙは目的に応した官能基で、例えば、−ＣＯＯ
Ｈ，−５ＣｈＨあるいは基、ＲＩおよびＲｔは水素また
はメチル、エチル、ヒドロキシエチル等の脂肪族残基）
を有するアミノ基あるいはその塩〕をセルロース多孔担
体に反応させればカチオンあるいはアニオン交換体とな
る。Ｙが酵素ならばセルロース多孔体を用いた酵素固定
となる。

上記の改質処理前後で、必要に応じて、酸化、還元によ
り更に改質を有益な方向に進めることもできる。また、
改質はセルロース多孔担体に均一に行なうだけでなく、
用途によっては部分的な改質を行なう方がむしろ好まし
い場合もある。

〔作用および発明の効果〕

本発明の改質セルロース多孔担体は、約２趨より大きい
大孔径の連続空胞を持つため、多孔担体内に液体や固体
が出入りしやすい構造体である。

この多孔担体の空胞を形成する隔壁は、基本的に天然物
であるセルロースより成るため、水に対する親和性が良
く、生物的に無害であり、耐有機溶削性が良く、耐熱性
が良いなどの利点がある。これらの利点に加え、ポリア
ニオン、ポリカチオン、多価金属イオンを付与した本発
明の改質セルロース多孔担体は、触媒、酵素、医薬品の
担体やイオン交換体、吸着体の原料および菌体、酵母、
動植物細胞培養用の各担体、マイクロキャリア等に有用
である。

酵素、担体などに使用する場合、粘性のある液に対して
も通液性がよいものとなる。また、動物細胞のような大
きな体積を有するものでも、表面に開いた孔から多孔体
内部に侵入することができるため、従来の表面付着型の
マイクロキャリアと異なり、多孔体の内部に細胞を保持
するマイクロキャリアとして応用できる。また、セルロ
ースの反応性水酸基、ポリアニオンやポリカチオンの反
応性基を利用した誘導体化も容易であり、機能性反応基
の導入により酵素同定、イオン交換能、キレート能など
が付与できるため、種々の用途に応用することができる
。

さらに、ポリアニオンの種類と量、ポリカチオンや多価
金属塩の導入等により、セルロースが有する親水性をコ
ントロールしたり、荷電容量、タンパク質の吸着特性、
微生物や細胞の付着・増殖特性その他の表面特性を任意
に調節または付与することができる。

〔実施例〕

以下、実施例について本発明を具体的に説明する。

実施例において、セルロース溶液あるいはセルロース誘
導体溶液の粘度は、市販の回転粘度計を用い、温度２３
°Ｃにおいて、ロータを２叶ρ−で回転させて測定した
値である。

セルロースの銅安相対粘度（η、、１）はＪＩＳ　Ｐ−
８１０１によって測定し、平均重合度（３丁）は銅安相
対粘度から次の式によって求めた（１．Ｅ、Ｃ。

４２．５０２（１９５０）参照）。

（ＶＰｒ）　＜３００）　　Ｔ１’＝５２０（η、、ｔ
　−１＞（３丁）≧３００）　　”Ｄｉ’ｌ’＝２１６
０　（ｌｏｇ（η、、ｔ＋ｉ）０．２６７　） 粒子の径および多孔対の大きさは、未乾燥状態のまま、
光学顕微鏡により適当な倍率に設定して測定した。５０
μ径以下の微小粒子については、洗浄後の未乾燥粒子を
液体窒素で急速冷却して構造を保ったまま凍結した後、
０．１）−＋しの真空中で凍結乾燥（凍結乾燥処理）後
、走査型電子顕＠鏡（ＳＥＭ）を用いた観察測定も併用
した。多孔体表面の開孔径及び開孔面積率は、凍結乾燥
処理した試料を金スパツタリング処理してＳＥＭで適当
な倍率に拡大し観察測定を行なった。多孔体内部の開孔
径および隔膜の厚さは、上述のように液体窒素で凍結し
た後、同温度で割断を行ない、そのまま真空中で乾燥以
降の処理を施しＳＥＭで多孔体断面の観察測定を行ない
求めた。

粒子径、開孔径等については、それらが真球や真円でな
い場合は、最も短い直径をもって定義した。

実施例１ アラスカパルプ社製溶解用パルプＡＬ−Ｔを酸加水分解
により平均重合度４５０に調整したものと和光純薬社製
カルボキシメチルセルロースナトリウムを−６”Ｃの８
％水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、セルロース濃度２
％、カルボキシメチルセルロースナトリウム濃度１％の
溶液を得た。この溶液を一３０゛Ｃのヘキサン中にスプ
レーノズルを用いて霧状の微粒子状態で投入した後、緩
攪拌を続けながらヘキサンを−１６”Ｃに昇温し２０分
間保持してから、−２０°Ｃの５０％硫酸水溶液中に投
入し、−２０℃に５時間保った後、粒子を取り出し水洗
した。

次に、この粒子３Ｍｉを０．５％アンモニア水１００ｉ
中に投入し２０分間攪拌水洗した後、更に５％ＣａＣ＃
！ｚ水溶液５０ｄ中に投入した。１時間後濾紙で濾別し
蒸留水で十分に洗浄した後、耐圧ビンに１留水１００ｄ
とともに入れ、１２１℃のオートクレーブで２０分間滅
菌処理を行なった。

生成物の一部を取り出し、光学顕微鏡で粒子を観察した
ところ、粒子径は５０〜３００庫ですべての粒子にｌＯ
〜２０−の孔径の孔が表面から均一に開孔していること
が認められた。

また、ＳＥＭで観察したところ、膜で隔てられた径１０
〜２０趨の空胞が集合した形状の球形の粒子であること
を確認した。高倍率での観察により、空胞間を隔てる膜
が部分的に開通した連続孔構造を形成している様子が明
らかになった。凍結割断面をＳＥＭで観察したところ内
部の空胞径は１０〜２０１Ｍで、隔膜の厚さは１−以下
であった。

一方、ハムＦ−１２（大日本製薬株式会社製）培地に牛
胎児血清（大日本製薬株式会社製）を５％添加したもの
５−を径６０Ｉ！１ｆｆｌの滅菌法デイツシュに入れ、
水洗後の上記粒子をデイツシュ底面に一層敷き詰めるよ
うに添加した後、チャイニーズハムスター卵巣由来の株
細胞ＣＩ（Ｏ−Ｋｌ　（大日本製薬株式会社製）を加え
３７°Ｃ５二酸化炭素５％の条件で１４日間インキュベ
ートした。培養期間中培養液を２回交換した。インキュ
ベート後、リン酸緩衝溶液で洗浄し２％グ１しタルアル
デヒド中に粒子をいれ４℃で３時間放置した後、さらに
リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、２％オスミウ
ム酸で１．５時間、４°Ｃで処理した０次に、４°Ｃの
２０％、５０％。

７０％のエタノール水溶液で順次各１０分間処理した後
、室温の８０％、９０％、　　１００％エタノールで順
次アルコール置換をおこなった。さらに、酢酸イソアミ
ル中に３０分間浸漬した後、二酸化炭素を用いた臨界点
乾燥処理を行ない、乾燥試料を得た。この試料を金蒸着
処理した後ＳＥＸで観察したところＣＩＯ−Ｋｌが粒子
の孔に入り込んで付着繁殖している状態を′ｆｆ１認し
た。

さらに、ＣＩ（Ｏ−Ｋｌが粒子表面の開孔部より粒子内
部にまで入り込んで付着繁殖していることを詳しく観察
するために、粒子の切片を作成した。前記同様に、イン
キュベーター内にて１４日間培養後、ＣＨＯ−Ｋｌの付
着している粒子をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２回洗浄
した。さらに、その粒子を２％グルタルアルデヒドに入
れ、４℃で３時間放置して細胞を固定した。次に、過剰
のグルタルアルデヒドをのぞくために水洗し、水溶性メ
タクリル樹脂に徐々に置換してゆき、１００％樹脂置換
後、６゜°Ｃ１１２時間で樹脂を固化した。超ミクロト
ームにて１μの切片を作成後、トルイジンブルー染色を
行なうことにより細胞のみ染色した。このようにして作
成−した切片を光学顕微鏡で観察したところ、ＣＨＯ−
Ｋｌ細胞が粒子内部に進入して付着繁殖充填している状
態を確認した。

実施例２ 実施例１と同様の方法で調製した改質セルロース粒子を
滅菌前に１４５メツシユのふるいにかけて１００ｉｎａ
径以下の粒子のみ分取した後、１２１°Ｃｌ２Ｏ分間の
オートクレーブ滅菌を施した。次に、単に攪拌式培養に
従って細胞と粒子を併せることによってミクロキャリア
培養を開始した。この培養は、磁気駆動テフロンコーテ
ィング攪拌翼を備えた２５０ｄのガラス製スピナーボト
ル（直径６．５　ｃａ＋　）中において、実施例１と同
様な細胞と培地を用いて行った。攪拌速度は約６Ｏｒｐ
ｍであった。１４日間の培養期間中、培養液を２回交換
したが培養の後、粒子を取り出し、実施例１と同様な後
処理を施し、切片作成後、細胞染色を行なった。光学顕
微鏡で観察したところ、粒子の内部にＣｌ０−に１細胞
が増殖充填されていることをｆｉ認した。

実施例３ 一３０’Ｃに冷却したシリコーンオイル（信越シリコー
ン■社製ＫＦ９６　）を用意し、和光純薬社製のヘパリ
ンナトリウムと精製リンターを原料として調製した２３
℃における粘度１万センチポイズ、セルロース濃度６％
、ヘパリンナトリウム０．６％、銅濃度３．６％、アン
モニア濃度７．０％のセルロースヘパリン銅安溶液を孔
径１００ｍ＋のシリンジで、シリコーンオイル中に押し
出したところ、糸状に凍結した。シリコーンオイルの温
度を一２０°Ｃに上昇させ、３時間放置した後、−２０
°Ｃの５０％硫酸水溶液中に投入し、−２０℃に１時間
保った後、セルロースヘパリン糸状体を取り出した。

また、シリンジとは別にスリット幅１００Ｉ！ｍ、スリ
ット長１５Ｃ１１のダイから上記のセルロースヘパリン
銅安溶液を押し出し、同様に処理してセルロースヘパリ
ンフィルムを得た。

水洗後、光学顕微鏡で糸とフィルムを観察したところ、
糸径は１２０ｎ、フィルム厚も１２０廂でともに１０〜
４０ｎの孔径の孔が表面から均一に開孔していることが
認められた。

また、ＳＥＭで観察したところ、厚さ約２−の膜で隔て
られた径１０〜４０ｊｍの空胞が集合した形状の糸とフ
ィルムであることを確認した。高倍率での観察により、
空胞間を隔てる膜が部分的に開通した連続孔構造を形成
している様子が明らかになった。

この糸とフィルムをそれぞれ長さ１ｃｍあるいは１ｃｉ
Ｘ１ｃ＋ａの大きさに切断して凍結乾燥した後、それぞ
れ０．５ｇずつ分取し、１３０°Ｃのオートクレーブで
２時間滅菌処理し、４°Ｃに保冷した。

これらの試料を実施例１と同様に細胞培養試験に供した
後、後処理をして切片を細胞染色し、ＳＥＭで観察した
ところ、糸とフィルムの内部にまでＣＨＯ−Ｋｌ細胞が
増殖充填していることを確認した。

実施例４ キトサン（東京化成製）０．５ｇを０．５％ＨＣｆ水溶
液１００ｄに溶解し、実施例３で得た凍結乾燥後の糸お
よびフィルム各０．５ｇを投入し、１０分間緩攪拌した
。

次に、取り出しスパチェラーで圧して余分の水溶液を除
いた後、９０℃で乾燥した。この乾燥サンプルに対し、
１００ｉの純水を加え、１３０″Ｃのオートクレーブで
２時間滅菌処理した。

これらの試料を実施例３と同様に、細胞培養試験に供し
た後、後処理をして切片を細胞染色し、光学顕微鏡観察
したところ、糸とフィルムの内部にまでＣＨＯ−Ｋｌ細
胞が増殖充填されていることを確認した。

実施例５ ペクチン（和光純薬製）を−６”Ｃの８％水酸化ナトリ
ウム水溶液に溶解し、ペクチン濃度２％の水溶液１００
ｄを得た。次に、アラスカバルブ社製溶解用パルプＡＬ
−Ｔを酸加水分解により平均重合度４５０に調整したも
のを一６°Ｃの８％水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、
濃度４％のセルロース溶液１００ｄを得た後、同温度で
２液を均一に混合溶解せしめた。続いて、この溶液を一
１６°Ｃのへキサン中にスプレーノズルを用いて霧状の
微粒子状態で投入し、同温度で１０時間の緩攪拌を続け
たところ、ヘキサン中で微粒子形状の該溶液の凍結体を
得た。次にこのヘキサン容器から該溶液の凍結体を取り
出し、−２０°Ｃの５０％硫酸水溶液中に投入し、−２
０℃に５時間保った後、セルロース・ペクチン複合体粒
子を取り出し水洗した。この粒子５ｄを蒸留水で十分に
洗浄した後、平均分子ｆｉ７０，０００のポリエチレン
イミン（和光純薬社製）の０．５％水溶液１００ｄに１
０分間浸漬し水洗した。次に、０．５％アンモニア水溶
液１００ｄに１０分間浸漬後水洗し、最後に５％ＭｇＣ
ｆ　、水溶液１００ｄニ１０分間浸漬し十分に水洗した
。

この粒子を耐圧ビンに蒸留水１００ａｆとともに入れ、
１２１’Ｃのオートクレーブで２０分間滅菌処理を行な
った。

生成物の一部を取り出し、光学顕微鏡で粒子を観察した
ところ、粒子径は５０〜３００−ですべての粒子に１０
〜２０摩の孔径の孔が表面から均一に開孔していること
が認められた。

また、ＳＥＭで観察したところ、膜で隔てられた径１０
〜２０迦の空胞が集合した形状の球形の粒子であること
を確認した。高倍率での観察により、空胞間を隔てる膜
が部分的に開通した連続孔構造を形成している様子が明
らかになった。凍結割断面ＳＥＭで観察したところ内部
の空胞径はｌｏ〜２゜趨、隔膜の厚さは１ｐｍ以下であ
った。

さらに、実施例１と同様の培養実験と後処理を行なった
ところ、粒子内部にＣＨＯ−Ｋｌ細胞が増殖充填してい
ることを確認した。

実施例６ アルギン酸ナトリウム（東京化成製）とデキストラン硫
酸ナトリウム（和光純薬製）を純水に溶解し、アルギン
酸ナトリウム濃度０．５％、デキストラン硫酸ナトリウ
ム濃度０．５％の混合水溶液（Ａ）を用意した。次に精
製リンターを原料として調製した２３°Ｃにおける粘度
１万センチポイズ、セＪＩｚロース濃度６％、銅濃度３
．６％、アンモニア濃度７．０％のセルロース銅安溶液
（Ｂ）を用意し、Ａ、８両溶液を１：１で混合攪拌し、
Ｃ液を得た。

このＣ液を一３０゛Ｃのヘキサン中にスプレーノズルを
用いて霧状の微粒子状態で投入した後、緩攪拌しながら
一２０°Ｃに昇温し、１０分間保持した。次に、−２０
’Ｃの５０％硫酸水溶液を投入し、攪拌を続けながら２
時間で室温まで昇温し、粒子を取り出し、水洗した後、
０．５％の大過剰のアンモニア水に１゜分間浸漬し水洗
した。この粒子を３１ｄずつとり、実施例４で調製した
キトサン０．５％溶液１００雇とポリーＬ〜リジン塩酸
塩（和光純薬製）０．５％溶液１００ｄに攪拌しながら
２０分間浸漬し水洗した。

これらの処理を終えた両粒子を耐圧ビンに蒸留水１００
１Ｉｆｌとともに入れ、１２１°Ｃのオートクレーブで
２０分間滅菌処理を行なった。

生成物の一部を取り出し、光学顕微鏡で粒子を観察した
ところ、粒子径は１５０〜５００趨ですべての粒子に２
０〜５０ｔａｘの孔径の孔が表面から均一に開孔してい
ることが認められた。

また、ＳＥＭで観察したところ、膜で隔てられた径２０
〜５０趨の空胞が集合した形状の球形の粒子であること
を確認した。高倍率での観察により、空胞間を隔てる膜
が部分的に開通した連続孔構造を形成している様子が明
らかになった。凍結割断面をＳＥＭで観察したところ内
部の空胞径は２０〜５０塵で、隔膜の厚さは２−以下で
あった。

これらの試料を実施例１と同様に細胞培養試験に供した
後、後処理をして切片を細胞染色し、ＳＥＭで観察した
ところ、両粒子とも内部にまでＣＨＯ−Ｋ１細胞が増殖
充填していることを確認した。

実施例７ 亜硫酸法で作った針葉樹木材パルプを原料として調製し
た、温度２３°Ｃにおける粘度が２，５３０センチボイ
ズ、セルロース濃度が７．４％、ＮａＯＨ濃度が５％、
１価３６のビスコース２００ｄに実施例１で用いたカル
ボキシメチルセルロースナトリウム２ｇを溶解した。こ
の溶液を実施例３と同様の方法で一３０″Ｃのシリコン
オイル中に押し出し糸状体とフィルムを得た。この糸状
体とフィルムを６０’ＣのＨｚＯｚ　１％、ＮａＯＨ１
％の水溶液で３０分間処理し、水洗し、次いで、塩化バ
リウム濃度１．５％、塩化アルミニウム濃度１．５％の
混合水溶液に２０分間投入した。

水洗後、光学顕微鏡で糸とフィルムを観察したところ、
糸径は１２ＯＡ１１、フィルム厚も１２０．ｍでともに
５〜２０趨の孔径の孔が表面から均一に開孔しているこ
とが認められた。

また、ＳＥＭで観察したところ、厚さ約２−の膜で隔て
られた径５〜２０μの空胞が集合した形状の糸とフィル
ムであることを確認した。高倍率での観察により、空胞
間を隔てる膜が部分的に開通した連続孔構造を形成して
いる様子が明らかになった。

この糸とフィルムをそれぞれ長さ１ｃ１１あるいはＩＣ
ｌｍＸＩＣ１の大きさに切断して凍結乾燥した後、それ
ぞれ０．５ｇずつ分取し、１３０℃のオートクレーブで
２時間滅菌処理し、４°Ｃに保冷した。

これらの試料を実施例１と同様に、細菌培養試験に供し
た後、後処理をして切片を細胞染色し、光学顕微鏡観察
したところ、糸とフィルムの内部にまでＣＨＯ−Ｋｌ細
胞が増殖充填されていることを確認した。

カルボキシメチルセルロースナトリウムを実施例６のア
ルギン酸ナトリウムに替えた他は、本実施例と同様に実
験を行なったところ、同様の結果が得られた。

実施例８ 実施例３　、４のヘパリンに代えてケラタン硫酸、コン
ドロイチン硫酸Ａ、デルマタン硫酸を用い、それぞれ実
験を行なったところ、同様の結果が得られた。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）膜で隔てられた径が約２μｍより大きい多数の空
   胞を有し、該空胞は隣接した空胞との間を隔てる膜の開
   孔部によりたがいに、連通した連続孔構造を形成して成
   る改質セルロース多孔体であって、該膜は、ポリアニオ
   ンまたはその塩がコーティング、ブレンドまたは含浸さ
   れたセルロースから成ることを特徴とする改質したセル
   ロース多孔担体。
2. （２）該セルロースがさらに、ポリカチオンまたは多価
   金属イオン処理を施されてポリイオンコンプレックス化
   または多価金属塩化されていることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の改質したセルロース多孔担体。