CN113943375B - 一类来源于新型冠状病毒s2蛋白hr区域的重组融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白及其应用。该类新型冠状病毒重组融合蛋白是由新型冠状病毒膜蛋白S2蛋白的两个膜融合相关的保守氨基酸序列HR1和HR2通过连接肽连接得到的重组融合蛋白。该重组融合蛋白可在大肠杆菌中诱导表达，表达量高，同时易于纯化。本发明提供的新型冠状病毒重组融合蛋白，可以形成并维持稳定的二聚体结构，模拟新型冠状病毒膜融合中间态的构象，可作为检测新型冠状病毒膜融合过程的检测原料；具有很好的抗新型冠状病毒活性和很好的免疫原性，在预防或治疗新型冠状病毒蛋白药物开发以及新型冠状病毒疫苗和抗新型冠状病毒抗体开发领域具有广阔的应用前景。

Description

一类来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白及其 应用

技术领域

本发明涉及新型冠状病毒重组融合蛋白，特别涉及一类来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白及其应用。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)为具有包膜，基因组为线性的单股正链RNA病毒，属于巢病毒目(Nidovirales)冠状病毒科Coronaviridae)正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)，β属的新型冠状病毒。新型冠状病毒在2019年被发现，随后在世界范围内引起大流行，具有潜伏期人传人的特性，传播速度较快，可引起感染人员轻度、中度和重度肺部和呼吸道等器官的多种类型的症状，为高致病性病原。2020年2月12日世界卫生组织将SARS-CoV-2导致的疾病正式命名为COVID-19。

新型冠状病毒基因组大小为26kb-30kb，含多个开发性读码框，可编码4个主要的结构蛋白和16个非结构蛋白。其主要结构蛋白为外壳spike蛋白(S)，跨膜蛋白(M)和小膜蛋白(E)和核衣壳蛋白(N)。其中，外壳spike蛋白(S)为三聚体，在病毒进入宿主细胞中发挥重要的作用。外壳spike蛋白单体由S1蛋白和S2蛋白组成。在病毒与宿主细胞靠近时，S1蛋白的RBD结构域能和宿主细胞的ACE2受体相互结合，诱发了病毒的吸附和进入细胞过程，同时，S1蛋白与S2蛋白发生切割。S2蛋白上有两个重要的功能结构域：HR1和HR2。这两个结构域随后相互结合，形成HR1-HR2的3聚体的6个HR螺旋结构，进一步拉近了病毒膜和细胞膜的距离，促使病毒膜和细胞膜相互融合，诱导病毒进入细胞。

目前，新型冠状病毒蛋白疫苗和抗体的研发主要针对新冠S1蛋白的RBD结构域；对S2蛋白上HR1和HR2结构域研究较少。HR1和HR2结构域可介导病毒与宿主膜融合，是新冠药物和疫苗的设计靶点之一。但如何模拟HR1和HR2结构域融合前的天然构象，抑制HR1和HR2的结合，阻断新型冠状病毒与细胞膜的融合过程，是目前抗新冠药物和新冠疫苗的设计难点。目前，还没有检索到相关的专利和文献。专利号CN202011346373.6“一种跨膜表达新型冠状病毒抗原S2的融合蛋白、重组载体、重组树突状细胞及其应用”公开的融合蛋白包括顺次链接的CD4信号肽、新型冠状病毒抗原S2蛋白、Flag标签序列和CD4跨膜结构域。同本发明相比，采用的是完全不同的策略。

发明内容

本发明的目的在于提供一类稳定的新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一类新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白HR121或HR212，由来源于新型冠状病毒S2蛋白的HR1区的截段蛋白HR1、HR2区的截段蛋白HR2以及将二者偶联的连接肽构成，所述的HR121的蛋白结构为HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1；所述的HR212的蛋白结构为HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2，其中所述的HR1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或包含在SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中替换、缺失或插入1个或数个氨基酸的序列；所述的HR2氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示或包含在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列中替换、缺失或插入1个或数个氨基酸的序列，所述的Linker1、Linker2的氨基酸序列分别SEQ ID NO.3-4所示。

进一步地，所述的HR1氨基酸序列如SEQ ID NO.11-13所示；所述的HR2氨基酸序列如SEQ ID NO.14-16所示。

进一步地，所述的新型冠状病毒重组融合蛋白HR121的其氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。

进一步地，所述的新型冠状病毒重组融合蛋白HR212的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步地，所述的编码HR121的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

进一步地，所述的编码HR212的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

本发明还保护一种表达来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白的载体，其特征在于HR121骨架载体、HR212骨架载体，所述的HR121骨架载体、HR212骨架载体分别包含有权利要求4、5所述的核苷酸序列。

本发明还保护来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白在制备抗原检测试剂以及预防或治疗新冠病毒药物中的应用。

另外，本发明还保护来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白作为免疫原在制备新冠病毒疫苗和抗体中的应用。

由于来源于新型冠状病毒S2蛋白的HR区域，本发明提供的一类新型冠状病毒重组蛋白HR121和HR212，能够模拟新型冠状病毒膜融合中间态构象，作用于新型冠状病毒膜融合阶段。为抑制新型冠状病毒复制的新型靶点，与目前报道的来源于新型冠状病毒S1蛋白的重组RBD蛋白(作用于新型冠状病毒吸附阶段)，有较明显的区别。而且，这两个蛋白在动物体内可诱导高亲和力的中和新型冠状病毒抗体，其抗体活性和动物保护效果与目前报道的RBD蛋白诱导的抗体活性相当(Nature.2020Oct；586(7830):572-577.doi:10.1038/s41586-020-2599-8.)。

相对现有技术，本发明的有益效果：

1.本发明提供的新型冠状病毒重组融合蛋白，可以形成并维持稳定的二聚体结构，模拟新型冠状病毒膜融合中间态的构象，可作为检测新型冠状病毒膜融合过程的检测原料。

2.本发明提供的新型冠状病毒重组蛋白，具有很好的抗新型冠状病毒活性，在预防或治疗新型冠状病毒蛋白药物开发领域具有广阔的应用前景。

3.本发明提供的新型冠状病毒重组蛋白，具有很好的免疫原性，可在动物体内诱导高亲和力的新型冠状病毒中和抗体，保护新冠病毒易感动物如：金黄地鼠，免受病毒感染。在新型冠状病毒疫苗和抗新型冠状病毒抗体开发领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是新型冠状病毒重组融合蛋白HR121和HR212结构示意图；其中，HR121融合蛋白由HR1－linker1－HR2－linker2－HR1连接而成；HR212由HR2－linker2－HR1－linker1－HR2连接而成。

图2是新型冠状病毒重组融合蛋白HR121和HR212的SDS-PAGE分析图，其中图2A为HR121电泳图。M(Marker)：170kDa,130kDa,100kDa,70kDa,55kDa,40kDa,35kDa,25kDa,15kDa,10kDa(从上至下)；1：HR121(20μg)；2：HR121(50μg)；3：HR121(50μg)；图2B为HR212电泳图。M(Marker)：170kDa,130kDa,100kDa,70kDa,55kDa,40kDa,35kDa,25kDa,15kDa,10kDa(从上至下)；1：HR212(10μg)；2：HR212(20μg)；3：HR212(50μg)。

图3是新型冠状病毒重组融合蛋白HR121和HR212的圆二色谱分析二级结构图。其中图3A为HR121可形成α螺旋结构图；图3B为HR212可形成α螺旋结构图。

图4是新型冠状病毒重组融合蛋白HR121和HR212的抗新型冠状病毒活性图。

图5是新型冠状病毒重组融合蛋白HR121和HR212免疫兔子后抗体滴度图。

图6是新型冠状病毒重组蛋白HR121和HR212兔抗血清均能高效抑制新冠假病毒进入293T-ACE2细胞。

图7是新型冠状病毒重组蛋白HR121和HR212免疫兔子后兔血清抗新型冠状病毒活性图。

图8是新型冠状病毒重组蛋白HR121和HR212免疫兔子后兔抗体抗新型冠状病毒活性图。

图9是新型冠状病毒重组蛋白HR121免疫地鼠后，能够高效抑制新型冠状病毒感染地鼠肺组织。

图10是新型冠状病毒其它3个HR121和3个HR212在HR1和HR2区缺失不同氨基酸的序列比较图。

图11是新型冠状病毒HR1和HR2区不同氨基酸序列缺失的其它3个HR121和3个HR212重组蛋白的SDS-PAGE电泳图；M：Marker:100kDa,70kDa,40kDa,25kDa,20kDa,15kDa,10kDa(从上至下)；1：HR121-1(20μg)；2：HR121-2(20μg)；3：HR121-3(20μg)；4：HR212-1(20μg)；5：HR212-2(20μg)；6：HR212-3(20μg)。

图12是新型冠状病毒HR1和HR2区不同氨基酸序列缺失的其它3个HR121和3个HR212重组蛋白也具抑制新型冠状病毒活性。

具体实施方式

下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。

一、材料和试剂：

1.主要材料

病毒：新型冠状病毒(SARS-CoV-2)临床分离株(序列号：NMDCN0000HUI)；

新冠假病毒(由VSVΔG-*G和pcDNA3.1-SARS-CoV-2-envΔ18共转染293FT细胞，包装获得的假病毒)；

质粒扩增菌株：E.coli DH5α感受态；蛋白表达菌株：E.coli BL21(DE3)感受态(北京诺唯赞)。

2.主要试剂

LB培养基，2×YT培养基(Sigma)；

DMEM培养基，FBS(Gibco)；

jetPRIME转染试剂(polyplus-transfection,Illkirch,France)

卡那霉素(Sigma-Aldrich，St Louis,USA)

无内毒素质粒小提，质粒大提试剂盒(天根，北京)

TaKaRa BCA Protein Assay Kit(宝生物，北京)

CCK8试剂盒(碧云天，上海)

罗氏病毒RNA提取试剂盒(Roche Diagnostics,Mannheim,Germany)

Renilla Luciferase试剂盒(Promega,Madison,USA)

Trizol试剂(Invitrogen,CA,USA)

Protein A填料纯化试剂盒(BBI life science,上海)

二、实施例

实施例1：新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白表达载体pET-30a-SARS-CoV-2-HR121和pET-30a-SARS-CoV-2-HR212的构建

1.1.pET-30a-SARS-CoV-2-HR121载体的构建：

将新型冠状病毒HR121的核苷酸序列(SEQ ID NO.7)进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)进入pET-30a载体的EcoRI(GAATTC)和XhoI(CTCGAG)酶切位点之间。

将合成的pET-30a-SARS-CoV-2-HR121载体转化进入E.coli DH5α感受态。用含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基37℃培养12h后，小量提取质粒后备用。

1.2.pET-30a-SARS-CoV-2-HR212载体的构建：

将新型冠状病毒HR212的核苷酸序列(SEQ ID NO.8)进行基因合成(上海捷瑞生物工程有限公司)进入pET-30a载体的EcoRI(GAATTC)和XhoI(CTCGAG)酶切位点之间。

将合成的pET-30a-SARS-CoV-2-HR212载体转化进入E.coli DH5α感受态,用含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基37℃培养12h后，小量提取质粒后备用。

HR121和HR212的结构如图1所示。

实施例2：新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白HR121和HR212的诱导表达和纯化

2.1.将质粒按照常规的转化方法，将pET-30a-SARS-CoV-2-HR121或pET-30a-SARS-CoV-2-HR212质粒转化到BL21(DE3)感受态细胞中；

2.2.挑单克隆，用含5mL有kan的2×YT培养基，放37度培养基摇菌，摇至浑浊，接种100μL菌液到100mL的2×YT培养基中，一共接种500mL，37度180rpm摇菌过夜(12h)；

2.3.称取0.238g IPTG用1mL水溶解，每100mL中加100μL IPTG溶液，20度，140rpm摇过夜(12h)；

2.4.收集菌液，用20mM咪唑溶液重悬，每100mL菌液用5mL 20mM咪唑溶液重悬；

2.5.超声破碎，超1s停1s,216000Joules，超声时注意冰浴，防止温度过高，破坏蛋白，超声使得浑浊的菌液变稍透明(约超声10-20分钟左右)；

2.6.向超声后的菌液加入10％Tritonx100,至终浓度为1％，冰上放置30min；

2.7.12000rpm离心30min，将上清倒入新的离心管中，重复一次，再将上清倒入新的离心管中；

2.8.样品上镍柱(GE Ni SepharoseTM6 Fast Flow；货号：17-5318-06)，上柱前，用10倍体积的20mM咪唑溶液洗柱子，洗完后，上柱；

2.9.样品上完后，用20倍柱体积(40mL)20mM咪唑溶液洗，以除去杂蛋白；

2.10.再用5倍柱体积(10mL)100mM咪唑溶液洗，除去杂蛋白；

2.11.洗完后，用25倍柱体积(50mL)200mM咪唑溶液洗脱目的蛋白；

2.12.用15mL 10KD的浓缩管分批次浓缩目的蛋白，样品上完后，用PBS溶液置换200mM咪唑溶液，即：样品浓缩完后，向浓缩管加入PBS溶液，离心，置换200mM咪唑溶液，反复离3次，以确保蛋白溶解液为PBS；

2.13.将浓缩后的蛋白溶液约1.5mL吸入1.5mL EP管内，用BCA试剂盒定量蛋白浓度。分装成小管，以避免反复冻融。

实施例3：新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白HR121和HR212的SDS-PAGE蛋白电泳分析

3.1.将纯化的蛋白用BCA试剂盒定量。

3.2.各取50μg的HR121和HR212蛋白，使用10％SDS-PAGE胶进行电泳分离。电泳结束后，使用考马斯亮蓝法进行染色和脱色。分析检测结果如图2所示，HR121蛋白大小为28kDa左右，HR212蛋白大小为24kDa左右。

实施例4：新型冠状病毒重组蛋白HR121和HR212的圆二色谱分析二级结构分析

4.1.新型冠状病毒重组蛋白HR1和HR2的表达载体构建和蛋白纯化：将新型冠状病毒HR1核苷酸编码序列(SEQ ID NO.9)和新型冠状病毒HR2核苷酸编码序列(SEQ ID NO.10)分别连入pET-30a载体的EcoRI(GAATTC)和XhoI(CTCGAG)酶切位点之间，按实施例2的方法进行蛋白纯化，得到新型冠状病毒重组蛋白HR1和HR2。

4.2.使用Jasco spectropolarimeter(model J-815)分别检测1μM HR121,1μMHR121+1μMHR2,1μM HR212,1μM HR212+1μM HR2的光吸收。检测HR121蛋白和HR2蛋白的结合能力；HR212蛋白和HR1蛋白的结合能力。

分析检测结果如图3所示，HR121蛋白能与HR2蛋白结合，形成稳定的ɑ螺旋结构。HR212蛋白能与HR1蛋白结合，形成稳定的ɑ螺旋结构，因此，这两个蛋白可用于制备新型冠状病毒抗原检测试剂。

实施例5：新型冠状病毒重组蛋白HR121和HR212的抗新型冠状病毒活性检测

采用CCK8方法检测细胞抗病毒活性。

5.1.在96孔细胞培养板上，每孔接种100μl的5×105个/mL的Vero E6细胞，CO₂培养箱37℃培养过夜。

5.2.然后，每孔加入50μl的MOI为0.1的SARS-CoV-2病毒感染细胞，同时，每孔加入50μl的梯度稀释的的新型冠状病毒重组蛋白HR121和HR212。孵育2h后，更换为200μl的含梯度稀释的的新型冠状病毒重组融合蛋白HR121和HR212的新鲜培养基。

5.3.CO₂培养箱37℃培养72h后，在培养上清中加入CCK8试剂，在酶标仪上读OD450值，定量分析SARS-CoV-2引起的细胞病变效应和HR121和HR212对细胞病变的保护作用。

分析检测结果如图4所示，从图4(A)可以看出HR121可抑制新型冠状病毒诱发的Vero-E6细胞病变，且HR121蛋白保护SARS-CoV-2引起的细胞病变效应的EC₅₀在0.891μM；图4(B)可以看出HR212可抑制新型冠状病毒诱发的Vero-E6细胞病变，且HR212蛋白保护SARS-CoV-2引起的细胞病变效应的EC₅₀在0.583μM。表明这两个融合蛋白具有较好的抗SARS-CoV-2活性。

实施例6新型冠状病毒重组蛋白HR121和HR212免疫成年新西兰大白兔程序

6.1.初免：用PBS溶液稀释实施例3中制备的新型冠状病毒重组蛋白HR121或HR212，使蛋白浓度为200μg/mL。加入等体积的弗氏完全佐剂，与蛋白溶液混匀成白色乳胶状，每只兔子皮下多点免疫1ml(蛋白含量为100μg/只)。

6.2.加强免疫：在21天，42天进行两次加强免疫。用PBS溶液稀释实施例3中制备的新型冠状病毒重组蛋白HR121或HR212，使蛋白浓度为300μg/mL。加入等体积的弗氏不完全佐剂，与蛋白溶液混匀成白色乳胶状，每只兔子皮下多点免疫1ml(蛋白含量为150μg/只)。同时设不含蛋白的阴性对照免疫组。

6.3.在第56天对免疫的兔子进行心脏采血，收集血清，-80℃分装保存。

实施例7：新型冠状病毒重组蛋白HR121和HR212兔血清抗体滴度的测定。

7.1.1μg/ml的HR121或HR212蛋白溶于ELISA包被缓冲液100μl/孔于4℃包被过夜，或37℃包被2小时；

7.2.ELISA洗涤缓冲液洗涤3次，3分钟/次，每孔加入100μl的PBS-5％脱脂奶粉，37℃封板2小时；

7.3.洗板同上，每孔加入100μl的稀释血清，37℃/2小时；

7.4.洗板同上，加入100μl的1：5000稀释的羊抗兔IgG-HRP(或抗鼠IgG-HRP)，37℃，1小时；洗板同上，加入OPD底物反应液。10分钟后，2M硫酸终止反应；

7.5.ELISA仪测定OD490/630nm值。

7.6.根据ELISA的读值，样品OD值>0.12+阴性对照OD值为阳性。

分析检测结果如图5所示，HR121和HR212蛋白的抗兔血清滴度均在106-107之间。表明这两个蛋白在动物体内均能诱导较高滴度的抗体。

实施例8：新型冠状病毒重组蛋白HR121和HR212兔抗血清中和SARS-CoV-2假病毒抗体滴度的测定。

8.1.新型冠状病毒假病毒的制备和病毒滴定：按照转染试剂jetPRIME的操作说明，将带有pCDNA3.1-SARS-CoV-2-Spike-Δ18质粒10μg与500μL的jetPRIMEBuffer混匀，加入20μL的jetPRIMERegent混合，混匀后室温静置10min，将混合液逐滴加入T75培养瓶的239T细胞中，37℃、5％的CO₂培养12h候后将培养液弃去，加入MOI＝1的VSVΔG-VSVG假病毒感染，感染后6h用PBS洗涤3次，换成新鲜DMEM培养基继续培养，24和48小时后收获含SARS-CoV-2假病毒的上清。1000rpm/min离心10min离心后收集上清分装于-80℃保存。并用239T-ACE2细胞进行病毒滴度测定。

8.2.HR121和HR212兔血清中和SARS-CoV-2假病毒能力测定：在96孔细胞培养板上，每孔加入100μl的239T-ACE2(2×105个/ml)培养12h,然后在另一块96孔细胞培养板上，加入50μl梯度稀释的HR121或HR212抗兔血清溶液，每个稀释度三个重复孔，每孔加入50μl的MOI为0.1的SARS-CoV-2假病毒。同时设置不含蛋白的阳性对照孔和不含病毒的阴性对照孔。37℃孵育1h后将病毒和蛋白的混合液加入细胞。CO₂培养箱37℃培养48h后，用RenillaLuciferase试剂盒检测SARS-CoV-2假病毒的荧光表达强度，计算HR121或HR212抗兔血清的EC₅₀值。

分析检测结果如图6所示，HR121蛋白兔抗血清中和SARS-CoV-2假病毒的EC₅₀值11536倍血清稀释。HR212蛋白的兔抗血清中和SARS-CoV-2假病毒的EC₅₀值636倍血清稀释。表明这两个蛋白的抗体可能具有较好的抗SARS-CoV-2病毒进入细胞活性。

实施例9：新型冠状病毒重组蛋白HR121和HR212兔血清中和SARS-CoV-2病毒的抗血清滴度测定。

在48孔细胞培养板上，每孔加入200μl的HPAEpiC(5×10⁵个/ml)培养12h，弃上清，每孔加入100μl梯度稀释的HR121或HR212抗兔血清的DMEM培养基，每个稀释度三个重复孔，然后加入100μl的MOI为1的SARS-CoV-2病毒。同时设置不含蛋白的阳性对照孔和不含病毒的阴性对照孔。37℃孵育2h后弃上清，用PBS洗涤细胞3次，加入200μl梯度稀释的HR121或HR212抗兔血清的DMEM培养基。CO₂培养箱37℃培养48h后，取上清，用罗氏病毒RNA提取试剂盒提取培养上清中的RNA。采用定量PCR方法检测上清中的病毒RNA含量，定量PCR的引物为：SARS-CoV-2-F：5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3'；SARS-CoV-2-R：5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3'；SARS-CoV-2-probe：FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'.根据病毒RNA的含量计算HR121或HR212抗兔血清的EC₅₀值。

分析检测结果如图7所示，HR121蛋白抗兔血清中和SARS-CoV-2病毒的EC₅₀为8515倍血清稀释值。HR212蛋白的抗兔血清抗兔血清中和SARS-CoV-2病毒的EC₅₀值为1308倍血清稀释。表明这两个蛋白的抗兔血清具有较好的抗SARS-CoV-2病毒复制的活性。

实施例10：新型冠状病毒重组融合蛋白HR121和HR212兔抗体的纯化及其抑制SARS-CoV-2病毒复制活性的测定。

10.1.新型冠状病毒重组蛋白HR121和HR212兔抗体的纯化：采用Protein A填料纯化试剂盒对HR121和HR212蛋白的抗兔血清进行过柱，纯化得到HR121和HR212抗兔IgG多克隆抗体。

10.2.HR121和HR212兔抗体抑制SARS-CoV-2病毒复制活性的测定：检测方法同实施例9，只是将检测样品“梯度稀释的HR121或HR212抗兔血清”换为“梯度稀释的HR121或HR212兔抗体”。

分析检测结果如图8所示，HR121蛋白兔抗体中和SARS-CoV-2病毒的EC₅₀为1.52μg/mL。HR212蛋白兔抗体中和SARS-CoV-2病毒的EC₅₀值为39.22μg/mL。表明这两个蛋白的抗体具有较好的抗SARS-CoV-2病毒复制的活性。

实施例11：新型冠状病毒重组蛋白HR121作为疫苗对感染SARS-CoV-2病毒的金黄地鼠的保护作用

11.1.新型冠状病毒重组蛋白HR121免疫8周龄金黄地鼠。初免：用PBS溶液稀释实施例3中制备的新型冠状病毒重组蛋白HR121，使蛋白浓度为100μg/mL。加入等体积的弗氏完全佐剂，与蛋白溶液混匀成白色乳胶状，每只地鼠皮下多点免疫0.3ml(蛋白含量为15μg/只)。加强免疫：在14天，28天进行两次加强免疫。用PBS溶液稀释实施例3中制备的新型冠状病毒重组蛋白HR121，使蛋白浓度为100μg/mL。加入等体积的弗氏不完全佐剂，与蛋白溶液混匀成白色乳胶状，每只兔子皮下多点免疫0.3ml(蛋白含量为15μg/只)。同时设不含蛋白的阴性对照免疫组和不含佐剂的阴性对照组。

11.2.对地鼠的保护作用：在42天进行地鼠攻毒，攻毒剂量为TCID50＝104的SARS-CoV-2病毒，攻毒后3天解剖地鼠。取肺组织，用Trizol试剂提取肺组织RNA。采用定量PCR方法检测上清中的病毒RNA含量，定量PCR的引物为：SARS-CoV-2-F：5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3'；SARS-CoV-2-R：5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3'；SARS-CoV-2-probe：FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'。根据病毒RNA的含量计算HR121对SARS-CoV-2病毒感染地鼠的保护作用。

分析检测结果如图9所示，HR121蛋白免疫金黄地鼠后，能够保护金黄地鼠免受SARS-CoV-2的感染，是一种较好的预防新型冠状病毒SARS-CoV-2感染的候选蛋白疫苗。

实施例12：HR1区和HR2区氨基酸序列部分缺失的其它HR121和HR212的表达载体构建和纯化

对HR1或HR2氨基酸序列进行改造：缺失部分氨基酸的其它3个HR121蛋白：HR121-1,HR121-2,HR121-3和其它3个HR212蛋白：HR212-1,HR212-2,HR212-3。其表达纯化方式同实施例2HR121和HR212。

在HR1氨基酸序列(SEQ ID NO.1)和HR2氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的基础上，对HR1和HR2区的氨基酸序列进行部分缺失，缺失后的序列分别为HR1-①，HR1-②，HR1-③，所述的HR1-①，HR1-②，HR1-③的氨基酸序列如SEQ ID NO.11-13所示，HR2-①，HR2-②，HR2-③的氨基酸序列如SEQ ID NO.14-16所示。其缺失的氨基酸序列比较如图10所示。

以这些HR1和HR2序列为基础，构建了3个其它的HR121蛋白和3个HR212蛋白。分别将它们命名为HR121-1，HR121-2，HR121-3和HR212-1，HR212-2，HR212-3。其中，HR121-1的氨基酸序列以HR1-①－Linker1－HR2-①－linker2－HR1-①连接而成；HR121-2的氨基酸序列以HR1-②－Linker1－HR2-②－linker2－HR1-②连接而成；HR121-3的氨基酸序列以HR1-③－Linker1－HR2-③－linker2－HR1-③连接。HR212-1的氨基酸序列以HR2①－Linker2－HR1①－linker1－HR2①连接而成；HR212-2的氨基酸序列以HR2-②－Linker1－HR1-②－linker2－HR2-②连接而成；HR212-3的氨基酸序列以HR2-③－Linker1－HR1-③－linker2－HR2-③连接而成。

将它们的核苷酸编码序列连入pET-30a载体后，按实施例1-3的方法，进行蛋白纯化，纯化后蛋白SDS-PAGE电泳图见附图11所示。其中，HR121-1蛋白大小为18kDa左右，HR121-2蛋白大小为19kDa左右，HR121-3蛋白大小为19kDa左右。HR212-1蛋白大小为18kDa左右；HR212-2蛋白大小为19kDa左右；HR212-3蛋白大小为19kDa左右。

实施例13：HR1区和HR2区氨基酸序列部分缺失的其它HR121和HR212也具有抗病毒活性。

按实施例5的方法，对这3个HR121和3个HR212的抗新型冠状病毒活性检测，发现HR1区和HR2区氨基酸序列部分缺失的其它HR121和HR212仍然具有抗病毒活性。结果如附图12所示，其中，HR121-1抗新型冠状病毒活性的EC₅₀值为0.672μM，HR121-2的EC₅₀值为0.614μM，HR121-3的EC₅₀值<1μM。HR212-1抗新型冠状病毒活性的EC₅₀值为0.157μM，HR212-2的EC₅₀值为0.128μM，HR212-3的EC₅₀值为0.736μM。新型冠状病毒HR1和HR2区不同氨基酸序列缺失的其它3个HR121和3个HR212重组蛋白也具抑制新型冠状病毒活性。

上述结果说明，新型冠状病毒HR1和HR2区不同氨基酸序列缺失的其它3个HR121和3个HR212重组蛋白也能够模拟新型冠状病毒膜融合中间态的构象，具有抑制新型冠状病毒复制的活性。而且，可作为免疫原，诱导产生较强的中和抗体，表现出较好的免疫原性。

本发明制备的新型冠状病毒重组蛋白HR121或HR212来源于新型冠状病毒S2蛋白的HR区域，能够模拟新型冠状病毒膜融合中间态构象。这两个蛋白作用于新型冠状病毒膜融合阶段，其自身具有一定的抗新型冠状病毒活性，有望用于制备新型的新型冠状病毒检测试剂原料和预防或治疗性药物。

而将新型冠状病毒重组蛋白HR121或HR212作为免疫原，可在兔子体内可诱导高亲和力的中和新型冠状病毒抗体。在使用新型冠状病毒重组蛋白HR121免疫金黄地鼠后，可基本保护金黄地鼠免受新型冠状病毒感染。其抗体活性和动物保护效果与目前报道的来源于新型冠状病毒S1蛋白的RBD疫苗诱导的抗体活性相当(Nature.2020Oct；586(7830):572-577.doi:10.1038/s41586-020-2599-8.)。因此，本发明制备的新型冠状病毒SARS-CoV-2重组蛋白HR121或HR212可具有开发为新型的新型冠状病毒蛋白疫苗的应用前景。

总之，本发明一些实例的新型冠状病毒重组蛋白HR121或HR212，有望用于制备新型的新型冠状病毒检测试剂原料、药物，疫苗和抗体。

为本领域的专业技术人员容易理解，以上所述仅为本发明专利的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均落在本发明要求的保护范围之内，如将上述实施例中HR1或HR2肽段氨基酸进行删减或修饰，宿主细胞改为酵母细胞、大肠杆菌或哺乳细胞等等，从而根据宿主细胞选择相应的骨架载体，进行同以上实验例类似的表达新型冠状病毒重组蛋白HR121或HR212，以及将新型冠状病毒重组蛋白HR121或HR212作为疫苗或制备其抗体等，均落在本发明要求的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院昆明动物研究所

<120> 一类来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白及其应用

<130> 1

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 77

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe

1 5 10 15

Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser

20 25 30

Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu

35 40 45

Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser

50 55 60

Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu

65 70 75

<210> 2

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn

1 5 10 15

Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn

20 25 30

Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr

35 40

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gly Gly Ser Gly Gly

1 5

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ser Gly Gly Arg Gly Gly

1 5

<210> 5

<211> 209

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe

1 5 10 15

Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser

20 25 30

Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu

35 40 45

Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser

50 55 60

Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Gly Gly Ser

65 70 75 80

Gly Gly Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val

85 90 95

Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn

100 105 110

Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Ser Gly

115 120 125

Gly Arg Gly Gly Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile

130 135 140

Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser

145 150 155 160

Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn

165 170 175

Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly

180 185 190

Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val

195 200 205

Glu

<210> 6

<211> 176

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn

1 5 10 15

Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn

20 25 30

Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Ser Gly Gly Arg

35 40 45

Gly Gly Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr

65 70 75 80

Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln

85 90 95

Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile

100 105 110

Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala

130 135 140

Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala

145 150 155 160

Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr

165 170 175

<210> 7

<211> 630

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acacagaatg ttctctatga gaaccaaaaa ttgattgcca accaatttaa tagtgctatt 60

ggcaaaattc aagactcact ttcttccaca gcaagtgcac ttggaaaact tcaagatgtg 120

gtcaaccaaa atgcacaagc tttaaacacg cttgttaaac aacttagctc caattttggt 180

gcaatttcaa gtgttttaaa tgatatcctt tcacgtcttg acaaagttga gggaggaagc 240

ggaggagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 300

aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 360

caagaacttg gaaagtatag cggaggaaga ggaggaacac agaatgttct ctatgagaac 420

caaaaattga ttgccaacca atttaatagt gctattggca aaattcaaga ctcactttct 480

tccacagcaa gtgcacttgg aaaacttcaa gatgtggtca accaaaatgc acaagcttta 540

aacacgcttg ttaaacaact tagctccaat tttggtgcaa tttcaagtgt tttaaatgat 600

atcctttcac gtcttgacaa agttgagtaa 630

<210> 8

<211> 531

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatgttgatt taggtgacat ctctggcatt aatgcttcag ttgtaaacat tcaaaaagaa 60

attgaccgcc tcaatgaggt tgccaagaat ttaaatgaat ctctcatcga tctccaagaa 120

cttggaaagt atagcggagg aagaggagga acacagaatg ttctctatga gaaccaaaaa 180

ttgattgcca accaatttaa tagtgctatt ggcaaaattc aagactcact ttcttccaca 240

gcaagtgcac ttggaaaact tcaagatgtg gtcaaccaaa atgcacaagc tttaaacacg 300

cttgttaaac aacttagctc caattttggt gcaatttcaa gtgttttaaa tgatatcctt 360

tcacgtcttg acaaagttga gggaggaagc ggaggagatg ttgatttagg tgacatctct 420

ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc 480

aagaatttaa atgaatctct catcgatctc caagaacttg gaaagtatta a 531

<210> 9

<211> 231

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acacagaatg ttctctatga gaaccaaaaa ttgattgcca accaatttaa tagtgctatt 60

ggcaaaattc aagactcact ttcttccaca gcaagtgcac ttggaaaact tcaagatgtg 120

gtcaaccaaa atgcacaagc tttaaacacg cttgttaaac aacttagctc caattttggt 180

gcaatttcaa gtgttttaaa tgatatcctt tcacgtcttg acaaagttga g 231

<210> 10

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gatgttgatt taggtgacat ctctggcatt aatgcttcag ttgtaaacat tcaaaaagaa 60

attgaccgcc tcaatgaggt tgccaagaat ttaaatgaat ctctcatcga tctccaagaa 120

cttggaaagt at 132

<210> 11

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln

1 5 10 15

Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val

20 25 30

Val Asn Gln Asn

35

<210> 12

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val

20 25 30

Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu

35 40

<210> 13

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser

1 5 10 15

Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn

20 25 30

Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val

35 40

<210> 14

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu

1 5 10 15

Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu

20 25 30

Leu Gly

<210> 15

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile

1 5 10 15

Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu

20 25 30

Ser Leu Ile Asp

35

<210> 16

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 16

Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile

1 5 10 15

Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp

20 25 30

Leu Gln Glu Leu

35

Claims (9)

1.一类来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白，其特征在于：所述的重组融合蛋白为HR121或HR212，由来源于新型冠状病毒S2蛋白的HR1区的截短蛋白HR1、HR2区的截短蛋白HR2以及将二者偶联的连接肽构成，所述的HR121的蛋白结构为HR1-Linker1-HR2-linker2-HR1；所述的HR212的蛋白结构为HR2-Linker2-HR1-linker1-HR2，其中所述的HR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的HR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的Linker1、Linker2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-4所示。

2.一类来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白，其特征在于：所述的重组融合蛋白为HR121-1、HR121-2、HR121-3、HR212-1、HR212-2、HR212-3，由来源于新型冠状病毒S2蛋白的HR1区的截短蛋白HR1、HR2区的截短蛋白HR2以及将二者偶联的连接肽构成，所述的HR121-1的蛋白结构为HR1-①－Linker1－HR2-①－linker2－HR1-①；所述的HR121-2的蛋白结构为HR1-②－Linker1－HR2-②－linker2－HR1-②；所述的HR121-3的蛋白结构为HR1-③－Linker1－HR2-③－linker2－HR1-③；所述的HR212-1的蛋白结构为HR2-①－Linker2－HR1-①－linker1－HR2-①；HR212-2的蛋白结构为HR2-②－Linker1－HR1-②－linker2－HR2-②；HR212-3的蛋白结构为HR2-③－Linker1－HR1-③－linker2－HR2-③；其中所述的HR1-①，HR1-②，HR1-③的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.11-13所示，所述的HR2-①，HR2-②，HR2-③的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14-16所示；所述的Linker1、Linker2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3-4所示。

3.如权利要求1所述的来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白，其特征在于：所述的HR121的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.如权利要求1所述的来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白，其特征在于：所述的HR212的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

5.如权利要求3所述的来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白，其特征在于：编码所述的HR121的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

6.如权利要求4所述的来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白，其特征在于：编码所述的HR212的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

7.一种表达来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白的载体，其特征在于：所述的载体为HR121骨架载体、HR212骨架载体，所述的HR121骨架载体、HR212骨架载体分别包含有权利要求5、6所述的核苷酸序列。

8.如权利要求1-6任一权利要求所述的来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白在制备新型冠状病毒抗原检测试剂以及预防或治疗新冠病毒药物中的应用。

9.如权利要求1-6任一权利要求所述的来源于新型冠状病毒S2蛋白HR区域的重组融合蛋白作为免疫原在制备新型冠状病毒疫苗和抗体中的应用。

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