JPH0488985A - ヒトパルボウィルス構造蛋白質遺伝子 - Google Patents
ヒトパルボウィルス構造蛋白質遺伝子Info
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- JPH0488985A JPH0488985A JP20282790A JP20282790A JPH0488985A JP H0488985 A JPH0488985 A JP H0488985A JP 20282790 A JP20282790 A JP 20282790A JP 20282790 A JP20282790 A JP 20282790A JP H0488985 A JPH0488985 A JP H0488985A
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- structural protein
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、流産、胎児水腫、肝障害、出血熱、関節炎や
リューマチなど種々の疾患の病因に係わる新規なヒトパ
ルボウイルス構造蛋白質遺伝子に関する。
リューマチなど種々の疾患の病因に係わる新規なヒトパ
ルボウイルス構造蛋白質遺伝子に関する。
バルポウイルスの仲間は、−本鎖の直鎖ＤＮＡゲノムを
有する最小のウィルス群（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科
）に属する。Ｐａｒｖｏｖｉｒｊｄａｅ科ウィルスを電
子顕微鏡で見ると、その粒子は球状で、正二十面体様対
称性を示し、３２個のキャプソメア（ｃａｐｓｏｍｅｒ
ｅ ）から成る０直径約２０〜２５ｎｍの極めて小型の
ウィルスで、エンベローブヲ保有せず、熱、乾燥、脂質
溶剤、洗剤などに比較的耐性のウィルスである（ Ｉｎ
ｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ２３．６ｌ−７３（１９８
５） ）。を椎動物に感染するバルボウイルスの宿主に
は、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス
、ミンク、イタチ、ガチョウ及びヒトが含まれるが、一
般に病原性は似ているものの、これらのウィルス間で免
疫学的な交叉性は見出されていない。従って、ヒトパル
ボウイルスの診断やワクチンの開発に使用可能なウィル
ス抗原は、ヒトパルボウイルス由来のものであることが
重要な条件となる。
有する最小のウィルス群（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科
）に属する。Ｐａｒｖｏｖｉｒｊｄａｅ科ウィルスを電
子顕微鏡で見ると、その粒子は球状で、正二十面体様対
称性を示し、３２個のキャプソメア（ｃａｐｓｏｍｅｒ
ｅ ）から成る０直径約２０〜２５ｎｍの極めて小型の
ウィルスで、エンベローブヲ保有せず、熱、乾燥、脂質
溶剤、洗剤などに比較的耐性のウィルスである（ Ｉｎ
ｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、 ２３．６ｌ−７３（１９８
５） ）。を椎動物に感染するバルボウイルスの宿主に
は、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス
、ミンク、イタチ、ガチョウ及びヒトが含まれるが、一
般に病原性は似ているものの、これらのウィルス間で免
疫学的な交叉性は見出されていない。従って、ヒトパル
ボウイルスの診断やワクチンの開発に使用可能なウィル
ス抗原は、ヒトパルボウイルス由来のものであることが
重要な条件となる。
ヒトバルポウイルスは、１９７５年に初めてその存在が
知られたＣＬａｎｃｅｔ、 ｉ 、７２−７３． （１
９７５）〕が、病原性は不明であった。その後、遺伝性
溶血性疾患を有する僧体に、劇症の再生不良性貧血を引
き起こすことが知られ（Ｌａｎｃｅｔ、 ｉ、６６４−
６６５（１９８１）） 、小児に流行する伝染性紅斑症
の病因ウィルスとして確かなものとなった〔Ｌａｎｃｅ
ｔ、 ｉ 、１３７８．（１９８３）） 、更に、健常
成人においても、現在までのところ、発熱、不定の発疹
症、出血熱様疾患、肝障害、関節炎、流産や胎児水腫な
どの原因となることが知られている〔医学のあゆみ、
１４２．５３０−５３２（１９８７））。またリュウー
マチへの関与も推定されている〔第３６回日本ウィルス
学会抄録、 ３２８（１９８８） ）。
知られたＣＬａｎｃｅｔ、 ｉ 、７２−７３． （１
９７５）〕が、病原性は不明であった。その後、遺伝性
溶血性疾患を有する僧体に、劇症の再生不良性貧血を引
き起こすことが知られ（Ｌａｎｃｅｔ、 ｉ、６６４−
６６５（１９８１）） 、小児に流行する伝染性紅斑症
の病因ウィルスとして確かなものとなった〔Ｌａｎｃｅ
ｔ、 ｉ 、１３７８．（１９８３）） 、更に、健常
成人においても、現在までのところ、発熱、不定の発疹
症、出血熱様疾患、肝障害、関節炎、流産や胎児水腫な
どの原因となることが知られている〔医学のあゆみ、
１４２．５３０−５３２（１９８７））。またリュウー
マチへの関与も推定されている〔第３６回日本ウィルス
学会抄録、 ３２８（１９８８） ）。
以上のように、ヒトパルボウイルスは、臨床上極めて興
味深いウィルスであるといえる。しかしながら、ウィル
ス抗原の取得が困難であるため、診断系の一般化が遅れ
ており、血液のスクリーニングや臨床検査が容易に行え
ないのが現状である。
味深いウィルスであるといえる。しかしながら、ウィル
ス抗原の取得が困難であるため、診断系の一般化が遅れ
ており、血液のスクリーニングや臨床検査が容易に行え
ないのが現状である。
ヒトバルポウイルスの個体への侵入経路は、輸血と鼻腔
が知られ、その標的細胞は極く限られた赤芽球の前駆細
胞である（Ｎａｔｕｒｅ、 ３０２．４２６−４２９（
＋９８３） ）。ヒトパルボウイルスが体内に侵入した
場合、血中のウィルスの増殖は、一般に感染後６〜１２
日の不顕性期に観察され、症状が現れてからのウィルス
抗原の検出は困難である。従って、ヒトパルボウイルス
感染の証明は、ウィルス抗原そのものではなく、血清中
に抗ヒトパルボウイルス抗体を検出することによって行
われている。
が知られ、その標的細胞は極く限られた赤芽球の前駆細
胞である（Ｎａｔｕｒｅ、 ３０２．４２６−４２９（
＋９８３） ）。ヒトパルボウイルスが体内に侵入した
場合、血中のウィルスの増殖は、一般に感染後６〜１２
日の不顕性期に観察され、症状が現れてからのウィルス
抗原の検出は困難である。従って、ヒトパルボウイルス
感染の証明は、ウィルス抗原そのものではなく、血清中
に抗ヒトパルボウイルス抗体を検出することによって行
われている。
ヒトパルボウイルス診断系は、現在、献血検体およそ２
万例に１例の割合で発見されるウィルス血症の血清より
、ウィルス粒子を精製し、それを抗原として、免疫電気
向流法〔医学のあゆみ、 １３５．３１７−３１８（１
９８５）） 及Ｕエンｆ イムイムノアッセイ法〔医学
のあゆみ、 １３４．９０９−９１０（１９８５））や
ラジオイムノアッセイ法〔感染症学雑誌５８．１２１３
−１２２０（１９８５））が極く限られた範囲内で行わ
れているにすぎない。しかも、免疫電気向流法は検出感
度が低く、さらに広範な検査のためには、いずれの方法
においてもウィルス抗原量が不足している。このような
状況からヒトパルボウイルスの診断系の開発のためには
、有用かつ大量のウィルス抗原の取得が重要である。
万例に１例の割合で発見されるウィルス血症の血清より
、ウィルス粒子を精製し、それを抗原として、免疫電気
向流法〔医学のあゆみ、 １３５．３１７−３１８（１
９８５）） 及Ｕエンｆ イムイムノアッセイ法〔医学
のあゆみ、 １３４．９０９−９１０（１９８５））や
ラジオイムノアッセイ法〔感染症学雑誌５８．１２１３
−１２２０（１９８５））が極く限られた範囲内で行わ
れているにすぎない。しかも、免疫電気向流法は検出感
度が低く、さらに広範な検査のためには、いずれの方法
においてもウィルス抗原量が不足している。このような
状況からヒトパルボウイルスの診断系の開発のためには
、有用かつ大量のウィルス抗原の取得が重要である。
一般に、診断、医薬応用のためのウィルス抗原の取得方
法は、ｉｎ ｖｊｔｒｏでウィルスを感染・増殖させる
方法、もしくは、ウィルス遺伝子をクローニングして、
抗原蛋白を大量に発現させる方法に大別される。ｉｎ
Ｖｉｔｒｏ感染系は、特殊な遺伝的疾患患者の骨髄細胞
を用いた報告例がある［ＢＩｏｏｄ、７０．３８４−３
９１（１９８７） ）が、ウィルスの回収率は極めて低
（、また、通常の骨髄中にはウィルス標的細胞が極めて
少ないため、骨髄細胞を用いたｊｎ ｖｊｔｒｏ感染系
はその使用範囲に制限がある。多くの株化細胞も、ヒト
パルボウイルスに対する感受性を消失していた。最近、
株化細胞の１つに感染性が確認されたが、この系ではウ
ィルスの増殖は極めて低い〔臨床と微生物、 １６，１
７７−１８６（１９８９））。
法は、ｉｎ ｖｊｔｒｏでウィルスを感染・増殖させる
方法、もしくは、ウィルス遺伝子をクローニングして、
抗原蛋白を大量に発現させる方法に大別される。ｉｎ
Ｖｉｔｒｏ感染系は、特殊な遺伝的疾患患者の骨髄細胞
を用いた報告例がある［ＢＩｏｏｄ、７０．３８４−３
９１（１９８７） ）が、ウィルスの回収率は極めて低
（、また、通常の骨髄中にはウィルス標的細胞が極めて
少ないため、骨髄細胞を用いたｊｎ ｖｊｔｒｏ感染系
はその使用範囲に制限がある。多くの株化細胞も、ヒト
パルボウイルスに対する感受性を消失していた。最近、
株化細胞の１つに感染性が確認されたが、この系ではウ
ィルスの増殖は極めて低い〔臨床と微生物、 １６，１
７７−１８６（１９８９））。
本発明者らは、先に胎児肝組織由来の赤芽球細胞を用い
たｉｎ ｖｉｔｒｏのヒトパルボウイルス増殖方法を報
告している〔特開昭６３−２４２１６６号〕この方法は
、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトパルボウイルスを増殖させる
のに有力な方法であるが、原料の入手の点でやや難点が
あり、広く利用するためには必ずしも十分ではなかった
。
たｉｎ ｖｉｔｒｏのヒトパルボウイルス増殖方法を報
告している〔特開昭６３−２４２１６６号〕この方法は
、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトパルボウイルスを増殖させる
のに有力な方法であるが、原料の入手の点でやや難点が
あり、広く利用するためには必ずしも十分ではなかった
。
遺伝子組換え法によってウィルス抗原を取得する為には
、ヒトパルボウイルス遺伝子が必要である。現在、ヒト
パルボウイルスに感染した鎌形赤血球貧血患者血清由来
のヒトパルボウイルスＢ１９株遺伝子の全配列が報告さ
れている（ Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ５８．９２１〜９３
６（１９８６） ）。この遺伝子産物の解析から、ウィ
ルス構造蛋白質としてウィルス粒子に存在するのは、Ｖ
Ｐ−１（分子量約８４ＫＤａ）及びＶＰ−２（分子量約
５８ＫＤａ）の２種類の蛋白質のみであり、また、精製
ヒトパルボウイルス粒子と患者血清との反応性から、ヒ
トパルボウイルスに感染した宿主がこれらＶＰ−１及び
ＶＰ−２を標的として抗原抗体反応を惹起することが確
かめられている（Ｊ。
、ヒトパルボウイルス遺伝子が必要である。現在、ヒト
パルボウイルスに感染した鎌形赤血球貧血患者血清由来
のヒトパルボウイルスＢ１９株遺伝子の全配列が報告さ
れている（ Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ５８．９２１〜９３
６（１９８６） ）。この遺伝子産物の解析から、ウィ
ルス構造蛋白質としてウィルス粒子に存在するのは、Ｖ
Ｐ−１（分子量約８４ＫＤａ）及びＶＰ−２（分子量約
５８ＫＤａ）の２種類の蛋白質のみであり、また、精製
ヒトパルボウイルス粒子と患者血清との反応性から、ヒ
トパルボウイルスに感染した宿主がこれらＶＰ−１及び
ＶＰ−２を標的として抗原抗体反応を惹起することが確
かめられている（Ｊ。
Ｖｉｒｏｌ、６１．２６２７（１９８７） ） 、更に
また、ＶＰ−２遺伝子の蛋白コード領域は、ＶＰ−１遺
伝子の内部に完全に含まれていることも確認されており
、従って、診断系の抗原として、ＶＰ−１及びＶＰ−２
抗原はどちらも好適な部分抗原であるといえる。
また、ＶＰ−２遺伝子の蛋白コード領域は、ＶＰ−１遺
伝子の内部に完全に含まれていることも確認されており
、従って、診断系の抗原として、ＶＰ−１及びＶＰ−２
抗原はどちらも好適な部分抗原であるといえる。
ｃ問題点を解決するための手段〕
そこで、本発明者らは、ヒトパルボウイルス遺伝子を得
るべく鋭意検討したところ、従来公知のヒトパルボウイ
ルス遺伝子と、アミノ酸レベル及びＤＮＡレベルで幾つ
か構造の異なる新規な、診断系の開発に有用なヒトパル
ボウイルス遺伝子を見出し本発明を完成するに到った。
るべく鋭意検討したところ、従来公知のヒトパルボウイ
ルス遺伝子と、アミノ酸レベル及びＤＮＡレベルで幾つ
か構造の異なる新規な、診断系の開発に有用なヒトパル
ボウイルス遺伝子を見出し本発明を完成するに到った。
即ち、本発明の要旨は、下記式（１）〜式（３）で表さ
れる部分塩基配列を有するヒトパルボウイルス構造蛋白
質ＶＰ−１遺伝子及び下記式（２）〜式（３）で表され
る部分塩基配列を有するヒトパルボウイルス構造蛋白質
ＶＰ−２遺伝子に存する。
れる部分塩基配列を有するヒトパルボウイルス構造蛋白
質ＶＰ−１遺伝子及び下記式（２）〜式（３）で表され
る部分塩基配列を有するヒトパルボウイルス構造蛋白質
ＶＰ−２遺伝子に存する。
式（１）
％式％
式（２）
ＡＧＡＡＧＣＣＡＧＣ
ＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧ
ＧＴＣＡＡＡＡＧＣＡ
ＧＧＧＧＧＣＣＡＣＴ
ＡＣＴＣＴＧＴＡＡＣ
ＴＣＣＡＧＡＣＡＧＴ
ＡＴＡＴＧＡＣＣＣＡ
ＡＴＡＡＧＧＴＧＴＴ
ＧＣＡＡＧＴＡＧＣＴ
ＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧ
ＴＴＴＧＣＡＣＣＡＴ
Ｔ
ＡＡＡＧＴＧＡＴＧＡ
ＡＡＡＡＣＴＧＴＧＴ
ＴＧＴＧＧＡＡＴＴＴ
ＴＴＡＣＧＧＧＡＡＣ
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ＴＣΔＴＴＡＴＡＡＴ
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ＴＴＧＴＡＣＡＴＴＴ
ＴＴＴＴＡＡＴＴＣＣ
ＧＡＧＣＡＣＣＡＴＴ
ＴＴＣＴＣＣＣＮＴＡ
ＧＣＣＡＣＡＡＴＧＣ
ＧＡＧＧＣＡＡＡＧＧ
ＴＡＧＴＣＣＣＡＴＡ
式（３）
％式％
（上記式中、Ｎは構造未決定の塩基を表す。）以下に本
発明を説明する。
発明を説明する。
本発明のヒトパルボウイルス構造蛋白質遺伝子は、分子
量的８４ＫＤａのＶＰ−１遺伝子と分子量的５８ＫＤａ
のＶＰ−２遺伝子の２種類で、ＶＰ−２遺伝子はｖｐ−
ｉ遺伝子の領域内に含まれている。
量的８４ＫＤａのＶＰ−１遺伝子と分子量的５８ＫＤａ
のＶＰ−２遺伝子の２種類で、ＶＰ−２遺伝子はｖｐ−
ｉ遺伝子の領域内に含まれている。
ＶＰ−１遺伝子は、前記式（Ｉ）、式（２）及び式（３
）で表される部分塩基配列を含み、ＶＰ−２遺伝子は、
前記式（２）及び式（３）で表される部分塩基配列を含
む。
）で表される部分塩基配列を含み、ＶＰ−２遺伝子は、
前記式（２）及び式（３）で表される部分塩基配列を含
む。
本発明のヒトパルボウイルス構造蛋白質遺伝子をクロー
ニングするための材料としては、例えば、小児の伝染性
紅斑症（Ｅ Ｉ）の原因ウィルスに感染した成人患者急
性期血清等が挙げられる。
ニングするための材料としては、例えば、小児の伝染性
紅斑症（Ｅ Ｉ）の原因ウィルスに感染した成人患者急
性期血清等が挙げられる。
このような血清中のウィルス粒子を、例えばサッカロー
ス密度勾配遠心によって沈澱させて精製し、得られるウ
ィルス粒子から常法に従っでヒトバルポウィルスＤＮＡ
を抽出・精製して、クローニングに供する。
ス密度勾配遠心によって沈澱させて精製し、得られるウ
ィルス粒子から常法に従っでヒトバルポウィルスＤＮＡ
を抽出・精製して、クローニングに供する。
クローニングは、ヒトパルボウイルスＢＩＱ株の遺伝子
配列（Ｊ、 Ｖｊｒｏｌ、 ５８．９２１−９３６（１
９８６） ）に基づき合成したＤＮＡをプライマーとし
て使用して、ポリメラーセ連鎖反応法ＣＰＣＲ法： Ｎ
ａｔｕｒｅ、ｆｉ…、 １６３（１９８６） ）によっ
て目的とするヒトパルボウイルス構造蛋白質遺伝子を増
幅することができる。
配列（Ｊ、 Ｖｊｒｏｌ、 ５８．９２１−９３６（１
９８６） ）に基づき合成したＤＮＡをプライマーとし
て使用して、ポリメラーセ連鎖反応法ＣＰＣＲ法： Ｎ
ａｔｕｒｅ、ｆｉ…、 １６３（１９８６） ）によっ
て目的とするヒトパルボウイルス構造蛋白質遺伝子を増
幅することができる。
具体的には、例えば、精製したヒトパルボウイルスＤＮ
Ａに、該遺伝子の部分配列からなるＤＮＡブライマーと
該遺伝子に相補的な部分配列からなるＤＮＡブライマー
の２種のＤＮＡブライマーをアニーリングさせ、常法に
従って、該ＤＮＡブライマー間のＤＮＡを増幅させる。
Ａに、該遺伝子の部分配列からなるＤＮＡブライマーと
該遺伝子に相補的な部分配列からなるＤＮＡブライマー
の２種のＤＮＡブライマーをアニーリングさせ、常法に
従って、該ＤＮＡブライマー間のＤＮＡを増幅させる。
得られた各ＤＮＡ断片を、クローニングベクター、例え
ば、ｐＵＣＩ９（東洋紡社製）等に組み込んでクローニ
ングし、得られるクローンからプラスミドＤＮＡを抽出
し、該ベクターに組み込まれているＤＮＡ配列をジデオ
キシ法等により決定することにより、目的とするヒトパ
ルボウイルス構造蛋白質遺伝子の全塩基配列を決めるこ
とができる。
ば、ｐＵＣＩ９（東洋紡社製）等に組み込んでクローニ
ングし、得られるクローンからプラスミドＤＮＡを抽出
し、該ベクターに組み込まれているＤＮＡ配列をジデオ
キシ法等により決定することにより、目的とするヒトパ
ルボウイルス構造蛋白質遺伝子の全塩基配列を決めるこ
とができる。
本発明によれば、ＶＰ−１遺伝子は、前記式（１）、式
（２）及び式（３）で表される部分塩基配列を有してお
り、また、ＶＰ−２遺伝子は、前記式（２）及び式（３
）で表される部分塩基配列を有していることが判った。
（２）及び式（３）で表される部分塩基配列を有してお
り、また、ＶＰ−２遺伝子は、前記式（２）及び式（３
）で表される部分塩基配列を有していることが判った。
これら式（１）〜式（３）で表される塩基配列中、塩基
レベルで１２２個所アミノ酸レベルで６個所が、公知の
ヒトパルボウイルスＢｌｅ株の配列と異なっていた。
レベルで１２２個所アミノ酸レベルで６個所が、公知の
ヒトパルボウイルスＢｌｅ株の配列と異なっていた。
本発明のヒトパルボウイルス構造蛋白質遺伝子は、その
全配列或いはＰＣＲ法で得られるＤＮＡ断片を公知の発
現ベクターに導入し、該発現ベクターで形質転換した宿
主細胞内で発現させることにより、ラジオイムノアッセ
イ法、エンザイムイムノアッセイ法等の診断に使用し得
る組換え抗原を得ることができる。
全配列或いはＰＣＲ法で得られるＤＮＡ断片を公知の発
現ベクターに導入し、該発現ベクターで形質転換した宿
主細胞内で発現させることにより、ラジオイムノアッセ
イ法、エンザイムイムノアッセイ法等の診断に使用し得
る組換え抗原を得ることができる。
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
実施例１
〔■〕ヒトパルボウイルス構造蛋白質遺伝子の調製
小児の伝染性紅斑（Ｅｌ）の流行剤に該原因ウィルスに
感染した成人から血清を採取した。
感染した成人から血清を採取した。
エンザイムイムノアッセイ法及びＤＮＡハイブリダイゼ
ーション法にてヒトパルボウイルス血症を確認できた血
清を選び、ヒトバルポウィルス構造蛋白質遺伝子の材料
とした。
ーション法にてヒトパルボウイルス血症を確認できた血
清を選び、ヒトバルポウィルス構造蛋白質遺伝子の材料
とした。
ウィルスＤＮＡ量が約Ｉｎμｇ／ｍｌの上記血清１ｍｌ
を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ） ｐＨ７，４＋、
：て２倍に希釈し、１２．・０００ｒｐｍ、６０分間遠
心した上清を、３０％サッカロース水溶液２ｍｌ上に重
層した。
を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ） ｐＨ７，４＋、
：て２倍に希釈し、１２．・０００ｒｐｍ、６０分間遠
心した上清を、３０％サッカロース水溶液２ｍｌ上に重
層した。
これを日立超遠心機（ローターＲＰＳ−５６Ｔ）で４℃
ニテ３５． ００ Ｏｒｐｍ、 １５時間遠心してウ
ィルス粒子を沈澱として回収した。
ニテ３５． ００ Ｏｒｐｍ、 １５時間遠心してウ
ィルス粒子を沈澱として回収した。
これを７５ｍＭＮａＣ１−２５ｍＭＥＤＴＡ水溶液（ｐ
Ｈ８，０）に縣濁後、終濃度１％となるようにドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、また、０．１ｍｇ／ｍｌ
プロテイナーゼＫを加えて５６℃にて１時間以上加熱し
てＤＮＡを熱変性させた。
Ｈ８，０）に縣濁後、終濃度１％となるようにドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を、また、０．１ｍｇ／ｍｌ
プロテイナーゼＫを加えて５６℃にて１時間以上加熱し
てＤＮＡを熱変性させた。
この縣濁液中の変性ＤＮＡを常法に従い、フェノール・
クロロホルム抽出、エタノール沈澱によりヒトパルボウ
イルスのＤＮＡを精製した。
クロロホルム抽出、エタノール沈澱によりヒトパルボウ
イルスのＤＮＡを精製した。
このＤＮＡは１０μｍの水に溶解した。
（ＩＩ）ヒトパルボウイルス構造蛋白質遺伝子のクロー
ニング 上記（１）で得たＤＮＡ試料１μｍを用いて、５ａｉｋ
ｉらの方法（Ｎａｔｕｒｅ ３２４．１６３． （１９
８６）〕に準じてＰＣＲ法によってバルポウイルス遺伝
子を増幅した。ＰＣＲ法は宝酒造社製タカラＧｅｎｅ
Ａｍｐ ” ＤＮＡキットを用い、その説明書に従って
行った。
ニング 上記（１）で得たＤＮＡ試料１μｍを用いて、５ａｉｋ
ｉらの方法（Ｎａｔｕｒｅ ３２４．１６３． （１９
８６）〕に準じてＰＣＲ法によってバルポウイルス遺伝
子を増幅した。ＰＣＲ法は宝酒造社製タカラＧｅｎｅ
Ａｍｐ ” ＤＮＡキットを用い、その説明書に従って
行った。
即ち、５０ｍＭＫＣＩ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ
８，３，１，５ｍＭＭｇＣＩｔ０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラ
チンを含む反応液中で、ヒトパルボウイルスＤＮＡ試料
１μｍに第１図に示した６種類の合成りＮＡブライマー
から第２図に示した組合せの２種を選び、それぞれ１０
０ｐ１００ｐをアニーリングさせ、増幅反応を行った。
８，３，１，５ｍＭＭｇＣＩｔ０．１％（Ｗ／Ｖ）ゼラ
チンを含む反応液中で、ヒトパルボウイルスＤＮＡ試料
１μｍに第１図に示した６種類の合成りＮＡブライマー
から第２図に示した組合せの２種を選び、それぞれ１０
０ｐ１００ｐをアニーリングさせ、増幅反応を行った。
ポリメラーゼ連鎖反応は許容量１００μｍの反応液中で
、Ｔａｑポリメラーゼ非存在下で９５℃、５分間反応後
、Ｔａｑポリメラーゼ存在下で９５℃、１分−３０〜３
７℃、１分−７２℃、１分のサイクルで増幅反応を３５
サイクル行ったのち、さらに７２℃、７分間反応させた
。
、Ｔａｑポリメラーゼ非存在下で９５℃、５分間反応後
、Ｔａｑポリメラーゼ存在下で９５℃、１分−３０〜３
７℃、１分−７２℃、１分のサイクルで増幅反応を３５
サイクル行ったのち、さらに７２℃、７分間反応させた
。
上記方法によって、第２図に示した４個のＤＮＡ断片を
得た。
得た。
これらＤＮＡ断片は、さらにＴ４ポリメラーゼで平滑末
端化し、ポリヌクレオチドキナーゼで５′末端にリン酸
基を導入後、ｐＵＣ１９クローニングベクターに組み込
み、大腸菌を形質転換し、形質転換体を培養してそれぞ
れ約１００個以上のクローンを得た。
端化し、ポリヌクレオチドキナーゼで５′末端にリン酸
基を導入後、ｐＵＣ１９クローニングベクターに組み込
み、大腸菌を形質転換し、形質転換体を培養してそれぞ
れ約１００個以上のクローンを得た。
得られたクローンからＤＮＡを常法により調製し、デュ
ポン社製蛍光シークエンサーＧＥＮＥＳＩＳ ２００
０を用いて各ＤＮＡ断片の部分塩基配列を決定した。そ
の配列を第３図に示した。
ポン社製蛍光シークエンサーＧＥＮＥＳＩＳ ２００
０を用いて各ＤＮＡ断片の部分塩基配列を決定した。そ
の配列を第３図に示した。
第１図は、実施例で使用した６種類の合成りＮＡプライ
マー（ＯＮ １〜０Ｎ６）の塩基配列（５”→３′）を
表す。 第２図は、実施例で使用した６種類の合成りＮＡプライ
マー（ＯＮ １〜０Ｎ６）及びクローニングした４種の
ヒトパルボウイルスのＤＮＡ断片のＶＰ−１遺伝子及び
ＶＰ−２遺伝子に対する位置を示す。図中の塩基配列番
号は、ヒトパルボウイルスＢｌＱ株の塩基配列番号に合
わせた。また、各ＤＮＡ断片における←→は、第３図に
示した塩基配列のＤＮＡの位置を示す。 第３図は、実施例で決定した４種のＤＮＡ断片の部分塩
基配列を表す。図中、Ｂ１９株の遺伝子と異なる塩基に
一印を、また、アミノ酸が異なる部分に一印を付した。
マー（ＯＮ １〜０Ｎ６）の塩基配列（５”→３′）を
表す。 第２図は、実施例で使用した６種類の合成りＮＡプライ
マー（ＯＮ １〜０Ｎ６）及びクローニングした４種の
ヒトパルボウイルスのＤＮＡ断片のＶＰ−１遺伝子及び
ＶＰ−２遺伝子に対する位置を示す。図中の塩基配列番
号は、ヒトパルボウイルスＢｌＱ株の塩基配列番号に合
わせた。また、各ＤＮＡ断片における←→は、第３図に
示した塩基配列のＤＮＡの位置を示す。 第３図は、実施例で決定した４種のＤＮＡ断片の部分塩
基配列を表す。図中、Ｂ１９株の遺伝子と異なる塩基に
一印を、また、アミノ酸が異なる部分に一印を付した。
Claims (1)
- （１）下記式（１）〜式（３）で表される部分塩基配列
を有するヒトパルボウイルス構造蛋白質ＶＰ−１遺伝子
。 式（１） 【遺伝子配列があります。】 式（２） 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 式（３） 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 （上記式中、Ｎは構造未決定の塩基を表す。）（２）下
記式（２）又は式（３）で表される部分塩基配列を有す
るヒトパルボウイルス構造蛋白質ＶＰ−２遺伝子。 式（２） 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 式（３） 【遺伝子配列があります。】 【遺伝子配列があります。】 （上記式中、Ｎは構造未決定の塩基を表す。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20282790A JPH0488985A (ja) | 1990-07-31 | 1990-07-31 | ヒトパルボウィルス構造蛋白質遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20282790A JPH0488985A (ja) | 1990-07-31 | 1990-07-31 | ヒトパルボウィルス構造蛋白質遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0488985A true JPH0488985A (ja) | 1992-03-23 |
Family
ID=16463849
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20282790A Pending JPH0488985A (ja) | 1990-07-31 | 1990-07-31 | ヒトパルボウィルス構造蛋白質遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0488985A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6413716B1 (en) | 1995-06-26 | 2002-07-02 | The Japanese Red Cross Society | Method for detection of human parvovirus and reagent therefor |
| US7094541B2 (en) | 2001-08-31 | 2006-08-22 | Gen-Probe Incorporated | Assay for detection of human parvovirus B19 nucleic acid |
-
1990
- 1990-07-31 JP JP20282790A patent/JPH0488985A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6413716B1 (en) | 1995-06-26 | 2002-07-02 | The Japanese Red Cross Society | Method for detection of human parvovirus and reagent therefor |
| US7094541B2 (en) | 2001-08-31 | 2006-08-22 | Gen-Probe Incorporated | Assay for detection of human parvovirus B19 nucleic acid |
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